FLORIN.

DAN IRIMIE

Elemente de

BIOCHIMIE .I.

CLUI-NAPOCA r9 9 B

O 1998. Florin-Dan Irimie Referenfi.

Prof.llniv. Or. i Cawit tUe-alqiu-l

Prof. Univ. Dr. Carmen Socaciu Pregdtiretipograficd . ,<1024 studio> Cluj . Tehnoredactare Kert6szSdndor Editat de editura uErddlyi Hfrad6o, Cluj ISBN973 9837492 Tipdrit la S.C.(Atid)) Prodimpex, Cluj

Cuprins
Cuvint inainte lntroducere ll I

CAPITOLUL r. Glucide
f .f . Defini1ie. Clasificare 17

1.2. Chiralitatea ozelor lB 1.2.). Seriile D;i L 1B 1.2.2.Ciclizareamonoglucidelor 19 1.3. Deriva{i ai rnonoglucidelor gi oligoglucidelor 1.3.1. Esterifosforici 28 1.3.2. Antinoglucide 29 1.3.3. Deoxigluctde :10 1.3.4. Alcooli glucidici :ll 1.3.5.,\cizi glttcidici 32 1.3.6. Glicozide 32 1.4. Poliglucide 38 1.4. 1. Poliglu.ckle clerezerud. 39 1.4.2.PoLiglucide de struL'turd 4l 1.4.:J .l i c o c o r t j u g a t i ' 1 5 G 28

CAPITOLUL2.Lipide
2.1. Clasificarea lipidelor 2.2.Lipide simple 60 2.2.1 . Acilgliceroli 60 2.2.2.Steriele 6l 2.2.3.Cericle 66 2.2.4. Utolide 67 2.3. Lipide complexe 67 2.3.1.Fosfatide 67 2.3.2.Sfingolipicle 72 2.4. Nte lipide 76 2.4.1.Glicozilglicerolt 76 2.4.2.Terpene ;i terpettoicle 76 2.4.3.Icosanoizi 79 2.5. Membrane biologice Bz generole 82 2.5.L Caracteristic! 2.5.2.Straturi dubht lipidk:e B4 2.5.3.Asinrctriamentbranelorplasnmtice B7 2.5.4.Distibufia asirnetricaa lipidelor 89 2.5.5.Tranzifii cle acestora 90 fazd ale straturilor dubLttlipidice ;i nzobilitatea 59

Elemente de biochimie,l.

CAPITOLUL 3. Proteine
3.1. Clasificarea proteinelor Sz 95 3.2. Conlinutul de proteind al materialelor biologice gZ 3.3. Purificarea proteinelor 3.3.1.Dezintegrarea cehtlara 99 3,3.2.Separarea solid-lichid 102 3.3.3.Precipitarea diferenSiald 103 3.3.4.Metode cromatograficepe coloand 105 3.3.5.Electroforeza 107 3.4. Compozi{ia proteinelor 109 3.4.L Con;inutulde qminoacizidin proteine 109 3.4.2.Identificareaaminoacizilor N - terminali 1I I 3.4. 3. I dentificareaaminoacizilor C-terminali I 12 3.5. Structura proteinelor I f3 3.5.1.Structuraprimard a proteinelor 113 3.5.2.Structurasecund.ard 122 g domenii 134 3.5.3.Stnrcturi suprasecundare 3.5.4.Structura terliara a proteinelor 139 3.5.5.Structuracuaternard 143 generale priuind stabilitateastructwriiproteittelor 143 3.5.6.Considerapii 3.6. Sinteza chimici a catenelor polipeptidice (Merrifield 1963) 147 3.7. Proteine fibrilare 149 3.7.1.a-Keratirn 149 Fibrotna 150 3.7.2. 3.7.3. Colagenul l5l 3.8. Proteine globulare 154 3.8.1. Artticorpi 154 3.8.2.Mioglobina ;i hemoglobina 166 3.9. Proteine membranare l83 3.9.1.N[odalitafi de interacfiunee proteinelorctt straturile dublu llltidce 184 3.9.2.Ilidrofobicitatea catenelorpolipeptidice 189

CAPITOLUL4. Enzime
4.1. Specificitateaqi selectivitateaenzimaticd 193 4.2. Clasificareaenzimelor f 95 4.2.1. enzimelor Codificarea ;i nomenclatura 195 4.3. Cuantfficareaactivitdlii enzimatice l98 4.4. Mecanismul de acfiune al enzimelor lg9 4.4.1 . Stabilizarea std.rii rJe tranzilie 200 deactiuare in.reacliileenzimattce 206 4.4.2. Modalitdli concrete de reducere a energiei - enzimd 212 4.4.3. Interactiunea substrat 4.4.4. holoproteice218 Enzime enzimatici 4.4.4. si ttitamine 226 Cofactori

Cuprins.

4.5. Enzimemultimerice 4.6.Abzime 280

278

4.7. No{iuni de cineticd enzimatici 282 parametri 282 4.7.1. Modelulmichaelian, 4.7.2. FactoriicareinfluenSeaza activitatea enzimaticd 291 qctiuittiliienzimatice 307 4.7.3. Reglarea

CAPITOLUL5. Acizi nucleici

5.1.Introducere 319 5.2. Constituenfii acizilor nucleici 320 5.3. Structura acizilor nucleici 324 (ADN) 324 5.3.1 . Aciziideoxiribonucleici (ARN) 346 5.3.2. secundard;i Structura terSiard a acizilor ribonucleici 5.4. Hidroliza acizilor nucleici 353 5.4.1. Llidrolizaacida;i bazicd a acizilornucleici 353 5.4.2. Ilidrolizaenzimaticd a acizilornucleici 354 5.5. Determinarea structurii primare a acizilor nucleici 359 5.6. Sintezape suport solid a oligonucleotidelor 364 (multiplicarea Amplificarea 5.6.3. enzimatica) afragmentelor ADN- metodaPCR (Polimerase enzimatic) 367 ChainReaction saupolicondensarea controlatd Bibliografieselectivd 370

inuinte Cuvfrni
Biochimia seafld Ia confluenla a doud;tiinye extrem de dinamice: biologia ;i chimia. Ea estechematd sd elucidezemecanismelemoleculare ale complexelorproceseuitale ;i deopotriud. sa ofere modele de strategie sintetica ;i alternatiue mai ieftine ;i mai prietenoasecu mediul pentru procesarea, materiilor prtme, subproduselor ;i chiar de;eurilor, tn scopul modificdrii naturii lor substanliale. Direclionarea eforturilor speciali;tilor cdtre acesteobiectiue,confera biochimiei un ritm de dezuoltarefoarte alert, concretizat tn explozia specifice, numdrului de articole de specialitate, al titlurilor de reuiste ;i al coeficientuluide impact al Acestora, mdsurd a gradului audienfa. Sarcina elabordrii unei astfel de cd.rpinu este una dintre cele mai pentru cd trebuie asigurat un raport rezonabil tntre componenta ugoare, biologica;i ceachimicd.a obiectului de studiu. Con;tient de cauzalitatea interacliunilor moleculare tn determinarea latura structurald.tn complexelorproceseuitale, materialul accentueazd prin intermediulfuncyiunilor proprii scopulreliffirii acliunii fiziologice, compu;ilor. in primul uolum, cel defapd, se prezintd,structura;i proprietdtile claselorfitndamentale de biomolecule:glucidele,lipidele, proteinelesi acizii generale,definitorii pentru fiecare nucleici. Se insistd asupra aspectelor clasd tn defauoareaexemplificarilor detaliate. Alaturi de capitolul proteine, materialul dezuoltdpe o tntindere tnare enzimele,principalii biocatalizatori. Motiuul deriud din larga deschidere cdtre caracterul practic, aplicatiu, careface din enzime produse deia comerciale, de mare tonaj, utilizate pe scard largd in industria detergenyilor,farmaceuticd, in industria alimentard, tn scopuri analitice etc. Deqi intitulat ,,Elenrcnte de Biochimie", tnlelegereamaterialului presupune din partea cititorului o familiarizare prealabila cu no{iunile se reelementare de chimie, tn specialorganicd. Termenul de ,,elemente" ferd Ia o introducere sistematicd tntr-un domeniu de granipd ;i nicidecum Ia simplitatea no;iunilor expuse. Materialul esteutil specialistilordin chimte, chimisti gi ingineri chia structuo consecinpd, mt;ti. Ei uor gdsi tn funcpiile biologiceprezentate, rii gi reactiuitdfii moleculare.Frumusepea construc;ieisitusului catalitic, perfecliuneaa;ezdrii fiecdrui component, ordnduitd de'a lungul multor

l0

Elemente de biochimie.l.

generalii, oglinditd tn actiuitatea cataliticd, specificitatea ;i selectiuitatea, constituie deopotriud modele dar ;i mijloace utilizabile. Cartea se adreseazdcel pu{in tn egald mdsurd biolngilor, medicilor, agronomilor, farmac$tilor, etc. Insistenla aborddrii aspectelor legate de structura, proprietdlile biomoleculelor Si detalierea mecanismelordupd care decurg interac[iile moleculare, creeazd. bam obiectiud.a tnlelegerii posibilitafii, oportunitdtit ;i modalitd.lii interuenliei factorului uman pentru ualorificareatn interespropriu a potenlialului creat de naturd. Autorul este recunoscdtor referenlilor ;tiinlirtci, pentru rdgazul de a zaboui asupra manuscrisului, pentru sugestiilegi obseruagiile fdcute. Un cuudnt de mulpumire se cuuine profesorului Sorin Mager, decanul Facultdlii de Chimie gi Inginerie Chimicd a Uniuersitdfii ,,Babe;-Bolyai", care a sustinut introducerea liniei biochimice in facultate. Nu pot fi omi;i colegii Si colaboratorii, din disculiile cu care, tn perioada redactd.rii materialului, au rezultat elementeutile autorului. In fine, un rol decisiv tn apari;ia acesteilucrdri, il au studenlii Facultd;ii de Chimie ;i Inginerie Chimica;i cei de Ia Facultatea de Biologie, specializareaBiologieChimie, care prin feed-ba*-ul realizat, au cizelat forma concretd de tr an smitere a info r mali ei. Octombrie 1998 Florin-Dan IRIMIE

Ia editn procesare P.S.in momentele in careprezentacartesegdsea tn nefiin;a a de trecerea turd, lumeabiochimi;tilor clujeni afost miscatd. profesorului dintre cei mai pro' doctorGaurilNeamfu,unul uniuersitar referentat cdrSiide fa;d. Ii lifici truditori din biochimia romdneascd, aducemprofundul nostruomagiu.

Introducere
Biochimia este chimia viefii. Ca entitdfi, moleculele sunt lipsite de viafa. Materia vie confine insd.molecule, de la cele mai simple pdnd cele mai complexe.Viafa este o nofiune extrem de dificil de definit. Ea presupune cooperarea intre diferite sisteme biologice prin transferul de substanfi 9i de energiein scopul indeplinirii funcliilor vitale. Sistemele vii (organismele)posedd fatd de sistemelechimice nevii o serie de caracteristici particulare: complexitatea, individualitatea, funcfiile biologice, transferui de energie gi de substanfd,reproducerea,evolufia, migcareasi moartea. Complexitatea organismelor vii constd at6,t in numdrul mare de substanfe care le compun, cdt gi in nivelurile ierarhice (subsistemelor biologice) care pot fi identificate in interiorul organismelor.La cele mai evoluateorganisme,mamiferele, moleculele simple gi macromoleculele sunt confinute in celule, care Ia rdndul lor conlin formafiuni infraceluIare specializatefuncfional, organitele celulare. Un grup de celule cu aceeagi funcfie constituie un tesut. ln Frg. 1.1 se prezintd, dupd Lehninger ierarhizareastructurilor, de la cele mai simple molecule Ei pdnd la celuld, unitatea vitalA esenfiald.Cu toatd aceastecomplexitate, organizareasistemelor vii este caracterizatdprin unitate. Componenfii celulari alcdtuiesco serie continud din punctul de vedere al masei moIeculare. Un numdr relativ redus de substanfe au o masd moleculard mici, fiind formate dintr-un numdr mic de atomi. Menfiondm cdteva monozaharide, 20 de aminoacizi, opt nucleotide, cdfiva alcooli, cdfiva acizi gragi. Majoritatea substanfelorchimice sunt biomacromolecule moleculelor primordioblinute prin transformareagi policondensarea Transformdrile substanle includ intreaga gama ale. chimice suferite de a reacfiilor studiate de chimia organicd.Tot legat de complexitatea sistemelor vii, se cuvine a fi amintit caracterul specific gi nespecific al compugilor chimici. Compugii primordiali existd in toate organismele, la acest nivel deosebirile flind legate de prezenfa sau absenla unui termen comparat. Constituenlii biomacromoleculari, sunt insd specifici de la specie la specie, de la organism la organism. Ei pot exista intr-o varietate practic infinitd. Amprenta individualului apare in particularitatea structurilor macromoleculare confinute. De aceea incdrcdtura informationald continutd intr-o moleculi depinde de specificitatea

t2

Elemented,ebiochimie .1,

acesteia.Dintre tipurile de biomacromolecule existente,gradul cel mai mare de specificitate il au acizii nucleici, urma{i de proteine gi de poligiucide. Funcfionalitatea (biochimicd) a acestor structuri care asigurd posibilitatea transformdrilor specifice este asiguratd de structurile mic entropice, realizate prin intermediul interac{iunilor Va:r der Waals, leg[turi de hidrogen, ionice, covalente.Oricdt ar fi de complexd, structura materiei vii conline adevdrul fundamental cd naturir chimici a substanfelorcare o compun poate fi descrisdgi infeleasi. Chimia celulelor vii nu este altceva decdt chimia: chimia organicd,in primul rdnd, chimia supramoleculard,chimia anorganicd, chimia fizicd, chimia coloidali, chimia... Constituenfii celulari se supun principiilor fizice gi chimice care guverneazd natura. Proceselebiologice, indiferent de complexitatea lor, finalmente pot fi descrisein termeni chimici. Aceastapentru cd logica proceselor si fenomenelorbiologiceestechimia.

Organit c6lulars

Ansambluri suPramole&lare ( M : 1 CF1 d )

Maqomolgculs - 1@ (M:1cP

Monomeri (M:10s350)

Int6rmediari (M:50-250)

Prcursori din mdlu(M:18-44)

Hto N1

Fig. I. 1. Structura iprarhicd. a substanlelor biaadive

Introducere,

13

I. Individualitatea caracterizeazetoate sistemele vii prin aceea cd existafie o membrand simpld, fie un perete atagatunei membrane, care asigurd separareadintre sisteme asigurdndu-le o autonomie vitald limitatd. 2. Toate structuriiebiologiceale unui organismigi au rafiunea de a fi intr-un rol functional exercitat.De la pirgi ale unui organism, precum frunza sau lesutul adipos gi pdnd la compugii chimici intdlnifi in metabolism, pentru fiecare din acesteelementese poate identifica un scop al existenfeiacestora.caracteristica funclionald este mai degrabdun atribut al structurilor biologice decdt a celor frzice sau chimice, aceasta pentru cd intrebarea ,,ce rol are ?" nu se justificd in cazul sistemelor fizice sau chimice nevii.

r!!

!.

'r'
,rl1\

Energie solard

,'

t-

Apd9i dioxid de carbon ri

I

Glucozd gi oxigen (6narglo chimict)

t
TIE ,

_i

vtvlivv
Eneryie biologicd(ATP) Fig. L 2. Schimbul de energieSi substanld tntre sktemele uii

L4

Elemente de biochimie .1,

3. Schimbul permanent de energie gi substanfd deosebegte de asemenea sistemelevii de cele neinsuflelite. Sursafinald de energiepentru tot ce esteviu o constituie radiafia solari. Energiasolard esteconvertitd in plante in energie chimicd prin formarea in decursul fotosintezei a glucidelor.Acestea,prin lanful trofic.trec la ierbivore gi apoi la carnivore, la care energia chimicd se stocheazdgi se transportd sub forma unor legdturi macroergice existente in compugi precum ATP sau NADH. Sintezade substanpd organicd,necesardbunei desfdgur5.ri a.activit5lilor organismelor se face pe baza unei surse de carbon. Organismele fotosintetizatoare folosesc dioxidul de carbon atmosferic, pe care il convertescin glucide gi alte substanfe organice, care sunt preluate de animale gi folosite atdt pentru biosinteza substanfelor proprii cdt gi in scopuri energetice.Produsele de degradarea substanfelor organice in proceselede respiralie sunt dioxidul de carbon gi apa, care sunt preluate din nou de sistemelefotosintetizatoarela inchiderea ciclului carbonului. In interiorul organismului energia estefolositi qi pentru a menfine in stare funcfionald o structurd inalt organizat6,, homeostazicd,mic entropicd, aflati in dezechilibru permanent cu mediul. Numai dupd moarte se poate instaura echilibrul cu mediul. Transformdrile energetice gi de substanfi realizatein interiorul fiecdrui organism sttnt orientate in scopul bunei funcfioniri ale acestuiagi sunt in esenfdreaclii chimice. Sistematizarea acestora in reacfii endergonice de sintezd respectiv exergonicegi de degradaredefinegtemetabolismul de ansamblu cu cele doud laturi ale sale catabolism 9i anabolism. 4. Poate cea mai remarcabili insuqire a materiei vii o constituie capacitatea de autoreproducere. Generalie dupd generalie, organismele produc copii virtual identice cu originalul. Mecanismele sunt diferite, mergdnd de la simpla diviziune la bacterii gi termindnd cu reproducerea sexuatdla plante qi animale, dar in fiecare cazin parte sunt caracte'Iotugi rizate printr-o mare f,delitate. aceastdfidelitate nu este perfectd, ea permitand in decursul generafiilor ca prin selecfiea caracteristicilor celor mai adaptate mediului sd se producd evolufia speciilor. Originea mecanismelor reproductive rezidd.in natura chimicd. a materialului genetic format din dublele catene de acizi deoxiribonucleici.Prin procese de policondensare, care au loc pe matrile preexistente se asigurd fidelitatea copiilor de material genetic, defecteleinregistrate ducdnd la aparilia unor caracteristicicare in procesul exprimdrii in mediu pot remdne sau pot fi eliminate.

Introducere.

15

5. Migcarea organismelor in mediul biologic igi are cauzain deplasareaspre sursa de hrani gi de energie,indepdrtareade surselede pericol gi devine cu atdt mai complex motivatd si realizat5,cu cdt pozifia organismului pe scara evolutivd este mai inalte. Natura miqcdrii este de asemeneachimicd, ea realizAndu-seprin intermediul unor reacfii chimice care implicd structuri moleculare specializate. 6. Moartea este o insuqire a viului, un punct in spirala infinitd a evoluFei. Fiecare organism se nagte dintr-o zestre geneticd acumulatd in mii de generafii, trdiegte,contribuind cu experienfa sa la fondul de informafie mogtenit, dupd care prin moarte, se reinte greazd, mediului, ldsind loc noilor indivizi sd.-gi exercite rolul rezervat in cadrul diviziunii biologice a activitefii in habitatul ocupar. sistematizdnd Ei abstractizdnd la maxim se poate afirma cd.un sistem esteviu dacd: . poate si se menlind in viafd, prin nutrilie, asimilafie,prin reacti_ ile energeticedin respirafie gi fermentafie, I poate si propageviafa prin reproducere, o poate si-.si coordoneze individual 9i optim activitifile prin sincronizareagi reglareareac{iilor chimice de ansamblu.

l. Glucide CAPIT0IUI
l. 1. Definitie. Clasificare
Aceastdclasa de compugi este cunoscutd sub mai rnulte denumiri. general Fiecaredintre acesteaa incercat sd ilustreze o caracteristicd definitorie. Numele de glucide sau zaharide derivd de la gustul dulce care caracterizeazd majoritatea termenilor {glykis- dulce in limba greacd), iar cel de hidrafi de carbon (carbohidra{i). derivd de la compozifia generald(C)-(H2O)..In realitate,nici una dintre acestedenumiri nu pentru cd se cunosc reprezentanlicare nu reflectdo insugiregenerald, au gust dulce, dupd cum se cunosc hidrali de carbon care nu pot fi metil glucidefinili dupd formula (C)*(H2O).precum deoxiglucidele, dele ori aminoglucidele. ln pofida acestorimperfecfiuni, cele trei denumiri, sinonime, se utilizeazd curent. Foarte frecvent se foloseqte gi denumirea deoze. Definilia bazatd, pe funclionalitatea chimicb alirmd cd aceste substanle sunt compugi de tip polihidroximonocarbonilic, ori produqi de (poli)condensarea mai multor astfelde structuri. Avdnd in vederedoar pondereamasicdin lumea vie, glucidele ocupd primul loc reprezentd.nd astfel o clasd mare 9i importantd de biomoleculeformate in principal prin fotosintezd. Glucidele,atdt cele monomerice cdt gi poliglucidele, indeplin escfunclii esenfialein organismele vii. Astfel, ele sunt substantede stocarea energiei.Prin oxidare energia se elibereazdintr-o formd utiiizabila de organism. ln al doilea rdnd, multe poliglucide sunt constituenpii majoritari ai perelilor celulari ai bacteriilor gi ai plantelor. ln fine, glucidele intrd in componrenlaunor precum unele coenzimesau acizii nualte tipuri de substanye bioactiue cleici. glucidelor are in vederemai multe criterii: Clasiflcarea 1. dupd natura grupdrii carbonilice distingem: aldoze atunci cdnd existdo grupare aldehidica cetoze atunci cdnd in structurd gasim o grupare cetonica
H

R-C-o
pl

R-C:O

Elemente de biochimie .1.

2. dupd gradul de policondensaredistingem: monoglucide (monomeri) oligoglucide(di_tri_... deca_) poliglucide (cu gradul de policondensaresuperiorvalorii l0) 3. Numdrul atomilor de carbon din structura monoglucielor le subdivide in: tri-, tetr-, pent-, hex-, hept- oze, eventual cu prefixul aldo sau ceto (dupi caz).De exemplu aldohexoze,cetopentozeetc. 4. ln fine, gradul de omogenitate imparte glicanii (o denumire gene, ricd a tuturor poliglucidelor) in homo- gi heteroglicani, dupd cum unitdfile monomere sunt identice sau nu.

1.2.Chiralitatea ozelor
cu excepfia dihidroxi-acetonei, toate ozele posedd unul sau mai mul{i atomi de carbon chirali, ceea ce conduce la aparilia izomerilor optici. r.2.1.SeriileD gi L
H

to n-rf-o"
no*n
H-*-oH

H I

c-o

t'o-f n
H-tFoH HotH HO-?_H
cH2oH L-glucoza

n-{pon cHpH
Dglucoza

Fig. 1.1.Relafia dintre D- SiL-glucozd

cea mai sirnpli aldozd.,aldehida glicerici, un compus monochiral are cei doi enantiomeri desemnafi prin D gi L. Atribuirea denumirii celor doud substanfea fost f[cuti a]eatoriu,deoarecela data aceeanu era cunoscutd configurafia absolut[ a substanfei. semnificagia iniliald a celor dou6litere a fost: D - dextrogir (rotagiaplanului luminii polarizate la dreapta) $i L - levogir, (rota{ia planului luminii polarizate la stdnga). Pebaza acesteiconvenlii stabilite de Emil Fischer, s-au construit seriile D respectivL ale monozeror, dup6 cum atomul de carbon chiral cel mai indepdrtat de gruparea carbonil, are configurafia identicd cu a celui din

Glucide . Chiralitatea ozelor

r9

D-glicerinaldehidasau cu a celui din L,glicerinaldehidi. De aici rezultd cd monozele din seria D sunt in relatie de enantiomerie cu cele din seria L care au aceeagidenumire. De refinut cd semnificagiainiliali a notaliei D respectivL, referitoare la sensul rotafiei planului luminii polarizate nu s-a pdstrat. Numdrul de izomeri optici ai unei molecule chirale este dat de 2n, unde n este numirul de centre chirale din moleculd. Astfel aldohexozele,de exemplu, posedd patru atomi chiraii, prin urmare vor avea 2a = 16 izomeri, adicd opt perechi de antipozi optici, fiecare pereche fiind formatd dintr-o structurA D- gi una L-(Fig. 1.4.1n cazul cetozelor,numdrul de atomi chirali se reduce cu unu, la acelagi numd,rde atomi de carbon. De aceeacetohexozele vor existasub forma '= unei familii cu 23 B elemente, respectiv cu patru perechi. Diastereomerii sunt tot izomeri care apar la substanle cu mai multe centre chirale. Diasteromerii diferd intre ei prin conflgurafia unuia sau mai multor centre chirale (dar nu a tuturor). Prin urmare, relafia de diastereomerie exclude antipozii optici. Un caz particular de diastereomerie il reprezintd epimeria. Epimerii sunt izomeri care diferi intre ei prin configurafiaunui centm chiral. Glucozagi manoza sunt in relafie de epimerie. La fel si glucoza cu galactoza,dar galactozagi manoza nu sunt epimeri. 1.2.2.Ciclwareamonoglucidelor Gruparea carbonil este susceptibild atacului nucleofil din partea unui reactant corespunzdtor, cum ar fi o grupare hidroxil. Dupi cum compusul carbonilic este aldehida sau cetond, se obline in primd fazd. fie un semiacetalfie un semicetal. ln conditiile unui excesde alcool se obline acetalsau cetal (Fig. J.3)
,^'.

R1

Eo T4
semi(a)cetal

R2/ U
compus carbonilic

n1t ,ons c \ons nzl

(a)cetal

atomi de carbon Fig. I. 2. aldoznle gi cetozeledin seria D, cu pdnd.la gase

20
cHo
H--{-OH

Elemente de biochimie .I, Aldozele D dinseria cupdnA la qase atomdecarbon

cHo
H(4-H

I
I

cFhoH Dglicorinaldhida

"

H--1-oH

{noo"

H-{FOH CHaOH

I
I

"i::"
H*1-oH Ft-1-oH

clio

no-f" '.-J-o" "-J-o, I

CH2OH

*1-"n
CH2OH

,,*i:." *-r-,
FToH

Dlcors

"o-l-n

"o-fn I

H-1-oH

":i:::"
I H-1-oH

*,fl'"o"
cHo

*-.1-, I
*1-o"
H-t-oH H-1-oH
CH2OH

H-fox

Ho--1-H

*fo"
H-t-oH
Ho-l--H FlfoH
CH2OH Dguloza

"*1-o"
H---+--OH

*-1-n
H-1-oH H-t-oH
CHzOH Dllucoza

'*1-n
H-t-oH *1-o"
CH2OH D.mano.s

Ho-fn H-1-oH

HtoH

tt

cHo

Ho+r-H

"-l-on I o",l*on

xo-t-x *-1-" '{-1*oH o-1-o"

cl-boH
C&OH D{alactoae

Ho-fn

*-t-,

*-1-r
H-t-oH
CHzOH }taloza

CHzOH

.cH2oH Dhidroxiaclton8 ?FhoH

I

I I

Cetozele

dinseria D

cu pinl la Easeatomi de carbon

H-a--oH
CH2Oll Dnlruloze

I
I

cr-hoH j
HO--+-H

I
I

H-+-oH l
cfhoh Dxiluloai CHzOH CH2OH ct-hoH

t.

n-I-o" n-I-on i H---!-oH I cFhoH

Dpsicoza

H+H I

I I

CHrOH

I H-T-oH
ro-<F-n
I H--?-oH
I CH2OH G3o602a

C:O

H--{-OH

H-t-oH
I CH2OH Dtrucloz6

lI HO--+-H I Ho-T-H Hfo|1

o,.o!,11?n

Fig. 1.3. ReacSia dintre un compw carbonilic Si un alcool

Glwide . Chiralitatea ozelor

2l

Monozele se pot semi(a)cetaliza intramolecular, formdnd cicluri. Reacfia conduce la compuqi stabili dacd ciclurile formate au cinci sau gaseatomi (numite piranozice, respectiv furanozice, de la heterociclurile corespunzdtoare).

\o/
furan prran
Carbonul carbonilic glucidic este un centru prochiral. Prin urmare, atacul nucleofil poate conduce la aparilia unei perechi suplimentare de izomeri optici, care in cazul particular al monozelor se numesc anomeri. Forrnareaunui anume anomer depinde de fafa planului grup[rii carbonil unde are loc atacul.
u"*o"
s\-:,.H --) tl 4 /Y-Y
c:

/-\

CH4H -t-

,d \-[aY-"
' '\ -:12"

i6" l, ,,.,^4\
HOH

f".r

'Xou __-> "l.,'ti-"xi " n -Q 'll

d,Y=
tJ tl

zl
H-. C- OH

al el

rotrre in jurul legtturii C5-C6

HO* C--H H-- C-OH H- C-OH cHpH

HO-C'-H 4l H--C-oH o 5l HOCH,-c-H -l OH

ttt--o zl H*C-.OH sl

13

l'

Hox Anomerul a
6 qHPH
-l

r.i ,. y-u. OH r\/ l. \'.c / )', oH ^ r-r

dr\;
lo
HOH

'?I/ \"
I

Dglucoza

Anomerul $ Fig. 1.4.Formarea celor doi anomeri (q;i f) dependentd defafa planului carbonului carbonilic gt') unde are loc atacul nucleofil asupra carbonului

Denumirea anomerilor se face prin comparafie cu configurafia atomului de carbon chiral al giicerinaldehidei.Dacd atomul de carbon care poarte hidroxilul nou format (carbon anomeric) are aceea$i configurafie cu cel din D-glicerinaldehida atunci anomerul este denumit cr. ln caz contrar, anomerul va fi denumit B. Interconversia anomerilor poarta numele de mutarota{ie. Acest fenomen este spontan, decurge prin intermediul stirii aciclice, Ei este caracterizat prin echilibru.

22

Elemente de biochimie .I.

Conformer ii mo noglucidelor Formele furanozice si piranozice ale monozelor nu sunt plane, datoritd unghiurilor tetraedrice ale atomilor de carbon gi oxigen hibridizali spt. De aceea,formulele plane, FIAWORTH,cu toate avantajeleconferite de simplitate, nu reprezintd fidel moleculele ciclice. ciclul piranozic este extrem de rdspdndit. unghiuriie c-c-c sunt de lllo, ugor diferite de unghiul tetraedric de 10go28'. De asemenea unghiul C-O-C este de 113o. Fiecarepiranozi poate existain doud conformafii scaun,-C (de la chair) gaseconformafii baie sau barcd -B (de la boat), gaseconforma(ii de tip barci torsionatd -S (de la skew boat), 11 conformafii semiscaunH (de la half-) gi gaseconformalii plic. Codiflcarea formelor ciclice se face plecdnd de la un plan central definit de cel pufin trei atomi adiacenli (eventuaidoi cdte doi) folosind numdrul atomului de deasupraciclului ca preexponent, iar cel al atomului de sub ciclu ca indice. Exemplele care urmeazd vor fi edificatoare. Conformeri scaun Formele scaun (chair -C) sunt cele mai stabile. La acestea,energia interacfiunilor dintre substituenfii ciclului piranozic este redusd la minim. Secunoscdoud tipuri de forme scauntcn gi nC,(Fig.i.A

4c1

1ca 1c4

Fig. 1.5. Conformerii scaun (C) ai ftD-glucozei

Pentru evaluarea stabilitdfii uneia sau alteia dintre formele conformerilor scaun s-au elaborat mai multe metode. Dintre acestea le prezentem pe cele mai semnificative: A) metoda factorilor de instabilitate a lui Reeves. ln conformitate cu aceastdmetodd, existd patru tipuri de factori de instabilitate pentru o moleculi de monoglucidi. Fiecare din acegti factori, care sunt cuantificafi, poate apare odati sau de mai multe ori, dependent de structura respectivi. Pentru fiecare structurd se va calcula suma valorilor factorilor de instabilitate. Suma acestorvalori a factorilor de instabilitate va caracteriza un anume conformer. Conformerul cu suma cea mai micd va fi evident cel mai stabil. Cei patru factori sunt:

Glucide . Chir alit atea ozalor

23

C2

orH

*cr
factorut dda 2 nenul H

Fig. 1.6. Utili,zareafactorulul delta

1) factorul delta 2, cuantificat cu o contribufie de 2.5. Acest factor se aplica in situafia in care hidroxilul atagatIa C-2 bisecteazi unghiul dintre atomul de oxigen ciciic gi hidroxilul semiacetalic.ln acest aranjament, cei trei atomi de carbon implicafi vor forma un triunghi isoscel (asemdnarea acestuiacu litera greceascd A este evidenti), de unde numele factorului (Fig.1.6). Ceilalfi factori de destabilizareimpreund cu valorile de corespunzdtoare sunt urmitorii: 2) CH2OH axial :2 3) OH axial :I 4) interacliune diaxiali I,3 intre OH gi CHzOH:2,5

interactiune 1,3 diaxiala

B) metoda energiei interacfiunilor necovalente pleacd de la ipoteza ca energiile libere ale conformerilor sunt funcfii aditive ale diferitelor tipuri de interacliuni care pot apare intre substituenfi (interacfiuni axiale de tip 1-3 gi interacliuni tip gauche axial-ecuatorialsau ecuatorialecuatorial). Evaluarea energeticd a tipurilor de interacfiuni este prezentatd inTab. 1.1.
Tab. 1.1. ualorile energeticeale interacsiunilor axiale 7,3 gi gauche 1,2

Interactiuni axiale 1,3 O:H H:C O:O O:C

KJ'mofr 1,9 3,8 6,3 10,5

Interacfiuni gauche 1,2 O-le: Oe 0-le: Oa Oe:Oe sau a Ce:Oe sau a

kJ'mol-t 2,3 4,2 1,5 1,9 1,3

Efectulanomeric (vezimai departe)in func1iede OR-l sau oH-2

24

Elemente de biochimie .1.

Utilizdnd aceste valori, s-a caiculat ca energia liberd a conformerului aCr al glucozei este de 8,5 kJ .mol-r fafd de 33,6 kl .mol-r la conformerul tcn. De aici rezultd fdrd dubii stabilitatea mai ridicatd a conformeruluinC1, care are o energielibera mai redusd.ln Tab. 1.2. se prezintd conformafiile cele mai stabile aga dupi cum rezultd prin determindri tH-RMNt 9i prin calcule aditive ale energiilor a interacliunilor necovalente.De subliniat cd.determinirile RMN concordd cu calculele.
Tab.1.2. Stabilitatea conformerilor evaluatl prin determindri LH-RMN Si calcule energeti.ce
Stabilit Energiide interacFuprin RMN ne kJ.mol-l 'C, tC. 9i calcule u-D-Arabinoza o-D-Alloza p-D-Alloza a-f)-Altroza B-D-A)troza a-l)-Galactoza p-D-Galactoza cr-D-Glucoza [i-l)-C;lucoza a-D-Guloza B-D-Guloza a-D-ldoza p-D-ldoza c-D-Manoza 0-l)-Manoza a-D ratoza a-D-Taloza "c, tcr 'c,tco 'cr 'c, "cr 'Cr oc, nc, nc, nc,'C, oc, 'cr oc, oC, {c, 16,33 12,35 15,28 14,03 11,93 t0,47 10,05 8,5s 16,75 12,77 18,21 16,96 10,47 l?,3s 14,86 16,75 22,40 25,33 16,12 22,40 26,38 32,45 27,84 33,49 19,89 22,82 16,12 22,40 23,24 32,03 24,70 33,49 B-D-Arabinoza 0-D-Lixoza p-D-l.ixoza a-D-Riboza p-D-Riboza cr-D-Xloza p-D-Xiloza Energiideinteracli Stabilit prin RMN unc k].mol-' ncr'Cn gicalculc "cr "cr'cr ocr'cn 'c, tcJco nc,'c, nc, nc, 13,40 t2,t4 8,58 10,47 14,44 10,47 8,16 6,70 8,58 10,05 10,89 14,86 14,86 lz,98 i5,07 16,33

Aldohexozc

Un aspectparticular este dat de B-D-glucoza. Aceastdsubstanfdare tofi hidroxilii adiacenli in configuratia trans. Pe nucleul piranozic al pD-glucozei hidroxilii vor fi plasafi ecuatorial, structura ncr fiind favorizate in raport cu rCa, in acord cu necesitateaminimizdrii energiei de interac{iune.Anomerul sdu, o, va aveahidroxilul giicozidic in pozilie axiald, ceeace conduce la o anume neregularitatein structura moleculei.
' Prin determiniri 'H RMN se poate stabili propo4ia intre doi conformeri intr-un solvent oarecare, prin faptul cd se pot identifica protonii corespunzitori fiecirui conformer. Raportul dintre ei se poate stabili prin integrare.

Glucide , Chiralitatea ozelor

25

Fig. 1. 7. Structura moleculei de pD-glucozd

\vor

\,...,-o...-\--x

<+

/---d

f----"1

Fig. 1.8. Efectul heteroatomului asupra stabilltdfii conformafionale

Aceastase va regdsiin proprietili particulare ale formelor polimerice. Nu menfiondm decd,t diferenla de solubilitate in api dintre celulozd (poli-p-l,a-D-glucozd) gi amidon (poli-cr-l,4-(1,6)-D-glucozd). Celuloza este practic insolubild in ap6, datorita regularitdlii structurii sale care apare intr-o dispunere fibrilari. Acest tip de structurd favorizeazl. stabilirea de legi.turi de hidrogen intre grupdrile OH din fibrele aldturate, impiedicdnd expunerea hidroxiliior c[tre exterior. Spredeosebirede celulozd,amidonul adoptd o conformafie elicoida15. a catenei,ceeace permite interacliunea cu apa din mediu, justificO.ndu- gi astfelsolubilitatea.

26

Elemente de biochimie .1,

@
\^\<rr

@
\-----="\% \\
I

H
@v \Jt@
I

'-&rn \4 x
anomer cr(gauche / anti)

anomer / gauche) B (gauche

Fig. 1,9, Explicagia efecruIui anomeric prin intcracfiuni orbitalc p

Aparent, conformerul B este cu mult mai mai stabil decdt cel cr.Prin cristalizareaunei solufii apoase sau etanolice de glucozd, Ia temperaturd sub 50oC,se obline insd anomerul o cu [o]fro= +112,2 (HzO).La dizolvare, datoritd mutarotaliei se stabilegteun echilibru intre formele = +52,7"(HzO).Conceno $i P. Solufiava avea o rotafie specifici tcr)fro trafia de echilibru a formei a estede 37Vo, ceeace corespundeunei constante de echilibru de 1,69 (fiind favorizat anomerul ecuatorial), respectiv AGls = -1.30 kI'mol-t. Aceastd valoaretrebuie comparatacu variafia energiei conformafionale datorate gmpirii hidroxil in ciclohexan (aG!u = -3.97 kl'mol-t). Evident,preferinfapentru pozilia ecuatorialda hidroxilului anomeric este mai micd decAt am fi anticipat-o. Acest comportament preferenlial pentru pozifia axialA a substituentului electrodonor din pozifia 2 la oxaciclohexaniin general,la monoglucide in particular, este denumitd efect2anomeric. Acest efect se poate cuantifica prin diferenfa diferenfelor energiilor substituenfilor ecuatoriali, respectiv axidi la oxaciclohexanulZ-substituit Ei la ciclohexanul analog substituit. Existd mai multe explica{ii pentm acest efect. Una dintre acestease refer6 la interac{iunile dintre orbitalii p ai oxigenului ciclic gi oxigenul (atomul electronegativ) aflat in pozipie glicozidicd. In cazul anomerului B, orientarea ecuatoriald a substituentului X (Fig. J.9) va fi gauche.cu ambii orbitali p ai oxigenului, in timp ce anomerul cr, axial, va fi gauchedoar cu un orbital p, respectivantiperiplanar cu celdlalt.

'ca intotdeauna cdnd apare o diferenld intre datele experimentale9i teorie

Glucide . Chiralitatea ozelor

77

Fig. 1. 10.Conformafii mai pufin uzuale la monoglucidele piranozice

'v<"

\u \ 2 t 7 \ ')*T--o
/i\

conformer de tip barcl torsionati (skew boat)oS2 155;5Sl;2So;1S.;35, ceilalti conformeri

confurmer semiscaun( 5Ha) ceilalti conbrmeri: 2Hi ZHz:3Hz; oH1; 1Ho;1H.r: 5;H q 5 , Hoo ; Hs 3 H a4 ; He;4lls

plic (O) Conformer ceilalti conformeri 1, 2, 3; 4; 5. Fig. 1. 11.Modele piranozice barcd

interacliunile O alte explicalie datd efectului anomeric se bazeaz6.pe HOMO LUMO. Astfel, intrepdtrunderea dintre orbitalul HOMO al oxigenului ciclic (un orbital p ocupat) gi orbitalul LUMO (o*) al legdturii glicozidice este maximd atunci cdnd substituentul anomeric este antiperiplanar fafa de orbitalul HOMO al oxigenului. Dacd substituentul din pozifia glicozidica este electronegativel va stabiiiza aceast[ suprapunere. Dacd insd.substituentul este hidrogenul, efectul este destabilizant. ln cazul anomerilor B, suprapunerea orbitalului HOMO se va face cu orbitalii LUMO implicAnd hidrogenul gi nu cu cei ai substituentului electronegativ(O,S,Nsau halogen). In acestecondilii, anomerul B este mai pulin stabil. Efectul este cu atdt mai pregnant cu cdt solventul este mai pufin polar, substituenul din pozifia glicozidicd este mai electronegativ9i cu cdt existd substituenti care s5.perturbe mai pufin prin interacfiuni diaxiale substituentul glicozidic. Pe ldngi conformerii scaun, cu cei mai redus con{inut energetic,mai z'sB; t'aB;Br,a; pot fi identificategi cele qaseforme barci (B de la boat):

Elemente de biochimie,l.

o'38;Bs,3. Bz,s; Ceilalli conformeri au o importanfA pur teoreticd, fiind intdlniti ca forme tranzitorii. Prezentdm totugi in Frg. l.l I . structura celorlalfi conformeri tranzitorii piranozici.

Conficrmalie plic

Confirrmage rdsucitd(twisted)

Fig. 1. 12. Conformafiile cele moi comune ale furanozelor

ln cazul furanozelor, pot fi identificate doud tipuri de conformeri: conformeri plic, in numdr de zece,la care patru atomi ai ciclului sunt in plan gi al cincilea estein afara planului gi conformeri rdsucili (twisted), tot in numdr de zece,dar la care doar trei atomi sunt coplanari, ceilalli doi fiind de o parte qi de alta a planului determinat de ceilalfi atomi (Fig.1.12).

1.3.Derivali ai monoglucidelor qi oligoglucidelor

1.3.1. Esterifosforici Sunt combina(ii extrem de rd,spdndite in lumea vie, fi.ind biosintetizafi de citre organismul viu in special prin reacfii de transfer de grup5,rifosforil de pe nucleozidtrifosfaii.
XTP XDP

RoH V*Ropo3Ht
Fig. 1. 13.Mecanismuldcfonnare al esterilnr fosforici

,i

Printre cei mai importanfi se pot glucozo-l-fosforic(Coril, aminti: esterul (Robison), esterulglucozo-G-fosforic es(Neuber$,esterul fructozo-G-fosforic (Haardenterul fructozo-1,6-difosforic Young),esterul glicerinaldehid fosforic

(Fischer'). Acegti compugi sunt intermediari cheie in metabolismul energetic. Un alt exemplu notabil este esterul ribulozo-l,5-difosforic, implicat in interacfiunea primard a dioxidului de carbon cu materia organicd in procesul de fotosinteze. Prin fosforilare, glucidele devin anionice.

Glucide. Deriuapiai monoglucidelor Si oligoglucidelor

29

Valorile pKu ale esterilor fosforici ai glucidelor sunt cuprinse in plaja 2,1--6,8. Astfel, la un pH intracelular de 7,4 sarcina netd aproximativd a esteruluiRobison estede l,B, ceeace ii permite o interacfiune puternice cu situsul catalitic al enzimei care il va transforma gi, in plus, ii va impiedica traversareastratului dublu lipidic al rnembranei celulare.

fl
""/\ ttl

oAry

.o,

o--i:l_H,P,)
s-toEoribozi l-'l-pirolosfat orotidilat

Fig, LM, Prinfosforilare se nndreSte fugacitatea grupd.rii care se substituie

O altd funcfie a glucidelor fosforilate o constituie aceeade intermediari activi in formarea de legdturi O EiN-glicozidice:

B-D-2-glucozamina

p-D-2-galacto zamina Fig. 1. 15.Aminoglucide

Acidul muramic

1.3.2. Aminoglucide in constitulia multor oligo- gi poliglucide. Cei mai comuni Se gdsesc reprezentanfi ai clasei sunt N-glucozamina gi N-galactozamina care conlin in pozilia 2 cdte o grupare aminicd. Chttina, poliglucida care constituie scheletul extern al crustaceelorqi insectelor, este formatd din unitdfi de N-acetil-p-D-glucozamind unite prin leg[turi 1,4. Structura acesteia estesimilard cu a celulozei. Acidul muramic gi acidul neuraminic, se gdsescin compozilia polizaharidelor care intrd in constitufia membranelor celulare sau a peretelui bacteriilor.

30

Elemente de biochimie .1.

Ambii confin unitefl de trei atomi de carbon care se ataqeazdde atomii C1 sau C3 ai aminoglucidelor respective.In acidul muramic (de la latinul murus - perete), gdsit in peretele bacteriilor intdlnim o legdturi. etericd la atomul de carbon 3 al 2-glucozaminei,cu hidroxilul acidului lactic (Fig.1.15.).

,*.o"s"!E!f!,,""u
Fig. 1. 16.Structuri ale sialatului

In acidul neuraminic (izolat din fesutul neural) int6lnim o legdturi C-C intre carbonul 1 al N-acetilmanozaminei gi acidul piruvic. Prin semicetalizare se formeazdstructurd ciclicd,ale cdrei diversereprezentiri sunt redate mai jos. N- acetil gi N-glicolilaminoderivafiiacidului neuraminic sunt cunoscu{i sub numele generic de acizi sialici. 1.3.3.Deoxiglucide Sunt monoglucide la care una sau mai multe grupe hidroxil sunt inlocuite prin atomi de hidrogen.2-deoxirlboza esteun constituent al acizilor deoxiribonucleici, care sunt intdlniti in toate sistemelevii. Deoxiglucidele se intdlnesc frecvent in glicoproteine gi in poliglucide. L-ramnoza gi L-fucoza, ambiele O-deoxigiucide, sunt componenfi ai peretelui unor celule gi de asemeneaintre in compozifia unor glicozide.

Glucide . Deriuasi ai monoglucidelor gi oligoglucidelor

3r

Ho-.^,,
wn2

#w 6*
2-deoxi-s-D-riboza cr-L-ramnoza (6-deoxi-L-manoza) I:ig. 1. 17.Deoxiglucide conTune

,rf--ot. ?t

o -L-fucoza (6-deoxiL-galactoz a)

1.3.4. Alcooli glucidici De regula sunt produgi de reducere ai glucidelor. Exemplul glicerolului (glicerinei) sau al ribitolului sunt clasice.Pe ldng5.acesteaprintre cei mai comuni produgi de reducere ai glucidelor amintim manitolul, xilitolul, glucitolul (sorbitolul). Refinem cd numele alcoolilor glucidici seformeazdprin addugareasufixului ol la rdddcina numelui glucidei. qHroH
H-c-OH
I

9fh-oH
c-oH cl-h-oH glicerol
I

I I H_?-OH
*-c-OH
I CH2-OH ribitol

?' ?y'-\T" no) [4H

\J

OH

structuriHAWORIH

REEVES structurd

mio-inositolul

Fig. 1. 18.Exemple de alcooli glucidici

Aite exemplesunt date de alcoolii ciclici. Cei mai rdspdndili sunt inositolii, dintre care se detageazdca reprezentativitate mio- sau mezo inositolul, al cdrui nume vine de la faptul cd a fost descoperit prima datd in mugchiul cardiac.Aceastdsubstan!f,,asemindtoare vitaminelor (vezi Capitolul 4. Enzimele) o intdlnim in structura unor glicerofosfolipide mernbranare. Acestea, prin hidrolizd mediata hormonal, elibereazdesteri fosforici ai mioinositolului, substanfecare indeplinesc rolul de mesageri secundari ai unor acfiunii hormonale respective, declanqAnd o succesiune de evenimente care vor conduce la amplificarea semnaluluihormonal initial.

32 1.3.5. Acizi glucidici

*-"ro

Elemente de b iochimie .1.

*L,.,
*Lo"

r1_c_ oH

A"""7
,/

t -E-ox

-f

P-on vFor
OHI

&-r-o"

-'

Acilul DgluconE

OH Dgfuconolactona

\--o I |-*C-OH

*gt'o
oxd.roE

r+--6-on -

,._L;

4".*''
+

*-i-n
r+C-or-=

ro --

| t-f-c-ot'l

pc-oH
&,.-on DolJcoza

n-Lon
ozc-on

Fp"( "'L \ \ 'c\4\\.-:n

01
\

*-\---r/o\ ro \'fr-\.:+
\ co,it_ \

Acldul'gtucuronic form 'clclcr Elform clcBcr Acadur L,huron, (ldtA)

*-f a \1 oro"," o irc6

tu-t-ox

\l

*-l-"
ft- c- oH

',-L-on
I o?ton Acidul Dqlucerlc aru Fglucozeharlc

Fig. 1. 19.Formarea diferifilor produSi de oxi.dareai D-glucozei

Monozele se pot oxida la Cr (aldozele)cdnd rezultd acizi aldonici, la Co, cdnd rezulte acizi uronici, sau simultan la Cl gi Cco, cdnd se formeazdacizizaharici sau glicarici (Frg.1.19.). 1.3.6. Glicozide
A glicon

f0licon

T')

zh

? O-,

f0licon

uh

?"1

uI

O-glicozidA

Sglicozidd R = H, CH2OH

N-glicozidi

Fig. 1. 20. Strustura generalda glicozidelor

Glucide. Deiuapi ai monoglucidelor Si oligoglucidelor

3t

Glicozidelesunt substanfeorganicenaturale formate dintr-o componentAglucidica (mono- sau oligo-) gi o componente neglucidici numitd aglicon, unite printr-o legdturi glicozidicS. ln func1ie de atomul din aglicon care se leagd de glucidi se disting O, S gi N- glicozide. Chimic, legd,tura dintre cele dou6. componente este de natur[ (a)cetalicd, tio (a)cetalicdrespectiv aminalic6 (Fig.1.20 . Agliconii pot face parte dintr-o varietate de clasechimice (alcooli, fenoli, amine, tioli etc) $i pot indeplini functii biologice diferite in celul6, fesut sau organism. De asemeneaunii agliconi sunt produgi interni de degradareai unor toxine. Glicozidele sunt formele prin ctue se transportd sau se stocheazdunele substanfe,agliconii. Totodatd prin glicozilare aglicclniipot fi mai ugor transportafi in zone in care pot fi metabolizafi, materiaiizO,ndu-se astfel o func1ie particulard de detoxifiere sau protecfiein lumea vie. Majoritatea glicozidelor sunt hidrosolubile, datorita grupdrilor hidroxilice.De asemeneatoate prezintd activitate optice. Cea mai semnificative reacfie este hidroliza, care poate decurge in catalizd acidd sau enzimaticd.In specialin plante, glicozidelesunt insofite de glicozidaze(enzimelehidrolitice specifice). le corespunzdtoare O-glicozidelesunt compugi de condensarecu alcoolii sau
OH OH

"u,,$\--"'Y

.^(-_-* 1,fi- cH2oH *;4 ^Lnn'*)'Ofi

oll Goniferina ocH3

-\="'Y oH

cH2oH

ocH3

Siringlna

Fig. 1. 2 1. O-glicozidefenolice

ocHs
Coniferina Siringina

Fig. 1.22. Glicozide cianogenice

fenolii. Coniferina El siringina, B-D glucozizii alcoolului coniferilic si respectivsiringic, pot fi identificafi in sucul cambial fiind precursori al ligninelor (Fig. 1.21.).

34

Elemente de biochimie .1.

Interesante sunt aga nurnitele glicozide cianogenice (Flg. 1.22.) aI cdror reprezentant tipic esteamigdalina, un glicozid al genliobiozei cu benzocianhidrina.Amigdalina se intahegte in sdmburii de cais6,piersicd, prun5, in migdale amare. Prin hidrolizd acidd sau enzimaticd (cu emulsina) rezultd genfiobiozd, acid cianhidric ai benzaldehidd. Amigdalazahidrolizeaza amigdalina la nivelul legaturii 1,6 B-glicozidice dintre cele doud monozaharide,rezultdndin acestmod o noud glicoziprunasirzarespectiv B-D glucozd.Separe cd funcfia biologicd, dd. a amigdalinei este proteclia plantei impotriva insectelor gi altor agenfi patogeni. O O-glicozidd de sintezd este Laetrilul, in care componenta glucidicd.este acidul glucuronic, iar agliconul este tot benzocianhidrina. Se pare cd aceastdsubstanla esteun agent antineoplazic. Foarte rdspdnditein regnul vegetalsunt si glicozidelesterolicedintre care importanfd deosebitd o prezintd glicozidele cardiotonice (cardiotoxice) precum si glicozidele saponinelor. Ambele tipuri de substanfe au proprietdfi tensioactive,dar acfiunea fiziologici Ie este diferenfiate. Prima clasd de compugi, in doze mici, acfioneazd stimulator asupra mugchiului cardiac, in timp ce cea de-a doua clasdprovoacd hemolizd. Agliconii glicozidelor cardiotonice se numesc genine. Dupa structura inelului lactonic legat de ciclul ciclopentanic al nucleului steroidic se disting doud clase:cardenolide(lnel lactonic de cinci atomi n-B nesaturat) respectiv bufadienolide (inel lactonic de gaseatomi cu doud duble Iegaturi). Fig.1.23.

Cardenolidi

Bufadienolidi

Fig. L 23.Agliconi sterolici (genine)

Glucide . Deriuayiai monoglucidelor ;i oligoglucidelor

35

lro

Fig.1.24

Surse importante de glicozizi cardiotonici surrt Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Strophanrus kombe penuu glicozide cadenolitice, respectivScilla maritima pentru cele bufadienolidice. Un exemplu interesantil constituie oubaina, extrasedin planta oubaio, din Africa de est, careera folositd de indigeni pentru otrdvirea sdge{ilor(Fig.1.24.). Tot in clasa O-glicozidelor sterolice inud gi glicoalcaloizii sterolici dintre care se amintesc a-solanina (Fig.1.25.), substanfacare se gdsegte in plante din familia Solanaceae(solanum tuberosum),al cdror fruct le ciror le conferd binecunoscuta toxicitate. Prin hidroliz[ cr-solaninaelibereaz6. solanidina (agliconul sterolic) gi solatrioza, o triglucidi care conline D-glucozi, D-galactozi gi L-ramnoz6..Tomatina este o glicozidi identificatd in tomate Solanum lycopersicum, cu structurd asemdn6toarea-solaninei.

a-Solanina

Fig.1.25

36

Elemente de biochirnie.1,

Rutinoza (6[ pJ.-rumopiranozil] -Dglucopiranoza

Ibsperitina

Hesperidina

Eriodictina
Fig. 1.26. Vitamine P

Pigmenfii flavonoidici, extrem de rispdndifi in regnul vegetal,unde igi manifestA prezenld prin coloritul viu conferit in special florilor, se gdsescin special sub formd de B-D glucozizi.Numd.rul lor este extrem de mare. Tot aici intdlnim grupul aganumitelor vitanfne P. (Fig.1.26.) De origine vegetald,acfiunea lor constd in reducereatensiunii arteriale gi micgorareapermeabilitefli capilarelor sangvine,de unde gi numele de vitamine P. Au ac{iune sinergicdcu vitamina C qi prin oxidare pot forma structuri chinonice. Ceie mai cunoscute sunt hesperidina (citrina) gi eriodictina. Prin acliunea hidrolazelor sau oxidazelorasupraunor compugi toxici pentru celuld, acegtiase transformS. in compugi hidroxilici, susceptibili de a forma glicozide fird potenfial toxic, dar mobile. Acizii ariloxialchilencarboxilici utilizafi ca ierbicide pot fi degradali la compugi fenolici, care prin glicozilare formeazd glicazizrnetoxici, mobili. Exemplul acidului 2,4 diclorofenoxiaceticestebine studiat (Fi4.1.27.):

Glucide. Deriuayiai monoglucidelor;i oligoglucidelor

37

?'
_-.__-->

2'..,/c,

Gtucozd

ll

\**
2,4 diclorofenolglucozid

Acid2,4diclorofenoxiacetic 2,4diclorofenol

Fig. 1. 27. Glucozilarea acidului 2,4 diclorofenoxiacetic (2,4-D)

similar sufera reaclii de detoxifiere gi unele fungicide: etirimolul este un exemplu (Fig.1.2B)

CaHsOGlrcozil

cHs
v2,'5

CzHs Elirimol{lucozid

Etirimol

Intennedlar hidroxilat

Fig. 1. 2B Glucozilarea etirimolului

S- glicozidele da:u prin hidrolizd izotiocianati, glucozdprecum gi anionul sulfat.Aceastdreacfie se produce in organismul vegetalprin intermediul unei B-tioglucozidaze(hidrolaze)speciflce,mirozinaza.
NCS R_N:C\ ,S-Glucozil

oSo.
S/flrucfitra de principiu Sglicozidelor a Brasicina

Fig. l. 29. S-glicozideleSi brasicina ca aglicon S-glicozidic

Structura generala este redata in Fig.1.2g.Se gdsescin plante care confin substanfe odorante cu sulf. Sinigrina din seminfele de muqtar negru,prima S-glicozidadescoperitd,pune in libertate alilizotiocianat. Glucobrasicina,identificatd in Brasicaceae, pune in Iibertate brasicina (Flg. 1.29.) sau izotiocianatul provenit din metabolizarea acidului indol-3-il aceticfitoregulator de cre$tere. N-glicozidelesunt, se pare, cele mai rdspdndite gi studiate glicozide, reprezentanfiilor tipici fiind nucleotidele gi nucleozidele,substante care intri in componenfa acizilor nucleici (ueziCap.Sacizii nucleicil.

38

Elementede biochimie .1.

1.4.Poliglucide
Poliglucidele sunt compugi macromoleculari extrem de rispdndigi, ca rezultat al activitagiiorganismelor.In funcgiede gradul de omogenitate al glucidelor componente ale catenei policarbohidrice, ace$ticompugi macromoleculari pot fi sistematizati in homo- qi hetero- glicani. Spre deosebirede proteine, a cdror stmcturA primard (secvengd), implicit lungime, este codificatd in genom, poliglucidele sunt create aparent fdra existenfaweunui model, prin atagareade mono- sau oligoglucide la o catend preformatd. De aceea,lungimea gi compozilia poliglucidelor adeseaprezintd o mare diversitate gi sunt aparent aleatorii. In realitate s-au pus in evidenfd structuri repetitive, conservateinterindividual 9i chiar interspecii. Compardnd posibilitdlile de Iegare intr-o secvenfd datd a doi aminoacizi cu posibilitafile de legare a douf, hexoze,se constatd cd in primul caz se poate realizao singurd legituri, peptidicd spre deosebire de al doilea caz, chnd putem realiza cinci tipuri de legdturi glicozidice (l-1, l-2, l-3, l-4 gi f-G). (FiS. 1.30). Din acest motiv (bio)chimia formdrii oligo gi poliheteroglucidelor este mai complexi decdt a polipeptidelor iar factorii care determind o anume secvenfi glucidicd nu sunt incd bine cunoscuti. Majoritatea poliglucidelor pot fi sistematizatedupd funcfia biologicd. ln concordanfd cu aceastadistingem poliglucide de rezerud(amidonui, glicogenul,dextranii) Eipoliglucide structurale (chitina gi celuloza).

(0-1,6)
(p-1,4)

(p-1,2)

Fig. l. 30.Posibilitdgl de realizare a unci joncfiuni p-glicozi.d.ice

Glu.ci d.e. PoIi glucide

39

1.4.1.Poliglucide de rezervi D-glucoza este principala surs[ de energie pentru organisme. Ea se gdsegte in interiorul celulelor sub formd polimerici de amidon, la plante gi fungi, de glicogen,la animale precum gi de dextran Ia unele bacterii gi drojdii. La bacterii s-a determinat existenfain principal a amidonului gi a glicogenului, 1.4,1.1. Amidonul se gdsegtestocat in celule specializate numite amiloplaste. Forma acestora este specificd fiecdrei plante, ceea ce permite identiflcarea amilosursei.Dimensiunea amiloplastelor variazd. intre 3 gi 100 pm. De asemenea amidonul se mai gisegte gi in cloroplaste,sediul fotosintezei. Amidonul esteformat din doud tipuri de macromolecule: Amtloza care cohstituie fracliunea neramificatd a amidonului, formata din 300 - 6000 de resturi de cr,-D-glucozd legate intre ele prin leg[turi de tip l-4 crglicozidice.In amidon, amiloza are o pondere de 10 30%. Degi nu tocmai ugor solubild in apd, amiloza formeazl, agregate hidratate cu conformafie de helix de stinga (Fig.1.31). Hidratarea are loc atit in interiorul helixului cdt 9i in exteriorul acestuia.Iodul poate inffa in lumenul helixului, in urma interacfiunii particulare rezultdnd coloratia albastrdcunoscuti de la titrdrile iodometrice. Amilopectina estevarianta ramificatd a amilozei. Ramiflcaliile sunt realizate prin legdturi de tip 1-6 o-glicozidic gi ele apar in medie la 25 de resturi de glucozd unite 1-4 cr-glicozidic. Lungimea medie a acestorramificatii este de 15-25 de resturi de glucoz6. Ramificaliile se pot ramifica la rdndul lor, generd.nd structuri arborescente.Interacfiunea cu iodul dd o colorafie rogie-violet caracteristic6. Importanli din punct de vedere practic sunt produqii de degradareparfiald a Fig. 1.Sl. structurahelicoidalda amidonului. La utilizare in organism, unuifragmentdeamilozd amidonul estehidrolizat de c6tre amilaze.Existi mai multe tipuri de amilsaze,care diferd prin locul unde acfiin catend (la extremitdfi sau nu ) respectiv tipul de legd.turdpe oneazd, careil scindeazd (cl1-4 sau cr l-6). In funcfie de gradul de avansareal

40

Elementede biochimie .1,

hidrolizei se oblin forme cu mase moleculard din ce in ce mai micd, numite generic dextrine.In urma utilizdrii c-amilazelor respectivB-amilazelor, care scindeazd, doar legituri de tip l-4 la componentele oligo(poli)glucidice care confin legiturile 1-6, se oblin oligomeri ramificafi numifi limit dextrine. Diferenliate dupd colorafia cu iodul, in ordinea descrescdndda masei molare, dextrinele sunt amilodextrine, atunci c0nd colorafia cu iodul este violetd, iar capacitatea reducitoare este practic nuld, eritrodextrine, cAnd colorafia cu iodul esteros,ie, apdrdnd puternic fd.rda reducdtoare caractenrl reducdtor, acrodextrine, forme da coloralie cu iodul gi maltodextrine.

o-ciclodextrina

pciclodextrina Fig. 1. 32. Tipuri de ciclodextrine

y-ciclodedrina

Sub acfiuneaunor amilaze bacteriene,precum cele extrasedinBacilIus ma.ceranns, concomitent cu scindarea legiturilor I-4 ale helixului amilozic are loc reformarea intracatenard a acestora rezultatul fiind aparilia unor dextrine ciclice, cele mai abundente fiind cele cu 6, 7 gi B unitifi de glucozS, numite ciclodextrine o, B respectiv y. (Fig.1.32.) Acestesubstanle gi-au gisit utilizare in industria poligraficd gi textild, ca agenfi de incleiere, iar mai nou ca faze stafionare cromatografice,respectiv ca matrice pentm catalizatori chirali enzimomimetici. 1.4.1.2.Glicogenul este forma principald de depozitare a glucozeila animale. El se gdsegtepredominant in ficat, (10 7odin masa acestuia),precum gi in mu9chii scheletici (1 - 2Vo dtn masa acestora).Glicogenul este mult mai ramificat decdt amilopectina (o ramificalie la B * 12 unitdli de glucozd).

Glucide. Poliglucide

4r

q
)

"ti7, \",!1, .',",o^,on('o' v

\tH') \

*r ;l:

S t r u c t u r au n u i d e x t r a n r e t i c u t a tc u e p i c l o r o h i d r i n i 9 i mecanismul acestei reticultrri

rFig. 1. 33.Reticularea dextranilor

1.4.1.3. Dextranii sunt, aleturi de glicogen qi amidon, poliglucide de tezervL.Originea Ior estebacteriand.Componentul esenlialestea-D-glucoza,care intra in compozifia polimerului prin legdturi de tip l-6. Pe ldngd acestease mai intdlnesc legdturi minoritare de tip t-2; 1-3 Ei f-4. Bacteriile care fac parte din flora bucald produc dextrani extracelulari,care constituie un element al plecii dentare. 'materii Dextranii au intrat in atenfia laboratoarelor de cercetale ca prime' pentru faz.elestafionare in cromatografia de excluziune sterice (gel filtrare). Dextranii destinali acestui scop provin dintr-o bacterie (Leuconostoc Pentru utilizare, dextranul se reticuleaze mesenteroides). Produgiilezultafi sunt cunoscuti sub nucu epiclorohidrini (Fig.1.33.). mele comercial de Sephadex. Existd mai rnulte tipuri de produse care diferd prin gradul de reticulare. Sephadex, 1.4.2. Poliglucide de structuri 1.4.2.1. Celuloza estecel mai rdspdnditpolimer de pe scoarfaterestrd.El conferdrezistentAmecanice perelilor celulelor vegetale, (plantelor in ultimd instanfd).Aceastf,rezistenta mecanice, completata de delicateleafibrelor celuloziceale bumbacului sau inului, fac din celulozi o materie prime din ce in ce mai utilizate. Ca Ei amiloza, celulozaesteun polimer nera-

42

Elemente de biochimie .1,

mificat. Deosebireaconstd in proprietdfile conferite de legdturile 14 a glicozidice din amilozd, respectiv cele 1-4 p glicozidice din celulozd.La amilozd, prin iregularitatea introdusd de pozilia axiale a oxigenului glicozidic, apare o deformare gradatd,a catenei, cu consecinfa apariliei

uneistructuri deci o anume helicoidale, cu apa, apti deinteracfiune

solubilitate. La celuloz5, tofi hidroxilii (inclusiv cel glicozidic) fiind ecu-

atoriali, prin alternarea rotirii unitdfilor monomerice cu lB0' rezultd o cateni liniari (Fig.1.34). Cateneleliniare ale celulozei se gdsescasociate in planuri, acesteala rdndul lor asociindu-se.Asocierile intra- si interpianare sunt realizate prin intermediul legdturilor de hidrogen formate prin cele trei grupdri OH per unitate, ceeace impiedicd interacfiunea cu moleculele de apd din mediu, explicAndinsolubilitatea celulozei.

f"d

2tr'S+"MTS+^
'?
D-Glucozi legati 1P{licozidic (in celuloz6)

D-Glucozd legati 1@licozidic (in amilozA)

Fig. I. 34. Ioncfiuni 14a- Si 14ft glicozidice tn amilorl Si celulozd

1.4.2.2.Chitina este al doilea polimer ca rdspdndire pe pdmdnt. Este constituentul principal d perefilor celulari ai ciupercilor Ei de asemenea al exoscheletuluiinsectelor, crustaceelorgi pdianjenilor. Unitatea monomerici este N-acetil-B-D-glucozamina(GlcNAc)gi aceastase leagd 1-4 cu celuloza atdt Ia strucB glicozidic, formAnd un polimer asemd.ndtor tur5.cdt gi la proprieta;i. La fel ca 9i celuloza,chitina incepe sa fie utilizatd. ca materie primd. Astfel, ea se utilizeazd,laacoperireafructelor, in derivafi de chitina vedereapdstririi prospeqimii acestora.De asemenea, sd activeze impiedicdndu-l sunt utilizali pentru a lega fierul din carne, nesaturate ale lipidelor. oxigenul din aer care oxideazS.catenele 1.4.2.3.Hemiceluloze Numele acesteiciasede polizahariderpropus de SCHULTZEin l89l' nu este cel mai potrivit dar, datoritd utilizirii, s-a irnpus. El desemneazd o clasdde substan(econsiderateprecursori ai celulozei (de unde etimologia), relativ ugor de extras din fesuturile vegetale.Astdzi se cunoagteci ipoteza legiturii cu celulozanu s-a confirmat. Sunt substanfe

Glucide. Poliglucide

43

posedi o solubilitaterelacu gradrelativmic de polimerizare(150-200). tiv redusdin apa. ln alcdtuireaunei cateneintr6 mai multe tipuri de glucide,Dupd monozahariduldominant, hemicelulozele se subdividin trei subclase: xilani, arabani gi galactani, fiecare dintre acegtiaconfindnd polizaharidede o diversitatestructurald remarcabild. 1.4.2.4. Pectine

"ot\\y'6ilo\ Ho\-..1A\_on

Acid B-D-manuronic

a-l-guluronic "A,cidul

Fig. 1.35.Acizi uronici corxtituenfi ai unor pectine

Sunt polizaharide prezente parfial in peretele celulei vegetale precum gi in sucul plantelor. substanfe structural asemdnitore au fost identificate in constitufia unor alge marine (cand poartd numele de acizi alginici). caracteristica structurald a acestei clase de substanfe macromoleculare este participarea in proporfie majoritari a acizilor uronici. ln pectinele vegetalepredomind acidul galacturonic. Gruparea carboxil poate fi libera, sub formd de sare,de reguld cu Cazn, sau sub formd de metil ester. Au aplicafii in industria alimentarr, formdnd geluri transparente dupa incalzire in mediu acid (pH 2-3.5) in prezengdde zahdr, urmatd de rdcire.Aceasta se intdmpli datoriti faptului cd la dispersareain apd pectinelese afld sub formd de particule coloidale anionice (prin grupirile carboxilat),stabilizatede straturi de apd.Addugareade zahdr destabllizeazd acestesistemecoloidale, datoriti interacfiunilor hidrofile intre moleculelede zahdr 9i cele pectice. Prin reducereapH-ului, sarcina negativaa pectinelor se neutralizeazd., permi;and aglomerareaacestorain agregate de dimensiune ridicatd. 1.4.2.5. Acizi alginici Au fost identificafi in algelebrune, (Phaeophyceae) gi confin doui tipuri de acizi uronici: acidul B-D-manuronic (M) $i cr-L-guluronic (G) (F1g.f .35.),unifi prin legdturi B-1*4 (Fig.1.36.), respecriva-I-4 glicozidi(Fig.1.37.) ce, Proporlia dintre cei doi acizivariazaintre 2:I Si 1:2.Aceste unitafi sunt grupate in blocuri.

44

de biochimie'I' Elemente

d.epolimanuronat Fig, 1. 36.Secvengd

Catenaconfine blocuri homopolimere (M)ngi (G)n'precum 9i blocuri cu secvenfealternante (MG)p. Conformafia secvenfelorpoli-D-manuronice este similard celulozei. ln prezenta cationilor (Li*, Na*, IC qi Cat*),insi catena adopte o conformalie de helix.

Fig. 1. 37. Secuenldde poliguluronat

Spre deosebire de aceste secvente,cele poli-L-guluronice prezinta un model de band5. ondulatd cu mobilitate limitate din cauza configura{iei diaxiale a legi.turii glicozidice. Interstiliile din interiorul (albenzii pot fi umplute cu molecule de api sau ioni putin voluminogi 'dimer de calini). In prezenta ionilor de Caz*se induce formarea unui asocia{ie',a cirui stabilitate esteasiguratdde ionul inserat intre catene' care este stabilizat de grupdrile carboxilat. Alginafii alcalini gi de Mg sunt solubili in ap6, in timp ce acizii alginici gi sdrurile celorlalli cationi sunt insolubili. Sunt utilizafi in industria alimentarf, ca aditivi de ingrogare, iar sub formd derivatizatd ca emulgatori. ln ultima perioadd, sunt mult folosili la imobilizarea celulelor 9i a preparatelorenzimatice.

Glucide. Poliglucide

.l)

Fig, 1. 38 PorSiunedin structura unui alginat de calciu

1.5.1. Glicoconjugati Oligo-gi poliglucidelese pot cupla cu cornponenteproteicesau lipidiceformdnd glicoconjugafi. Conjugalii cu componenteproteice se sistematizeazdin glicoproteine, proteoglicani gi peptidoglicani. Primele doud clase de substanle se formeazA prin glicozilarea catenei (poli)peptidice,gi sunt caracteristiciesen{ialeale eucariotelor,in timp ce peptidoglicanii sunt constituenfii peretelui celular al bacteriilor. Prin conjugare gama funcfionalitdfii glucidelor sporegte,rolul lor in recunoagterea moleculard precum gi in patologie justificdnd aparifia glicobiologieigi a glicopatologiei ca domenii biochimice de interfafS.. Progresele fdcute in tehnica experimentalda chimiei glucidelor au avut motivafia in funclionalitatea glucidelor sub formi conjugaH. Franqois Jacobafirma c6 ,,tmpreund cu acizii nucleici ;i proteinele, hidrayii de carbonreprezintd a trei.adimensiune a biologiei moleculare." 1. 5.1.1. Glicoproteine Prin glicozilare, proteinele devin glicoproteine. Glicozilarea ca proces,succedeproteosinteza (procesul este posttranslafional - vezi biosintezaproteicd Vol. ID gi se poate realiza atdt enzimatic cdt qi neenzimatic. ln aceastdclasi de substanfeintdlnim reprezentanli cu funcfionalitatediversdprecum: proteine structurale, enzime, receptori memb-

46

Elementede biochimte .1.

ranari, proteine de transport, imunoglobuline. Ca efect al glicozildrii, componentele proteice vor suferi modificdri ale proprietefilor lor, ceea ce se va reflecta firesc in noi funcfii: r prin glicozilare cregte solubilitatea componentei proteice. Mai mult, cateneleoligoglucidice pot masca resturile hidrofobe ale aminoacizilor din proteine, influenfdnd interacfiunile proteini: proteind. r prin glicozilare componenta proteicl adopt[ conformafii particulare carcii faciliteazd transferul prin membrana reticulara;i plasmarrcd.Aceste conformalii sunt rezultatul stabilizdrii structurilor proteice de tip terfiar gi cuaternar, (vezi structura proteinelor) cu participarea legdturilor de hidrogen gi a interacfiunilor van der Waals. r prin glicozilare se poate realiza regioselectiuitatea proteolizei, componenta glucidicd orientdnd enzima proteoliticd strict citre legdtura peptidicd vizatl. r prin glicozilare se poate realiza gi protecpia faya de proteolizd: exemplul glicoproteinelor epiteliului tractului digestiv este ediflcator. Prin impiedicarea glicozildrii sau prin impiedicarea atagirii la capdtul restului glucidic a acidului sialic (vezi mai departe), are loc expunerea legdturilor peptidice acfiunii enzimeior proteolitice. ln acest context apare limpede dependenfa ulcerului tractului digestiv de sializare sau de glicozilare. r prin glicozilare se realizeazd reglarea permeabilitdfii membranare. Glicoconjugafii membranari (vezi proteinele membranare) creeazd. bariere hidr ofi le p e suprafafa celulaid, mdrindu -se selectivitatea prin doud mecanisaccesuluiintracelular. Acest proces se poate reaJiza me. Primul dintre ele estedatorat cregteriigradului de hidrofilicitate, ca efect al glicozildrii. Cel de-al doilea, numit efectchaotropic,se datoreazi orientirii specifice a moleculelor aflate in tranzit, prin distribufia spafiala locald a resturilor r distribulia spaliald locald a resturilor glucidice mai hidrofobe (fucozd.) respectivmai hidrofile (acid sialic).Orice modificare in cornpozifia gi distribulia glicoproteinelor membranare poate generadezordini metabolice majore prin perturbarea selectivitilii traficului membranar al substantelorbioactive. Separe cd glicoproteinele reprezintd forma principali sub care existd proteinele.Le gdsim atat sub formd circulantd (enzime,hormoni, agenli de transport, anticorpi etc.) c6t pi ca substan{eextrinsecirespectivintegral membranare (Fig.1.39.).In cazul proteinelor circulante putem aminti cd in plasma sanguini, din cele cca. 60 de tipuri de proteine exis-

Glucide. Poliglucide

47

gi a lizozimuluiplasmatente,(cu excepfia albumineit,a prealbuminei tic)toatesuntglicozilate.

resturiglucidice de glicolipidA glucidice resturi de glicoproteini I
ll IJ
'Jj

,:: I
a/

II

.l
.

'lt 'j , . ..\.

-L

, :.;;,,,;,,,,;..;,.
.

...:

jt:'f,

exterior celular
i l

: ' , , ' " 't ,

'lr::11:l j

' a r ' , '' . , , .

t-

,,,

-';

,,,;;.
l

',:'

11 , t

..,::: '.
i'

:"

"'":'.:.I ,,

' ' , ' ' : .' 1, : .t, .

:j jjji:: .i . 1 l i:i'r ': "''

::

,,,,:::,,

..',.. I
::: .:

t-_

membranl celulard

pfOteini membranari

. interior celular

Fig.I. 39.Pozifionarea comPonentelor"ili::r;"

Utlipidice glicozilate tn membrana

Ioncliunea glucidei cu componenta proteicd se face in cazul glico(Fig.1.40): proteinelor prin douAmoduri fundamentaJe

tH.oH

l-o..Xn"o"n'

|Y",.*o.
, NHCOCH3

GlcNAc
NHCOCH3
a-N-scetilSrlsctozrminr legsti h un i6t dc treotrini

ol
OH

lcgrtl P-N-rcetilglucoailinr h un relt de rsprrrginintr

wMan(a1,6)a
p1,N)Asn p1,4)GlcNAc( Man(p1,4)GlcNAc( * Van(a;,3/

Fig.1. 40. Modele ale joncsiunilor de tip O- Si N-glicozidice lntre componenta proteicd Si cea glucid.icd.

3 Albumina sericd este o proteind de transport a numeroase substanle precum acizi gragihorrnoni, ioni gi substanle medicamentoase.

Elementede biochimie .1,

I prin legdturi de tip N-glicozidic (prin intermediul azotului ami_ dic al asparaginei). Asparaginade legdturd din glicoproteinele legate N-glicozidic se gisegteintotdeauna intr-o ambianld de tipul Asn-X-ser sau Asn-X-Thr unde X poate fi orice aminoacid, rrr&i pufin prolina, Asn asparagina, ser- serina,iar Thr- treonina. Motivul joncfiunii N-glicozidiceprezentat in fig', se continui cu doud structuri identificate in marea majoritate a cazurilor:

Sial-

Y"n T:',' y"n

Man-

Gal GlcMc

tl

SialGal GlcMc

SialGal

Y.n

Man,

\^#
I I

,Man

-Man

MAnl

tl t\

9.Mt
an

)r,n -M5n
GlcMc
Glcll|Ac

GlcMc GlcMc
-

I I

Asn-X-Ser-

Asn-X-SerGlcNac- NacetilglucozaminE Gal- Galactozi Man - Manozd Sial-- Siatat

Fig. I. 41, structuri gricoproteice triantenare regate N-gticozidic

o prin legdturi de tip o-glicozidic (prin intermediul serinei,treoninei sau hidroxilisinei). Acest tip de legdturd este mai sensibili la acfiunea alcaliilor, cel mai frecvent tip de joncfiune o-glicozidicd este s_N_ acetilgalactozamina(GalNAc)legati de treonind. se intdlnegte la glicoproteinele de grup sangvin, grobulinele plasmatice, la unele glicoproteine membranare. La ciuperci gi drojdii se lntdlnegte frecvent joncgiunea B-manozi (Man) - serind sau treonind. ln plante, arabinoza (Ara) se leagd de hidroxiprolind printr-o legiturd o-glicozidici mai rezistenti la alcalii decdt celelalte. s-au mai identificat 9i alte glucide, precum

Glucide, Poliglucide

49

B-galactoza(Gal), a-L-fucoza, (Fuc), cr- Ei P- glucoza (Glc), B-xiloza (Xyl).Componentele esenfialeale tutoror glicoproteinelor O- glicozidice sunt, pe langd cele mai sus menfionate, manoza, fucoza gi acidul sialic (N-acetilneuraminic sau NANA), ultimele doud fiind intdlnite la glicoproteinelecirculante. Glicoproteinelecu joncliune O-glicozidicd sunt extrem de diverse ca func{ionalitate gi rdspdndire. O menliune aparte trebuie fdcutd pentru mucine, o categorie de glicoproteine care se gdseqtein tractul gastrointestinal;i cel respirator, cu rol de protec{ie asupra membranelor celulare externe.Aceste glicoproteine, cu masi molard relativ ridicatd, acoperd lungimi remarcabile la scard. moleculard (de ordinul a 1500-2000 A), protejdnd astfel suprafafamembranard. Conforma$a relativ rigida gi gradul mare de hidrofilie duc ia crestereaIocald a viscozitdfii, ceea ce reprezintdo barierd protectoare suplimentari. Multe dintre O-glicoproteine sunt atagate membranei plasmatice. Prin glicozilarea catenei in zona extracitosolicd,catena polipeptidicd este forfati prin interacfiunile cu componentele glucidice sd adopte conformafii cu grad de impachetare cat mai redus, care pot fi stabilizate de mediul hidrofil extracitosolic.Dupa extinderea amplasdrii catenelor glucidicepe componentaproteicdse disting doud tipuri de O-glicoproteine membranare: tipul I reprezentat de leucosialind, care posedd intreagapo4iune extracitosolicdglicozilatd, asemeneamucinelor qi tipul II reprezentat de receptorul LDL (Low Density Lipoprotein receptorreceptorul lipoproteinei de densitate redusd), in care doar o portiune adiacentdmembranei plasmice este glicozilatd,capdtul terminal, extracitosolic rdmdndnd neglicozilat gi in consecinfd, datoritd resturilor hidrofobe ale aminoacizilor din aceastdpo4iune, va adopta o conforma1ieimpachetatd, aptd sd recunoascdgi sd interaclioneze cu biomolecuIelespecific e (Fig. 1.39.) Secventaqi modul de legare al unitdfilor glucidice in glicoproteine, degisunt aparent aleatorii, prezintd un determinism strict ce constituie un veritabil limbaj de comunicare intercelulard (prin intermediul glicoproteinelormembranare),intre celule Eidiferili hormoni, particule virale saubacterii. Cdtevadin exemplelede mai jos vor oferi o imagine asupra extinderii funclionalitdfii proteinelor prin glicozilare.

50

Elemente de biochimie .1,

it'illii
Glicoproteine tip I (cap extracitosolicglicozilat total) Glicoproteine tip II (capextracitosolicneglicozilat) Fig. 1. 42. CeIedoud tipuri fundamentalc de gllcoproteine membranare

A) Cronomarkeri glicoproteici Componentele glucidice ale glicoproteinelor pot constitui etichete pentru circulafia sau distrugereaglicoproteinelor. Spre exemplu, la suprafala celulelor hepatice acfioneazdaga-numitul receptor asialoglicoproteic. Acesta nu interacfioneazi cu glicoproteinele care posedd ca unitate terminald acidui sialic (imunoglobuline, hormoni peptidici). Acesta este insd indepdrtat cronobiologic de sialaze specializate,existente pe suprafafavaselor sangvine,lasAndliberi manoza, ori galactoza care estecomponentul adiacent.Manoza (galactoza) deveniti astfel terminal5., este recunoscuti de receptor, legatd de acesta,realizdndu-se astfel condiliile intrarii glicoproteinei in celula (endocitozA). ln interiorul celulei glicoproteina va fi hidrolizatd de echipamentul enzimatic existent. B) Abilitdli anticongelante ale glicoproteinelor. Un exemplu interesant de glicoproteine cu legituri O-glicozidice la joncfiunea glucidd - polipeptide il constituie compugii identificali in sdngelepegtilor care trd.iesc in apele reci (-1,9oC)din regiunile arctice 9i antarctice. comp onenta p eptidicd are secventa:[Ala-Ala-Thr].,-Ala-Ala, cu n = 4,5,6,12,17,28,35,45 sau50.

Glucide, Poliglucide

51

Gq'.lAc

* @w f"f" ts
ctct{Ac

uL-

-Yf

\nd

GliMc

clcMc

-AsrX_SsE

{o*" @

Nu exist6 legare pe receptor

Legaremoderatede receptor

6"u"
Glc|\{Ac I

-AsrX_Ss_

Legare

putemicS

de receptc

Fig' I' 43' Desialarea succesivda glicoproteinelor m^dreste succesiu afinitatea acestora pe receptorii asialoglicopr oteicl

.|on
)

,Jon
I
I

1*,
I

)
Fig. 1.44. Glicoproteind antirongelantd

Fiecarerest de treonind este glicozilat cu o dizaharidd p-galactozil(l-3)-cr-N-acetilgalactozamind. Se pare cd proprietilile anticongelante ale acestorstructuri cu aspect de bastonagmobil se datoreaza abilitafii lor de a interacfiona cu centrii de cristalizarecare apar in masa apoasa, impiedicdnd expandareacristalelor de gheald.

52

Elemente de biochimie .1.

C) Lectine Lectinele sunt proteine sau glicoproteine de origine non-imund, capabile sd lege componente glucidice libere sau conjugate.Ele coniin cel pufin doud situsuri de legare a glucidelor.AceastaexplicS, abilitatea lectinelor de a precipita poliglucidele, conjugatele glucidice cu proteinele gi lipidele precum gi capacitatea de a aglutina celulele. Degi sunt ubiquitare (segdsesc in majoritatea organismelor),surselecele mai importante sunt cele vegetale.Existenfa lectinelor materializeazdun me' canism particular de recunoa;tere celuld-celuld, bazat pe structura lectinicd (piesa) prin care se face joncfiunea. Exemple de lectine sunt Concanaualina A cu speciflcitate fafd. de resturile de D-manosil, identificatd in fasole, aglutinina din germenii de grdu cu specificitate fafd de resturile de N-acetilglucozamindgi altele, prezentatein Tab.1.3. plantelor a bacteUnul din rolurile lectinelor este legareade rd.ddcinile prin legarea specificd la riilor fixatoare de azot. Aceasta se realizeazd, componentele glucidice ale plantei gi ale bacteriei. Fixarea bacteriei Escherichiacoli de celulele tractului intestinal este mediatd tot de o lectind, bacteriand de aceastddatd. Lectinele sunt folosite ca faze stafionare in cromatografia de afinitate pentru separareaglucidelor gi chiar a glicoproteinelor. ln Tab.1.3 se prezintd cdtevadintre cele mai comune lectine utilizate, in funcfie de glucida pentru care prezintd afinitate de legare. Sunt prezentate de asemeneamotivele (monoglucida sau secvenfa) care se poate atagacompetitiv de lectind inhibdnd astfei capacitatea de legare de receptorii specifici de pe suprafata celulari (ceeace duce la inhibifia aglutindrii).
Tab. 1.3. Lectinek cel mai utiliznte in studii strrrcturale Si la iaolarea gluddelor dupd specificitatea pentru componenta glucidicd.
Specificitate pentru monoglucidi a-D-Manl cr-D-Glc orlginea lectinei Canaualiaensiformis Galanthus nivalis Lens culinaris Ricinuscommunis Erythrina crisngalli Arachis hypogea Dolichos biflorus Glycne mar Triticum uulSare Aleuria aleurontha Lotus tetragonolebus Ulex europeus I Limulus polaphenus Sambucusnigra Maackia amurensis Abret4atie ConA GNA LCA RCA ECA PNA DBA SB WGA AAA LTA UEA-I LPA SBA N'IAA Skuctura celor mal inhibitorlt mogh"tar;"h hemaglutlnaril """ GlcNAc(bl-2) Man(sl-) Manozeterminali (0-1,3) cr-Manoza+Fuc(or,6)GalNAc B-GaIterminala cal(pl-4)GalNAc Gal(bl-3)GalNAc(al-O)Ser/Thr a-D-GalNAc terminald GlcNAc(al-O)Ser/Tlu GlcNAc(Pl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc Specificitatelargf c-L-Fuc terminal Fuc(al-2)Gal(01-) NeuAc(a2-3si2-6)Gal NeuAc(u,2-6)Ga1 NeuAc(o2-3)Gal

o-D-Gal; 0-D-GalNAc

P-D-GlcNAc o-L-Fuc

cr-NeuAc

Glucide.Poliglucide

53

1.5. 1.2.Proteoglicani Proteoglicanii constituie o clasd aparte de conjugate poliglucidice. particular al acesteiclasede conjugali consti in componenta Caracterul glucidicd,numitd glicozaminoglican, care esteun oligomer format prin policondensarea unei unitili diglucidice. ln diglucida repetitive existi cel pulin o gmpare aminici acetilatdsau sulfatatd,precum qi cel pufin o grupareacidd (carboxilicd, ori sulfuricd). Glicozaminoglicanii sunt polianioni Ia pH-ul flziologic, putdnd ataga apa, cationi anorganici ori structuri cationice organice,determindnd proprietdfile vdscoelastice ale articulaliilor gi ale altor structuri supusedeformafiilor mecanice. + Structura componentei proteice este diversd. Joncfiunea dintre cele doud porfiuni, peptidicd gi glucidica, se face de reguld printr-o legdtura Omndroitin sulfat heparan glicozidicd.Aminoacidul de legdturd sulfat face parte dintr-o secvenfdrepetitivd serin5.-glicin6.Pe o catenA proteicd, miez se pot atagauna sau mai multe cateneglicozaminoglicanice. Proteoglicanii se gdsesc fie sub forma solubild, fie sub formd integral membranard. Func{iile indeplinite de proteoglicani sunt bazatepe capacitatealor de CO; a atagacomponente cationice, hidroFig.1.45.Sindecanul file, inclusiv structuri particulare, recunoscute de secvenlespecificedin componenta proteicd. Sindecanul (Fig.1.45.), de exemplu este format dintr-o catend oligopeptidicdce strdbate stratul dublu lipidic al membranei plasmatice. Porfiunea citosolicd interacfioneazd cu f,lamentele de a.ctind, elementeconstitutive ale citoscheletului,iar cea extracitosolicdse atageazd de fibronectind, o proteind existentS.in matrixul extracelular. Prin aceasta sindecanul ancoreazdcelulele de matrixul extracelular.Astfel de interacfiuni mai permit legareareciprocd a celulelor, precum pi atagarea de celuli a unor biocompuqi diferifi. Proprieti,file vdscoelastice conferite de prezenfa componentelor glicozaminoglicanicesunt bazate pe asociereamoleculelor de apd la structurile proteoglicanice odatd cu structuri cationice. Agregatelerezultate,de mare volum gi micd densitatepot acfiona atdt ca lubrefianfi

54

Elemente de biochimie ,1.

cdt gi ca medii de circulafie pentru diferite substantehidrofile. Datoriti acestor insugiri proteoglicanii sunt tntdlnifi in special in fesutul conjunctiv. Componenta glucidicd estemajoritari (95%). Dintre glicozaminoglicanii cunosculi o figuri aparte o face acidul hialuroniclGlcA(B1,3)GlcNAc(9 1,4) Acesta este singurul reprezentant 1,,. neasociatcovalent cu weo componenta proteicd. Se gisegte in agregatede dimensiuni ridicate gi se asociazdcu alli proteoglicani, cu confinut majoritar de acid condroitin sulfuric (vezi mai departe).

Fig. 1. 46.Porfiune din molecula de condroitin sulfat

Acidul hialuronic, se gisegte in cartilagii, umoarea vitroasi, cordon ombilical, lichid sinovial, dermd etc. Constituie o barierd impotriva germenilor patogeni. Este hidrolizat de hialuronidazd, o enzimi care este produsd de unele bacterii, de veninul unor gerpi, se gdsegte in lipitoare, asociatcu condroitin sulfalii in Iichidul spermatic. In cartilaj se gdsegte gi keratan sulfafii. Fig.1.46. Condroitin sulfatul, [clcA(p1,3)GalNAcG(4)SO3H(p1,4)]", (condroitin poate pozifia 4 4-sulfatul) fie in fi suifatatd fie in Galactoza pozifia G(condroitin 6-suifatul). Gisindu-se preponderent in cartilagii, datoriti grupd.rilorputernic acide, contribuie pe linga proprietdfile vAscoelasticela mineralizatea gi homeostaziaminerali a matrixului osos gi cartilaginos.(Fig.1.48.) (Fi9.1.47.).Are, Keratan sulfatul [GaIA(pf,4)GlcNAc6SO3H(p1,3)] " dupd cum se observd o structurd asemdnitoare cu a condroitin sulfatului. Structura acestuiproteoglican include un filament central de acid hialuronic, de care sunt legate necovalent la intervale de aproximativ 30 nm filamente proteice miez. Numirul acestor filamente per caten[ de

Glucide. Poliglucide

))

hialuronat estede cca. 140.Intreg complexul are o mase de aproximativ 2.106 D gi o lungime de aproximativ 2-4 pm. De acesteasunt atagateresturi de condroitin sulfat si de keratan sulfat, de data aceastacu legdturi covalente.
otl ,6qH

-oJ-5-9-o, S\----f
Acid hialuronic

tA^--v$f Condroitin-6-sulfat
! --\-'*-\

,J-1-9-o..

I
I

|
Keratan-sulfat

u*qr **t.f_\'--\

i
I

n"parina

\/'\-\ **"J+i

Fig. 1,47. Unitdfile glicoznminogllcanice ale unor proteoglicani importanfi

fiiament de hilauronat sulfat(keratansulfat) ., - filamentede condroitin legatecovalentde miozuiiproteico de filamentul de atasatsncovalnt hialuronat

miez proteical proteoglicanulul dln cartilagii

Fig. 1. 48.Structura unui proteoglican din cartilagii

Un alt exemplu esteheparina, (a 1,4) (a I,4)l @ig. 1.4 7.) sau GlcNAcGSOsH lclcA2 SO3H " u (o1,4) (o1,4) GlcNAc6SOgH I ., UdAzSO3H o poliglucidii sintetizatd la nivelul pulmonului gi al ficatului. Poseda funcfie anticoagulantS., care este asiguratdprin interacfiunea cu tromboplastina,care Ia rdndul ei inhibd acfiunea trombinei, o proteind care producecoagulareasangvine.

" Id A acid iduronic - epimerul 5 al acidului glucuronic

56

de biochimie,l. Elemente

1.5,1.3. Peptidoglicani (poliglunidele canjugate ale perelilor celulelor bacteriene) Bacteriile sunt printre cele mai primitive forme de viafd. Interiorul celulei are o presiune osmoticd ridicatd gi adeseorifluctuantd. Stabilitatea celulard esteasiguratdde existenlape ldngd membranele dublu lipidice a unor perefi rigizi. Natura chimicd a acestoraestepolipeptidio-poliglucidicd, substanfeIe respective fiind cunoscute sub numele de peptidoglicani. Bazat pe coloralia Gram (cristal violet) bacteriiie se clasificdin Gram pozitive gi Gram negativea.Structura peptidoglicanilor este diferiti in func1ie de aceastdclasificare.Astfel bacteriile Gram pozitive au un perete gros, de aproximativ 25 pm, format din mai multe straturi peptidoglicanice,care deasupramembranei celulare dublu lipidice. se gdsesc Bacteriile Gram negativeposedl un perete sublire, de aprox.2-3 pm, format dintr-un singur strat peptidoglucanic, dispus intre doud straturi dublu lipidice membranare. ln ambele cazuri peptidoglucanul este numit gi mureind (latinul rnurus - perete).Scheletulperetelui esteun polimer (p-1,4) format dintr-o succesiunealternanti de N-acetilglucozamind Ei acid N-acetilmuramic, similard celulozei.Acest polimer este reticulat la nivelul carboxjlului restului de acid lactic, prin atagareaunei tetrapeptide care in majoritatea cazurilor are stmctura L-Alanil'D-iGlutamil.L-Usil.D-Alanil. Grupareae-NHza lisinei se leagi de carboxilatul D-alaninei unei tetrapeptide adiacente, apar{indnd altei catene (Fig.1.50,), La celtrlele Gram negative legarea se face direct, iar la cele Gram pozitive legarease face prin intermediul unei secvenfepentaglicinice (Fig,1.49.). In interiorul structurii perefilor celulari se gdsescformafiuni glicolipidoproteice. ln cazul bacteriilor Gram negatiuecca. 10 % dintre resturile de D-alanind sunt inlocuite cu acid diaminopimelic care realizeaz[ joncfiuni cu secventeproteice hidrofobe care strf,bat membrana celulari externdrealizdnd ancorarea stratului peptidoglicanic. Pe lAngd aceste structuri, peretele celulelor Gram negative mai conline substanfe lipoproteice care stri.bat ambele membrane, realizdnd o rigidizare suplimentard a peretelui celular. Catenele lipoproteice gi glicoproteice, cu o secvenf6 particulard depdgesc de multe ori membrana externS.
a bacteriile care ata$eazastabil colorantul (acestarezist{ la spdlare) se numesc Gram pozitive,fatd de cele care nu atageazd stabil colorantul (Gram negative)

Ghrcide.Poliglucide

57

)uH3

u*-c\4
rNH

f\

L;Alanina 1 CF-CH3 (LAla) L E:o

tl

INH tl
I

Izoglutamat 1

tl
| |

CFI-CO'

(D-Glu)

ft,

,'ri,1,u.,,
rslutamll \--l

I E:o

ln, 1"'

L-Lisin6 (L-Lys) k= 5 k=0

L-Ala D-Glu L-Lys D-Ala

Bacterii Gran-pozilive BactefiiGram-negative

Fig. 1.49. Strucrura peptldoglicanilor din perefil bacterieni

atretc cc{ahr Sarurii Qram-ncgative

Amu atuhr Sactaii Qranaozifive

Fig.1. 50,Modelele structurii monostraturilor peptid.iglicanice la bacteriilc Gram pozitive Si Gram negative

58

Elemente de biochimie.l.

Prin secvenfa monomerice specificd, are loc interac{iunea cu alte structuri de pe suprafafa'altor celule sau din spafiul extracelularinconjurdtor. suprafala bacteriilor gram negative este acoperiti de o mullime de catenepoliglucidice care sunt ancoratein startul lipidic extern,printr-o component[ lipidici. Aceste formagiuni sunt denumite tipopoliglucide sau lipopolizaharide. Diversitatealungimii gi a secvenfeiglucidice particularizeazdcelulele, constituind veritabile etichete de individualizare, recunoscuteca atare de mediu, de alte celule asemdndtoaresau nu. ln ultimul caz lipopoliglucidele acfioneazi. ca determinanli antigenicis (vezi secfiunea legati de anticorpi), permifdnd organismului superior invadat recunoastereacelulelor bacteriene ca agenfi strdini (nonselfl. Aceastdrecunoagtereeste realizatd,de cdtre sistemul imunitar care totodatd declangeazd rdspunsul imun care duce la neutralizarea prin mijloace specificea specii invadante. ln cazul bacteriilor Gram pozitiue,peretele peptid.oglicanic, mai gros decdt la bacteriile Gram negative, dar fdrd membrana externd, conline structuri oligomerice de acizi teichoici legate covalent (Fig.l.Si). Acegti compugi sunt produgi de policondensare ai glicerofosfatului sau ribitolfosfatului. Ioncfiunea dintre monomeri se realizeazdprin legdturi de tip fosfodiestericde tipul aceloradintre nucleotide. Grupele hidroxil ale resturilor de glicerofosfat sau ribitolfosfat sunt foarte adeseautilizate ln iegdturi o-glicozidice cu mono- sau di-glucide din care cel mai adesintdlnite sunt Glc ai GlcNac.Uneori D-alanina esteriflcd acegtihidroxili. Acizii teichoici posed6 de multe ori antigenicitate, servind gi ca receptori pentru bacteriofagi.

R=HsauD-alan,. Fig. 1,51. Structura de principiu a acizilor teichoici

" secvenlespecificede care sevor lega anticorpii

CAPIT0IUI 2. Lipide
Aldturi de glucide, protide gi acizii nucleici, lipidele sunt substanfele fundamentaleale lumii vii. Rolul lor estestructural, intrdnd in compozi1iamembranelor celulare 9i ale organitelor celulare, mediind transportul selectiv al substanfelorprin acestemembrane. De asemeneaau un rol energetic important, fiind substanfele de rezervd cu cel mai mare conlinut energeticpe unitatea de masd. Sunt in generalsolubile in solvenfii aprotici, cu diferenfieri intre clase.Solubilitateain solvenlii protici estelimitatd. Chimic, in majoritatea lor sunt esteri ai acizilor gragi cu diferili alcooli (lipide simple -vezi in continuare), putdnd aveainsd gi alte tipuri de legdruriintre diferite componente.

l.1.Clasificarealipidelor
Se poate face dupd mai multe criterii, datd fiind diversitatea structurali, implicit a proprietdtilor (Fig.2.1).

cizi fosfatidici 'osfatidilcoline

osfatiililcolamine osfatidilserine
tiililinositoli Plasmalogeni

Fig. 2. 1. Clasificarea lipi.delor

60

Elemente de biochimie .1.

2.2.Lipide simple
Pe lingi faptul cd posed5.doar elementele C,H Ei O, lipidele simple sunt exclusivesteri ai acizilor gragicu diferili alcooli. 2.2.l.Acilgliceroli Sunt substanfe organice de origine naturald, esteri ai glicerinei cu acizii gragi.Pentru denumirea acesteiclasese folosegteadesea termenul sinonim de gliceride. Sunt constituenfii principali ai grdsimilor gi uleiurilor naturale. De notat diferenfa intre grdsimi Ei uleiuri, primele fiind semisolide la temperatura carnerei in timp ce celelalte sunt lichide. Sunt insolubile in apd, dar solubile in solvenli lipoflli. Se gS,sesc atit in regnul vegetal cdt gi in cel animal, indeplinind funcfia principald de substanfede rezervd. Sistematizareagliceridelor se poate face dupd natura acizilor gragi care esterificdgruparile hidroxil ale glicerinei: r acilgliceroli simpli care confin acelagi acid gras gi acilgliceroli micati cu acizi gragi diferili. Majoritatea gliceridelor naturale sunt mixte. r acilgliceroli saturafi, respectivnesaturafi o dupd numdrul grupelor hidroxil esterificate distingem: mono-, di- gi triacilgticeroli. Deoarecemajoritatea gliceridelor sunt triacilgliceroli, iar acesteaconstituie masa principald a grdsimilor, termenul de grdsime este utilizat in sens sinonim cu cel de trigliceridd sau triacilglicerol. Mono- gi di-gliceridele apar ca intermediari metabolici. Numirul trigliceridelor este aparent mare. Totugi datoritd abundenfei mari a acizilor palmitic, stearic, oleic gi linoleic ai numdrul trigiiceridelor poate fi limitat (ceilal;i acizi gragi form6,nd acilgliceroli rari). Glicerideie mixte prezintd activitate opticA in cazul in care carbonul central este chiral. De exemplu cu trei acizi gragi se pot forma 18 perechi enantiomorfe (36 de speciimolecularedistincte). Pentru a rezolva problema nomenclaturii gliceridelor mixte, care in trecut era limitatd la pozitiile crqi B, care desemnauhidroxilii secundari respectivprimari, Comisia IUPAC-IUB pentru Nomenclaturd Biochimica a introdus sistemul stereospeciflcde numerotare (,,stereospecific numbering system").ln concordanfe cu acesta,,,carbonulclin capdtul superior ai catenei glicerolului, cdnd aceastaeste reprezentatdin proiecfie Fischer,cu hidroxilui secundarln stdnga,este notat C-l". Pentru a fi diferenfiat de alte sisteme de numerotare se utilizeazd prefixul ,,sn"

Lipide, Lipide simple

61

ata$attermenuiui glicerol. (de la stereospecificnumbering). Exemplul 1-palmitil-2-linoleil-3stearil-sn-gliceroluluiesteconvingdtor (Fig.2.2.). Gliceridelese pot altera prin pastrare,in urma unor procesehidrolitice gi oxidative. Susceptibilitateala alterare cre$te odatd cu gradul de nesaturare.Legati de nesaturare este sicativitatea, proprietatea unor uleiuri (de naturd gliceridicl) de a forma pelicule in prezenla oxigenului atmosferic.
1

qi'zoH
rJ z. >n<Ll v

r
Cl-13(Cl-t2)3(Cl-l2Cl-FCFDICI-Ir)?-C-OC.. H
3:

o ll

: "ct-toFl

,P-"-(cltr)'oclt
Ct-tO-,9-(CFtz)roCF|3

GIicerina (Glicerol ul) cu atomii de carbon numerotati dupSsistemul

o
1-p aIm itiI-2-Ii n ol eiI-3 -steari I-sn-gIi ceroI

il

Fig. 2. 2. Structura Sistereochimia acilglicerolilor

In naturi, gliceridele se gesesc sub formd de amestecuri.Caracterizarea expeditivda calitafii acestorase poate face cu ajutorul unor indicatori: Ia, Is gi Ii. Indicele de aciditate (Ia) este definit ca masa de KOH (mg) care neutralizeazd un gram de grdsimela rece. Este o mdsurd a gradului de prospelime al grdsimii brute, determindnd acizii gragiliberi, provenili desigur prin hidroliza gliceridelor. Indicele de saponificare (Is) este definit ca masa de KOH care neutralizeaz1.lacald (reflux) un gram de grdsime.Se referd Ia tofi acizii graEiconlinufi in probi inclusiv cei din gliceride,care sunt elibera;i hidrolitic. Este corelat invers cu masa molard a acestora. Indicele de iod (Ii), estedefinit ca masa de iod (g) care reacfioneazd. cu 100 g de grdsime.Este direct corelat cu gradul de nesaturareal grdsimii. 2.2.2.Steride Sunt esterii sterolilor cu acizii gragi.Sterolii derivf, de la nucleul cic2.3.). I op entanperhidrofenantrenic de bazd al gonanului (Fig. Dintre derivafii gonanului se pot aminti urmdtoarele structuri de bazd desintilnite in lumea ie (Fig.2.4. ln cazul compugilor naturali, c<lnfigurafiarelativd a ciclurilor B/C 9i C/D este trans, in timp ce ciclurile AIB pot fi in pozilie trans (forme numite cr),respectiv in cis (forme numite il. Fig.2.5.) Pozilia cis, res-

Elementede biochimie .1.

pectiv trans se estimeazedup6 pozifia relativd a protonilor legali de c-5 respectiv c-10. in cazul trans: axial-axial, iar in cazul cis: axial-ecuatorial.

16 15

Estran

Androstan

Pregnan

Colan

Fig. 2. 4. Structuri steraniae tnthlnite la hormoni Si acizi bihart

Lipide , Lipide simple

63

\, '

!:rr

Sterolii poseda cel putin o grupare hidroxil locaiizatd in malontatea cu acizi graqi. cazurilor Ia C-3. AceastaesteesterificatA

Structuricr (A/Btrans)

Structuri (A/B cis)

Fig. 2. 5. Configurasii ale nucleului gonanic

Dintre sterolii mai comuni se poate menfiona colesterolul (Fig.2.6.), care este unul dintre cei mai importanfi steroli existenli in organismul animal. Pe ldngd faptul cd este un constituent important al membranelor plasmatice gi al organitelor celulare, colesterolul este precursorul tuturor steroizilor animali.

64

Elemente de biochimie,I.

Colesterol (5-colesten-3B-ol)
Fig. 2.6. Formula Si modelul structural aI colesterolului

Rigiditatea relativd a structurii ciclopentan-perhidrofenantrenice, precum s,islabapolaritate a grupdrii 3-hidroxilice, au consecin{easupra propriet5filor membranelor, in punctele care acesteail confin, contribuind la reducereamobilitifii zonale.Colesterolulesteun component al complexelorlipoproteice din sAngegi intri in constitufia pldcilor care apar in aterosclerozd.. De asemenea colesterolul participa la reglarea permeabilitdfii eritrocite, la emulsionarea grdsimilor la nivelul intestinului.

Testosteron

Estradiol

Progesteron

Cortisol

Aldosteron
Fig. 2. 7 Hormoni steroi"dici

Lipide . Lipide simple

65

Hormonii steroizi, Fig.2.7.nu intrd propriu zis in clasa lipidelor dar datorita nucleului steroidic ii vom aminti in aceastdparte: ei se pot sistematiza in androgeni, estrogeni,progestativi,gluco- gi mineralo- corticoizi.

Acid colic

Acid chenodeoxicolic

Acid deoxicolic

Acid litocolic
Fig. 2. I Acizi biliari (colici)

Hormonii androgeni precum testosteronul gi cei estrogeni precum estradiolul rnediazd dezvoltareacaracterelorsexualesi regleazdfunclia sexuali. Hormonii pro gestativiprecum pro gesteronulregleazd, cronobi ologia or,ulaf ei. Hormonii glucocorticoizi precum cortisolul participS.la reglareade ansamblu a metabolismului glucidelor,lipdelor si protidelor, in timp ce mineralcorticoizii precum aldosteronul regleazdbilanlurile ionice ale H*, Na*,K* gi Cl-. O alte clasi importantd de steroizi tot nelipidici o constituie acizii billari (Fig.2.B.). Acestesubstanfe,sintetizatein ficat sunt secretatede c6tre vezicabiliard in intestin. Acizii biliari (colici) au proprietdfi tensioactive, contribuind prin emulsionarea grd.similor la transportul transmebranar al acestora in circulafia portale Ei de acolo Ia nivelul ficatului, unde are loc metabolizarea lor. Emulsionarea grisimilor se face practic de conjugali ai acizilor biliari fie cu glicina (cdnd se formeazd de exemplu acidul glicocolic) . (Fi9.2.10.) sau cu taurina (acidultaurocolic)

66

Elementede biochimie .1.

C-.-\@Ag/--\--60

LY iI NlI "f>n r r<l-4

@-1 \ilti ii / f@

r$$\
acizi biliari

r-^@

\'lipid"

Fig. 2. 9 Stntctura micelard creeatd de acizii bilia.ri cu liptdele

Acestesubstan{eposedd pe ldngd o funcfie acidd gi o func{ie amidicd. Aceasta va forma o legdturd amidicd la nivelul carboxilului din acidul colic respectiv.Prin ionizarea funcliilor acide rezultd grupe puternic hidrofile care vor fi orientate cdtre mediu, in timp ce porfiunile hidrofobe (lipofile) ale nucleului steroidic vor fi orientate catre globula de grdsime formdndu-se astfel structura micelard (Fig.z.9.).

*H3N

c02

*rr*"\-soaTaurina

Glicocolul

care se ataseazfi. Fig. 2, 10.SubstanSe amidic de acizli colici

2.2.3.Ceride Aceste substan(eintrd.in componenfa cerurilor, alAturi de hidrocarburi, alcooli, dioli, acizi, hidrortacfui. Ceridelesunt esteri ai unor alcooli gragi cu acizii graqi.Numele le vine de la consisten{aceroasda acestor substanfe.Sunt intdlnite atAt in regnul animal cdt Ei cel vegetal.La animale menfiondm: ceara de albine care confine in principal palmitat de miricil (C16 - C30), ceara de balend, spermanceti al cdrui component majoritar este palmitatul de cetil (C16-C16),lanolina care este un amestec complex de ceride dar gi de alcooli grapi gi Ianosterol - un alt tip de sterol. La plante, ceridele se intdlnesc pe suprafala fructelor, a frunzelor gi au un rol de protecfie atdt impotriva umiditdlii, prin hidrofobic\zarea suprafefelor,cdt gi impotriva insectelor.

Lipide . Lipide complexe

67

2.2.4.Etolide Au o rispdndire exclusivvegetald,fiind gdsite in cantitd{i ridicate in cerurile coniferelor.Provin din hidroxiacizi prin dubla esteriflcarea cdte doud molecule (Fig.2.11.).Cel mai adeseain compozifia etolidelor se intdlnesc co-hidroxiacizi. rr./-on ) (I Se men{ioneazd. acidul sabinic (to-hidroxilauric HO-(CHz)n'-*oH COzH), acidul iuniperic (ro-hidroll O xipalmitic HO- (CHz) Se rs-COzH). cunosc Ei etolide la a ciror forE Etolidf, mare contribuie mai mult de doi Fig. 2. 11.Fonnarea etolidelor hidroxialcooli. Oricum, structura ciclicdesteesteo caracteristicd esentiala a acestei clase.

ll

"\

"\/+

2.3.Lipide complexe
Lipidele complexe reprezintd o clasa de substante cu mai mult de trei tipuri de atomi in moleculd. Majoritatea confin acid fosforic, legat fosfoesteric. mai rar fosfoanhidridic de alte molecule, 2.3.L.Fosfatide Sunt componentelemajore ale membranelor celulare.Ca termeni sinonimi se utilizeaza:glicerolfosfatide,fosfogliceridesau glicerofosfolipide. Sunt substanle greu cristalizabile,solubile in solvenlii aprotici, cu exceplia acetonei, care ii precipitd. Sunt insolubile in apd cu care pot forma emulsii. Sunt mai reactive decdt acilglicerolii. Caracteristica esenlialSesteparticiparea la structura acestorsubstanfea glicerolului, a acidului fosforic, a acizilor gragigi opfional a altor componente. 2.3.1.1. Acizi fosfatidici Grupul acestorsubstanfe,cel mai simplu structural din clasd,posedd structura de bazd a tuturor fosfogliceridelor flind precursorii acestora. (Fig.z.12.) Sdrurile (fosfatidalii) alcaline, de amoniu, calciu gi magneziu sunt solubile in apd. ln constitufia lor intrd preponderent acizii palmitic, stearic, oleic,linoleicEi linolenic. Au fost identificafi in cantitate apreciabil[ in plante gi bacterii. Derivali ai acizilor fosfatidici, formafi din doud unitdfl de acid

68

Elemente de biochimie .1,

fosfatidic gi una de giicerol, sunt cunoscuti sub numele de cardiolipide (cardiolipine), dupi locul unde au fost izolate prima dati (miocard). (Fig.2.13.)Sunt folosite in unele reacfii serologice (Reaclia Bordet Wassermann).

gH2o@R2 i

Rlcoo-?- t
=l

? o
t1

CHrO-P-O-il

Fig.2. 12. Fosfatidat

cH2o-P-o-cH2 . rI p'699r,,,,..f.,,,,,rH 6 I

o tl

n4cog o \ .',""CHzocOR3 - O- ll O- Cgrgrr"""'rt' 9nt ?Hori-H

cHrocon2

Fig. 2, 13. Cardiolipind (cardiolipidd)

2.3. 1.2. Colinfo sfolipid e Termeni sinonimi: Iecitine, fosfatidilcoiine, colinfosfatide.Sunt substanle amfionice, datoritd prezenfei atdt a restului acid al acidului fosforic cAt qi sarcinii pozitive la atomul de azot al betainei 2aminoetanolului (colina) (Fig.2.14.).Sunt extrem de rdspdndite,atdt in regnul vegetalcdt gi in cel animal. Rotescla dreapta planul lumini polarizate.

Lipide . Lipide complexe

69

n'coo-!lijT-o-""' CH -\\
o

gH2ocoR2 io

@
N(CH3)3

Fig. 2. 14. Lecitine (colinfosfatide)

pe solubilitateain etanol Ei insolubilitatea in Extracfialor se bazeazS. acetond.Surseiecele mai comune sunt gd.lbenuqul de ou gi seminlele de soia. Posedi, patru legaturi esterice. Sclndarea legdturii esterice din pozilia 2-(sn)conducela lizolecitine,compugi extremde toxici, cu acfiune puternic hemoliticd. l.izolecitinazele,prezente in veninul de cobrd explica acfiuneamortald a mugcdturii. 2.3.1.3. Colaminfo sfolip ide. Sunt asemdndtoarestructural cu colin-fosfolipidele cu deosebireacd (colamina). in locul colinei se gdsegte 2-aminoetanolul(Fi9.2.15.) QH2OCOR'

Rlcoo-!:: !o^--""'.^,,.rR"' CH2O\'nz - \ \ P-C

o
r^ig. 2. I 5. Cefaline (colaminfosfatide)

Deoareceau fost izolate prima data din creier au primit numele de cefaline.lnsolesccolinele,dar au o concentrafiemai redusd,cu excep1iacreierului unde predomina. 2.3.1.4. Serinfosfatidele confin serina legatd fosfoesteric de acidul fosforic. (Fig.2.16.)Au fbst izolate din creier, din frac{iunea cefalinicd. Aici serin-fosfolipidele reprezinta cca 50Vo din totaiul fosfolipideior, fiind prezente sub formd de potasiu. Nu au fost identificate insd in gdlbenugulde ou. Sunt sd.ruride mai acide decdt colinele gi cefalinele gi au o solubilitate mai redusd in alcool etilic. Intervin in metabolismul intermediar ca donori de acid fosforic.

Elementede biochimie .I.

qH2ocoR2

Rlcoo-9-,
:l

?"
O p,,,f
I

cH?o-P_o-cH, -il\-o

coz

ruN@
Fig.2. 16.Serinfosfattde 2.3.1.5. Acetalfosfatidele (plasmalogenii). Au o structurd asemdnitoare colaminfosforipidelor,qi mai rar cu a colinfosfolipidelor.
s--R2 H \i o--ru :'?

*ato=-i-" \
n'cooz-Y\H / :_P-g4.o C|6o..---il'-Oll n
nO

*rrrctor--g--H ?n (D n-.--i.--^-cn, " br1-Ntct11' |] n

slructurdacetalicd

bn;- Ncttdr

-ac strudu re acetal i Iali cd

Fig. 2. 17. Structuri acetalice Si acetal-acilalice ale plasmalogenilor OH

EH

nlcooz'l\n I q^ . ioo..-|,-e-CHz ' br6trtcttrl' ll n

stucturd semiacehlicd

;oo

QH2o./'\cHr-*t :

gH2olc\cH-R2

nlcoozY\H I e'to--;--g-cn' ll o

;oo

@ bHf-N(cFl's

stucfurt viniletericd

Fig. 2. 18 Structuri semiacetaliceSi uinil.etericeale plasmalogenilor

Diferenfa constd in faptul cd cel pufin o grupare hidroxil din molecula glicerolului este legatd semiacetalicde o ,,aldehidi grasa".Acegti

Lipide. Lipide complexe

7l

compu$i au fost identificali cu ajutorul reactivului Schiff, specific dupa cum se cunoa$tepentru aidehide. Datorite reactivitdtii structurilor, formele semiacetalice, acetalice,vinileterice gi acetal acilalice, (Fig.2.17.gi 2.18.) sub care au fost identiflcate pot fi rezultatul unor transformdri ce au loc in decursul extrac{iei, deci artefacturi. Certd rdmdne identiflcarea formelor aledehidice (reduse) ale acizilor gragi care explicd toate structurile intdlnite. 2.3.1.6. Ino sttolfo sfatidele.
gFt ocof

n'coo-9-H P
o

ct-t"o-P-o -tl
monofo{oinoitidd

gFhocof *r.oo.!-s pO
cliro-P-o tl
n

difodoinodtidd

gt-t ocoR,

n'coo'9-H 90 ct-r"o-P-o 'il

n

L---./-4-on"' .,/-=T<f-oeo;,
trifogolnodtid^

^ll -/".-f=- i .a
_unz
-:

o
\rr |
l_

.t_ \4=t

oPo.-'
oPoi2

ntcoo'c,.-H n A Lnu'uuJ"

"'"^'\

oo
offo,,oinodude crcrice

Fig. 2. 19. Inositolfosfatide (fosfoinositide)

Sunt fosfogliceridecare conlin de reguld mioinositol aldturi de glicerol, acid fosforic ai acizi gragi.Mioinositolul esteunul din izomerii inositolilor, care sunt hexitoli ciclici. Acesta posedd un hidroxil axial, restul fiind ecuatoriaii. ln func;ie de numdrul resturilor de acid fosforic din molecula acestor substanfe tipurile identificate se sistematizeazd. in inositol monofosfolipide (monofosfoinositide), inositol difosfolipide (difosfoinositide) gi inositol trifosfofolipide (trifosfoinositide). De asemenea a fost identificatd in creier o fosfatidildifosfoinositidd,ciclici, flecare rest de acid fosforic poseddnd doud legdturi fosfoestericegi doar un rest acil organic (Fi9.2.1.9. Inositolfosfolipidele sunt mai rispdndite in canin regnul vegetalgi la bacterii decdt in cel animal unde se gd,sesc titd.firelativ ridicate in creier. ln unele organisme s-au identificat derivali ai inositidelor, care conlin resturi oligoglucidicelegatede nucleul inositolic.

de biochimie'l' Elemente

2.3.2.Sfingolipide sfingolipidele sunt li$ide complexe, care in locul glicerolului contin un aminoalcoolnumit generic sfingoid, cu o carbocaten6lungd(cel mai de 18 atomi). S-au identificat peste 30 de astfel de aminoalcooli adesea dintre care cei mai comuni sunt D- sfingozina (2-amino-octadec-4-en1,3-diol),D-sfinganina (dihidrosfingozina) 9i fitosfingozina (2-aminoultimul fiind gisit in regnul vegetal tetrol), (Fig.2.20) octadecan-I,3,4,5 Eila unele microorganisme. cH3-(cH2)11 ,..c\a-H

cru-(cH2)1\
CH3-(CHz)r1
H-C..OH

"t^"r,

H-f.-on
H-.C-NHz cH2-oH Sfingozlna

tH*C.-OH
H--C..NHz cH2-oH

H-l..oH
H-6-OH I
H-C-NHz dHr-oH Fito*lngozlna

Sflnganlna

Fig.2. 20.Sfingoide tntllnite tn compozilia sfingollpidelor

sfingoidele se gdsescsub forma unor amide numite ceranxide,obl:icei nute piin acilarea grupirii amino cu diferifi acizi gragi dintre care mai comuni sunt rt"uri., Iignoceric, nervonic, hidroxinervonic ai cerebronic. Ceramidelereprezinid de fapt precursorii tuturor sfingolipidelor' (conceramidele se gasescdestul de pu,tin raspdndite in organisme de centratii reduse in ficatul, splina qi pulmonul animalelor), ele fiind poate reguld oblinute prin hidroliza menajatd a sfingofosfolipidelor.Se bazi face deci o analogie cu acizii fosfatidici, considerafi ca structuri de ale glicerofosfoliPidelor. 2.3.2. 1. Sfingofo sfoliP idele legat sfingofosfolipidele confin in moleculd o ceramida, un rest fosforic unul la hidroxilul din pozilia I 9i un rest de colina (la sfingomieline) sau de colamind legate fosfoesteric.Cele mai rdspdndite sunt sfingomielide nele. Cele din substanfa cenuqiea creierului confin cantite$ ridicate sunt acid stearic. Alli acizi gragi prezenli in moleculele de sfingomielina 1)' acidul palmitic (Ci6), Iignoceric,nervonic (Fig'2'2

Lipide . Lipide complexe

73 -palmitic -stearic -lignoceric -nenonic

cH3-(cH2)11
RCO2H

H'lc\c'lH H-C-OH
H-C-NFI-CO-R

I
I

I cH2-oH

r^R lr r-o-r,, g-.r/. v' '2 1.n.1. to" (

Sl?ngofosfolipide (Sfingomieline)

Ceramida

I H3C-(CH2)t-CS
H3C-(CH2)22-CO2H Acid lignoceric (C24)

H .C-H

(CHz)r-COzH
Acid nervonic (Als lignoceric) H

H3C-(CH2)zr-C,H-CO2H I OH

I ltsc-(cH2)z-C.

\\. C - H

(cH2)r2-cll-co2H
OH Acid cr-hidroxinervonic

Acid cerebronic (C24-o-OH)

Fig. 2. 21 Cerami.daca precursor gi sfingomielinele

2.3.2.2. Sfingoglic olip id,ele Sfingoglicolipidelediferd de sfingofosfolipide pdn faptul cd atomul C-l ai ceramidei este legat o-glicozidic de o monoglucidd (cerebrozidele gi sulfatidelesau oligoglucidd (gangliozidele). Cerebrozidele, au fost identificate in regnul animal. ln pozilia C-t ele posedi un rest de B-D glucozd sau P-D galactozi. Primele se gesesc in splini gi mucoasa intestinali, celelalte doar in creier. Dupd natura acidului gras legat amidic de structura debazd,aminoalcoolicd, distingem cerazine,cerebrone,neruone;i oxineruone. (Fig.2.22) Din structurd reiese c5.cerebrozidelenu posedd grupdri ionizabile. Toate cerebrozidelesunt greu cristalizabile, de reguli prezentdndu-se

/+

Elemente de biochimie ,1,

ca o masAceroasA, solubile in cloroform, acid acetic (precaufiela transamidare!), piridini gi insolubile in api, etanol rece,eter etilic Ei eter de petrol.
-cerebronic - cerebrone -lignoceric - cerazine -nervonic - nervone -oxinervonic- oxinervone

c H-. - ( c H - ,')t, , "'-c\"-H

RCO.H

cH.-(cH,)," -1 ","\a,"'
II-C-.OH

r-J.-o"
n--l-"r,-.o-*

u--l-*",
Pslhozina

t".

Cerebrozide

Fig.2.22

Prin hidroliza legiturii amidice, din galactocerebrozidasfingozinei de obline psihozina, un intermediar in biosintezagalactocerebrozidei (Fig.2.22). Sulfatidele sunt derivafi clIl-(clIr)r, sulfatafi ai cerebrozidelor (Fig. RCqH 2.23). Au fost identificate in ,a[=-t' -ligrloceric -nervonic creier,in porfiunea medulard a r*f-on suprarenalelor. Resturile de "-tr-**-co-R acil cel mai adeseaintdlnite in structura sulfatidelor din mamifere sunt cel mai adesea provenite de la acizii nervonic Sulfatide gi lignoceric gi mai rar acizli Fig.2.23 oleic, stearicqi palmitic. Gangliozidele au structurd asemdmdtoarecerebrozidelor, cu diferenla ca in structura lor apar oligo sau poliglucide care confin N(NAG),N- acetilneuraminat (NAM) galactozdgi glu acetilgalcatozaminS. coz\, (Fig.2.24).Glucoza este in majoritatea cazurilor legatd de restul ceramidic printr-o leg5.tur5. B-glicozidicd.Compozifia lor este destul de complexd,componenta glucidicd putdnd conline p6nd la 100 de unitdli monoglucidice. O altd caracteristicdeste absenla sau concentratia extrem de redusd a acizilor gragi nesaturafi din componenta unitifii ceramidice. Prezenfa resturilor sialice in molecula gangliozidelor le conferS. caracteristici (poli)anionice gi evident puternic hidrofile la pHul fiziologic.

Lipide . Lipide complexe

/J

ln ciuda faptului ci se gd.sesc in cantitifi foarte reduse in membraglicosflngolipidele nele celulare, prezentela suprafala celuiei determind funcfii importante precum recunoa$tereacelulard gi imunitatea tisula16.Gangliozidelese gdsesc cu precdderein terminafiile celulei nervoase fiind implicate direct in transmisiaimpulsurilor nervoase.
p -D-galacbza B-N-adilgalatueine

II]\NtIY-1;
OII

otl

T6)

"J

I Ac N{cdilncuraminic

Gangliozidd Fig.2.24

Atdt glicerofosfolipidelecAt gi sfingolipidele au o structurd amfipaticd formatd dintr-o zond (cap) hidroflld, gi doud cozi hidrofobe (Fig.2.25). Acest tip de structurd se orienteazdin orice mediu, cu porfiunile careprezintd similaritate cdtre acel mediu.

Cap polar (hidrofil)

* -B x.o
El tr

XE

Fig.2. 25.Modelulamfipatic al fosfolipidelormembratuue pe o exernplifrcat colaminfosfatidd

76

Elemente de biochimie,l.

2.4. AJrte lipide

Existi o serie de alte substanfe care nu intrd in categoria lipidelor simple sau complexe. Dintre acesteavom aminti glicozilglicerolii, terpenelegi icosanoizii. 2.4.L.Glicozilgliceroli

oll |

Cf{r-OCOR2 I 1"" RIco+-H

\--\----o., \\ Ho-1--'nL-o
OH CalcdoaudtocUgfc.rol

!,.

Srt olog Iu oLil d lact lg ilc. tu I

4ig alc ilo zUI i ! cIIg It c.r oI

Fig. 2. 26. Glicozilgliceroll neutri Si acki (sulfatafi)

Vom arninti monoglicozilacilglicerolii,sulfomonoglicozilacilglicerolii gi diglicozildiacil glicerolii (Fig.2.2A. 2.4.2.Terpene Eiterpenoide Reprezinti o clasd de substanfe extrem de rdspdndite in lumea vegetali, dar prezente totugi in cantitdli apreciabile gi in lumea animald. Solubilitatea redusi precum gi participarea unora la constitufia straturilor bilipidice le plaseazl.in categorialipidelor. Termenul de terpend.se utilizeazd pentru a desemna o substanfdformatd dintr-un multiplu intreg de 5 atomi de carbon, iar cea de terpenoidd, desemneazdo substanfd cu numdr diferit de multiplu de cinci al atomilor de carbon, dar care,metabolic provine dintr-o terpen6. Unitatea de cinci atomi de carbon este izoprenul (2-metil-1,3prin di- tri-.., merizare a izoprenului (notat de butadiena).Repetarea multe ori ip) duce la formarea familiilor de terpene gi de aici, a celor de terpenoide.Ioncliunea dintre doud unitdti de izopren se face coadi-cap (ipip) sau coadd-coadd (ippi).6 De notat cd terpenele sunt in cele mai multe cazun forme modificate chirnic (oxidate,reduse etc.) ale produgilor de oligomerizareai izoprenului.

o Prin cap desemnd.mextrernitatea ramificatd a catenei izoprenice.

Lipide . Alte lipide

Cu excep{iahemiterpenelor, sesterpenelorgi a cauciucului natural, foarte adeseacelelalteterpene apar sub formd de esteri pirofosforici ca intermediariin procesemetabolice. Clasificareaterpenelor se face dupd numarul unitdlilor izoprenice din structura compusului (Tab. 2.1):
Tab. 2.1. Clasificarea terpenelor
Nr. de atomi de carbon li:<emple structurd
numg

Tip

Flemiterpene

)-'.

rzopren

Monoterpene

10

geraniol

Sescviterpene

farnesol

Diterpene

20

Geranilgcraniol

Sesterterpenc

25

Ofiobolina A

Triterpene

30

Scualen

'l'etraterpene

40

Fitoen

Cauciuc Politerpene n nautral

78

Elemente de biochimie ,1.

Hemiterpenele Terrnenul de bazd, izoprenul se gesegte liber in concentratii extrem de reduse.Tot aqase gdsesc gi derivalii A2A3-izopentenilpirofosfat. ai Monoterpenele Confin doufl uniti]i izoprenice (10 atomi de carbon), Se gdsescin special in plantele superioare,reprezentanlii ior fiind utilizali datoritA mirosului lor in industria de parfumerie. In plantd se gdsesc in formaliuni secretorii,de unde pot fi recuperateprin diferite metode (antrenare cu vapori de apd sau extracfie cu grdsimi - (tehnica enfleurageutilizatd in parfumerie de secolein Franfa)-, sub formd de uleiuri esenfiale. Sescviterpenele Reprezintd cel mai divers grup de terpene atdt ca numdr de specii, cAt 9i ca structura, in prezent fiind cunoscute cca. 200 de carboschelete sescviterpenice. Segf,sesc de reguld asociatecu monoterpenele Diterpenele $i acestgrup este numeros. Dintre cei peste 500 de reprezentanli cunoscufi o notf, aparte o fac giberelineie, substanfe cu funcfie fitohormonal6. Sesterterpene
18

Fi9.2.27. Ofi.obolanul Conlin 25 de atomi de carbon, deci cinci unitdfi izoprenice. Cei mai cunoscufi reprezentanfi sunt cei din familia ofiobolanului al ciror termen parental este prezentat in (Fi9.2.27.).Acegti compugi au fost identificafi in fungi. Ofiobolanul A, un exemplu al acestei familii, este prezentatinTab.2.1. Semai cunosc incd cinci grupe de termeni. Triterpenele gi triterpenoizii Sterolii sunt triterpenoizii cei mai cunosculi ai acesteiciase.Au fost prezentafi la lipidele simple.

Lipide. AIte lipide

79

Tetraterpenele Cei mai importanfi reprezentanfi sunt cele cca. 500 de carotenoide cunoscutepdna in prezent. Datoritd sistemului de duble legdturi conjugate acegtipigmenfi sunt colorafi. Se gisesc atat in organismul animal dar mai alesin cel vegetal.Aici, in cloroplast,formafiunea infracelulard unde se gf,sesc,ei joaci atAt rolul de pigment fotosensibil, implicat in fototransmisia semnalului luminos cdt gi de substanfd antioxidantd. ln organismul animal, carotenoidele,in special cele de tip hidrocarburic, numite caroteni,joaci rolul de provitamind A (vezivitaminele) 2.4.3.Icosanoizi Sunt o clasd. de substanfelipidice derivate din glicerofosfolipidecare poseddla 2-(sn) ataEatun rest arahidonil. Caracteristicaacestuigrup de substan{e este cd au 20 de atomi de carbon, de unde gi numele (icosanul este n-alcanul cu 20 atomi de carbon). Acfiunea icosanoizilor constdin medierea proceselorinflamatorii, reglareatransmiterii impulsurilor nervoase,reglareaagregdriitrombocitare, stimularea contractiei musculaturii netede etc. Func{ia hormonald a icosanoizilor este locald, ei ac{iondnd in concentrafii extrem de scdzutegi doar aproape de locul sintezei datoritd duratei lor de via15 reduse, de ordinul secundelor eventual al minutelor. Substanfade origine a biosintezei lor este acidul arahidonic (acidul icosa-S,8.11,14 tetraenoic).(Fig.2.2B) ln stare liberd.,concentrafiaacidului arahidonic este neglijabili. Din glicerofosfolipidelecare il confin, el poate fi eliberat in doua rnodalitdli. ln primul caz, sub acfiunea unei fosfolipaze (fosfolipaza A) se hidrolizeazd legdtura esterica 2-(sn) din fosfatidilcolini. ln celalalt caz, observatdoar la fosfatidilinositoli, inifial iar apoi din diacilglicerolul rdmas, sub acfiuse indepdrteazS"inositolul, nea unei noi lipaze (fosfolipaza C), va fi eliberat restul de acid sub control arahidonic. De menfionat ci ambele procese se desfdgoar5. hormonal. Acidul arahidonic poate fi transformat in doud moduri care vor determina tipul de icosanoizi care vor fi sintetiza;i. ln primul caz, sub accare confine o componentd {iunea prostaglandinendoperoxidsintazei, ciclooxigenazicdgi una peroxidatici se vor forma succesivdoui prostaglandine particulare, PGGzgi PGH2,(Fig. 2.30.) de la care vor deriva celelalteprostaglandine gi tromboxanii. Cea de-a doua caJe,utilizeazd' lipoxigenazacare duce la formarea leucotrienelor.

80

Elententede biochimie ,I,

Prostaglandinele au fost primul tip de astfel de substanfe descoperite. Ele au fost identificate in lichidul seminal,fiind presupus a fi sinte_ tizate de cdtre prostatd, gi av6nd un efect constrictor asupra miomet_ ruiui. ulterior, s-a demonstrat ca prostaglandinelese formeazd practic in toate lesuturile mamiferelor.

Acidul arahidonic

Acidul prostanoic

Fig. 2. 28 Structurt de bazd ale icosanoidelor

se cunoscg tipuri de prostaglandine codificatecu pGAi - pGIr.Toate acestesubstanle derivd de la acidul prostanoic (Fig.2.2s). caracteristica lor este prezenfa unui ciclu ciclopentanic. Indicele semnificd numdrul de duble legdturi neciclice. Prostaglandinele E (pGE) (Fig.2.29) posedaca elemenr distinctiv prezenfa unei grupdri carbonil la c9 precum gi a adoud grupdri hidroxil si una (PGE'), doud (PGE,)sau trei duble legdturi (pGE3). Numele le-a fost atribuit de descoperitoriiBergstromgi sjovail in rg60 datoritd solubilitilii lor in eter, prin care se deosebescde prostaglandineleF (pGF), solubile in tampon fosfat.

PGE,

PGE3

Fig. 2. 29 prosuglandine F

PGF sunt derivafi cu gruparea carbonil din pozi{ia 9 redusd la hidroxil. Dupd cum noua grupare hidroxil este trans sau cis in raport cu hidrogenul B, acesttip de prostaglandineprimesc numele cr,respectiv p. PGA' PGB gi PGC sunt produgi de eliminare a hidroxilului I t din pGE (Fi*.2.31.).

Lipide . AIte lipide

81

ciclaoigenaza

.2o2

fl>-l t( |

| I 6-o-"

- "o,t
PGG:

ffit"'
Frcxidaza

t Tt'>i--'------,,,^.,t( |

to,*

ffitt'
Fig.2. 30. Transformareo rirri]ru, acidutui arahidonic "nooor)*ra PGD difera de PGE prin inversareaOH-ului din pozilia ll cu carbonilul din pozilia g.
\\n \\l

t.
\

Y-"*

,ry',\>-f
I z //"t

----

\-{ JfPGE

-\-\

\\

q,
\

l-i

"\i
( \/^ li
PGB

\z\
PGc

Fig. 2. 31 Formele deshidratate ale prostaglandinelor deriuate din PGE

,.**_.ffi
tl
tromboxanul Q
TXB2

tnn fucozH

Fig.2.32

PGGqi PGH sunt peroxizi derivafi din PGF. Medicamentele antiinflamatorii (aspirina, indometacinul, ibuprofenul etc.) inhibe acfiunea ciclooxigenazicda prostaglandin endoperoxid sintazei.Mecanismul acesteiinhibitii constd in inactivareaprin ace-

Ehmentede biochimie ,I.

tilare (acilare)a unui rest de serine. In acest mod se inhibe sinteza tu_ turor prostaglandinelor respectiv a tromboxanilor, prin aceasta influenfdndu-se rispunsurile inflamatorii gi trombocitare prostaglandin dependente. In locul ciclului pentanic din prostaglandine, tromboxanii (Fig.2.33.)au in structura lor un ciclu de gaseatomi cu oxigen (ciclu oxanic). Numele le deriv5 de la acest ciclu gi de la directa implicare in agregarea plachetard (formarea trombusului). ln plus tromboxanii provoacdvasoconstricfiecoronariani.

Leucotriena &
Fig.2.33

Leucotrienele (Fig.2.33.)reprezintd cea de-a treia mare clasi de icosanoizi. Numele le derivd de la leucocite,unde au fost descoperite gi de la cele trei Iegdturi duble conjugate. Ele se formeazd din acidul arahidonic prin acfiunea lipoxigenazei.Aceastdenzimi nu este afectatd de antiinflamatoarele care inhibd prostaglandin endoperoxid sintaza. Caracteristicaleucotrienelor este cd nu con{in nici un ciclu, fiind doar derivati oxigenali ai acidului arahidonic. Acfiunea lor se manifestd prin crestereapermeabilitdfii vasculare.

2.5. Membrane biologice

2.5.1.Caracteristici generale Sunt formafiuni de naturi lipoproteicd care delimiteazd celulele de mediul exterior, organitele celulare de citosol. Funcfionalitatea membranelor, ca rezultat al interacfiunii lipide - proteine nu se limiteazi doar la separareasistemelormicrobiologice (celuli, organite celulare)ci se manifesti prin realizareatransportului selectiv,prin membrani, recepfia unor semnaledin mediu, reacfii chimice specifice.

Lipide . Membrane biologice

83

Spaliu erttacilosolic
_fragment oligoglucidic

gticoproteind
glicolipidd colesterol

proteind p r otei nd ihrcgra I Perife r i cd membranard filamente ale citoschelehtlui

Citoplasmd

Fig. 2, 34. Structura unui fragment de membrand plasmaticd

ln pofida diversitdlii funcgionaletoate membranele biologice poseda o seriede caracteristicigenerale: | fiecare membrand este un fllm foarte subtire, format din molecule lipidice gi proteice. Integritateamembranei este menlinute prin interacfiuninecovalente. t moleculele lipidice sunt aranjate ca un strat dublu lipidic de 5 l0 nm grosime Ei reprezintd o barierd relativ impermeabild pentru trecereamoleculelor hidrosolubile. t membranele sunt structuri mobile, fluide, ca rezultat al interacliunilor slab energeticeintre catenelehidrofobe din interiorul stratului dublu lipidic. o membranele au o structurd asimetricd regisiti in funcgionalitatea diferitd pe cele doui fefe. Aceastd asimetrie sebazeazd. pe tipurile diferite de lipide Eiproteine care se gdsesc pe ambele fefe membranare. r moleculele proteice inseratein membrani, mediazi majoritatea funcfiunilor membranei, transportdnd specific diferitele substanfe moleculare sau ionice sau catalizdnd reaclii specifice membranei precum sinteza ATP-ului. Raportul masic lipide: proteine este cuprins in piaja 4:1 - 1:4.Existf,membrane cu confinut majoritar de proteine cum ar fi membrana intern[ mitocondriali, membrana perinucieard,,cea a Iizozomilor. Alte membrane au un conlinut aproximativ egal al proteinelor Ei lipidelor cum este cazul membranei mitocondriale externe, a reticulului endoplasmatic, a membranei interne ale bacteriilor Gram-

84

Elemente de biochimie .I.

negative. ln fine unele membrane au un confinut iipidic majoritar: membranele aparatului Golgi, teacamielinicd a nervilor etc. I Marea majoritate a membranelor sunt polarizate electric, cu sarcina negativf, spre interior (de reguld 60 mV). Aceastd polarizare electricd, efect al asimetriei transversale a distribufiei lipidice (vezi mai departe),joacd un rol esenfial in transport, conversiachimic[ de energie gi in excitabilitate. o ln membranele plasmatice ale celulelor organismelor superioare, se gdsescproteine care asigurd legdturi structurale ce conecteazd celulacu alte celule. 2.5.2.Straturi dublu lipidice Constituenfii maj ori ai membranelor celulare sunt /os/o/ipidele. Aqa dupd cum s-a ard,tat la capitolul legat de lipide fosfolipidele sunt substanfecare confin legdturi fosfoesterice, in care componenta alcoolicd este fie glicerolul, fie sfingozina (mai rar sfinganina gi i:r regnul vegetal fitosfingozina).

Model micel!

Model dublu- lipidic

Monostnl lipidic superlicial

Fig, 2. 35.Structuri rezulate prin agregarea lipidclor tntr-un med.luhtdrofiI

Acizii gragi care intrd in compozilia fosfolipidelor acoperdun domeniu cuprins de reguli intre 14 gi 24 de atomi de carbon. Acizii gragicare intr6. tn structura membranelor celulelor animale nu sunt rarnifrcafi. Acegtiainsi pot fi atdt saturali cdt gi nesaturafi. Aproape intotdeauna, dubla legdtura are o configurafie cis qi datoritd rigiditifii acesteia,creeazd. o zond de neomogenitate structurale, cu efecte asupra fluiditefii membranei. Caracteristic structurii fosfolipidice este existenla unei zone hidrofile, gi a unei zone hidrofobe biramificate, (FiE.2.35.) determinatA de catenele hidrocarbonate ale resturilor de acizi gragi,respectiv de sfingozind. Aceste zone fac din moleculele fosfolipidice structuri amfipatice, sau amfifilice carele orienteazdatunci cdnd sunt introduse

Lipide . Membrane biologice

85

intr-o solufie apoase sau uleioasd. (simili simile gaudet). Astfel cdnd moleculele iipidice sunt introduse in solu{ia uleioasd. ele se vor orienta cu catenelehidrocarbonate cdtre mediu, iar cele hidrofile cdtre interior. Acesta este totusi un caz intdlnit mai mult in testele experimentale, pentru cd mediul extern celulei respectiv citosolul este hidric. La introducereaintr-o solulie apoasd,in funcpe densitatealipidelor orientarea se poate face in mai multe moduri: formarea de micele monostratificate (aglomerdri ordonate cu simetrie sfericd, orientate cu partea hidrofrld citre exterior - mediu) sau formarea de straturi (pelicule) dublulipidice atunci cdnd densitatea lipidelor este aproximativ aceeagicu a mediului de dispersie. Datoritd lungimii mari a catenelor hidrocarbonate,orientareaspontand,in absenfaunor forfe de intensificarea omogenizarii moleculare are loc de preferinfd dupa modelul stratului dublu - lipidic. Atunci cdnd densitatealipidelor estemai redusd decit a mediului de dispersie se formeaze monostraturi superficiale orientate cu partea hidrofila a lipidelor cdtre mediul de dispersieapos.

S
r

tino.ot
moleculd hidrofili

I ;
I

_".1
.] t,, '.;,l'

lrsau dializd -"--'-'=11----get - ilrrare

sontcare saI
IUrDOmtxare
..-;-__.-->

lxml

fosfolipidd Fig. 2. 36.Formarea liposomilor cu trasori hidrofili incluSi

Prin omogenizare intensd precum cea realizatd cu turboagitatoare sau prin sonicare, moleculele fosfolipidice introduse intr-o solufie apoasdpot forma structuri dublu sau qvadruplu lipidice cu simetrie sferic6, care includ in interiorul lor volume variabile de solulie. Astfel de formafiuni artificiale, care prezinti o stabilitate relativ mare sunt cunoscute sub numele de liposonzisau ueziculemultilamelare (Fig.2.36).

86

Elemente de biochimie .1,

orifclu q,r diarn-1mm

daw [r& d.h

Compadimenle cu solute apoase

Fig. 2. 37. Model experimental pentru determinarea permeabilitdfii straturilor bilipidice

Liposomii se pot obtine gi prin introducerea rapida, printr-un ac de siringd a unei solulii etanolice a unei fosfolipide intr-o soluiie apoase, Liposomii astfel oblinuli au un diametru de ordinul a 50 mp. Diametre mai mari, pdnd la lmm (1000 pm) se pot obline prin evaporareasub agitareintensd a unei suspensiifosfolipidice apoase. Datoritd,asemdndrii acestor agregateartificiale cu membranele biologice naturale liposomii sunt numili qi membrane negre (black membranes) intr-o analogie nu tocmai fericitd cu termenul consacrat de black box atribuit dupd cum se gtie sistemelor cdrora nu li se cunoa$te decdt intrarea gi iegirea,nu gi ceea ce se petrece in interior. Liposomii pot fi manipulafi fdrd modificarea structurii, prin gel-filtrare sau dializd. Ei gi-au gisit o aplicabilitate practicf, prin includerea in interiorul acestora a unor substanfe precum enzime, vitamine, agenfi dermo-activi. De asemenealiposomii sunt utilizaii pentru introducereain organism a unor substanfe de contrast in procedurile imagistice moderne de diagnostic, precum tomografia computerizatd gi rezonanla magneticd nucleard. Datoritfl similaritS.fii structurii cu membranele celulare conlinutul liposomilor poate fuziona cu cel al celulelor, credndu-seastfel condiliile preliminare pentru eliberareaconlinutului liposomilor in celulelefinti. Tot similaritatea structurali cu membraneie celulare fac din liposomi modele experimentale utile pentru studiul permeabiliti,fii membranelor naturale. Astfel pentru dublurile straturi lipidice sferice se stabilegteviteza de eliberare a compugilor inclugi in liposomi, prin determinarea cantitativd in timp a nivelului acestoratntr-o anume solufie. O procedurd elec-

Lipide . Membrane biologice

87

trometricd de determinare a permeabilitd$i dublurilor straturi lipidice utilizeazd, un vas bicompartimentat. Pereteledespdrfitor al acestuiaare prevdzut un orificiu de cca. I mm in diametru. (Fig.2.sV. Stratul dublu Iipidic se formeazi prin pensulare cu o solufie de fosfolipid[ intr-un solvent organic. In ambele compartimente se introduce o solulie apoase. Studiul se poate face mdsurdnd curentul prin circuitul format cu doi electrozi imersafi in cdte un compaftiment, ca raspuns la diferite potenfiale aplicate. Prin astfel de procedee s-a determinat - ,t.; l 0 ' 2 Ap5 P(cm s permeabilitatea membranelor dubiu lipiIndol dice la diferite specii ionice sau molecul0-4 lare agadupd cum se prezintdinFig. 2.38. t-iree(Gicerol) l0'5 Stabilitatea straturilor dublu lipidice, 'fhptoihn Glucozi inclusiv a liposomilor se explicd prin com10-8 pensarea sciderii de entropie la formarea 10.r0 acestora de cdtre scdderea de entalpie datorati interacfiunilor nou apirute (legdturi ionice gi de hidrogen intre zonele hidrofile ale fosfolipidelor gi apa respectiv componenfii ionici existenfi deliberat in Va lo ri I e permeab i Ii ld lii pentru aceastape de o parte gi interacfiunilor hidilerite specii care troversea:d drofobe - forfe Van der Waals de dispersie stratul dublu Iipidic - intre catenele hidrocarbonate ale restuFig.2.38 rilor acil. 2.5.3.Asimetria membranelor plasmatice Cele doud straturi dublu lipidice permit atdt lipidelor componente cdt gi proteinelor integrale sau periferice o circulalie practic liberd. Aceastdcirculalie esterealizatdprin doud tipuri de miEcdri:a) o migcare de translafie in planui membranei gi b) o migcare de rotafie in jurul unei axe normale la suprafafa membranard. Mobilitatea rezultatd in urma acestor migcdri poate fi pusd in evidenld prin utilizarea unor proteine membranare marcate fluorescent. Pe ldngd acestedoud tipuri de migcdri mai sunt posibile gi migcari de rotafie in jurul unei axe aflate in planul de separafie al celor dou5,monostaturi lipidice ale membranei. Aceste miqcdri, cunoscute sub numele de flip-flop sunt defavorizate energetic,iar dacd se petrec totugi ele au o viteze redusd, frind de reguld realizatecu asistenfdenzimaticd.Ponderearedusi a acestormi$cdri gi energia mare necesarase justifice prin obligativitatea ca extre-

88

Elemente de biochimie .1.

mitatea hidrofili a componentei care executa mi$carea sa traverseze zona hidrofobi din centrul membranei. Acest tip de migcare frdnatd impiedicd omogenizareacomponentelor inseratein membrand pe anrbele fele: interni qi extern6.Firesc,asimetria structurald creeazdpremisele asimetriei funclionale. ln Tab.2.2.se redd compozilia ceior doui straturi ale membranei eritrocitare umane. Pe ldngi asimetria transversalddeterminatd de compozilia diferitd a celor doud straturi lipidice mai existd gi o asimetrie klngitudinald. Aceastase manifestd prin aspectul de masd mobild, cu zone diferite ca structure, constituite din asociafii lipidice, proteice sau lipoproteice. Ionii bivalenti de exemplu, pot induce separdri de faz6.in membrane formate din fosfatidilserini, fosfatidilcolina sau/gi fosfatidilcolamind prin forrnarea de asociafii ale fosfatidilserinelor (punfl saline prin in termediul carboxilatilor),

Fig. 2. 39. Gli.coforina A

De asemenea,anumite proteine membranare pot forma asociafii cu anumite lipide care creeazi astfel ,,insule"mobile intr-o mare agitate. Orientarea proteinelor intr-o membrani poate fi determinatd prin utilizarea unor enzirne proteolitice care nu pot traversa membrana. Carboxipeptidaza,de exemplu este o exoproteazl.ce hidrolizeazi leg6turil e p eptidice mar ginale, aferente capdtului C-terminal, GlicoforinaA este un bun exemplu de proteind membranard, constiNumele i-a fost attuent majoritar al membranei eritrocitare (F19.2.39.). 131de amiumand con{ine ribuit de c[tre MARCHESIin 1975.Proteina

Lipide . Membrane biologice

noacizi dintre care 38 % se situeaze in portiunea transmembranard, fiind hidrofobi. Capdtul N-terminal se afld in exteriorul celulei, iar cel C-terminal in interior. Porfiunea N-terminale, externe este puternic glicozilata (15 catene oligoglucidice legate O-glicozidic terminate cu acid siaiic, si o cateni legatdN-glicozidic). Acestecatene sunt deci puternic hidrofilice gi anionice. Aceste catene poatd determinanfii antigenici ai grupelor sangvine,flind in acelagitimp gi receptori pentru virusul gripei. 2.5.4.Distribulia asimetricd a lipidelor Lipidele prezintd de asernenea o distribufie nesimetricd pe cele doua fefe ale membranei plasmatice.In cazul rnembranei eritrocitare majoritatea fosfatididil etanolaminelor (cefalinelor)gi a fosfatidilserinelor se gdsesc localizate pe fa{a internd iar fosfatidilcolinele (lecitineie) qi sfingomielinele sunt localizatein specialpe fafa extern[. Aceasti distribufie preferenliali influenfeazdpe de o parte distribufia sarcinii electrice pe cele doud fefe ale membranei, iar pe de altd parte, permite interacfiuni specificecu proteine membranare particulare.
Tab. 2.2. Compozifia membranei eritrocitare umane Gomponent Proteine 9iglicoproteine Lipide Fosfolipide Sfingomieline Fosfatidil coline Fosf atidiletanolamine Fosfatidilserine Fosfoinositide Fosfatidilinositol (4-P) Fosfatidil diinositol (4,5-Pz) Fosfatidil triinositol Colesterol Glicolipide gragi Acizi % masi
6q AF

procentuald Distributia oe fiecarcstat Stratul extern

28 6,8 7,0 7,4 4,3 1,0 0,34 0,22 0,39 13

1

80 20 0

20 25 80 100

50 100

50 0

Localizarea diferenliatd a lipidelor, pe tipuri, pe cele doud fele ale membranelor, creeazd asimetria transversal[. Localizarea lor se face spontan prin sintezd pe fala de referinfd, ori dirijat, prin intermediul unor proteine specializate in transferul transmembranar al lipidelor.

Elemente de biochimie,I.

sinteza fosfolipidelor, a glicolipidelor, a colesterolului se realizeazd, de enzime localizatein membranele reticulului endoplasmaticrespectiv al aparatului Golgi. Fluxul acestor compugi cdtre membrane, inclusiv cdtre cea plasmaticd este realizat de c{tre proteinele de transfer al lipidelor, mai sus menfionate. Odati stabilitd, asimetria transversald. a membranelor sementine prin bariera energeticaridicat[ necesardtrecerii lor de pe o fali pe alta a membranei. ln anume condilii, poate avealoc un transfer al lipidelor de pe o fa15pe alta a mernbranei plasmatice.Acest transfer ss lgalizeaza de cdtre proteine specifice numite flipaze. De multe ori aceste flipaze necesitd asistenfa ATP-ului pentru a realiza transferul lipidic. AceastareprezintI o a doua modalitate de mentinere a asimetriei stratului dublu lipidic. 2.5.5.Tranzifii de fazd ale straturilor dublu tipidice gi mobilitatea acestora

fififififi M[[
inc6lzire
-------------lt

Fig. 2.a0. tanzilia de fazd suferitd de strarurile dublu lipidice Ia rnodificarea de temperaturd

La temperaturi relativ scd.zute, mobilitatea carbocateneloreste limitat5, energia liberd fiind redusd. Legdturile carbon sunt in conformalie anti, catenele avdnd lungimea maximd respectiv suprafapa minimd. In aceste condilii, grosimea stratului dublu lipidic este maximd, de asemenea gi rigiditatea acestuia.Prin incdlzire, creqtemobilitatea catenelor care prin modificdri conformafionale igi mdresc suprafafa acoperit5, dar in acela;i timp permit intrepitrunderea catenelor opuse (Fig.2. }.).

CAPITOLUL 3. Proteine
Dintre cele patru clase de substan(e fundamentale ale materiei vii, proteinele sunt pe departe cele mai importante (in comparatie cu glucidele, lipidele gi chiar cu acizii nucleici). Natura macromoleculard, nemaiintdlnita multitudine a structurilor care se regisegte intr-o funcfionalitate extrem de diversd, le conferd un loc prioritar tn raport cu alte substanfebiologice. Termenul de proteine (derivat de la grecescul proteios- primul), introdus de cdtre Idns I. BEMELIUS in lB3B, subliniazdprimordialitatea clasei. Semnificafia celor afirmate este in acord cu func{iile principale indeplinite: l. Biocatalizd enzimaticd. Marea majoritate a reacliilor petrecute in organismul viu sunt catalizate de macrornolecule de naturd proteicd numite enzime. Domeniul de acfiune al enzimelor se intinde de la cele mai simple reacfii precum ar fi hidratarea dioxidului de carbon, catalizatd, de anhidraza carbonicd, gi termindnd cu cele mai complexe, cum sunt cele implicate in procesele de replicare cromosomiald. Valorile specificitd{ii gi activitdlii enzimelor sunt caracteristici care Ie departajeazd. net de catalizatorii chimici convenfionali, ficdndu-le competitive procese in de sintezd organicd. 2, Biocatalizd hormonald. ln prezent se cunosc o serie de hormoni cu structuri polipeptidicd care, secretafide celule specializate,igi exercitd func1ia biocataliticd la nivelul celulei fintd, dupd transportul pe cdi umorale. Hormonii nu sunt catalizatori in sensul strict al cuvdntului. Prin reglarea nivelului unor anume metabolili, stdri, procese, toate acestea realizate prin controlul unor cdi metabolice, hormonii influenteazd reac{iile chimice, de unde qi atributul de biocatalizatori. Insulina, hormonul homeostaziei glicemi ce, somato statina hormonul de reglare a cregterii, uasopresina, angiotensina,bradikinina, oxitocina etc. sunt alte exemple de hormoni peptidici. 3. Transport gi stocare. Proteinele indeplinesc funcfia de transportori speciflci pentru diferite molecule sau ioni atdt in spaliile intercelulare cdt mai ales prin membrane, realizdnd astfel selectivitatea accesului substanfelor biologic active pdnd in interiorul celulei. Hemoglobina, transportorul de oxigen la nivelul eritrocitelor, mioglobina, substanfa care stocheazS. oxigenul la nivelul celulelor musculare, transferin*, care transportd ionul feros, depozitdndu-l in ficat sub formi de complex cu

92

Elementede biochimie .I.

feritina, o alte proteind, ceruloplasrnina,purtdtorul de cupru, albumina sericdcare transporta lipide\e, citocromii care asigurdtransportul electronilor sunt numai cateva dintre reprezentangiiproteinelor de transport sau stocare. 4, coordonare a migcdrilor. Natura proteici a forma{iunilor contractile ale fesutului muscular, a formafiunilor motile ale flagelilor (cililor) celulelor bacteriene, determini migcdri, ca rdspuns la acfiunea unor stimuli de naturd diferitd. 5. Suport mecanic al diferitor {esuturi. Elasticitateaqi rezistenfapielii este datoratd.colagenului, cea a vaselor sangvineelastinei,iar a fanerelor keratinei. 6. Protecfia imund. La aparigia substanfelor sau corpurilor straine (virusuri, bacterii) celula reactioneazd,in funcfie de pozifia ei pe scara evolutivd,prin sinteza gi secrefiaunor subs;tan1e proteice, anticorpii care neutralizeazd. materialul exogen. 7. Generareagi transmiterea impulsurilor nervoase. Rdspunsul celulelor nervoasela diferifi stimuli este mediat de o serie de receptori de naturi proteicd. Rodopsina, o cromproteidd, este responsabild de recepfia luminii la nivelul celulelor bastonagedin retina. Proteinelereceptoare pot reacliona ia prezenla unor substanfecu masi moleculard redusi precum acetilcolina gi genereazl,semnale la nivelul sinapselor (terminatiilor celulei nervoase),realizdnd comunicareaintre celule. B. Controlul cregterii gi diferenfierii celulare. Se realizeazd,instrAnsi legdtur5, cu determinismul genetic al proteinelor. Transcriereagi traducerea mesajului genetic este coordonata de proteine represoare. ln organismele superioare factorii de cre;tere, de naturi proteic6, asigur[ cregtereagi diferenlierea celular5,.De asemenea,in organismele superioare, activitatea diferitelor celule estecoordonati de hormoni printre carese disting gi cei polipeptidici.

3.1. Clasificareaproteinelor
Din nem: t o t r multitudinea de criterii care ar putea fi luate in considerarerefimasa moleculard numS.mlde catene ale proteinei funcfionale omogenitatea solubilitatea gi legatd de aceastastructura fibrilard sau globulare

Proteine . Clasificarea proteinelor

93

Astfel,dupd.rn&sa. moleculardproteinele se pot sistematizain: r oiigopeptide r polipeptide r proteine propriuzise Distinclia dintre cele trei categorii este arbitrard. Se considerd cd oligopeptidele confin pdnd la zece aminoacizi, polipeptidele intre zece gi 50 de aminoacizi iar proteinele peste aceastd valoare. Numdrul de catene este important pentru proteine deoarece este direct corelat cu complexitatea edificiului proteic. O proteind funcfionald poate fi monomericd saupoate fi multimericd..Proteinelemultimerice pot fi formate din catene de acelagifel ca in cazul proteinelor homomultinterice sau din catene peptidice diferite ca in cazul proteinelor heteromultimerice. Dupd.omogenitate,proteinele se subdivid in: t proteine omogene formate numai din aminoacizi). Acestea se subdivid dupd forma catenei in proteine globulare (diametrul maxim gi minim sunt de acelagiordin de mirime; majoritatea sunt solubile in apd gi/sausolulii saline) ;i in proteinefibrilare (diametrul mare poate fi denumit lungime iar diametrul mic poate fi denumit pur Ei simplu diametru, deci coeficientul de zveltele sau raportui lungime / diametru este mare). Proteinele fibrilare pot fi solubile (fibrinogenul din sdnge, respectivactina si miozina din lesutui muscular) sau insolubile: colagenul, elastina,fibroina, keratinele. I proteine neomogenq conjugate sau heteroproteide. Ele sunt formate dintr-o componentd polipeptidicd (proteice;numitd apoproteind gi dintr-o componentdneproteicdnumitd cofactor.ln functie de natura acestuicofactor distingem: t glicoproteidd(glucidevezi capitolul 1) t nucleoproteide(acizinucleici vezi capitolul S) t lipoproteide (lipide). Aceastd clasd este reprezentatd de conjugafi proteici cu lipidele simple ori complexesau cu produgii lor de hidroliz6. Seintd.lnescatdt in serul gi plasma sangvindcdt gi in constitufia membranelor celulare.Ioncfiunea lipidd-proteind se face prin: I) Iegd' turi coualente(acilareacu un rest de acid gras a grupdrilor aminice sau hidroxil libere din componenta proteicd), 2) prin legdruri ionice, (componenta lipidica participd cu resturi fosfat sau amoniu -din colind- iar componenta proteicd.cu resturi carboxilat ori amoniu, guanidiliu etc).
7 componenteleneproteicese vor specificaintre paranteze

94

Elementede biochimie .1,

Pe ldngd acestea,stabilizarea conjugahrlui lipoproteic se poate face gi prin legdturi mai slabe precum 3) legdturile de hidrogen, respectiv 4) forle uan der Waals. Lipoproteidele plasmatice se sistematizeazd. dupa densitate,(corelatdaici cu mobiiitatea electroforeticd)in cinci categorii: chilomicroni, lipoproteide de densitate foarte micd (VLDL8), Iipoproteide de densitate intermediare [DL), lipoproteide de densitate micd (LDL) gi Iipoproteide de densitatemare (HDL). I cromoproteide(pigmenli, coloranfi) t metaloproteide (ioni metalici ) Componenta neproteicd este un ion metalic. De cele mai multe ori, acestion metalic apare asociat,in interiorul apoproteinei cu alti structurd neproteicd,ceeace face ca multe dintre metaloproteide sd apa4inA in acelagitimp gi altor clase de heteroproteide.Exemplui hemoglobinei (vezisubcapitolul hemoglobina) esteedificator. Ionul metalic, care face parte dintre oligo- sau microelemente (Fe,Cu, Zn, Mn. Co, Mo, Ni etc.), se gdsegteatagat prin legdturi ionice, fiind de asemeneacoordinat de atomi electrodonori. Rolul componentei metaiice estediferit qi determind func{ionalitatea proteinei. Vom face referinfd la cdtevaexemple clasice.ln cazul metaloproteidelor care fac parte din lanluri transportoare de electroni, rolul metalului (Cu, Fe) este acela de acceptor de electroni din partea unui component din amonte (in sensulpotengialuluide reducere),care se va oxida gi, succesiv,acela de donor de electroni catre un component din aval, care se va reduce. ln acest mod funcfia transportor de electroni a metaloproteidei se face prin bascularea stdrii de oxidare (in cazul ferului Fez*) Fe3*, in cazul cuprului Cu* ) Cuznetc.). ln alte metaloproteide rolul metalului este catalitic. De reguld metalul acfioneazdprin reducerea densitSlii electronice la un centru de reac{ie,fdcdndu-l mai susceptibil unui atac nucleofil. (Veziin Vol.2. exemplul aldolazeide tip II in care oxigenul carbonilic, aflat in vecindtateaionului Zn?*din enzimi, igi va deplasaelectronii cdtre ionul metalic, crednd astfel o polarizare care va favoriza finalmente clivarea legdturii C3-C4 din esterul Haarden Young). Trebuie menfionat rolul ferului care apare in doui tipuri structurale de metaloproteide: proteidele Fe-heminice gi proteidele Fe-S.Din prio Acronimele provin din denumirea in limba englezd.a acestor compugi Very Low Denisty lipoproteins (VLDL), fntermediate Density Iipoproteins (IDL),Iow Denisty Iipoproteins (LDL), Iligh Denisty Iipoproteins (HDL),

Proteine. Conlinutul de proteind al materialelor biologice

95

ma categorie,care are drept caracteristiceexistenla unui nucleu porfirinic (vezihemoglobina), fac parte substanfecu functie catalitice precum catalazelegi peroxidazele,apoi substanfe transportoare de electroni precum citocromii (vezi lanful mitocondrial al transportului de electroni in Vol. II) gi proteidele de transport gi stocare a oxigenului (vezi hemoglobina gi mioglobina). Din cea de-a doua categorie,caracterizatd prin existen{a legdturii covalente Fe-S, fac parte substanle cu func{ie catalitice precum succinat dehidrogenazagi aconitaza,respectiv componente ale lanlului transpoftor de electroni (vezi lanful mitocondrial al transportului de electroni gi fotosintezadin Vol. II) t fosfoproteide (acid fosforic). Confin grupi.ri fosforice ata$ate estericde resturi de serind sau treonind. Exemple de astfel de substanfe sunt cazeinele din lapte. Acestefosfoproteide sunt prezente sub formd de sdruri solubile de calciu. Ele nu precipiti termic, ci doar prin cobordrea pH-ului. Fermentafia lacticd, prin acidul lactic pus in libertate duce la formarea cazeinei insolubile, din cazeinalii solubili existenli in biomasi. Pe acest proces se bazeazd, tehnologiile de fabricare ale brdnzeturilor. Dupd. solubilitatea in apd.Sisohtlii saline proteinele se impart in: t proteine insolubile (scleroproteine):cum sunt de exemplu: colagenul, elastina,fibroina, keratinele. t proteine globulare sau fibrilare solubile precum: albuminele, globulinele etc. r O categorie particulard surrt proteinele membranare. Aceste proteine (vezi proteine membranare) sunt structuri amflpatice, porfiunea hidrofobd fiind cea transmembranard.Acesteproteine sunt cunoscute ca proteine insolubile, insolubilitatea acestorafiind insd datoratd atagdriide membrand. De altfel extracfialor necesitddistrugereamembranelor celulare, prin utilizarea detergenfilor. Proteinele solubile propriuzise (globulare) sunt structuri tridimensionale, care expun pe suprafafa externd.,in contact cu mediul hidrofil, catene laterale, hidrofrle din aminoacizi.

3.2. Confinutul de proteini al materialelor biologice

O procedurd. comunf, este metoda KIELDAIIL, prin care confinutul de proteind brutd din materialul biologic se estimeazddin determinarea pe ipoteza validatd cd valoaazotului total. AceastdmetodS.se bazeaz6. cu rea medie a conlinutului de azot din materialul proteic este de 16To,

96

de biochimie .1. Elemente

precumgi pe neglijilea conlinutuluiin azot o dispersie relativscezute, al celorlallicompugiprezenfiin probd. intregii cantiteli de azot orDeterminarearealizeazd transformarea ganicin NHr* cu ajutorul acidului sulfuric la fierbere,in prezenfaunor in fapt substanle pentru ridicarea temperaturii de ,,catalizatori", (SeOz, cu un urmatd de transformarea KzSOn), fierberea amestecului vapori cu acestuia exces de NaOHa ionului NHr* in NHs $i antrenarea intr-o solu,tie titratade acidclorhidric.
H2Soa \ NaoH \ titrarecu IICI

Ntorgl\r_--t-

Nr1- -\r-_--.

\:r{4OH

B[|!'"t

de tip biuret Complex

Complex bicinconinic

Fig,3.1. Euidenfierea proteinelor prin complexare cu ioni de cupru'

O alta metodi, frecvent utilizatd datoritd simplitdfii ei este cea a lui LOWRY,care constd in aparifia unui complex cupric de tip reacfie biuret (Fig.3.1.)gi, simultan, a unor forme oxidate la tirozind, la cisteina gi la triptofan, prin interacfiunea ploteinei cu o solulie alcalinocupricd gi cu o solu{ie fosfowolframicd respectiv fosfomolibdenicd (Nazwor ' ZHzO+ NazMoOa. 2HzO + HsPOr ). Solulia fosfomolibdowolframicd poartd numele de reactiv FOLIN - CIOCALTEU.Formele oxidate genereazd ionul cupros cale reaclioneazd cu complexul fosfomolibdowolframic. complexele cupros gi cupric absorb la 660 nm. Dupd incubareaprobei proteice, timp de 10 min. la 50oC,proba (cu complexele cupro-cuplos formate) se fotometreazela 660 nm fali de apa distilat6. Etalonarease face prin utilizarea unor solufii standard de albumini sericdbovin6, disponibild comercial. Sensibilitateametodei este de cca.l0 mg.l-I.

Proteine, Purificarea proteinelor

97

o*

soi

Fig. 3. 2.. Reactivul CoomasieBlue utilizat la determinarea calitatiud Si cantitativd a protelnelor prin metoda BRADFORD

O varianti imbundtdfitd a metodei Lowry este metoda acidului bicinconinic (acid 2,2' bichinolin 4,4' dicarboxilic), care formeazd un complexfotometrabilcu ionul Cu.r. (Fig'3.1.) Proteinele se mai pot determina printr-o reaclie de culoare datd cu colorantul trifenilmet anic Coomassie@ 3.2.). Brilliant BIue G-250 (Fig.

3.3. Purificarea proteinelor

Purificarea proteinelor se face in scopul determind.rii structurii acestoradar gi pentru evitarea unor interferenfe pe care compugii cu care se gdsesc asocia{iinifial i-ar putea produce in utilizare. Datoritd complexitdfii amestecului in care se gdsegteproteina, procesul de puriflcare prezinti dificulte$ a cdror mdrime cre$te odatd cu gradul de purificare cerut, gi constd intr-o serie de operafii realizate intr-o succesiune logicd".Aceasti succesiune depinde de localizarea proteinelor in materialul biologic. Proteinele se gAsescin microorganisme unde pot fi avea localizare intra- sau extracelulard,precum gi in lesuturi sau organe animale ori celule vegetale.Procedurile de oblinere a proteinelor sunt adaptateparticularitifilor celulelor sursi (F19.3.3.).

98

Elementede biochimie .l-

Celule vegetale fesuturi, organeanimale

l*

Celule microbiene

Prot eine \ intrac( ilulare)

Prot erne ( \extrac, =lulare,

- solid lichid Separare

dezintegr r recelulard

Separare chid - solid

Solide

Lichide

lndepdrtare acizi nucleici

Purificare

Concentrare

(Condi{ionare)

/o"ui
-

ffiifimll$fr$F,.

/prot"in].-#

Ftg. 3, 3. Schemade primipiu de purificare a proteinelar

Proteine . Purificarea proteinelor

99

O restriclie de care se line seama,estelegatd de fragilitatea structurii edificiului proteic care poate suferi cu mare ugurinfd alter[ri. 3.3.1. Dezintegrareacelulard Materialul biologic, care de cele mai multe ori constd dintr-un preparat celular sau tisular, in care proteina se gdsegtesechestratdin interior, trebuie supus inifial operaliei de dezintegrarecelulard,prin care are loc mperea (distrugerea) membranelor si a perefilor celulari. Aceasta se poate realiza prin doud categorii de metode: mecanice gi nemecanice.Aplicabilitatea uneia sau alteia depinde de tipul de celuld utilizat, de sensibilitatea proteinei gi de scarade aplicare(laborator,pilot pdnd la ceaindustriald). 3.3.4.1.Metode mecanicede dezintegrarecelulard Sunt cele mai folosite, datoritd simplitA$i, costului redus gi a lipsei de contaminare cu produse strdine. Intensitatea procesului trebuie sd asigure dupd caz,distrugereaperetelui celular, a membranei celulare sau a membranei structurilor subcelulare.Procedeelefizice utilizate trebuie sd fie suficient de eficace,dar in acelagitimp, sd nu provoace denaturarea proteinei (modificarea structurii sale sub acliunea forfelor care se dezvoltd). In practica uzuald se lucreazd la rece, in prezenfa unor substangeprotectoare. Trebuie avut in vedere Ei faptul cd distrugerea prea avansatda peretelui celular produce resturi de dimensiuni mici ale perefilor sau membranelor, care pot contamina produsul, ingreundnd procesele De aceeauneori se preferd un randaulterioarede separare. ment de extracfie mic printr-o omogenare incompletd dar cu avantajul simplific[rii operafiilor ulterioare respectiv al necontamindrii. Rezultatul operatiilor de dezintegrare celulard mecanicd este aga numitul omogenat celular. 3.3.1.1.1.Utilizarea de abraziui Agitareaenergicd,in prezenfa microbilelor de sticld, de ofel, sau a nisipului fin, provoacd dezintegr.ueacelulelor prin ruperea perefilor celulari, a membranelor gi eliberarea constituenfilor citoplasmatici. Dezintegrareaeste datorat[ atdt frec[rii dintre particulele de abraziv gi materialul celular cdt gi ciocnirilor care au loc. Gradul de dezintegrare depinde de viteza gi durata agitArii, de concentralia in celuli, de cantitatea gi de mdrimea microbilelor sau granuleior de nisip. Procesul se poate aplica de ld scard de iaborator (cu ajutorul mojarului cu pistil), la

100

Elemente de biochimie,l,

scare pilot $i pdnd la productia industriald. Aparatele utilizate la scari mare sunt mori cu bile. Pentru mdrirea intensite$i frecirilor, ele sunt previzute cu discuri plasate concentric sau excentric pe un ax central aflat sau nu in migcare relativi fala de corpul morii, sau pur gi simplu axul central mobil, are un diametru care se apropie de diametrul intern al aparatului. 3.3.1.1.2.Dezintegrarea prin destindere (liquid shear)

scaunul ventilului de destindere

intrarea suspensief celulare

_------>

inel de impact iegirea omogenatulu

Fig. 3. 4. Schema de principiu a unui omogenizator MANTON-GAUIA,IN

Se realizeazdprin trecerea unei suspensii de celule, comprimati la presiuneridicata (de ordinul a 30-125 Mpa) printr-o valvd cu secfiune micd.. Decomprimarearapida care are loc duce la,,explozia"celulelorgi eliberareacon{inutului lor. Alte mecanisme prin care are loc distrugerea peretelui ceiular in acesttip de proces sunt frecareafoarte puternicd de perelii aparatului a componenfilor suspensieicelulare gi de asemenea impactul cu suprafe(elevalvei (Fig. 3.4.) Deoarececomprimarea gi frecarea sunt insolite de incdlziri locale, este necesardprezenfa unui sistem de ricire eficace (circulafie de alcool la -25 "C). Viteza cu care suspensia treceprin valva de destindereestede ordinul a 300-350m.s*t. Omogenizatorul Manton - Gaulin care lucreaz[,pe acestprincipiu poate realiza tratarea in sistem continuu a unui debit de 250 l.h-t. Aceastd tehnici se aplicd in special bacteriior Gram pozitive, al cdror perete are o rezistenti mecanicd remarcabili.

. Purificarea proteinelor Proteine

l0l

3.3.1.1,3. D ezintegrare ultrasonicd Este o operatie aplicabild in laborator. Ea constd in aplicarea unor vibratii de frecvenfd gi energie ridicatd asupra preparatului brut (suspensiei celulare).Sub influenfa vibrafiilor care se produc, au loc comridicatd, in cale variafiile locale primdri gi decomprim[ri cu frecvenlS. de presiune ating valori considerabile.ln fazade decomprimare are loc fenomenul de cauitayie,care constd in vaporizarea instantanee a apei, Prin aceastavolumul ocupat cregte,cu consecinfa distrugerii inveligurilor celulare. Tot prin cavitalie se distrug perefii celulari in cazul dezintegrdriiprin destinderede la presiune ridicatd. 3.3.1.2. Metodele nentecanice componenfilorcelularise poate faln condilii particulare,eliberarea ce prin permeabilizareaperetelui ceiular. Aceastase poate realiza prin tratament chimic sau tratam ent enzimatic. Fata de metodele tnecanicetratamentul chimic prezintd avantajul cd o aparaturi specializatdia.rresturile de perefi se pot elimina nu necesit5. cu suficientd ugurinfa avdnd in vedere cd peretele celular este doar major estecontaminareaprodusului, ceea permeabilizat. Dezavantajul ce complicaoperaliile de purificare din aval,9i in plus, datd fiind sensibilitatea proteinelor,posibilitateadenaturdrii acestoracregte.Cu toate acestea,in cazuri particulare, metodele nemecanice pot oferi satisfactie. 3.3.1.2.1. Metodelechimice agenti p recum : U rilizeazd, solven{ii organici: toluenul, in concentrafii de o,5 - Bvo,laeliberarea enzimeior din Escherichiacoli, t-butanolul, metanolul, 2-propanolul, etanolul la eliberarea enzimelor din spafiul periplasmatic (la bacteriile Gram negative). Detergenfii: ionici, precum Tritonul-lo0, sau anionici precum dodecilsulfatul de sodiu, acfioneazd asupra membranelor plasmatice sau ale formaf iunilor infracelulare destabilizdndu-le. Agenlii chaotropici: precum clorohidratul de guanidind sau ureea. Degi pot produce cu uqurinfa denaturarea proteinelor, in cazul determinarii condiliilor optime de lucru, utilizarea acestor substanfe devine eficientd pentru ca pot fi indepdrta.te cu ugurinfd prin ultrafiltrare, gelf,trare,sau dializ6.

102

Elemente de biochimie,l.

Tratamentul alcalin: este utilizat ca alternativi cu totul particulard de permeabilizare in cazul asparaginazei produse de Erwinia carotouor4, respectival hormonului uman de cregtereexprimat in E. coli. 3.3,1,2.2. Liza eraimaticd

Digestia peptidoglicanic enzimaticA a peretelui realizati, in cele este

mai multe cazuri de citre lizozim (vezi cap. 4. secfiunealizozim). Bacteriile Gram pozitive pot fi procesate mai simplu deoarece au stratul peptidoglicanic plasat in exterior. ln cazul bacteriilor Gram negative, deoareceau stratul peptidoglicanic inclus intre cele doud membrane, acfiunea lizozimului trebuie completatd cu acfiunea EDTA, care are rolul de a chelata cationii bivalenli, perrneabilizd.nd membrana externe. Membraneie plasmatice rdrnasefdri consolidareaoferitd de perefi vor fi distruse sub acfiunea presiunii osmotice interne ridicate. 3.3.2.Separareasolid-lichid ln procesul de ob$nere a proteinelor (vezi Fig.3.3.)separarea lichidproteinelor solid apare fie in cazul extracelularebacteriene, cind este necesardseparareafazei lichide (care confine proteina) de biomas5., fie in urma operafiei de dezintegrarecelulard cdnd este necesardindepdrtarea resturilor perefilor gi membranelor celulare de faza lichidd care de reguld contine proteina de interes. Principial se pot utiliza filtrarea gi centrifugarea. Filtrarea este utilizat[ in special la scard mare, industriald. Descriereaoperafiei este fdcutd pe larg in literatura. Specificpentru separdriledin biochimie ;i biotehnologie estecentrifugarea. Omogenatul oblinut confine, pe ldnga o multitudine de proteine Ei organite celulare, resturi de membrane celulare, precum gi aite substante neproteice. lndepdrtarea organitelor celulare gi a resturilor membranare se poate face prin centrifugare diferen;iald. Parametrii procesului sunt forta centrifuga gi durata. Forta centrifugd depinde de diametrul rotorului gi de turafie, se exprimi de obicei prin intermediul accelerafieicentrifugale calculatd ca multiplu al accelerafieigravitafionale.ePentru fiecare centrifugd existd posibilitatea determinirii acceleraliei centrifuge, prin cunoa$tereaturafiei (n) gi a diametrului rotorului (d).

e acceleraliacentrifug{: 8"=rDaR unde <oreprezintdviteza unghiulari (rad.s-l). rdndul siu co= 2.r.n, unde n = rotalii pe secundd

La

Proteine,Purifi"car ea proteinelor

103

Printr-o operafie de centrifugarediferentiala se separedoud faze:un precipitat (sediment) gi o fazd lichidd (supernatant).Cele dou5.faze pot fi separateprin decantare.De exemplu, dacd proteina de interes se afld in fracfiunea mitocondriald, omogenatul este centrifugat mai intdi 10 min. la 4000.9,pentru indepdrtarea resturilor de membrane Ei perefi celulari, a nucleelor gi, in cazul celulelor vegetale a cloroplastelor. Supernatantul este apoi centrifugat la 15.000'9timp de 30 minute, izoldndu-se in precipitat mitocondriile. Dacd insd se doregte oblinerea fracfiei ribozomaie, atunci omogenatul inilial se centrifugheazl. Ia 30.000g timp de 30 minute, dupd care supernatantul se centrifugheazi g timp de 180 de minute, obgindndu-se la 100.000 fracfia ribozomald doritd. ln fine, dacd se urmS.rescproteinele solubile, omogenatul se g, refindndu-se supernatancentrifugheazdtimp de 180 rnin. la 100.000 jos prezintd In mai cdfiva tul. tabelul de se dintre cei mai comuni parametri pentru separareadiferitelor fraclii celulare din omogenateleobfinute.
Tab. 3.1. Parametrii necesarisepardrii diferitelor fracfiuni cu confinut proteic
Fraclia sedimentattr (eucariote) celule Cloroplaste, membnne celulare, nuclee Mitocondrii, celule bacteriene Lizozomi, membrane bacleriene Ribozomi (xg) Acceleralia centrifugf 1 .1 0 3 4. '103 15.103 30.103

(minute) Timp
5

10 20 30
180

100103

3.3.3.Precipitarea diferenfiald Separareaproteinelor din amestecul complex oblinut dupa distrugereaperefilor sau / gi a membranelor se realizeazdpe baza proprietaliior legate de masa moleculard (ultracentrifugarea, dializa, gel separareape schimbdtori frltrarea),proprietdlile electrice(electroforeza, de ioni), proprietdlile hidrofob-hidrofile (cromatografiade interacfiune hidrofobd, HPLC), precum gi cele legate de specificitatea legarii (cromatografiade afinitate). Preparatul oblinut prin centrifugare, sau uneori chiar omogenatul, se poate supune operaliei de precipitare diferenfiali sau fractionata. Aceasti metodd reflectd stabilitatea extrem de redusd a structurii proteice, gi este folositd curent in proceselede separare.Principial se pot utiliza doud procedee:precipitarea Ia punctul izoeiectric gi precipitarea prin efect salin (saltingin gi salting out).

104

Elemente de biochimie .1.

3.3.3.t . Precipitarea Ia punctul iaoelectric Dup[ cum se gtie, fiecare amfolit prezintd un pH specificla care numdrul sarcinilor anionice devine egal cu numlrul sarcinilor cationice. La acest punct mobilitatea electroforeticda substanlei devine nuld, iar solubilitatea devine minim6. Valoarea efectivd a punctului izoelectric depinde de balanfa grupdrilor bazice (anioni), respectiv a celor acide (cationi). Cunoscdndu-sevaloarea pH-ului izoelectric pentru o anume proteind, aceasta se poate precipita intr-un tampon adecvat, prin centrifugare.r0 separAndu-se 3.3.3.2. Precipitarea prin efect salin.
Log (S)

1.2 0.8 0.4 0.0 -0.4 -0.8 -1.2 -1.6 -2.

Na2S04 (NH4)2S04 t23456 Tiria ionici

Fig. 3. 5. Variafia solubilitd,ii cu tdria ionicd pentru o proteind.

Procedeul mai este cunoscut gi sub numele de salefiere sau efect salting. In generalproteinele prezintd o anumitd solubilitate in apd, desigur cu excepfia scleroproteinelor. Datoritd grupdrilor ionogene, proteinele interacfioneazdin solu{ie cu ionii. Interacliunile sunt complexe. La concentrafii mici de ioni salini are loc o cregterea solubiiitdfii, datoratd cregteriivolumului sferelor de hidratare a proteinelor prin participarea ionilor str6ini. Fenomenul este cunoscut sub numele de efect salting in. La tirii ionice care depdgescpraguri specifice proteinelor apare o descregterea solubilitalii, ca urnare a formdrii sferelor de hir0 ln laboratorul de biochimie centrifugarea inlocuiegte aproape in totalitate filtrarea datoritd pe de o parte consistenlei gelatinoase (necristaline) a precipitatului, dar gi candtetilor mici cu care se lucreazi.

Proteine . Purificarea proteinelor

105

dratare a ionilor pe seama apei care hidrateazS. proteina, care poate evolua cu tdria ionicd pdnd la precipitare (Fi9.3.5.). Acest fenomen este cunoscut sub numele de efect salting out, sau efect de relargaj. Cauza acestui efect este de naturi energetici: moleculele proteice tind sd se asocieze,prin intermediul ionilor strlini, care joaci rolul de liant, scddereade entalpie la asocialia protein[-ion-proteinl compens6.nd scddereaentropici datoratd cregteriigradului de organizare.Comparativ cu variafia de entalpie liberf, la asociatiaproteind-ion-apd, primul tip de interacfiune are o valoare mai negativd,deci mai favorabild., la concentrafii ridicate de ioni salini, realizdndu-seastfel condiliile unei precipitdri spontane a proteinei. Cea mai comund substanfd ionici utilizatd este sulfatul de amoniu. Aceastadeoareceprezintd o soiubilitate ridicatd, iar efectul de relargaj apare Ia tirii ionice (concentralii) mai scdzute dec6.tin cazul altor ioni comuni. Tehnica utilizatd este relativ simpl5. Cunoscdndu-sede exemplu cd proteina precipiti la o concentrafie de 30% sulfat de amoniu, inilial se lucreazd cu o concentrafie uEor sub aceastdlimit6, pentru precipitarea substanfelorcare precipitd in intervalul 0-30%. Acestease indepdrteazd apoi prin centrifugare. Supernatantului i se adaugd apoi sulfat de amoniu, pAnd la atingerea concentra{iei de 30 Vo, cdnd sub agitare,produsul dorit precipitd, fiind separat printr-o noud operatie de centrifugare, fiind utilizat ca atare sau fiind pregdtit pentru operafii suplimentare de purificare. Substanla ionicd utilizatd la precipitare se indepdrteazd.cel mai adeseaprin dializd, in saci de acetat de celulozd, cu dimensiunea controlatS.a porilor. Substanfelecu dimensiune mici pot trece in mediul extern, care de reguld confine apd distilatd, in timp ce substanfa proteicd, de dimensiune moleculard mare, nu poate trece. 3.3.4.Metode cromatografice pe coloani Sunt folosite pe scard.largddatoritd eficienfei, dar gi posibilitdfii de a se lucra cu cantitdfi relativ mari de substanfi, fiind utilizate in scop preparativ. ln func1iede umplutura folositd distingem mai multe tipuri de procedee: 3.3.4.1. Cromatografia de excluzittne stericd sau gelfiltrarea Este o metodd care folose$teca proprietate de separaredimensiunea moleculard. Faza stafionard este formatd dintr-o substanti reticulatd, cu dimensiunea ochiurilor controlata, hidrofild. Aceastase introduce in

106

Elementede biochimie .1.

coloana sub formd de gel, lntr'un solvent organic aposrr.Amestecul supus separdrii este format din molecule de mirimi diferite. Acest amestec se aplicd pe suprafafa gelului. Antrenarea moleculelor prin gel se va face cu ajutorul aceluiagi solvent. Moleculele cu dimensiune mare vor trece printre straturile moleculare ale fazei stafionare, fiind pufin fr0nate in deplasarealor. Moleculele cu dimensiune mai micd vor putea difuza in interiorul porilor re{elei reticulate a fazei stafionare, flind cu atdt mai puternic re{inute cu cdt dimensiunea moleculard este mai redusd. Ca faze stafionare se pot utiliza polimeri reticulafi precum dextrani de tip Sephadex.(vezila capitolul Glucide), sau agarozi de tip Bio-GelA, ori acrilamidd Bio-Gel P. Fazastalionari refine moleculele de dimensiune micd..ln func$e de gradul de reticulare se poate lucra cu diferite domenii ale dimensiunilor moleculare. Metoda are avantajul unei mari simplitdli, a unei agresivitili extrem de reduse fafd de componentele amestecului supus separirii. O calitate deosebitd a gel fltrarii esteaceeaa unei transpuneri relativ facile la condilii industriale. Dintre dezavantajelemetodei menfiondm pierderea mare de presiune datoritd rezistenfei hidraulice a stratului de gel gi precizia redus[ a separdrii. Din acestmotiv, gel filtrarea esteutilizatd ca o metodd de separare a amestecului in fractiuni mai inguste si nu o separe pe componente. 3.3.4.2. Cromatografia de schimb ionic. pe sarcina netd la un anumit pH a diferitelor substanfe. Sebazeazd. Ca fazd sta{ionard se utilizeazd cel mai adeseacelulozd derivatizatd cu diferite gruperi ionogene: | (PO3)2-,(fosfocelulozd), (carboximetilcelulozi), i CH2-CO2-, (dietilaminoetilcelulozdsau r (CIIz)z-NH*(CHz-CHs)z DEAE-celulozd). 3.3.4.3. Cromatografia de interacliune hidrofobd. Foloseqteca fazi. sta$onard.tot o celuloz6.derivatizatS.cu catene hidrocarbonatede dimensiuni relativ mari (de exemplu C8, C18 etc.). Relinerea se facein func{ie de hidrofobicitatea proteinei.

I' Sunt dezvoltate sisteme de gel filtrare care nu utiliz eazdapa 9i

Proteine . Purificarea pro teinelor

LO7

3.3.4,4.Cramatografia de afinitate Spre deosebire de celelalte metode convenfionale de separare,care se bazeazd pe valorile diferite ale unei anume proprietdfi fizice, cromatografia de afinitate ca metodd de separare,calitativd dar gi cantitativd, se bazeazl,pe specificitatealegarii dintre componentul de separat (in cazul particular substanle proteicd) gi o anume substanfd.Legareacelor doi compugi se face prin interacfiuni necovalente,extrem de specifice, implicdnd zone din cele doud suprafefe moleculare. Substanfa care prezinti afinitate fa{a de proteind se gdsegtede reguli imobilizatd pe un suport inert. Cupluri de substanfd care pot interacfiona sunt lectind: glicolipidd, sau glicoproteind sau glucidh, enzimd: coenzimi, anticorp - antigen etc. Separ5.rile prin cromatografia de afinitate sunt extrem de specifice,fiind de cele mai multe ori utilizate in fazele finale ale purificdrilor. 3.3.4.5. Cromatografia de tnaltd performanld sau presiune (HPLC). Este o variantd a cromatografiei de interacfiune hidrofobd, Ia care se utilizeazd faze sta{ionarehidrofrrbe dar care lucreazi.la presiuni ridicate. Aceastaconferi procesului o foarte bund rezolufie. 3.3.5.Electroforeza Este o metodd extrem de eficace de separarea amestecurilor de proteine. Trebuie subliniat cI electroforezaeste mai mult o metodd de verificare a puritdfii unui preparat proteic, dec6.to metodi efectivd de separare. Se bazeazd pe mobilitatea electroforetici a componenfilor supusi separ5.rii, care depinde de masa moleculard respectiv de sarcina electricd. Pentru reducerea numdrului de variabile in procesul de separare amesteculproteic se supune in prealabil acfiunii unui detergent anionic: dodecilsulfatuluide sodiu (SDS).Moleculele de detergentvor inconjura moleculele proteice, in numdr cu atat mai mare cu cdt masa moleculard a substanfei proteice este mai ridicatd. Se oblin astfel agregate anionice a c6ror sarcind, este corelatd cu suprafafa moleculard (implicit volumul respectiv masa moleculari). ln cAmpul electric dupd o anumitd.perioadi de timp acesteagregatese vor distribui dup sarcina lor. Separareaproteinelor se face aproape intotdeauna pe geluri (uneori se poate realizaEipe suporturi solide precum hdrtia).

108
A)

Elementede biochimie .1.

Rezeryor cu tampon

Probetratate cu SDS, adaugate in godeurile de start Gel de policarilamidl intre pltrcilede sticll Rezervorcu tampon

B)

Piste de saoararo

\* \\ *--\\ +
I I I I Ssnsul descregterii massl molaro

Fig. 3.6. Separarea proteinelor prtn electroforem uerticald

Utilizarea gelurilor reticulate prezintd avantajul elimindrii curenlilor convectivir', carein mediu lichid ar deranja separarea.In plus, prin reticulare apare o refea de clasare,care amplifici eficacitateasepardrii.Ce mai adesease utilizeazd ca gel un pat de poliacrilamide reticulatd, prin copolimeri zareaacrilamidei cu N,N' -metilenbisacrilamidd.Revelarea se face cu ajutorul unor coloranfi specifici (CoomassieBriliant blue). Datorita utilizirii SDS gi a gelului de poliacrilamidd, metoda poafta numele de SDS-PAGE. Aceastdmetode este folositl in special pentru separareapebaz| de masi moleculari a proteinelor. Trebuie subliniat cd, datoritd utilizdrii detergentului, proteina suferi alterdri ale structurii implicit a func$ilor sale biologice. Pentru estimareapuritdfii unei proteine se recurgela electroforezafdri detergent (electroforeza PAGE).ln nu acestcaz are loc denaturareaproteinelor, proteina de interes poate fi identificatd deci prin reacfii specificebiologice, iar proteinele care o insofescpot fl cuantificate dup5.revelarecorespunzitoare.

12acegti curenli apar ca urmare a apariliei gradienlilor termici datoritd trecerii curentului prin electrolit

Proteine . Compoziyiaproteinelor

109

O varianti a electroforezeieste fsgalizalss izoelectricd.Aceasti mepe utiiizarea unui amestecde amfoli{i, care sunt inifial todd se bazeazd. ldsafi sd se distribuie pe lungimea tubului electroforetic sub influen{a cdmpului electric, desigur in func{ie de sarcina fiecdrei particule de amfolit. Aceastdoperalie creeazd,incoloana electroforetici un gradient de pH. Dupi realizarea acestuia, se introduce amestecul de proteine care va migra. Fiecarecomponent se va opri la pozifia corespunzdtoare propriului punct izoelectric. Metoda este extrem de sensibild, permiproteinelor care diferd intre ele prin sutimi de unitd{i ale {And separarea valorilor pH-ului izoelectric. O alta metodd care combind avantajelecelor doud variante mai sus prezentati este electroforeza bidimensionali. Aceasta constd in realizareaunei focalizdri electroforeticepe o fdgie ingustd de gel. Fd;ia care confine gelul cu proteinele separateprin izofocalizarese plaseazdla o extremitate a unei pldci pdtrate cu gel cu SDS,dupd care are loc o noud separareelectroforeticd,pe direclie perpendiculard.

3.4.Compozilia proteinelor
3.4.1.Conlinutul de aminoacizi din proteine

CII

o{*
Ninhidr
Ninhidrind redusd

oroo

ffi *\

/\
/Hidrindantir
NH3 |

ok*o
Purpuro iui Ruhemann

FR

Fig. 3.7. Mecanismul reacsieiaminoacizllor cu nlnhidrina

110

de biochimie,l, Elemente

Legitura peptidica este extrem de rezistentd la hidrolizd. Degi este mai eficientd, hidroliza aicalind poate conduce la degradiri mult mai importante ale aminoacizilor decdt hidroliza acidd. De aceea,ca metoda de elecfie se folosegtehidroliza acidi, realizatd in condilii ,,dure": HCI 6N reflux 12-96 de ore. ln aceste condi;ii se distruge triptofanul caretrebuie evaluatindirect (printr-o hidrolizd alcalini cu NaOH 24M, B ore la I00"C). De asemeneatrebuie avute in vederehidroliza asparaginei gi a glutaminei, precum gi degradareahidroxiaminoacizilor alifatici (serinasi treonina). Existd corecfii care se aplici in funcfie de durata hidrolizei gi de concentragia acidului. Masa de aminoacizi rezultatd se supune separdriiin vedereadozdrii. Separarease poate face pe coloane cu schimbatori de ioni (cationili), folosind pentru eluare volume de tampoane diferite, in acord cu cregterea pH-ului acestora (tampon citrat 0,2M pH 3,25; tampon citrat 0,35MpH 5.25).Ordineade separare a aminoaciziloreste: Asp, Thr, Ser,Glu, Pro, Gly, Ala, Cys,Val, Met, IIe, Leu, Tyr, Phe, Lys, Hys, Arg. Fieciruia dintre acegtiaminoacizi ii corespunde,pentru o coloani datd, un volum dat de tampon. Evaluareacantitativi se face dupd - (pdfotometrarea produsului de transformare al ninhidrinei - Fig.3.7. ni la i0 nmoli), respectival florescaminei(4-feniispiro-[furan-2(3H),1Limita de deftalanl-3,3'diond) sau numele sinonim Fluram (Fig.3.B.). tecfie a acestuireactiv ajunge p6,ndla l0 pmoli. Din amestecul rezultat Ia hidrolizi se poate face o evaluarea confinutului de arninoacizi gi prin cromatografiepe strat sub$re, urmatd de o fotodensitometrare a cromatopldcii, dupd revelareacorespunzdtoare cu ninhidrind sau cu florescamind.

R-NH2 __* \ Coz Florescamina Derivat p uternic fl uo rescent cu aminoacizii al fluorescaminei

Fig. 3.8. Floracamina indicator altemativ Ia reuelareaamhtoaciailor

Proteine, Compozisiaproteinelor

11t

o alti posibilitate este utilizarea HPLC, dupi. derivatizareacu feniltioizocianat.solventul de eluare este acetonitrilul. De asemenease poate utiliza cromatografiagazoasd. $i in acestcaz este necesardo prealabild derivatizare, in scopul mlririi volatilitefli, prin formarea de esteri metilici, realizabila prin reaclie directd cu metanolul in condilii acide, sau prin utilizarea diazometanului. 3.4.2.Identifi carea aminoacizilor N- terminali se realizeazdprin dansilare.Aceastaconstd in tratarea proteinei cu clorurd de dansil (N,N dimetilaminonaftil-5-sulfoclorurd). Rezultd o sulfonamiddrezistentdla hidrolizd.In urma hidrolizei acide sulfonamida aminoacidului N-terminal se separdgi se identifici (Flg.J.g).
IirC.-*-CHr

I r2N-CH(R)-CO-NI r-CH-

hidrolid acidtr --_--.--->

so2Nu-cr(R)-co-NH-cH... so2NH-cH(R)-cqH
Cloruril de dansil

Fig. 3,9. Dansilarea, metodd de identificare seu marcflre a aminoacidului N-terminal

O metodd asemdndtoareeste cea propusd gi utilizatd de SANGERin anul 1953,care folosegte 2,4-dinitrofluorobenzenul. Aceastdsubstanfd va fi un substrat pentru o reacfie de substitufie nucleofild aromaticd realizatdde gruparea aminoterminald a polipeptidei. ln urma hidrolizei se poate identifica astfel aminoacidul N-terminal similar cu metoda dansildrii.
NTI.CII(R)-CO-NH-CH.
Ir2N-CH(R)-CO-NH-CH-

'it'*
Y
Nq

NH-CH(R)-Cq}I Nq
+a8l*

ill

,\-

NO2

hidroliz[ acide --____l>

tJq

2,4dinitrofluoro benx,en Fig. 3. 10. Metoda SANGER de i.dentificare a aminoacidului N-terminal

LL2

chimie .1. Elemente de b i.o

3.4.3.Identificarea aminoacizilor C-terminali Se poate reaJizachimic sau enzimatic. O variante chimicd frecvent utilizati este hidrazinoliza, cunoscutd ca metoda AKABORI (Fi9.3.11). Aceastaconsti in tratarea polipeptidei cu hidrazini la 100"C.Hidrazina scindeazi toate legdturile peptidice, formdnd aminoacilhidrazidele corespunzdtoare, cu exceplia aminoacidului C-terminal care rdmdne nesubstituit:

i:2'" r , rLNr--cH*-(D--NH-MI2
p.3 - - - - -NI Iq2 pl
(I]'-NH-CII- CI I-

lt OJ/

OO- NI{- O{-

q'

pl

tLt\{---cl-02rI2N-Nl12

,I

lhN-NFI2

Fig. 3. 11.Metod.aAKABORI de identificare a aminoacidului C-terminal

Aminoacidul nesubstituit poate fi identificat prin reac{ii specifice. pe reducerea gmpdrii carboxil liO alte varianti chimicd sebazeazd, bere cu hidruri de litiu si aluminiu LiAlH4.ln urma hidrolizei acide, rezultd un amestecde aminoacizi impreund cu aminoalcoolul corespunzdtor aminoacidului C-terminal, care se determind de asemenea specific. Metodele enzimatice utilizeazd. carboxipeptidazelede tip A, B, C gi Y. toate tiCarboxipeptidaza A, extrasi din pancreasul bovin, cLiveazi, purile de legdturi peptidice C-terminale cu excepfia celor care au ca aminoacid C-terminal arginina, lisina gi prolina. Carboxipeptidaza B, extrasi din pancreasul porcin, cliveazddoar legdturile peptidice C-terminale care elibereazd arginina gi lisina. Utilizarea amestecului de carboxipeptidazd A Ei B va putea deci elibera orice aminoacid terminal cu exceplia prolinei. Carboxipeptidaza C (din frunzele de ldmdi) gi Carboxipeptidaza Y (din drojdia de bere) pot cliva orice legS.turd peptidicd C-terminald. Diferenfieri apar sub raportul disponibilitefii acestorenzime, dar gi aI cineticii de hidrolizd, particulard pentru fiecare tip de legdturdhidrolizatd.

Proteine. Structura proteinelor

r13

3.5.Structura proteinelor
Componenta care determind activitatea gi implicit funcliile acestei mari clase de substanfe este structura. Complexitateaedificiului molecular, a cirui stabilitate este asiguratd de interacfiuni fizice gi chimice care acoperd intreaga paleti a t[riei, de la legituri covalente pdnd la forfe Van der Waals de dispersie,este ridicatd gi divers6.. De aceea,studiul unor asemeneastructuri nu se poate face fdrd o sistematizarebape criterii riguroase.La proteine, structura se poate detalia pe pazatd, tru nivele, cu complexitate gi implicit confinut de informafie direct corelate. ln ultimii ani incepe si se contureze o abordare mai detaliatd a structurii proteinelor introducdndu-se termeni ierarhici noi. Cei mai folosifi sunt cei de structurd suprasecundard, respectivde domenii, care apar intre structura secundari gi cea tertiard. 3.5.l. Structura primari a proteinelor Este dati de secvenlade aminoacizi a catenei polipeptidice. Legarea aminoacizilor se realizeazl, aga dupd cum se cunoagte prin legdturi peptidice (amidice), care se staH bilesc intre grupdrile carboxil gi NI amino ale aminoacizilor, arnU bele in pozifie relativd a. Acest .-.l tip de leg5.turdconferd catenei I particularitatea alternanfei uH nor porliuni rigide (legdturile amidice -OC-NH-) cu por{iuni peptidice mobile (_HN_C"_CO_). Fig. 3. 12. Tautomeria legdturii Aceasta datoritd tautomeriei grupdrii amidice (Fig.3.12.).lncddin 1930,Linus PAULING gi Robert COREY,pe baza studiilor de difracfie a razelor X, realizate pe catene polipeptidice au evidenfiat cd iungimea legdturii amidice estede 1,32A fald de 1,49A, caracteristicdlegdturii simple C-N, respectiv 1,27A, pentru legdtura dubla C=N. ln structura catenei polipeptidice intri setul celor 20 de aminoacizi naturali, tofi din seria L (Tab.3.2). Din acegtiaminoacizi pentru om, noud sunt esenfiali (vezi mai departe). Caracteristicade esenfialitate,atribuitd unei substanfe se referd,Ia imposibilitatea organismului de referinfi de a o sintetiza, prezenfa sa in respectivul organism fiind rezultatul exclusiv al aportului exogen. Acest aport poate fi ori direct, atunci cflnd substanfa propriuzisd provine din exterior, ori indirect, atunci

-$- -

D (|-n

LL4

Elemente de biochimie ,1.

cdnd din exteriorul organismului provine un precursor, care poate fi modificat chimic in organismul gazda. Se utilizeazl doui sisteme de prescurtdri ale aminoacizilor, listate in tabelul de mai jos: o abreviere din trei litere gi un simbol dintr-o literd. Rota{ia planului luminii polarizate depinde de natura aminoacidului. Proprietdfi importante sunt valorile punctului izoelectric (pHi), utilizabile in precipitarea fracfionatd in gradient de pH, sau la electroforezade izofocalizare,precum gi valorile pKa corespunzS,toare funcfiilor o-carboxil gi a-amino protonate:
Tab,3.2.Aminoacizli naturali cu denumlre, prescurtdri, ualorile pI@ Si pHl
Co?H

ttt,Arn,

t-

n3!-

H.
"'//,,/CO
U

Ala, A L{+)-alanind, GlicinA, Gly, G

2H

2,35 2,34
'1.99

9,66

9,60

6,02 5,97

INH

L-(-)-proline, P Pro,

10,60

6,30

H:N\ Y

I
/.N. .CHz. ./ CHz CHz
147

Aq, R L1+)-arginine,

il

9,04 (cr-NH:')

10,76

NIi

(_\."r
Ho -. ./ cHz

L-(-)-histidinA, Hrs, H

1.82

I,17

7(O

L-(-)-serin6, Ser, S Asn, N L-(-)-asparagina,

2,21

9,15

5,68

o
HzN

tl il
wn2

z,vt

8,80

5,41

"-.:

^ J

,.a-\H

L-(+)-izoleucine, I lle,

2,36

6,02

Proteine . Structura proteinelor

cO ,H

115

I n"'Ann,

HO

Y
:
H

Thr,T L{-)-treonin5,

2,09

9,10

5,60

HO

w^2

Acidul L{-)aspartic (L-asparagic), Asp, D

2.09

9,82

2,98

,,,.f."/
r-

L-(-)Jeucini, Leu, L

I,JO

9,60

5qR

-t\,
\,2

I /-+\\
/\
HS._ NH

CH,

,/
L-(-){riptofan, Try,W
o20

2,38

5,88

|ill

\\

./ CHz

L-(-)+isteind, C Cys,

1.71

9,90 8,27(SH)

5,02

l'l>11:L

L-(+)-valini, Val,V

2,32

9,62

H2N-

ll o
)

cH2

-^,,/

""
Ln2

L-(+)3lutamini, Gln, Q

7.17

a1?

q7n

H3c\-/cHz--^,,./

Met, M L{-)-metionind,

2,28

9,21

5,06

^o-.'-t"-"u/ o

il-"'

acidL(+){lutamic, E Glu,

2,19

9,67

3,22

Phe, F L{-)Jenilalanind,

1,83

9,13

5,48

r16

Elemente de biochimie .I.

To" t"'A*",

, ,2 ,r ,\ rCHr.t.^,, ..CHr., ^.../ n Ln2 lt12

L-(-)-lirosind, Tyr, Y

* prolina este singurul aminoacid natural care nu se tncadreazd tn generald. formula Omul are nevoie de noud aminoacizi esen(iali: F, H, I, K, L, M, T, W, V. Numirul de posibilitifi de construirea unei catenepeptidice care sd confinA a aminoacizi de b tipuri este dat de relalia ao.De aceeacu cei doudzecide aminoacizise pot constmi 20100 catene.DacI masamedie a unei proteine de 100 de aminoacizi este de 13800t3 de daltoni, atunci masatuturor celor 20100 de catenear fi de 1,38.10138 de daltoni, comparativ cu masa universului observabil,estimatd Ia 1080 daltoni. 3.5.1.1. Determinarea structurii primare Deoarece toate procedurile cunoscute si utilizate pdni in prezent necesitdfragmente scurte, de I5-20 aminoacizi, stabilirea secvenfei de aminoacizi este o operafie laborioasi, care presupune parcurgereamai multor etape: a. Separarea catenelor proteinelor formate din mai multe lanfuri peptidice. Aceasti separarepresupune desfacerealegd,turilorcare existd in cazul homo- sau heteromultimerilor. De reguld asociafiile heteromultimerice sunt necovalentede aceeainteracfiunile care le stabilizeazd.pot fl desfd.cute prin utilizarea de solu{ii 8M de uree sau 6M clorohidrat de guanidind ori alte solufii saline concentrate.

13 Masa molard medie a unui aminoacid este de 138de daltoni

. Structura proteinelor Proteine

rL7

ao
ltzl

'o)

"l)
^r/
nrrnf i I rrtr

\u--r/
rar]rrcara:

*^-]*t HcoooH --.--> c u r o t r m a r e a performic ti.ef,i.eb*

punti disulfuice oxidqre cu ocid ^*l**

[.' v"r
qa1^-

dlsurrurr-ce de qrur'iri Iib6re-

i-'

resturide acid cistaic

z.oI ro+ac

t-

blocoreo grupdrilor tiolice Fig, 3. 13.DesfacereaireversibiW a punlilor dkulfurice

*-ff'

pun{ilor disulfurice. b. Desfacerea Dacd exista punli disulfurice intercatenare, odatd cu desfacerea acestora,realizatd ca prim pas, se vor desfacegi punlile intracatenare. Desfacerealegdturilor covalente S-S se realizeazl, practic prin doud metode (Fig.3.l3): S-* HS HS

I I l. l
\?HO

SH SH

ditiotreitol (forma redusa)

ditiotreitol (forma oxidata

Fig.3. M. Ditiotreitolul, agent de desfacerapunfiIor disulfurice

o prin oxidare cu acid performic (Fig.3.13-1),sulful din legdturile resturi de acid cisteic). disulfurice se oxideazdla sulfat (seformeazd.

l18

Elemente de biochimie .1,

r pdn reducere cu mercaptoetanol (HS-CH2-CHz-OH), urmate de adifia acrilonitrilului Ia grupele tiolice (Fig.s.IJ.2.a)sau alchilarea resturilor -SH formate, prin intermediul iodoacetatului (Fig.3 .I 3.2.b.).Reducerea punfilor disulfurice este urmatd de blocarea grupdrilor tiolice, deoareceacestese pot reoxida cu ugurinfd refdcdnd punfile in pozifiile iniliale sau in alte pozilii. ln locul mercaptoetanolului se poate folosi ditiotreitolul (Fig. 3.14.), o substanfd cu doud grupe tiolice care se pot oxida formdnd punfi disulfuric e intramoleculare. c. Determinarea compozitiei in aminoacizi pentru fiecare catend polipeptidici (rezultatd la punctul l, in urma separdrii). Se face dupd procedura hidrolizei acide totale urmatd de cromatografiere (de reguld in analizorul de aminoacizi). d. Identificarea aminoacizilor N- gi C-terminali. Serealizeaza dupi procedurile descriseanterior. e. Fragmentarea fiecirei catene in lan{uri cu lungime mai redusd. Pentru fragmentarese pot folosi enzime sau reactivi chimici. Fragmentele oblinute se separi gi fiecarui fragment i se determind cornpozifia in aminoacizi gi aminoacizii N- gi C-terminali. Aceasti procedurd se repetd cu diferigi reactivi de clivare,fiecare cu altd regioselectivitate. Enzimele utilizate sunt proteaze (Fig.S.15). Acesteadispun de selectivitate variabili, Utilizarea combinatd a lor permite in final obginereaunivocd a secvenleicateneisupusdanalizei.Tab.3.3.listeazd celemai folosite enzime,detaliind locul pentru care posedi afinitate.
Tab 3.3. Specificitatea de acfiune ahidrolizei peptidrnice) cu referire la Fig.3.15.
preferat Situs Tripsina Clostripaina Chinntripsina Termolisina Pepsina Proteazl (tampon stafilococici fosfat) (tampon Proteazi slalilococicd HCO:) Subtilizina Carboxipetidaza A

R1: Arg Lys, R1: Arg Rl:Tyr, Phe, Leu, lle, Val, Trp Phe, lle, R2: Tyr, Leu, Val, Trp R1: Phe, Leu, mulli alli aminoacizi R1: Asp, Glu R1:Glu R1:Mulli (oxceptie, Trp) Arg, Tyr, R2:Aminoacid C-terminal

Proteine . Structura nroteinelor

119

^.^ ^-fil-, i;--**.oo. Hfr^

@
ttt o
H3N-rnz-rn^--CH-C

ttt

o -O

^i
PZ

u ^l\r- Qfj-=,\ar..nnlggg

Fig 3. 15.Cllvarea enzirnaticd alegdturii peptidice

De notat ci specificitatea atacului este corelatd invers cu lungimea fragmentelor generate. Dintre reactivii chimici, cel mai folosit este bromocianul (BrCN) in concordanfi cu metoda pusd la punct de Bernard WTKOP gi Erhard GROSS(Fi9.3.16), Aceastareacfioneazdcu resturile de metionind. Se formeazd inifial un derivat de sulfoniu, care elimind rnetil sulfocianura, rezultdnd ca intermediar o iminolactond. Prin acfiunea apei are loc hidroliza legdturii iminice.
.,

\,i"

i-i

t: -Y-;irT\'o \.{,Lr)- "

a\l

B i T. -c-ru-5rr _<\. \d
aI{
YY

n!

niR*

(y\l
/t.'!Y

n{

fi -G-t.tl-Tt--fo cHo+
\*/"
sD

homoserinolactona
F{\L--

Fig 3. 16.Cliuarea cu bomocian a lcgdrurii peptidice

120

Elementede biochimiet.1.

f. Secvenlarea fragmentelor

Z'\

tilii \./.-l.ff
G}----l

n
I

PH:

cF3;c2l

Ou
I FRI

.mediuarl \-\
( PT}*)ilinotiozotinono

oeotida
atttrtrvou!uu!

firS

?-,il
FeniltiohidantoinS Fig. 3. 17. Mecanismul metodel EDMAN de secuenlarea catenelor polipeptid.ice

Din catenele oligopeptidice, separate,cdrora li se cunoa$te compozifia in aminoacizi, aminoacizii N- 9i C-terminali se supun operafiei de secvenfare, care deocamdatd se realizeazd,cel mai eficient cu ajutorul metodei lui EDMAN (Fig. 3.171. Aceastaconsti in tratarea solufiei care confine oligopeptida cu tioizocianat de fenil, care reactioneazecu capdtul N- terminal al catenei. Spre deosebirede metodele de derivatizare, expuse anterior, prin creareamediului acid are loc decupiareaa:rrinoacidului N-terminal cu formarea consecutivd a unui component ciclic, tiohidantoinic, care esteidentificat prin cromatografiede strat subfire sau prin HPLC. Metode se preteazi la automatizare,fiind cunoscute in prezent o serie de secvenfoareautomate. Pe l6.ngi metoda EDMAN, asistam la eforturi pentm folosirea spectrometriei de masd, clasice sau in varianta ei mai modemA (eleclrospray-massspectrometry,care permite oblinerea doar a picurilor moleculare). Utilizarea spectrometriei de mase pune problema cre$terii volatilitSlii probei, operafie care poate fi ficutd prin derivatizare,in pdncipiu dup6.tehnicile utilizate la gaz-crornatorgrafie.

proteinelor Proteine.Structura

l2r

Desigur, metoda este aplicabili catenelor polipeptidice care au grupareaN-terminald liberd. ln foarte multe cazuri aceastaesteblocati, cel mai ades prin acetilare. Pentru secven{areEDMAN este necesard o prealabildhidroliza. g. Stabilirea secven{ei catenei polipeptidice iniliale se realizeazi prin operalii de suprapunere a fragmentelor obfinute gi analizate. h. Pozilionarea pun{ilor disulfurice prin electroforeza bidimensionali a fragmentelor rese realizeazd. zultate la fragmentarea prealabild secvenfirii. Inilial se supune electroforezei amestecul rezultat Ia fragmentare, dar fdrd a fi supus in prealabil desfaceriipunlilor disulfurice (prin oxidare sau reducere - alchilare). Fragmenteleseparatevor fi supuseacfiunii vaporilor de acid perforpe dimic chiar pe placa de electroforezd,dupd care urmeazd separarea legdturi recfie perpendiculard celei inifiale. Fragmentelecare nu contin distanld (in condifiile in care parametrii disulfurice vor migra pe aceeagi electrici sunt identici) fiind gdsili pe diagonala electroforepldcii. ln schimb, fragmentelecu pun{i disulfurice vor fi divizate apirdnd in spoturi separate, de reguld deasupra diagonalei, datoriti mobilitdfii electroforeticemai mari. ln decursul separdrilor cromatografice pot apare aminoacizi neuzuali care dau reaclia cu ninhidrina. Cauzele aparifiei acestor compuEi sunt diferite: l. Proteina a fost alteratd in decursul extracfiei. Oxidarea grupelor tiolice (cisteina);modificdri fotochimice (histidina, triptofanul) etc. In acestcaz avem de face cu o viciere a rezultatelor analizei deci cu un artefact provocat de experimentator. 2. Proteina a fost modificatd.enzimatic de cdtre celuli dupd sintezi (modificare post-translalionald). Unele dintre acestemodificdri nu rezistd la hidroliza acidd sau alcalind, cum se intdmpld in cazul legaturilor serind-fosfat,serind sau asparagindEi glucide etc. Existi modificdri date de grupdri noi, stabile la hidrolizd cum ar fi hidroxilul sau carboxilul. Un exemplu este oferit de colageni, in care prolina existente QO-25% dtn totalul aminoacizilor) poate suferi par{ial transformarea in 4-hidroxiprolind; de asemenease intdlnegte gi 5-hidroxilisind. 4-carboxiglutamatul rezultl prin carboxilareapostsinteticda glutamatului.

L22

Elemente de biochimie .I, H

r+ f^co.rl
Glicilamida qi

*fi,
@zl-l
Ac. piroglutamic

r6-ofi

Y-{' V I

YY'
turu^*r'
tiroxina

o I

Y*
\ ( HrN oryl

Y I

tst,
DOPA(2,4dioxifenilalanina) (in elastina Desmozina

citrulina

Fig. 3. 18. Aminoacizi atipici tntdlnigi tn operafille de identificare

3. cei doudzeci de arninoacizi tipici sunt utilizafi de sistemelecelulare de biosintezi proteicd.pentru fabricareacatenelorpolipeptidice. pe ldnga ace;ti aminoacizi, precum qi cei mai sus prezentati, se cunosc o serie de alfi aminoacizi, cu rispdnclire mai redusd,care apar in celulii ca intermediari de biosintezi sau de degradare a diferitelor substanfe. ARN de transport precum gi aminoacil-tARN sintetazelecare,impreuni fac parte din echipamentul de recunoagteregi incorporare a aminoaciz.llor,proceseazddoar aminoacizii tipici, de aceea,incorporarea altora este practic imposibili. cdfiva dintre arninoacizii atipici intdlnili in celule sunt prezentafi in Fig.S.lB. 3.5.2.Structura secundard Structurile de ordin superior celei primare, privesc conformafia catenei (sau a catenelor polipeptidice). Aranjamentul spafial global al catenei polipeptidice depinde de totalitatea interacfiunilor intracatenare ce se stabilesc in macromolecula proteicd. o observafie a lui John K-ENDREW, primul care a analizat la rezolufie inaltd mioglobina, a stat lirbaza definirii structurii secundare. El a remarcilt ci resturile hidrofile ale aminoacizilor sunt dispuse cdtre periferia structurilor proteice glo-

Proteine , Structura proteinelor

L23

bulare, in timp de resturile hidrofobe sunt dispusecetre interiorul agregatului molecular. Ori catenelelaterale Ri corespunzdtoare resturilor de aminoacizi sunt legate de catena principald, care consti in motivul repetitiv -t-NH-cH(Ri)-co-1"-. Acest motiv, deci intreaga catenil principali, prezinti o anume hidrofilicitate, conferitd de capacitatea de a forma I'eg6turide hidrogen: a grupirii -NH- (donoare) respectiv -CO(acceptoare).De aceea, in lipsa apei, in interiorul hidrofob al macromoleculei, din rafiuni energetice,(minimizarea energiei libere), catena principali va tinde sd-gimaximizezenumirul de legdturi de hidrogen realizate cu sine insiEi. Pentru aceasta,se vor mobiliza la maxim grupdrile donoare gi acceptoare din caten6, in interac{iuni reciproce (motivate de absenta solventului protic sau a grupdrilor hidrogenodonoare sauacceptoare). ln plus, rigiditatea legiturii amidice joaci un rol esenfialin determinarea conformafiei globale, fd.cdndca migcareamoleculei sd fie posede de un numd.rmai redus de grade de libertate, fiecare legiturd amidicd, impreund cu cei patru atomi legali direct, deterrnindnd un plan nedeformabil.

/:.,,.

/i

'!i|.,.,."

),jnti:i$r1,.i \'- r \ . , - , . . l :.,

;pn

" ..\\...:.,...:
,-Ifl

N J , 1 . : . j . i ,:,!, ,

\{t

Fig.3. 19..Planurile lcgdturllorpeptidice Siunghlurile diedre Ygi Q

124

Elemente de biochimi'2,1,

Q=t8oo, Yd A)

@ = - 6 0 oY , =tmo B)

s=oo,Y=oo

cl

Ftg 3. 2O.Posibilitdfi de variafie ale unghirilor Y Si <D

lntreaga moleculi apare ca o succesiunede astfel de planuri, cetre pot aveao miscare relativd doar prin rotafiile legdturilor Co - Ccarbo'nilic (Ccr- C2), respectiv Ccr - Namidic (Co - Nl). Cuantificarea pozifiei relative a planurilor adiacentese face prin intermediul unghiurilor cliedre (Dsi Y. Acesteasunt pozitive daci rotafia se face in sensorar, atunci cdnd sunt privite dinspre carbonul cr.(F1g.3.19,). Valoarea zero a unghiurilor O gi Y, este consideratd aceea pentru care doud planuri adiacente bisecfioneazdplanul determinat de legd.turile R - Cc - H, astfel incdt cele doui planuri sd fie in configurafia cis. (Fig.3.20. schema C). Deoareceatomii nelegafi chimic se pot apropia pdnd cel mult la distanfa corespunzdtoaresumei razelor van der Waals, rezultS.o serie de restricfii supiimentare in conformafia globald a lanlului polipeptidic. Dac5.pentru un numdr mare de proteine se reprezintd intr-o diagramd pdtratd numiti diagrama Ramachandran perechile de ungh.luri Y 9i (D,pentru flecare aminoacid, se oblin zone de maximd derrsitatede puncte, denumite o, B gi L. (Fig.3.21.) Asupra acestoravom reveni.

Proteine . Structura proteinelor

r25

Diagrama RAMACHANDRAN

"180

150 -120

3C

{0

-3C

l0

60

90

12C

1s0

i8"

o
Fig. 3. 2 1. Di.agrama RAMACIIANDRAN

Fig. 3.22. Legdturi care stabilizeazd.strucfiiri secundare

Structura secundaraeste determinat[ doar de legiturile de hidrogen stabilite in catena principald, fare implicarea catenelor laterale (resturilor R ale aminoacizilor). Structura secundard se referd ia un numar restrdns de forme canonice, identificate in formd purd pe porfiuni limitate in proteinele globulare. Aceste forme ale structurii secundare, practic detalii locale, sunt caracterizatede o succesiunede aminoacizi care posed[ perechi de unghiuri V, O care ocupi o suprafafd limitatd i:r planul Ramachandran. In fun4ie de valorile concrete ale perechilor Y,O sau altfel spus de zone in care se aglomereazepunctele de coordonate Yi, (D1 se pot particulariza structurile secundaretipice, cunoscute

126

Elemente de biochimie,I,

gi sub numele de structuri secundaresau repetitive (prin aceeacA perechile Y, (Dse repetd). Structurile secundare apar in zone hidrofobe, in care Iegdturile de hidrogen intracatenare la care participa doar comllonente ale legi.turilor peptidice, depS.gesc in tdrie pe cele dintre resturile de aminoacizi. De aceeastructurile secundareapar ca elemente de organizare intermediarS.intre secvenla aminoacizilor in caten6, dati de structura primard definitd univoc, gi organizarea spaliald globalii a proteinei, care este datd de structura terfiari, la a cdrei definire particip5.,a9a dupd cu se va vedea, practic toate tipurile de interacfiuni; att&t covalentecdt qi necovalente. Fafd de structura primard, detaliul suplimentar adus de structura secundard este dat de legdturile de hidrogen intracatenare realizate exclusiu tntre grupdrile NH gi CO peptidice neadiacente(Fig.3.22 qi Fig.3.23.). Prezenta acestor legdturi coroboratd cu configurafia R a tuturor aminoacizilor naturali din structura primard a peptidelor genereazdtrei tipuri de modele canonicede structuri secundarecatenei.Ele au fost teoretizate de cdtre Pauling gi Corey pebaza studiului de difraclie de r'aze cu X a unui numdr foarte ridicat de substanfe polipeptid;.ce. Cuantificareaior s-a fdcut pebaza analizei unghiurilor Y,O in diagrama RAMACHANDRAN Ei corespund modelelor de maximi densitate din aceastadiagrami (s, I gi L) 3.5.2.1.Modele elicoidale de dreapta Stabilizareastructurii secundareare loc prin realizareaunor legdturi de hidrogen, cu frecvenld determinatd, intre grupdrile NH donoal: 9i cele acceptoareCO de pe caten6.In func{ie de numiLrul de resturi de aminoacizi per spir[ (pas), respectiv numdrul efectiv de atomi in ciclul inchis de legdtura de hidrogen, distingem mai multe modele helicoidale catnonice (Fig.3 .24.).De exemplu modelul a-helix se codilica in cu 3,6(13),(legdturilede hidrogen care se stabilesc: catena principalS din patru in patru resturi de aminoacizi deiimiteazl, un ciclu de 13 atomi). Se mai cunosc, este drept, cu o rispdndire mai redusd, gi alte tipuri de Fig.3.23. helixuri: 3,0 (10); 4,4(16)cunoscut ca model Pi (n) Ei2,7 Legdturi care (Fig.s.28.).Acesta din urmd esteextrem de rar. stabilizeazi helixuri Citeva detalii referitoarela modele helicoidale:

{r'

.i?

. Structuraproteinelor Proteine

rT7

Fig. 3. 24. Modalitdfile de formare a diferitelor tipuri de helixuri

3.5.2.1.1. Modelul a-helix (3.6,I 3) Este modelul helicoidal cel mai rdspdndit la proteinele solubile. Catena principald are forma unui gurub de dreapta (tirbu$on). Parametrii modelului ideal sunt: pasul elicei: 5,4A, numirul de aminoacizi per spiri: 3,6. Catenele laterale ale aminoacizilor sunt dispuse in exteriorul helixului (Fig.3.26.). Legiturile de hidrogen se stabilescdin patru in patru legdturi peptidice, iar ciclul inchis de o legdturd de hidrogen include 13 atomi.

zona de intoarcere
Fig. 3. 25. Dispunerea catenelor laterale la perifeta helixului

L28

Elemente de biochimie .I.

I:ig. 3. 26 Alternanfe ale zonelor helicoidale cu zone nehelicate

Modelul o-helix este un model ideal, identificat pe portiuni relativ reduse ca lungime in proteinele globulare. Aici, zonele helicate alter- vezi structurile suprasecunneazAcu cele lipsite de elicitate (Fig.3.25. dare). Numdrul de aminoacizi dintr-o zond helicatd este cuprins intre 4.-5pind la 40. Unghiurile Y gi O sunt cuprinse intre -60' gi -50o. Valorile ideaie determinate prin calcul sunt Y= 47.0 9i O= -57.8oDe aceea, in diagrama Ramachandran zona a corespunde structurii de helix. Proiectia unghiului care este fdcut de dreptele care unesc un carbon alfa de cei doi atomi de carbon alfa adiacen! lui estede 700".(Fi9.3.27.). Studii efectuate pe homopoliaminoacizi (catene polipeptidice formate din acelagitip de aminoacid) au ardtat cd tendinla aminoacizilor de a forma spontan o-helixuri este diferiti.: astfel polileucina gi polialanina de exemplu formeazd spontan cr-helixuri, in timp ce acidul poliaspartic, respectiv poliglutamic, care Ia pH neutru sunt incdrcafi negativ, formeazd catene neregulate, datoritd repulsiilor dintre gruperile carboxilat. Prin coborArea pH-ului la valori de 1,5 - 2,5, prin protonare, interacfiunile diminueazd in intensitate (rdmdn6.nddoar legdturile de hidrogen), catenele respective putdnd adopta conformafia alfa helicatd.Aceastdcomportare o prezintd gi polilisina care doar la pH = l2 devine a-helix. Este de menfionat prolina, respectiv derivafii acesteia(3- gi respectiv S-hidroxiprolina care nu se acomodeazdcu structura de helix datorita existenlei atomului de azot secundar.De ateea prolina esteint6lniti in aga numitele puncte de intoarcere ale moleculei, de fapt zone dintre doua porpuni de helix. Pe lAngdprolind, in acestezone se mai gdsegte

Proteine. Structura proteinelor

r29

frecvent glicocol, a cdrui mobilitate ridicatd este conferitd de lipsa unei catenelaterale. De altfel, intr-o diagramd Ramachandranrealizatd numai pentru acest aminoacid, punctele se distribuie aproape uniform pe suprafafi, atestd,nd prezenla glicocolului in toate tipurile de structuri, inclusiv in cele dezordonate (random coil). Un aspect care trebuie menfionat este faptul cd structura o-helix are un moment de dipol semnificativ, care polarizeazd pozitiv capdtul N-terminal, respectiv negativ capdtul C-terminal. Acestmoment de dipol Fig.3.27. ProiecSiiale direcsiiloresterezultanta momentelor de dipol ale lelegdturilor Ca-Ca gdturilor amidice, orientate paralel cu axa helixului, prin topologia specifici a stabilirii legdturilor de hidrogen.
helix alfa helix 3.10
-Ifl

Iig

@,

wlil

Fig. 3. 28.Modele helicoidale mai des tntfi.lnite

130

Elementede biochimie ,I.

3.5.2.1.2. Modelul 3, I 0 Este un model rar int1lnit ln structurile proteice. Se identificd de reguii fie la capihrl N-terminal, fie la capdtul C-terminal al helixurilor de tip alfa. Valorile medii determinate experimental ale unghiurilor diedre \y gi @ sunt respectiv-18,0o 9i -71,0o.Ele diferd de valorile calculate ale acestor unghiuri: --4,0o9i -74,0. Numdrul de aminoacizi per spird este de 3,2. Spredeosebirede dipolii legiturilor de hidrogen din catenaprincipala a a-helixului, care sunt aliniafi aproape perfect cu axa helixului, in cazul helixului 3,I0 apare o deviafie de cca. 30oa vectorului moment de dipol fap de axa helixului. 3.5.2.2.3.Modelul helix-pi (4,4( 16)) esteun model extrern de rar. Legiturile de hidrogen se stabilescdin 5 in 5 resturi de aminoacizi. Ca gi modelul 3,10, acest tip de model este intdlnit de regul5.la capetele structurilor de tip cr-helix.Parametrii rnodelului ideal sunt O = -57,1 $i Y - -69,7". ln Fig.3.2B. se prezintd modelele cele mai frecvente ale helixurilor de dreapta. 3.5.2.2.Modelele B saufoi pliate (pleated,sheets)

./ RI
:r'

ri

L/

\a
\

?r*
:ii:i

'\,,,"i$.1"4

\$

\:i

Fig, 3. 29,ModeIuI foi pliote (plisate)

Proteine. Structurap roteinelor

131

Spredeosebirede modelul cx,-helix, format pe o porfiune continud de catend,modelul B sau foi pliate este construit pe baza mai multor regiuni dintr-o catendpolipeptidicd.Acestmodel ideal confine secvenlede 5-10 aminoacizi ca lungime, unghiurile V gi O, siruandu-sein plaja -90' -> -l80o pe diagramaRamachandran. Dac5 structura cr-helixuluise stabiliza prin legdturi de hidrogen intre aminoacizii n gi n+4, in cazul modelului de foi pliate, stabilizareaprin legdturi de hidrogen se face intre porfiuni mai indepartate (in sensul structurii primare), dar care prin plieri ale catenei vin una in apropierea celeilalte. Planeitatea legdturii peptidice precum gi apropierea dintre porliunile de catene unite prin legdturi de hidrogen, conduc la planuri comune catenelorunite structura capdtiind aspectuiunei foi pliate in zona atomilor de carhon a, de unde gi numele modelului. Dupd sensul C-+N a doud porfiuni de catendunite prin legaturi de hidrogen distingem modelul paralel gi rnodelul antiparalel (r^ig. 3.29.). In modelul antiparalel, distanfeie dintre legdturile de hidrogen nu sunt egaleexistdnd o alternanti intre acestea, spre deosebirede modelul paralel in care distanlele dintre legdturile de hidrogen sunt egale (Fig.3.2s.). Aceste structuri pure, precum cr-heiixul se pot combina intre ele existdndpor{iuni p, care confin amestecuride ,,subportiuni" B-parerlele, precum gi B-antiparalele. strxcturile stabilizate foncfiunea dintre catene prin care se rezlizeazA de tip foaie plisati diferS, intre modelul antipara\el sj cel paralel. tntre catenele antiparalele legitura se face printr-o porfiune peptidicd care realizeazd.o intoarcere simpld sau in ac de p5r (hair pin). Pentru realizareafoilor plisate de tip paralel, intoarcerile simple ale catenei polipeptidice sunt insolite de risucirea uneia dintre catenele polipeptidice. Acesterdsuciri nu pot fi decdt de dreapta, din rafiuni care fin de chiralitatea aminoacizilor constituenfi. Aceasta constituie o regul6 de la care face excepfiestructura subtilisinei {o enziml proteoliticd din Bacillus subtilis gi glucozofosfatizomeraza,o enzimd glicoliticd care izamefizeazdesterul glucozo 6-fbsfatin esterulfructozo 6-fosfat.

t32

Elemente de biochimie .I,

l\4ld pcrdd

IrilII [||lt -o,r-RMG-ca \c^-MG-C\or,RMG-C rtilttilttil

ORHORHORH

lll \ or'\Nro\/ tttl R-uo

ut(

*"-s '*n -Zouur,rouu*., o-R ||rr[triltl "-*n "--"--n l l l -or.(

MG-c-\ ltilttiltttl
H O

orAMG-C\or-(MG-C\
R H O On* V

orAvG-y' tltl
RHO

f-----

>
N/od cntiwdd

ORHORHORHOR

-o,r-( MG-c\crAMG-c
tlilttiltlilttil n6trROFnOHnO t t il l

*+ = -+ = -+ =-+ o
.Nt \f aH \V JI

il

il

\ or-( nro-c\oA,'.r*-y'

il

lt

\y

OHROHROHROHR

r l t l t irr l l t i l li' l l l r-1r a .-, \ 5f'^O1'' \C*-MtqCl''

il

O7'

Nt ar1 \C*-

ll

N/

./ Cl-t

Fig. 3. 30.Mod.elul paralel Si modelul antiparalel al foilor pliate beta

Din analiza unui mare numir de date de difraclie a razelor X, Peter CHOU gi Gerald FRASMAN au dedus in 1984, pe baza frecvenfei identificdrii fiecdrui aminoacid la o structurf, de tip o sau p, o ierarhie a participdrii aminoacizilor Ia acestestructuri (Fig.S.31.). Aceastdierarhie poate fi utilizatd in prediclia structurii adoptate de diferite secvenledin catenelepolipeptidice. In acord cu acestefrecvenie cuantificat prin tendin{a a (Tcr)gi tendin{a B (TB),cei doi au sistematizataminoacizii in gase categorii: tendinld.puternicd (P),medie (M), slabd (S),indiferenti (D, tendinfd puternicd de destabilizarea structurii (DP), respectivtendinfd slabade destabilizare(DS)- Tab.3.4.

Proteine . Structura,proteinelor Tab.3.4.Proprietlllilc CHOU - FASMANale aminoaciailor

Aminoacid
Til

r33

lerarhizarefil
7

TI

lenrhizare n
M DP DP M

A.Ala
C,Cys

1.42 0.70 1.01

1.51

0,83 1.19 0.54 0.37 1.38

u./3

D,Asp
E,GIU F, PhC G, Gly H, His t, lte K, Lys
L, LeU

P M DP
D

1.13
0.57

00 08
16
t.zl

0.87
1.60

M P

M P
P
IJD

0,74 1.30 1.05

0.89

DS
M M

M, Met N,Asn P,Pro Q,Gln R,Arg S,Ser

1.45 0.67 0.57 1.11

DP
M

0.55 1.10 0.93

0.75 1.19

DP M

0.98
0.77

DS
M P M

T,Thr
V.Val

0.83
1.06 1.08 0.69 M M DS

1.70 1.37 1.47

W,Trp Y,Tyr

EGlr MtvH AAh l-t'J K tys F,FtE QGtt t,tb WTD VVd D,A6p H,Fb R'As T,Ttr q sr C,qis Y T}r l.l As.t GG' P,RD 0 02 0.4 05 0,8 1 12 1.4 16 0 0.2 0.4 0.6 08 1 12 1.4 1.6 1.8

lHirfademrgbrcdfa

Itrdita&rurndrc

bea

Fig. 3. 31. Tendinle de acomodare ale aminoacizilor cu structura a-hellx saufoaie B

L34

Elemente de biochimie .I.

3.5.3"Structuri suprasecundareqi domenii

Fig.3. 32, Pantalbumina cu ionul Ca2*ataEat

Asamblarea structurilor secundare succesivese face intr-un numAr limitat de posibilitdfi; organizarealocald a acestorstructuri se poate include ca aspectparticular, de detaliu, in structura terfiarA,sau se poate delirnita ca nivel distinct, intre structura secundard Ei terfiard. Literatura esteincd diversd privind numele acestorstructuri suprasecundare. Pentru acestea se folosesc termeni in sens sinonim ca: motiv sau structuri secundare nerepetitive. Literatura menfioneazd.trei tipuri de motive simple cro,pB gi motivul puB.Acestemotive simple se pot combina intre ele, rezultdnd motive complexe. Motivele complexe sunt sistematizatein trei mari tipuri: all-cr,, all-B gi mixte aB. Atunci cdnd motir,ul capdtd o stabilitate gi identitate (individualitate) structurald ori funcfionala el definegteun domeniura.Acestapoate avea o funclionalitate distinctd in cadruI catenei polipeptidice. Domeniul poate funcliona similar cu o catend polipeptidicd. Exemplul sintezei acizilor gragi care se realizeazd.de cdtre saseenzime diferite esteedificator.

raTrebuie menfionat cd termenul de domeniu estefolosit in unele tratate in senssinonim cu acela de motiv complex, adicd de asocialie de mai multe motive simple, fdrd autonomie structurald qi functionala.

Proteine, Structura proteinelor

r35

3.5.3.I. Motivul d,asau,helix- bucld- helix (HIII) Constd din doud helixuri unite printr-o regiune nehelicatf,. Lungimea acesteiregiuni difer6. Motivul poate fi asociatcu o func{ie specificd exercitatdde caten[ precum in cazul proteinelor care se leag5. de ADN (vezi interacfiunea proteine ADN), ori a proteinelor care leag6.calciul. Alteori catena care confine motivul nu posedd o func1ie biochimicd specifici, ci este integratd in ansambluri structurale sau funcfionale. Foarte studiat este exemplul proteinelor de legare a calciului. Primul studiu stmctural a fost fdcut pe parvalbumind, o proteind monocatenard din mugchi, in 1973 de cdtre KRETSINGER, care i-a determinat structura prin difracfie de raze X. Motivul HLH, a fost numit de autor mdnd Eljrs GF hand). Calciul se leagd in regiunea de bucld prin intermediul a doud grupdri carboxil provenind de la resturi de Asp respectiv Glu, de un carbonil din catenaprincipal[ a regiunii de bucl6 gi de o moleculd de apd. $i celelalte dou5.proteine principale care leagl calciul au o structurd asemdndtoarea motivului HLH. Estevorba de troponina C, tot din mugchi gi de calmodulina, o proteind extrem de comun6, cu rol in reglareaconcentrafiei calciului celular, in modularea unor enzime gi a unor proteine de transport. Pe ldnga motivele simple, HTH sau HLHr6 se mai cunosc ai rnotive multihelix intdlnite in cazul structurilor proteinelor mernbranare (receptorii membranari heptahelicoidali, precum rodopsina, reprezintd o clasd importantd de proteine cr).ln acestetipuri de proteine helixurile interacfioneazdreciproc fie prin intermediul unui ligand, fie direct prin intermediul unor zone de contact hidrofobe. Tot aici mai poate fi amintit modelul mdnunchiurilor de patru helixuri exemplificat de feritind. Proteina confindnd cele patru helixuri, expune spre exterior, in mediul apos zone hidrofile, in timp ce in zonele de contact dintre cele patru helixuri sunt prezente resturi hidrofobe de aminoacizi.

15numele provine de la faptul ci cele doua helixuri erau notate EF precum gi datoritd faptului cd aspectul motimlui sugera degetele mare respectiv ardttrtor de la mdna dreaptd, ro Bucli este traducerea termenului englez de loop. HLH este deci acronimul termenului helix-loop-helix. Atunci cAnd lungimea buclei este mai micd (cazul proteinelor care Ieagd ADN-ul, ea se numegte intoarcere (turn), motivul fiind cunoscut sub numele de HTH (helix-rurn-ftelix)

L36

Elemente de biochimie .1,

3.5.3.2. Mativul BBsau agrafa (cotul)F

O Coknalatzrald gN

0c o {bD
oH

Fig. 3. 33.Agrafa sau cotulbeta

Estecel mai simplu motiv care implicd.doud catene beta. Majoritatea structurilor beta antiparalele il confin. Lungimea agrafeiestein general cuprinsd intre 2-5 aminoacizi. Cel mai simplu tip de agrafa beta este cea cu doud resturi de aminoacizi.ln funclie de natura jonctriunii dintre acegti doi aminoacizi agrafapoate fi de tip I sau II (Fig.3.3J.). Celelalte modele de agrafe sunt similar construite cu agrafa din doi aminoacizi. Se mai cunosc structuri antiparalele sucesiveinteresante. Unul dintre acestea este: Motivul cheie greceascd Motivul cheie greceascd este o variantd a motilului se referi la disBB(F1g.3.34.); punerea a patru foi beta, antiparalelegi la conexiuniledintre ^, '' ele intr-o topologiecare amintegte de motivul decorativ inFig.3.34. Motivul cheiegreceascd tdlnit in constructiile si imbrScdmintea din Grecia anticd. Se pare cd acest motiv deriv[ dintr-un motiv clasic BB,care este pliat dupd un plan care trece simultan prin ambele foi. Exemplul tipic de motiv cheie greceascd se gesegte in nucleaza din Stapylococus.Astfel de motive se pot regdsi 9i in plastocianind., o proteind ce face parte din catene de transport electronic din organismele fotosintetizante, precum gi in structura anticorpilor. Structuri ale dispunerii foilor beta antiparalele sunte redate in F4g,3.35. Un model

Proteine . Stnrctura proteinelor

r37

particular de foi beta antiparaleleesteacelade ,,supra"cheie greceasce, gdsitin virusul satelit al necrozeitabacului (Fig.3.35. B).

3 35. Structuri compl.exe Fdg. careconfin motiuul cheii greceSti 3.5.3.3. Motiuulbeta - alfa - beta (FaF)

A)

B)

Fig-3.36. Motivul BaB.A) motlvul cel mai rdspdndit de macrohelix paB d.edreapta B) rnotiv cu mauohelix pap de stdnga tnthlnit doar tn subtllizint

joncfiunea dintre este cel de-al treilea motiv fundamental. El realizeazd doui foi paralele prin intermediul unui alfa helix. Principial, aceasti legdturd se poate face in doud moduri, ,,macrostructura"de helix rezultatd putAnd fi de dreapta sau de stdnga. Cu o singurd exceplie, subtilizinarT, motivul pcrB A). esteun macrohelix de dreapta (Fig.3.36. Acest motiv se gdsegte in majoritatea structurilor proteice care poseda foi beta paralele.Axele helixurilor sunt aproximativ paralele cu foile beta. Helixul mascheazdresturile hidrofobe ale aminoacizilor din foile beta. Regiunile de bucld.ce conecteaz[ structurile B gi cr au lungimi diferite (.1ela doud pdnd peste 100 aminoacizi). Bucla care leagi capdtul C-terminal al foii beta de capdtul N-terminal al helixului are de reguli funcfie de recunoa$tere.Ca exemplu de astfel de motiv complex se citeaz6.fosfotriozoizomeraza, o enzimh din calea glicoliticd construitd
17Subtilizina este o enzime proteolidce efirasi din Bacillus subtilis; aici se intdlnegte motivul Bcrp in configuralie de macrohelix de stdnga.

r.38

Elemente de biochimie ,1.

pdn repetareamotivului pcrp,Douf, motive succesive in coutilizeaz1, mun o foaie beta,astfelincdt structuraenzimeiapareca o succesiune (9cr)s

Triozo fosfat izomeraea

w
Fig. 3. 37. Modelul,,butoi" aI fosfotriozotzomerazei

Structura din Flg. 3.32. este reprezentareavdzutd de sus gi cea laterald a triozofosfatizomerazei.Astfel, catenelebeta, ugor torsionate, vor avea o orientare paraleld, precum doagele unui butoits, helixurile de joncliune fiind plasate in exteriorul acestei structuri tridimensionale. Astfel de modele sunt destul de rdspdndite. Domenii structurale Multe proteine posedd func1ii muitiple. Unei anumite funcfii ii este asociatdo porliune din catena polipeptidicd. Aceastadefinegteun domeniu structural sau un modul. Cazul dehidrogenazelorNAD* dependente estetipic. Toate posedd, NAD*-ului o zond,in care are loc ataqarea pe ldnga una sau mai multe zone in care are loc atagarea substrat-ului (urilor) sau a eventuaiilor efectori alosterici (vezienzime alosterice). Lactat dehidrogenaza, gliceinaldehidfosfat dehidrogenaza, alcool dehidrogenazagimalat dehidrogenaza,ca exemple menfionate posr:dd domenii specifice de legarea NAD-ului. De asemenea cazul anticorpilor este bine cunoscut (vezi sectiunea anticorpi). Acegtiaconlin domenii constante gi domenii variabile, bine delimitate in spa{iu.

rBIn englezi motirul este cunoscutsub numele de barrel - butoi

. Structura proteinelor Proteine

139

Domeniile structurale se pot sistematizadupi tipurile predominante de structuri secundare care le compun. (all-alfa, all-beta precum gi mixte: alfa-beta). 3.5.4.Structura terliard a proteinelor

-l-{

f'" I
D I

t. i*
puntedtsulfurld

**z*
lvl

Ao
I

d,oa
lqdfun coordlnativl

*6**J".-*A*

legdturiiontce

--|-T-l' r
va\

--T-ru

"Y
I

I rAl
'-o'

'

legdturi de hidrogen

Interacliunl Van der Whals

F?. 3. 38. Interacfiuni care stabilizead structurt tergiare

Se referd la organizarea de ansamblu a catenelor polipeptidice in spafiul tridimensional. Organizareaspafiald a proteinelor este dati de complexul de interacliuni intre catenelelaterale ale aminoacizilor adiacenfi sau nu. Pentru o structurl primard datd, posibilitdfile relativ limitate de realizare a legdturiior de hidrogen caracteristicestructurii secundare sunt completate de o diversitate combinatoriald a interacliunilor intracatenare. Funcfiile proteinelor sunt legate nemijlocit de acesteinteracliuni. Paletaforfei legdturilor implicate in structura terliari se intinde de la legdturiie covalente caracteristice punlilor disulfurice realizate intre resturi de cisteini gi se termind cu interacfiunile Van der Waals de dispersie dintre resturile apolare ale aminoacizilor hidrofobi (Fig.3.3B).

140

Elemente de biochimie .I.

Pun{ile dkulfurice. Se stabilescintre gruperile tiolice libere ale resturilor de cisteind.Datoritd energiei de legiturd ridicate (30 kcal' mol-r), contribuie intr-o mdsurd foarte ridicatd la stabilitateatermicd.a proteinelor. De aceease intdlnesc in specialla proteinele secretorii (anticorpi, enzime digestive, transportori etc.). Prezenla cisteinei nu presupune obligatoriu existenfa punfilor disulfurice. Aga cum se $tie sunt extrem de sensibilela acfiunea oxidanpilor.De aceeaanaliza substanfelorpro-. teice trebuie ficuti de o manierd care sd evite artefacturile.Aceastainseamn6. ca trebuie evitali oxidanfii care si oxideze grupdrile tiolice s,i totodatd reducf,torii care pot reduce legdturile disulfurice. Legdturile ionice. Se stabilesc intre resturile ionizate de semn contrar. Cele anionice sunt date de grupdrile carboxil ale acizilor aspartic gi glutamic gi cele cationice provin de la grupdrile NHz ale lisinei, argininei, mai rar de la histidind gi triptofan, Si acestelegdturi sunt derrsebit de puternice (energiade legdturi fiind de ordinul l0 - 20 kcal . mol-t) gi la fel ca;i in cazul puntilor disulfurice nu sunt frecvente. Legdturile coordinatiue. Se intdlnesc in cazul metaloproteinelor. Metalul este coordinat de reguli de atomi de azot (energia de legdturd estemai scdzutddecdt in cazul legaturilor ionice: 4 - 5 kcal ' mol-t). Legd.turilede hidrogen caracteristicestructurilor terfiare se stabilesc intre atomii de oxigen gi azot ai resturilor OH, C=O, NHz, pe de o parte gi atomi de hidrogen mobili (hidroxil, amino). De refinut ci nu se includ legdturile de hidrogen caracteristicestructurilor secundare.Energia lor este redusa (2-6 kcat . mol-r), dar contribufia lor este importantd prin numdrul mare al legdturilor existentela un moment dat. Legdturi (forle) Van der Waak de arientare (interacfiuni polare). Aceste interacJiuni se stabilesc intre resturile polare ale aminoacizilor fard a implica legdturile de hidrogen (cisteind - serind etc.). Energia lor este incd mai redusd, depinzdnd de distanfa dintre centrele care interacfioneazd. Legdfiri (forgel Van der Waak de dispersie (interacliuni hidrofobe). De o tirie individuaali extrem de redus6.se stabilescintre resturile nepolare ale aminoacizilor neutri apolari gi sunt extrem de importante deoarece asigurd,prin numdrul lor ridicat, stabilitatea edificiului proteic in interiorul acestuia,la adipost de mediu. intr-un mediu esenfialmentepolar. ln Substanleleproteice se gdsesc prezenla acestuiagrupdrile hidrofobe tind sd se aglomerezein interior, a iar cele polare spre exterior, Aceasti organizareare ca efect o scddere entalentropiei. Aceastdscddereeste compensatdparfial prin scdderea

. Structura Proteine proteinelor

r4l

piei ca urmare a stabilirii interacfiunilor polare gi hidrofobe pe de o parte, iar pe de altd parte prin reducereal,eminim a suprafelei de contact intre zonele hidrofobe-hidrofile, astfel incdt final, intreg procesul de ,,pliere"(folding) estespontan dr-'ci caracterizatprin variafia negativd a energieilibere. Evaluareastabiliteli unui agregatproteic in cazul particular al enzimelor se face prin determinareatenperaturii Tm (m de melting point la jumdtate a activitafii temperaturd de topire) la care are loc scd.derea enzimatice.Aceastaprin analogie cu temperatura de topire a unui cristal, care se afli in corelalie direct[ cu stabilitateastructurii sale.In acest context sunt de referinfi studiile echipei lui MATTHEWSde la Universitatea din Oregon (l9BB), care au lucrat pe lizozimul bacteriofagului 74. Lizozimul este o enzimi hidrolitici capabild sd scindeze peretele peptidoglicanic al bacteriilor, prehrdiu al intrdrii ADN-ului viral in celula gazdd.Aceastdsubstanfd. igi are analogulin lizozimul din albugul de ou, al cdrui rol este de aceasti datd protector, permitand distrugerea bacteriei.Diferenfa estede masd moleculard. In proteina nativd, aminoacidul din pozigia 3 este izoleucina. Moprin tehnici de inginerie genetici, succesivleucina cu alli dificd.ndu-se aminoacizi, mdsurdnd de fiecare dati Tm gi realizdnd studiul cu raze X al proteinei noi oblinute s-a constatat cd in toate cazurile are loc o scddere a valorii Tm. lnlocuirea cu aminoacizi cu volum mai mic (valind, alanind) creeazi spafii vide care produc scddereaTm odatd cu dimensiunea acestora.lnlocuirea cu aminoacizi cu volum mai mare gi totodatd hidroflli, precum tirozina, duce la modificarea conformaliei proteinei astfel incdt po4iunea hidrofild sd fi.e expusd in exterior, cu sc6dereagi mai accentuatd. a stabilitafii (Tab.3.5.) Tab,3.5. Variafiatemperaturii 3 cualsiaminoaciai Tmcumodificarea iznleucinei
pozitia Aminoacid 3 Valini 58.8 62.9 lzoleucini

Tm['C)]

64.7

pH (6,5). Determindrile au fostrealizate la acelagi O alteposibilitate de investigare a hidrofobicitdtiiunei anumeambiante este utilizarea sondelor fluorescente. O astfel de sondd fluorescentd este acidul B-N-fenilaminonafi-1-il sulfunic f/4NS). (Fig.3.se).

t42

Elemente de biochimie .I,

A ci d u I 8-N-feni Iam i n o-n aft-I -i I sulfo n i c

r.^ig. 3.39. Model de sondd.defluorescengdutilizatd Ia studiul structurii proteice

Analiza fluorescenfeiacesteisubstanfeintroduse in molecula proteicd ne poate furniza informafii asupra ambianfei in care se g[seste substanta.Astfel: r intensitatea fluorescentei este cu atat mai miue cu cdt solventul in care se face determinarea este mai pufin polar. Aceastadatoritd faptului cd solvenfii polari preiau o parte din energia radiafiei incidente care se disipd prin modificarea polarizdrii, reducAndastfel randamentul cuantic al procesului. r lungimea de undd a radiafiei fluorescenteestemai micd in cazul unei ambianfe hidrofile (poiare)deoareceprin interacfiune cu sonda de fluorescenfd,desigur dependentd de distanfd, o parte din radia{ie preluata de aceastaestefolositd la modificarea polarizarii ambianfei. Cu ajutorul acestor sonde sau cu substanfe fluorescente existente sub formd de cofactori (NAD, piridoxal, flavine) se pot obfne astfel informafii legatede: . topologia ambianlei (prezenfa unui anume cromofor in apropiere) r modificdri conformafionale (termice,sau legatede modificari de pH) r mobilitatea sondei. Aceasta se evalueazaprin trimiterea unui impuls de duratd extrem de scurtd (nanosecunde)a unei radiafii ltuninoase polarizate. Prin evaluareadispersiei radialiei emise de cromo,for se poate estima gradul de mobilitate al acestuia.

Proteine. Structuraproteinelor

t43

3.5.5.Structura cuaternard sub celor mai complexe proteine. Ele se gS,sesc Este caracteristicd Fiecarecatend polipepforma asociata,pnn interacliuni intercatenare. tidici poarte numele de protomer, structura rezultatd prin din interacfiunea acestora fiind un oligomer. Dupd identitatea sau nu a protomerilor ce compun oligomerul distingem homooligomeri sau heterooligomeri. De exemplu hemoglobina este un o substanli cu structurd cuaternard formatd din patru catene de doud tipuri ct gi p, Se Lespune ca hemoglobina este un heterodimer gi se noteazdcu u2B2. gdturile dintre catene sunt in majoritatea cazurilor necovalente,fapt care permite separareaelectroforetici a protomerilor. Pentru evitarea oricdror surprize, in vederea electroforezei este necesari reducerea prealabili a eventualelorpunfi disulfurice gi blocarea apoi a acestoracu iodoacetamidd.Electrof.orezaproteinelormultimerice presupune deci: cu acid tricloroacetic r precipitarea o centrifugarea a tratarea precipitatului cu tampon confinand mercaptoetanol 10 m M g iS D S , 2 % . r incdlzirea amesteculuicdtevaminute la 100"C gel. r depunereaa l0-50trr1pe t electroforezapropriuzisi. Masa moleculard a oligomerului se poate determina in prealabil prin p o coloand calibratd, asumindu-ne rezerva abaterii progel-fi.ltrare, medie de I,36. Evidentmateinei de la forma sferici, gi de la densitatea sa molard a protomerilor se determind prin electroforeza rcalizatd,, folosindu-seun amestecetalon de polipeptide. 3.5.6.Considera{ii generaleprivind stabilitatea structurii proteinelor Procesul de structurare a proteinelor este guvernat de interacliuni care se real\zeazdintrecomponentele proprii edificiului proteic pe de o parte 9i interacfiuni care se realizeazdintre componentele edificiului proteic 9i mediu. Procesulestespontan atunci cAnd variafia de entalpie liberd estenegativd (confinutul de energieliberd scade). Gradul inalt de organizare,paleta extrem de largd a tiriei interacfiunilor carell definesc,fac din proteine un edificiu extrem deftagil a cirui existenid reclamd condilii de ambiant foarte restrictive (temperaturd, pH, tdrie ionicd,lipsd ioni chelatanfi str6.ini).

r44

Elementede biochimie .I.

Structura dati a proteinelor este premisa activitAfii lor bioiogice. Odatd alteratd, aceastd stmcture igi pierde capacitatea func$onalf,. Agen;ii care produc o astfel de alterare modific{ local sistemul de interacfiuni interne proprii proteinei. Ei se numesc agenfi denaturanfi.ln funcgie de intinderea 'distrugerilor' produse de acegtia denaturarea poate fi reuersibilri,proteina putdnd reveni la structura sa iniliald, sau ireuersibild.Din prima categoriefac parte denaturanfii care aclioneaze la nivelul legiturilor slabe (Van derWaals, legdturi de hidrogen).Aceptia pot fi solufiile saline care modificd tdria ionicd respectiv pH-ul. Odatd indepdrtafi din mediu (printr-o tehnicd oarecare - dializd, gel filtrare etc.), proteina poate reveni la structura inifiala. O rnenfiune aparte trebuie fdcutd in cazul sulfatului de amoniu. Soluliile acesteishruri sunt folosite pentru precipitarea fracfionate a proteinelor (deoarece prin modificarea locali a interacfiunilor, in specialcele care privesc grupele polare are loc sciderea solubilitdlii). Prin indepdrtarea ionilor proteina devine din nou la starea iniliali. Denaturarea ireversibild are loc cu agenli care duc la formarea unor legdturi stabile.In acestcaz revenirea la structura ini{iala nu mai este posibila. Dintre acegti agen{i menl-iondm acizii minerali concentrafi (H2SO4, HCI), unii acizi organici (acidul tricloroacetic, acidul sulfosalicilic,acidul picric), acegtiafiind folosili in laboratoarele de biochimie pentm deproteinizareamaterialelor biologice in vedereaizoldrii sau modificdrii altor componente. De asem.enea produc denaturareireversibild ionii metalelor tranzi{ionale,prin formarea unor legdturi coordinative, de asemenea temperatura Ei acliunea mecanicd. Aga dupd cum s-a afirmat, structura reprezintd premisa activitifii biologice. Dar aceastd afirmalie nu trebuie sd conducd,la concluzia cd molecuia proteici actioneazdintr-o formd rigidd. Faimoasateorie lacit - cheie vehiculatd pdnd in anii 70 a fost inlocuitd cu teoria ajustdrii induse sau teoria mobilitdlii conformasionale a proteinelor. Acfiunea lor biologicd constd intr-o interacfiune la nivel molecular cu alte structuri organice. Ori acesteinteracfiuni pentru a se putea produce necesit[ o adaptareconformafionald reciprocd (unghiuri gi distanle) in scopul.minimizarii factorului steric al ecua{iei cinetice a interactiei. Aici stutliul cu raze X al conformafiei proteice nu este de un ajutor deoarecesurprinde moleculain stare rigidd. O alt5 problemd este cea referitoare la tipul de structurd adoptat de proteind. Se gtie ci structura unei substan+e este determinatS. de conliberd realizat de la care energia este minim5., Un experiment formafia

proteinelor Proteine. S:,r.uctura

145

ANFINSEN $i WHITE in anul 1960 cu ribonucleaza pancreaticd, i-a condus la concluzia cd structura primard determind univoc toate celelalte tipuri de structuri, iar activitatea proteicA depinde numai de aceastdstructurd primard. Aceastaa fost cunoscutdpdni nu de mult ca dogmd a structurii proteice. Experimentul lor a constat in tratarea ribonucleazeicu uree BM gi mercaptoetanol,cdnd s-a oblinut o denaturare a acesteienzime cu pierderea consecutivi de activitate. Dupd indepdrtarea prin dializd a rnicromoleculelor gi expunerea solufiei proteice la aer s-a remarcat o renaturare a enzimei (FigS. \.

.,-_a\ \ft-.)%'
=.--<_7
proteint nativA

=eH --,-\
,,'A " ) --r/ us-\ \ larat''a t J /l.expunere lu art .! / "u proterni rcnaturarc /,/ denaturata V

lN

mercaptoetanol

denalurare

proteina natrva

Fig. 3,a0. Denaturarea Si renaturarea ribonucleazei

Ori, in realitate, structura proteinelor in special a celor de tip oiigomer nu respectdin totdeauna acestprincipiu. ln cazurile de excep!ie, conformafia activA este diferitd de conformafia cu energie minimd. Stabilitateaconformafiei active este datd de energiade activare ridicatd care faceposibild tranzifia. 3.5.6.1. Proteinelechaperon Principiul elaborat de ANfiNSEN conform cdreia structura spafiald a proteinelor este determinatd exclusivde structura primard are gi excepS-auidentificatproteine caresupuserenaturdrii,dupd un fii in aplicare. proces de clenaturare,nu mai revin la structura iniliala deci nici la funcgionalitateainifiala. Evident, cele doud tipuri de structuri diferd prin legd.turileintra- Ei intercatenare care se stabilesc.Ribonucleaza,pe al cdrei studiu gi-a fundamentatANfiNSEN teoria, este o proteind cu masa relativ redusi, qi de aceeaprocesul de structurare poate fi condus ugor, proteina revenind dupd denaturare la conformafia corespunzdtoare confinutului energetic minim. Existenfa proteinelor care nu pot fi renaturate ,,in vitro" a pus problema ci aceste proteine posedd o structuri care difera de cea corespunzdtoareminimului global ai conlinutului energetic.ln acestcaz, energiamoleculei se plaseazdpe un minim local, iar trecerea de la acesta la minimul global evidenfiat de ANfiNSEN ar presupune dep[girea unei bariere energetice,prea ridicatd pentru a fi compatibile cu proceselevitale.

146

Elemente de biochimie,l,

lntre procesele de structurare ,,in vitro" qi cele ,,in vivo" existd diferenfe notabile. ,,In vivo", concentrafia proteici locali este ridicatd. Aglomerarea locului de structurare, Ia iegirea din ribozom, poate fi cauza unor asocieri intercatenare neintAlnite Ia procesul ,,in vivo", sau ale unor structuriri intracaten.ue nonconforme cu func{ionalitatea proteicd. ln acestecondilii apare fueasci existenfa unor proteine care asistd activ, (indnrmd) procesul de structurare. De aici gi numele de proteine chaperonls. Mecanismul prin care este realizatd asistenlaprocesului de structurare nu este complet elucidat. Avindu-se in vedere gi faptul ci proteinele chaperon faciliteazdtransferul proteinelor nou sintetizatedin citosol in unele forma{iuni infracelulare deflnilia urmdtoare pare a fi acoperitoare: Proteinelechaperon sunt proteinelecare se leagdSi stabilizeazd un conformer, instabil tn alte condipii. Prin asocieriSi disocieri cu Si de pe proteina;intd, ti determina destirwgia:fie prin structurare,fie prin asociereoligomericd, fi,e prin transport tntr-un compartiment infracelulnr ori prin comutare intre conformayii actiue respectivinactiue. Multe dintre proteinele chaperon sunt sintetizateln concentrafii ridicate la expunerea celulelor vii la stres termic, de unde gi denumirea de proteine de goctermic (hspn)z0. Doud familii de proteine de Eoc termic sunt mai bine cunoscute: hsp609i hsp70. La iegireadin ribozom, catena polipeptidicd in curs de sintezd, este preluata de hsp70, care se atageazd de catend prin recunoagterea unor secvenfehidrofobe. Se pare cd aceasti ata$area proteinei hsp70 este realizatd doar in scopul evitarii unor asocialii neproductive. La incheierea procesului de sintezi proteina chaperon se detageazd,intr-un proces ce presupune hidroliza ATP. Proteinele din clasa hsp70 posedd in porfiunea N-terminald o secvenfi conservat[ (cu structuri primard foarte asemindtoare la diferite proteine hsp70) unde se afli localizati activitatea ATP-azicdzt

ls Chaperonine, in limba francezi semnificd o femeie c?ue.ue rolul de lndrumdtoare, iniliatoare pentru tinerele fete. 20Heat shock proteins, ro< reprezinte masa molari oprimati in kilodaltoni De exemplu hsp60, hsp70, hsp90 etc. Proteinele de goc termic protejeazd prin atagareproteinele de denaturarea datoratd gocului termic sau altor surse de stress. 2' De hidrolizd aATP-ului

Proteine . Sinteznchimica a catenelorpolipeptidice (Merrifield 1963)

r47

In continuare, proteina nestructuratd este preluat.i de hsp60. Structura hsp60 se asemind cu ce a unui butoi, fiind formati prin suprapunerea a doud unitdli cu formd toroidali. Fiecare unitate este formatd din gapte subunitdfi fiecare cu masa de 60 de daltoni. Masa intregului ansambluestedeci de 2.7'60= 840kD. Procesul de structurare, asistat de hsp60 presupune mai multe cicluri atagare-detagare a proteinei pe / de pe structura hsp60. Elementul activ esteproteina hsp60 care pulseaza(igi maregte9i igi micgoreazadianietrul interior) ca urmare a unor procesede fosforilare, defosforilare. Dupa mai multe runde de astfel de migcari, proteina asistati va fi structuratd in forma corectd, flind eliberatd din interiorul proteinei chaperon.

3.6. Sintezachimicd a catenelorpolipeptidice (Merrifield 1963)

Obfinereaprin sintezi a unor catenepolipeptidicecu structurddatd a devenit stringentd odatd cu izolareagi determinareastructurii primare a analogilor naturali. $i aceastadin mai multe motive: ln primul rdnd nevoia de mai mult material necesar studiilor de structurS, proprietdfi si actiune biologicd, atunci cdnd costul ob;inerii din sursa naturald devine prohibitiv. Apoi, elaborareape baza relafiilor structurd - acliune a unor polipeptide cu funcfionalitate modificatd.,utile in diferite scopuri. De asemenea, bazat pe proprietS,file antigeniceale unor proteine, sintezalor in vedereaoblinerii de anticorpi. Reactivitateamare a grupelor carboxil, arnino, precum gi a resturilor funcfionale din catenele laterale, a complicat mult sinteza convenfionald, atdt prin nevoia utilizdrii unor reactivi de blocare pentru grupele funcfionale, dar mai alesprin procedurile sofisticatede purificare necesitate atAt datoritd reacfiilor incomplete dar gi a celor secundaregi, in vertiginos odatd cu final, randamentele scizute care se micaoreazd, cre$tereanumdrului resturilor aminoacil din molecuia dorit5. Toate aceste dificultifi au fdcut din sinteza clasic6, chimicd un instrument greoi de lucru pentru cele mai mici catene gi practic inutilizabil pentru catenecu un numd.rmai mare de 5-6 aminoacizi. O alternativd geniaid prin simplitate a imaginat MERRIFIELD, intr-o sintezi etapizatd,realizatdintr-un sistem heterogensolid-lichid. Catena atagatd polipeptidicd, in cregtere,cu capdtul N-terminal liber, se gdsegte de un suport macromolecular solid. Solulia de aminoacid cu gruparea

148

Elementede biochimie .1,

amino blocatdse adaugein exces. ln acestmod vor reaclionagrupdrile amino gi carboxil" libere.Dupd formareanoii legi.turipeptidice,excesul de aminoacidblocat se hdeperteazl prin spdlare. Seindepdrteazd, reactivulde blocare,relu0ndu-se prin ciclul de sintezi addugarea unui nou aminoacid pe suport. N-blocat.Final,polipeptida seelibereazd.de

x "*_",AY E"",---cHrct
cHaoCo---;Nllr .-{,orffiOpoI'lr6 Orpqi.l.dq

H?c:f-c|r.
CHr TDO,

/-\_*" \-J l_^

(_.ts.

Y-"

dp.ptd.

pe.t4e

p*.pltd.

p. .uporl

Hrc-1----cH._

?*'

6f

. !bltiloxbalbonil

Potlp.ptida

Fig. 3. 41. Schemade principiu a sintezeiMERNFIELD

22Gruparea carboxil se va activa cu DCC (Vezi mai departe).

Proteine . Proteinefibrilare

149

Mersul reacfiei se poate urmeri in Fig. 3.4.1. Drept suport solid, insolubil, se poate folosi, printre altele,polistirenul clorometilat (cu ajutorul clorodimetileterului). Pe acest polimer se atageazi Boc-aminoacidul23. lndepdrtarea grupei blocante se face prin tratare cu acid trifloroacetic. Seva elimina izobutend gi CO2,capdtul amino rdminAnd liber sd reac{ioneze cu cap[tul carboxil al monomerului urmator N-blocat. Reaclia presupune activarea grupdrii carbonil, care se realizeazd. cu DCC (diciclohexilcarbodiimida).lndepertarea suportului se face prin tratare cu acid fluorhidric.

3.7. Proteine fibrilare

Structura tridirnensionald a unei proteine o poate plasa intre proteinele globulare atunci cdnd diametrul gi lungimea structurii sunt de acelagi ordin de mdrime, respectiv proteine fibrilare in care raportul lungime pe diametru este mare. Proteinele fibroase, sunt formate din cateneparalele aranjate fie in fibre, f,e in foi cu lungime mare. Caracteristicile definitorii pentru proteinele fibroase sunt rezistenla mecanicd, gi insolubilitatea in apa gi solu{ii saline(diluate). 3.7.f . cr-Keratina Ca gi analogul sdu B, se gdsegtein fanere (unghii copite, coarrre, remarc6.ndu-se prin confinutul foarte mare de cisteind (22-24 %) ;i de asemenea de prolind. Structura tridimensionald a o-keratinei este reprezentatd de filamentele de o-keratina. Fiecarefilament este format din patru protofibrile. O protofibrild este formatd dintr-o pereche de duplexuri monohelicoidalespiralate reciproc(coiled coil). In fiecare catend existd un segment central cu structuri regulatd crhelicoidali. Capetele acestuia sunt neregulate, atdt sub aspectul compozifiei cat gi al lungimii. Structura principald conste dintr-un motiv repetitiv format din gaptetipuri de aminoacizi(a-b-c-d-e-f-$n.Aminoacizii a gi d sunt de regul5 hidrofobi, qi findnd seama de numdrul de 3,6 aminoacizi per spird, acegti aminoacizi formeazd urr Eir al cdrui ax face un anume unghi cu axul helixului. Prezenla resturilor hidrofobe destat' Tert butoxi carbonil aminoacidul - formd cu gruparea amino blocatd gi cea carboxil libera. Carboxilatul va ataca nucleofii legdtura clorometilenicd realiz6nd substitulia, in prezenta trietilaminei cabazd'

r50

Elementede biochimie .I,

bilizeazi, po4iune din helix expuse la solventul apos. Prin asocierea helixurilor cu structuri asemdnitoare, astfel lncdt sd se poatd manifesta interacqiuneahidrofobi intre acesteresturi ( ,,ascunse"cele doud helixuri), structura rezultatd va fi stabilizata. Stabilizarea respectiva, se poate realiza doar prin r[sucirea reciproci a helixurilor crue vin in contact. Aceastaeste de fapt explicafia structurii suprahelicatea duplexurilor monoheiicoidale, a protofibrilelor gi a filamentelor. Legdturile intercatenare dintre structurile helicoidale sunt intdrite de participarea punlilor disulfurice posibile datoritd confinutului ridicat de sulf al okeratinelor. Aceste punli disulfurice sunt obiectul propriuzis al muncii coafezelorcare fac pirul ,,permanent".ln acestproces ele desfacinipial punflle disulfurice, folosind un compus tiolic de tipul acidului tioglicolic sau tiolactic, apoi aranjeazd, pdrul dupd forma doritd, Ei intervin cu un oxidant care reface punfile disulfurice pe structura nou creatd. Prin incilzire, a-keratina se transformi in B-keratini ca urmare a reorientdrii legiturilor de hidrogen. In structura de tip beta catenelese orienteazd in foile pliate corespunzdtor modelelor beta cunoscute la structurile secundare. 3.7.2.Fibroina

OH

cHs

Fig. 3, 42. Structura stratifitatd afibroinet

Este o proteind fibrilari produsd. de viermele de mdtase (Bombix rnor[]. Structura sa este reprezentatd de un ansamblu stratificat de foi

Proteine , Proteine fi.brilare

151

beta antiparalele. structurile stratificate sunt posibile datoritd conlinutului ridicat de glicocol, care prin volumul minim al restului expus in afara planului (H), permite o apropiere intre planuri. De asemeneain fibroind se remarc[ gi un confinut ridicat de alanini (al doilea aminoacid ca mirime dupd glicocol). Structuri stratificate de tip foi beta se intAlnescin aripile pdsdrilor. Realizarea structurilor stratificate sebazeazd, pe similaritateazonelor care se gisesc la interfafa planurilor. Estevorba de zone de contact extinse de glicocol alanind gi mai rar serind (Fig. 3.42.) 3.7.3.Colagenul In lumea vertebratelor, colagenul este cea mai rdspdnditd proteind. Ponderea acesteiain totalul substanfelor proteice ale organismului, este de aproximativ 25 Vo. Numele, derivat din limba greacd semnificd: generator de clei. Se gdsegtein fesutul conjunctiv, aldturi de alte proteine inrudite ca elastina,fibronectinele, proteoglicanii. De asemeneaeste intAlnite in piele, tendoane, cartilagii, perefii vaselorde sAnge, in matricea proteicd a oaselor. Insolubilitatea colagenuiui a fost mult timp o piedicd in calea studiului acestei substanfe. Impasul a fost depdgit la constatareacd din lesutul conjunctiv al animalelor tinere poate fi extrasdo formd mai solubild, cu grad de reticulare mai redus, formd numitd tropocolagen. Aceastd substanfd formeazd un agregat trimeric cu masa de cca.2B5 kD, cele trei catene, - fiecare constituite dintr-un helix de stinga ! - fiind risucite spre dreapta, in jurul unei axe comune. O ,,moleculd" Fig. 3.43. Modele ale tripluluihelix de tropocolagen are lungimea de cca. 300 nm Ei colagenic un diametru de cca. 1,4nm. Fiecare din cele trei catenedin tropocolagenparticipd cu aproximativ 1000de aminoacizi. Se cunosc peste 12 tipuri structurale de colagen,fiecare diferind prin localizare, implicit prin structura de detaliu gi funcfionalitate (Tab.3.6 -1991). dupdAPPS

L52

Elementede biochimie .1. Tab.3.6. Principalele tipuri de colagen Ei caracterlstlcile acestora

Tip
1 I tl llr IV o1(l) cr1(ll) a1(lll) o1(lV) cl1(V) VI vll VIII IX cr1(lX) o1(X) XI cr1(Xl) c1(Vl)

Catene

Locrlizare tisularl
cr2(l) crl(ll) cr1(lll) cr2(lV) c3(V) a3(Vl) cl(Vll) piele, plaman, oase, vase tndoane, sangvine, comeee intervertebrale, cartitagit, discuri umoare vitroase piele, pEmen, vase sangvine, tendoane, intestin Membnne bazale piele, placente, vas sangvine, comee, tendoane piele, placentd, vase sangvine, aorta Piele plamin, iniml timus,

2
o1(l) o1(ll) 1(lll) cr cr1{lVi cr(V) ct2(Vl)

a1(Vll) c l ( V l l )

a2(lX) ct1(X) a2(Xl)

umoare vjtroase cornee, cr3(lX) cartilagii, o1(X) o3(Xl) Gaflilagii Cartilagii Tendoane

xrl

Structura tuturor formelor de colagen este una de tip triplu helix. Monohelixurile sunt de stdnga gi fiecare se supraspiraleazd, inspre dreapta,peste alte doud helixuri cu acelagicomportament, in jurul unei axe comune (Fig. 3.43). Prin aceastase obline o structurd ce explici marea rezistenfemecanice a fibrelor colagenice.Un detaliu al cornpoziliei chimice, face din colagen o substanfAaparte in lumea proteinelor: fiecare catene din colagen contine motivul repetitiv GIy-X-Yunde X gi Y sunt cu mare probabilitate prolind, respectivhidroxiprolina (Hyp). Cagi prolina, lisina se gasegteatAt sub formd ,,normala" dar gi sub formi hidroxilatd de 5 - hidroxilisina Hil). Prezenla hidroxilisinei, respectiv a hidroxiprolinei face posibild stabilirea unor legeturi de hidrogen intercatenarein stmctura triplului helix, ceeace ii mdregteconsiderabil rezistenfa.La procesul de hidroxilare al celor doi aminoacizi participd acidul ascorbic (Figs. $. De altfel, unele manifestfui ale carenfei in acid ascorbic, sunt datorate tocmai deficienfelor structurale ale colagenului cauzatede imposibilitatea rigidizdrii structurii saleprin punfi intercatenare. Stabilizarea tropocolagenului se face gi prin legdturi covalente in care sunt implicate cdte trei resturi de lisini. Sub acfiunea lisiloxidazei, o enzime cupru-dependentd resturile de lisini se transformd in alisind, prin oxidareacarbonului e din lisini gi pierdereaamoniacului (Fi9.3.4O.

Protei ne . Proteine fi,brilare

r53

cozH 'o'"Ao succinat a-cetoqlutarat

Cto.

C.o;

(i
"""-N-\.

Qz\

prolinh

/fv*

icid a:
prolina rest4-hidroxi

restprolina

HOTCAO

co2H succinat

C.o;

lizinhidroxilaza acid ascorbic rest 5-hidroxilizina

rest lizina

Fig. 3.44, Hidroxilarea aminoacizilnr colagenici care participd. la formarea de legdruri intercatenare

ii
""F/)

"i
{

oi'
rest lizini

riziroxidaza "tyr:,A-"

T
I

rest alizind

Fig, 3.45. Reticularea colagenului prin resturile de lkind

154

Elemente de biochimie .1.

O alte posibilitate de stabilizareintercatenaraestejoncliunea a doud resturi de hidroxilizind cu un rest de lizind. Rezultd o structuri de tip hidroxipiridiliu, care stabilizeazdtrei catene.Acest tip de legdturdintercatenard se realizeazd intre regiunea N-terminali. a unei unitd,li tropocolagenicesi regiunea C-terminaiS a unitdfii tropocolageniceadiacente, Spre deosebirede modelul cr-helix,in monohelixurile colagenicenu intdlnim legd.turide hidrogen intracatenare.Stabilizarcamonohelixului se face prin repulsia resturilor voluminoase de prolind gi hidroxiprolind. Aceasta face ca distanfa dintre aminoacizii adiacenfi sd fie rnai mare decdtla modelul a-helix. Catenete de tropocolagen se asociazdin fibrile care constau din mf,de tropocolagenexistd nunchiuri tropocoiagen.lntre catenelesuccesive un spafiu de cca. 40 nm. Acest spaliu servegte atdt ca zond de inserfie a (prin unor oligoglucide intermediul S-hidroxilizinei) dar gi ca centre de nucleatie,unde se vor plasa cristale de hidroxiapatite,(Cas(PO+)sOH) carevor forma tesutul osos.

3.8. Proteine globulare

3.8.1.Anticorpi Vertebratele gi-au dezvoltat sistemul imun care sd le protejeze de parazilii patogeni (bacterii gi virugi) gi de asemeneade substanfeleilIacromolecularecare pot pdtrunde in organism. Fdri acestsistem via{a in condilii normale ar fi imposibild. Dereglarea sistemului imun poate produce alterdri ale funclionirii intreg.rlui organism. Sindromul imunodeficienlei dobdndite (SIDA sau AIDS - acronimul de la Aquired Immunodeficiency Syndrome) este unul dintre cele mai dramatice efecte ale malfuncfiondrii sistemului imun. Tot sistemul imun, de data aceastain bund stare de funcfionare, este rdspunzdtor de dificilele probleme care apar in cazul transplantului de organe. Sistemulimun igi indeplinegte func1iade protec{ie prin: t recunoa+tereaspecificd a moleculelor strdine, care presupune discriminarea intre moleculele proprii (self) Ei cele strdine (nonself). Acestemolecule pot pitrunde in organism independent, ori se pot gdsi pe suprafafa microorganismelor. In unele stdri patologice, moleculele

Proteine. Proteineglobulare

155

proprii sunt recunoscute ca ,,streine",ceea ce genereazi aga numitele maladii autoimune. t capacitateadistrugerii agenfilor strAini l memoria acliunii, care faciliteazdun rdspuns mai rapid la o acliune ulterioard a aceluiagiagent strdin. Sistemul imun recunoagtein structura strdind, numitd antigen, wr fragment molecular numit determinant antigenic sau epitop. Recunoagtereacelulard dintre determinantul antigenic (epitop) gi situsul de legare al determinantului antigenic (paratop) se face prin stereocomplementaritate. La pi.trunderea unui agent strdin, sistemul imun poate declangadoui tipuri de rdspunsuri. Fiecare dintre acesteaeste asociatunui tip de celuli limfaticd: l. rdspuns umoral, prin intermediul unor proteine solubile, circulante, anticorpii, (numite gi imunoglobuline, notate Ig), care fomeazd complexe cu antigenii. Anticorpii sunt sintetizali de limfociteie B. cdtre celule particulare, specializate, 2. rdspuns celular, prin intermediul altor celule specializate, limfociteleT. Componentele de bazd.ale sistemuluiimun,limfocitele B gi T se dezvoltd din celule tulpind (stem) odati cu toate celulele din sdnge.Aceste celule tulpind sunt localizate mai intdi in lesuturi primare hematopoie' rlce (mdduva osoasd la adult, respectiv ficatul la fetugi). Celulele T, imature, migreazd pe calea circulafiei sangvine Ia timus (de aici gi numele de celule T), unde are loc maturizarea acestora,dupf, care tot pe CeluleleB migreazd cale umorald ajung la lesuturile limfoide secundare. direct la lesuturile limfoide secundare,unde se vor forma celulele limfatice mature Bza.lesuturile limfoide secundare sunt reprezentate de nodulii limfatici, splina, fesuturile limfoide asociate epiteliilor din tractul gastrointestinal,respiratoriu gi din piele. Rispunsul umoral Ca reacfie la invazia antigenilor, in organelelimfoide secundaregi in circulafia sangvind,apare o cantitate mare de anticorpi specifici agentului strdin. Speciflcitatearecunoagteriicuplului anticorp - antigen este esenfiali. Natura stereocomplementari a acestei recunoagteri este similard recunoagteriienzimi - substrat.Diferenfa dintre acestedoui tipuri de cupluri, este cd enzimele s-au format in prezenfa substraturilor
2a numele vine de la os: mi,duvd osoasi: bone marrow

r56

Elemente de biochimie .1,

corespunzdtore,intr-un proces evoluti% a carui mdsura este durata viegii pe pimdnt, in timp ce anticorpii, reprezintd materializarcapractic imediati a rispunsului unei agresiunisubstanliale.Existi doud teorii cu privire la acfiunea anticorpilor: (1) teoria autoinstruirii elaboratd de Linus PAULING in 1940, gi (2) teoria selec{iei clonale2s, elaboratd de BURNET, JERNE, TALMAGE 9i LEDERBERG,in 1950. Potrivit teoriei autoinstriurii, antigenul servegteca matrifd pentru plierea (structurarea) anticorpului in curs de biosintezd. Anticorpul va putea dobdndi specificitateainteracfiunii cu un anume antigen doar in urma plierii catenei asistatede acelagitip de antigen. Aceastdteorie a fost combdtuta mai intdi de cdtre Christian ANFINSEN, care, ceva mai tArziu a gi postulat principiul univocitifii relafiei structura primara - structurd spatialA (secundari, terfiard ori cuaternard). Dovada experimentald a pot fi profost oferitd prin demonstrrueafaptului cd anticorpii specifi.ci dugi in lipsa antigenului gi prin observafiaci un tip de celuld limfaticd B fabricd o singurd specie de anticorpi. De aici s-a ndscut cea de-a doua teorie, (2) teoria selecliei clonale. Aceastd teorie atestd existenfa primordiald a unei mari varietdfi de anticorpi. Antigenul va selectape cel potrivit; tn urma selecfieise va stimula producfia dirijatd a clonei. Diversitateaanticorpilor esteextrem de mare, prin urmare gi a limfocitelor de tip B. Inifial anticorpii limfocitelor B se gisesc dispugi pe suprafafa celulei, prin inser{ie membranard. Fiecareceluldposeddpe suprafafasa cca. 105moleculede anticorpi. Anticorpii legafi au capacitateade a recunoagtegi de a lega moleculele solubile sau cele existente pe suprafafa rnicroorganismelor invadante. Prin legareaantigenului, celulele B vor fi stimulate sd prolifereze gi sd producf, mari cantitafi de anticorp, identic cu cel care a fost iegat.Aceqti anticorpi vor putea fi secretafi.O limfocitd B matura poate sd producd cca. 2000molecule de anticorp / secund5.. 3.B.1.1. Structur a anticorp ilor Anticorpii sunt structuri mono- di- sau pentamerice.Unitatea de bazd.are forma literei Y gi posedd situsuri identice de legare a antigenului pe fiecarebra!. De aceeaanticorpii monomerici (IgG,IgD gi IgE - vezi in continuare) sunt agenfi bivalenli. Bivalenla anticorpului face posibill, in cazul in care numdrul de determinanfi antigenici per antigen este

25clona, reprezintd o populalie celulard care derivd de la o singurd ceiula generatoare (genitoare)

Proteine. Proteine globulare

157

egal sau mai mare de doi, reticularea antigenilor de cdtre anticorpi26. ln acest mod, se formeazd structuri voluminoase, cu mobilitate scdzut[. Diferite tipuri de legdri anticorp-antigen sunt prezentatein Fig3.47.
identice de atagare_- situsuri a determinantului antigenic

'-'-

CafenaL

CO,H

Fig, 3. 46. Structura de principiu a unitdfit de bazd a unui anticorp

Structura unitdfii rnonomerice este formatd dintr-o pereche de dimeri gi are stoechiometriaHzLz. CateneleH, numite si catene grele (de la fr'ear,y)au masa de cca 50 kD fiecare. Pe catenele H existd o zond.,aproximativ la mijloc numitd zond balama. Catenele L, (L de Ia Zight - ugor) sunt scurte gi au masa de 25 kD fiecare.Deci masa globald a IgG este de cca 150 kD. Legareacelor patru catene se face prin intermediul pun{ilor disulfurice. Structura principiald a ansamblului monomeric este prezentati in Fig. 3.46. Zonabalama permite, prin mobilitata sa, ajustareadistan{ei dintre situsurile de legare ale determinanfilor antigenici astfel incdt anticorpul sd poatd reticula determinan,tiantigenici prezenfi la distanfe diferite pe suportul unic (Fig.S.47.). ln mamiferele superioare, existd cinci clase de anticorpi (imunoglobuline), care se diferenfiazdin funcfie de catenaH, de numdrul de punli
26numdrul de determinanli antigenici de pe un antigen poard numele de valenla antigenului.

r58

Elemente de biochimie .1.

disulfurice, precum qi in func1ie de confinutul de hidrali de carbon. pe Idngd aceste caracteristici chimice de diferenfiere, cele cinci clase de anticorpi se particularizeazd. prin proprietdfi antigenice comune. Aceasta, pentru cd anticorpii ingigi au proprietatea de a induce anticorpogeneza (sunt imunogeni), prin determinanpii antigenici pe care ii poartd. Cele cinci clasede anticorpi sunt: G, M, A, D 9i E sau IgG, IgM,IgA,IgD gi IgE, la care catenele H se numescrespectivy,F, o,6 Eie. Toate acestetipuri au structura de bazi descris[ pentru IgG gi prezentatdin Fig.3.46.

lf

(rsG) anticorp
6t determinantantigenic

CrO

antigenbivalent posibilitdli de reticulare ale antigenelor bivalente

q'lr" ,'P Ts. -,'ii

oil{g*p,j.r'
r::i1wc

1ri .6$9.-Y:t!.rr

*:&rEgr.. .
:

antigenhexavalent antigenhexavalent reticulat Fig.3.47. Modalitdgi de legare a anticorpilor de antigeni bi- Si rnulti- aalenfi

Fig.3. 48.Zonelccu secuenle constante Sivariabiledin structuraunui anticorp

Protei ne . Prateine globulare

r59

Compardnd structura debaz6,a mai multor anticorpi, se constatd cA existi dornenii care individualizeazd, fiecare anticorp. Acestea au secuenpeuariabile de aminoacizi gi sunt situate la capetele N-terminale. Acestezone sunt notate Vi gi Vsin funcfie de catenelepe care se gf,sesc: L, respectivH. Acestedomenii sunt responsabile de legareaspecificaa antigenilor. in aval de secvenfele variabile se gdsescdomenii cu secuenlecu o constanfd. rernarcabilaintre diferifii anticorpi. Pe catena L se gasegte un singur astfel de domeniu C1,iar pe catena H se gisesc trei domenii constante:C1l, C112 gi Cp3.Toate domeniile,variabile qi constante sunt delimitate prin legdturi disulfurice (Fig. s.ail. Studiul sistematic al structurii anticorpilor se poate face prin procedee care cliveaz'aselectiv legituri ce menfin structurile de tip terliar si cuaternar. Comun utilizali sunt papaina, pepsina precum gi diferigi reactivi de reducere ai punfilor disulfurice (Fig.3.49). Papaina, in urma unui tratament bidnd (scurt ca duratd si cu concentrafie micd CLe enzimd), cliveazd ambele catene H, inainte de puntea disulfuricd clintre ele (in sens normal N + C). Prin aceastase formeazd doud fragmente identice Fab27, care confin situsul de legare al determinantului antigenic, gi un fragment Fc. Acest ultim fragment, format din doud porfiuni N-terminale ale catenei H este ugor cristalizabil de unde gi codificarea Fc. FragmenteleFab au capacitateade legare a antigenului, dar nu pot realiza reticulareaantigenilor polivalen!i. Pepsina,ca gi papaina,rupe doua legdturipeptidice opuse de pe catena H, dar dupa puntea disulfurici. Prin aceasta rezultd doud fragmente: unul F'(ab)zcare confine cele doud situsuri intacte de legare a antigenului si fragmentul F'c. Fragmentul F'(ab)2, care este bifuncfional, va putea lega Eiin acelagitimp reticula antigenii multivalenfi. Prin reducere,se pot obline cele doud cateneH gi cele douA catene L, cu grupdrile SH libere. Cele 12 domenii (patru domenii variabile;i opt domenii constante), au structurd spafiald asem[nfltoare, fiind formate din c6,tedoud foi beta. Domeniile constante sunt formate din 7 catenebeta antiparalele:trei dintre ele grupate intr-o foaie iar cele patru rdmase,in alte foaie. Aceste doud foi beta pot fi privite ca o topologie tip butoi in care se gdsegte motivul cheii grecegti(vezistructuri suprasecundare).

2' de laantigene binding

160

Elemente de biochimie .1.

papaina /'

,/

\ t, \..

H YsQ
t

q-D
{,/
't

/)frff
./

-%

reducere

\--

''

Fig. 3. 49. Studiul anticorpilor prin tratement cu papaind, pepsind Siagent reducdtor

ln Frg 3.50. se prezinti un model Cs intrutoul similar cu C1 (domeniile variabiie au noud catene beta vezi mai departe).Ioncfiunea dintre catenele beta se face prin intermendiul unor zone scurte de bucli. Aceste structuri delimiteazd. zone hidrofobe care pot interacfiona cu cele similare din vecinitate precum gi cu zone hidrofobe ale unor proteine cu care zonele constantevin in contact.

Proteine . Proteine globulare

l6r

'punte AB

disulfuricd

r'ig.3.50.Dispunereacateneipolipeptidicetn domeniile constantedin Ig

Domeniile constantesunt impelecheate:Crrl cu Cr (din lanlurile L si H), respectivCs2: Cs2 gi C'3: Cn3 din lanlurile H perechi. Studiile de difrac(ie de raze X au ardtat cd imperecherea se face Ia nivelul foilor prin interac{iunide tip (cateneleI,2,5 Ei4 vezi Fig.3.50.). tetracatenare hidrofob.

Fig.3.51. Dlspunerea catenelor beta (organizate tn doud fai) pentru domeniile variabiLe

162

Elemente de biochintie.1.

Structura domeniilor variabile este asemAnitoare cu structura domeniilor constante. Diferenfa consta in doud catene beta antiparalele suplimentare, care se inserd in bucla care conecteazd catenele3 Ei4 din structura domeniilor constante (cateneie3 b gi 3c Fig.3.5l.) Domeniile hipervariabile CDRI, 2 respectiv 3 sunt plasatein zonele de bucld. Pentru un domeniu, cele trei zone hipervariabile sunt dispuse foarte apropiat in spafiu, ele fiind responsabilede interacfiunea cu determinantul antigenic (epitopul). Mai mult, zonele hipervariablie de pe catena H gi cele de pe catenaL sunt plasatefald in fa!d. Ioncfiunea dintre domeniile variabile se face la nivelul foilor tetracatenare,in acest mod buclele hipervariabile fiind dispuse apropiat in spafiu. Acest mod de asamblare va generao structuri de tip butoi, realizatdcu ajutorul catenelorbeta, iar bucleleunde se gdsesc zonelehipervariabilefiind plasatepe fafa superioard a acestei construclii (aflate la capatul bralului anticorpului), delimitdnd un situs de legare,cu specificitateextrem de ridicatd, conferiti tocmai de zonele hipervariabile. 3.8.1.2.Tipuri de anticorpi
procentualia lgG umane pe subtipuri Distribufia
'lo 60 50

30 '20 10 0 .gur

tr
tG2

23

W_w
gG3

UG4

Fig. tipurilor de IgG 3.52.Proporgin. IgG este cel mai rdspdndit tip reprezentdnd70*90 % din totalul anticorpilor circulan{i. In func1ie de natura catenei y, se disting patru subtipuri de IgG, respectiv[gG l, lgG 2,IgG 3 gi IgG 4. IgG | (Fig.3.52) are doud punli disulfurice spre capitul C-terminal al regiunii baiama, IgG 2 are patru punfi disulfurice dispuse la ambele capete ale regiunii balama, IgG 3 are 15 punfi disulfurice de la balama pdnd laC',2, iar IgG

Proteine, Proteineglobulare

r63

4 are doud punfi disuifurice dispusela ambele capete ale regiunii balama. De notat cd imunoglobulinele G sunt cei mai eficaceagenfi in apirarea antibacterian5. Ele sunt singurele care pot traversa bariera placentarl, contribuind astfella protectia fetului.

,"J
I

,.,.
pie6a J (d6 ionctiun)

Fig. 3.53 Structure pentamericd a IgM

IgM este secretat ca pentamer al structurii monomerice de baza. Joncfiuneaunitdlilor monomere se face prin punfi disulfuriceprecum joining). (Fig.S.53.). 9i printr-o piesdspecialdnumiti l (de la englezescul Esteprimul anticorp secretAt, ccrrdspuns Ia antigen. Celulele B imature, (pre-B), sintetizeazdrnai intdi catenele grele ale acestui anticorp, p, care se vor cupla cu catene u$oareimpropriu numite catene-surogat. Pe mdsurd ce sinteza catenelor ugoare proprii are loc, acesteavor inlocui in structura monomerilor Ig catenele surogat, iar structura formate va fi inseratd in membrana celulard, putdndu-gi astfel indeplini rolul de a recunoagteantigenul. IgA sunt principalii anticorpi din secrefii (salivd,lacrimi, lapte, precum gi secrefiile respiratorii gi intestinale), Apare ca dimer, joncfiunea dintre cele doud structuri de bazd fdcdndu-seprin intermediul unei piese J similari structural gi funclional cu cea de la IgM. De asemeneala nivelul structurilor Fc se afli. o catend polipeptidicS, al cdrei rol se pare ci esteacelade protecfieantiproteoliticd(Fig.3.7.4.).

r64

Elemente de biochimie .1.

piesa J (de joncliune)

Fig. 3.54. Structura dimericd a IgA secretorie

Aceastaeste cunoscute sub numele de componentd secretorie pi are o masd de cca 60 kD. Pe lingd tipul care este identificat in secrelii IgA apare gi in ser, unde o gdsim fie sub formd monomericd fie di-, tri- gi mai rar de tetramer. Plaja de concentralii a tgA serice este de 1-4 g'l-1., reprezentdnd5-25 % din totalul anticorpilor serici. IgE sunt formate din lanfuri grele mai lungi gi spre deosebire de tipurile mai sus prezentate,nu traverseazd,placenta. ln condilii normale, concentrafia acestei specii este reduse (0,5 g . ft). La aparilia unor infecfii bacteriene,fungice sau virale, concentratia cregtemult. Prin ataantigenului Ia IgE legatd de celula receptoare" lmastocit sau baEarea zofild), aceasta,printr-un proces de exocitozl, va expulza histamina. Aceastdamini biogeni, provenitd prin decarboxilareahistidinei, este responsabildde manifestareaalergiilor. Efectul imediat este dilatarea $i cregtereapermeabilitdfii vaselor sangvine.Acestease pot asocia cu un tablou generai care include febra, astmul, urticaria etc. Prin modificdrile vaselorsangvine,se faciliteazdaccesulleucocitelor, al anti28IgE este secretatdde celule de tip B, gi atageazd se de celule purtetoare specifice(bazofile mastocite),careprezinti pe suprafa{alor receptori pentru porliunea Fc.

Proteine. Proteineglobulare

165

corpilor qi al altor elementeale rdspunsuluiimun (sistemulcomplement)la loculinfectiei.

CH

nl ".S

otl rl\

GIu

rF rn --v

t'ig. 3.55.Atasareafosforilcolineitninteriorul unui antlcorp specific, cu prezentarea de aminoacizi care asigurd stabilimrea substanfei.

IgD se gdsesc in cantitate extrem de redusd (concentrafialor nu de' pdgegte durata de viafd esteredusdcomparativ 0,03g l-1.De asemenea cu celelaltetipuri de imunoglobuline la cca.6 ztle, Modul concret de legare al haptenelole gi antigenelor a fost relevat prin analizede difraclie de razeX. Cazul concret al legarii fosforil colinei este citat in literaturd gi exemplificat in Flg. 3.55. Specificitateacu care anticorpii atageazd antigenii corespunzdtori a fdcut din anticorpi instrumente de separaregi analitice de un deosebit rafinament.

2eO haptene este o substan;dcare se poate atagade un anticorp preexistent,dar care singurS. nu poate induce formarea de anticorpi (nu posedd imunogenitate). Pentru a (condensatd) putea induce anticorpogeneza, cu un fragment haptena trebuie conjugatd, - vezi abzimele. macromolecular,de reguli albumind sericd. bovind.

t66

Elemente de biochimie .1,

Cromatografia de afinitate realizatd cu cupluri antigen anticorpi permite separdriextrem de specificeaplicabile amestecurilorcomplexe. Metodele imunologice de analizi sunt dintre cele mai sensibile metode cunoscute in prezent: I Radioimunoanaliza (RIA) se bazeazdpe atagareala un anticorp de titru (capacitatede legare)cunoscut a unei cantitAti dintr-un antigen de dozat iar ulterior a unei cantitdti radiometrabile dintr-un excesad6ugat. Prin diferenfa dintre maximul radiometrabil gi cantitatea radiometratf, efectiv se poate estima cantitateade dozat atagat[ inifial. o Analiza prin legare imunoenzimatici, (ELISA- Enzl'rne l-inked ImmunoSorbent Assay) reprezintd o metodd imunoenzimaticd prin care anticorpul substanlei de dozat se ata$eazd covalent de o enzimd, peroxidaza.Complexul antigen anticorp va avea o acticel mai adesea vitate enzimaticd mdsurabild,corelatdcu cantitateade antigen ataEatd. 3.8.2.Mioglobina gi hemoglobina Trecereade Ia viafa anaerobdla cea aerobi a constituit un important salt inainte pe scila evolutiv[ deoarecerandamentul energeticde utilizare al substratului glucidic cregtede mai multe ori (lB ori in cazul glucozei). Vertebratelegi-au dezvoltat doud sistemecare si asiguretransportul gi furnizarea de oxigen p6nd la celula utilizatoare: o infrastructurd constituita din sistemul circulator gi un sistem de transport gi stocare reprezentat prin hemoglobine 9i mioglobine. Cerinfele majore la care trebuie sd facd fald sistemul de stocare gi transport sunt (1) solubilitatea scdzut6. a oxigenului in ap6 gi (2) varialia relativ micd a presiunii parliale a oxigenului intre punctul de preluare ;i punctul de furnizare. Aceasta presupune o legare reversibild a oxigenului, gradul de legare depinziind de presiunea parfiald a oxigenului. Pentru activitatea de transport au fost dezvoltatehemoglobinele, iar pentru activitatea de stocaremioglobinele. Structura lor diferd pufin intre speciilelumii vertebratelor unde se gisesc.

Proteine , Proteineglobulare

L67

Fig'3'56'Dispunerea'1:::##,:,,';#:!i:;,:T:'*'"miogtobineisau Mioglobina (Mb) este o cromoproteidi care are rolui de stocare a oxigenului in mugchi. Este foarte abundentd in corpul mamiferelor acvatice (baleni, cagalot,delfin). La celelaltemamifere, mioglobina are cel mai mare grad de acumulare in muqchii scheletici gi in cei cardiaci. Culoarearogie a mugchilor se datoreazdacesteisubstanfe. Structura sa esteconstruitd pe o cateni polipeptidicd globina formata din 153aminoacizi.Acegtiase dispun pe opt cr-helixurinotate cu litre FiecaA - H, dinspre capdtul N-terminal cdtre cel C-terminal (Fi5.3.56). re aminoacid din helix se noteazd cu o cifrd.ce succedelitera helixului. Aceastdcifri specificd,in sensul N -+ C pozilia aminoacidului in helix. (aminoacidul 4 din o-helixul C se codificd C4). Ioncfiunea dintre helixuri se face prin intermediul unor porfiuni cu structurd.aleatoriecodificate cu literele corespunzdtoare helixurilor unite. La fel, aminoacizii din acestezone se codiflcd prin numere de ordine (de exemplu CD3).

r68

Elemente de biochimie,I,

ln interiorulcatenei peptidice, intr-un buzunarformatdin resturide aminoacizi, in majoritatehidrofobe, segdsegte componenta neproteicd, hemul. Acestaesteo feroprotoporfuini,cu aceeagi structurdla toatevertebratele. Ea provine din protoporfirina IX (Fig.3.57.). ln centrul structurii tetrapirolice segdsegte ionul de fer.Doarstructurileferoporfirinice care pot confin Fez* lega oxigenul. Acestestructurisunt cunoscute sub numelede structuriheminice, spredeosebire de celecareconfin Fe3", numite hematinice.
CO ?H

l-

Co ?H

C Or H
.E

CHr

CH:

t-

CHz

tt-

CO ?H

CHr

\/

,/
CH:
n3u LI-LH2

-r
CH:

HsC

Protopotf,irina

cH:CHz Eenl Ee-Protoporfirina

Fig. 3. 57. Protoporfirina D( Si Hemul, structurl din mio' Si hemoglobind.

v2

\_
<-

planul protoportirin

Fig.3. 58.Dkpunereahemului ?ntrehktidina proximalnSihistidina distaW

Proteine . Pro teine globulare

169

Structura spafiala a hemului este plane. Fe'* se stabilizeazi prin doud covalenfe gi doua coordinalii realizateprin intermediul atomilor de azot pirolici. Ionul feros rnai poate realizaincd doud coordinalii in afara planului hemului. Perpendicular pe planul porfirinic se gdsescdoud nuclee imidazolice ale unor resturi de histidind din globind. Una dintre acestecoordinafii este stabild, fiind realizatd prin intermediul azotului unui rest histidinic. Acest rest, numit histidina proximali, FB,se gdsegte mai aproape de ciclul tetrapirolic. Cealaltacoordinalie este influenlata la o distanfd de un alt rest de histidin6.,histidina distali,87, se gdsegte mai mare decdt FB neputAnd realiza astfel cordinafia, dar in acela;i timp fiind plasatd la o distan!6 suficient de mic[ de planul heminic pentm a permite o bund coordinare din partea unui alt component. De aceeaa gaseacoordinafie, realizatd cu oxigenul, monoxidul de carbon sau apa se va face cu o tirie diminuatd (Fig.s.s9).Legareahemului de componenta proteicd se face in afara legdturilor cu ferul gi prin intermediul metililor respectiv vinililor atagati macrociclului tetrapirolic (legaturi hidrofobe). Structura de ansamblu a mioglobinei este ptezen' tatd in Fig.3.59.

Fig. 3,59. Structura mioglobinei

Forma care confine oxigenul legat este oximioglobina. Legareaoxigenului esteposibild prin inserfia acestuiaintre histidina distal[ 9i Fe2*

170

Elemente de biochimie ,1.

gi stabilireaunei coordinafii. Zona de inserfie este aglomerate,astfel incAt molecula de oxigen nu va putea fi perpendiculard pe planul hemului, ci va face un unghi de aproximativ de 60'. Aceastddeplasarenu va permite o legare puternici a oxigenului, care, astfel va putea fi eliberat mai ugor. ln deoximioglobini, forma care ia nagtereprin eliberareaoxigenului, locul acestuiapoate fl luat de apd, care realizeazdcoordinafia ce stabilizeazdFe?*. Un inhibitor puternic al mioglobinei este monoxidul de carbon. Acestaare o afinitate mai mare fafd de mioglobind decdt oxigenul. Raportul afinitafilor CO respectiv al Oz fali de inelul heminic cregtede la 250 in mioglobind la 250 .103 in hemul Iiber (de globind)in solutie apoasd.Aceasta dovedeEteodatd in plus rolul pozitiv al aglomerS.riisitusului de legare al oxigenului, care labilizeazdmai mult interacliunea cu COto. La concentratii mari, sau la timpi lungi de expunere la CO acestaigi manifestdacfiunea toxicd prin competilie la legarecu oxigenul,blocAnd o parte din mioglobind, dupd mecanismul descrismai sus.
3d
t>

4p

4d1

psz*(spin inalt) (spin Fe2+ coborat) cAmp slab pse* (spin coborAt) intens cAmp

li[il-+f+f+lI

n-n ml-l-l

lT-{iF-l-+lTl W WWWM

FWffW

&w

nT-n

Fig.3. 60. Configuralia electronicd a Fe' tn hem" Explicalii in text.

Legarea oxigenului mai are o consecinld conformafionald: In deoximioglobine, Fd* pentacoordinat (flnl, participarea apei), estedeplasat ugor in afara nucleului protoporfirinic spre histidina proximald. Deplasarea de cca. 0,55 A, este datoratd neechilibrdrii vectoriale a for{elor care leagi ferul, repulsiei dintre electronii n ai inelului porfirinic gi electronii Fezn, repulsiei dintre atomii de azot porfirinici Ei azotul histidinei proximaie FB. In plus, datoritd volumului mai mare al ionului feros de spin inalt aflat intr-un cdmp de liganzi relativ slab, nu incape in interiorul porfirinei. 7n Fig.3.60.se prezintd configuralia elecuonicd a
30De altfel CO esteprodus in urme prin metabolism,O legareprea putemicl acestuia ar a pentru blocain timp mioglobina. Chiarin absenla CO, lipsaimpiedicdrii stericear m6ri afinitatea oxigen, lngreundnd eliberarea acestuia la nevoie.

Proteine . Proteineglobulare

L7l

ionului Fe'*, necoordinat gi in stare hexacoordinatd in cdmpuri de liganzi intensitate diferitd. Orbitalii hagurafi sunt ocupafi de electroni de coordinafie. Deplasareaferului in afara planului nucleului porfirinic antreneazddeformareaacestuiplan.

Planul porfirinic ffi

J. -

Fig,3.61, Deplasarea prin oxigenarea hemului a helixului atasat de histidina proximald

Prin legareamoleculei de oxigen, datoritd echilibrdrii electriceparfiale precum gi reducerii volumului ionului de fer, acestaeste atras cdtre inelul protoporfirinic, (totugi rdmdne o distanli intre centrul nucleului gi centrul atomului de Fe (0,26 A); gi aceastaeste datoratd asimetriei forfelor de legare a Fe din afara inelului porfirinic. Aceastdmodificare conformafionald,lanucleul heminic, se transmite gi la globina prin deplasareaodatd cu ferul heminic a histidinei proximale, gi a helixului FB, care la rdndul lui modificd intreaga structurA Vig.3.61.) Importanfa acestuifapt esteneglijabila la mioglobind, dar estecruciald la hemoglobine. Hemoglobinele (Hb) sunt substanfe care reprezintd cca. 90 % din masa uscatd eritrocitard. Ele au rolul de a transporta oxigenul de la pldmdn pdnd la celulelein care acestaestefolosit in proceseleoxidative. Transportul se face prin forma de oxihemoglobini (HbOr. Ele realizeazd transportul oxigenului prin echilibrele: in dr,edele pJmoncre
LIF\ rlu rI n v n7 , *

L72

Elernente de biochimie.l.

Fig, 3. 62, Tetramerul hemoglobinlc

Estimareacapacitdtii de transport a oxigenului de cdtre hemoglobina din sdngese face prin intermediul unui parametru, puterea oxiforeticd (Pox).Aceastaeste definitd ca volumul de oxigen legat de hemoglobina existentdin 100 ml de sdnge.La adultul sanetosvaloarea acestui parametru este 19,6ml oxigen.

Fig 3. 63.Modeluldeoxi- gi oxihemoglobinci

Abaterile de la vaioarea normali pot avea semnifica{ie patologicd. sistemul circulator poartd oxihemoglobina de la alveolelepulmonarr: la lesuturile unde estenevoie de oxigen prin intermediul sdngeluiarterial. Sdngelecare confine hemoglobina fdrd oxigen,se reintoarce la plimdni sub formi de sdngevenos. Sfingelevenos este mai inchis la culoare decdt cel arterial.Aceastamodificare se datoreazddeplasariimaximelor de absorblie in vizibil ale hemoglobinei, ca urmare a deoxigendrii (oxigenarii). Astfel Hb are un maxim la 560 nm, iar HbOz are doud maxime,:la 540,respectiv la 580nm. Hemoglobinele sunt substanle cristalizabile.Forma cristalelor, prermite identificarea sursei de provenienfd, aspect de utilitate in criminalisticI Tab.3.7.:

Proteine , Proteineglobulare Tob.3.7.sisteme d,ecrktaliznre pentru hemoglobine din diferitc surse

173

Sursa deH0 Om CAine Cobai

Cal

Sisfem de cristalizare Ortorom bicbipiramidal 0rtorombic Tetraedric Monoclinic

Hemoglobinele au structuri cuaternard,tetramericd (Fig.3.62.), fiind formate din doud tipuri de catene polipeptidice, din gasestructuri posibile (cr,F,y,6,e $i q ). ln cazul omului adult hemoglobinaA (HbA) posedd catenede tip c ai B: Hba- cu l4t de aminoacizigi HbB- cu 146de aminoacizi. Fiecare din acesteacontin aceeagicomponentd neproteicf,, hemul. AtaEarea moleculei de oxigen pe fiecare dintre cei patru protomeri se face similar cu ataEareaoxigenului pe mioglobind. procesul este prezentat in Fig.3.63.pentru catena cr.ln Fig.3.6J.A) in structura deoxi- se observdionul Fez*care iese din planul curbat al hemului apropiindu-se de histidina proximali (His B7). ln Fig. 3.63. B) se observd cu atasarea angulard a oxigenului antreneazd deplasareaFe2*in interiorul ciclului porfirinic. cei patru protomeri se dispun in doud subunitdfi identice crB,formdnd structuraglobauol Fl. Tot la adult se mai intdlnegteo hemoglobini secundaraHb&. Aceastaare stoechiometriaol 61, diferind prin catena 6 care inlocuiegte catena de tip B. La embrioni ;i fetu;i se intalnesc catene de tip ( (zeta),care inlocuiegte catena de tip a, de aseme_ nea catenee gi y similarelui 0. ln funclie de pH structura cuaternard a: p: poate disocia simetric sau asimetric in dimeri: Bl + 2aApA (simetric in doud,subunitdli identice) pl + of + Bf (asimetricin doud subunitd;i diferite) "l Fiecaredin cele doud tipuri de protomeri care participd la structura unei hemoglobine, au o structurd similard globinei din mioglobind (opt segmenteq,-helicoidaleA - H). Structura prezintd doar similaritili spa_ fiale, existdnd mari diferenle intre structurile primare (secvenlele acestor catene). cu toate acestediferen{e existd aminoacizi conservati "l

174

Elemente de biochimie .1.

(care pot fi gnsili la toate tipurile de hemoglobind indiferent de sursd). Acegtiasunt redatiinTab.S.B.
Tab. 3,8. aminoaciai corceruafi tn diferite hemoglobine

proxinulicare leagd Histidina ferul heminic

Permite apropierea helixurilor I9i E in bucta terminald a helixului C

FG Suporl donor deleg. dehidrcgen cusegmentul

,y
Fig, 3.M, M$carea relatiud a heterodimerilor aB prin oxigenarealdeoxigenarea hemoglobinel

lntre catenele hemoglobinei3r se manifestd o serie de interactiuni. Interactiunile cele mai puternice sunt realizate intre subunit5.file neidentice crBgi Bcr.Din acest motiv cele doud unitafi heterodimerice identice au un mare grad de rigiditate. Ele se pot deplasainsd una fafd de cealaltd,in urma oxigendrii - deoxigen[rii, printr-o mi9care de rotafie cu cca. 15", fati de o axa ce trece printre cele doud perechi cr,B. (Fig3.6 .). Aceastd mi$care de rotalie este realizatd printr-o basculare
3r In continuare ne vom referi la hemoglobina de tip A. Celelalte tipuri de hemoglobind au comportament similar

Proteine . Proteine globulare

175

conformafionald care implicd desfacerea unor legdturi ce stabilizeazdo stare gi formarea unor legdturi care stabilizeazi noua stare. ln acest proces sunt implicate legdturi de hidrogen s,ilegdturi ionice. Legarurilede hidrogen carese rup la oxigenaresunt stabilite intre hidroxilul fenolic al penultimului aminoacid al fiecdrei catene tirozina (Tyr a140, respectiv Tyr F 145, plasate in zona nehelicoidald care urmeazd. helixului H adicd Tyr crl40 - T1'rHC2, respectivTyr B 145=HC2) gi gruparea CO din catena principald care aparline unui rest de ualind Val FG5 (pozifiile cr939i B98). Legdturile ionice rupte prin oxigenare sunt in numir de opt. $ase dintre acesteasunt realizate intre catene diferite. Dintre acestea,doud sunt realizateintre capeteleN gi C terminale ale catenelor cr,doud leagd capeteleC terminale (carboxilafii) ale subunitdlilor p, de cdte un rest de lisind Lys 40 din subunitdlile cr,gi doud leagd restul Arg141 dintr-o catend o de restul Asp126 al celeilalte catene cr.Legdturile ionice intracatenare care se rup la oxigenare leagd resturile Asp94 cu His146 din fiecarecatend B. (Flg'3.6O. ln stare neoxigenatd,capeteleC-terminale ale celor patru subunitdfi sunt legate, conformafia corespunzdtoarefiind numita T (de la tense tensiontd).In oxihemoglobind, prin desfacerea celor opt legituri se eligi capetele C-terminale astfel incdt acesteadobdndesc o mare bereazd, libertate de rotafie, din acest motiv conformalia oxihemoglobinei fiind numitd R (de la relaxed- relaxatd).

co;

:i"{
H3N|j*#l
OzC

N H; fr$ffia:':t:ff:.-=*uTl=ui:,:Ilil

Fig, 3, 65.Legdturi ionice din hernoglobind afectate de oxigenare

Legarea oxigenului se face inifial la grupa heminici a catenei G, in stare T. ln aceastdstare structuatunci cdnd hemoglobina se gdsegte rile heminice ale catenelor B, sunt inaccesibile,datorite impiedicdrilor sterice exercitate de resturile de aminoacizi ai helixului E. $i legarea

t76

Elemente de biochimie .I,

oxigenului la aceasti subunitate este dificild, din cauza celor opt tipuri de legituri ionice gi a celei de hidrogen mai sus amintite. Prin legarea oxigenului la subunitatea o, hemoglobina va trece in stareaR, iar impedimentul steric dispare astfel devenind posibild, atagarea cu afinitate superioari a oxigenului gi pe subunitdlile B. Modificarea structurald cauzatd de deplasarea histidinei proximale, implicit a helixului F, se transmite la protomerul adiacent, ceeace ii mdregtesusceptibilitateala legareaatomului de oxigen. Din acest motiv constantele de afinitate la legareaoxigenului diferi intre subunitdfi, odatd cu legarea oxigenului. Succesiv, modificarea se transmite gi celorlalli protomeri. Concret, afinitatea hemoglobinei pentru oxigen cregteodatd cu ocuparea succesivd a situsurilor de legare. Acest efect indici o cooperativitate a subunitdfilor. De altfel diagramele de disociere ale mioglobinei Ei hemoglobinei pun in evidenfd acest efect, Diagama de disociere este reprezentareagradului de ocupare al situsurilor in funcfie de presiunea parliale a oxigenului. Mioglobina neposeddnd structure cuaternare va prezenta o alurd hiperbolicd a curbei de disociere,in timp ce la hemoglobind va existao formi sigmiodald (Fig.3.67.). Studiind cantitativ asocierea - disocierea oxigenului putem scrie pentru miogloblnd: Mb + Oz.. MbO2 =* de aici constanta de disociere: Cro' Co,

K,=

c"oo.

t3.ll

definind gradul de saturare Y ca raport al concentraliei situsurilor

la concentrafia Y= ^ + ocupate totali a situsurilor: Co. + K'

c^

2l 13.

qi impnrlind prin c w seobline: Elimindnd c r&o,din relalia t3.21

Y-

Cr,*^ '''""'

C"*, + Cvo

t3.31

Proteine . Proteineglobulare

L77

po, ( Po, ste sau inlocuind Co, cu presiuneaparfiall a oxigenului

de disociere se va propor{ionald cu Co, - in acesteconditii constanta exprima in torri, K ), gradul de saturareva fi:
D^ v - ---:-=Po,+K

t3.41

Evoluliagraduluidesaturarecupresiuneapa4ialeaoxigenuluiareo 66) alurd hiperbolicd (Fig.3'

Fig.3'66.Variafiagrad'uluidesaturare,almioglobincicupresiuneapargiali'a

omarimeimportantdesteP56,definit[capresiuneapar{ial6pentru caregradul de saturareestede 50 To,adicd: P-^ '3u n Vttre --P r o + K = l(' se ajunge la P5e rezolvhnd ecuaiia in Pso Introducdnd aceastdvaloarein expresia[3'4]' se obline: D ^ '"2
v'-- P o " * P s o

t3.51

t3.61

seobline: prin transforrnare

L78

Elemente de biochimie .1.

Y _po,
1-Y P5o Prin logaritmarea expresiei[3.7.]rzultd:

t3.71

( v

(v\ In reprezentarea pe coordonatele tO[,, , lgbo,) datele,ro. _ \/ V I

determina o dreaptd de pant[ unitard. ln cazul hemoglobinei, care este un tetramer, considerdm echilibrul disociatirl2: Hb(Oz)" -Hb + nO2 De aici rezulti, pentru saturafiaY o formd similard expresiei[3.6]:

[JYj

, =rs(Po,)b t%,)

3. Bl

r ' 5 0- l t o r r

P50- 26 tolri

Fig. 3.67. Curbele de saturalie ale hemoglobinei Si mioglobinei

Reprezentareacurbei de saturafie a hemoglobinei in functie de presiunea parfiala a oxigenului relevd alura sigmoidald a acestei variafii comparativ cu a mioglobinei

Y-

p3,
p3,+K

el t3.

Prin rearanjareaecuafiei [3.9] se obline:

32Acest tip de echilibru presupune un mecanism de legare de tip ,,totul sau nimic" sau altfel spus un mecanism concertat. (Vezi reglarea activitelii enzimatice modelul MWC)

Proteine, Proteineglobulare

179

(Po, )"

1_Y
Lg (Y/1-Y)

t3.l0l

Prin logariftnare ecuafia [3.10]devine:

Fig. 3. 68. Reprezentareaecuasiei [3.11] pentru hemoglobind

b - ([.+'l 1 - Y ' = n,rs(p", ) - lg(K)

lu 13.

La semisaturafie, Y = 0,5,ceeace duce Ia anulareaexpresiei[3.] I]. De aici rezultd K= (pso)"' Prin reprezentareape intreg domeniul presiunilor parfiale a variafiei Y ) ..,( mdrimii l0l " \ . 1 _ YI' nu se obgine o dreaptd, cum ar fl de agteptat, ci o curbd sigmoidala (Fig. 3. 68.) Porliunea centrald din vecindtatea ordonatei nule poate fi asimilatd cu o dreaptd.Panta acesteia reprezintdcoeficientuln din ecuatia [3.11] cunoscut sub numele de coeficientul lui llitl. Domeniul in care acesta ia valori indicd existen{a sau inexistenfa cooperativitdfii, respectiv intensitateaacestuiproces.Un coeficient n=l atestdlipsa cooperativitatii, cu alte cuvinte independenla afinitdgii legdrii unui ligand oarecare,in particular oxigenul, de legarea ligandului Ia alte situsuri din aceeagi structurd multimerici. Un coeflcient supraunitar indici o cooperativitate pozitivd, adicd o cregterea afinit5;ii de legare a ligandului prin atasareaprealabild pe alt situs a ligandului respectiv, sau un n<l atestd o cooperativitatenegativ5,adicd o reducere a afinitdfii legdrii prin legare prealabilade alt situs.

r80

de biochimie .I. Elemente

Prelungind segmentelede dreapta ini{ial Ei cel final pdna la intersecfia cu ordonata, se oblin valorile -lg(I(I) gi -lg(K4), din care se por deduce valorile constantelor de disociere corespunzdtoarelegdrii primei gi ultimei molecule de oxigen pe tetramerul hemoglobinic. Inversul acestor mdrimi este o mdsurd a afinitdlii subunitdlilor respective pentru oxigen. Valoareaprimei constante de disociere este mare (cca. I02),in timp ce K4 = 1. Raportul afinitdgilorpentru legareaultirnei gi primei molecule de oxigenpe molecula de hemoglobini esteagadar cca. I00. Dacd nu ar exista interdependenfa sau cooperativitatea celor patru situsuri de legare a oxigemrlui din molecula hemoglobinei, eficienfa transportului oxigenului de Ia sursd (alveolelepulmonare), la destinafie (capilarelelesuturilor tinta) ar fi mai redusd. Un exemplu este ediflcator. Considerim cd.: Presiuneaparliala in alveolelepulmonare este de 100torri. Presiuneapartiald din lesuturile de eliberare a oxigenului este de 20 de torri. In condiliile unui coeficientde cooperatiuitatefl=2,8 gradul de saturare alveolar este de Y"iu= 0,98, iar gradul de saturarein capilareleunde = 0,32.Cantitateade oxigen transporse elibereazdoxigenul estede Y"up pldm&n tatd de la la lesuturi este proporfionald cu diferenfa dintre cele doud valori ale gradului de saturareAY. = 0.66. Pentru un coeficientde cooperatiuitateunitar (lipsa cooperativitifii) = 0,43, ceea ce conduce la AY" = 0.36. Raportul AY" / Yau= 0,79 iar Y"uo AY" = l,B3 poate fl considerat o mdsurd a eficienlei cooperativitdfii in transportul oxigenului. Factori suplimentari care afecteazA afinitatea hemoglobinei fafd de oxigen Efectul Bohr Afinitatea mioglobinei pentru oxigen este independentd de pH gi CO2pe un domeniu larg. Spre deosebire de mioglobini, hemoglobina este sensibild la varialii de C02, implicit de pH, in domeniul fiziologic. Astfel, la cregtereaconcentrafiei de CO2respectiv la cobordreapH-ului, finitatea pentru 02 scade,ceea ce provoacd o disociere a acestuiade pe hemoglobini33.
33Concentralia CO2influenfeazd pH-ul prin echilibrul CO, + H2O>tI* + HCO3-2. Aceastd reaclie este catalizatE. de anhidraza carbonicii.

Proteine . Proteineglobulare

181

(pCO)Z> (pCO2r

Fig.3. 69.Influenla concentraflci d.edioxid de carbon, respectiva pH-ului asupra afinitdsii ansdrii oxigenului de hemoglobind.

Prezenfaabundentd.aCOz este constatatdin fesuturile cu activitate metabolicd intensd, ca rezultat al proceselor oxidative exergonice.Nevoia de oxigen estefireasc[, hemoglobinapreia H* pi CO2gi elibereazd in anul 1904. Oz.Fenomenul a fost pus in evidenla de Christian BOHR34 Fenornenul invers pus in evidenla de I.S. HALDANE, are loc in plimdn gi constd in eliberareaH* gi a CO2concomitent cu preluarea Oz, c& urmare a concentrafiei crescute a oxigenului. Legdtura dintre 02, Hn 9i COzestecunoscuti sub nurnele de efect BOHR. In F4g.3.69. se prezintd dependenfa sirnilard a afinitdgii hernoglobinei de concentrafia COz, protonilor (pH). respectivde concentrafia Protonii nu sunt de fapt nigte efectori alosterici (vezi alosteria la enzime), deoatece nu interac{ioneazdcu un situs specific din structura proteicS.. Ei vor protona resturile suscepproducAnd tibile, astfel modificd.riin numdrul ionice gi a celor de histructura legdturilor 9i drogen. Existd insd centre importante, care prin protonare af.ecteaz6.mult stabilitatea Fig. 3. 70.Modelul molecular al 2,3 -difo sfo glicer atului structurii hemoglobinei. Acegtia sunt aminoa(2,3-BPG) cizii N-terminali din catenele o, care in stare
3afiziolog danez, talel celebrului flzician Niels Bohr

182

de biochimie.I. Elemente

protonate vor putea menfine legitura ionicd cu cateneleo vecine (FE 3.65.).Similar, nucleele imidazolice ale histidinelor B146,prin protonare, vor putea menline legdturile ionice cu resturile Asp B94din aceleagi catene. Dioxidul de carbon influenfeazd afinitatea hemoglobinei fafd de oxigen nu numai prin dependenla directd asuprapH-ului, ci gi prin legarea chimicd sub formi de carbamat:R-NH2+ COz>R-NH-COO-+ H*. Echilibrul acesteireactii este deplasat spre dreapta odatd cu cre$terea presiunii parliale a dioxidului de carbon. Prin formarea carbamatuIui, grupirile amino, potenlial cationice devin anionice. ReacFa este particular irnportantd pentru capeteleN-terminale ale catenelor cr,care pot stabili legdturi ionice cu resturile cationiceArgo141. Spre deosebire de H" gi COz, 2,3-difosfogliceratul (2,3-BPG) (F1g.3.70.) este un efector alosteric autentic, prin selectivitatealegdrii sale. Observafia lui Ioseph BARCROFTcd afinitatea pentru oxigen a hemoglobinei in solufie apoasd (pso= I torr) este de cca. 26.de ori mai mare decdt in eritrocit ( p5s = 26 torri), a fost explicatd in 1967 de Reinholdgi Ruth BENESCH , pebaza rolului jucat de 2,3-BPG. ln Tab.3.9.Se reprezintd concentraliileeritrocitarenormale pentru substanleleintermediare ale glicolizei.
Tab.3.9. Concentraliile eritrocitare normale ale unor intermediari glicolttlci Component Glucoz6 6- P GlucozoFructozo6- P 1,6P FructozoDihydroxiacetonP 3- P Glicerinaldehid1,3-bislosfoglicerat 2,3' bisfosfoglicerat 3 - fosfoglicerat 2 - fosfoglicerat Fosfoenolpiruval Piruvat Lactat

5000
OJ

14 31 138 19 1 4000 118 30 23

q,t

2900 p-1=-\--l-\\-*\-R
lnositol hexa/bsfat (IHP)

n-\-'-\----t \\\\ \...4--\-on

D -

ll n-D-^ I

R lnositol pentafosht (PP)

Proteine, Proteine membranare

183

Concentrafiileeritrocitare ale 2,3-BPGqi ale hemoglobinei sunt egale (aproximativ 44,5 mM). Structura 2,3-BPGconline cca. patru sarcini negativela pH-ul fiziologic. Acest ion se inserd intre cele doud catene beta, ale formei deoxi, unde va fi legat de sarcinile pozitive ale formelor protonate din His2, LysB2gi His143.Prin legareaionicd.a 2,3-BPG,se stabilizeazd forma deoxi, care va aveadeci o afinitate redusd fa!d.de oxigen. ln urma oxigenflrii, cavitatea dintre cele doud subunit[1i B19i B2 devine mai mici si prin urmare, 2,3-BPGva fi expulzat. La alte specii rolul 2,3-BPGpoate fi jucat de substanle diferite, dar care posedd de asemeneasarcini negative, provenite cel mai ades din resturi fosfat. La pegti ca substanfareglatoareacfioneazeATP sau GTP' La reptile gi pdsdri se int6.lnescderivali fosforilafi ai mioinositolului: inositolpentafosfatul(IPP)Eiinositol hexafosfatul(IHP).

3.9.Proteine membranare
Cu toate ci structura fundamentald a membranelor este datd de stratul dublu lipidic, diversitatea funcfionald a membranelor celulare este in ultimd instanfd datoratd proteinelor membranare. Proteinele membranare asigurd: o legdtura dintre citoscheletgi matrixul extracelular, r legitura dintre celule de acelagitip din cadrul unui fesut, . transportul moleculelor gi ionilor din interiorul forma{iunii delimitate de membrani, in exterior, r recepfia semnalelor chimice din exteriorul celulei gi-sau organitei celulare, I cataliza enzimaticd a unor reacfii specifice,localizate membranar (ATP-azagi succinat dehidroge\aza din membrana mitocondriald internd) etc. Odatd cu evolufia organismelor, speciaiizarea celulard duce la diversificareafunc{iilor membranelor, la aparilia membranelor formafiunilor infracelulare. Dace tipul de lipide rf,mdne aproximativ acelagi in acestemembrane, factorul variabil se referd atdt la raportul proteind - lipide, cdt mai alesla diversitateatipurilor de proteine intdinite. In medie, raportul masic proteind: lipide pentru o membrand plasmatici estecca. 1: 1. Acest raport suferd varialii de la 1: 3 la celulele mielinice la 3: I la membranele interne ale mitocondriilor. Trebuie menfionat cd pe lflngd componentele lipidice 9i proteice, membranele mai con{in gi componente glucidice ata$atefie de proteine

r84

Elemente de biochimie ,1.

(glicoproteine)fie de lipide (glicolipide),care contribuie de asemeneala rafinarea selectivitifii membranei, cele trei clase fundamentale de substanfe bioactive integrdndu-se func$onal la nivelul membranelor. catenele oligoglucidice atagatefie de proteinele sau lipidele membranare, forrneazi un invelig celular, hidrofil, numit gticocalix. 3.9.1. Modalitrifi de interac{iune a proteinelor cu straturile dublu lipidice Multe dintre proteine slJnt integral membranare, (intrinseci), adicd, strebat membrana, apirAnd ca structuri bicefale, cu regiuni de ambele pdrli ale stratului dublu lipidic. spre deosebire de proteinele solubile, proteinele integral membranare trebuie si posede zone hidrofobe la contactul cu catenele hidrofcrbeale componentelor lipidice. ln interiorul proteinei care strdbate membrana pot exista gi zone foarte hidrofile chiar canaie.Termenul de porind esteconferit proteinelor membranare intrinseci care posedd astfel de canale prin care pot trece molecule hidrofile sau ioni. Zonele aflate in interiorul membranelor se pot identifica din diagrama de hidrofobicitate [vezi lipofllicitatea proteinelor). Porliunile proteice transmembranare sunt de reguld cx-helixuri. Traversareazonei puternic hidrofobe a duplexului membranar obligd legiturile peptidice, hidrofile, sd,stabileascd intre ele un numir maxim de legituri de hidrogen. Ori, aceastase realizeazi cel mai bine prin intermediul structurilor de tip helix. Porfiunile externe ale proteinelor membranare pot fi identificate pe mai multe cdi. Prima dintre ele este iodurarea nucleelor tirozinice cu peroxidazdin prezenla iodurii de sodiu qi a apei oxigenate;o altd posibilitate ar fi utilizarea enzimelor proteolitice. In fine, por(iunile externe ale proteinelor se mai pot identifica prin utilizarea unor anticorpi specifici, eventual marcafi3s. Pe o catend proteicd se pot identifica unul (Fig.3.71.A) B). Porfisau mai multe heiixuri transmembranare (Fig,3.71 catena peptidicS in spafiul unile din aflate fie in citosol, fie extracitosoiic,con{in resturi hidrofile de aminoacizi. ln cazul existenlei mai multor porfiuni de a-helix pentru o anume proteini, acestea se plaseazdsub forma unor mdnunchiuri, expundnd cdtre carbocatenele lipidelor, resturi hidrofobe (spre exterior), iar cdtre interior, catena poate expune atdt zone hidrofobe cdt pi hidrofile, dependent de gradul de stabilitate cerut, deoarece interac{iunile de tip legdturd de hidrogen
35 Marcarefluorescentd

Proteine . Proteine membranare

185

sau dipol-dipol sunt mai puternice decdt cele hidrofobe. Trebuie menfionat cd helixurile membranare au o funcgionalitate complexS. care presupune interacliuni cu alte specii (ioni sau molecule) Ori acesteinteracfiuni sunt dependente de natura aminoacizilor de contact. Extracfia proteinelor intrinseci in vedereastudierii lor, se poate face doar prin distrugerea integritafii duplexului lipidic prin utilizarea detergenfilor. Uneori, interacfiunile hidrofobe proteind: lipide, in cazul proteinelor intrinseci sunt amplificate prin atasarea coualentd de catene acil (hidrofobe) Ia nivelul grupdrilor NHz, SH sau OH din resturile aminoacil ale proteinei. Catenele hidrofobe astfel ata$ate vor fi inserate in interiorul duplexului lipidic.

proteineintrinseci mono ti multi helix

fa!a extracitosolicd lipidic duplex

fafa
citosolici

dncord hidrocarbonati

B)

Fig. 3. 71.Proteine membranare intrirueci

Un aspectimportant legat de proteinele intrinseci este acelalegat de punfile disulfurice. Acestea se pot stabili de reguli doar in spafiul extracitosolic, citosolul constituind un mediu prea reducdtor pentru existenfapunlilor disulfurice. Tot in spafiul extracitosolicse gisesc atagate9i oligoglucidele.

186 zoni hidrofrld

I

de biochirnie.I. Elemente

@8

exterior hidrofob

Fig. 3.72. Mdnun.chi dcpatruhelixwiyffi;:;r"r"nare

spreexterior expun caretsi

Alte proteine sunt plasate spre sau la exteriorul stratului dublu lipiacestora dic. Ele se numesc proteine perifericesau extrinsecf.Separarea se po?te facepur si simplu printr-un tratament cu solufii saline diluate. Proteinele periferice (fie citosolice {ie extracitosolice)pot fi atagate de membrand prin intermediul unor alte proteine intrinseci, cu care stabilescinteractiuni necovalente (Fig.3.73A gi B), sau pot fi ata$atede membrand prin intermediul ancore hidrocarbonate. Ancora hidrocarbonatd (formatd din resturi acil sau farnesil Fig.3.74.) se leagd covalent de proteina perifericd.
proteind perifericd extracitosolici fata extracitosolicd

iiilj j.fljliiiijiir;j::
:i:irilii.,rr :i.;,,ii,''

llllrit,:li. ilfr, :' :.

it..,r: t:,:_.7

1i;:;ii

I -.";

fafa citosol

proteini perifericd citosolicd

Fig. 3. 73. Atasarea necovalcntd a proteinelor periferice de mpmbrand

Proteine . Proteine membranare

Legarea covalente de ancore pentru ata$areaproteinelor de membrane.

ancora miristoil

fmffff ili / >llilt )l )l tfi [[ff

ancorA / tioester / /

Fig. 3.74. Trei tip.uri de a ncore rezultate prin acilarea resturilar de aminoacizi

Legdtura dintre componenta proteicd ;i lipidele membranare poate fi intdriti prin ataEarea covalente a unor catene care pot intreracfiona suplimentar cu membranele.Acestecatene poarte numele de ancore, gi sunt de cele mai multe ori resturi acil gras.f)etectarealor se poate face prin experimente ,,in vivo", cultivand celule pe medii ce confin acizi gragi tritiali, urmdnd ca dupi separarea proteinelor gi conjugatelor acestora,catenelepeptidice ce confin ancorelemarcate sd se identiflce pe placa de electroforezd.. covalentd l. Ancora miristoil. Un motiv des intAlnit esteata$area a unui rest miristoil (Cl4), la nivelul aminoacidului N-terminal al componentei proteice. Acest aminoacid este in majoritatea cazurilor glicocolul. Legarea se face printr-o legd.turdamidicd, fiind catalizatd de o 36). miristoil-CoA: protein N-rniristoil fransferaze(NMT |oncliunea glicocol miristoril este extrem de puternici fiind rupte doar de hidroliza acidd sau alcalind. De asemeneablocheazd degradareaEDMAN (prin blocareacapitului proteic N-terminal).
36 acronimul denumirii engleze

188

Elemente de biochimie,I.

Exemple de proteine ancorate prin miristoilare sunt proteinkinazn cAMP dependentd, tirozinkinaza pp6d", calcineurina (o fosfatazi specifici), subunitatea a a proteinelor G. 2. Ancore de tip acid gras (tio)esterice Acizii gragide tipul acidului palmitic, stearic,oleic gi mai rar miristic pot constitui ancore pentru proteine. Ioncfiunea se face la o cisteind, eventual serind sau fteonini, prin intermediul unei iegaturi tiolesterice (cisteina)sau esterice (in celelalte cazuri). Aminoacidul care reaJizeazd, joncfiunea nu esteneapdrat terminal. Legdturiletiolestericepot fi rupte foarte ugor prin tratare cu hidroxilamindin mediu uEorbazic. Exemple de proteine ancorate prin ancora (tiol)esteric[ sunt: receptorii cuplafi cu proteine G, glicoproteinele de la suprafala unor virusuri etc. 3. Ancore prenilice de tip tioeteric

restfarnezil

restgeranil-geranil Fig. 3. 75.Ancore prenilice

Unit[file prenilice sunt formate din mai multe uniteli izoprenice, cel mai adeseatrei (farnesil)sau patru (geranilgeraniol)Fig.3.75. Acestease atageazdde un rest de cisteind. Joncfiunea se realizeazdla capdtul C terminal. lnainte de atasareultimii aminoacizi sunt CAAX (C - cisteind, A - aminoacid alifatic, X - aminoacid oarecare).Dupd realizarealegdturii tioeterice,la nivelul cisteinei, are loc exciziaproteoliticd a subunitdlii AAX, astfel incAt cisteina va deveni aminoacidul C-terminal. Procesul

. Proteine memb Proteine ranare

r.89

este desevdrgitprin metilarea acestui carboxil. Prin aceasta are loc o mdrire suplimentard a lipofilicitdlii joncfiunii. 4. Ancore fosfatidilinositolice. Sunt motive de o complexitate ridicat6. Catena polipeptidicd este ancorati in stratul dublu lipidic printr-o structurd de tip fostatidil inositolicd (vezi lipide complexe). foncfiunea dintre cele doui componente se face prin intermediul unui motiv oligoglucidic.Exemplul tipic este al imunoglobulinei Thy-l, care aparfine limfocitelor T (vezi anticorpi). Aceastdproteind are dimensiuni mici (lll aminoacizi) gi se pare cd este implicata in interacliuni de tip celuld- celula. Capdtul C-terminal al acesteiproteine se leagi amidic de un rest de 2-aminoetanolfosfatatagatla rdndul sdu fosfoestericde un rest manozil (Fig.3.76.).

'i q-manoza'O-FO
r

\i
o

NHa

f\of\-/\l \__r"\__/*\_/ --lo

T|i* r-o-co*
9Ft ?'r e

p-NAc-galactozamrna _o_to rl ot
tl

,/Arl"

a\.*/-\J r->KlKi-*r"
I mioinosirol

9rh
cFr2

alucozamina

uJ
Fig. 3.76.Ancorajul proteinei Thy-l prin intermediul fosfatidil inozitalului

3.9.2.Hidrofobicitatea catenelor polipeptidice Acomodarea proteinelor cu mediul in care se gdsesc presupune existenta unei similaritili hidrofob - hidrofile intre proteind gi vecindtatea sa. Deoarece proteinele citosolice sau cele din spaliile intercelulare se gd.sesc intr-un mediu hidrofi.l, ele vor adopta conformafii care sd prezinte spre exterior resturile hidrofile ale aminoacizilor. Trebuie linut de asemenea searna gi de polaritatea legiturii peptidice, care poate

190

Elementede biochimie ,1.

interacfiona cu apa prin legaturi de hidrogen. Proteinele membranare, cele intrinseci in particular, vor adopta in mediul hidrofob structuri helicate.Aceasta,deoarecespre deosebirede mediul hidrofil, nu existi competifia cu moleculele de apd la stabilirea legdturilor de hidrog;en care stabilizeazd.a-helixul. De aceea maximizarea numdrului de legdturi de hidrogen se face exclusivintracatenar.Ori structura helicatd este o structurd care permite stabilirea unei densitdli mari a legdturilor de hidrogen intracatenare.Nu orice helix poate traversaun mediu hidrofob. Aceastadepinde de natura hidrofild sau hidrofobd a aminoacizilor care compun porfiunea respectivdde catend. Cuantificarea gradului de acomodare a cr-helixului cu membranele (hidrofobe) sau cu mediile hidrofile se poate realizacu ajutorul enerlSiei libere de transfer din interiorul unei membrane,in ap5.Aceastamdrime pentru fiecarerest de aminoacid(Tab.3.10.) estecaracteristicd
Tab.3.10.energiile libere de trarxfer mediu mcmbranar - apd pentru aminoacizi Rest de aminoacid Fenilalanina Metlonina lzoleucina Leucina Valina Energle liberi de (kcal.mol-t) transfer de aminoacld Rest Serina Prolina Tirozina Histidina Glutamina Energie liberide (kcal.mol-t) transfer

3,7 3,4 3,1 2,8 2,6

L'U

0,6 4,2
J t I

-3,0
4,1

Cisteina
Triptofanul Alanina Treonina Glicocolul

Asparagina
Acglutamic

+,8
-8,2 -8,8 -9,2 -12,3

1q
th

1,2
1n

Lisina Acaspartic
Arginina

Deoarecegrosimea medie a unui strat dublu lipidic este de cca. ilO ,, rezultd cd acestapoate fi traversat de un a-helix care confine 20 de resturi de aminoacizi. Se considerd cd dacd o secvenld de doudzeci de aminoacizi are o valoare (cumulatd) a energiei de transfer superioari valorii de +20 kcai.mol-r, segmentul respectiv poate penetra complet membrana citosolicd sau organitici. Evaluareapotenlialului transbistrat al proteinelor se face cu ajutorul unor diagrame de hidofobicitate, in care se reprezintd cumulativ energia liberd de transfer membrani - ape. Modelul de relevarea unei astfel de diagrame esteprezentat inFig.3.77.

. Proteine Proteine membranare

aai+1 aai+3 aai+S aai aai+2 aai+4 aai+21 aai+23 aai+25 aai+20 aai+22 aai+24

19r

rrrltrrrrrrrr|--|--|.-|--}-{,',.ffi||l||||lll||r||l|||.tt|l|||'||'||||

Ii+1
Xi+2 J

Ei+4
kcal mol"'l

Ei+5#

+20

aai+7 aai+g aai+11 aai+g aai+10 aai+Z aai+4 aai+1 aai+3 aai+S

-20

Fig. 3. 77. Modul de calcul al diagrame.i de hid.rofobicitate (fereastra de lucru = 2O amtnoacw)

Plecindu-se de la capatul N-terminal, se calculeazesuma energiilor libere de transfer pentru primii 20 aminoacizi din secvenfe.(Se poate lucra Ei cu ait5 dimensiune a ,,ferestrei",diferita de 20). Valoarea oblinutd reprezintd un prim punct in diagrami gi se numegte indice de hidrofobicitate. In continuare suma se face pentru cei doudzeci de aminoacizi incepdnd cu al doilea aminoacid din capiitui N-terminal. Astfel fiecare aminoacid din secvenldva fi reprezentat cu suma corespunzetoareenergiilor libere a douizeci de aminoacizi careii succed,inclusiv el. Aminoacizii care figureazl in diagrama de hidrofobicitate cu valori superioarelui +20 kcal . mol-r, pot fi considerafi ci pot incepe o po4iune de q,-helixcare traverseazd. o membrani. Pe ldnga modalitatea cumulativd de calcul a indicelui de hidrofobicitate se utilizeazi gi o variantd care mediazi pe un segment de 19 sau 20 de aminoacizi valorile

r92

Elementede biochimitt ,I.

individuale ale indicelui de hifuofobicitate. Pe ldngd valoarea enerlgiei libere de transfer se poate utiliza gi alfi indicatori empirici, determin,afi experimental (Tab. 3.I l). $i in acestcaz, modul de calcul al indicelui de hidrofobicitate estesimilar celui prezentatin Fig.3.77.
Tab. 3,11, Valori ale scalei de htdrofobicitate, altele decdt energiil.elibere d.etransJ,br mediu membranar - apd pentru anninoacizi, dupff7 Doolittte(tt) SiEngelman (2,') Rest deaminoacid Fenilalanina Metionina lzoleucina
ll

2' 3,4
2, 1

2A

1,9 4,5

Leucina
Valina

4,2
)q

Cisteina Triptofanul
Alanina Treonina Glicocolul

2,8 2,6 2,0

1q

-{)q
,IA

4,7 -0,4

I'l

1,0

Restde aminoacid Serina Prolina Tirozina Histidina Glutamina Asparagina Acolutamic Lisina Acasoartic Arginina

1*

z',
u,o

-0,8 -1,3 -3,2

4,2 4,7

-3,0
4,1 -4,8 -8,2
nn

AR

-12,3

In acestmod se pot evalua por{iunile transmembranareale unei catene polipeptidice. Studiul poate fi completat cu determinarea fr;agmentelor nemembranare (deci cu hidrofobicitate scdzutd)extracitosolice. Pentru aceasta existd mai multe metode, fiecare dintre acestea bazdndu-se pe reactivi selectivi care reactioneazd cu porfiunile rremembranare ale catenelor. Problema pusd este relativ simplu de rezolvat cu segmenteleextracitosolice,dar mai dificil cu cele intramenrbranare.

tt Kyr., J.; Doolittle, R.F.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.,LMol. Biol. L982,L57 : 105-132 Engelman, D.M., teity, T.A.; Goldman, A. Identi$ing nonpolar uansbilayer helices in 1986:,15,i;21of membrane proteins.Annu, Rev.Biophys.Chem. amino acid sequences 353

CAPITOIUI 4. Enzime
Sunt substanle polipeptidice cu func1ie biocatalitici, sintetizate de cdtre organismul viu. lntocmai ca gi catalizatorii clasici din chimie, enzimele micgoreazd energia de activare a reacfiilor chimice, fdrd a modifica insf, echilibrul reacfiilor reversibile.Enzimele fac posibile biotransformdrile substan{elorin condi;ii de neconceput pentru catalizatorii convenfionali.Aceastase datoreazdatit specificitdlii gi selectivitdfii cdt gi activit[fii enzimatice ridicate.

4.1.Specificitatea gi selectivitatea enzimaticd

Sunt insugiri necesare pentru acegti biocatalizatori, care derivd in mod obiectiv din complexitateamediului natural in care au loc reacliile biochimice. A. Specificitatease poate sistematizain: r specificitatede substrat r specificitatede reacfie A.I. Specificitateade substrat se referdla preferinfa enzimei pentru o anumiti specie molecuiard (specificitateabsolutd) sau pentru un grup restrdnsde specii cu structuri similari (specificitaterelativi la grup).
Flzl\\ t+ / 'G-o ureeazl ---+ +Ftzo ,NF[+.Q

Specificitateaabsolutd implica interacfia enzimei cu un singurd substanfd. Un exemplu tipic este ureeam, o enzirni care actioneazd numai asupraureei: Specificitatearelatiud de grup. Este caracteristicdunor enzime care acfioneazi asupraunei clasede compugi care posedi un element structural comun. Lipazele, enzimele proteolitice, fosfatazelesunt exemple clasice. ln cazul in care substratul reacliei enzimatice posedd enantiomeri, preferinfa fafa de unul dintre acegtia,presupune enantiospecificitate. Estecazul enzimelor care acfioneazdasupra aminoacizilor. Aminoacizii naturali fac parte din seria L. Enantiospecificitatease manifestd prin

194

Elementede biochimie .I.

actiunea doar asupra acestoraminoacizi3s. Pe aceastdacfiune se bazeazd utilizarea enzimelor in biotehnologii de scindare a unor amestec:uri racemice. Similar existd qi diastereospecificitate. A.II. Specificitatea de reac(ie desemneazddoar o anume translbrmare a unui substrat din mai multe posibilitdli. Aceasti acfiune, raportatd la produsul de reacfie in misura in care este diferit in transforrnirile suferite, poate fi exprimata gi prin noliunea sinonimd (in acest caz particular !) de selectivitate. Existd cazuri in care specifrcitatea de reacfie se manifestd doar asupra mecanismului de reacfie,produ.giiob$rru1i fiind identici, doar cdile biosintezei lor fiind diferite. Aminoacizii, compugi bi- (multi- ) funclionali pot suferi reacfii t,iochimice care sd afecteze diferit grupele funcfionaie, ceea ce ducerla formarea unor compugi diferili. Astfel prin acfiunea unei oxidaze asupra unui aminoacid se obline un cr-hidroxiacid,prin acfiunea unei decarboxilazese obline o amind (biogend) iar prin acfiunea unei transaminaze se poate obline un crcetoacid.Un o-cetoacid se poate obfine insd dintr-un aminoacid gi prin acfiunea unei aminoxidaze, care favorizeazd,transformarea a-hidroxiacidului in o-cetoacid. Formarea cetoacidului fie prin acfiulrea transaminazeifie prin acfiunea oxidazei desemneazi specificitateade reaclie purd. Selectivitatease referd la produgii de reacfie.
HO2C H Acid fumaric

cozH CqH
Acid succinic

aH
\H

CqH CqH
Acid maleic

CqH

Fig.4.l.Selcctivitatea enzimaticd tn cazul succcinat dehldrogenazei

Dacd produsul de reacfie posedd,izomeri geometrici se poate vcrbi de selectiuitate cis-trans:aceastapresupune formarea selectivi din acelasi substrat doar a unui anume stereoizomer.Cit5.mcazul succinat,le38 Degise cunoscai exceplii.

. Clasificarea Enzime enzimelor

195

hidrogenazei (Fig.4.l), care ac{iondnd doar asupra acidului succinic (deci posedd speciflcitate absolut[) il transform5,doar (selectiv)in acid fumaric, fird formarea izomerului sdu, acidul maleic. ln cazui in care in urma unei reacfii se pot obline enantiomeri sau diasteroizomeri, preferinfa sistemului pentru unul sau altul dintre produgii de reac{ie poarta, dupi caz numele de enantio- sau diastereoselectivitate. Enzimele pot fi de tip holoproteic sau de tip proteidfc. Componenta proteicd a enzimelor de tip proteidic poartd numele de apoenzimd. Cofactorul (componenta neproteicd) are fie funcfie redox (preluare,cedare de electroni) fie func1ie conformafionald. ln funcgie de tdria legdturii cofactor-apoenzimi, cofactorii sunt coenzirne, atunci cdnd legdtura este labild, sau este grupare prosteticd atunci cdnd legdtura este puternicd. Asupra acestor aspecte vom reveni la paragraful legat de cofactori enzimatici si vitamine.

4.2.Clasificarea enzimelor
Pentru evitarea unor ambiguitili, sistematizareaacestei importante clase a fost fdcutd de cdtre Comisia internafionaia de Enzimologie, (Enzlrne Commission E.C.)organism subordonatUniunii lntemalionale de Biochimie (Intemational Union for Biochemistry - I.U.B). Potrivit clase: clasificdrii acestuifor, enzimeleseimpart in gase l. oxidoreductaze enzimele care catalizeazdreacfii redox (transfer de electroni) 2. transferaze - catalizeazdtransferul intermolecular de diferite grupiri chimice scindareahidroliticd a unor legdturi chimice 3. hidrolaze - catalizeazS. 4. liaze catalizeaze reacfii de adi{ie sau eliminare la molecula unui substrat [cu implicarea unor duble legdturi, formate la eliminare, desfdcutela reaclii de aditie), 5. izomeraze catalizeazdreactii de izomerizare reacfii de condensare a doud mole6. ligaze (sintetaze)- catalizeaz.d cule cu aportul energetical unor nucleozidtrifosfati. 4.2,1.Codificareaenzimelor qi nomenclatura Datoritd diversitdlii de acliuni chiar in interiorul unei clase a apdrut necesitateaunor subclasifi.cdricare sd find seama de particularitdfile diferitelor subclasede enzime. Pentru o mai ugoardidentificare s-a ela-

196

Elementede biochimie .1,

borat un sistem de codificare potrivit cdruia fiecare enzime igi are codul sdu, ugor de interpretat, care permite deslugireaacfiunii sale asupra unui substrat. ln conforrnitate cu acest cod enzimele au numele format din patru grupe de numere:

x.Y.z.T.
X- codiflcd apartenenfala una dintre cetre gaseclasede enzime. Y, gi Z, au semnificafii particulare pentru fiecare clasi de enziputdndu-se me, referi dupi caz la substrat, cofactor, produs, grupe transferatdetc., codificdnd sub qi respectivsub-sub clasaenzimaticd. T- codificd numdrul de ordine, de reguld in succesiunea descoperirii, al enzimelor care catalizeazd, reactii similare (vezi mai departe alcool dehidrogenaza 9i lactat dehidrogenaza). De exemplu in cazul oxidoreductazelor: clasa t. subclasele se sitematizeazdin 17, in funcfie de natura grupdrilor donoare de electroni, (1. -CH-OH, 2. carbonil,3. -CH-CH-,4.CH-NHz,5. CH-NH-, 6. NADH sau NADPH, 7. alfi cornpugi cu azot, B. grupare cu sulf, 9. grupare heminici, 10. difenoli, Il. apd oxigenati, 12. hidrogen, 13.incorporare de oxigen la un singur donor, 14.incorporare de oxigen la o pereche de donori, 15. radicali superoxid, 16. ioni metalici, 17. grupdri CH2-sub-subclasele se sistematizeazl.in funcfie de natura acceptorului -NAD+ de electroni(1. sau NADPH+,2. -citocrom,3.-oxigen,4.-compus disulfuric, 5. -chinond, 6.-gruparecu azot, 7.-fier-sulfproteind, etc). Astfel alcool dehidrogenaza, enzima care asigurd oxidarea alcoolului etilic la acetaldehidi are codul E.C.l.l.I.l deoarece faceparte din clasa oxidoreductazelor,folosegteca acceptor de electroni NAD*, folosegteca donor de electroni CH2-OH gi este prima enzimd din sub-subclasape care o reprezintd. Numele enzimelor poate fi comun sau sisternatic. A. Denumirea comund a enzimelor are un caracter istoric ai practic totodatd. Multe enzime se folosesc sub o astfel de denumire. Aceastd denumire a fost inifial nedescriptiv{ precum: o pepsina: hidrolizeazdproteinele la pH acid r tripsina: hidrolizeazd. proteinele la pH slab alcalin i renina: coaguleazf, laptele

ulterior, nomenclatura a fost imbunetdfite prin utilizarea numelui substratului + az,az t o-amilaza: amidon + glucozi + maltozd+ oligozatraride t lactaza lactoza-+glucozd+galactozd

Enzime, Clasificareaenzimelor

r97

I lipaza: acilgiiceroli -+ glicerol + acizi gragi r maltaza: maltoz1.-+glucozi o ureealza: uree + HzO-+ 2NH3+ COz o celobiaza: celobiozd-+ glucozd sau numele reactiei catalizate + aza: r alcool dehidrogenaza:EtoH+ NAD+ --'AcH + NADH,H* I glucozoizomeraza: glucozd-'fructozd o glucozoxidaza: D-glucozd + Or+ H2O -- acid gluconic r lactatdehidrogenaza:acidlactic ---,acid piruvic t invertaza: zaharoza-' glucoza + fructoza B. Denumirea sistematicd a enzimelor pleacd de Ia codificarea acestora. Conform prevederilor E.C. numele enzimei este format din doud parfi: o numele substratului sau al substratelorla reac{iile bimoleculare (in acestcaz celedoud substratevor fi separateprin doud puncte) gi I numele reacfiei catalizatela care se adaugdsufixul aea. Numele substratului se formeazd,pebaza preceptelor I.U.P.A.Cde nomenclaturi admitdndu-se folosirea unor prescurtdri pentru cofactori, de asemeneastandardizate(NAD,ATP, FAD etc.). Astfel invertaza, enzima care scindeazd hidrolitic zahdrul (zaharoza) in fructozd gi glucozi va avea denumirea B-D-fructofuranozid-o-D-glucopiranozohidrolaza(Fig. .2.)

nvertaza sau ti IiO

OH Zaharoza lcl2o n = +660 ctr2Ol a-Dglucophanoza [cl]" =+5lf t)

Gt:0ll fDftuctolamnoza ln 'lol"" T r = -qt"

- 40,50 Fig. a. 2. Inu ersia zaharozei

198

Elemente de biochimie .1.

4.3.Cuantificareaactivitdtii enzimatice
Activitatea enzimaticd mdsoard capacitateaenzimei de a transforma un substrat. Studiul activitafii presupune existenfa unor metode de a pune cantitativ in evidenld reacfia catalitica. Pentru aceastaeste necesarf, dozareain dinamicd fie a produsului de reacfie, fie a substratului, fie a unui cofactor care poate fi pus in corelafie cu formarea produsului sau cu consumul de substrat.Activitatea enzimatici depinde de o serie de condilii care trebuie cunoscute: , natura substratului. Deoarece enzima posedd specificitate de substrat, activitatea sa va fi diferenfiatd cu natura acestuia,unele substante fiind transformate cu vitezd mai mare decdt altele. r prezenfa sau absenfa unor cofactori enzimatici. Enzimele sunt substanle de naturi, proteicd. Anumite reacfii presupun asistenfaunor compugi nu neapdrat de naturd proteicd, ciue acfioneazdca donori, acceptori de fragmente moleculare (ionice) sau de electroni.ln lipsa acestora reac{ianu se poate produce, degi substratul are asiguratecondiliile stericenecesaredesfdEuririi reacfiei. I natura soluentulul. Este importantd in experimentele ,,in vitro" dar gi in cele ,,in vivo", atunci cdnd intervin situafii ,,anormale",patologice. Se gtie ci solventul influenfeazd in primul rAnd conformafia proteicd, dar gi iteza reacliilor care decurg prin intermediari (sauprin stiri de tranzilie) polare. ) compoziyiaionicd (pH, ioni salini) I temperatura t prezenla factorilor strdini (concentrafia oxigenului dizolvat, inhibitori, activtori). Factorii de mediu care acfioneazd asupra enzimelor au in cea mai mare mdsuri o determinare cineticd. Esenfialesteca determinareaactivite$i enzimatice sd fie realizatd in condiliile cunoagterii cantitative a acestor factori, premisd pentru asigurarea comparabilitefii datelor gi eventualstandardizareacondifiilor de determinare. r Activitatea enzirnaticd se poate mdsura prin intermediul numdrului unitdsilor de actiuitate numdrul de unitdli molare (mirco-, nano-, picomoli) de substrat, transformafi de o cantitate datd, dar neprecizatS. de preparat enzimatic in unitatea de timp. In funcfie de unitatea de timp la care se face raportarea avem: Unitali internafionale (UJ.) - cdnd se referf, Ia un micro-, nano- sau picomol de substrat transformat pe minut. De exemplu I U.I. poate

Enzime. Mecanismul de actiune al enzimelor

t99

semnifica transformarea unui pmol/min sau a unui pmol/ min. Aceste unitifi trebuie definite in prealabil. katal (kat.) - cdnd se refere la ffansformareaunui mol de substrat pe secundd. Se utilizeazd,frecvent submultiplii acestei unitifi (mkat, pkat Einanokat.) i dte posibilitate de mdsurd a activita$i enzimatice este actiuitatea specificd(AS.).Ea se exprimi in unitdli de activitate raportate la masa totald de proteini. Aceasti unitate de misurd esteimportanta pentru urmirirea mersului operaliilor de purificare enzimaticd. s Gradul de purificare (Gp.), exprimd raportul activitefilor specificeintre ultima treapte de purificare gi o treapt[ in amonte (chiar a extractului brut). o ln fine, randamentul de purificare (r7), reprezintd raportul dintre numdrul total de unitdli in extractul inifial gi numdrul tota! de unitafi in preparatul purificat. 1n Tab.4.1.se prezintd un exemplu al evolu{iei principalilor indicatori ai activitefii enzimatice in decursul unei operalii de purificare a unui preparat enzimatic.
Tab.4.1.Principalii indicatori ai activitdsii enzimatice pentru o operalie de puriftcare (date conventionale)
Probinitobh (mg) Extacl Fnc{ia1

u.l.
8000 7600 6500 4500 3000

AS.

Fnctn 2 Fractia 3
Fnactia 4

4000 1600 500

DU
IL

2.m
4.75

Gp 1.00
t.Jt

Ip

100 81
56

13.0
75.0

6,50
?7(

250.0

175.0

37.5

4.4.Mecanismulde acfiune al enzimelor

Pentru a evita confuziile care sunt destul de ft'ecvente, trebuie fdcutd distincfia dintre mecanism de acliune gi mod de acgiune.Mecanismul de ac{iune se referd la interacfiunea primarA $i la efectul chimic imediat care are loc (transformarea substratului in produs). Spre deosebire de aceastdnofiune, modul de acqiune este mai complex, definind ansamblul de evenimente consecutive formdrii produsului. Revenind, mecanismul de acliune enzimaticd presupune formarea unui ,,complex" enzimd - substrat, in fapt un intermediar de reacfie. Formarea acestuia este rezultatul participdrii mai multor resturi de aminoacizi, nu neapirat adiacente, in sensul structurii primare a catenei

200

Elementede biochimie .I.

polipeptidice a enzimei, eventual a unor gruperi active dintr-un cofactor prezent, pe de o parte gi substrat pe de altd parte. Existenla acestui intermediar este obiectivd, ea putdnd fi pusi in evidenfd prin mijloace specifice. 4.4.L. Stabilizarea stirii de tranzilie Stareade tranzifie este o caracteristicda tuturor reacliilor chimice. Structura sa reprezintE o trecere intre structura substratului (reactanare loc tului) gi a produsului de reacfie. Reacfia simpld.Subst.at r Produ, prin intermediul stdrii de tranzilie T#, care este cea mai bogatd in energie dintre tofi componenfii. Deoarecenivelul energetical produsului, in exernplulconsiderat (vezi diagrama energeticd- Fig. 4.3) estemai redus decdt in cazul subsffatului, procesul global fiind insofit de scddereaentalpiei libere (endergonic), succesiunea stdrilor se poate scrie ca:

S-

T; __-_-p

Aga dupa cum estecunoscut, diferenfa dintre nivelul energeticaI stdrii de tranzifie Ei al substratului reprezintl. energia liberd de actiuare.
Ener liberI (G) Starede trat.,zilie T# Energie liberd

(c)

ComplexenzimtrComplex starede tranzi{ie enziml ElY

ES
Coordonatd de reaclie S E-T# --+P Coordonatf, de reacfie E+S-r','ES--

E+P
ET#->E+P

Fig.a3. Diagramelc energetice pentru reacfie necatali.zatd (sthnga) Si o reacgie r ealizat d tn cata I izl enzimatic d. (dr ea p ta)

Pentru o reacfie catalizatd enzimatic, apare cel pufin o interacfiune moleculard suplimentarA concretizatd.p rintr- o stare p roprie de tranzif ie gi formarea unui intermediar3s numit complex enzimd - substrat. Aceasta trece printr-o noui stare de tranzifie, cu energie superioare primeia, de unde gi reversibilitateacelor doud reacfii (Fig.as.1,Variafia
3eSe gtie ci, spre deosebirede stareade tranzilie, un intermediar are energiamai redusd. Mai mult, pe diagrama energeticd un intermediar se gisegte intre doud stiri de tranzi1ie,energiasa constituind un minim local.

Enzime. Mecanismul de acSiuneal enzimelor

20L

de energia pentru formarea stdrii de tranzilie ET* este net inferioard stdrii T*. adicd +t# t4.11 AG" > AG n e'
+ t/; l\t I

*ll
IiJ
-L, !I-

E+:trL

----lb

+T# ---+E+P
]|*

kn

Kn
.. &

+ i

rd:
r^1 Lel

J} f

Ke

o"t ET#

.-.#r lr-l" l

u * P

Ke: t E S]

cuevidenferea necatalitice Ftg.a.4.Dtagrama enaimatice, forrnalda transformdrii d.e tranzisie starea constantelor depesubstrat, respectlv dedkociere a enzimei vitezei de reacfie. Un alt fapt ce justificd cel pufin in parte accelerarea factor care contribuie la accelerareeste stabilizarea complexului ETr. Altfel spus enzimele sunt substanfe care leagd starea de tranzifie mult mai puternic decdt substratul sau produsul de reacfie. Constanta de disocierea complexului ES: (E).(S) K _ 14.2,.)

(ES)

iar constantade disocierea complexului de tranzi{ie este:

_ K , .r -

(a.r#)
(Er#)
t4.3.1

Cataliza enzimaticd necesitd ca K1 ( Ks. In acord cu teoria std.riide tranzifie, raportul constantelor de vitezd catalizatd gi necatalizatesunt corelate cu Kr 9i I(s prin relafia:

k"
kn
Intr-adevdr:

-K,

Kr

14.4.1

x"=!* x!

ei

x,= b{

x: r4.b.l

Fdcdndraportul celor doud constantede vitezi se obline:

202

Elementede biochimie .I.

k, _K: KN_KT
Explicitdnd cele dou5.constantede echilibru se obfine:

t4.6.I

Kg

KX
echilibru K n $l [" ciere K5si K1:
-----.'ii=---_frfr 4_ ' frl+

#).(s) GT =Gs)m

14.7.)

Admifand cd valoarea concentraliei de echilibru a enzimei este aceeagigi in cazul disocierii enzimei de pe complexul enzimd-substratEiin cazul disocierii complexului enzimi-stare de tranziqie,constantele de insd pot fi puse in legdturd cu constantelede diso-

K:

Er).(s).(E)

K: ES). tr). E)

ceea ce esfe eclt' tvatent ,,

K: K" ! t4.B.l ,(: *:

demonstrdndu-seastfel cd accelerareavitezei de reac{ie de cdtre enzime este aproximativ egald cu raportul constantelor de disociere enzimh-substrat gi complexul enzimd-stare de tranzifie. Schema general[ prezentatdin Fig.4.4.oferd un tablou al corelagiilordintre mirimile m.ai sus prezentate. Accelerareavitezei reacfiilor enzimatice fafa de cele neenzimatice estefoarte mare (cu 7 pdnd la 16 ordine de mdrime) gi igi are corespondentul in reducerea substan{iald a energiei libere de activare. Din coordonata de reacfie se poate deduce cd scddereaenergiei de activarein cazul reac{iilor enzimatice se poate realtzapedoud cdi: o prin reducerea niuelului energetic aI complexului erai,md - stare de tranzitie (complex activat) ceea ce presupune o legare puternicd de cdtre enzimd a stdrii de tranzilie, fapt demonstrat mai sus gi: r prin ridicarea nivelului energetic al complexului enzimd - substrat. Cu alte cuvinte, acestcomplex va fi destabilizat. Complexul enzimd - substrat se realizeazd.pnnintermediul unor interacfiuni suplimentare, care pot cobori nivelul energiei libere cu aGi (energieliberd de legare intrinsecd), mirind astfel diferenfa de energie liberd dintre complexul activat gi complexul enzimi-substrat. Prin aceasta,eficienfa acliunii enzimatice va fi puternic redusd.

Enzime . Mecanismul de acliune al enzimelor

zo3

AH4- TAS

Coordonata

de reactie

Fig.4,5. Reprezentareadestabilizdrti complexului enzimd' - substrat

Destabilizarea complexului enzim[-substrat poate fi privitf, dtn punctul de vedere al celor doud componente energetice:termenul entalpic Ai termenul entropic. Termenul entalpic reflecti existenla unor tensiuni in sistemul molecular, care ridica nivelul energeticaI acestuia. De TARR sistematizeazd contribufia entalpiei de destabilizare AIIa in patru termeni: entalpia formald de legare (EFL) entalpie formald stericd (EFS) entalpie formali polari (EFP) entalpie formali de mediu (EFM) Entalpia formald de legare este termenul energetic pozitiv, atribuit modificlrilor lungimii legdturilor, qi ale unghiurilor de valenfS.de la valorile ,,normale",care apar la formarea unor legdturi chimice sau flzice, datoritd ambianlei ln care are loc formarea acestora. Exemplul clasic estecel al ciclopropanului in comparafie cu al ciclohexanului.Nesuprapunerea perfectd a orbitalilor sp3 ai atomilor de carbon, ridici nivelul energetical metilenilor printr-o contribulie EFL. Forfarea conformaliei eclipsateridici nivelul energetic al moleculei printr-o contribufie de tip EFS. Ludnd un alt exemplu, n-butanul gauche,energiasa estemai ridicati datoritd repulsiei dintre cei doi metili in comparafie cu izomerul anti. Atunci cdnd ambianfa forfeazi mai mult unghiul diedru din molecula n-butanului la o valoare diferiti de 60, 120 sau l80o apar tensiuni suplimentare datorate abaterii de la conformaliile intercalate situate pe minime energetice locale, tot ca rezultat al apariliei unei entalpii formale sterice.

204

Elemente de btochimie,I.

Efectul anomeric observatla hidra{ii de carbon, poate fl privit ca un rezultat al repulsiei dipol-dipol dintre legdrurile Cr-OH gi C1-OCH-, exemplificAndaparifia unei entalpii formale polare, carejustifici stabilitatea anormal de ridicata a anomerului a. ln fine, cregterea nucleofiliciti;ii anionilor in solvenfi apolari justiflci aparilia efectului entalpiei formale de mediu. Aceastdsistematizareesteutild pentru studiul teoretic al structurilor implicate. ln fapt, experimental efectelesunt imposibil de separat,pentru cd interacfiunile care destabilizeazdcomplexul enzimA-substratau o determinare spafiald, valoarea accesibil5, este entalpia de formare, o mdrime globald,rezultativd, cErre estemai mare dec6tin cazul referin{ei. Ca referinfd se considerd entalpiile de formare ale enzimei, respectiv substratului in solufii apoase. Pe ldngi termenul entalpic, reducerea stabilitefii complexului enzimd-substrat este datorat[ sciderii entropiei sistemului prin pierderea unor grade de libertate de rotafie, translafie, atdt ale enzimei cdt mai alesa substratului,in urma legdrii. Trebuie subliniat, cd, datd fiind realitatea formirii complexului enzimd-substrat,varialia globald de energieliberd estenegativd.De aceea destabilizareade esenfi entalpicd gi entropicd.este compensatd de o stabilizare esenfialmente entalpicd, rezultat al formarii unor noi legdturi. Relafia [4.6.]permite estimareaconstantei de disociere a complexului enzimi + stare de tranzitie. Accelerareavitezei de reacfie pentru reac;ia catalizatdde enzime fald de reacfranecatalizatdpoate ajunge la 1016 cu valori tipice de 1012. Aceastainseamnd cd pentru o constante de disocierea complenrlui enzimi-substratK5 de ordinul l0-4 M constanta de disociere a complexului enzimd-starede tranzifie Kl va avea valoa= 1016 rea lOa | 10rz ceeace esteo valoare extrem de redusd. Formalismul exprimat prin relalia [4.4] care afirmi cd enzimele leagd mai puternic starea de tranzilie decdt substratul poate fi obiectivat experimental prin utilizarea unor analogi ai stdrii de tranzifie, in fapt molecule cu structurd similari acesteia.ln contact cu enzima acegti compugi sunt legafi mai putemic decdt substratulpropriuzis. Au fost descrise sute de astfel de exemple.Unul dintre acestea, semnificativ,este realizat pe prolin racemazd. Aceastd enzimd realizeazd. inversia de configurafie a L-prolinei la D-prolini, prin intermediul unei stdri de tranzilie plane:

Enzime , Mecanismul de actiune al enzimelor H. H' I \

205

coz

4
coz-

\5-.

L-prolin6
stare de tranzilie plan[

D-prolinl

Fig. .6. Repreznntarea structurii stdrii d.etraraifie tn reacfi.a de racemiznre a prolinei

Studiind inhibitorii acesteienzime, Robert ABELES,a gesit cf, pirol2-carboxilatul leagi enzima de 160 de ori mai puternic decit L-prolina, substratul normal. Acest compus are o structuri pland a centrului de reacfie similard cu a stArii de tranzi{ie proprii substratului. De asemenea D-l-pirolidin-carboxilatul, un alt analog plan, are o comportare asemdnitoare:
/\

.>co;

\vN

coz-

Pirol-2-carboxilat

A- I -oirolidin-2-carboxilat

Alte exemple sunt oferite de fosfoglicolohidroxamat care este un analog al starii de tranzilie a aldolazei,o enzimi gisitd in glicolizi care (esterul lui Haarden-Young) la scindeazdreversibil 1,G-difosfofructoza fosfodihidroxiacetondgi aldehida 3-fosfoglicerica,precum gi de forma hidratati a ribonucleozidei purinei, analog al sterii de tranzilie a adenozindeaminazei,enzimi care transformd adenozinain inozind (ribonucleozida hipoxantinei). Un aspectcire ar putea fi discutat este faptul cd enzimele nu catalizeazd, reacfiiie chimice. Ele catalizeazi schimbdri de stare, care pot fi descriseca procese, transformd.ri,conversii. Termenul reacfie implicd de reacun anume set de reactanti care parcurge o anume coordonatS. vitezei de a Enzimele realizeazi func{ia catalitici, accelerare de {ie. reacfie prin faptul cd asigurd cdi alternative, de transformare a substratului in produs. Datoriti faphrlui cd energia de activare pe ceile enzimatice este mai redusd comparativ cu reactia desfdguratdin absenfa enzimei, calea enzimaticd estevarianta preferatd.Faptul cd intereseazi in primul rdnd substratul $i produsul reactiei chimice (realizatein prin mijlocire enzimaticd) este argumentul esenlial al folosirii largi a termenului de catalizd enzimatici..

206

Elementede biochimie ,1.

4.4.2, Modditdli concrete de reducere a energiei de activare in reac(iile enzimatice

R2(I-</-)-B..
1
nl-Ceo

\:,/

P * G-\ \----l/rW R1O'

kZlkt

o,--,.

Reactanfi
'o

^, -e ll^ crtq + rLC_\iFtr

2.,

-Co-{,
w2

/:\
\//

)-k

1 x3lo

-2,2

5xl4IA

4.\

-Hr ri
il\-o \_\_2

li

/:\
\\

//

/>-w

l- x7]l0

A-*-o*

5 x7xo

Fig.4.7.Materlaliznrea efectului de prortmitute in reacfia deformare a diferiwlor

Reducereaentalpiei de activare printr-un act catalitic enzimatic se bazeaz6, pe de o parte pe efectele de proximitate care constau in aducerea speciilor reactante in vecindtate reciprocd,pe de altd parte in stabilizarea stdrilor de tranzilie prin furnizarea unor contrasarcini prin cataliza generald acido-bazicd ori prin participarea metalelor sau prin formarea unor intermediari covalenli prin atac nucleofil, mai rar electrofil.

Enzime, Mecanismul deactiuneal enzimelar

207

4.4.2.1.Efectelsde proximitate Sunt legatede procesul catalitic, constau in lgalizareaapropierii spafiale a speciiior reactante, precum gi orientarea favorabild reciproci a acestora.Intuitiv, se gtie ci reac{iile chimice inffamoleculare sunt mult mai rapide decdt cele intermoleculare in condiliile in care sunt implicate aceleagi grupdri funcfionale. Exemplul tipic compar[ viteza de formare a anhidridei acetice cu cele de formare a anhidridei malonice, succinice,cu rezultatul cunoscut cd in primul caz iteza de reacfie este mult mai micd. Cauza acestui fenomen este simpld gi se referi la modificirile entropice care insolesc formarea stirii de tranzifie. ln cazul reacfiilor intermoleculare, scddereaentropiei de activare este cu mult mai pregnanti decdt in cazul reactiilor intramoleculare. Efectul entalpic fiind comparabil, scddereaentalpiei libere de activare estein consecinfi mai ridicatd la reacfiile intramoleculare, acestea fiind deci mai rapide.

nz--\ont ---

<frP>fl
)oH/Ho-

Catallzd bazlcd sp eclfi cd

*t-ffi'

R2-c-oH

Ir-onl

Ho-

Q". "\H

<fr
nz-c;onr o
H

CaraUzdbazlcd generald

---)

Rt

c-oRl

P>

--------{>

o il
R2.zC-OH g-ORl

o
*Ft"

D "i
u>
l\ on\
6gl

:B

Caalizd acldd generall

(?,"-^
nz-\ont
--+ p2-6,

-f

o"
---------->

H_A

o ll
R2-koH H-ORI

,f<

pt

Fig. . 8. Excrnplc de catalizd acido-bazicd specifud SigeneraWtn rea4ia da hi.drolizd. a esterilor

208

Elemente de biochimie,I,

Cantitativ, eficienfa intramolecularitdlii se poate calcula din raportul constantelorde vitezS. unimoleculard (reacfiile2-S Fig.4.7.) per bimole(reacfia cular6, bimoleculari aleasdca referin{d dintre acetat Ei acetatul de 4-bromofenil). Raportul are dimensiune molard (M) care poate fi interpretatd. ca molaritate efectivd. Prin aceastd mdrime desemndm, in condiliile exemplului prezentat, multiplul de moli de acetat de 4-bromofenii, care in reac{ia cu un num[r de moli de acetatliber, va da aceeaEivitezd de reacfie ca gi a reacfiei unimoleculare 2,3,4sau 5 (Aceea$i Fig. .7.). Cu alte cuvinte molaritatea efectivd,reprezintd un factor de amplificare datorat proximitifii particulare. ln cazul catalizei enzimatice, de reguld, nu se poate vorbi de o intramolecularitate propriuzisd deoarecegrupdriie reactive nu aparfin aceleiaEi specii moleculare (definitd ca entitate covalentd).Amplificarea printr-o proximitate forfatd are loc agacum s-a prezentat mai sus, prin aducereaspeciilor reactantein vecindtategi intr-o orientare favorabild. 4.4.2.2.Cataliza generald prin acki Sibaze. EsteintilnitA in multe dintre proceselebiocatalitice. Aga dupi cum se cunoagte,interacfiunea directd a H+ sau HO- cu substratul,finalizatd prin transformarea substratului in produs gi regdsireaH* sau HO- este denumitd catalizS. acidd sau bazicd specificd,in timp ce interacfia unui acid sau baza al{ii decdt apa, cu molecule de apd, cu generareaunor specii care reacfioneazd, cu substratul este denumitd catalizd. acidd sau bazicdgenerala(Fig.4.8.). 4.4.2.3. Catalizn coualentd Fie reacfia neenzimaticS: Sr-X+Sz :+ Sr-Sz+X S2

Enz
\_\

Sr-X \'--+,S,-fnzi

Sr-Se

\x

\En,

intermediar covalent
Fig. A,9.Schema catalizei enzirnatice prinformare de intermediari coualenfi

. Mecanismul Enzime deactiuneal enaimelnr

209

*:*-ro1\$r
EAz-\

r)fr
U

=:

R-o-l-o
Enz_y

Fosforil-enziml

R-C-X Enz.-Y

or-> ll -/

R-C-X

o-\ l*-

o
R-f
I

tl

__J

l\t Enz-Y

Acil-enzimd

Enz-Y

Fig. 4.10. F.xemplede catalizd enzimatlcd cuformare de intcrmediarl coualenfi

Prin catalizd enzimaticd, pe lingd posibilitefile mai sus enunfate, se poate ajunge la cregterea vitezei de reacfie gi prin formarea covalente a unor intermediari. In acest caz, condifia necesare pentru o catalizA enzimatici si fie o alternativd eficientd fa{a de reactria necataliticd, este pe de o parte ca gmpele funcfionale din catenelelaterale ale aminoacizilor care atace substratul si fie mai reactive decdt reactantul utilizat in procesul necatalitic, iar pe de alta parte, stmctura nou ataqatdsubstratului (care congine$i componenta enzimaticd),si fie o grupd mai fugace decdt cea preexistentd in substratul inifial. Cataliza covalenti presupune un mecanism secvenfialln care are loc formarea unui intermediar covalent intre enzimd gi substrat. Mecanismul general este redat in Fig. 4.9: De cele mai multe ori, formarea intermediarului covalent Sr - Enz este rezultatul unui atac nucleofil al componentei Y a enzimei asupra unui centru deficitar in electroni al substratului 51. (Fig. 4.10.).Dintre centrii nucleofli ai enzimelor, Y putem cita: grupe amino (lisind), carboxilat (acid glutamic, aspartic), hidroxil alifatic sau aromatic (serind, treonind, tirosind), imidazol (histidind), tiol (cisteini). Dintre fintele atacului nucleofil exemplificdm atomul de fosfor din resturile fosforil, atomul de carbon dublu legat de oxigen, carbonul glicozidic etc. @ig.a.10.) Intermediarii formafi vor conduce la produgii finali prin mecanisme de substitufie nucleofild realizate prin atacul unui al doilea substrat, fie

210

Eleme nt e de b iochimie .1,

la carbonul sp3,fie (prin adilie - eliminare) Ia carbonul spz,fosfor (din fosfat) sau sulf (din sulfat) etc. Existd gi cazuri de catalizi electrofild, care de reguld.implici participarea unor cofactori enzimatici, de reguld ioni metalici, capabili prin deficitul electronic,si joace rol de electrof,li. 7n Tab.4.2sunt listate o serie de enzime care formeazd intermediari lega$ covalent, inclusiv glicerinaldehid-s -fosfat dehidrogenazn, o enzimd din glicolizi, care catalizeazl. fosforilarea oxidativi a glicerinaldehid-3-fosfahrlui (esterullui Fischer),in care atacul nucleofil se realizeazd prin intermediul unei gruped tiolice a unei cisteine prezente in situsul catalitic:
Tab, 4.2. Enzime care formcazd intermediari covalenSi:

-Chimotripsina -Elastaza -Esteraze -Subtilisina -Trombina -Tripsina

o
cH,-oH
_CH
_CH CH?-

o-\*
acilserina

senna
I?-S[I

o
CHN*

-Glicerinaldehid-3Josfat dehidrogenaza -Papaina cisteina

,A*
acilcisteina

CFI

fosfataza alcalind -Fosfogulcomu'taza

-CII

ftz-oa
serina

lt,,,"
crl,-OtP-O clr
fosfoserina

-Fosfogliceralmutaza -Succinil-CoA sintelaza

Y t 'tN

CH.

"\U\
NwJ/

Y"')o*
o:i<-/
o fosfohistidina

- Aidolaza - Decarboxilaze - Enzime piridoxalfosfat dependente

-NHz amin0

-N

zrC(baze imina Schitf)

Enzime. Mecanismul de actiune al enzimelor

2L1

H
Enz-SH

ll --) c--R--> I

o<-\

Enz-$-G-R

?)
\ ) /

*mCv_
J I
l*Il

Enz-SH +

'-qrdi\n
unde:

a>
l ^f.z o

H I R=-G-GI'I'
I CH

Fig.4. I 1. Fosforilarea oxtdatiud a aldehidei fosfoglicerice, exemplu de rnecanistn realizat prin intermedi.arl covalenfi

4.4.2.4,Cataliza prin ioni metalici Multe dintre enzime acfioneazdprin intermediul ionilor metalici, de reguld tranzifionali. Acegtiioni sunt necesarifie pentru stabilizareapermanenti a structurii enzimelor, in cazul metalenzimelor, fie doar pentru actul catalitic propriuzis, in cazul enzimelor metal activate. Ionii rnetalici, intervin in actul catalitic enzimatic prin doui modalitafi: In primul rhnd, prin capacitateade a prelua sarcini negative,ei pot stabiliza centrii cu densitate electronicd ridicatd care pot apare in decursul reacfiilor chimice. Exemplul tipic esteoferit de alcool dehidrogenaza hepaticd,unde ionul Znz* stabilizeazdsarcina par{ial pozitivd care apareIa carbonil. Cea de-a doua posibilitate este consecinfa capacitdfii metaloenzimelor sau a enzimelor metal activatede a furniza nucleofili puternici la pH fiziologic. Nucleofilul se genereazd, dupd o prealabild deprotonare, favorizatdde polarizareastructurii, datoratd interacfiunii metal - ligand. Ligandul sd.rdcitin electroni va putea expulza un proton: \{s2* ( Nu- ) + H* Me2*+ NuH Me'* ( NuH ) s* De exmplu, carboxipeptidaza A confine Znz* cile faciliteazfl deprotonareaapei.

212

Elemente de biochimie.l.

4.4.3, Interactiunea substrat - enzime Zonain care se situeazdaminoacizii care interacfioneazd.cu substratul in vederea realizdrii actului catalitic poartA numele de sifus catalitic, (sit, situs activ sau centru activ sunt termeni sinonimi utiliza,tiin egali mdsurd.). Situsul catalitic are o topologie determinati de structurile de ordin superior (terliara gi cuaternara),contactul cu substratul fiind deopotrivd consecutiv[ gi simultand unor adaptdri conforma;ionale ale enzimei. Aceste modificdri sunt necesare pdtrunderii substratului in interiorul moleculei de enzimd, in situsul catalitic. ln acelaqi timp gi substratul suferd o modiflcare conformationald care sd faciliteze interacfiunea.Un exemplu de interac{iune intre lactat dehidrogenazdgi acidul lactic esteredatdin Fig. 4.12.:

9H3
l

-,/\^ u, \\-/
O

Y*,
Fig.4. 12. Sitnsul catalitic al lactatdehidrogenazni gi mecanismul reacsleide dehidrogenare a acidului lactic catali.mt de aceasta

Interacfiunea situs catalitic, substrat este complexi 9i, datoritd labilitalii conformafionale a catenei polipeptidice este dificil de investigat, pe blocarea selectivd a Principial, studiile de interacfiune se bazeazd. resturilor de aminoacizi gi urmdrirea efectului asupra activitetii enzimei. F5.rda se putea face o delimitare precisd aminoacizii constituenfi ai unei enzime pot fi incadra(i intr-una din urmitoarele categorii: s de conta.c, fixeazd. substratul gi participd nemijlocit la actul catalitic s confor magionali; stabilizeazi conformali a situsului catalitic e auxiliari; interaclioneazd. cu substratul fdrd a participa direct Ia actul cataiitic t indiferenfi; ceilaltj aminoacizi.

Enzime.Mecankmul de actiuneal enzimelor

2t3

4,4.3.1.Reactiui care perrnit studiul situsului activ, 4.4,3. 1.1. Reactivi pentru gyupele tiolice: Grupele tiolice pot fi dozate gi totodatd blocate prin utilizarea 5,5'ditio-bis-2-(nitrobenzoat)-ului (DTNB). Acest reactiv, prin reaclia cu grupdrile SH libere formeazi un compus fotometrabil la 4I3 nm. (e= 13600 M-r . cm-t). Prin reacfia cu grupele tiolice libere, acestreactiv formeazl. punfi disulfurice in componenta proteici, rup0ndu-gi propria punte disulfuricd. Un alt reactiv utilizabil in acelagi scop este N-etilmaleilimida (NEM). Acestava da o reac$e de tip adifie Michael cu gruparea tiolicd, blocdnd-o. Tot ca reactiv de blocare a grupdrilor tiolice poate fi folosit gi iodoacetatul sau acrilonitrilul (vezi determinarea structurii primare a proteinelor). *t\_.JCotB

o,*-\lFs-s-\fF-No,
5,5' ditio-b is- 2-nitro benzoat (DTNB)

"1)-"
N-ctil-maleilimida (NEM)

A t t00 i i t
a t e

martor)

l0 (%) U timp (minute)

Fig. , 13. prealabile cuun reactiv Efecrul eristenfei a substratului deblocare tn reacyia. specific La utilizarea reactivilor de blocare apare o problemd metodologici, legati de prezenla substratului. In prezenfa inifiala a substratului inhibilia activitAfii catalitice este mai pu$n pregnantd datoritd competifiei intre substrat gi inhibitor pe

2r4

de biochimie .l' Elemente

situsul catalitic care conline gruperile tiol. Dacd insd substratul se adaugd ulterior inhibitorului scddereade activitateestemult mai plegnanguperile tio}ice tind sd fie saturatecu inhibitor' ln cazul in t{ deoarece caregrupdrile tiolice nu intervin in situsul catalitic prezenfa inhibitorului nu are nici un efect asupra activitelii enzimatice.

-oo"-!:, l"'
COr-

oo.-r"t ?n,
n,*.th-.o,' ^i srut*oi"r2 +";
ot'-roroxalilacelal

Po.')::i 2n"tostuY

CH,

HrN-

CH -

t-

r azd aspar talaminolr ansfe

cor-

aspailal

Fig.4.I 4. Reacfia catalizatd de o asp&rtetaminotransferazd

iteza de inacExistd qi cazuri in care plezenla substratului mdres,te indicii ale sunt cazuri tivare a enzimei in prezenla inhibitorului. Aceste unor modificdri conformafionale.Un exemplu este aspartataminotransferaza din inima de porc. Aspartat aminotransferaza catalizeazd'reactia de transformare a acidului aspartic in acid oxalilacetic (Fig. .La.). Aceastd enzimd.contine doui subunitafi, fiecare dintre acesteaconfindnd cdte cinci grupe tiolice.
A t 100
i

reactivul grupelortiolice addugat in prealabil.Subs

i t a t 10 (%)

rcactivul grupelor tiolicti addugat dup6 introducerea substratului

propriu (cetoglutaratul)

I grupelortioliceaddugat
in dupd introducerea unut substrat analog

tinp (ore)

Fig.4.15. Efectul reactivilor grupelor tiolice asupra actiuitdlii aspartataminoatransfe r azei tn prezenla sub stratului propriu Si analo g

Enzime.Mecanismul deacfiuneal enzimelor

215

Fiecare subunitate are accesibile doar doui grupe tiolice libere. Toate celelaltepot fi titrate cu NEM sau DTNB doar dupd denaturare. Trat0nd enzima nativd cu NEM sau DTNB se constatd o slabi inactivare. Aceastd. inactivare lentd estedatorati. unei a treia grupdri tiolice care reacfioneazdlent cu reactivul de blocare. ln prezenla unui substrat puternic in preanalog, iteza de inactivare cregte,gi ea se accelereazd zenta substratului tipic ai chiar a sistemului glutarat oxoglutarat. (Fig. 4.15.) Cercetdri ulterioare au confirmat cd cea de-a treia grupare tiol, implicati in denaturareaIentd nu se gdsegte in situsul activ dar el impiedicd probabil conforma{ional activitateaenzimaticd. 4.4.3.1.2. Reactiui p entru hktidind. Se realizeazd prin intermediul dietilpirocarbonatului (DEPC). Ncarbetoxiderivatul absoarbe la 242 nm. Indepirtarea reactivului se poate face cu hidrazini. A\i reactivi de blocare ai histidinei sunt cloroacetona,sau bromoacetona (Fig.4.16).

(Fr)

Dietilpirocarbonat /-\
- AHsOI-l

lto

-oq

ocrf-b N-carbetoxihistidina

\,r*ti

. \o

Fig. 4.16. Blocarea resturilor imidazolice ale histid.inelor

216

Elementede biochimie .1.

4,4.3. 1,3. Reactiuipentru grupd,rilecarboxilice

R-N:C:N_R

^o
tl

NH_R

NH_R'

Fig.a, 17. Blocarea grupdrilor carboxil dupd prealabila actiuare cu carbodiimlde

se reartzeazi prin intermediul carbodiimidelor. Intermediarii formafi prin activarecu acestecarbodiimide sunt extrem de sensibili la ac{iunea nucleofililor, care realizeazl, adevdrata blocare a carboxiliior inifiali (ftg. 4.17.).

\J

*_"_*-1-) \ruA4x-6-xA \J
I
Di c i c I o h ex i lc a rbod i i m i da

(Dcc)

EtiI-1-(3-di m etiIami nop ropi l)carbodi i mi da (EDAC)

Fig,4. 18.Exzmple de carbodiimide frecuent ufili.mte in activarea carboxililor

Blocarea grupirilor carboxilice depinde de accesibilitatea(stericd si ambientalS hidrofob-hidrofild ) a acestora. Diciclohexilcarbodiimida (DCC),pu{in polard, solubildin metanol, va fi utild pentru blocareacarboxililor apropiafi grupdrilor hidrofobe. Pentru vecindtili hidrofile se utllizeazd. etil-l-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC) care estemai hidrosolubild (Flg.4.18). 4.4.3,1.4. Reactivi pentru grupdril.eaminice ale lkinei se realizeazi cu anhidridd maleicd ori cu anhidridd succinicd.Prin astfel de aciliri serealizeazdtrecerea de la forma bazicd.arestului (NHrl la cea acidi a carboxilului.

Enzime . Mecanismul de a.cgiune aI enzimelor

2r7

---/ Lisind

,,5
HzN

/Vl

Anhidrida maleicd

Fig. 4.19. Blocarea capdtului -aminoal lislncl prln malcinilare

Gruparea e-amino din lizini mai poate fi blocati gi prin utilizarea unei aldehide, cat in care se formeazi o aldimin[. 4.4.3.1.5.Reactiui pentru grupd.rile OH din serind. se r eafizeazi cu diizopropilfl orofosfat [DIp) :

"t'r''&x
N

-__>

Fig, 4,20. Bl.ocarearesturil,or serinlce prinfosfatare cu DIP

4.4.3.1.6.Reactivi pentru grupdrile OH din tirozind

\ \(H
N

OH

\zFl3c

\_ '(*

/+ ,,J
-_---.--> AI

qr"

Fig.4.21. Blocarea tirozinei

se realizeazd cu N-acetilimidazol (NAI) (Fig.4.2j).

218

Elementede biochimie .1.

4.4.3.1.7.Re actiui pentru resturile de tr iptofan serealizeaz (Fig. .22.) d cu bromuri de 2-hidroxi-5-nitrobenzil

r,m \r-\2
n/-''/

,,.o, -T-f
Fig. 4.22. Blocorea resrurilor de triptofan

4.4,3.1.8. Reactiui pentru resturile de arginind (Fig. .%.) seface cuI,2- ciclohexandiona

r-{

o\^ I "4t/ | ____> -Ft o

1,2-CiClohehandiona

fv
,)

iv *"\#1
t-__/

<-

r$

Fig. 4.23. Blocarea resturllor de arginind

4.4.4.Enzime holoproteice 4.4.4. 1. Serin proteazele Formeazd una dintre cel mai bine caracterizatefamilii de enzime atdt sub aspectulmecanismului de reacfie cdt gi al structurii. Sunt enzime care scindeazdlegitura peptidic[. Aceastdfamilie include: tripsina, chimotripsina, elastaza, trombina, subtilizina, plasmina, actiuatorul

. Mecanismul Enzime deactriune al enzimelor

2r9

pl"asminogenului tisular gi alte enzime inrudite. Primele trei enzime sunt digestive fiind sintetizate in pancreas gi secretatein tractul digestiv sub formi inactivd de proenzime (zimogene). Aici, prin excizia unei porliuni oligopeptidice se formeazl. enzima activ6. Trombirn este o enzimd cheie in coagulareasingelulao,subtilisina o proteazi bacteriand (din Bacillus subtilis). Plasmina scindeazd catenele polipetidice ale fibrinei din cheagurile formate la coagularea s0ngelui, iar actiuatorul plasminogenului tisular scindeazdplasminogenul la plasmind. O enzimd inruditd ca mecanism qi structurd cu serinproteazele esteacetilcolinesterazncare scindeazdlegdtura estericd. din acetil colind. Dintre enzimele mai sus enumerate, cea mai studiatd este cr-chimotripsina. Structura sa a fost determinati prin studii de difraclie de razeX realizatede echipa lui D.M. BLOW iar mecanismul de reacfie a fost elucidat in colaborarecu B.S.HARTLEY;i I.I. BIRKTOFT.de la laboratorul de Biologie moleculard al Universitdfii Cambridge. Numele clasei vine de la serind, aminoacidul cheie in mecanismul ac{iunii acestorenzime. Dealtfel enzima reacfioneazd cu ugurinfi cu un inhibitor ireversibil diizipropilfluorofosfatul (DIP), un compus in care fluorul poate fi deplasat cu ugurinld de un nucleofil precum hidroxilul serinic (Veziblocarea serinei la studiul situsului catalitic (Fig. .20.). lmpreuni cu un rest aspartil gi unul histidil, serina mai sus amintitd formeazd aganumita triadi cataliticd. Aminoacizii triadei catalitice ai crchimotripsinei sunt: Ser195,His57 gi AsplO2 (Fig.a.2(.)Dupd cum se observdaminoacizii nu sunt apropiafi in sensulstructurii primare. Reacfiaare loc in doud etape principale: ln prima etapd se realizeazd o legituri covalentd intre atomul de carbon Cl al legaturii peptidice ce urmeazd a fi hidrolizati gi serina din situsul catalitic (pozilia 195).Formarea intermediarului acilenzimi are loc printr-o stare de tranzifie incdrcatd negativ la atomul de oxigen atagat de Cl. Formarea acestei stdri de tranzi{ie este facilitati de rolul de bazd generald al histidinei din pozilia 57. Acest rol este potenfat de restul de acid aspartic din pozifia 102 care stabilizeazdsarcina parfiald pozitivd care apare la nucleul imidazolic al His57. Oxigenul Serl95 devine puternic nucleofil astfel lncdt poate genera o stare de tranzifie tetraedricd la Cl. Aceastd stare de tranzitie este stabilizati prin legituri de
a0Procesulde coagulareal sdngeluieste realizat printr-o cascaddde reaclii proteolitice in care fiecale enzimi proteoliticd este inilal un zimogen activat proteolitic de o enzimd din amonte, 9i care la rdndul siu activeazdun zimogen in aval

Elementede biochtmie .I,

hidrogen care fixeazd oxianionul de la Cl (intermediarul Z - Fig. 4.25.). Acestelegdturi de hidrogen sunt realizate in aEanumitul buzunar oxianionic. Ruperea legdturii peptidice duce la forrnarea acilenzimei (intermediarul3). ln cea de-a doua etapd, sub influenfa aceleiagibaze generale dar in prezenfa apei va avea loc un atac nucleofil la acelagiCl. (starea4). $i in cea de-a doua stare de tranzi{ie ionul oxianionic este stabilizat prin existenfa unor legdturi de hidrogen in acelagibuzunar oxoniu (starea5). Prin ruperea legdturii estericedintre serini, Ei fragmentul peptidic N(staterminal enzima se regenereazd rea 6). -' .. /. a i . ( Din mecanismul de funclionare Fig. 4.24. Pozilia relativd q al serinproteazelor explicitat pe craminoackilor componenli ai triadei chimotripsind, rezult[ urmdtoarele catalitice speciftci serin proteazelor caracteristici: I Edstenta triadei catalitice, Arg, His, Ser care permite hidroliza unei legdturi peptidice.

complexenzimA-substral

intermediar letradric

acil enziml

acil enziml

tetraedric intermediar

Cornplexenzimdprodus

Fig.4. 25,Mecanismul proteolkei catalimte de chimotripsind

Enzime. Mecanismulde actiuneal enzimelor

221

r Eficienla acliunii catalitice depinde de stabilizarea celor doud stdri de tranzifie prin legdturile de hidrogen care ftxeazdoxianionul de la cl. Aceste legdturi de hidrogen presupun existenfa buzunarului oxianionic.

o //
orH"""'N-,N*

calena enzimei

gV-"-*/^ o^ ./ /

-l
,,,,-a-''N-o

,at

".Y
H-*->,zn /

capitulN-termrnal al proteinei iniliale

/\N,H '
.. o4. i

I
Fig, 4.26. Interacliunea chimotripsind proteind. tn cazul serinproteazelor

r Selecflalegdturii peptidice care urmeazi a fi hidrolizatd.,cu alte cuvinte specificitatea ac{iunii enzimei, este dependenti de existenla unui ,,buzuna-r" cu structurd complementard restului de aminoacid atagat de carbonul legdturii peptidice care se va cliva. Astfel, acestrest este aromatic pentru chimotripsin6, bazic pentru tripsind etc.
NO"

A
)'

t-

'4(*
a\

acetatulde 4-nitrofenil

o N-acetil fenilalanilatul de metil

J--#* *.i--#",,,
o lenilalanilatul N-formil de metil

r-|-

Fig.4. 27. Substraturi sintetice utiliznte pentru studiul mecankmului reacfiei chimotripsinei

222

Elemente de biochimie ,1,

concentra!ia

4-nitro:

Fig.4.28.Dinamica",",f":::fffii:;i#:;yfl;:tahidroliznchimotripticda o In fine, porfiunea N-terminald a catenei polipeptidice imediat adiacentd situsului de clivare este fixatd de enzimd prin formarea unor porfiuni beta antiparalele atdt pe proteini cit gi pe enzimA7n Fig.4.21. se prezinti cele doud modalita{i de fixare ale celor doud stiri de tranzilie de cdtre serin proteaze. Dovada experimentald a existenfei a doul etape in funcfionarea serin proteazelor a fost oblinuta prin utilizarea chimotripsinei ca enzime pentru clivarea unor substraturi sintetice precum 4-nitrofenilacetatul sau N-acetil fenilalanilacetatul de metil ori N-formil fenilalanilacetatul de metil (Fig.4.27.).Primuldintre acestedoud estemai uEor de utiIizat deoarece 4-nitrofenolatul oblinut este uFor decelabil pentru ca prezintd o absorblie intensd la 400 nm.

Enz + 4-nitrofenilacetat$enzAcetil
\

rapid

-!9!! Acetat+ Enz

4-nitrofenolat
Fig.4.29. Schema acfiunii chimotripsinei asupra -nitrofenolatului

Utiliz6,nd o cantitate mare de enzimd, se observAinitid o creEtererapidd a cantit[fii de 4-nitrofenolat eliberat, urmatd de o reducere a vitezei de formare a acestuia, dinamica eliberdrii sale in aceastd faz6.urmdnd o alurd liniard, paraleld cu cea a eliberirii acetatului. (Fig, 4.28.). Aceasta confirmfl formarea rapidd a complexului enzimi substrat urmati de eliberareatreptate a acetatului din acest compiex. Pe mS.surd

Enzime. Mecanismul de actiune aI enzimelor

223

ce are loc aceasti eliberareenzima poate ata$anoi cantitdgide substrat, dar viteza procesului este limitati de disponibilitatea enzimei libere, disponibilitate limitatd de etapa lentd a descompunerii complexului enzimd substrat.(Fig. .29) 4.4.4.2. Proteazele aspartice Din multitudinea de enzime proteolitice o noti aparte o face o categorie caracterizatd de prezenfa in situsui catalitic a doud resturi de aspartat.De aici numele de proteaze aspartice.Acesteenzime lucreazd la valori acide,cel mult neutre ale pH-ului.
Asp32
dv

ts'^h i
t+-o \,^' i E-----rer' t' \ "ri.

46 V \', \_, |
l-,, hl

Asp2l5 |ililt Fig. 43A, Mecanismul general de acfiune aI proteazalor aspartice tv

Exemple semnificative sunt: pepsina gi chimozina, enzime stomacale care au rolul de a digera proteinele alimentare, catepsinaD, identificatd in mai multe fesuturi, cu rol in digestia lizozomald, a proteinelor, renina, enzima sintetizatd in rinichi, cu rol in formarea angiotensinei I din angiotensinogeno'. De asemeneaproteazn HIV-I din virusul SIDA, care acfioneazdasupra proteinelor virale SIDA este tot o proteazd,aspartici. Cele mai multe dintre proteazele aspartice au masa de cca. 350 kD ceea ce corespunde la 323 - 340 de aminoacizi. Structura proteicd este organizatdin doud domenii. Fiecare dintre acestedoud domenii confine doue foi beta gi douf, scurte alfa helixuri. Cele doud domenii sunt conectateprintr-o foaie beta cu $asecatene antiparalele.Situsul catalitic se gdsegte in ,,addncitura"formatd intre cele doud domenii. Volumul sdu estesuficient pentru a putea addposti cca. gapteresturi de aminoacizi. Aminoacizii de contact sunt doud resturi de acid aspartic de unde gi numeie clasei. ln cazul pepsinei porcine cei doi aminoacizi de conal Acest proces std Ia baza cregterii presiunii arteriale

224

Elemente de biochimie .I.

tact sunt Asp32 gi Asp2I5. Trebuie menlionat cA po4iunea N-terminaia a enzimei se constituie intr-un veritabil capac ce acoperA9i imobilizeazA substratulin situsul catalitic. Mecanismul prin care are loc clivarealegdturii peptidice este o catalizd generald acido-bazic5.. Cele doui resturi de acid aspartic funcfioneazd. succesivca donori gi acceptori de protoni, respectiv ca acizi sau baze generale (Fig. 4.30j.In etapa inifiald (I) restul aspartat se comportd cabaz6,generaldacceptdnd un proton de la o moleculi de ap6, a carei oxigen va dobdndi o nucleofilicitate sporitd, putdnd in acestmod sAatacecarbonul legdturii peptidice pozifionati in situsul catalitic. Prin preluarea de cdtre oxianionul tetraedric a protonului de la restul de acid aspartic 215, se va forma o amidd hidrat instabila (II), care se va descompune prin atacul bazic al Asp32,odatd cu ruperea legdturii C-N 0II) Ei formarea resturilor carboxil gi amino ale capetelor N gi C terminale nou formate prin mperea legdturii peptidice. 4.4.4.3.Lkozimul Este o enzimi detectatd prima dati, in albugul oului de gdinf,, de cdin 1909 gi apoi in 1922,in mucus qi lacrimi, de cdtre tre I,ASTCENKO FLEMING, descoperitorul de mai tdrziu al penicilinei, Numele derivd de la capacitatea acestei substante de a liza peretele unor bacterii. Substanfa este de naturS.enzimaticd. Aga dupi cum s-a ardtat, peretele peptidoglicanic al bacteriilor consta dintr-o multitudine de catene poligiucidice, fiecare fiind formati dintr-o unitate diglucidicd repetitivd. Catenelesunt reticulate intre ele prin scurte catene oligopeptidice. Unitatea diglucidici esteformatd din acid N-acetil muramic -NAM- (vezi aminoglucide), de care se gesegte atagatamidic catena oligopeptidicd gi N-acetilglucozamini -NAG-. care are capacitateade a rupe leLizozimul este o endoglucozidazd. gi NAG din peptidoglicani (vezi l-r& NAM gdturile glicozidice dintre 4.31) sau legaturile gicozidice dintre unitdfile de NAG ale chitinei. S-a constatat cd substraturile cele mai potrivite pentru enzimd, pentru care se ating vitezele maxime sunt trimerul (NAM-NAG)3, 9i hexa-Nacetilglucozamina (NAG)o-chitohexoza.

Enzime. Mecanismul de actiune al enzimelor

225

-ffro I I Y

NHAc

NAU

NAM

NAG

NAM

poliglucidice Fig.4.3I.Loculacfiunii lizozirnului din asupracomponentei

peptido glicanul peretelul bacterlan

Enzima are o dimensiune micd, fiind formatd din 129 de aminoacizi. Este de altfel prima enzime c[reia i s-a determinat structura prin difraclie de raze X (in 1965de cdtre echipa condusa de David PHILLIPS). Mecanismul de actiune Ei structura situsului catalitic au fost posibile dupd mai multe determiniri structurale ale complexelor enzimi inhibitori competitivi (analogide substrat),realizatepe un set de oligoglucide. Aceasta,deoarececomplexul enzimd substrat are o duratd de viafd prea scurti pentru a putea fi studiat. Cele mai bogate in informafii s-au dovedit datele relevate prin folosirea trimerului (NAG)3.Fald de substratul clasic viteza reactiei de hidrolizd este de cca. 60.000de ori mai scdzutd. S-a constatat cd enzima are $asesubsitusuri in care leagf,necovalent o secvenfi de ;ase glucide (A-F).ln urma rezultatelor oblinute de echipa lui PHILLIPSs-a propus un mecanism de reac{ie,neinfirmat pdna in prezent, Asp-52 ln vecind.tatea legdturii care urmeazi si fie clivatd se gdsegte qi Glu-35, (doud resturi acide).

Elementede biochimie ,1,

Legitura care va fi clivatS. se gase$te intre subsitusurileD gi E. Din acestmotiv trimerii (NAG)3 sauNAG-NAM-NAG se comporti ca veritabili inhibitori. ln subsitusul D, glucidaatagatd va suferio modificareconformafionali carela o structurdde tip plic sausemibarcd (structura B), Fig.4.;72.
GlJ3s

?--o

PAsp52

t-rl o-"'
I-f
+

I
(E

ouos f
(=o-= '>H

\o--\=---lof

J-,

\)z

^ -o
Asp52

Fig. 4.32 Mecanismul acfiunii liznzimului

ln catalizd acidd realizatd prin participarea restului Glu35 are loc ruperea legdturii O-glicozidice a nucleului D, expulzarea fragmentului dinspre capitul reducdtor iniFal gi formarea unui ion oxocarboniu, sitabilizat prin participarea celuilalt rest acidAsp52. Gruparea carboxilat a restului Glu35 acfioneazd in continu.ue ca o bazd generald prelu0nd protonul din ap6, care astfel va putea ataca structura oxocarboniu, formdnd gruparea OH (reducdtoare) a celui deal doilea fragment. 4.4,4.Cofactori enzimatici gi vitamine Tipurile de reacfii chimice catalizate de cdtre proteinele pure sunt limitate la posibilitdfile de interacfiune cu substraturile ale grupdor funcgionale prezente in catenele laterale ale aminoacizilor: imidazolul din histidind, carboxilul din acidul glutamic qi aspartic, amino din lisin6, guanidini din arginind, hidroxil din serin6, treonind, tirosind, srulf-

Enzime. Mecankmul de actiuneaI enzimelor

227

hidril din cisteina. Aceste guperi pot funcfiona fle ca acizi sau baze generaie in transferul de protoni, fie in calitate de catalizatori nucleofili in cazul transferului de grupe funclionale. Gama de interacliuni poate fi lirgiti prin participarea la actul catalitic a unor componente neproteice numite cofactori sau dupi caz coenzinxerespectiv grupd,ri prostetice. Componenta proteicfl a unei enzime care confine cofactori poartd numele de apoenzimS,.

Fig.4. 33.Participarea cofactortIor de naturd coenzimaticd Ia procesul catalitic

:X:::X"

Distinclia dintre coenzime 9i grupari prostetice,o reprezintd tdria legdrii cofactorului de componenta proteicd pe de o parte gi participarea sau nu a unei a doua enzime sau echipament enzimatic la regenerarea cofactorului. ln acest context, coenzimele, sunt substanfe neproteice, legatenecovalent,deci separabilede apoenzimi prin dializi sau adsorblie pe cdrbune activ. Ele se modifici in urma actului catalitic care transformd substratul ini$al. Regenerarea lor se face de cele mai multe ori prin intermediul unei alte enzime pentru care coenzima modificatd devine substrat,iar coenzima regeneratdprodus. ln Flg. 4.33.se reprezintd o reacfie de transfer la care participd o coenzimi (Coenz).Prima enzimi (el) catalizeazdreac{ia principald de modificare a substratului, coenzimei. in timp ce enzirna a doua (e2)asigurdregenerarea Grupdrile prostetice sunt de reguld legate covalent de apoenzimd. Regenerarea lor se face cu ajutorul unui substrat secundar, ia reacfia respectivdparticipAnd doar o singurd enzimd. Fig.43 .

''-\aEnz.P ,"r-rAr,
Fig.4.34. Cofactori de tip grupare prostcticd

228

Elementede biochimie.l.

Mulfi dintre acesti cofactori sunt formali prin modificarea unor substanfe organice esenfiale (care nu pot fi biosintetizate de citre om respectiv Eobolan), numite vitamine. Acest termen a fost introdus in 1911 in legiturd cu tiamina, prima vitamind, izolati. Ulterior s-a demonstrat ci gruparea aminicd nu este obligatorie pentru aceastdclasi, dar termenul s-a pdstrat. Trebuie ardtat cd nu toate vitaminele pot conduce obligatoriu la cofactori enzimatici. Caracteristicalor principald este cd sunt substanfe esenfialegi ci participd la reglareaunor procese metabolice sau fiziologice (oricum biochimice) cu sau fdrd participarea unor enzime legate, Vitaminele se pot sistematizain doud mari clasevitamine hidrosolubile gi vitamine liposolubile. Pe l6.ngd vitamine se mai cunosc substante cu aceeagi funcfie, dar care pot fi biosintetizatelimitat de cdtre organismul uman respectiv de goarece. Ele sunt cunoscutesub numele de substanfe asemindtoare vitaminelor (vitamin-like substances). vita1n Tab.4.3. se prezintd vitaminele qi substanfeleasemdndtoare minelor
tora Tab. 4.3. Principalele uitamine Sifuncgiile aces Subs&nfi
(Br) Tiamina (Bd Riboflavina Biotina (Be) Piridoxina Addulniotinic(Niacina) paniotenic Acidul Acidul folic Vitamina Brz Vitamina C A Vitamina Vitamina D Vitamina E Vitamina K Inositolul Colina Camitina Acidul a-lipoic Acidul 4-aminobenzoic

Funclia
Vita nine hidrosol iIe ub poate genera Deficienla beriberi tiamlnpirofosfat. Precursor al coenzimei gi (FMN) flavinadeninmononucJeotidd Precursor al coenzimelor poate (FAD). int0zieri cauza alecrEterii. Deficienla flavinadenindinudeotida blccitina Precursor al coenzimei poate piridoxal lagoareci. Deficienp cauza dermatite fosfat. PreruFor al coenzimei (NAD) nicotinamidadenin-dinucleotida Precursor al coenzimelor 9i poate pelagra. (NADP). Defi cienB cauza nicotinamidadenlndlnucleo$d-fosfat poate la pesAd, Deficienla onducela dermatite A (CoA). Precusor al coenzimei la anemii. Deficienla tetrahidrofolic. conduce Precursor acid al coenzimei perconduce Deficienp la anemia deoxiadenozil cobamida. Precunor al coenzimei nicioase. prolinei Deficienta condula la colagen, Anttoxidant. in hidroxilarea Cosubstrat smrbut. Vitamine liposolubile

gireproducere. Are rolinvedere, cregtere gifmforului calciului Reglarea mehbolismului Fac{or antisterilitate Factor decoaqulare

vitaninelor .Subsfanfe dtoare asemdn hormonali in actiunea Mediator alllpidelor factor membranare, detransport allipidlor Constituent gragi ln mitocondrie acizilor bansportului Substanp necesart oxidativa a cetoadzilor indecarboxilarea Coenzimd folic Commrpnt alacidului alalectrcnilor infansportul mitocoqdrial importantA Coenlma Q(ubichinonele) Componentl

Enzime. Mecanismul deactriune al enzimelor

229

Tiamina (aneurina)

Tiaminpirofosfat

Fig.4.35.Vitamina Bl St tiarninpirofosfatul

4.4,4.1. Vitaminele hidrosolubile Si coenzimel,e lor 4.4.4.1.1.Vitamina Bt (Tiamina sau aneurina) Are o structurd care include doud heterocicluri: un nucleu pirimidinic gi unul tiazolic (Fig. 35.). Atomul de azot al heterociclului tiazolic nu poseddperecheade electroni, neparticipanfi de aceeamolecula apare sub formf, cationicd.Prezenfasarcinii pozitive, labilizeazdlegatura C-H heterociclicd adiacenti, de aceea chiar sub influenfa unei baze relativ siabe, protonul se va elimina carbonul devenind astfel un bun nucleofil. Coenzima derivatd de la tiamind este tiamin pirofosfatul @i9.a35.) Prin legarea restului pirofosfat, pe de o parte se mare$te aciditatea compusului, datoritd efectelor electronacceptoareale restului pirofosfat, iar pe de alte parte, restul pirofosfat, permite interacfiuni puternice cu porfiunile cationice ale componentei proteice ale enzimei. Tiamin pirofosfatul intri in componenta unor enzime care scindeazf, legdturi de tipul prezentat in F4g. 4.36.prin covalengd ingrogatI:
V\J II

-crc-

il

II

tl

Iil -c-crc-

oFt o

ot-l

dl

HH b)

tl

Fig.4.36. legdturi care potfi scindate prin intervenSia cofanorilor TPP

Structurile de tip a) caracteristiceo-cetoacizilor fac obiectul reacfiilor de decarboxilare (piruvat decarboxilaza, u-cetoglutarat decarboxilazaetc). Structurilor de tip b) le sunt caracteristice reacliile catalizate de tr ansceto lazd respectiv fo sfocetolazi.

230

Ebmente de biochimie.I.

Un exemplu interesant al acliunii tiaminpirofosfatului este acela al transformirilor acidului piruvic in produgi gi intermediari precum acetoina, acetolactatul, acetaldehida, acetatul gi acetilfosfatul Fig.4.S7. Aceste transformdri au in comun adifia directi a carbocationul nucleului tiazolic la piruvat. Intermediarul format se decarboxileazdformdnd un nou intermediar, stabilizat prin rezonanfd, care poate la rdndul sdu, prin intermediul carbonului exociclic,cu ma.redensitatede electroni sd dea reac{ii de adilie nucleofild la acetaldehidf,,sau la piruvat, cu formarea unor compugi tetraedrici instabili datoriti apropierii de azotul cationic. Acegtia,datoritd depiasdrilor electronicevor suferi clivarealegdturii carbon-carbon formate prin adilia anterioard, regenerdnd coenzima gi form0nd respectiv acetoina gi acetolactatul, compuqi identificafi mai ales in fermentaliile anaerobebacteriene sau produse de drojdii, unde concentrafia de acid piruvic esteridicatd. De asemenea produsul de adifie-decarboxilareal TPP-ului poate sd capteze din mediu un proton. Prin ruperea legdturii carbon - carbon se formeazi acetaldehidd. O alta posibilitate este pierderea protonului hidroxilic Ai formarea in consecin{da unui carbon trigonal. Acest compus prin hidrolizi sau fosforolizd va forma acetatul sau acetil fosfatul. Transcetolaza este de asemenea o enzimd TPP-dependentd. O intdlnim in calea pentozofosfafilor, in fotosintezd,- vezi Vol. II. Mecanismul transferului motivului hidroxiacetil este prezentat inFig. 3B. 4.4.4.1.2. Vitamina nZ Riboflavina) Numele ii vine de la latinescul flavius (,,galben")- culoarea formei oxidate a substantei.

?
?Fr,-o-T-o-R o*-?-"

*-f-"

Ho-?--H

FAI

Fig. 4.37. Cofactoriifl^auinici(FADSi FMN)

rTl olro=o,;
I

['J "-\x--(
nr^ /

Acetoina

cH3

{>1>_e\s/ .--1 (H-)

d/
.c-o 2
Plrwal

cH,

lr

\-nl
--->

Acetaldehidlt

tr

--T ta
I

,,'iJ1'>,.'
,Q"-'
oo r\ '/
P-od
HrO \

,r

fo'z-'
\

R2= o&*'

(cF12>-o\

rffil

^/2

'<'=
h I

-O-P-O

["]-*"'l
Acetil{osfat

Fig.43e Modatitnfi de transformare alc piruvatului sub influenla eraimelor

cr-io

cli:

cH3

?-q,cr"trdn I Crigcb*z.

3-tostq,befta (ApG)

[**'
D-x.,t,rd65-tosfat
#
|-anl.ru

--{-Vl6a

cr-(xt--lttV];@ / 's1F--=i:zEZ
T:=-5=

tu-o'

k &*o.{

&'.*q'
&cq-,
o P:-ct-l G-P:
_O

D-Ritues't*rat o //

-T-o-Cri I
I

+.+1

cl-r_or

-===:==_-__/

cit--+t | cH-ol cli-ctl

O{_OJ

+-*, ipor
clr

ffi, a,(^" Vo -nz

'e \ -nt

\ Rr='*t;'i"
Rl = (C|ir)r-q

'6

L'sq'
O.SedorraFdo:c7-f6fat

'-tY \r-16

H'
Rz=

NH:
I
"-\-O, lr

,/^l
Fig.4.39.Mecanismul acfiunii trarccenlazei

Enzime. Mecanismulde actiuneal enzimelor

233

Cofactorii flavinici participi la lanlul transportor de electroni Ei totodati intrd tn componenfa unor oxidoreductazeprecum succiniatdehidrogenaza (E.C.1.3.99.1). Cofactorul flavoproteinelor este fie flavinmononucleotida, (FMI\I) fie flauinadenindinucleotida, (FAD), ale cdror structuri sunt redate in Fig. 4.39.Ambele confin in structura lor restul de riboflavini care constd in 7,8 dimetilizoaloxazindlegati in pozilia 10 cu carbonul I' al D-ribitolului. Aceastdiegdturd nu este glicozidicd de aceea numele de flavinmononucleotidd, respectiv flavinadenindinucleotidd sunt incorecte. Se accepti totugi datoritd intrdrii lor in uzul curent al literaturii biochimice.

*";etW'
1 e ga re a p r i n int, e rme di u t
(succinatdehidrogeneza)

ctsteinel h i s t jdriroeth intermedtut

(monoaminoxldaza)

I;ig,4.40.Atasarea coualentd.a unor grupdri prosteticeflavinbe

Majoritatea flavoproteinelor confin FAD, iar cofactorul este de naturd coenzimaticd,putand fi astfelindepdrtat prin dializd. Se cunosc inin care legareacu comsd gi excepfii cum ar fi succinat dehidrogertaza, ponenta proteicd are loc covalent prin intermediul unui rest de histidind din catena polipeptidicd gi monoaminoxidazalegatd.la componenta proteici printr-o legdturdtioetericd (Fig.4.40.)

@ SLbtrA

formd oxidatd (galbend ).450

nm)

formd redusd (l ncolord)

Fig.4. 41.Mecankmul ionic al reducerii I oxi.dd.rilnwleului koalox,azinic

Por{iuneafuncfional[ a FAD, respectivFMN consti in prezenfa celor doud nuclee azotate din structura izoaloxazinicS.Este acceptat mecanismul conform cdruia, in timpul reducerii, atomii de azot 1 gi 5 pri-

234

Elemente de biochimie,l,

mesc cate un echivalent de electroni gi protoni. ln prima etapi un ion hidrura, care provine de la substrat ( de exemplu de la NADH) atace atomul de azot din pozilia 5. (Fig. 4.41.)Dupi rearanjd,rile electronice consecutive,nucleul se stabilizeazd,princaptareaunui proton din mediu,la atomul de azot din pozilia I. Global, structura primegte doi protoni gi doi electroni. Prin modificarea sistemului de duble legituri, formele oxidat5, respectiv redusd au maxime de absorblie specifice in ultraviolet, gi vizibil ceea ce permite identificarea gi cuantificareaacestora(Fig.4.42.)

At
I

I tl
l\ I t \

I forma oxidatd I I ,,/

\ \
-l

t t t \ \ \-'

'

forma redusi

-l 300

l' 400

r" 500

I 600

lungimea de und6 (nm) Fig. 4.42. Alura spectrelor W.WS a formelor redusd.Si ortdatd a flavinelar

Potenfialul de reducere al FAD gi FMN este de - 0.219V la pH = 7 qi t = 30 oC. ln flavoproteine, datorite interac{iunii cu apoenzima valoarea acestuiasuferd deplasdri semnificative, cel mai adeseacdtre valori pozitive. Asocialiile coenzimelor flavinice cu diferite proteine fac din flavoproteine o familie de substanfecu potenliale diferite capabile si funcfionezecu o varietate mare de acceptori de protoni. Coenzimele flavinice posedd gi fluorescenfddar, din picate aceasti proprietate nu poate fi utilizatd in determindri analitice datoritd ,,stingerii" provocate de apoenzimi. Nucleul izoaloxazinic poate fi identificat gi sub forma unor structuri sernichinonice, radicalice rezultate in urma transferului unui singur proton respectivunui singur electron:

Eraime. Mecanismul de actiune al enzimelor

d,s-.8A

235

J
\

I 'f.-7..',lu'.o*-<o
tllll

,oM*i,l*

etl

o
(rqu 1z 191, na)

lq n I od.hrt (grbnl

I 4 50 m)

lqma.emhhlnmlca (.lbta ^z 570m)

anle t.mlchhbnlc

Fig.4. 43. Punerea tn evidenld a intermedl.arului radicalic la oxld.oreducereaflavinelor

Forma redusAa flavoproteinelor (FMNH2sau FADH2) are o afinitate deosebitdpentru oxigen putand forma in reac{ia directd cu acesta un hidroperoxid (Fig. .a$ :

*"-'-,an1fu-o
I ll ll\

T.?
| -

H"c*&\r*,-/o
| ll | |

u.c.\-A|#lr-**
I ^

?X
\ FADH2EMNH2)

r o

H,cy'\-A\,4)fnn '

| .Oll *d'. o

rn-l

(FAoooi" sau hidrcpercxid rnuoont

Fig.4.44.Reacfiafonnelor redtue ale Jlavinelor cu oxigenul

Acest hidroperoxid este deosebit de reactiv, avdnd posibilitatea de a se descompune, cu formare de apd oxigenatdrespectiv de flavind oxidatd(Fig.4.4A: Datoritd acestuicomportament complex flavinproteinele pot fi: A. dehidrogerraze,atunci cAnd oxigenul nu este redus de cdtre nucleul ixoaloxazinic. B. oxigenaze,cdnd preiau hidrogenul de pe substrat gi il transferd pe oxigen cu formarea de apd oxigenatd, aceastadescompundndu-se ulterior sub acfiuneacatafazelorsan fiind utilizatd de cdtre peroxidaze.

riq

/I

"\.2\.'*-z*-2" | | ll |
HzQ

)"-ll

,-,pA/\*41*n
o

hidroperoxid d (FADOOIU,sau FMNOOI-12) FMNOOI-|2)

FAD (FMN)

Fig,4, 45, D escompunerea hidrop eroxi.d.ului flavinin

236

Ebmente de biochimie .1.

C. transportoare de electroni precum flavodoxinele Acfiunea dehidrogenazelor flauinice se exercitein special: . I. asupra legdturilor carbon carbon. De exemplu succinat dehidrogenaza farmeazd prin acidul fumaric prin oxidarea (dehidrogenarea) acidului succinic. 2. asupralegdturilor CH-OH cu ar fi oxidareamembranard a lactatului in piruvat sau in oxidarea menrbranard a 3-fosfogliceratului.In general aceste oxiddri membranare se realizeazi cu enzime flavinice interpuse. 3. asupra legdturii C-H precum oxidarea membranard a NADH, H+: complexul NADH dehidrogenazdconline FMN precum gi centrii FeS gi canalizeazd electronii cdtre o chinona respiratorie (ubichinona). 4. ca reductaze. Flavinenzimele capabile si reducd citocromii sau proteinele cu fier - sulf sunt exemple tipice. Multe dintre acesteenzime ttttlizeazl, ca surse de electroni NADH sau NADPH sau glutationul redus. Altele primesc electroni din alte surse.Astfel de reductazecedeaz\.de reguld secvenfiaicei doi electoni primifi, putdndu-se astfel identifica intermendiari radicalici semichinonici, expulzdnd in mediu protonii. 5. ca oxidaze in care acceptorul de electroni al formelor reduse este oxigenul diatomic. Oxidazele intervin in oxidarea mai multor substraturi: aminoacizi, amine, glucoza etc. f)e remarcat ci in cazul acestor enzime oxigenul introdus in molecula substratului provine din apd. Reducereaoxigenului diatomic reprezintd doar faza de regenerarea formei oxidate a acestorflavoenzime. Notind substratul cu AH2 oxidazele ac{ioneazd prin transferul simultan al celor doi electroni, cu eliberarea de api oxigenati sau transferul secvenfial a doi electroni cu formarea ionului-radical superoxid g)-. Acest ultim caz este exemplificat prin xantinoxidazd. Ionul radical, toxic, este inactivat de citre superoxid dismutazi, o cupruenzimi care faceposibild reacfia: + Oz 20; +2H* -+ HzOz Un exemplu de acliune oxidazicd,esteprezentatin Fig. 4.46.In acest caz D-aminoacizii se transformd in a-cetoacizi prin interrnediul D-aminoacidoxidazei, o enzimd larg rdspdnditd in lumea animald. Mecanismul propus a fost verificat folosind ca substrat nitroetanul, un compus carein mediu bazic formeazdun carbanion stabil cdtevaore Ia pH=7.

Enzime . Ivlecanismulde actiune al enzimelor

/.--t(H+) flavinenzimd ( H N

237

oxidatd V*-

\.zNxr

\Nz&'

____-__> \:i

cu
coc-f-r.rHi
carbanion frovenit dintr-un D-aminoacid

,A "*-:tyt
,
\N^\

I Y NHs

q_tl
.G

>R,A
v

il

-[].,r-,"
li --'-*-.
il

T --.2*-.
il ll -

'i,
--rt

H
d-cetoacld

\A

flavinenzimd reduse

ooc-T.-oJ
Ril

f-

Fi94.46. oxidarea aminoacizilor de cdtreflauinoxidaze

Reamintim faptul cd oxigenul introdus in structura substratului de cf,tre formele oxidazice ale flavoproteinelor provine de la api, flavina redusdputdndu-se reoxida fie anaerobfle aerob.
NADPH,H* FAD

NADP

FADHz
salicilat hidroxilaza

ct-r
I

C02

Pirocatehind CO)1

FADqH

Acid salicilic Fig, 4,47. Oxidarea fenolilor sub acgiunea unor oxidazeflauinice

238

Elemente de biochimie,I.

Monoxigenazele flavinice sunt enzime capabile sd introduce un atom de oxigen in structura unui a.numesubstrat. Majoritatea monooxigenazelordin aceastdclasi sunt FAD-enzime.Exemple tipice sunt 4hidroxibenzoat hidroxilaza din diferite specii bacteriene precum Pseudomonas, Azotobacter,Acinetobacter.D e asemenease poate aminti salicilathidroxilaza din Pseudomonas.Numele de hidroxilaze vine de la faptul cd ele realizeazl. intercalarea atomului de oxigen intre un atom de carbon gi unul de hidrogen. caracteristic acestor enzime este ce ele acfioneaz5. sub formi redusd (FADH2),obfinute prin oxidarea NADPH, mai rar a NAD. Ele activeazd oxigenul prin formarea structurii 4a-hidroperoxidice.Aceasti structure va suferi o clivare heterolitici la nivelul legiturii peroxidice, sub asistenfa unui proton din mediu, formdnd ap6. Oxigenul de pe structura flavinici, cu deficit de electroni, deci foarte oxidant, va fi smuls de cdtre substrat careil va incorpora, Importanfa coenzimelor flavinice constd in capacitateaacestorade a catalizao varietate mare de proceseredox, incluzdnd transferul de electroni dar gi activareaoxigenului in proceselede oxigenare. Un alt exemplu interesant il constiuie acfiunea ciclohexanonoxigenazei bacteriene, o enzimi care mediazd transformarea cetonelor ciclice in lactone cu ciclu incrementat. ln acestcaz hidroperoxidul flavinic, atacd nucleofil carbonul carbonilic, intermediarul oblinut suferind o transpozifie Baeyer-Villiger.(Fig. . B.) Acfiunea lor constituie punctul de intersecfie a ciilor citosolice de metabolizarea carbonului, inifiale, care implicd transferuri bielectronise, cu ciile finale, asociatemembranelor care sunt predominant monoelectrontransferazice.

Fig.a.4& Acgiunea ciclahscanonoxidazei

Enzime , Mecanismul de actiune al enzimelor

239

In celulele mamiferelor, metabo\izareaglucozei (vezi metabolismul glucidelor) duce la formarea de COzgi NADH. Caleaterminali de transfer de electroni, Iegatdde membrand include citocromii, proteinele ferice neheminice precurn si cuproproteinele, toate aclionand succesiv, prin transfer monoelectronic pdnd la acceptorul final oxigenul, cu formare de apf, din protoni gi oxigen astfel redus, NAD*, concomitent cu inmagazinarea unei mari cantitdfi de energie sub form[ de acid adenozintrifosforicformat dinADP gi fosfat. 4.4.4. L3. Vitamina BS ( Acidul pantotenic) OH

"otYYNHfco,H HsC CHo

O
Acid pantoic p-alanina

Acidul pantotenic
Fig.4.a9.

Denumirea, de origine greacd sugereazdlarga rdspflndire a acestui Acidul compus,in fapt amida acidului pantoic cu p-alanina(Fi4.4.49.). pantotenic natural, existent in enantiomerul R, se absoarbela nivel intestinal qi din acestaderivi doi cofactori enzimatici: fosfopanteteina $i coenzirna A. Ambii se oblin dintr-un intermediar comun rezultat prin fosforilareahidroxilului terminal al acidului pantoic.

fosfopanteteina
Fig.4.50.

Fosfopanteteina (Fr6'.4.50.), este prezentd in anabolisrnul acizilor gragi unde iegatd de o componentd proteici formeazi proteina transportoare de acil (ACP - Acil Carrier Protein) care are rolul de suport al sintezeicateneide acid gras (vezimetabolismul acizilor gragiVol.II.).

240

Elementede biochimie .I.

Fosfopanteteina conline legat amidic de carboxil 2-aminoetantiol, iar de capitul oH terminal un rest fosfat. prin restul fosfat al fosfopanteteinei se face joncliunea cu o catend polipeptidicd care conline 7T,d,e resturi de aminoacizi rezultdnd astfel complexulACp.
OH

)i'

o. ,

-. -.j. 1, =b*,

*'*r*

"J
^try{l
oH

l>r'u o) ,-Yd
p
'2orno

coenzima A
Ftg.4.51.

Cel de-al doilea produs bioactiv la care participa acidul pantotenic este coenzima A (Fig.4.46.)Structura coenzimei A confine fosfopanteteind atagatdfosforanhidridic de acidul adenilic (vezinucleotidele),fosforilat in pozifia 3'. Rolul coenzimei A este de a fixa prin acilarela sulfrrl tiolic diferili acizi. Legdtura tiolestericdformati estemacroergicd,astfel incAt hidroliza acesteia,cu regenerareaacidului, respectiv a coenzimei A, putdnd furniza energie. 4.4.4.1.4. Vitamina 86 (Pirid,oxayosfanl ) este coenzima care derivd de Ia vitamina Bo.In naturd, aceastaesteprezertte.in trei forme: piridoxal, piridoxamina gi piridoxind, (piridoxol) Fig. 4.52:
*aNH'

"l'

* -/ t" '' ^{o"/-17o

tJ13

ru

,dG^,/';1u ttl \"/\^, !\

Plrtcloxal fosfat

ttl \rAo.
PIrldortne @iridoxol)

Plidoxamina

Fi9.4.52. Formale vitaminei 86 precurn Si piridoxalfosfatul derivat

Enzime. Mecanismul deacliune al enzimelor

24r

"\C2"

!n

R\r\'cFl
.......,..........l-

un "\c2" '''\.4',/" l^oR

\*Ao.

ill

\$A.n"
I H

R(
H

s3

Fig.4. 53.Mecankmul interacfiunii.piridoxalfu sfatului cuQmtnoacuu

Intrd in componenfa unor enzime care ,proceseazdaminoacizi" reaIizAnd reacfii de transaminare, a- decarboxilare,racemizare, aldolizare gi p-decarbozilare in cazul acidului aspartic.

,^A*,,\/?' *-{t*y

oX*",
=r
H Acorn

T'

Fig.4,54.Mecanismul acgiunii transaminazelor

Acestereacgiisunt posibile datoriti structurii piridoxal fosfatului de a forma imine (bazeSchif2) stabilizateintern, care pot la rdndul lor, prin existenfa centrilor atrdgdtori din structurd, sd stabilizeze perechile de electroni rezultateprin clivareaheteroliticd a unor legdturi adiacente (cr, sau p cel mai adesea). Hidrogenul hidroxilic din pozilia 3 se poate deplasa in pozilia I. ln acestmod se creeazi posibilitatea stabilizdrii iminei prin legituri de hidrogen, gi totodatd apare un centru suplimentar atrdgdtor de electroni (N) - Fig.4.Sa. Transaminazele sau aminotranferazele catalizeazd. reactia de dublu schimb formdnd dintr-o pereche aminoacidr: o-cetoacidzo noui pereche: aminoacid2o-cetoacidr @ig. .54 :

a2Termenul de bazd Schiff se folosegtede reguli penuu iminele Ia care amina de provenienti^ este aromatici..

242

Elementede biochimie .1,

T*"T ?*, Tpx 1,-{"-* xtT*<,..'----

\ffi =-\*:.:
f "^t* "^t*
t/"r tr/"r
1","- x\zRz tt'f\Qi*

S( \Y #U: Qr =-w'
'-1 ' "G'11..,.
m_ *[ R^ t frr. ;^ 'C'. \fir\. -F -ctt.
Jl.tn. Ht" ctt,

I o

tl ptndorrmtnr

*r

w" \ilo\*.
Fig.4. 55.Mecankrnul reacfic i d,etratuaminare

+"

Nnz H+

Atacul asupra legdturii aldiminice se realizeazd prin intermediul formei deprotonate a aminoacidului reactant.Acestava substitui lisina cu sine insugi, formdndu-sein acestmod o noui aldimind. Mecanismul esteprezentat in Fig.4.55. Protonul inilial al aminoacidului va fi stabilizat intre gruparea fenoxid din pozifia 2 a moleculei de piridoxalfosfat qi azotul aldiminic. Formarea acestei aldimine va destabiliza protonul a al aminoacidului provocdnd o extinderea delocalizirii electronicela centrul de reacfie. Aceastd delocalizare este sesizabildprin efectul batocrom 360 nm inifial in absenfaaminoacidului la 430 nm. Mobilitatea protonului este accentuati de asistenfa grupdrii amino a restului de lisind, rdmas liber. ln urma expulzirii protonului din o Ei al deplasdrilorde electroni c:onsecutive, aldimina se va transforma in cetimind. Aceasta,prin hidrolizd

Enzime, Mecanisntul de acpiuneal enzimelor

243

va elimina o-cetoacidul (1), corespunzdtor aminoacidului inifial. Concomitent se va forma piridoxamina. Aceasta,va reacliona cu cr,-cetoacidul (2) reactant,rezultdnd o noue cetimin[. Aceasta,prin medierea aceluiagi rest de lisini. se va transforma in aldimind care prin hidrolizl, va forma aminoacidul2. Reactia de decarboxilare a aminoacizilor care se realizeazi cu aminoacid decarboxilazepiridoxalfosfat dependente decurge dupi un mecanism asemdndtor,cu deosebireacd deplasareaelectronici are loc de la grupareacarboxilat cdtre nucleul piridinic. 4.4.4.1.5 Vitamina B I 2 (Cob alamina) Vitamina cea mai eficientd (prin raportul rispunsi dozd) estevitamina 812.Nu este produsd nici de animale nici de plante, fiind procuratd de la bacterii. Doza necesardzilnic pentru un adult estede cca. 3 mglzi. Anemia pernicioasd,este o maladie a bdtrdnelii, caracterizatdprin eliminarea urinard a unor mari cantitd{i de acid metil malonic. MINOT qi MURPHY (1924) au observat cd boala, care reprezintd unul dintre efectele carenfei acesteivitamine, a putut fi tratatd cu ficat crud. De aici s-a separat un preparat antipernicios, care a constituit sursa din care s-a izolat ulterior vitamina Brz. Se pare cd dintre compugii nonpolimerici, vitamina Br2 posedd una dintre cele mai complexe structuri. Elucidareasa a fdcut necesardutilizareadifraciiei de razeX. Performanfa la aceadate (f 961) aparfine gupului lui Dorothy C. HODGKIN. Vitamina B12propriuzisd, sau ciancobamida, sau denumirea intratd in uz cianocobalaminaconfine: ,t un nucleu corinic, format din patru cicluri pirolice unite fie direct fie prin intermediul unei punfi metenice. Nucleul corinic este puternic substituit, confindnd opt grupe metil, trei resturi acetamidice gi patru propionamidice. I un ion central de cobalt care poate avea numdrul de oxidare +3, +2 sau +1. Acesta intocmai ca gi ionul de fer din feroporfirine este hexacoordinat. Patru dintre coordinalii sunt realizate de atomii de azot pirolici. A cincea coordinalie se realizeazS. de citre un atom de azot aparfindnd unui nucleu dimetil benzoimidazolic, legat de nucleul corinic printr-o legiturd fosforibozicd. Cea de-a gaseacoordinafie este realizatd. de componente variabile: CN-, -CHr, HO- sau 5'adenozinia3.
a3 Compugiicorinici corespunzdtorisunt codificali CNCbl,MeCbI, HOCbI 9i AdoCBl

244

Elemente de biochimie .1.

-CN.......... ....ciancobalamina -CH............. metilcobalamina* R_ -OH.......... ,...hidroxicobalamina - 5' deoxiadenozina.....deoxiadenoizi lcobalarnina* * forme coenzimatice

H,N

CH,

Fig.a. 56.Structura Cobalaminelor (cobamidelor)

Degi s-a realizat sinteza chimic6.a vitaminei B12, in prezent produsul comercial se obline prin biosintezi folosind in acest scop propionobacterii precum Propionibacterium shermanii respectivfeundenreichii sau Pseudornonasdenitrificarzs. Precursorii utilizafi sunt 5,6 - dimetilbenzoimidazol,acid 8-aminolevulinic ai aminopropanol. Transformareavitaminei in coenzima cea mai rispdnditd, S'-deoxiadenozilcobalaminase realizeazdprin doud etape reductive, catalizate de flavinreductaze,care conduc la formarea intermediarului 812. in care cobaltul se gisegte in starea de oxidare +1. Acest intermediar are insugiri supernucleofile,put6,ndatacametilenul 5' dinATP (Fig.4.57).

Enzime . Mecanismul de actiune al enzimelor

245

B fl fr\ i-c-?-o-?-o\,
A I

A;r,

Vitamina 812

5' -adenozilc obalam ina

Fig.4.57. For mar ea MoCbl din CNCbI Uitamina B I 2)

Legitura Co - C din AdoCbl, cu o lungime de 0,205nm, iar unghiul de vaien{d Co-C-C de 130o, uueun caracterintermediar ionic - covalent. Aceastdlegdturd se poate desfaceheterolitic in doud moduri, formdnd resturi cobamidice cu Con,(812Jrespectiv Cb3' @n). De asemenea, legitura Co-C se poate desfacehornolitic, cu formarea restului cobamidic cuCo2*(Bn).

246 pe

Elcmentede biochimie .1,

,Nr;V

ry V

/v
\

/\l

4_W
R'

arzs

Fig.4.58.Posibilitd,Side cliuare a kgdturii Co-C tn AdoCbl, respectivMeCbl

ff"'" ff"'"
R@

Existenla acestor forme fustificd reactivitatea coenzimei. Reacfiile catalizatede cobalamina (AdoCbl)se pot sistematizain trei tipuri: 1. reacfii de transpozifie 2. reacfii de reducere a ribonulcleotidelor la deoxiribonucleotide (la unele bacterii). 3. reacfii de metilare, la care participi gi metil tetrahidrofolatul. Vom detalia acestereactii in cele ce urmeazd: Transpozitii catalizate de cobamide Cele mai frecvente cobamide utilizate de organisme pentru realizarea transpozifiilor sunt AdoCbl gi HOCbl. Se cunosc qi date despre MeCbl. Mecanismul generalesteprezentatin Fig. 4.59 babcc -c-c-d

ii
A

-o-c-c-d

l r lr- r r

it::lxlotoze,e\ I >;c-c-o .
\ /\l { ' . 1 .
oH

itHt

ll x(H)H

de cobamide Fig.4.59.Mecankmulgeneralal transpoziliilor asistate

Enzime. Mecanismulde actiuneal enzimelor

247

Exemple:
Nr.crt
1

Enzima )ioidehidraza dehidraza Glicerol

c
n n

x(H)
nu

un
OH

H
n H

Me sauH
]HOH

liaza OH amoniac 3 Aminoetanol (RlMetilmalonii-CoA H mutazAMesau

q

MesauH
rUzll

OH ,,lHz IOSCoA IHNH-:COz' C=CHdCOr NHr

d
d

(S)-Glutamat mutazi
il

H n

loH
COrH
H

fMetilenglutarat muhza mutaze \minoacid

\4ezCH

l&H

Reacfiilede transpozifie au un mecanism radicalic.AdoCbl(III) va di(Adoe)$i Cbl(ID. sociahomolitic formdnd radicalul5'-deoxiandenozilic Radicalul 5' deoxiadenozilic va extrage din substrat (SH) hidrogenul care urmeazi a fi schimbat. Se formeazd in acest mod radicsiul $o. ln acestradical, grupa migratoare X, se va deplasa ca radical de la pozifia initiala la atomul cu electronul impar, formdnd in acest mod produsul radical (Po).Acestase va stabiliza prin captareaunui atom de hidrogen din 5'metil adelozine (AdoH). Se formeazd astfel (Ador) care prin ata$arela Cbt(II),va refaceAdoCo(IID,precum .siprodusul finai (PH).
AdoCbl(lll) Cbl(ll)Bl2r

-o I

,J

.o

*r T.'I --,.Js. \ -"-f"

(PH) Fig.4.60.Mecankmula$iunii dioldehidratazei

HscAGl (SH)

(Po)

248

Elemente de biochimie.l,

Dehidratazelecobalamino dependente aclioneazeasupra unor dioli vicinali. Prin migrare, acegtiavor forma dioli geminali, care vor elimina apd form0nd compugii carbonilici corespunzitori (Fig.4.60). 4.4.4.1.6. Nicotinamid.a sau niacina intrd in compozifia coenzimelor sub forma unor dinucleotide (Fig.4.61.): Nicotinamid Adenin Dinucleotida (NAD) sau Mcotinamida,AdeninDinucleoti dfosfatul. (NADP) Acestea sunt formate din acid adenilic gi Nicotinamidoribonucleotida. Funcfia redox, caracteristici acestorcofactori este asigurati de nucleul piridinic. ln acestnucleu intrd cei doi electroni dar numai un singur proton (un ion hidrura). Celalalt proton rdmdne in mediu. Enzimele nicotinamidice manifestd o stereospecificitatedeosebitd. (E.C.i.1.1.27), ln cazul lactatdehidrogenazei ionul hidrurd preluat de nucleul piridinic, provine de la atomul de carbon chiral.
coNH2

I
tl I

t>4,1n**",

o<- P - O -

(ll
f*/
I
formaredustr NAD(P)H + H+

I I o

HO

o+-P-o-

o_q,

#
o

I
lorma oxidatd NAD(P)+

R: rl

'. NAD+

R=Pdj : NADF

Fig.4.61. Coeraimele nicotinarnidice

Enzime. Mecanismulde acyiuneaI enzimelor

n

249
A

a) H3C-C-Ot I D

ll n1\-\-

/z

Alcooldehidrogenozo

"\D

-.

NAD redus confL+i

un atom de dufb:

b) H"c-& "\H

NAD redusconbinond un otom de deuteriur H+

Al cnnl dahi d.^^on3i3

D
H3C-C-Cfl
| H

NADI+

Fig.4.62,EvidenSiereahidrogenului care se transferd tn reacfiile redox NAD - depend,ente

(E.C.l.l.1.I), ionul hidrura preluat de In cazul alcool dehidrogenazei nucleul piridinic provine de la gruparea metilen, aga dupa cum s-a demonstrat intr-un experiment efectuatincd din anul 1950de citre Birgit VENNESIAND qi Franck WESTHEIMER.Acegtia au foiosit ca substrat etanoldideuteratla C1. NAD-ul deuterat obtinut a fost utilizat apoi pentru reducereaacetaldehidei nedeuterate.In urma experimentului s-a constatat cA deuteriul a fost transfer pe acetaidehida@i9.a.62.) Efectestereoelectro nice la oxidoreductazele nicotinamidice Stereospecificitatea dehidrogenazelornico tinamidice a fost intens studiatd.Cei doi hidGlrL rogeni din pozilia 4 a heterocicluluiredus legat N- glicozidic de ribozd sunt diastereotopici'4. (Fig.a.ffi.) Enzimele transferi fie hidrogenii Hp (pro-R) fie Hs, (pro-S) din structura nicotinamidicd. ln analiza stereospecificitilii acestor enziCt-I me au fost utilizate argumente stereoelectronice. S-a plecat de la faptul cd perechea de Fig.4.63.Protonii diastereotopici din p ozigia electroni ai atomului de azot heterociclic pre4 -a nucleului nicotinamidic fer5,o pozifie antiperiplanara cu perechea de aINAD(P)H electroni ai legdturii carbon - oxigen adiacentd azotului din ciclul ribozei. Aceastdipotez5.estein acord cu un efectexoanomeric gi conduce la concluzia cd rotafia in jurul legdturii N-glicozi44 Substituiia unuia dintre ei cu orice atom sau grupare, va genera un anume diastereomer. Ei prezintd un motiv particular in spectrometriade tH-RMN.

250

Elementede biochimie ,1.

dice este impiedicatS..Pentru a facilita intrepatrunderea dintre perechea de electroni ai azotului gi orbitalul de antilegdturd o* asociat legiturii carbon-oxigen, orbitalii de legdturd ai azotului se vor plasa in afara planului inifial, ceea ce va conduce la modificarea conforma;iei plane a formei dihidronicotinamidice. ln acestecondilii, apare o barieri energetici a rotafiei in jurul legiturii N-glicozidice care duce la apari{ia unor conformeri efectivi. Prin conformalia barcd formatd, hidrogenul axial din pozifia 4 a heterociclului cu azot devine sin cu perechea de electroni a azotului, in timp ce cel ecuatorial devine anti. Eliminarea hidrogenului axial este favorizati termodinamic, atdt datoritd poziliei axiale, mai bogatdin energiedar gi naturii viniloge de tip sin cu perecheade electroni neparticipanfi ai azotului. (Fig. 4.64.).

Fig.4.64. F"xplicarea stereospeclftcitd.fii transferului ionului hldrurd d,in NAD(P)H

ln consecinf[, conform acesteiipoteze stereoelectronice, hidrogenul din pozilia 4, pro-R se va elimina dintr-un conformer anti, in timp ce cel pro-S se va transfera dintr-un conformer sin. (Fig.a.6a.) Efectul anomeric exo- este slab ca intensitate, de ordinul a 1-2 kcal.mol-t. Aceastaface ca nucleul dihidropiridinic si se poatd roti in jurul legdturii N-glicozidice.Totugi, enzirna este capabild sd discriminezeintre cei doi conformeri cvasistabili, elimindnd (transferdnd) doar hidrogenul axial, pro-R sau pro-S, in funcfie de topologia situsului catalitic al enzimei. lntr-adevdr, studii de difraclie de raze X au confirmat cd enzimele care elimind hidrogenul pro R din structura coenzimei reduse o leagi in conformalie anti in timp ce dehidrogenazele care transferd hidrogenul pro S leagdsubstratulin conformafie sin.

Enzime . Mecanismul de actiune aI enzimelor

251

In celulese gesegte atat NAD (redusgi oxidat)cdt gi NADP (redus gi oxidat).Diferenfadintre aceste doud forme estedatd de raportul concentratiilor formeioxidate Eireduse. Astfel: [NAD-]

* H-] [r.rnnu

\\ ' // r

NADP*

[Naonn* H.]

((1

Degi ambii cofactori au potenfialul redox standard foarte apropiat AE = -0,32 V, NAD" este utilizat in procese oxidative, deci pe cdile catabolice,iar NADPH + H* estegdsitin principalele cdi anabolice. Dintre enzimele NAD* dependentese pot cita: alcool dehidrogenaza, lactat dehidrogenaza, malatdehidrogenaza, glicerofosfatdehidro genaza, glicerinaldehid-3-fosfatdehidro genaza, iar dintre enzimele NADP. dependente:glucozo-6-fosfatdehidrogenaza, glutationreductaza. Datodte modificarii cromoforului la nivelul nucleului piridiliu, proceseleredox catalizatede enzimele NAD sau NADP dependente,mersul reacfiei poate fi monitorizat prin intermediul benzii de absorblie de la 340 nm, care aparein forma redusd. 4.4,4.1.7. Biatina Funclioneazd.ca un transportor de carboxilat in reacfii de carboxilare enzimatica.Apare ca grupare prosteticd fiind atagatamidic de gruparea e-amino a unui rest lizinic. Motivul biotind - lisind este cunoscut sub numele de biocitind (Fig.a.65.).

Biocitina

l_"

Fig.4.65. Biotina gi ansarea acesteiade apoenzimi

Legarea carboxilatului se face prin intermediul azotului din pozilia t'. Carboxilatul estepreluat de citre biotind din forma de carboxifosfat, format ia rdndul sdu prin fosforilarea ATP - dependentd a bicarbonatului (F84.66.):

252

Elemmte de biochimie .I,

ATP

FCoe--!/-

*-TJ,\-

oo lln\\

g
-o ' _

,A*,
Ftg. .66. Formarea carboxlbiotinei

Ncarboxibiotina

"J-J^, o'txt-fft
(')-* -)-

COrH tI

Hot..r,rNL.tln

g\ g _-/ (H) 9
*,,cH-.a,-S-coA

q-cH'.azS-coA

tl o

tl o

Fi9,4.67. TTansferul carboxilatulul de pe biotind pe substrat

Sub formi de carboxibiotini, carboxilatul devine suficient de susceptibil de atac nucleofil astfel incdt reacfiile de carboxilare se vor face prin intermediul unor centre nucleofile (Fig. .67): Prin acest mecanism se pot carboxila: piruvatul, acetilCoA, propionilCoA, metilcrotonilCoA, geranilCoA, ureea, formdndu-se respectiv oxaloacetatul, malonil CoA, metilmalonil CoA, carboxigeranil CoA,N-carboxiureea etc. Fig. 4.68.

Enzime . Mecanismul de actriuneaI enzimelor

253 o ll ^,,-( clli'-\coz'

uv2

tl
Hrc-c-co,
piruvat

...._._--->

oxaloacetat

H.c-c-s-coA
acetilCoA

------')

o tl
^"tctit;

-s'coA

COe' malonit CoA

u a ; ' 't"-t*;-"-'a

o tl
^
rlv\

tv '- \cH--\s_coA

o tl

"oo propionil CoA

CH" CH. O

I COz-

metilmalonil CoA

l-l'll_==r.c#s^con

geranilCoA

geranilCoA 1-carboxi

tl

__{>

H,N,ANH,

HzN-

o ll -/\

NH-CO2'

N-carboxiuree

Fig.4.6& Carboxildri biotindependente

Toate enzimele biotin dependente sunt multimerice. Ele realizeazl, transferul carboxilatului prin mecanisme ping-pong posedand componente monomerice de legare a sursei de carboxilat (carboxifosfatul),de legare a substratului destinat carboxilirii 9i de legare a biotinei. Prin intermediul bralului de zeceatomi de care estelegat biciclul biotinei de catena proteicd, se realizeazdo pendulare a purtatorului de carboxilat intre sursdgi destinafie (FE 4.70.).

W
t'\"'J:;
\.-""u*
Fig.4. 69. Structura complexului auidind-biotind

254

Elementede biochimie ,1,

In albugul de ou crud, se gese$teo proteind avidina care are o afinitate extrem de ridicati pentru biotini (constantade disociere,Kd = 10-15 M) - Fig. 4.69. Prezenfa avidinei conduce la preluarea biotinei gi excesulutilizdrii albugului de ou crud se manifestd prin sindromul hipovitaminazei care consti in pierderea pd.rului,gi aparilia deregldrilor dermatitice. De remarcat faptul cd din cei opt izomeri optici, doar unul are activitate biologici. proteina purtatoare de

HzC

domeniu biotincarboxilazic

transcarboxilazic

F1g.4,70. Modul dc acltune al carboxilazelor biotindependentn

De exemplu acetil CoA carbonlaza din Escherichia coli, constd din trei tipuri de subunititi: (1) biotincarboxilazaun dimer format din doud unitifi de 100 kD; proteina purtd.toare de carboxibiotind, un monomer de 22 kD, de care prin intermediul unui rest lisind se leagd biotina gi subunitatea transcarboxilaza, unde are loc transferul carboxilatului, un dimer cu doud subunitdfi de 90 kD. Lungimea bra;ului de care estreatagat biotina ii permite acesteiasd penduleze intre unitefile biotincarboxilazicd gi cea transcarboxilazicd. 4.4.4.1.8. Acid.ul lipaic Este o substanld care funcfioneazd ca gmpare prosteticd, cu rol de transportor pentru diferite grupiri acil. Structura sa contine o punte disulfuricd, ce conferd moleculei labilitate la reducere.ln consecintd,va existaintr-o formi oxidatd qi una redusi (Fig. .71.).

Enzime, Mecanismulde ac;iuneal enzimelor

255

pcazq

il SH

pcozn

SH

lr

formaredusa (acid 6,8ditiooctanoic)

formaoxidata

Fig.4.71.Acidul lipoic forma oxidatd Si redusd

Intocmai ca gi in cazul biotinei legarea de apoenzimd se face prin intermediul unui rest de lizin6. Acidul lipoic esteintdlnit in doud complexe enzimatice implicate in metaboli smul energetic: piruu at dehidr ogenaza gi a -cetoglutarat dehid, rogenaza.Aceste complexe enzimatice catalizeazdreacfii de decarboxilare oxidativd a acestorg-cetoacizi cu formarea de derivati de CoAas:
oo iltl

trr-r
cor'A+

R-C-C-O

Fig. .72. Particlparea acidului lipoic la transformarea ecetoacizilor (acidulpiruvic Si acidul a- cetoglutaric)

l. 2. 3, 4.

Etapeleprocesului de decarboxilareoxidativd (Fig. .72.) sunt: legareape coenzima tiaminpirofosforica gi realizareadecarboxildrii transferul restului acil pe acidul lipoic aflat in fcrma oxidatd. Rezultd acidul ar-Sacil-dihidrolipoic. transferul restului acil pe coenzima A. Rezultf,acil-CoA gi acidul dihidrolipoic. oxidareaacidului dihidrolipoic cu ajutorul coenzimei NAD*.

4.4.4.I. 9. Acidul folic Coenzimelederivate de la acidul folic sunt componenti de transfer al unei unitdfi care con{ine un singur atom de carbon. Atomul de carbon transferat se poate afla intr-una din stdrile de oxidare -2; 0 sau +2. @ig.a.75.)

4sDetalii suplimentare la capitolul legat de catabolismul glucidic in Vol Il

256

Elementede biochimie ,1.

,lH-cH

/cozH

\ I

\_l

plerina (2amino-4oxopteridina)

glutamat

\l c-+o
//

Ivt

Fig. 4.73.Acidfolic Si componentelesale

Acidul folic (in fapt existi mai mulli acizi folici - vezi mai departe) are in structura sa trei componente: pteridina, acidul4-aminobenzoic qi unul pdnd la 7 resturi de acid glutamic (Fig.4. 73.). Coenzimele derivd de la acidul tetrahidrofolic (THF), format prin acliunea reductivd a dihidr ofolat reductazei (Fig. . 7 ).
H

t.t--Z*\a-i\

rill *">A*4
o
Folat
n

_/.NH

o
Dihidrofolat

^/'NH n

lttl

H R/,NH

Tetrahidrofolat

Fig.4.74.Formc reduseale aciailorfolici

Ioncfiunea intre unitatea de carbon care se transferi qi THF se realizeazd.prinintermediul atomilor de azot NrOsau/EiNs, dupd cum se prezintdin Tab.4.4. O componentd interesantd din structura acidului folic este acidul4aminobenzoic. Pe ldngd participarea sa la formarea folafilor, aceastA substanli indeplinegte si rolul de substanf[ ecran pentru radialiile UV posedind un maxim de absorb1iela297,5nm. Prin esterificarecu N,N'dietil-2 - aminoetanol, acidul 4 - aminobenzoic formeazd 4- aminobenzo atul de N,N'-dietil-2-aminoetil cunoscut sub numele de procaind, principiul activ din preparateleGerovital.
Tab,4.4. Formp ale acizilor folic'l care reallreazd transferul unei unitdfi dc carbon

-2 0
+l

CHOH(celnni redus) Formaldehidl CHzO (celmaioxidat) formiat

un34Hz-CH=O -CH=O 4H=NH -CH=

Ns-metilTHF N5,N1o-metilen THF Ns-formil THF N1o-formil THF Ns-formimino THF N5,N10.rnetenil THF

Enzime , Mecanismul de actiune aI enzimelor

257

CFlr-N

-R

N5,N1&mettlen

-il**r

\.\o^

'
rR

H NADPH,

*_,,

l,-,t@

l,l5,Nl&metenil THF

Fig.4.75.forme de trarcformare ale THF tn uederealntroducerii unui atom de carbon tn dtferite stdri de oxidare

4.4.4.1.10. Vitamina C Are una dintre cele mai simple structuri dintre toate vitaminele. in toate fiinfele vii, dar nu poate fi sintetizatd de @ig. .76). Se gS.segte om, primate, cobai unele specii de pdsdri gi pegti. Lipsa vitaminei C, din aceste specii se expiice prin absenta unei enzime cheie din sinteza acestuicompus: L- gulono-y-lactonoxid aza (Fig.4.78.). Caracterul acid al acesteisubstanfe este conferit de cei doi hidroxili atagati de inelul lactonic. Constantele de aciditate sunt foarte diferite datoriti leg[turilor de hidrogen intramoleculare ce se formeazd atdt in molecula in stare neionizatd cdt gi in urma ionizd.riiuneia dintre gruparile hidroxil (Kar-8,0.10-5 EiKa2=1,6.10-rz).

258

Elementede biochimie .1.

Aciduloscorbic C) Q/itornino
Fig.4.76.

In organism intervine in mai multe proceseredox. Participareasa la acesteprocese sebazeazd,pe reacfiile din Fig. .77.
H++s H+

Ha.\

^'

Forma radicalicd

Acid dehidroascorbic

(semioxidatd)

(forma oxidatd)

Fig' a.77. Formele acidului ascorbic ln reacsiilc de oxidoredurere la care partlcipd

Hidroxilareaprolinei gi a lizinei din colagensunt dependentede acidul ascorbic.(vezicolagenul).

r+-]

C0fi -

NADH.Fr Co rl -

t '*J noo V. *-J l-cH icH ryq GUX GO

Acid D-guluronic
Acid L-gulonic L-0ulonoloctond

*-]

touromgrlzore +-

Aciduloscorbic (Vitomino C)

3-ceto-L-gulonoloctono

Fig. 4.78. Etapele blosintezei acidului ascorbic

Enzime. Mecanismulde acyiune al enzimelor

259

Implicaliile vitaminei C in biosinteza carnitinei Carnitina este o substanfi cu rol de naveta pentru aciziLgraqi iiberi. Carnitina poate traversasistemul membranar mitocondrid atdt tn stare liberd c6t gi av6.ndatagali covalent acizi gragi. In mitocondrie are loc atdt degradareaexergonicdcdt gi o parte a biosintezei acizilor gragi.Acizii gragi sunt substanfe cu conlinut energetic specific foarte ridicat. Funcfionarea sistemului muscular, a creierului, a inimii, in condilii de efort prelungit depinde de carnitind, Ori aceastaestebiosintetizatdintro cale metabolicd care pleaci de la lisind gi care include doud etape oxidative dependente necesarde acidul ascorbic gi de Fez*.Ultima dintre constd in hidroxilarea enantiospecificda y-butirobetainei la carnitind. De aceeacarenfa in vitamina C se manifestd 9i prin disfunclii ale sistemului muscular, angind pectorald (dureri la nivelul inimii) gi stare de confuzie. Implicaliile vitaminei C in biosinteza catecolaminelor

Finitelanint

Tirozina

DOPA

DOPAmlnt

No,apinaftina

Epinofrin.

Fig. 4.79. Secuenfatratuformdrii fenilalaninei in epinefrind

Acidul ascorbic se implicd in procesul de hidroxilare al 3,4-dioxifeniletilaminei - DOPAminei (produs de decarboxilareal dioxifenilalaninei - DOPA).Fig. a.Zg. Se formeazd astfel norepinefrina (noradrenalina), care prin metilare trece in epinefrind (adrenalind), un hormon important implicat in reglareamai multor procesemetabolice. Participareavitaminei C la alte reacfii de hidroxilare Acidul ascorbicparticipe la reac{ii de hidroxilare ale sterolilor, participdnd astfel Ia biosinteza hormonilor steroizi gi a acizilor biliari, in cortexul suprarenal precum gi in ficat. De asemeneavitamina C este implicatd in reac{ii de hidroxilare ale unor substante xenobiotice. Prin hidroxilare, acesteadevin mai solubile 9i in plus capd.ti abilitatea de conjugare cu acidul glucuronic (sau alfi acizi uronici), favorizdndu-se astfeleliminarea lor din organism. acidul ascorbicmai participd la: Pe ldnga acestea,

260

Elemente de biochimie .1.

i Procesede oxidoreducereale unor substraturi aromatice,in special aminoacizi (fenilalanina, tirosina, triptofanul) a Proceselede desatur.re ale unor acizi gragi,precum palmitic Ai steariccu formarea acizilor palmitoleic, respectivoleic r Menfinerea fierului in stare redusd (Fe'*), ceea ce favonzeazd,incorporareasain protoporfirine (cu hem, citocromi). 4.4.4.2.Vitamine lip osolubile 4.4.4. 2.1. Vitaminele A
I r,l

..ft 7

ftla .l- d

Vltamina 4 (Retinol)

Vitamina Q (3-dehidroretinol)

Ftg.4.B0.WtamineA

Fig. 4.81. Modelul molecular al all-trans retinalului

Vitamina A existfl sub mai multe forme. Nici una dintre acestea nu poseddfuncfie de cofactor enzimatic. Ceamai comund estevitaminaAl sau retinolul. ln aceastdstructurd catena lateral5.diizoprenoidd confine dublele legdturi in configuratie trans. Se mai cunosc vitamina A2 sau 3dehidroretinolul (Fig.4.B?). S-au identificat izomeri geometrici ai vitaminei A'1 respectiv izovitarnina A". (9-cis retinol), izovitamina A.u

Enzime. Mecanismulde actiune aI enzimelor

261

(9,13 di-cis retinol), neovitamina A5. (11-cis retinol), neovitamina A". (11,13 di-cis retinol). Se cunoagtede asemenea $i vitamina A3 (13 metilen, 13,I4 dehidroretinol).

Fig.4.82,Structurq Simodul de ancorare al LL-ck-retinalului

Retinolul nu poate fi sintetizat ,,de novo" de cdtre organismul animal. El poate fi oblinut totugi din carotenoide provitaminice (provitamine A). Carotenoidele sunt o clasd de pigmenfi ai cdrei reprezentanfi sunt gdsili atdt in regnul vegetal cdt gi in cel animal. Carotenoidele hidrocarburice (lipsite de oxigen) indeplinesc rolul de provitamine A, putdnd fi oxidate enzimatic, cu ruperea catenei,pdn[ la retinal. Degi se cunosc corela{ii intre conlinutul de vitamine A, (respectiv carotenoideprovitaminice) gi confinutul unor produgi sau intermediari ai metabolismului lipidic, glucidic, protidic sau al acizilor nucleici, rolul cel mai important al vitaminei A este legat de vedere. ln acest proces, este implicat un derivat oxidat al retinolului, retinalul. Informa;ia, sub formi de stimuli luminogi, esterecepfionatd de cdtre celule specializatedin retind. Acesteasunt de doud tipuri denumite dupa forma pe care o au: celulele conuri, gi celulele bastonage.Primele, (cca. 10 milioane) sunt adaptate recepfiei luminii diurne, puternice, colorate. Celulele bastonaqein numdr mai mare (100- 1000milioane) sunt adaptate recepliei luminii la slabd intensitate (crepusculare).Receptorii propriuzigi sunt cromoproteide care confin l1-cis-retinal. In celulele conuri existi mai multe tipuri de fotoreceptori. Ei difera prin componenta proteici gi asigurdrecepfia culorilor. In celulele bastonaqe cromoproteida fotoreceptoareesterodopsina.

Elementede biochimie .1.

membrana celulara

aparat Golgi

t, fata 'r' cdoplasmadci \ _co.rp . slnaptlc \ ._ 7 _ -., rodopslna

Fig. 4.83. Celula bastonas Si arhitecrura fotoreceptorilor

Fig. 4.84. Dispunerea moleculel de retinal tn interiorul structurii opsinice

Enzime. Mecanismul deactiune al enzimelor

263

Celulele bastonageau o structuri particulari. Ele sunt fonnate dintrun segment intern si un segment extern. Segmentulintern contine elementele fundamentale ale celulei (nucleul, mitocondriiie, aparatul Golgi, reticululul endoplasmatic etc.) adaptate pentru un proces intens de sintez[ proteicd dar gi pentru oblinerea ATP-ului. Acest segment se termind printr-un corp sinaptic, prin care se transmite un semnal electric generatin urma excitaliei luminoase.ln segmentulextern se gdsesc formafiunile fotoreceptoare,in fapt nigte vezicule membranare de forma discoidald., in stivd, in numir de aproximativ 1000per celuagezate ld. In acestea se gisesc inseratemoleculele de rodopsind (Fig. .ffi). Opsina are o structurA monocatenard, heptahelicoidald, in care helixurile se gdsescplasate intr-un mdnunchi. Capdtul N-terminal al acesteiproteine se gdsegte pe fafa intradiscoidaldfiind glicozilat, iar capatul C terminal se gdsegte in pe fafa citosolici a membranei discoidale. Aceastd porfiune este bogatd in serind gi treonini, hidroxiaminoacizi susceptibili la fosforiiare.Retinalul se gdsegte plasat in interiorul mdnuchiului de helixuri (Fig.4.B4), ata$atde opsind printr-o legdturd aldiminicd protonatd reaiizatd prin intermediul carbonilului retinalului gi o grupare e-amino al unui rest lizinic (Lys296) din opsini (Fig. .B2). Spre deosebire de clorofild, care in procesul de fotosintezd, sub influenla luminii sufbrd o reacfie de oxidare, expulzd.nd un electron, l1cis-retinalul, prin fotoexcitare,va suferi o reacfie de izomerizare la alltrans retinal. Retinalul all-trans esteprezentatin Fig. 4.81. In solulie, reacfia de izomerizare a cis-retinalului la all-trans retinal este favorizatd energetic.In rodopsind insd, structura I1-cis-retinalului se acomodeaz5. mai bine cu vecindtateaproteicd dec0t izomerul sdu. ln starea fundamentald, in care moleculele se gdsescla intuneric, bariera energetici intre cei doi izomeri este de cca. 30 kcal. Prin absorb;ia unui foton, molecula trece intr-o stare excitatd in care diferenfa energetici dintre cele doud forme se micaoreazd.Aceasta se datoreazl, creEterii mobilitdfii sistemului de electroni n. Bariera energeticdrelativ ridicatd in stare fundamentald are importanfd in diminuarea zgomotului de fond Ia vedereanoctumi. Absorbfia unui foton va duce la formarea unei prime structuri metastabile batorodopsina in care retinalul este izomerizat in forma alltrans. Aceasti formd nu este stabilizati de opsini ca qi structura ll-cis gi in consecinfd, prin deplasareasarcinii pozitive a atomului de azot iminic protonat fafa de centrul negativ (din structura proteicd) care il stabiliza ini{ial, apare o deplasarea maximului de absorblie de la 500

Elementede biochimie ,1,

nm in rodopsinf, la 543 nm in batorodopsiniao.lntre batorodopsinl gi opsini vor apare migcdri relative care se vor opri temporar in structuri intermediare caracterizate prin maximul absorbliei, durata tranzifiei care le formeazdgi temperatura sub care devin stabile (Fig.a.SS) Forma finala, metarodopsina II numitd qi rodopsinafotoexcitatd (R*), va putea expulzaprotonul, fenomen insotritde sciderea maximului absorbfiei la 343 nm. ln urma expulzdrii protonului, va avealoc disocierea all-trans retinalului de pe opsind.
Rodopsina' (lorma oxcilala)
rc! a

)
6t o X

-20 ps

-500 ts

NADH,Hdehidros.Mzd

NAD*

Fig. 4.85. Secuenla cicllcd a strucfirrilor intermcdiare ole tansformdrii fotoexcitare

rodopsinei prin

Regenerarea 1I-cis retinalului se face printr-un proces care implicd o succesiune de reaclii: l.de reducere la all-trans retinol (catalizat de retinol dehidrogenaza),2. izomenzare la ll-cls retinol (catalizat de retinol izomeram) gi 3. dehidrogenarela Ll-cts retina,Iqt retinol dehidroSenaza.
a6 Deplasarea citre lungimi de undd mari este cunoscutii sub numeie de efect batocrom. De unde qi numele intermediarului.

Enzime. Mecanismulde actiuneal enzimelor

265

rzomerizareall-cis retinolului sub acfiunealuminii, va cauzain cele din urmd reducerea permeabilitdfii membranei plasmatice pentru sodiu (prin inchiderea unor canale selectivede sodiu din portiunea externd a celulei),ceeace va generao hiperpolarizare a membranei celulare. Aceastd hiperpolarizare este cauza apariliei impulsului nervos care se va transmite Ia creier. cum are loc aceasti hiperpolarizare? La intuneric, sodiul parcurge un ciclu, iegind din celuld prin porfiunea internd a membranei celulei bastonagprintr-o pompi Na* / K*, pusd in miscare prin sub acfiunea unei ATP-azent. Odata cu iegireasodiului, in celuld va intra potasiul. Dacd potasiul se poate reintoarce difuziv in exteriorul celulei tot in porfiunea internd, sodiul nu va putea reveni in celuld ci va difuza prin spa{iul extracitosolicpdn[ la zona externda celulei bastonag unde, printr-un sistem de pori va reintrain citosol. Acfiunea luminii asupra rodopsinei va avea ca efect ulterior inchiderea porului de sodiu din spafiul extern. Prin aceasta,ciclul sodiului este blocat temporar, sodiul acurnuldndu-se in spafiul extracitosolic, prin aceastamembrana va suferi un proces de hiperpolarizare (sarcina pozitivd spre exterior, iar cea negativdspre interior).
R.. ._,__.-. f

\ L-g"'li'L-J
f--:--\ lumnA

l'*9!,.:fli"l' . 6ffi1
-lacrYa)
I

_-) r+DE

.tt@iiJ ''

UgryU-

r G,ffi;l | .- -; [rransdmlna
I R.{p) "_ - a_;-__.1 J
l-{ens!na) a'tPJ "r Rodopsina inaclivd

7 '.

aoP^] ere orpodp .; ''

-.

I rrccTp I H,o .r o, *,, f$ffi-n tiiW.r]iJ

,,
Tc'GDP

,r"..u!r , __,-,

Fig.4.86.Efectul excitdrii rodopsinei (explicafii tn text)

Interacliunea rodopsind - canalul de sodiu este complexd gi nu se realizeazl.direct (Fig. 4.86). Rodopsina activatd (R*) actioneazdasupra unei proteine multimerice, transducina, pe care o activeazd.La rdndul sdu, transducina activeazd o fosfodiesteraza care actioneazl asupra cGMP formdnd GMP48.
a7 Transpornrl este activ, lmpotriva gradientului de concentralie. Vezi capitolul de transport activ vol. II 48detalii la capitolul acizi nucleici

266

Elementede biochimie .1.

pirofosfat

fostoaiesterazd

Yt-

k--*ot H.
-N

o\d_
I HO

o I

I .r---J ' "aolj'/-Yo *y*t

Ho.* ".oH
GMP

NH,

Fig.4.87. Traruform.area GTP - GMP

Transducina face parte din categoriaproteinelor G, care se pot ataga de divergi receptori de semnale. Ea are o structurd trimericd Tcrpy.De atagat GDP (acid guanozindifosforic). Sub subunitatea ct, se gd.segte rodopsina influenfa luminii activati interacfioneazdcu transducina. ln urma acesteiinteracfiuni GDP-ul atagat de To se va schimba cu GTP. rodopsina va fi eliberatd,ea putdnd Odatd format complexul TcrBy-GTP, transducini. O moleculd de rointeracfioneze cu alti moleculi de sd dopsini activatd poate interacfiona (gi activa) cca. 500 molecule de transducind,ceeace constituie prima etap[ de amplificare a semnalului pe transducini a GTP-uiui va determina diluminos. Totodatd, ata$area

Enzime . Mecanismul de acgiuneal enzimelor

267

socierea complexului in subunitdfile TFy $ Tc-GTP. Subunitatea Tcr,GTP este forma activ6. a transducinei gi va putea interactiona cu fosfodiesteraza careva generaGMP prin consumareacGMP (Fig. .B7.). Fosfodiesteraz.a, in stare inactivi are o structurd tetramerici fiind formati din doud subunitili catalitice s $i p, precum gi din doui subunitdli inhibitorii y. ln urma interacfiunii Ta-GTP cu fosfodiesterazainactivd aceastadin urmd va transferape transducind subunit[file inhibitorii devenind activ6. Enzima are constanta k ut = 42O0 s-r gi raportul krnl/Ky ' = 6.107 (Vezi M-r s-r subcap.a.6.).Hidroliza cGMP-ului reprezintd a doua etapdde amplificare. Ca efect al scdderii concentrafiei cGMP-ului are loc inchiderea canalelor de sodiu, din porfiunea externi a celulelor. ln aceste condilii pompa Na* / K* din segmentul interior va func{iona, expulzAndsodiul, dar acestanu va mai putea reintra in celuld. ln acestecondilii se formeazl.gradientul de potenfial prin membrani, care va declanEa impulsul nervos. Celula excitatdva reveni la forma inactivi, in urma unui complex de evenimente. Primul dintre ele este deznctiuareatransducinef.Subunitatea cr,poseddo activitate GTP-azicin'.In urma acestuiproces subunitatea cr va pierde afinitatea pentru subunitatea y,(I) inhibitorie a fosfodiesterazei. Aceasta,eliberatd, se va deplasa prin difuzie pdnd la fosfodiesterazd, se va reata$a de aceasta, inhibdndu-i activitatea. Prin aceasta, nivelul cGMP nu va mai scddea. Rodopsina in forma activatd (R*), va suferi sub acfiunea unei rodopsinkinazno polifosforilare in zona citosolicd,la niveiul hidroxililor din restruile de treonini gi serind. Prin aceasti fosforilare, molecula poate atasaun inhibitor de naturd proteic5, arestina, care va face imposibili interactiunea rodopsinei cu transducina. De asemenea,pentru inchiderea canalelor de sodiu este necesar[ reluarea sintezei de cGMP. Acest proces se realizeazl prin intermediul ionilor de calciu. prin segLa intuneric, ionii Ca2* cagi ionii de sodiu, intri in celuld., mentul extern, traversdnd membrana printr-un canal controlat de o concentrafierelativ ridicatd.de cGMP. De asemeneaCaZ* iese din celuld prin transport activ, pentru a-qi realiza ciclul, odati cu K*, in contrapar-

aerealizeazd. hidroliza GTP -+ GDP + Pi

Elementede biochimie .1.

tidd cu Na*. Pentru menfinerea $adientului electrochimic, la ieqirea unui ion de Ca2* gi a unui ion de K in celuli vor intra patru ioni Na*. Prin iluminare, concentrafia cGMP scade, aceastava duce la lnchiderea canalului de intrare a CaZ* .ln conditriilein care Ca2* este continuu evacuatconcentralia celulard a acestuiascadede cca. Io ori (de la 500 nM la 50 nM). Sciderea concentrafiei Ca2*, stimuleazd guanilat ciclaza care va produce din GTP, cGTP care va deschide canalele de sodiu duc0nd la reducereahiperpolarizirii membranei celulare. 4.4.4.2.2. Vitaminel.eD
2'1 22

\e
Dz

v^v/^\r,o{3 o'
I
(o'

&.,.

\a&""'
Fig.4.88. Structura vitaminelor D

k\/\y'Yo' looL.

g
t l t
D, cFl3

Hc:.Nl.cft3

Grupul vitaminelor D are Fasecomponenfi codificali notafi D2 -D7. At6.t provenienfa cflt gi rolul acestor substanfe justifici mai pufin apartenenfa vitaminic5. ln cazul organismelor animale, colesterolul endogen este un precursor vitaminic. Rolul major jucat de vitaminele D privegte metabolismul calciului gi al fosforului, stdrile carenfiale manifestdndu-se la copii prin rahitism iar la adulli prin osteomalacie,ambele fiind cauzatede procesedefectuoasede calcefiereale oaselor. Toate vitaminele D provin din precursori sterolici, cale posedi pe ldngd nucleul ciclopentanhidrofenantrenic (Fig. .BB.): t un hidroxil in pozilia 3 r doud duble legituri in pozifiile 5 gi 7 t catend laterald formatd din 8 - 10 atomi de carbon, terminatd printr-un rest izopropilic gi o cdte un metil atagatin nucleu la pozifiile f 0 gi 13

Enzime. Mecanismulde acgiune al enzimelor

269

provitaminele D suntprezentate mai jos:

Provitamina Dz Ds D+ Ds Do Dz Denumirea Ergosterol 7-dehidrocolesterol 22-dihidroergosterol 7-dehidrositosterol 7- dehidrostigmasterol 7-dehidrocampesterol

Trecereade la provitamine la vitaminele D propriuzise se realizeazl sub ac$unea radialiilor ultraviolete, disponibile in radiafia solard. De exemplu ergosterolul prezintd maxime de absorbtrie la 260, 270, 280 ;i 293 nm, cea mai eficace fiind cea de la 280 de nm. Procesul este o transpozilie sigmatropicd II,7] suprafacialddecurgdnd prin intermediari previtaminici. (F49. 4.89.).

Provltamina D

Prevltamlne D

Fig. .89. Secuenlatrecerii de la provitamine D la vitaminele D

Cele mai abundente vitamine D sunt: Vitamina D2 sau ergocalciferolul (prefixul ergo- provine de la ergot sau cornul secarei,-Clauiceps purpureea-, o ciuperc[ ddunitoare plantei, de unde a fost izolat prima datd ergsterolulsau provitamina Dz). Ergosterolul se mai gesegtein cantitdfi apreciabile ca sursd in drojdia de bere, precum gi in ciupercaAspergilliusniger. Vitamina D3 sau colecalciftrolul (prefixtil cole- atestd provenienfa din colesterol a provitaminei D2 sau 7-dehidrocolesterol).Originea endogenf, a colesterolului infum[ forma] apartenenfa acestui grup de substan{ela familia vitaminelor.

270

Elemente de biochimie,l.

Dupd formarea vitaminelor D, acesteaajung la ficat. Cele provenite prin dieti se absorb Ia nivelul intestinului sublire proximal, de unde trec in circulafia sangvin5. Cele endogene, formate in piele ajung in ficat tot prin circulafia sangvind. ln ambele cazuri transportul se face prin intermediul unei proteine de legare a vitaminei D, DBp (de la vitamin D Binding Protein) sintetizatd in ficat. Ea mai este cunoscutd gi sub numele de transcalciferind. ln ficat gi in rinichi vitaminele D pot suferi succesiv o serie de hidroxildri care duc la compugi cu ac{iune eflcace {Fig. .g\.). Natura acesteiacfiuni ne indreptdfegte sd incadrdm vitaminele D mai degrabd ln clasaprohormonilor decd.t in cea a vitaminelor.

colocalcilorol (CC)

25-OH colecalcilerol {25-OH-CC)

(1,25-(OHI-CC) 1,2s-(OHf, colecalcilerol

Fig.4.9o.transformdri prin hidroxilare ale colecalciferolului

Prima transformare, cea petrecutd in microsomii hepatocitelor va consta intr-o hidroxilare in pozilia 25 cu formarea derivatului corespunzdtor 25(OH)D. Numele sub care mai sunt cunoscufi ace$tideriva{i monohidroxilali ai calciferolilor este de calcifedioli. (in cazul colecalciferolului sau vitaminei Ds se va forma 25-HO-colecalciferolul sau 25-OH-CC). Acestcompus se va reintoarcepe caleacirculatorie. De acolo o parte va ajunge la rinichi. ln rinichi se va realiza o noui hidroxilare cu formarea 1,25 (OH)rD sau in cazul vitaminei Ds (1,25OH)r-CC).Hidroxilaza renali este o monooxigenazdlocalizatdin membrana mitocondriali internd. Ea conline proteine Fe-SEi esteNADH,H* gi citocrom Pa5s dependentd. Activitatea sa este supusd unui control prin inhibifie feed-back, concentrafie de comutare a produsului (I,Zs (OH)rD)fiind 0,1nM. Dintre cei doi compugi hidroxilali, I,25 (OH)2Dare, in conjuncfie cu doi hormoni, calcitonina 9i hormonul paratiroidian (PTH) un rol esenfial in reglarea homeostaziei calciului Eifosforului.

Enzime. Mecanismulde actiuneaI enzimelor

27r

Calciul este un ion important in multe procese:contractie muscular5.,transmiterea impulsurilor nervoase,structura gi func$ile membranelor celulare, coagulareasingelui g.a. Nivelul sdu trebuie sd fie constant. Intrarea Ca2n in organism se face prin absorblie intestinald. In organism, calciul se gi.segte in sistemul circulator, locul principal de detecfie a varialiilor de concentrafie.El se stocheazd,in oase.Eliminarea se face pe cale renald. Realizareahomeostaziei calcice presupune acfiuni coordonate la nivelul absorbtiei si excre{iei sale. Astfel la sci.derea ialcemieisO vitamina D se transformd in 1,25 (OH)2D,forma activd care va ac{iona la nivelul intestinului pentru cregtereaintensiteFi absorbliei. De asemenea vitamina D activS,impreund cu PTH acfioneazi la nivelul oaselorpentru a cregteabsorblia calciului. ln cazul unei hipercalcemii, calcitonina amplifica excrefia renald a calciului impiedicdnd mobilizarea acestuiadin oase,blocdnd in acelagitimp activareavitaminei D gi secrefia hormonului paratiroidian. Acliunea vitaminei D asupra f.osforului se realizeazd indirect prin acfiunea sa asupra calciului. 4.4.4.2.3. Vitaminele E

Hzo
\ - r

-2H -2e

Fig.4.91. Manifestarea caracterului antioxi.dant aI uitaminelor E

Sunt cunoscute ca produgi cu acfiune antioxidantd (Fig. .9L), a cdror activitate fiziologicd la mamifere conste in creEterea fertilitS.lii.Numele sinonim de tocoferoli, sub care acesteasunt cunoscute are etimologie greacd.:(tokos - a naqte, phero - a putea). Se cunosc gapte termeni (Fig.4.92.) numili cu cr,-,F--,T-, 6-, r*, (-, gi 11-tocoferol. Structura lor estecaracterizat6, prin prezenfa unui nucleu cromanic substituit. Caracteristiceste prezenfa hidroxilului in pozilia 6, de asemeneaa metilului din 2, aldturi de o catend hidrocarbonici de origine triizoprenicd, saturatepentru tocoferolii (a, 0, y qi S gi 11-Fig.4.gZ.) 9i nesaturatf, pentm tocoferolii e (Rr gi Rs = CHa iar R, =H) gi ( ( Rr, Rz $i Ra- CHJ. Surselecele mai importante sunt cele vegetale,extracfia fdcdndu,se cu
tu Sufixul-emie desemneazd valoareaunui parametru in sdnge,dupi cum -urie se referd.laurind.

Elemente de biochimie,I.

eter,benzensau acetone. Compugiinesaturafi(e qi () sunt mai rar in-

tahiu.
VltaminaE a tocoferol tocoferol P tocoferol 7 6 tocoferol tocoferol11 R1 92

n3

cHs cHs cHg cHo H CHa

H CH3 CHg CHgHH HCHEH

Fig. .92. Structuravitaminelor E cucatenli frizoprenicd ssaturatd

Chimic, vitaminele E sunt relativ stabile in mediu acid, dar instabile in mediu alcalin. Formele comerciale sunt folosite in special ca esteri, prin acilareahidroxilului 6 in special cu acidul palmitic. Prin aceastase mdregte mai mult lipofilicitatea substanfei, implicit viteza de acces transmembranar. Biochimic, rolul imediat aI vitaminelor E esteacelaantioxidant pe de o parte gi apoi acela de stabilizator membranar. Rolul antioxidant aI tocoferolilor este determinat de prezenla hidroxilului din pozilia 6 a cromanului substituit, care permite prin oxidare succesivd hidrolizei legiturii eterice l-2-formarea unui intermediar chinonic (Ftg. .il.) Aceasti oxidare ,,sinucigagd" protejeazi de oxidare alte substanfe bioactive precum acizii gragi nesaturati, vitamina A, carotenoizii gi grupdrile tiolice. Mecanismele concrete de oxidare sunt incd insuficient cunoscute.Rolul protector se manifestdin specialla nivelul membranelor, unde se gesegte ancorat prin catenahidrocarbonicd. 4.4.4.2.4.Vitaminele K

Vitamind(? (sinteti ce) 0nENAD|Or{A

VitamindQ (origine vegetali) FILOCHINONA

Vilamineld(2(origine bacterit (MENACHTNOryE

Fig.4.93.Vitamlnele K1,K2 SiKs

Suntcunoscute ca vitamineantihemoragice qi prezinti ca o caracteristici generalio structura2-metil I,4 naftochinonic[.Structura de ba-

Enzime - Mecanismul de acyiuneal enzimelor

273

zA, vitamina Ks sau menadiona nu este un compus natural, el producandu-se sintetic la scard mare. Vitamina Kr (filochinona) gi vitaminele Kz (menachinone sau farnochinone) posedd catene laterale izoprenoidicesaturatesau'nu, ata9atede carbonul3. Vitamina K1 a fost oblinutd prima dati din lucernd prin extractie cu eter de petrol urmatd de puriflcare pe cirbune. ln pozilia 3 confine o catendde 20 de atomi de carbon fragmentul purtdnd numele de fltil (de la alcoolul corespunzdtorfitolul). Vitaminele Kz diferd intre ele prin numdrul resturilor izoprenice atagate la carbonul 3. Cea mai r5.spdnditi formd este vitamina Kz (n=7) identificati abundent in intestinul gros al mamiferelor. De asemeneasau identificat vitamine Kz (menachinone) cu 4,6,8,9,I0 resturi izoprenice (Fig.a.%).

K4 Vitamina H Acetil Succinat Sulfonat Vicasol Vitamine I menadiol acetilmenadiol succinilmenadiol sulbnilmenadiol

Fig.4,9a.Forme sulfonice Si estericeale uitarnlnelar K de sintezl

Implicafiile terapeuticemajore, ca agenfi de coagulareai vitaminelor K, au fdcut necesare oblinerea unor analogi de sintezd ai acestora, deoareces-a constatat ci alternativa chimicd este competitivS.economic cu cea a extracfiei din surse naturale. In plus, acegti analogi au structurd mai simpl6, fotosensibilitatemai redusd, iar activitatea biologicd estecomparabild cu a analogilor naturali. Slabasolubilitate a compugilor se rezolvi fie utilizdnd aduclii bisulfitici (cazul aductului bisulfitic al menadionei, Vicasolul), fie folosind derivafii redugi ai formei naftochinonice (vitaminele IQ (Fig.A.9sJ).Inacestcaz grupdrile hidroxil se pot acila formdndu-se acetil-, succinil-, butiril- sulfonil- menadiolii. Prin acilare, fie se miregte solubiiitatea (derivafii succinil, sulfonil), fie se mdregte lipofilicitatea (derivalii butiril, acetil) Mai existavitamine K de sintezd care posedd grupdri aminice. Acestea prezintd avantajul cd prin trecerea lor in siruri clorhidrali, sulfafi, solubilitatea lor creEteputernic, potenfialul redox modiflcAndu-serelativ pulin. Cele mai cunoscute sunt vitaminele K5,Ko$i &. (Fig. .9$

274

Elemente de biochimie ,1,

Aga dup[ cum s-a ardtat, rolul major al vitaminelor K esteinterven{ia lor in mecanismelecoaguldrii.
@

o e

cl NHs

OH VitaminaK 5

cl NH3 @o
Vitamina K 5 Vitamina K 7

Fig.4.95.Form,eclorhidrat ale unor structuri uitaminice K de shxezd

Coagulareasd.ngeluieste un proces prin care organismul frdneazi hemoragiile. El consti dintr-o succesiunede reacfii proteolitice la care participd cel pufin $apte enzime proteolitice. Acesteaexistd sub formi inactivd, de zimogenisl.Dupd exciziaporfiunii inhibitorii din cateni de cdtre o enzimd specifice pentru zimogenul respectiv, acesta devine o enzimi proteoliticd activd pentru alt zimogen.ln acestmod se realizeazd o amplificare a semnalului dat de rdnirea unui fesut, amplificare care culmineazd cu formarea de cheaguri care obtureazdvaseleafectateimpiedicdnd hemoragia. Cheagurile de sAnge sunt forma{iuni rezultate prin excizia unor fragmente (fibropeptide) din flbrinogen. Fibrinogenul esteun diheterotrimer format din trei tipuri de catene (Acr)zGF)zYz. Sub acliunea tromgi doud binei, rezultd fibrina un diheterotrimer cu structura (crpy)z fibropeptide: A (fiecarecu c6.te1Baminoacizi), respectivdoui fibropeptide B (cu cdte 20 aminoacizi). Cele doud tipuri de fibropeptide sunt bogate in acizi aspartic Ai glutamic precum gi in resturi de tirozind sulfatat5.,ceea ce ie conferd un caracter anionic. In fibrinogen, participarea catenelorA gi B provoac[ repulsia intercatenard gi explicd solubilitatea agregatului oligomeric. Prin excizia fragmentelor A gi B, solubilitatea scade mult. Formarea cheagurilor se desdvdrgegte printr-o serie de reacgiiintercatenarede transamidareintre resturi de glutamind Eilisind, aparfindnd fragmentelor de fibrind (Fig. .96.A).

sr Componentele proteice inactive (zimogenii) active se numesc factori. Cifrele roma9i ne care denumescfactorii sunt cele stabilitein func1iede data descoperii1or.

Enzime, Mecanismulde actiune al enzimelor O CHz-CHz

275

Fibrini-cH,
L-_J

)o-rr, \c*1

urN-Juz-

[*r-Fibrini

alrriemin,i

risi"a
tronsomidare

os
FibrinS-CHz

/cH2-c(2
9-NH-CHz

r"r1

CH2-Fibrini

A)
cotene de librtnd

I transamidore Agregot polifibrinic

B)
Fi9.4.96Mecanismul reticulnril fibrinci

Multitudinea reac;iilor de reticulare fac din resturile de fibrind un agregat insolubil (Fig.4.96.8.) Aceasta duce la formarea unor agregate insolubile cu masd moleculari mare. Reacfiarespectivdeste catalizatd de o transglutaminazd (factor stabilizator al fibrinei -FXIII-). Fig.4.97. Exista doud modalitdli de declangarea cascadei de reac$i proteolitice care culmineazd. cu formarea fibrinei reticulate (a cheagurilor de (Fig.4.97.): sdnge) Modalitatea (calea) intrinsecd de activare a coagulSrii. La contactul direct cu colagenul din vasele sangvine, contact care se poate realiza doar in cazulin care vasele sunt rinite, sau in contactul cu alte tipuri de suprafefe, are loc activarea factorului )ff (FIAGEMAN).Acesta, odatd activat, pe de o parte activeazl prin proteolizi prekalicreina, la kalicreind care genereazi noi cantitdfi de factor KIa52 iar pe de altd parte actsveazd,factorul X[, care la rindul sdu activeazi factorul D( iar acesta
52Indicele a desemneazi forma activati (capabiltr de proteolizi a factorului corespunzdlor.

Elementede biochimie ,1.

la rAndul sau indepirteazd peptida care mascheaza factorul X (STUART). Trebuie subliniat cd declangarea succesiuniide evenimente, este dependentl de legarea a patm factori proteici de suprafe{ele specifice:factorulXIl, prekalicreina (PK),kininogenul de masd mare gi factorul )il sau Rosenthal. DacI factorul XII se leagd direct, prekalicreina gi factorul Rosenthal se leag[ prin intermediul kininogenului de masd mare.

prin care Fig.a. 97.Succesiunea areloc forrnareafibrinei Succesiunea factorilor proteici esteXII -+ )il -+ D( + X (Fig.4.97.).La factorul X se face joncliunea cu calea extrinseci a cdrei declanqareeste realizati de citre factorii eliberali de iesutul traumatizat. Acegtia activeazd factorul VII gi elibereaz5, din vasele sangvine o lipoproteini numitd factor tisular, care impreund cu factorul VIIa se activeazd factorul X.

Enzime. Mecanismulde actiuneal enzimelor

Factorul Xa la rdndul sdu, transformd protrombina inactivd in tlombind (Factorul II), care catalizeazl exciziaproteoliticd a fibropeptidelor Agi B. Vitamina K este un cofactor indispensabilin procesul de activare a factorilor II, VII, IX gi X, care intervin in etapele finale ale coagUldrii. Acfiunea sa conste in participalea la procesul de carboxilare a unor resturi de acid glutamic (Glu) la acid y-carboxiglutamic(Gla). Aceste resturi sunt plasatela capitul C-terminalal cateneipeptidice. La acest proces vitamina K participd sub formd hidrochinonicd (reduse) Fig.4.9B.:

carboxi Vitamine

A;;
I I

Pi,,,,""*

.--11pAco-* GlaCa+2
Fig. .\S. Mecankmul parttcipdrii ultaminei Kla procesul coaguldrii

OH

4)41"" 02 <>a\<1"'t;':'"Ny*"
\/l\z\o
|ilu oHoo

T"

ii

^^^..ii eooxid

11

ff

\_\r<;

*."'\,^;A*

lormi hidrochinonici

formaepoxidica

formtrchinonici

K eo vitaminelnr Regenerarea Fig. 4.99. fonneiactiv Activarea protrombinei prin carboxilare gi legarea calciului, este esenfiald pentru ata$areaacesteia de zonele anionice ale fosfolipidelor din membranele pldculelor sangvine. ln acest mod se facrliteazd'ac[iunea proteolitice factorului X activat, pe protrombina astfel fixatl. Car-

278

Elementede biochimie .1.

boxiglutamatul (Gla Ca2n1 leagd calciul cu afinitate mai mare decdt glutamatul. Prin aceasta va cregte intensitatea interacfiunii specifice protrombind - Ca2*- fosfolipide, care este esenfialdin procesul de coagulare.

dicumarol

warfarina

Fig,4. 100.Antagon$ti ai vitaminelor K, cu acyiune hemoraglcd.

Reoxidareaformei hidrochinonice utilizate la transportul dioxidului de carbon se face prin intermediul unui derivat epoxidic format in prezenAcest derivat epoxidic trece, prin acfiunea unei fa oxigenului (Fig.4.99.). epoxid reductaze,in derivatul chinonic. Unii antagonigtide tip cumarinic, naturali precum dicumarolul, sau prin impiedicarea legdrii calde sintezd,precum warfarina, (Fig.4.100.) ciului pe trornbind, blocheaz[ coagulareasdngeluigi in consecinld prope duc hemoragii fatale. Acfiunea antagonigtilor prezentafi se bazeazd. similitudinea structurald cu vitaminele K, ceea ce sugereazdun mecanism competitiv de acfiune.

4.5. Ettzime multimeric e

Ca proteine, enzimele pot poseda structurd cuaternard. Complexitatea structurii este mare la enzimele intracelulare qi mai redusd la enzimele destinate exportului in spafiile extracitosolice.ln afara celulei, variabilitatea condiliilor locale de mediu poate denatura cu atdt mai ugor edificiul proteic cu cdt acestaare un grad mai mare de organizare. Enzimele extracelularesunt de reguli monocatenare. Existenfasubunitifilor (monocatenare)la proteinele multimerice face posibild modularea activitefii enzimatice prin interacliuni suplimentare atOtintre subunitdli, c6.tgi cu substanle specifice-modulatorii.

Enzime. Enzime multimerice

279

Interacfiunile suplimentare dintre subunitdli stau Ia baza efecteior de cooperativitatecare constau in modificarea aflnitdfii unui situs pentru un anume substrat atunci cdnd are loc atagareaunui ligand (substrat sau altd substanli) pe alt situs - vezi reglareaactivitefii enzimatice. Subunitdfile enzimelor multimerice pot fi identice precum in cazul aldolazei sau sunt diferite precum in cazul aspartat transcarbamilazei. Pe o catend existi de reguld un singur situs catalitic. Excepgiade referinfd esteADN polimeraza I care acfioneazdin procesul de transcriere (veziVol. II), care pe o singurd monocateni poseddtrei situsuri catalitice distincte: un situs polimerazic, unde are loc formarea unei legituri fosfodiestericegi doud situsuri exonucleazice. Enzimele multimerice pot cataliza o reacfie sau mai multe reacfii biochimice. ln ultimul caz, atunci cdnd fiecare cateni poate fi asociatd unei activitili catalitice distincte putem vorbi despre complexeenzimatice. Reacliile catalizate de complexele enzimatice se desfdgoari intr-o succesiuneproprie unei anume cdi metabolice, complexul enzimatic facilitdnd circulalia ordonatd a intermediarilor de reaclie intre situsurile unde au loc transformdrile. In majoritatea cazurilor fiecare reacfie este catalizatd de o anumitd enzimd. Regulaigi are excepfiaprin existenla tzoenzimelor,enzime diferite care realizeazd. aceleagiactivitdfi insi diferd prin localizare, prin distribufia in diferite organe, prin vdrsta organismului, finalmente prin parametrii cinetici specifici. Ca exemplu, Ia om, se pot cita existenfa a doua malat dehidrogenazei una citoplasmaticd gi una mitocondriald; piruvat kinaza poate existain patru forme: L (hepaticd),R (eritrocitard),Mz (fetal6),gi Mr (in mugchi, creier). Forma M2 este treptat inlocuitd in creier, gi mugchi cu forma M1. Dintre toate acesteforme Ml nu este reglati alosteric (vezi reglareaactivitdfii enzimatice).Un alt exemplu clasic este lactatdehidrogenaza.Aceast6, enzim6, tetramericd, ilustreazi o modalitate interesanti de structurd realizatdprin combinarea in proporfii diferite a doud tipuri de catenemonomerice H gi M. Secunosc cinci izoenzime date cu compozifia lor, in ordinea creqteriisarcinii pozitive LDr (Hr), LDz (H3M), LD+ (HMe)gi LDs (M+). ll)3 (H2M2), Acesteenzime se gdsescin ser dar semnificafia fiziologici a concentraliei lor nu esteinsd cunoscutd.Unele abateri de la compozilia ,,idea16" in izoenzime pot fi atribuite pe baze pur statistice unor tulburdri funcfionale. De exemplu, in infarctul miocardic, in unele afecliuni renale, in leucemie,se constatdcd.LD1> LDz.

280

Elementede biochimie .1.

4.6.Abzime
Aqa dupi cum s-a prezentat la subcapitolul4.4. mecanismede acgiune enzimatici, principiul de realizare al actului catalitic de citre enzime, conste in legarea substratului, gi in stabilizarea stdrii de tranzilie proprii substratului. Utilizdnd-se capacitateade legare a anticorpilot'3, se poate realiza o enzimd artificiali, atunci cdnd anticorpul este generat de o substanfeanalogea stirii de tranzifie a unei anume reacfii. ln acestmod, anticorpii, produgi ca rdspunsla acfiunea unui antigen potrivit, pot mdri viteza unei reac{ii chimice precum gi selectivitatea la valori comparabile enzimelor consacrate. Noii catalizatori au acesteia primit numele de abzime, de la antlbody qienzyme. Ob;inerea abzimelor constd in mai multe etape. In primul rdnd se sintetizeazi analogul stdrii de tranzifie al reacfiei care trebuie catalizate. Apoi, acestanalog,de reguld o substanfdcu masd molarl relativ redus6, deci fdr5.capacitateimunogeneticd, se va transforma in intr-un imunogen prin ataqarea chimicd a unei catenepolipeptidice purtdtoare, de re(substanfainifial guld albumind sericl bovind. Prin aceasta,haptenasa sintetizatd)va deveni antigen, deci va aveacapacitateade a inilia sinteza de anticorpi. Antigenul va fi injectat in reprize unui animal, de regUli goarece,care va produce anticorpii dorifi. Din antiserul obfinut se vor separa anticorpii, care, intocmai ca gi enzimele, vor putea fi utilizali p entru biotransformareasubstraturilor. Analogul stdrii de tranzifie, haptena, esteinzestrati cu capacitateade a induce formarea unui anticorp care va posedasitusuri (paratopi) cu o topologie $i o structuri electronicautild actului catalitic. Primele experimente de utilizare cataliticd a anticorpilor au fost extrem de laborioase. Reducerea efortului experimental a fost realizatd abia dupd ce s-au pus la punct metodele de oblinere a anticorpilor monoclonali (vezi Cap.3 la sec;iuneaanticorpi) precum gi a celor de separare efectivi a anticorpilor (utilizdnd in special cromatografia de afinitate).

53 Linus Pauling afirma in anii i940 cd ,,anticorpii leagdmolecule iar enzimele leagd strlri de tranzilie". Pentru tratarea cantitativi. a legirii enzimelor de substrat vezi mecanismul reactiilor enzimatice. saHaptena este capabild str se lege de un anticorp preexistent dar este incapabild de anticorpogenezd.

Enzime.Abzime

281

Fig.4.101. Oxidarea sulfurii Ia sulfond, catalizatfi. abzimatic

oxidareacu periodat De exemplu abzima codiflcati 2884 catalizeazd' de potasiu a l-metilsulfanilmetil-4-nitro-benzenului la sulfoxidul corespunzdtor,conform reacfiei dinFrg. 4.101. Stareade tranzi;ie pentru reac{ia obiect are structura prezentatd in Fig. 4.102 a. Prin analogie cu aceaste stare de tranzilie s-a proiectat haptena corespunzdtoare, cu ajutorul cdreia s-a oblinut anticorpul (abzima 2BB4).Proiectareahaptenei a trebuit sd find searnade necesitatea stabilizdrii sarcinilor negative pe cei doi atomi de oxigen din periodat, respectiva sarcinii pozitive de pe atomul de sulf. Ca model s-a ajuns la derivatul aminofosfonic din Fig. a.fi2. b. s-au oblinut mai multe tipuri ln urma imunizdrii realizatdpe Soarece de anticorpi monoclonali, a cdror aflnitate pentru substrat precum gi eficienfi cataliticd prezentau o plaji largd de valori.

@&) offo

)*-**r"
I I
I

I l

J\
(

do Yoe

Stare de tranzi{ie

Hantena

r{o2c

Fig. 4.102.Proiectarea haptenei pe modelul stdrii de tranzifie a reacjiel cotalizate

Anticorpul (abzima) 2BB4 prezintd,Kd - Ku = 52 nM, respectiv kr/Kt = 190'103 M-r.s-t, parametri catalitici remarcabili. Pe ldngd reacfiile de oxidare, de tipul celui mai sus prezentate, au palete mare fost sintetizalio serieintreagd de abzime, care catalizeazd.o de reac{ii: hidrolize, izomeriziri cis-trans, decarboxil5.ri,transpozitii sigmatropice,cicloadifii etc. Num[rul abzimelor este,dupi numirul in continui cre$tereal publicaliilor care le descriu,in continui cregtere.

282

Elementede biochimie .I,

4.7.Nofiuni de cineticdenzimaticd
4.7.1. Modelul michaelian, parametri

ICs],[Cp]

Fig. 4.103.Dinamica concentrafiei substratului Si a produsului

Reacfiileenzimatice sunt in cele din urmd reacfii chimice. De aceea, evolulia lor in timp, precum gi factorii care influenleazd.aceastdevolufie pot fi urmdrili dupd principiile cineticii clasice.Cinetica enzimaticd poate fi utild, ca gi cinetica chimicd clasic[ de altfel, in elucidareaunor mecanismede reacfie, in calculul timpului de reacfie, al conversiilor, al condiliilor optime economice, cdnd se urmdregteproduc;ia industrialS, in bioreactor. Pentru o reacfie enzimaticd simpld: Enzimd S --+P dinamica Cs (concentrafiasubstratului) 9i a Cp (concentrafiaprodusului) au alura prezentate inFig 4.103: Studiindu-se influenfa concentraliei substratului asupravitezei iniliale a reacliei enzimatice, s-a relevat pentru wteza reacfiei enzimatice, o curbd cu alurd hiperbolicd, de tipul celei prezentatein Fig.a.10a.Analizdnd comportamentui sistemului de reaclie,s-a constatatci: l. la concentrafii scezute ale substratului, viteza de reacfie este proporfionali cu Cs (reaclie de ord I) 2. la concentrafii ridicate ale substratului viteza de reaclie este independentd de acesta(reacliede ord 0).

Enzime . Nopiuni de cineticd enzimaticd

283

vi

Fig. 4.104, Variafu vitezci dc reacfic cu concentralta iniliald a substratului

3. existdo plajd a concentratiei de enzime la care itezamaximd depinde liniar de Ce (concentraliade enzimi). Pebaza acestor observafii, HENRY, propune in anul 1902un model empiric pentru dependenta vitezei reacfiei enzimatice de concentrafia de substrat(Cd:

v=ffi

t4.e.l

Acest model empiric verifici observatiile fdcute asupra influenlei concentratiei de substrat asupra vitezei reacfiei. Mdrimile v,r,* gi Ky sunt parametri care se determini experimental. Asupra lor vom reveni. BROWN, propune tot in 1902,un mecanism general potrivit cdruia inifial se formeazd, intr-o reacfie reversibili, un complex enzimf,-substrat ES,care se transforrnd ireversibil in produs de reacfie,cu regenerarea enzimei:

E+s Jt-

k2

ES ks,' E*p

Irnpiicarea complexului enzimd-substrat in mecanismul reac{iei enzimattcea fost ficutd inainte de cunoagtereanaturii chimice a enzimelor precum si inainte de detecfia spectrofotometricd a complecailor enzimd-substrat.Labazamecanismului propus de BRo\tfN a stat teoria lacit-cheie a interacgiunii enzimd-substrat.Aceast5. teorie explici interacfiunea enzimd - substrat prin stereocomplementaritateastatich a zonelor de contact din enzimd qi substrat.Astdzi aceastateorie este in-

284

Elemente de biochimie.l.

Iocuitd.cu teoria adaptd,riiinduse care afirmi cd interacliunea pdmare presupune o adaptarereciprocd a geometriilor partenerilor de reaclie. Dintre ipotezele suplimentare introduse de BRO\AIN citdm: l. Concentralia totali de enzimi rdmine constantdin timpul reacfiei enzimatice,adici enzima iniliali se va regdsiatdt sub formd de complex = Ce+ Crs enzimd - substrat,cAt gi ca enzimd liberd: CEo t4.tOl 2. Concentra{ia de enzimd estemult mai micd decdt cea de substrat, prin urmare, formarea complexului enzimd - substrat nu va modifica semnificativ concentrafia substratului. 3. Concentrafiade produs esteconsideratd suficientde micd, pentru produce nu inhibilie. a

Fig. .105. Lenor MICIIAEUS gi Maade MENTEN

MICHAELIS Ei MENTEN introduc in 1913ipotezaconform cdreia, iteza de formare a produsului (din complexul enzimd - substrat)este mult mai mici decdt viteza de asociere- disocierea enzimei gi substratului. De aceea,etapa limitantd de vitezd estereacfia de formare a produsului.ln plus, se poate defini o constantdde disocierea complexului ES: KS=

cr. c,
C*

k2
kl

14.1r.l

In 1925,BRIGGSgi HALDANE au emis ipoteza de stafionaritate,potrivit cdreia concentrafia complexului enzimd - substrat atinge rapid o valoare constantd in dinamica sistemului; cu alte cuvinte viteza de formare a acestuia poate fi considerati egal6 cu viteza sa de descompunere, ceeace formal se transcrie ca:
.{wEs .\

clI

'.-V

14.Lzl

Enzime. Noliuni de cineticd.enaimaticd

285

Elaborarea modelului evoluliei vitezei de reacfiein funcfie de congi MICFIAELIS sepoatefacefinAndcont de ipoteza centraliade substrat -HALDANE (2). MENTEN(1)saudeipotezaBRIGGS cCP cCs -

dt

=-

dt

= kgCrs

t4.131

Din echilibrul primei reacfii gi din valoarea redusd a fu comparativ cu kz rezultd: krCs'Cs= kzCrs 14.141 Elimindnd mdrimea Cn, dificil de determinat experimental, intre ecuatiile t4.141gi [4.10] se obline expresia concentratiei complexului enzimd-substrat:
,^

".t

Cro 'Ca

La*

[4.15]

c,

Introducd.ndaceastdvaloare in expresia [4.13],se obline expresiavitezei de reac{ie:

\v /-

cCo di

.cs ccs _ k3cEo _ k,,n K" +C, dt

'f \-c

t4.161

Kl

ln aceasti expresievaloareaKr'resteegal6cu constantade disocierea complexului enzimd substrat. K1,a poarte numele de constanta MICFIAELIS, iar ecualia model este cunoscute sub numele de ecuafia sau modelul MICHAELIS-MENTEN in onoarea muncii de pionierat a celor doi cercetetori. permite o abordare Ipoteza de stafionaritate BRIGGS-FIALDANE cantitativi mai exactd, deoarece la evaluarea dinamicii concentrafiei complexului enzimi substrat line seama de toate cele trei reactii pe care acestele poate suferi:

+=

^,o kr CE cs - kzc's - lQCss

t4.r7l

de aici, elimind.ndconcentrafia momentand a enzimei, Cr in conformitate cu ec. [4.10]rezultd valoareaconcentrafiei stalionare a complexului ES:

kr+kr+k,' C"

t4.1Bl

286

Elementede biochimie .1,

Introducdnd aceastdvaloarein expresiavitezei de reaclie (ec.4.13) se obline:

V=-_

cCP

_ --____:_=

ccs
dt

.cs k3cEo

df

k, +k. -(-*tt

v.r- 'C, K"+C,

t4.1el

compardnd expresiiievitezelor de reac{ie descrisede ec. ta.16l qi t4.1gl constatdm cd diferenfa consti in termenul ks care apare in constanta Kr,a' Kr',r oferd o idee asupra afinitetii enzimei fali de substrat.Dimensiunea sa este de concentrafie, iar semnificalia sa este de concentrafie de substrat la care se atinge jumdtate din valoarea maximi a vitezei de reacfie. Determinarea experimentald a valorii sale trebuie realizatd in zona optimului de pH ;i temperaturd (vezi mai departe). Pentru majoritatea sistemelor enzimatice valoarea lui Ky este foarte apropiatd de cea a constantei de disociere a complexului enzimd,-substrat ES (datd fiind valoarea micd a k3 comparativ cu k2.).Exceptiile care apar se datoreazddiferenfelor intre concentrafia de substratin vecindtateasitusului catalitic ai in vecindtatea enzimei. Cu alte cuvinte Kr,.r real trebuie sd reflecte concentralia de substrat accesibili la situsul catalitic, ori experimental estedisponibild doar concentratia de substratin exteriorul enzimei. Abateri mari se observdin cazul enzimelor membranare, cdnd datoriti difuziei in vecinitatea imediatd a enzimei (a situsului catalitic) concentrafia reald de substrat este mai redusd dec6.tcea determinatd experimental, constanta experimentaldavdnd deci o valoare superioardcelei reale.Acelagitip de abatere se poate observagi in cazul enzimelor imobilizate. Un caz cinetic particular apare atunci cand etapa de formare a produsului din complexul enzimd - substrat estereversibild.Aceastacorespunde modelului: E+S -!kz cg =-.i(3---5*p k4

In conformitate cu ipoteza de stafionaritate:

dr precedent Urmdnd ralionamentul seobtrine:

"cEl

= kr cr Cs - kz Ces- k, Crs+ h cB cp= 0

t4.201

Enzime . Notiuni de cineticd.enzimaticd

287

k , ' C r o' ( k , C , + k o C r ) Crs = ( k , + k , ) + k , . C , + k oC o

14.2t)

De aici, iteza de reacfie pentru procesul reversibilin ambele etape:

t r*

dc,
dt

dC.

Ct' '(Ct

-ffi",

dt

t4.221

T*..*h""

dacd anulSm valoarea constantei k<, ec.[4.22]igi va modifica forma ajungdndu-se la ec. [4.19]sau [4.9]. Cel mai des utilizat model pentru cinetica enzimaticd monosubstrat este modelul MICFIAELISMENTEN, cunoscut gi sub numele sinonim de modelmichaelian, descris sau [4.9]. de ecuafia[4.16], Cunoscdndconcentratiile iniliale ale partenerilor de reacfie, precum gi constantelede reaclie k1,k2 gi kg,modelul matematic descrisde ecuafiile:
cCP

dt

=ks'CEs

CC'" -A= = kr Cr Cs - kz Cus- ksCes

*=krQr-k,crQ

ccE

dr

= k z C E s- k r C r C s + k g C r s

14.23)

poate fi rezolvat pe calculator cu un program de integrare numerici ugor de realizat intr-unul din programele accesibile ca MATIAB, MATHCAD, MATHEMATICA oTiMAPLE. O astfel de rezolvare necesitdcunoagtereacelor trei constante de viteza,dificil de determinat experimental. Modelul MICFIAELIS- MENTEN poate fi rezolvat relativ simplu, prin determinarea parametrilor Ky, respectiv v**. Desigur, prin reprezentarea vitezei de reaclie (iniliale pentru ca substratul sd fie in exces) in func1iede diferite valori ale concentraliei substratului se obline o curbd cu alura celei din Fig.4.98,pe care se pot identifica geometricKy 9i vn'*.

Elementede b i ochi mie .1.

Metoda analitice estemai precisa,de aceea,prin liniarizarea ecuafiei [4.9] parametrii pot fi deja determinafi prin metoda celor mai mici pitrate. Se utilizeazd,curent trei metode de liniarizare: - Burk 1. Modelul Lineaweauer prin inversareaecuafiei [4.9]se ob$ne expresia14.24.1:

1 v

I Vn*

KM I vrrn< cs

14.24)

Aceastd expresie conline variafia liniard a inversului vitezei cu inversul concentraliei substratului. Ordonata la origine a curbei Lineaweaver - Burk este I / v-*, iar panta esteKr,E / Vn*. Intersecfia cu abscisase face in punctul -1lKM. 2. Modelull-angmuir prin multiplicarea ambilor temeni ai expresieiLineaweaver- Burk cu Cs se obtine:

ct=

KM Vrro<

CS Vrrr:< 14.251

Forma ecuafiei oblinute 14.251, estesimilard ecuafiei cu acelaginume pentru utilizatd studiul adsorbliei gazelorpe solide.Expresiaesteliniard cu Cs.Ordonata in origine este Kylv-ar p?nta.l/v-o, iar intersectia cu -Ky. abscisa 3. ModelulEadie - Hofstee prin multiplicarea ambilor termeni ai ecuafiei de definilie a vitezei de reacfie [4.9]cu Km + C5,urmatd de rearanjareatermenilor se obline: V = Vrrnx - KM

cs

14.261

expresiaeste liniard in v/Cs. Ordonata la ori gine este vmax,panta -Kr'r gi intersecfiacu abscisav-".,./ Ky. Dintre cele trei forme cel mai mult se :utrlizeazd,reprezentarea Lineweaver - Burk, chiar daci prezintd o aglomerare de puncte experimentale in zona concentratiilor relativ mari de substrat, fali de punctele cu concentrafie de substrat micd, deci mai afectatede erori experimentale. Celelalte doud reprezentdri au dezavantajulcd aceleagivariabile (v in cazul Eadie - Hofstee,respectiv C5in reprezentarealangmuir, intri atdt in expresia variabilelor independente cdt gi dependente ale formelor liniare).

Enzime. No;iuni de cineticd enzimaticd

289

ln Tab.4.5.gi in Frg 4.106.A, B gi C se prezinti modul de preiucrare a datelor experimentale (date convenfionale) pentru oblinerea celor trei tipuri de reprezentiri.
Tab. 4.5. Prelucrare a datelor analitice experimentale pentru determinarea parametrilor ecua;iei Michaelis-Menten prin diferite variante de liniari.za.rea ecuafiei inifiale (date conven|ionale)
Dateinifiale,lconventio- Prelucrare LinerrcaverPrelucrare Langmuit - Holstee Eadie Prolucrare

ISI
U.IJ

v 1.0
16

0.5 '1.0 1,5 2.0 2.5 3.0 3,5 40 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0

2.8 3.7
A1

4.8 5.0 5.6 6.0 6.0 6.4 6.4 66 6.7 6.8 6.9 7.0 7.0

1'[SI 4.00 2.00 1.00 0.67 0.50 0.40

n12

lrv
100
0.6/

tsl
0,25
0,50

lSltv 0.25
II.JJ

v/ISI 4,00
J.OU

v 1.0
t.J 19

029 02s 0.22 020 0.18 0.17 0,15 0.14 0,13 0.13 0.11

0,36 0.27 0.24 0,21 0.20 0.18 0.18 0,17 0.17 0.16 0.16 0.15 0,15 0,15 0.14 0.14 0.14

1,0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 65 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0

0.36 0.41 0.49 0.52 060 0.64 0.71 0.75 0.83 0.86 0.94 0.98 1.04 1.10 1, 1 6 1.21 1.29

280 2.47 2.05 1.92 1.67 1.57 1.40

t??

1.20 1.16 1.07 1.02 0.96 0.91 086 0.82 0,78

3,7 4.1 4,8 5.0 5.5 5.6 6.0 6.0 6.4 6.4 6.6 6.7 6.8 69 7.0 7.0

Varialiavitezei initiale a reactieienzimaticecu concentratiade substrat

7 6
1}a OOO"O"

oao' o o a a a

4 3

2
I

Gs

l0

290
Reprezentare Ll NEWEAVERAURK .1,20 L00 0,80
-LEm =4.32 1 l r ' ma x = 0 J 2 1 1

Elementede biochimie .1.

ltu= 0.2302 113 + 0,l2l l

Km /vm ax= 0 2302

0.60 0.40 0.20

t
1/Gs

Rsptezentarca LANGMUR

1.4 1.2 I 0.8 0.6 o.4

panla = 1l/m ax = 0.1145

G&= 0. I ]45 ]l/nrx + O.2a62

Kmy'y'mu=02452

EadieHofstee Reprezentarea v = -2.0642 v/Cs+ 8-6186

Vmax/Km=4.175

l I

= -Km--2.0642 I Panta

I I

Fig. a,fi6. Reprezentd.ri liniarizate d.eriuate din eanfia Michaelis - Menten

Enzime . No;iuni de cinetica enzimatica

29r

Diferentele care apar in determinarea parametdlor modelului michaeliansunt legatede precizia cu care s-a lucrat in procesareadatelor. 4.7.2. Factorii care influen{eazd activitatea enzimaticd 4.7.2.1.Influenla concenffafiei de enzimd Enzima ca substanfd cataliticd, acfioneazdin concentrafii mici comparativ cu substratul.De aceea,ea se manifestd ca factor limitant, adicd raportul concentratiilor enzimei gi substratului trebuie sd fie extrem de mic. Altfel spus, situsurile catalitice ale enzirnei trebuie sd fie saturate cu substrat. Aceasta se poate verifica din liniariatea vitezei iniliale a reacfiei enzimatice cu concentralia de enzim[, (Fig.4.107.a) sau din proporlionalitatea pantelor dreptelor concentralie produs funcfie de timp cu concentralia enzimei (Cn)@ig.a.rc7.b)

Fi9.4.107.Domeniul concentrafiilor uzuale de enzim.dI.acare viteza reac[iei enzimatice esteliniard cu Cg

Cregterea concentratiei enzimei poate duce la scddereacregteriivitezei iniliale, fle datoritd epuizadi substratului, fie datorit[ inactivdrii prin asociere a enzimei. (Fig. .107.B) Nici dilufii foarte mari (concentrafii foarte scizute ale enzimei) nu sunt indicate deoarecepot apare: reduceriale uitezeiini;iale de reacliepentru cd: I pot exista inhibitori in concentralii mici, care consumd o parte din cantitatea inifiald de enzim6, efectul catalitic apdrdnd doar dupd inactivareainhibitorului. I enzima are o structurd cuaternari care la dilutii mari poate disocia, dispdrdnd efectul catalitic t enzima E esteactivd doar prin asocierecu un activatorA: E + A>EA

Elementede biochimie .1.

La dilutii mad complexulEA poate disocia.Toate aceste comportdri genereazd curbecineticevitezdinifidn - Cr de aluraceleiprezentate in (Fig.4.108.A).

Fig. 4.108. Inttuenfa con*:nf:#r17#tryi#itezei

initiate de Ia reactie

ln alte cazuridilufiile foarte mari pot favoriza: creSteriale uitezei ini[iale de reacpieFig. 4.108.8) pnn: r disociereaunor complecgiparticulari enzimd - inhibitor o disociereaformelor asociateinactive ale enzimelor 4. 7.2.2.Influen{a pH - ului

A viteza t .
\ \ \/ t / /

,A\
pH optim

\ \ \

3456

T- l-

-T--f --T

' 10 1} pH

Ftg. 4.1O9.InflucnSa pH-ului asupra actlvitdgii enzimatice

Natura proteicd a enzimelor le face extrem de sensibilela acfiunea factorilor de mediu, implicit a pH-ului. Modificirile de pH duc la modificiri tn numdrul gi distributia legdturilor necovalente care intervin in: structura enzimei, in asociereaenzimei cu substratul si in me-

Enzime. NoSiuni de cineticd enzimaticd

293

canismul de reacfie,toate, cu consecin{easupra actului catalitic. Efectul global este scadereavitezei reacfiei enzimatice. Scddereaeste cu atdt mai pregnantdcu cdt abatereade la pH-ul optim estemai mare.ut Valoarea pH-ului este importantd atat pentru determinarea influenfei asupra vitezei, dar gi pentru evaluareastabiiitilii enzimei la modiflcdrile concentraliei ionilor de hidrogen. In consecinfd, pentru studiul efectului pH-ului se vor realiza doui tipuri de experimente.Ambele se vor desfdgurain solufii tampon. In primul caz, se vor mdsura vitezelereacfiei enzimatice,la valori diferite ale pH-ului (solutii tampon diferite), dar la aceleaqiconcentratii iniliale de enzim6, substrat gi la A). In cel de-al aceeaqi temperaturd (de reguld optimd) Fig.4.109.curba doilea tip de experiment, enzima se introduce in solufia tampon, se incubeazdo anume perioadi la o anumitd temperaturd (de exemplu 10 min la 30"C), dupd care se readuce pH-ul la valoareainifiala (de reguld optima) Ei se mdsoard ca gi in cazul precedent viteza reacfiei Fig. .109., enzimatice. curba B). optim pH-ul optim al enzimelor este variabil: pepsina care lucreaz5. la un pH de 2 3,3, amilaza salivardIa un pH optim de 6,8, in timp ce chimotripsina pancreaticdate pH-ul optim situat intre 7 gi B. 4. 7.2.3. I rttluenla temp eraturii Ecuafia lui Arrhenius aplicabild unei reacfii care decurge dupd un mecanism unic, consacrddependenfa directd a vitezei de reaclie (constantei de vitezd) cu temperatura:

- * + W.z7l = koe-Fi scu gin togcritrrcre Ink= Inko t< t<l

Natura proteicd, foarte mic entropicd, conferd enzimelor o mare sensibilitate termici a structurii. Temperatura iqi exercitd efectul direct asupra structurii globale a enzimelor, asupra topologiei situsului catalitic in particular. De asemenea,temperatura aclioneazd asupra stabilitdfii complexului enzimd - substrat. Pe ldngd acesteaspectelegate direct de enzim6, crestereatemperaturii poate deplasacaracterullimitant la un alt proces, cuplat cu reacfia enzimaticd, difuzia de exemplu. De schimbareatemperaturii poate sd ducd la modiflcarea locali asemenea, a concentraliei speciilor reactante (exemplelereferitoarela modificarea
ssValoareaoptimd a pH-ului unei reaclii enzimatice este aceeapentru care viteza este maximd. Tot astfel se definegte temperatura optimi, tdria ionicd optimi etc. ln general, o valoare optimd este aceeacare extremizeazi (maximizeazd, sau dupd caz minimizeazd) o variabild numitd criteriu de optim

294

Elementede biochimie .1.

solubilitdfii oxigenului sau dioxidului de carbon sunt edificatoare). ln fine, modificarea temperaturii afecteazi fluiditatea membranelor biologice cu impact asupra transferului de substanli. Complexitatea factorilor care intervin asupra unei reacfii enzimatice odatd cu modificarea temperaturii, este deci ridicati. Experimental, urmirind evolufia vitezei reacfiei enzimatice cu cregtereatemperaturii, se constatd o cre$terea intensitdlii proceselor de denaturare structurali, a cdror dinamicd,, dupd atingerea unei temperaturi optime, va devansape aceea a reacfiei propriuzise. Prin urnare, cregtereade temperaturd va duce la cregterea inifiali a vitezei de reaclie pdnd la atingereaunui maxim al vitezei, la temperatura optim6., dupd care viteza reacfiei utile va scidea datoritd intensificirii proceselorde destabilizaretermicd a enzimei. Stabilitateatermicd a enzimei poate fi evaluatdprin Tm (vezi structura terliari a proteinelor). Temperatura optime a enzimelor este situata in jurul temperaturii medii in care enzimele acfioneazi ,,in vivo". De aceea,temperatura optimd a enzimei este corelatd cu sursa din care aceasta s-a oblinutsu 4.7.2.4. Influenla forlelor de forfecare Cu semnificafie mai redusd in experimentele in ,,vivo", forfele de forfecare ce apar la curgerea solufiilor de enzime, la agitarea acestora, pot duce la scddereaactivite$i, ca urmare a modificirii locale structurii enzimatice. Ca gi in cazul temperaturii, mdrimea efectului depinde de tipul de enzimd precum gi de mdrimea forlelor de forfecare. In cazul experimentelor realizate cu catalazi, renet qi carboxipeptidaza Aintr-un reoviscozimetru s-a demonstrat o corelafie intre activitatearemanentd gi mirimea adimensionald y0.57 S-a demonstrat de asemeneacd in decursul experimentelor de forfecare absenfa aerului reduce influenla forfei de forfecare asupra stabilitelii edificiului proteic. 4. 7.2.5. Eficienla enzimaticd ln orice reacfie enzimaticd la care concentrafia substratului depdgegtepe cea a enzimei se poate considera cd enzima parcruge un ciclu:
s6Microorganismele, utilizate ca principale surse de material biologic sunt in funclie de temperatura medie psichrofile sau criofile (20-30"C), mezoflie (3(}-40'C) 9i termofiIe (55-60"C) 57ln aceasti espresie y este viteza de forfecare, definitd ca raport dintre tensiunea de forfecare t [Pa] $i viscozitatea dinamici. m [Pa.s]. $ reprezintd. timpul de expunere la forfecare [s]

Enzime. Noyiuni de cinetiad enzimaticd

2;95

E ) ES + E. Raportdndu-ne la timp, se poate defini o merime, numrtrul de ciclu (lq"J, ca nurndrul de molecule de substrat transformate tn produs in unitatea de o moleculrt de etaimi, atunci cdnd. toate moleculele de enzimd din sistem sunt sa.turatecu substrat.
Tab.4.6 Catalua Anhidraza carbonici Acetil colinestereaza Penicilinaza Lactat dehidrogenaza Chimotripsina polimeraza ADN I Lizozimul k.a(secundid) 4 .101 1.106 . 104 1,4 2. 103 '1. 103 1.102 101 1,5. 0,5. 100

ln conformitate cu modelul michaelian, hut se poate mS.suraprin constanta de vitezi a reactiei enzimatice care decurge cu itezd' maximi:
vatu* ,- = ; K3
-Eo

14.2B.l

ln acestecondilii, constanta de vitezd kr este chiar k"t. misurdnd de fapt activitatea maximd a unei enzime. Intr-adevir daci Ceose exprima in moli .l-r dimensiunea lui k este de timp-t. Inversul lui k"ut(l / k", ) ", va avea semnificafia de timp necesar transformdrii unei molecule de substratin produs final. ln Tab.4.6sunt prezentate cateva enzime ierarhizate dupd valorile
hut.

Relevanfamirimii k 4, singurd.,este redusd deoarece,de reguld, in experimentele'in vivo", in interiorul celulei, enzimele sunt departe de a fi saturate cu substrat, raportul Cs / Ku fiind situat de cele mai multe ori intre0.0l - 1,0. Condiliile in care se poate evidenfia h"t s ating doar la experimentele ,,in vitro". ln condilii mai apropiate de cele din interiorul celulei, la valori scdzute ale concentra{iei de substrat Cs, util este raportul kut / Kp. Importanta acestuia se observe prin prelucrarea ecualiei model Michaelis - Menten [4.19]:

k c o t' C r o ' C s
V_

Kp1+ Cg

t4.2el

Elemente de biochimie,I,

La concentrafii reduse ale substratului cdnd Cs (( Ku, cd.ndin numitorul expresiei t4.2gl se poate neglija Cs, iar Cs6poate fi considerat egal cu concentrafiaenzimei libere, Csse obfine: V=l

(t,-*) *'l.QCS
\Kv/

t4.s0l

Factorul ku, / Kr,rare semnificafia de constantd aparentd de ordinul iI, (desigur aplicabild in condifii de deficit de substrat). ca gi in cazul saturdrii enzimei cu substrat constantade vitezd (hu, I KM) de mdsura eficienfei enzimatice.ln cazul in care se compard doui reacfii enzimatice care uttlizeazd. sub straturi diferite : A+E>AE-+P+E B+E>BE+Q+E ln condiliile unor concentrafii reduse, mult sub constantele Ky ale proceselorrespective,vitezelede reacfiepot fi scriseca:

u^=I&ft9 ei u,=&fttr

cu ca << Kfi cu << cs Kn

t4.311 14.321

Raportul celor doui viteze de reacfie, catalizate de aceeagienzimi, va exprima capacitatea relativi enzimei de a transforma substrateleA gi B in produgii P, respectivQ. Admifdnd cd valoarea concentratiei de enzimd esteaceeagi in ambele reacfii, rezultd cd:

, o = \ / K i ) . cA
vB (k:^,/ ^\
rzg

(k:^,/ \

14.331

\ /K;)
De aici semnificafia de efi,cienlacataliticd a raportului k"u1lKyeste evidentd. 4. 7.2.6.Enzime multisubstrat gi/saumultipod.tts uneori, reacfiile catalizate de enzime, transformd doui sau mai multe substraturi in unul sau mai mulli produgi. Reac{iileoxidoreductazelor, ale transferazelor, hidrolazelor, ligazelor sunt exemple tipice. Drept substrat poate fi considerat gi cofactorul enzimatic, in ideea cd la sfdrgitul reacliei chimice catalizate,forma chimici a acestuiase modificd (NAD* -+ NADH,H*, FAD -+ FADHzetc.).

Enzime. Nofiuni, de cinetica enzimaticd

297

ln func1iede numirul de substraturi, respectiv produgi, se folosesc, dupd W.W. CLELA.ND prefixele Uni-, Bi-, Ter-, Quad- etc. Astfel o reacfie de tip: A > B (izomenzare de exemplu) este denumitS.Uni - Uni, in timp ce o reacfie de tip: A> B + C (scindare)este denumiti Uni - Bi, ori reacfia de dublu schimb: A + B >C + D se poate denumi reacfie Bi-Bi.

- ordonat Mecanismsecvential
t

) t

br

P1

,g

ES SES1s2=--

+f

P2

Eprp J2 -

ee r$g

Mecanisrnsecyential - aleatoriu
t',

>Z\ ,-,uK,,

Fs. as'

ES 152q:=

EPlP2

>,,,4,,

ping - pong Mecanism

Fig,4,110. Princlpalcl.e tipuri de mecankme ale reacliilor bisubstrat

Reacfiilemultisubstrat gi multiprodus, care presupun eliberareaprodugilor de reaclie numai dupd ce au fost legate toate substraturile, poartd numele de reacgiisewen{iale, spre deosebirede cele in care, dupd legareaunui substrat, are loc eliberareaunui produs, apoi are loc legarea altui tip de substrat gi eliberareacelui de-al doilea tip de produs, ;.a.m.d., denumite reacfii ping-pong. Reacfiilesecven{ialepot fi ordonate, dacd legareasubstraturilor respectiv eliberarea produgilor se face intr-o secvenfd determinatd, spre deosebire de reacliile sewenlial aleatorii, la care atagareasubstraturiIor, respectiv eliberareaprodugilor are loc intr-o ordine tntiimpldtoare. Schematicmecanismele de reacfie secvenfial (cu cele doud variante) gi ping pong sunt prezentatein Flg. 4.110.

298

Elemente de biochimie,l.

4. 7.2.7. Inhibifu

enzimattcd,

Substanfelecirre interacfiondnd cu enzima duc la scddereaactivitefii acesteiapoartd numele de inhibitori. Ei diferd prin origine (endogeni sau xenobiotice) precum gi prin mecanismul de interacfiune cu proteina enzimatici (in competifie cu substratul sau fdrd competifie cu acesta). 4.7.2.7.1. Inhibifu competitiud Inhibitorul concurd cu substratul la legareape enzimd. Dacd.reacfia cu substratul estedescrisdde modelul:

E+s +L K2
E+ |
k/\

ES

k3

- E*P

reaclia competitivd cu inhibitorul are o formd asemdn{toare:

f,

El X+

fdr6transformar

Similar cu modul de definire al constantei de disociere enzimd substrat Ks [4.11] se definegte gi constanta inhibitorului Ki (tot o constanta de disociere,de data aceastaa inhibitorului de pe enzimd):

=k, 14i=c,'cu
C., k4

14.341

Cu cit valoarealui Ki va fi mai mare cu atdt complexul enzimd - inhibitor va fl mai putin stabil. Pentru evaluareavitezei globale a reacfiei enzimatice, pebaza bilanlului enzimei gi a faptului cd ecualia de formare a produsului estelimitantd de vitezi se poate scrie cd: Ceo=CE+Cps+Cs1 t4.351 v=ksCcs i4.361 Sepoate construi expresia:

v
CE^

ke'Ce s
Q +CEs +CE1

14.371

Elimindnd Ces$i Csrprin intermediul relafiilor de definilie K5 9i K1se obtine:

-= \/tr

ks'cs
K^ Ku c * Cuc + Cr' +
K;

t4.3Bl

sau lindnd cont cd K5nv Ky qi cd k3 . Cro= Vmax

Enzime. Notiuni de cinetica enzimqticd

Vr"* cs

n"[t+Gr' 1 ) cs

i4.3el

KJ-

prin inversarese obfine:

1=r-fK" l.,.9.].,.l v V,"",1-C. ( K,i

I
t' r-t

t4.401

Notdnd Ky' mirimea K1,4'l f * *1, Kr/ \

a""umind-o constanti Ku

aparentd gi inlocuind-o in expresiile ta.16l qi [4.19]vom obfine formai, expresiile ecuafiilor MICHAELIS-MENTEN [4.19] respectiv LINE\MEAVER-BURKL4.2al:

,, ' _
-=
I

Vrr*'Cs KM'*CS

t4.4ll [4.42]

*[*.,]

(cu inhibitor)

AA

rl

Cs

_1 - 1 KM Kv
Fig. a.ll 1. Drepte Lineweaver-Burk in cazul tnhibisiei competitiue

300

Elementede biochimie .1,

deoarececonstanta aparenta are valoare rnai mare decOtconstanta claprin prezenfa inhibitorului competitiv, enzima igi micaoreazdapasicd,, rent afinitatea pentru substrat, valoarea. vitezei maxime nefiind afectat6. Prin reprezentareaLINEWEAVER BURK se poate identifica acest tip de inhibifie, relevind cineticile enzimaticein prezenfa Ei in absenfa inhibitorilor. Inhibitori competitivi. Substanfele care se comportd ca inhibitori competitivi posedd analogiestructurali cu substratul.Aceastdanalogie, permite inhibitorului sd stabileascd interacliuni similare atdt ca numdr, tip dar gi ca distribufie spafiald (topologie)1Fig.4.114.-. Problema care apare,estedeci una de specificitateenzimaticd. tln exemplu este oferit de p-galactazidazds din E Coli, o enziml carehidroilzeazl.lactozala glucozdgi galactozl. Enzima, un tetramer cu patru subunitili identice (masatotald 520 kD) se poate doza cu un substrat artificial (sintetic) analog 2-nitrofenil B-D galactopiranozida, (ONFG)asupra cdruia enzima acfioneazdproducdnd hidroliza la galactozd gi Z-nitrofenil (KM= 0,95 mM la 20oCgi pH = 7,6)tn. ln procesulde dozare,dacd se intro duce 2 tiopropil B D- galactozida acestaacfioneaza ca inhibitor competitiv tipic deoareceparticipd doar la faza de legare pe situsul catalitic. Galactozidazarruestecapabild sa scindezehidrolitic legdtura tioglicozidicd. Din acest exemplu se observd cd enzima posedd specificitate doar fafa de componenta glucidici, orice modificare la nivelul acesteiainacin micd mdtivdnd-o. Componentele atagatede galactozdinfluenfeazd, surd legareape situsul catalitic. In locul 2-nitrofenil-B-D-galactopiranozidei se mai poate utiliza gi X-Gal, numele de cod al 5-bromo-4-cloro* 3-indolil B-D-galactopiranozidei. Analogii stdrilor de tranzifie sunt de asemeneainhibitori competitivi, deoareceei se leagd mai intdi de situsul catalitic al enzimei, realizAnd complexul enzimd-analogcare ulterior trece in complexul stabilizat enzimd-stare de tranzilie (vezi paragraful legat de mecanismul acfiunii enzimatice Ei abzime).

58 Aceastdenzimi va exemplifica reglareala nivel transcriplional a exprimdrii genetice. 5eDozarea se bazeazd pe diferenla intre maximele de absorblie ale nitrofenolului liber in mediu acid (absorblie in W apropiat) gi ale 2-nitrofenolatului in mediu alcalin (420 nm, cdnd estegalben).SemS.soard deci intensitateaabsorb{ieidupi acliuneaenzimei gi alcalinizare.

Enzime , Nofiuni de cineticd enzimaticd

301

Lactoza

2-nitrofenil- ft D-galactpiranozida
OH t( 'OH

F
*bromo-4-cloro-3 -indoIiI- ft D-galactp iranozida Ks -*

S\--or rc\--1.-\-^4o,
OH

?'

21iopropi|- ft D-gaIactoz ida

ES
ESI-> inactiv

-+
E'
K1

inactiv
Fig.4.I 12. Inhibigia necompetltivd (schemade principiu)

4. 7.2.7.2. Inhibilia necompetitiud Sianticompetitiud, In cazul in care inhibitorul se leagd de enzimi intr-un situs diferit de cel catalitic, gi prin aceastase reduce itezareacFei enzimatice,vorbim de inhibiyie necompetitiud. Lipsa de competilie intre substrat gi inhibitor face posibili formarea unui complex enzimd - substrat - inhibitor, ordinea legdrii celor doui substanleputand fi oarecare,conform Fig. .ID. Pentru formalizare, plecdm de la ipoteza cd.afinitdfile enzimei fali de substrat gi fald de inhibitor sunt diferite. De asemeneaconsiderdm cd ne aflAm in condigiile stdrii stafionare.

de biochimie .1, Elemente

lJtilizdnd acelagimodel de calcul ca $i in cazul inhibiliei competitive avem: v=ksCns t4.43I C " o = C s + C s s + C+ sC 1sN 14.441 Raportul vlC1oeste:

k,.c,'
CE" CE + CEs + Cr, + Cr,,

14.451

Concentrafiile complexelor ES,EI qi EIS se deduc din expresiileconstantelorde disociereKs,Kr gi Kr' (sauKs'). Prin inlocuire in relatia [ 12] se obline:
V
+ =

n,9i3

-Eo

rr cr.c, c..c, - cE.cs.cr "u- K.-_--J(, K.Kl

[4.46]

prin imparlire cu Ce. / Ksse obline: kr' Ct

vEo
(-

K, II*ot i *cuIi*)nl ^r/ |\r/ \ \

V.*C.

c-\

a\

[4.47]

Tindnd seamade deflnitiavitezei maxime obtinem:

n.[' .*)...[,.&)
prin inversarese obline:

[4.48]

(1*g). 5"J*i, )-l r =-:-l

v V.",L( K,,/C, ( K@./l

[4.491

dacd K1= K'i, suiltem in cazul inhibiliei necompetitiue pure, iar ecuagiile[4.48]pi t4.491 pot fi scrisesub forma i4.501, respectiv[a.5f]:

t4.501
respectiv:
(.vl

| | '-K,

IK. ,l v,,* L c, 'J

14.511

Enzime. NoSiuni d.ecineticd enzimaticd

303

(fdrdinhibitor

+ I
1 KM
Fig. 4.1 13.Drepte Llneweauer-Burk in cazul inhibiflel necompetltlve

Dacd facem apel $i la aproximafia Ks * KM, ecuafiile t4.501gi t4.5ll vor avea formal acelagi aspect cu reprezentdrile MICFIAELISrespectiv LINEWEAVER- BURK tipice. Factorul suplimentar care apare in modelul inhibiliei necompetitive fald de modeiul fera inhibifie, este intotdeauna supraunitar gi pozitivm. De aceeaviteza maximi aparentd va fi mai micd decdt in cazul michaelian clasic (Fig.4. 1 13). In reprezentarea LINEWEAVER - BURK, a reacliei inhibate necompetitiv, se observi cd. iteza maximi scade (inversul acesteia cregte). Ecuafiile t . Bl gi [4.49] permit analiza comparativi a comportirii sistemului de reaclie in func$e de raportul Kr / K'r,Aga dupd cum rezultd din fig. Xr cuantifrcd inversul aflnitifii enzimei faf[ de inhibitor, iar K'1cuantifici inversul afinitd{ii complexului enzimd substrat fafi de inhibitor. Sunt posibile urmdtoarele situafii extreme: l. K'1 tinde cetre infinit. ln acest caz inhibitorul nu se atageazdde complexul ESformat. Suntem in cazul inhibifiei competitiue.

60Factorul este unitar atunci cdnd K1-+ B, adicd atunci c6.ndenzima are afinitate nuli fati de inhibitor

304

Elementede biochimie .1.

E+P

eTJJ:i""
Fig.4.114.Schema de principiu a inhibisiei competitlue

2. K1gi K'1au valoare egald. Suntem in cazul inhibiliei necompetitive 3. K1 tinde cdtre infinit. Acestd situafie este cunoscutA ca inhibifie anti-competitivd. Mecanismul de inhibifie presupune legareainifiald a substratului (enzima purd nu are nici o afinitate fafd de inhibitor (Krtinde cdtre infinit). Dupd ce s-a format complexul enzimd substrat inhibitorul se ata$eaze de enzimi, impiedicdnd actul cata-

litic. Acestcazestecunoscut ln ecuaca liipi#Jpe,snl.t:"VimtiefffiUa.

tia [4.49], ca reprezentare LINEWEAVER-BURK,termenul Cr / Kr -+ 0, iar factorul I +

C'
Kj

uu afectapanta dreptei ecuafiei [4.49]terme-

nul liber, avdnd aceeagivaloare ca gi tn modelul fare inhibifie (ecugraficd a modelului neinhibat gi a inhibifiatia 14.241. Reprezentarea ei anticompetitive relevi paralelismul dreptelor LINE\MEAVERBURK (Fig.4.115.). De cele mai multe ori in practicd se intdlnesc modele intermediare intre A, B pi C caracterizateprin valori finite ale constantelorK1qi K'1. Gradul de apropiere cu unul sau cu altul dintre modele se poate releva din reprezent5.rileLineweaver - Burk. Inhibilia prin produs gi prin substrat Aga dupd cum s-a enunfat, orice substanfdcapabili sd interacfioneze cu o enzimd, reducdndu-i viteza de reactie esteun inhibitor.

Enzime . Notiuni de cineticd enzimafiart

305

(cuinhibitor)
(fdr6inhibitor
-.->

V 'ma x

II
1 K'M

1 Cs

1 Ky

Fig.4.115,Schema de principiu a lnhibiltei anticompetltlue

4. 7.2.7.3. Inhibilia prin produs Cinetica michaeliani este studiat5.prin mdsurarea vitezei inifiale. Aceastdmodalitate exclude produsul de la o eventuald interacfiune cu enzima. Dar, produsul poate avea aceastdabilitate. IJn astfel de sistem poate fi studiat prin introducerea in mediul de reaclie a unei anume cantitifi de produs. Viteza globald a reacfiei enzimatice (de formare a produsului) esteegaldcu diferen{a reac{iei directe (de formare a produsului cu Vmax gi a reacfiei inverse (de consum a produsului cu s gi Kr,as)
Vmax p Si K1ai,):

Vrr*, 'C,
V_

Vrr-s 'Cp

o*('.*) +cs o*[,*ft) *c,

14.521

dacd reaclia inversdpoate fi neglijabild,vn* s -) 0, atunci rdm0ne doar primul termencareareforma clasicda inhibiliei competitive. 4.7.2.7.4. Inhibifu prin substrat De multe ori, la utilizareaconcentraliilorridicate de substratse constatdo scddere a vitezei de reaclie detectabil5vizibil pe o reprezentare - BURK(Fig.4.116) de tip LINEWEAVER

306

Elemente de biochimie,I,

Aceastd scidere poate avea mai multe explicafii. Doui dintre ele, cele mai plauzibile sunt urm[toarele:
1

domeniu de
-6h-onl-r:{i o

mare de substirat.

Fig. 4.116. Comportannentul enzimatic ffimeniile

de corrcentrasi.e ridlcatd de

1. odatd cu concentratia de substrat, cre$teconcentrafia impuritdlilor pe care acestale confine. 2. la concentralii mari, substratul este forfat sa se plasezestabil in pozi{ii neproductive, impiedicdnd accesulaltor molecule de substrat la situsul activ. 4. 7.2.7.5. Inhibifu reversibild./ ireversibild

Inhibilia, ca proces poate fi reversibild sau ireversibild.Inhibitia reversibild presupune atagarea inhibitorului prin interacfiuni necovalente, care pot fi desfdcute. Inhibitorul poate fi indepdrtat, de reguld prin procese difuzive, dializa fiind cel mai comun. Cu c6.tconcentrafia de inhibitor este mai scdzutd,indiferent de mecanismul prin care acesta acfioneazd,efectul asupravitezei de reaclie estemai mic (ecuafiile4.39; 4.509i 4.s2). Spre deosebirede inhibifia reversibili, cea ireversibild presupune o ata$arecovalentd,puternicd a inhibitorului. Acestanu mai poate fi desprins de pe enzimd sau complexul enzimd substrat,de aceeaefectul introdus are caracterpermanent.

. Nofiuni decinetica Enzime enzim.atica

4.7.3. Reglarea activitifii enzimatice Funcfionarea celulei, lesutului sau a organismului presupune un complex de activitf,tri metabolice prin care se produc ai se degradeazl. substanfe, in raporturi cantitative gi de succesiune foarte bine reglate. ln acest context, rolul biocatalitic exercitat de enzime este crucial gi exercitareaacestuiaeste supusdunui proces de reglarepe cdt de complex, pe atdt de eficient. Reglareaactivitefii enzimatice se face la doud nivele: I. reglarea concentraliei locale a eraimelnr, realizatd prin: t mecanisme care intervin in exprimarea genelor corespunzdtoare (la nivel transcriplional sau Ia nivel translafional), t mecanismede degradareale enzimelor I mecanisme de transport al enzimelor de la locul sintezei pini la locul exercitdrii acliunii. Mecanismele concrete ale acestui tip de reglarevor fi detaliate la capitolul reglareaexprimdrii geneticerespectivla sintezaproteinelor. 2. reglarea efectivd,a funcfiondrii (activitd,fii) enzimei. Enzima existenti va cataliza transformarea substratului in produs. Yiteza procesului este dependenti de o serie de factori, asupra cdrora organismul acfioneazd.Concentrafia speciilor reactantereprezintd modalitatea ,,banald" a regldrii activitdlii enzimatice. Reacfia se va deplasa in sensul dictat de abaterea concentrafiilor efective de la valorile de echilibru. O alte modalitate de reglare, caracteristicd enzimelor cu afinitate micd pentru substrat este legatd de concentrafia substratului. Atunci c6.ndconcentrafia substrahrlui se situeazd mult sub valoarea lui Kvr (vezi ecuafia Michaelis - Menten), viteza de reacgieeste liniar dependentd,de concentrafia de substrat. In cazurile in care concentrafia substratului depigegte valoarea lui Kr,a, efectul modificarii concentrafiei (reacfia fiind de ordinul zero. pH-ul se exercitddoar asupra echilibrului constituie un mijloc auxiliar de reglare, avhndu-se in vedere ci fiecare enzimi igi are propria plaji ori chiar valoare optimd a pH-ului. ln ceiuld existdinsfl mecanisme care asigurd homeostazia pH-ului, care limiteazd drastic intervengia pH-ului ca mijloc de reglare. Pentru arealiza func1ia reglatorie, celula dispune de alternative mai sofisticate care se aplicl unui numdr redus de enzime din mul;imea celor existente la un moment dat. Aceste enzime reglabile posedd particularitifi structurale, care le conferd o complexitate sporiti fafd de celelalte enzime. Mecanismele efective prin care are loc reglarea sau modularea activitdlii enzimatice sunt in principal de doud tipuri: L) mod.ificdri coualente

308

Elementede biochimie .I,

realizate prin ata;area unor fragmente sau clivarea unor legituri gi 2) modificdri necovalente, realizate prin intervenfia unor substan{e strdine (efectori)care se pot ata$afie la situsul catalitic (inhibitori competitivi), fie la un situs distinct numit situs alosteric.Prin acestemodificdri se modificd fie afinitatea enzimei pentru substratul propriu (Km), fie viteza maximd a procesului v**. 4.7.3.1.Reglarea activitdfii enzimelor prin modificd.ri covalente Modiflcirile covalente comutd de reguld enzima dintr-o stare inactivd intr-o stare activd. Aceste modificdri constau in formarea sau desfacereaunor legdturi covalente.Procesulpoate fi ireversibil sau reversibil. Modificdrile covalente ireversibile sunt caracteristice enzimelor care sunt produse in forrn6. inactivd. Aceste forme inactive reprezintd o rezewd imediat disponibild de enzimd qi uneori structuri rezistente la agresivitatea mediului in care sunt sintetizate.Odatd ajunse Ia locul acfiunii, sunt activate prin desfacereaunor legituri covalente.O altd categorie de enzime activabile prin clivaj proteolitic ireversibil, sunt cele care trebuie sd participe la acliuni rapide al ciror moment de producere este aleatoriu. Este cazul enzineelorcare participd la cascadade reacfii caracteristicdprocesului de coagulare sangvind.In cazul aparifiei hemoragiilor, intervenfia trebuie sf, fie rapidd, neexistdndtimpul necesar sintezei echipamentului enzimatic necesar.Acesta existdsub formd latent6, inactivi, care, printr-o modificare covalentd,hidroliticd.se va activa diminuAnd astfeltimpul de rdspuns. 4.7.3.1.1.Hid.roli.za paryiald, ireuersibild a enzimelor ca modalitate de reglare Multe dintre enzime sunt sintetizate gi secretate sub formd inactivi numitd proenzimd sau zimogen. Prin excizia (cu ajutorul unei enzime proteolitice) a unei porliuni din catena peptidicd a proenzimei rezultd enzima acdve. Exemple de enzime astfel reglabile (activabile) le intdlnim prinue enzimele digestive precum: chimotripsina, tripsina, pepsina, carboxipeptidazeleA 9i B, fosfolipazele,printre enzimele (factorii) implicate in coagularea s0ngelui (vezi vitamina K) ori printre enzimele implicate in dezvoltarea pro gramati (colagenaza,chitinsinte taza etc.). Prin excizia unui fragment N-terminal din zimogen, se modificd intreaga structure spaliaH (tntreagatopologie) a situsului catalitic, acesta din urmi devenind apt pentru procesul catalitic.

Enzime. No{iuni de cineticd ewimaticd,

309

Fr.n l/\ \? His40

o
M
n.Y-, n

ct-l

(o
tripsind --------->

Aspl94 o
l\F|

Aspl94

^-t
/

Ser1e5

t\}|

uo

lle16

"rr-rffi

|\V*%,,'n' ' Chimotripsind

Fig.4.117.Modificarea conformafionald consecutiudcliuajului proteolitic care dtrce la formarea sitn sului catalitic la chimotripsind

Exemplificdnd pe transformarea chimotripsinogen + chimotripsind realizatd sub influenfa tripsinei, in molecula de chimotripsinogen, se remarcd existenfatriadei catalitice (vezi serinproteazele) Asp I02, His 57 gi Ser 195.Aceastdtriadi esteincd nefuncfionalS. datoritd faptului cd topologia definitd.inifial este improprie interacfiunii cu substratul. Prin clivare proteoliticd cei trei componenfi ajung intr-o topologie apta de actul catalitic. Modificirea conforma(ionali care activeazdchimotripsinogenul este schimbarea restului His40 ca partener stabilizant al Asp194cu gruparea amoniu din Ilel6 a fragmentului clivat. (Ftg.4.11V. De asemeneaprin clivajul proteolitic, se modificd pozitia Gly 194, care inifial impiedicd atit fixarea substratului, cdt gi ac{iunea catalitice asupra acestuia.Un proces similar apiue gi la activareatripsinogenului. Formarea zimazei (enzimei active) prin excizia unui fragment din zimogen esteun proces ireversibil. Odatd activatd enzima, activitatea sa nu va scddeadecdt prin digestie,inhibilie sau prin dilulie. Astfel de mecanisme de activare se intdlnesc Ai in cazul hormonilor peptidici precum insulina ori angiotensina, care sunt secretafi inifial sub formd inactivd de prohormoni. Ei vor fl activafi prin excizieproteolitici.

310

Elemente de biochimie .L.

4,7.3,1.2, Reglareaactiuitdfii eraimelor prin modifrcd.ricovalentereuersibile I. Reglarea enzimelorprin fosforilaredefosforilare

ATP \,/ ,/\
Enz_OF Enz_OPO3z'

ADP proteinkinaza

\ , / \.

foslalaza

,/

,/\ /\ {\ Pi

HrO

Fig. 4. l 18. Fosforilarea-defosforilarea enaimaticd

Prin introducerea unui rest fosfat in molecula unei proteine, apar doud sarcini negative care prin interacfiune cu resturile de aminoacizi vor produce o modificare conformafionald care se transmite situsului catalitic. Spre deosebirede clivareaproteoliticd, reglareaprin fosforilare este reversibild. Fosforilarea (transferul de rest fosfat pe o grupare oH aparfindnd unui rest serinic, treoninic sau tirozinic) este realizatd de cdtre o proteinkinazd, donorul fiind de regul[ ATP-ul. (Fig.4.t1\.). Reacfia inversd,catalizatd de o fosfatazd hidrolizeazd.legdtura fosfoestericd pundnd in libertate fosfatul anorganic. Comutarea enzimei de la forma fosforilat[ la cea defosforilatagi invers,se face sub influenfa unor semnaleextracelulareprecum hormonii sau factorii de cregtere.Adrenalina, de exemplu activeazdprin intermediul cAMP (acidul adenilic ciclic, vezi nucleotide) o proteinkinazd. care fosforileazi o fosforilazkinazd,(o noud proteinkinazi), aceastala ldndul sau fosforildnd fosforrlaza,enzima care elibereazdglucoza din glicogen, Prin fosforilare sunt reglate o serie de enzime intdlnite in metabolismul glucidic: glicogenfosforilaza, fosforilazkirrArtr glicogensintaza, fosfofructokinaza-Z, piruvatkinaza gi piruvat dehidrogenaza (vezi glicoliza respectiv gluconeogeneza) (vezi Vol II), in metabolismul lipidic: hidroximetilglutaril-coA reductaza, acetil-CoA carboxilazaqi triacilglicerol lipaza, in metabolismul aminoacizilor: cetoacid ramificat dehidrogenaza,fenilalanil hidroxilaza,tirozin hidroxilaza etc.

Enzime. NoSiuni de cineticd enaimaticd

311

II. Reglarea activitilii enzimatice prin adenililarea - deadenililare Prin atagarea fosfoesterici a restului adenilil (voluminos, incdrcat negativ) de un rest de tirozind aflat in vecindtatea situsului catalitic, se blocheazi funcfia cataliticA ce poate fi exercitati de glutaminsintetaza, o enzime cheie din metabolismul amoniacului din Escherichiacoli.Rolul acestei enzime este de a atagape un rest de glutamat amoniacul existent in mediu. Procesul de adenilare este reaiizat de o adenililtransferazd,la depdgireaunui prag critic al raportului concentrafiilor glutamind - glutamat, respectivcarbamilfosfat,glucozamino-6fosfat, triptofan, aianind, glicocol, histidind, citidintrifosfat, respectiv AMP (vezi Cap. 5 nucleotidele). Tofi ace$ticompugi reprezintd pentru enzimfl indicatori cd rezervelede amoniac sunt suficiente, ca urmare nu mai este necesard acumularea acestui produs. La r6.ndul si.u, adenililtransferazaeste activati prin deuridinilare, adicd prin detagarea unui rest de acid uridilic, proces declangatde concentrafii crescute ale glutaminei. Procesul invers, de dezactivareeste declangat de concentralii scdzuteale aceluiagimetabolit. III. Formarea gi desfacereapunfilor disulfurice Este o alta modalitate prin care se poate modifica structura enzimei, gi in consecin{dse poate interveni asupramecanismului sdu de acfiune. Aceastdmodalitate este utilizatd de plante frind intdlnitd la unele enziglucidele.Reducerea puntilor disulfurice se face pe me care degradeazd grupiri seama oxiddrii unor tiolice din structura unei proteine de masi. mic5, tioredoxina.La rdndul sdu tioredoxinaesteredusd de reacfii redox dependentede lumind, reacfii care comuti metabolismul glucidic de la oxidare (catabolism)la reducere (anabolism). 4.7.3.2.Reglarea actiuitdlii enzimelor prin modificdri necoualente; Alosteria O modalitate mai subtili de reglare a activitefii enzimatice este alosterismul.Termenul de alosterie(ailos= altul, diferit; steros= spafiu, loc) desemrreazd., modificdri care apar in conformafia gi legat de aceasta, ln activitatea unei enzime, datoritd legarii unui compus intr-un loc distinct de situsul catalitic. Enzimele care posedi aceasti proprietate dispun de o modalitate suplimentari de reglare a reacfiei catalizate. Compusul care se leagi de situsul alosteric poarti numele de efector sau modulator gi in funclie de acfiunea concreti asupra vitezei de reacfie sau afinit[1ii enzimei fald de substrat, modulatorul poate fi activator sau inhibitor.

3tz

Elementede biochimie .1,

studiile efectuate asupra unui numdr mare de enzime alosterice a relevat c[ acestea posedd o serie de caracteristicidefinitorii: t structurAcuaternare. i au comport:ue nemichaeliand, curbele cinetice v/[S], avdnd o alurd sigmoidald.Dac5.lao enzimd michaelianf,,cei doi parametri Ky gi vmaj{ sunt constanfi, ia enzimele alosterice,acegtiparametri pot fi variabili. Dupa parametrul care suferd modificdri, distingem enzime de tip K la care se modificd numai afinitatea fald de substratul activ, gi enzime de tip V, la care se modificd doar itezade reacfie. r modificirile conformafionale induse de efectorul alosteric sunt temporare gi doar de ordin cantitativ. t au funcfie de reglare in metabolism, fiind prezente pe cdile biosintetice principale. Interacfiunea dintre situsul catalitic ai situsul alosteric 9i de asemenea intre situsurile catalitice ale aceleiagienzime, este denumiti prin analogiecu comportamentul hemoglobinei, dar prin extensie,(deoarece in cazul enzimelor efectorul este diferit de substrat),efect de cooperativitate, sau de cooperare.
,'{ !.:,,A
OH

ooc

^_-I,-\
I

fH,
H"N

\o""rt\

1 1(" '\:,/
cadcam iF f)sht aspadat

oA",,A.o,
cabam ilaspartat

Fig. 4.1 19.Reacfia. catali.mtd dc aspartnt tra.nscarbamilazd

Un exemplu clasic, bine studiat de enzimi alostericd este aspartat Fig. .119.Aceastase coli (8.C,2.1.3.2) transcabamilaza din Escherichia gdsegtein ciclul ureogenetic (vezi in volumul II) gi catalizeazi. prima reacfie dintr-un lan! care conduce la biosinteza nucleotidelor pirimidinice: Daci se variazd.concentralia de aspartat in mediu, menfindnd constanli ceilalli parametri, curba cineticd va avea un aspect sigmoidal. Curba din Frg.4.120.,rede comportarea enzimei in absenfaefectorilor. Studiile s-au fdcut in prezenfa unor substanfe diferite. CTP-ul este un inhibitor tipic. ln schimb AMP sau ATP sunt activatori. Tratdndu-se enzima cu 4-cloromercuribertzoat,un reactiv al grupdrilor tiolice, se constati cd enzima devine michaeliand, pierzdndu-qi sensibilitateala

Enzime. Notiuni de cinetica enzimaticd

313

activatorii susmenlionafi, dovada cd situsul aiosteric posedd in acest caz un rest de cisteini., in timp ce situsul catalitic nu. Enzima cu situsul alostericblocat se numegte enzimi desensibilizatd.
Vrax
enzirE desensibilizata

- 'inhibitor (CTP)

enarncu

enzirrq f&A efector

enzirnacuacti\,"tor

efector ilor alo" sterici

oroo*,, o)X"

n si absenta "" sa

Se constati deci cd activitatea enzimei native este modulatd de efectori,in func{ie de necesarulcelular.Activitatea enzimei desensibilizate,in acestcaz cre$te,dar, reglareaeste realizatl.doar prin mecanismele termodinamice gi cinetice ,,normale" (concentragia locali de substrat gi de produs de reacfie direct, temperaturi, pH etc).
Subunltrie ---.- otrlitica

-{nitata dc Eglaro

- - unihle c.trllticl

Conforma[ie R (activA) - inhibitor nelegat

Conformalie T (inactiv6) - inhibitor legat-

Fig. 4,121. Celedoud conforrnasii ale aspartai transcarbamila.z.ei

Studii complexe, biochimice qi de difraclie de raze X, au stabilit ci aceasteenzimd esteformatd din 12 unitdfi proteice. $asedintre acestea sunt catalitice gi sunt organizatein doui subunitlfi plasate fa{i in fa{i, flecare dintre acesteaconfindnd trei unitd;i, fi.ecare capabile sd lege cele (aspartatul doud substraturi Ei carbamilfosfatul). Celelalte gase unitdli sunt organizate in trei subunitili reglatorii, plasate ca pun{i intre subunitdfile catalitice. (Fig. aJ2l. Subunitdfile reglatorii au posibilitatea

3L4

Elemente de biochimie .I.

sd lege efectorii.Aceasti enzime prezintd doar douf, stdri termodinamic stabile: o stare tensionatd (T de la ,,tense")-inactivdcatalitic gi o stare relaxatd (R- de la ,,relaxed") capabild. de actul catalitic. Legarea substraturilor pe situsurile catalitice, aduce molecula in conformafia R, din care moleculele de inhibitor (CTp) disociazd.Din contrd, legarea inhibitorului aduce molecula in conformafia T, cdnd moleculele de substrat disociazi de pe subunitd{ile catalitice. competilia inhibitor substrat estereglatd de concentraliile celor doud tipuri de specii. Aparenla enzimei, aga cum rezultd din analizele de raze X permite eviden{iereaunui model mecanic simiiar. 4.7.3.2.1Efectecooperatiue Ia enzimele alosterice Enzimele alostericepot posedaunul sau mai multe situsuri de legare ale substraturilor ;i unul sau mai multe situsuri de legareale efectorilor. ln cazul in care la atagarea unei molecule de ligand pe un situs multiplu modifici afinitatea celorlalte situsuri pentru ligand se vorbegtede un efect cooperativ. Acest efect cooperativ se numegte homotrop dac6, se referd la acelagitip de situs. Dacd efectul de cooperativitateimplicd situsuri diferite (catalitic ai alosteric),implicit liganzi diferifi, se vorbe$te de un efectheterotrop. Cooperativitateareprezintd o modalitate suplimentari de modulare a afinitafii atagarii unui ligand in func1ie de gradul de ocupare al situsurilor la care acestapoate fi atagat.Hemoglobina este unul dintre primele exemple investigate, dar pe lAngd aceasta,o serie de proteine manifestd cooperativitatein ata$areadiferililor liganzi. Astfel de proteine indeplinesc funcfii de enzime, receptori sau proteine de reglare(represorul transcrierii operonului lac). Termenul de alosterie utilizat in specialla enzime, poate fi folosit gi pentru a desemnao proteind aptd sd atageze liganzi in mai multe situsuri. Modele cooperative Pentru a se putea explora comportamentul cooperativ al proteinelor s-au elaborat modele func{ionale bazate pe premise simplificatorii. Dintre modelele elaborate se disting doui: modelul concertat al lui MONOD, \A/YldAN, gi CFIANGELIX gi modelul secvenfial al lui KOSHI-AND, NEMETHY gi FILME Modelul MONOD, WYMAN, 9i CIIANGEUX (MWC) In 1965 Iacques MONOD, Ieffries \AIY-N{AN gi Jean - Pierre CHANGEUXau elaborat un model simplu al comportamentului alosteric, bazdndu-sepe cdtevaipoteze simplificatoare:

Enzime . Notiuni d,ecineticd enzimatica

3L5

o Proteinelealostericesunt oligomeri. r Proteina alosterici poate exista in doud conformalii alternative: una tensionatd (T), cu afinitate reduse sau nulf, fali de substrat gi una relaxati (R) cu afinitate ridicatd pentru substrat. Cele doui structuri prezintf, diferenfe la nivelul tuturor subunitifilor monomere. De aceea trecereade la structurd la alta, presupune basculareaconformafionaie a tuturor substructurilor, nefi.ind permise stdrile cu conformafii diferite (R) gi G) ale monomerilor.or Intre cele doud structuri se stabilegteun echilibru. Aceste structuri difera prin numdrul de legdturi care se stabilesc intre subunitd.fi.Bariera energetici dintre cele doud structuri este redusd pentru a putea fi compensati de energia eliberatd ca urmare a atagdrii liganzilor. Afinitatea interacliunii proteind substrat poate fi cuantificatd prin intermediul constantelor globale de disociere ale ligandului de pe forma R respectiv forma T, adicd Kq gi K1: R+ nLcuKp= [R].[L]" / [RL"] RL / tTt l T+nLcuKr= [T].[L]n TL'I Toate situsurile de legare sunt echivalente gi in consecinfd vor avea aceeagiafinitate pentru ligand. In conformitate cu acestmodel, proteina poate atagaligandul in ambele forme R sau T. Evident probabilitatea atagdrii de forma R este mai mare. Odatd cu ata$arealiganzilor forma R se consumd, prin urmare echilibrul T R, (caracterizat prin constanta alostericd iniliald, relevatd in absenla ligandului [o = [To] / tF"gl) se deplaseazd.cdtre forma R, se cu afinitate mai mare pentru ligand. Prin urmare contanta alostericd. va reduce.Valoarea constantei alostericeL = [Ti] / lRil, la atagareacelui de-al i-lea ligand din n posibili este datd de: L =ci ' Lo,unde c este raportul constantelor de disociere: Kn / Kr = c. Evident valoarea sa va fi subunitard. Exemplificdnd pe hemoglobinS., vom aveaurmdtoareledate: numdrul situsurilor de legare: n = 4 Lo= 9000gi c = 0,014 ln aceste condifii, constanta alostericd, raportul L, va avea valorile 9000,in condifii inifiale gi 126; 1,76;0,025gi 0,00035odatd cu legareaa
6r Datoritd trecerii simultane a subunitdlilor din conformalia T in R modelul MWC mai este cunoscut gi sub numele de modelul concertat sau modelul de tip ,,totul sau nimic". Dac{ de exemplu o proteind. este trimericd., fiecare subunitate poate exista in conformaliile R sau T. Conform modelului MWC, intreaga proteind va putea exista ln conformalia T (TTT) sau R (RRR),nefiind permise structuri hibride de tipul TRT, TTR etc.

3L6

Elementede biochimie .1.

l; 2;3 si respectiv patru molecule de oxigen per molecula de hemoglobina. Se observ5 cd odati cu scedereavalorilor constantei alosterice cre$te con{inutul in forma R care are afintate mai mare pentru hemoglobind, aceastacrescdndodati cu atagarea moleculelor de oxigen. 4.7.3.2.2.Influenla efectorilor alasteri.ciasupra enzimelar Aga dupd cum s-a ardtat enzimele alostericesunt influenfate de ac!iunea indirecti a efectorilor alosterici asupra situsului activ. Acesta este un exemplu tipic de interacfiune heterotropi sau heteroalostericd. Modelul MWC explicd acest tip de acpune prin stabilizareauneia dintre cele doud forme: R in cazul efectorilor alosterici pozitivi gi T in cazul efectorilor alosterici negativi. ln acest mod se modificd echilibrul T >... R, implicit constanta alosterici L. ln cazuri extreme un efector (activator in acest exemplu) poate deplasa echilibrul astfel incdt forma R sd fie majoritard iar forma T sd fie neglijabild. Daci existd un singur situs catalitic, cooperativitatea este abolitd, enzima dobdndind o comportare michaeliand,afinitatea fafi de substrat inregistrdnd cregteri importante. (Fig.4.122.). Este cazul piruvatkinazei, o enzimi intilnitd in catabolismul glucidic (vezi volumul II), care transformd fosfoenolpiruvatul in piruvat. Aceast[ enzimd este aiostericd,dar care dobdndegteo comportare michaeliani in prezenta esterului fructozo-2,6-difosfat care acfioneazd. ca activator. De asemeneaizocitrat dehidrogenAza,o enzimi intalnitd in ciclul acizilor tricarboxilici (vezivolumul II) esteactivatdpdnd la abolirea cooperativitafii de cdtreAMP (acidul adenilic, vezi nucleotidele).
6-dif cu esterfructozo-2. osloric

0,2 fosfoenolpiruvat ImM] piruvaEkinaza

0,4

0,6 izocitrat [mM

izocitrat dehi drogen aza

Fig. 4.122, Efectul efecnrilor alosterici esupra unor enzime

Enzime , Nopiuni de cineticd enzi,maticd

317

4.7.3.2.3.Comportamentul de tip K Siu. Modelul MWC explicd cele doud cazuri de comportament ale enzimelor alosterice sub influenla efectorilor. Modificarea afinitdlii enzimei fafi de substrat, sub influenfa efectorului, intervine in cazul enzimelor de tip K. Efectorul ac$oneazi printr-un efect heterotrop. El influenfeazd afinitatea ataqdrii ligandului stabilizdnd una dintre stirile T sau R. Ambele stdri vor avea aceeagivaloare pentru k""r deci vor conduce la aceeagivaloareavitezei maxime de reactie. ln cazul enzimelor de tip v, substratul are aceeagi afinitate pentru ambele stdri. Cele doud stdri insd diferd prin valoareaparametrului v.*. In schimb efectorul se leagi preferenfial de o anumitd stare pe care o stabilizeazd,modificdnd valoarea constantei alosterice.In acestecondi;ii efectorul nu poate modifica afinitatea pentu substrat ci va influenfa doar viteza de reacfie prin preferinla pe care enzima o poate aveafaf6 de una din cele doud forme. M odelul secuen[ialal lui KOSHIAND, NEMETI{Y ;i FIRMER $i acest model presupune existenia celor doud forme pentru cooperativ ligandul R Ei T. Spre deosebirede subunitifile ciue atageazd modelul MWC, care admitea pentru proteina multimericd exclusiv doui stiri, modelul KNF admite cd pe mdsura legdrii are loc trecereasuccesivi a subunitdfilor de la conformafia T la R, cea cu afinitate mai mare pentru ligand. Caracterul succesiv al trecerii subuniti;ilor agregatului multimeric din forma T in R a dat numele alternativ al modelului - modelul secvenfial.ln acest model deci, se admite existenfa formelor hibride. Ipotezelemodelului sunt: in stareaT, unicd. inifial proteina se gdsegte Pe mdsurd ce are loc atagarealiganzilor, subunitatea care a legat ligandul, va induce o modificare conforma;ionali in subunitatea sau subunitdlile adiacente,care vor trece in stareaR de afinitate mai mare. Aceastdteorie explicd la rdndul ei cregtereaafinitdfii proteinei in urma atagdrii ligandului (cooperativitatepozitivd). Acest model este mai plauzibil, decdt modelul concertat deoarece presupune modificdri conformalionale treptate, reduse ca intensitate la nivelul agregatului globale multimeric, spre deosebirede tranzilia comutativi intre stS,rile R gi T. Modelul KNF conline ideea ajustdrii induse, enun(atd prima datd de cdtre KOSHI"qND, o teorie care vine in contradiclie cu cea a aiustdrii complementare rigide, intre proteini gi ligand ln general, intre enzimd gi substratul sdu in particular.

318

Elemente de biochimie .1.

4.7.3.2,4.Cuantift carea cooperativitdlii Efectul de cooperativitate a fost intens studiat pe hemoglobini (vezi cap. 3). De o manieri similari, efectul poate fi cuantificat printr-o ecuafie derivatd de la formalizarea gradului de saturare al enzimei (proteinei) cu ligand (substrat sau efectori). Folosind ca ipotezi modelul simetric sau concertat al lui MONOD, \ mvIAN gi CFIANGEUX (vezi hemoglobina), se presupune o enzimd cu n situsuri de Iegare pentru substrat: E + nS ES., cu constantade echilibru:

6 = [E]' [S]' [ES^ ] Definindgradulde saturare Y: Y = t=S+,' respectiv grad,ul d,e nesaturare 1- Y = l Eo l

t4.531

IE], IEJ

14.541

prin eliminarea lui [E], intre gradul de nesaturaregi constanta de disocierese obfine expresia:

1_ Y _
Y 1_Y

K.[ES"] lsl".[Eo]

t4.551

sau prin inlocuirea expresieigradului de saturarerezulti

:-

lsl"
K,

t4.s6l

expresiecare poate fi liniarizatd prin logaritmare:

-lnK InltY.rl=n.ln[S] _YJ L1

14.571

Ecuafiile de mai sus sunt vaiabile pentru toate tipurile de comportamente alosterice(receptori,proteine de reglare,enzime). Pentru a particulariza strict la enzime ecuafia saturdrii proteinei, gradul de saturareY se poate inlocui cu viteza de reaclie.Evident gradul maxim de saturare (unitar), igi va avea corespondentul in viteza de reactie maximd:

. v _ [s]" , saualtfelscris: v = 5* [sJ" V.",-V K K+[S]"

t4.5Bl

(v = f(lSl)), varialialui vin func{iede valn coordonate michaeliene riafiaconcentrafiei substratului l'a aveao alurdsigmoiddn.

nucleici 5. Acizi CAPITOLUL

5.1.Introducere
Sunt compugi intracelulari cu o incdrcdturd informafionald extraordinard. De reguld, se gisesc in asocialii cu substan{eproteice, formdnd nucleoproteidele.Componentele neproteice, acizii nucleici, sunt compugi macromoleculari care provin din policondensarea nucleotidelor. Existd dou[ tipuri majore de acizi nucleici: acizii deoxiribonucleici (ADN) 9i acizii ribonucleici (ARN). Dintre acegtia,ADN detine informalia necesarabiosintezei tuturor biomacromoleculelor fabricate de un anume organism. Fiecareceluld a unui organism confine tntreaga informafie necesard indeplinirii tuturor funcfiilor organismului. Aceastd informalie se gd'segteinscrisd in ADN-ul nuclear numit genom,intocmai cum memoria unui calculator confine intreaga informa{ie destinatdbunei sale funcfiondri. Prin diviziune, oul fecundat, care reprezintd o singurd celuld, igi va multiplica informalia genetici. Aceasta se va regf,si, pe mdsura cregterii gi dezvoltdrii, in multitudinea de celule nou apdrute. Prin diferenficare apare pe treptele superioareale dezvoltdrii speciilor, erea celularS., Ele vor folosi doar pdrfi din intreaga informacelulele se specializeazS,. lie stocate.Intre indivizii aceleiagispecii informalia geneticd diferd pupe planul insugirilor fizice dar gi fin, aceste diferenfe manifestO.ndu-se comportamentale. Informafia genetici se gdseqte sub forma unui mesaj genetic,inscrisi prin intermediul unui alfabet format din patru litere, constituit din nucleotidele care formeazdADN-ul nuclear. Succesiunea acestoradetermind individuaiitatea fiecdrui organism. Genomul uman este format din aproximativ 3 miliarde de perechi de nucleotide ceea ce daci ar fi inscrise pe pagini a 3000 de caractere ar incipea pe 1000 de volume a 1000de pagini. Genomul este organizat pe mai multe subuniti{i, genele,care funcfioneaz6. coordonat. Transmiterea informafiei, de la ADN gi pdnd la catena polipeptidica care se sintetizeazi, se realizeazd prin intermediul acizilor ribonucleici (ARN), care sunt de mai multe tipuri, fiecare cu un rol bine determinat.

320

Elemente de biochimie .1,

5.2.Constituen{ii acizilor nucleici

Acizii nucleici sunt produgi de policondensare ai nucleotidelor. Nucleotidele,la rdndul lor, sunt substanle care con{in trei tipuri de molecule legatecovalent: obazd,az;otatd,, o pentozd gi acid fosforic. Bazeleazotatedin constitufia acizilor nucleici sunt in numdr de cinci (cele mai frecvent intdlnite) gi dupd structura heterociclici proprie pot fi sistematizate in baze purinice qi baze pirimidinice.

'lr^)i-*o
zl. ll /8

sl l

Hrrl
Adenina (6-aminopurina)

T4Uil

Guanina (2-amino-6-oxipurina)

Fig.S. 1. Bazc purinice (R): adenina (A) Slguanina (G)

Bazelepurinice (R), (F9t5.1.) sunt derivafi ai purinei: adenina (A) (6aminopurina) $i guanina (G) (2- amino-6-oxipurina)

'i*\' til
o4*
1

o It

o tl
,r*,\./cH' 'i'
|il

NHz

t-

)u

rl

N^l

ttl

o4Nu/
Timina (5-metil-2,4-dioxipirimidina)

o4Nu/
Cltozina (4-amino-2-oxipirimidina

Uracil (2,4-dioxipirimidina)

Fig.5.2. Baze pirimid,inice (Y: uracil (I), timina (T) ,i citoztrn(C)

Bazele pirimidinice 00, @ig.5.2.) sunt derivati ai pirimidinei: uracilul (U)-2,4-dioxipirimidina, timina [T)-5-metii-2,4-dioxipirimidina gi citozina (C)-4 - amino-2 -oxipirimidina Timina se gdsegte doar in structura ADN, iar uracilul numai in structura ARN. Celelalte baze azotate se gdsescin ambele tipuri de actzi nucleici.

Acizinucleici. Constituenfii acizilornucleici

5

32r
HO-CH,

HO- CHI

OH

l-2"\,, 4'
\r,*-.-t2 ./
OH OH g-D-rlboza

.,L2"\., \

OH

tl

g,t-CH, 2'| OH p-D.2'4eoxlrlboza

,/'

Fig, 5.3. Pentozele acizilor nucleici

Pentozele sunt de doud tipuri: D-riboza gi D-2'-deoxiriboza (F1g.5.3.). BazeLeazotate se leaga N-glicozidic de aceste pentoze formAnd nucleoztdele.Bazele pirimidinice se leage prin intermediul atomului de azot 1, iar cele purinice prin atomul Ne.Pentru evitareaconfuziilor legate de numerotarea atomilor de carbon, in cazul pentozei acegtiase .,o-3r, - -L2"\-r(1saue) ^ \ui .

N-+
d, k

( ,=H- deoxinucteozide \ HO-nucleozide \ / a unei rurcIeozide

Fig. 5.4. Structura de principiu

noteitzdcu numere prime (')(Fi9.5.4.). Numele nucleozidelor se formeazi din rdddcina numelui bazei azotate la care se adaugi sufixul idina pentm cele pirimidinice respectiv ozina pentm cele purinice. Deoxiribonucleozideleprimesc sufixul deoxi (Tab.5.1.)
Tab.5,1. Formarea numelui nucleozidelor Bazaazotati

Uracil Timina Citozina

Adenina Guanina

Deoxltimidina Deoxicilidina

Deoxiadenozna Deoxiguanozina

oI o--9-o-cH2
o4'
3'

)Tf*,n,
1'

dt

( *= r- deoxinucteotide \ HOnucleotide \ )

Fig.5. 5. Structura de princlpiu a unei nucl.eotide

322

Elemente dc biochimie,l,

N ) N

Q+p-g

OH

oAden ozin mo n ofosfatul cicIi c (cAMP) I:ig.s.6. Acidul fosforic, se leagd fosfoesteric de hidroxilul 5' rezultdnd in acestmod nucleotidels,monomerii sau elementele debazd,(cardmizile) ale acizilor nucleici. (Fig. 5.5.). Prezenfa acidului fosforic, conferi caracterul acid atdt nucleotidelor cit gi catenelor polinucleotidice. Policondensarea nucleotidelor se face prin intermediul acidului fosforic, care stabilefte o noui legdturi fosfoestericdcu hidroxilul de la C3' al altei nucleotide. Denumirea acestornucleotide se poate facein mai multe moduri. O primd posibilitate este aceeade a utiliza numele de acid + (prefixul deoxil + rad[cina numelui bazei + sufixul illc, pentru bazele purinice, respectiv idilic pentru cele pirimidinice. Astfel se poate exemplifi ca: acidul (deoxDguanilic, acidul deoxitimidilic, acidul uridilic etc. O altd.posibilitate este de a denumi nucleotidele ca esteri ai acidului fosforic (mono) cu nucleozidele: adenozin-5'-monofosfat, deoxitimidin-5' monofosfat etc. sau de a utiliza prescurtdri aie acestoresteri (AMP = adenozin-S' monofosfat, dAMP = deoxiadenozin-5'-monofosfat,CMP-citidin monofosfat etc). Existd gi nucleotide ,,speciale"care se abat de la structura de bazd mai sus enunlate. Acesteasunt fie intermediari in sinteza polinucleotidelor, fie indeplinesc alte funcfiuni. Astfel amintim zAMP sau adenozin monofosfarulciclic, care confine doud legdturi de tip fosfoestericla poziliile 3' gi 5' (Fr9.5.6). Aceastdsubstanfdfunclioneazi ca un medjator al acfiunii hormonale fiind interpus intre hormon gi enzima specificd asupra cdruia acesta acfioneaze.ln prezenfa hormonului se activeazd

Acizi nucleici. Constit uentii acizilor nucleic i

323

AMP ciclaza, enzima care mediazS.formarea cAMP din ATP (vezi mai departe).
NHz
t-

I
N^lll5' -O-P\ O-P\n O-?-O-9Ht

N ) N

? ? ? ^,\*
ooo4',
Adenozin trifosfatul OH

lll

iii'>

1'

OH

(ArP)
Fig.5.7.

Difosfo- 9i trifosfonucleozidele sunt principalele substanfe folosite de materia vie ca tampon energetic. Legfltura fosforanhidridica are o energieliberd ridicati (AG' = 7 kcal/mol). Reprezentantultipic al acestei categorii de substante este adenozintrifosfatul (ATP),care posedd doud astfelde legaturi numite macroergice.ln formulele structurale,legiturile macroergicese reprezintd prin tildd (,,- ,) - Fig.5.7. Pe lAngd ATP existd gi ADP, precum 9i tofi ceilalfi nucleozid di- gi trifosfafi. Dintre insugirile nucleotidelor amintim: I caracterul acid (la pH = 7 toate grupdrile acide ale acidului fosforic sunt ionizate) r absorblia radiafiei UV de 260 nm r hidroliza nucleotidelor la nucleozide se poate realizaintracelular prin acfiunea 5' -nucleotidazelor I pe ldngi rolul lor primordial de a intra in constitu{ia acizilor nucleici, nucleotidele pot fi intdlnite ca tampoane energetice(XTPgi XDP X- bazd azotati), ca mesageri ai acliunii hormonale, precum Ei in calitate de coenzime sau precursori fie in reac{ii anabolice, fie in reac{ii catabolice.

324

Elementede biochimie .1,

5.3.Structuraacizilor nucleici
5.3.l. Acizii deoxiribonucleici (ADN) Reprezintdbaza moleculard, a conservariigi transmiterii informa;iei ereditare, a diferenfierii gi regldrii celulare, a menfinerii gi perpe\-/ tuerii caracterelor,qi totodatd a modificdrilor I @ O:P-O naturale (spontane)sau induse. I In imensa majoritate a cazurilor (excepfie fac cdtevavirusuri), ADN-ul are o structurd biBi ?t+ ^ [-/"\J (dublu helix). catenar elicoidalS. Structura primard aADN-ului este datd de o' I secvenfa de nucleotide, care sunt unite prin ,P-O De fapt structura legdturi 3'-5' fosfodiesterice. I primari a ADN-ului este similard cu structura primard a ARN-uIui deosebireafiind la tipul de pentozd gi Ia existenfaexclusivi a: uracilului in moleculele de ARN gi a timinei in molecula deADN. Datoriti ionizf,rii restului de acid fosforic, ADN-ul se comportd ca un macroanion. ln ADN nucleotidele nu participa in cantitd{i echimolare. Totugi intre bazele azotate componente s-au stabilit anumite raporturi. Fig,5. 8, Structura primard a Tab. 5.2. redd cdteva dintre acestea, stabilite ADN pe diferite specii. S-a constatat, gi datele prezentate o confirmi, cd: lAl / tTl = [G] / [C] r t ; (tAl+tcl) / (tTl+tcl) c l. Raportul ([A]+[T])i (tcl+tcl) poarti numele de indice de specific[tate.Acesteraporturi sunt cunoscute sub numele de relaliile sau regulile lui CFIARGAFF, autorul (1950). determindrilor cantitative

'"rj2'i

5.3.1.1. Structura secundard a ADN-ului Modelul ideal al structurii secundarea ADN, a fost creeat de James WATSONgi Francis CRICKin 1953,pebaza rapoatelor lui CFIARGAFF Ei a datelor oblinute prin studiul structurii ADN prin difracfie de raze X

Acizi nucleici, Structura a.cizilornucleici

325
spect,

Tab.5.2.Rapoartcintre concentraliile baze,lor azntatetn ADNprouenitdin difertte

WtGI
Bou Om Gaind Somon GrAu DOdie Haemophillu s infl uenzae E.Coli K-12 Bacilul tuberculozei aviare Senatia marcescens Bac/lus scnat 1,29 1,56 1,45 1,43
|,12

FiltCI
1,43
,l 7t

tAYIJ
1,04 1,00 1,06 1,02 1,00 1,03 1,47 1,09 1,09 0,95 1.12

IGYICI 1,00 1,00 0,91 1,02 0,97 1,20

nol 0,99 1,08 0,86 0.89

IRYP
1,1 1,0 0,s9 1,02 0,99 1,0 1,0 1,0 1,1 0,9 1.0

I,n 1,43
1,18 1,92 1,54 0,95 0,4 0,7 0,6

1,67 1,74 '1,05 0,4 0,7 0,7

I1g.5.9. Vederede su.s a unui duplex ADN

PotrMt acestui model, ADN se prezinte ca o structurd bicatenard, antiparaleld,dublu elicoidali, de dreapta,ambele catenefiind infSgurate pe aceeaSi axd. Diametrul dublului helix este de 20 A, pasul helixului estede 34 A, cu l0 nucleotideper pas.
Timina Citozina

Adenina
5 7

H, Cl al deoxiribozei

Fig.S.l\.Imperechereabazelor complementare dln nucleotideleADN prin tegdruri de hidrogen

326

de biochimie,l, Elem,ente

5''CfL

t-"-"\ \,/
o.t

menina illlilli

^,)b:-o rb

Fig.5.11.Stabilizarea duplexului ADN prln legdturi de hidrogen

Bazele azotate se aflA dispuse inspre interior, (Fi9.5.9.),cu planul perpendicular pe axa comund de rotafie, decalateintre ele cu un unghi de 36o,iar moleculele cledeoxiribozdau planul paralel cu axa de rotatie. Dispunereainterioard a bazelor azotateestefa\rorizati de hidrofobicitatea conferitd de electronii n delocalizafi ai nucleelor acestor structuri. Stabilitateahelixului este asiguratdprin legdturi de hidrogen intre perechile A-T Ei G-C (cdte dou[ gi respectivtrei pentru fiecare pereche.Fig. 5.10.)Acestelegdturi de hidrogen nu se pot stabili decit dacd cele doud 5.I 1.) catenepolideoxirib onucleotidice sunt antip aralele (Fig. In dublul helix se delirniteazd doui caneluri, una mare gi alta micd, care urmeazd traseul celor doui catene antiparalele.Structura descrisi mai sus se referd la cel mai des intilnit tip de ADN gi anume la structura de tip B. Pe lAngd aceasta,au fost identificate gi alte forme sub care se poateprezentaADN-ul. 5"3.1.2. Mobilitatea confo r mafiona,Ui aADN-uIui Studiul sistematic, prin difracfie de raze X, efectuat pe cristale de ADN a fost impulsionat de descoperireagi perfecfionareatehnicilor de sintez[ chimicd, gi de biosintezl.,,in vitro" a catenelor oligonucleotidice, de amplificare a numdrului acestorfragmente.

Acizi nucleici . Structura acizilor nucleici

r\gzurlatertr observafiilor ul moRezultatele ilu confirmat au uustrtvautrur propus gi delul CRICK, dar in de WATSON \,_/ acesacelagi au mobilitatea timp evidenfiat Y", ^ i tuia. Dublul helix se poate indoi, rlsuci, desf\ . / > pirala Eiretrospirala. \ / difractometreRezolutia Rezolufla la scard scard atomici. atomici. a difractometreo lor de raze X a relevat cd intr-o nucleotidd I P componentd a unei oligo- sau polideoxiribonucleotide dublu catenare existd gase tipuri Fig.5.12. de leg[turi care permit o rotafie limitatd, justifi cdnd mobilitatea catenard(Fig.5.12., legiturile ingro$ate). D\ ^ ^ -or^,

C2'-endo

C2'-exo

C3'-endo

3'

C3'-exo

Fig.5.13.Conformagii ale nucleului pentozic din nurlcotl.de

Astfel, prin analiza unui dodecamer, DICtrGRMAN, relevi o mare variabilitate a unghiului de decalare a nucleotidelor, care se intinde in plaja 28" - 42o,fali de valoareafixd dati de modelul WATSON - CRICK (36'). Mai mult, el a observat cd bazele azotate perechi devrazd, adesea de la planaritate intocmai ca gi palele unei eiice. Mirimea devialiilor de la valorile modelului inifial, depind atdt de condil.iile de mediu (pH, temperature, terie ionici), dar gi de secvenfa particulard a nucleotidelor in catend. ln ceea ce privegte inelul furanozic, al deoxiribozei, acesta nu este plan. El se gisegte in diferite conforma;ii, patru dintre acesteafiind pre-

328

Elemente de biochimie,I.

zentatein Flg.S.J3. ln structura de tip B a ADN-ului, cea mai favorizatd formd esteconformatia C2'-endo. Planul bazelor azotateeste perpendicular pe planul pentozei. Deoarece legitura glicozidici estemobild, pot apare conformeri sin respectiv anti (Fig.5. M).7n cazul nucleotidelor pirimidinice, conformafia sin este defavorizatf, energetic pe temeiul repulsiei dintre atomii de oxigen ai ciclului furanozic respectiv cel legat in pozifia 2 a nucleului pirimidinic. In cazul nucleotidelor purinice, ambii conformeri sunt stabili. Cea mai rdspO.nditd formi. este anti- gdsiti in structura de tip B (vezi mai departe), in timp ce conformafia sin se gdsegte in structuradetip Z.

{}

sin-adenozind anti-adenozind

sin-citidind

anti-citidind

tn permise pentrunucleotide, rezultdnd dln rotasia Fig.5.14, Conformafii Siinterzke j urul Ie gdrur e li glicozidlc Posibilitatea acestor deformalii ale dublului helix are o remarcabild semnificafie biochimicd, deoarecepermite formarea speciilor de ADN circular precum gi ,,mularea" reciproci, stabili a ADN-ului de proteinele nespecifice- histonele sau temporard de enzime sau diferili factori proteici. Pe lOngd aceasta,trebuie menfionat cd gradul mare de compactitate al ADN-ului, care ii permite sd existein celuli, in ciuda lungimii sale imense in stare nepliatd, nu esteposibil decdt pe suportul mobilitAfii saleconforma{ionale. 5.3.1.3. Tipuri necanonice de duplexuriADN este Structura canonicd, labaza cireia sti modelul WATSON-CRICK, cunoscutd sub numele de structuri B sau B-ADN. De fapt aceastaeste forma predominantd sub care se pare cd se gi.segte ,,in vivo" ADN-ul. Pe lAngi acesteaau mai fost identificate in experimenterealizate ,,in vitro" incd doui. tipuri de ADN respectivA gi Z.

Acizi nucleici . Stntctura acizilar nucleici

329

5.3.1.3.1.Structura d,etip A (A-ADN-ul) Reprezintd o modificare a dublurui helix B-ADN care se produce in condilii de deficit de apd, astfel incat hidratarea molecutei(lor) nu se poate face complet. Din aceasti cauzd.dublulhelix devine mai compact fa;d de axa principali dar mai larg (in diametru), conformafia inelului piranozic se va modifica in c3'-endo, planul bazelor azotatenu va mai fi perpendicular pe axa dublului helix, fiind rotit cu aproximativ lg". De asemeneabazele azotate vor fi distribuite spre periferia dublului helix. se pare cd astfel de structurd este adoptati de hibrizii ADN-ARN precum gi de zonele dublu helicate din ARN. E:rplicafia acestui comportament rezultd din prezenla hidroxilului din pozifia 2' la resturile de ribozd aleARN. 5.3.1.3,2.Structura de tip Z (Z-ADN)

Z-ADN

ftg.S. 15. Modalitatea deformare a structurii Z_ADN

A fost identificatd de cdtre Alexander RICH de la MassachusetsInstitute of Technology in cursul determinirilor structurv,ls lsalizate pe

330

Elementede biochimie .I.

fragmente deoxiribonucleotidice sintetice cu secvenfaCGCGCG. Acestea cristalizeazd. in duplexuri antiparalele cu o conformafie dublu helicoidali de stdnga mai puiin compacta decdt stmcturile B. Aceasta se datoreazdalternanlei bazelor purinice cu cele pirimidinice gi in special resturilor guaninice care se acomodeazdusor cu conformalia sin. lntr-o astfelde conformafie inelul ribozic basculeazd la structura C3'-endo. Topologic, esteposibil ca guanina si basculeze in conformafia sin. In aceastAconformafie, pentru realizareaimperecherii cu citozina ar fi necesar ca aceastasI igi roteascl planul cu 180o.Ori aceastdmigcare nu este permisi datoritd imposibilitdlii adoptdrii de cdtre citidine a conformaliei sin. Prin urmare, in aceasti situatie este nevoie ca intreaga catenAcare con{ine citidina si se roteasc6la nivel ribofosforic (sdfaci o bucla). Succesiunea alternanti GC pe o cateni gi implicit pe cealaltdva conduce la un mers zigzagal catenelor deoxiribofosforice. Astfel, in zone din ADN care confin motivul repetitiv conformaliaZ poate fi adoptatd. Trecereade la conformafia B la Z modifici helixul de dreapta intrunul de stanga, in care scheletul ribofosfat merge dupi un zigzag de unde 9i numele acestei forme. lnTab.5.3. se prezintdcomparativcdteva caracteristicidefinitorii ale modelelorA, B gi Z aleADN (Flg.s.i6).
Tab. 5.3. Principalele caracterlstici ale d.iferitelor tipuri de duplexurl ADN
Caracteristica Prop(ii globale Lungime / perecie debaze Diametru helix Sensul derotatie al helixului Pelechi debaze / sDire Unghi de rolatie i pereche de baze A helix Tipdedublu B

z
foarte elongat, sublire

glgros scun

gisubtire tung

234

zs,s A
dedreapta 11

3.32Ar0,19A zl/ A
dedreapla

3,8 A

re,q A
desHnga
tz

-10 35,9" t 4,2.

33,6" 24,6 A
+19o

40"t2

Pasul helixului
planuluibazelor Deplasarea fa perpendicuhritate Pozitia axei dublului helix

33,2 A
-1,2o + 4,1o

45,6 A
_9o

Propo4ii alecanelurii mari

Propo(ii alecanelurii mici Confonnalra legeturii olicoldir:e

perechile in canelura mare intre debaze Tn canelun micS Foarte inguslidarfoarte Laql, darcuaddncime DeplasatA spre exterior adanca intermediara Foarte laeadarpulin Ingustll cuadincime in- Foarte ingusE darfoarte adand termediard ad6nctr
antl anti

sinpentru G

Acizi nurleici. Stnrctura aciailornucleici

33r

5.3.1.4.Comportarea dublului helix ADNtn solu(ie

B-ADN

A.ADN
ADN

Z-ADN

Fig. 5. I 6. modelel,eformclor A, B gi Z ale duplcxurilor

ln solulie apoase precum gi ,,in vivo", stmctura dublu helicatd. a ADN, in conformalie majoritard. B este dinamicd, rdspunzdnd fluctuagiilor termice care ii modifici local conformafia. Atit scheletul ribofosforic, cdt gi bazeleazotatese migcd elastic cu perioade de ordinul nanosecundelor.Local, aceasti mobilitate este influenfat[ de secvenfa nucleotidici particulard. De aceeadublul helix, departe de a fi o stmcturd rigidi, apare cu o conformatrie mobili aparent dezordonatd. Aceastdstructura permite, in anume momente, in zone precis delimitate, prin conformatii optime, interacfiuni tranzitorii cu substanfeproteice, care in majoritatea cazurilor moduleazd procesele de transformare ciue au Ioc la nivelul ADN-ului (replicare,transcriereetc). Tot legat de mobilitatea structurald in solufie trebuie amintit cazul aganumililor agenli de intercalare. Chimic, acegtiasunt substanfearomatice cu nuclee condensate,prin urrnare plane. In contact cu ADN-ul ln solulie, acestesubstanle pdtrund intre planurile bazelor.Lzotate unde igi stabilizeazd.paziliaprininteracliihidrofobe cu nucleeleheterociclice ale acestorbaze. Formarea in acest mod a complecgilor de intercalare, pe de o parte reduce mobilitatea dublului helix rigidizdndu-l, iar pe de alte parte duce la pierderea elicitdfii in zona de intercalare, implicit creAndu-setensiuni la niveiul scheletului fosforibozic. (Detalii suplimentare in Vol. II la secfiunea rnutafii). ln plus, agenlii de intercalare afecteazdinteractiunea ADN-ului cu proteinele specifice (echipamentul proteic al proceselorde replicare, transcriereetc.) perturbdnd procesele in care acesteproteine sunt implicate.

332

Elemente de biochimie .1.

5,3.t.5. Denaturarea ri renaturarea ADN ln anume conditii de temperaturl, pH gi tirie ionicd acizii deoxiribonucleici igi pot pierde structura bicatenard, cele doud catene separ0ndu-se. Acest fenomen este cunoscut sub numele de denaturare. ln cazul in care intensitatea cu care acfioneazdacegtifactori nu afecteazd structura primard a celor doud catene, prin indepirtarea agentului denaturant (ricire, aducereapH-ului in limitele normal fiziologice,indepdrtareaionilor) structura bicatenardse reface,fenomenul numinduse renaturare. Evolulia denaturdrii, respectiv a renaturarii poate fi monitorizatd spectrofotometricprin monitorizarea absorbanfeila 260 nm. La aceastd lungime de undd absorb bazele azotate. In structura dublu helicatd, datoritf, mascdrii bazelor, absorbanfa are o valoare relativ redusd. Pe misurd ce catenele se indepirteazi reciproc, cregte gi valoarea absorbanfei, efectul fiind cunoscut de specrometrigti sub numele de efect hipercrom saudeplasarehipercromd.Pfin analogiecu punctul de topire al solidelor, respectiv cu cel al enzimelor (vezi efectul temperaturii asupra structurii - activitdlii enzimelor), se poate deflni !\ punct de topire al ADN-uIui (p.t.). Acesta este temperatura la care se inregistreazdjumatate din variafia totalS a absorbanfei. Desigur relevareaacestuia se face pe baza inregistrd.riivariafiei absorbanfeiin funclie de temperaturd (Fi9.5.17.).

c o (D

l ,

(\
-g {! .E o 1)

a. (E o
o
o

1.0

'

oC Temperature

Fig.S.17, Efectul hipercrom al ri.dicdrii temperaturii unei solufii de duplex ADN

Punctul de topire (p.t.) estespecificf,ecdrui ADN fiind determinat de valoare este rnai mare cu atdt inraportul G+C / A+T. Cu cdt aceastd. teracfiunile dintre catene sunt mai puternice gi in consecin(d punctul de topire va fi mai ridicat.

Acizi nutleici. Structura atizilor nucleici

33t

Trebuie subliniat cd punctul de topire este corelat direct cu concentrafia ionilor. Acesta,pentru cd in prezenfa ionilor, are loc o neutralizare a sarcinilor grupdrilor fosfat, care le anuleazd repulsia intercatenari reciprocd, rezultind in acest mod o stabilizare a structurii dublului helix. Experimental s-a constatat cd in api distilatl p.t al ADN-ului este situat la temperatura camerei. Odata cu cre$terea concentrafiei ionice, creEteqi punctul de topire. Pentru o solugie0,2M de Na", s-a stabilit o relafie cantitativA, hniard in concentralia perechilor G+C, pentru punctul de topire: p.t. = 69,3+ 0,41[%G+C]. pH-ul are o influenfd nefavorabild asupra stabilitefii macrostructurii ADN. Prin protonarea respectiv deprotonarea moleculei, are loc destabilizarea sistemului intern de legdturi de hidrogen, cu pierderea dublei helicitili. Acest proces este practic complet in afara plajei de pH 2,3 11,5.De notat, cd.in cazul ADN-ului, denaturareaprodusd de baze este reversibild,in timp ce acizii, prin ruperea leglturii glicozidice consecutivd protondrii, duc la denaturare ireversibili (vezi hidroliza acizilor nucleici). Renaturarea, este procesul invers denaturirii, ln evolufia sa, cele doud catene se vor alinia reciproc, stabilind interacfiunile complementare. Viteza renaturirii este dependenta de lungimea, concentratia ADN gi de timp. Temperatura acfioneazdla un nivel optim, difuzia macromoleculelor fiind direct dependenti de temperaturd, dar peste o anumitd limita,se poate declanga,,topirea" duplexului. Cinetica renaturdrii estedescrisdde modelul bimolecular: dC^C1 _ =Uar sausubformdintegratd: = f.tcr, * * Proceselede denaturare-renaturareau ca aplicafie formarea hibrizilor ADN-ADN sau ADN-ARN, utilizafi in tehnicile de manipulare a acizilor nucleici. 5.3.1.6. Hibridizarea aciailor nucleici. Dupa cum se cunoagte,atatARN-ul cdt mai alesADN-ul coniin zone dublu catenare.La incdlzire la 100oC sau in prezenfa unor agenfi denaturanfi are loc un proces de desfacerea pun{ilor de hidrogen care asiguri interacfiunile intercatenare, proces cunoscut sub numele de denaturare. Procesul este in anumite limite reversibil. De aceea, opusul sdu, refacerea interacfiunilor intercatenare gi implicit a structurii bicatenare a acidului nucleic, in totalitate sau pe porfiuni, poartd numele de renaturare sau hibridizare. In practicd acest fenomen apiue la men$-

334

Elemente de biachimie .1,

nerea un timp suflcient de lung a partenerilor de hibridizare la temperatura de 65'C. Viteza renaturerii depinde de probabilitatea intdlnirii secvenlelor complementare, implicit de concentrafia speciilor care confin acestesecvenfe.De aceeaviteza ,,dereacfie" poate servi ca mdsurd a concentraliei acestorspecii.Combinareapebazd,de stereocomplementaritate abazelor poate produce hibrizi (de unde gi denumirea) ADN - ADN, ARN-ARN sau mai alesADN-ARN, pentru cd imperecherea bazelor se poate face pe intreaga structurd a celor doud catene sau pe porfiuni ale acesteia. Importanfa analiticd a procesului rezultd fdra dificultate, in identificarea secven{elorcomune a doud fragmente de ADN care pot aparfine unor indivizi diferifi. Preciziagi sensibilitateametodei permite identificarea unor substanle existentein concentrafii de pane la o moleculd pe celuld. Dintre problemele care le rezolvd hibridizarea amintim: r determinarea numiruiui de copii ale unei secvenle particulare de nucleotide care existdintr-un genom. r detcrminarea secvenfelorcomune ale aceluiagitip de geni care aparfin Ia specii diferite. r determinarea genelor exprimate intr-o anume celuld prin hibridizare ADN - mARN, Etiut fiind ci nu toate genele dintr-o celuli igi vor gdsi expresiain sub forma unei substanfe proteice, implicit a mARNului corespunz5.tor. I determinarea exactda regiunilor de contact intre ADN gi ARN-ul celular cu stabilirea exacti a situsurilor de start gi stop gi mai mult, intre acesteadeterminarea poziliei secvenlelorintercalate (a intronilor) care ulterior vor fi indepirtate in procesul de excizie - splicing (vezi vol. 2 transcrierea). Practic,tehnica de hibridizare a acizilor nucleici folosegteo monocateni ADN numiti sondd nucleotidicd sau pur gi simplu sondi care va ,,detecta"fragmente complementare.Sonda trebuie sd fie in mod obligatoriu marcatd fie radioactiv fie chimic, pentru a putea fi vizualizatd odatd cu fragmentul complementar de care se va atagadupi ce esteintrodusi i:ntr-un mediu care confine material nucleic (fie ADN fie ARN). Dupa o incdlzire in timpul cireia are loc desfacerea tuturor duplexurilor are loc hibridizarea sau combinarea catenelor complementare, proces la care va participa gi sonda. Imperecherea catenelor nu necesit[ o complementaritatestrictfl, procesul avdnd loc Ai in condiliile unor catene complementaredoar pe porfiuni. Un rol important in hibridizare,

Acizi nucleici . Stuctura acizilor nucleici

335

atunci cind gradul de complementaritate este redus, il are temperatura. Cu cdt aceastaeste mai ridicatd, selectivitatea procesului este mai ridicati, gi invers. Sonda nucleotidici se ob;ine prin clonare (PCR, sau clonare ,,in vivo" - vezi in continuare) plecdnd de la fragmente de restricfie (obfinute in unna clivdrii cu enzime de restricfie sau de la fragmente complementare (cADN) ob;inute din mARN, sub influenfa reverstranscriptazei62. Uneori, in cazul fragmentelor scurte, acestease pot obline prin sintezd chimici. Marcarea radioactivd a sondei nucleotidice se poate face principial prin doui metode: marcare interni gi marcare extemi' a) marcarea internd. {Fig.s.18.)se realizeaznprin biosinteza catenei sondei in prezenfi de ADN polimerazd, utilizdnd deoxiribonucleozid trifosfa$, marcali la fosforul crcu t'P. Aceastdmetodd se poate realizala rdndul ei prin doud variante: (1) deplasareabregei gi (2) amorsajul aleatoriu.
Harca@ Nin'depl.sar8 brerei' '.mo/9d Uarcrrat prln tleatodu'

I oo*--o
5

l rn'*
J

|+ t ADNpollmr@o I )cfP(uo6l morcqte Y b to8toruld )

3'

s s.

I ADNpolherolo I + I XfP (unele mooto to iosforulc) i

---

Fig, 5.18. Marcarea internd a sondclor nucleotidice

(l) Marcare prin deplasarea breSei (nick translation): prin tratarea unui fragment ADN surs[ cu ADN-azn I in prezen{a ionilor MgZ*, se creeazd breqeintr-o catend ADN. Dispunerea pe cateni a acestor brege este aleatorie.Extremitelile 3' ale acestorapot servi ca reactant pentm reac;ia de policondensare la care mai participd nucleozid trifosfafi (unii dintre ei marcafi la Pcr)Ei desigur ADN-polimercaa.L In acest mod, se
62Reverstranscriptazafolosegte o matrila de ARN pentru a sintetiza monocatene de ADN. Vezi tehnici de inginerie geneticiVol. II.

336

Elementede biochimie .1.

vor obline catene identice cu cele clivate inilial, dar care vor avea incorporafi atomi 32P. (2) Marcareaprin amorsaj aleatoriu (random priming) utilizeazd. hexanucleotide sintetice, disponibile comercial, cu rol de primeri in sinteza catenelor marcate. Hexanucleotideleigi vor avea corespondentul complementar in catenele63 ADN din care se ob;ine sonda. Dupd decuplarea catenelor helixului prin incdlzire, la rdcire are loc primerilor. ADN p olimeraza, in prezenfa nucleozidtrifosfatilor atagarea (din care unii marcati va sintetiza noi cateneplecdnd de la pimerii existenfi. Diferenta intre cele doui metode este cd in cazul amorsajului aleatoriu se oblin fragmente de ADN de lungimi diferite. b) marcarea externi se realizeazdla capetele 5', foiosind in acest scop polinucleotidkinaza codiflcatd de genomul bacteriofagului T4 gi extrasddin bacterii E. coli infectate cu acest fag. Fosfatul radioactiv se va atagain pozilia 5' gi provine dinATP-ul marcat la fosforul o.

brat

de distan

HOn

Fig. 5,19. Nucleotidd marcati chimic, detectabild imunologic

Aceasti metodd se utilizeazd cu fragmente ADN cu pdnd la 100 de nucleotide, deoarece peste aceastevaloare confinutul de fosfor radioactiv per catenAar deveni prea mic (avdndu-sein vedere ci existd doar un ttP la fiecare catend).
63probabilitatea de a intAlni un fragment de secvenld datd de lungime n este ll4" - in cazul nostru 1/4096adicdlungimea medie a unui fragment carepoate conline secvenla hexanu.lcleotidicd. estede 4096de nucleotide).

Acizi nucleici . Structura atizilor nucleici

337

Marcarea chimicd, este mai complexe, insi are avantajul evitdrii contaminarii radioactive.De reguli marcareachimicd se face cu o componentd pentru care se dispune de un anticorp (F85.I9.). Acest anticorp conline atagati o enzim6. Dupd separareaelectroforeticd a fragmentelor de analizat, are loc hibridizarea cu sonda nucleotidicd. Dupd hibridizare, se indep[rteazd, prin spdlare excesul de sondd, gi in mediu se introduce anticorpul, mediul se incubeazi suficient pentru ca reacfia sd.aibd loc Ei apoi se introduce substratul pentru enzima atagate de anticorp. Locul existenfei enzimei (locul unde s-a atagat anticorpul) se detecteazd de reguld prin schimbareaculorii produsului de reacfie prezenla hibridului. Identificarea fragmentelor hibridizate prin transfer (blotting)

t'/

gd culngmartr ADll oblinutprinclectrolonri

pclolla dr innsforulfngmcntelor (blottingul pollemidi saunitrccclulorl propriuzit)

f-l

ffi
cu sondc hibridarta nuclaqlidicc h'tbtidc lirueliranr f ngmcntelor prinaulondicgrrfir(sondrcaldr) (sonde ruoi! mufluorcsoanli

Fig.S.20. Schema tehnlcil ,,blatting"

338

Elemente de biochimie .1.

Capacitatea hibridizdrii, ca instrument de lucru, de a realiza identificarea unor fragmente complementare cu sonda nucleotidicd, igi gdsegtevalorificarea prin combinarea cu separarea electroforeticS.. oligo- sau polinucleotidice supuse analizei sunt separate Fragmentele prin electroforezd, in gel de poliacrilamidd sau agarozd (cele peste 20 kD).Acestefragmente nu pot fi supuseoperafiei de hibidizare cu sonda nucleotidici pe gelul de separare,deoarecepe de o parte fragmentele nucleotidicese gdsescincluse in gel, iar pe de altd parte sunt necesare operafii de incdlzire, spdlare,condifii in care fragmentele nucleotidice igi vor pierde pozifia dati de lungime. De aceeaestenecesartransferul fragmentelor oligo- sau polinucleotidice pe un suport inert si ,,fixarea" la condiliile de lucru (de reguld folii poroase de poliamida - nylon sau de nitrocelulozd). Transferul are loc in condiliile unui mediu de tdrie ionicd ridicatd. practicd a blottingului se face prin: capilaritate,sucfionarela Realizarea vid sau electromigrare. Practic,placa cu gelul care con{ine fragmentele de acizi nucleici separate electroforeticse introduce intr-o solufie de NaOH, care are rolul de a denatura duplexurile ADN. Apoi placa se introduce tntr-o cuvd care folia poroasdde nitroceluloconfine o solufle salin6. Pestegel se ageazd vor ata;a doar monocatene. ln cazul folii se Pe aceste sau nylon. zd transferului prin capilaritate, peste placa poroasi de nitrocelulozd sau poliamidd se ageazdmai multe straturi de hdrtie absorbanti. ln timp, prin capilaritate, se realizeazdtransferul fragmentelor. ln cazul electromigrarii pe gel se plaseazdo placi electroconductoarecare se leaga la anod, catodul fiind legat la solu{ia in care este plasatd placa cu gel. Transferul se face prin deplasaleapolianionilor in cdmp electric pdni la placd..Transferul prin vacuumsucfiune se face prin conectarea pldcii poroasela o incintS.vidatd care realizeazd transferul materialului. Dupd uscare intr-o etuvi de vid, folia cu monocateneleADN se supune unei operafii de prehibridizare, care constf,in incubare cu o solulie proteicd (de reguld albumind sericdbovind) sau / gi o solufie de detergent. Prehibridizareaare rolul de a ocupa situsurile din folie unde sar putea atagafragmenteleADN din sonda nucleotidicd. ln continuare, folia care conline fragmenteleseparatese pune in contact, intr-o pungd de plastic, cu solufia care conline sonda nucleotidicd marcatd radioactiv sau chimic. In timpul incubdrii, sonda nucleotidici se hibridizeazd. cu fragmentele complementare. Dupi incubare are loc spdlareafoliei pentru indepirtarea excesului de solutie care con{ine sonda. Vizuali-

Acizi nrcleici - Structura acizilor nrcleici

t39

zuea sondei, implicit a fragmentelor hibridizate se face prin autoradiografie, in cazul utilizdrii sondelor calde sau prin expunere la lampa de ultraviolete. Tehnica a fost aplicatd prima datd. de citre SOUTHERN. De aici si numele de SOUTHERN blotting. O varianti a acesteia este utilizatd pentru hibridizarea fragmentelor ARN, in acest caz tehnica se numegte NORTHERN. In acest caz, pentru denaturarea fragmentelor de acid ribonucleic se folosegte formaldehida, dupd care are loc hibridizarea propriuz.is6. Ca tehnici de hihridizare, atdt tehnica NORTHERN cdt 9i SOUTHERN. se bazeazd.pe complementaritatea catenelor ADN * ADN sau ARN ADN ori mai rar ARN-ARN. Pe acest model a fost elaborati metoda WESTERN pentru determinarea unei anume proteine, prin complementaritatea legdrii cu un anume anticorp (care constituie sonrla). Proteina este denaturatd in prealabil cu SDS.Anticorpul se marcheazi prin ata$area covalentd a unui colorant sau a unei enzime. Dup{ incubare, excesul se indepdrteazd prirr spilare, complexele antigenanticorp formate putand fi puse in evidenfd direct, in cazul marcdrii prin colorare, sau indirect in cazul marcdrii enzimatice. In acest ultim caz, dintr-o molecul{ de proteind legatdde anticorp se oblin mai multe molecule de substrat transformate, care se pun in evidenfi printr-o tehnici analiticd corespunzitoare. 5.3.1.7. Structura terfiard a ADN-ului ComplexitateaADN depinde de tipul procariot sau eucariot al celulei precum gi de pozifia organismului pe scara evolufionald. Organizarea spaliald a macromolculelor de ADN in interiorul celulei definesc structura tertiard a ADN-ului. Procariotele nu au materialul genetic separat de alte structuri, neprezentdnd un nucleu distinct. Virusurile gi bacteriile posedd o singuri moleculd de ADN bicatenar, de reguld circular, inchis covalent, De menfionat cd, in cazul virusurilor, materialul genetic poate fi stocat gi sub formd deARN. Eucariotele posedd de reguld un nucleu distinct structural de citosol, de care este separat printr-o dubld membrani poroasi. Dimensiunile reduse aie celulei, pentru a nu mai aminti pe cele ale nucleului, oblig5.

340

Elemente de biochimie,l.

ADN-ul sd adopte conformatii cu grad mare de impachetareo4. Atingerea acestorconformafii este posibili doar prin interacfiunea ADN-ului cu substanfeproteice care vor ghida duplexul cdtre conformatii dense. Substanleleproteice tipice care interacfioneazi cu ADN-ul au caracter bazic conferit de aminoacizi precum lisina, arginina, histidina Ei sunt cunoscute sub numele de histone.Peldngi histone, ADN-ul se mai gdse;te asociat temporar cu o serie de proteine nehistonice,al cdror rol acoperi o mare diversitate,legati in principal de expresiagenelor,de la proteosintezei,pdn6.la enfactorii proteici responsabili de declan$area zimele care faciliteazi acestproces. Raportul masic intre materialul genomic gi proteinele asociate este aproximativ unitar. Histonele sunt proteine de cinci tipuri diferite: Hl, H2A, H2B, H3 gi H4. Tipurile H2A, H2B, H3 gi H4 prezintd un grad foarte inaintat de conservare,structura primari deosebindu-se extrem de pufin intre specii. Aceasta atestd menfinerea mecanismelor de pliere a ADN-ului. De fapt, acestepatru in perechi.Acest un octamer, prin asocierea tipuri de proteine formeazd. octamer reprezintd miezul unei structuri repetitive, nucleoz,omul. Acestaesteformat din octamerul proteic descrismai sus,in jurul cdruia se infi,goarddoui spire de dublu helixADN, in care intrd 164pb6s. lnfdgurareadublului helixADN in jurul miezului nucleozomului presupune deformarea dublei catenein zona de contact cu proteina. Enerin caneluramicd. De gia necesari procesului de deformare estemaximS. pliere canelurii mici in contact cu in zonele corespunzdtore aceea de nucleozomul se intdlnesc foarte frecvent perechile A - T. Stabilitatea structurii nucleozomice este ridicatd, poziliile ocupate de octamer pe catenadeoxiribonucleotidicd fiind fixe. Pe lAngfloctamerul histonic ai cele doud spire de duplexADN, nucleozomul (Fig.5.21.) contine ca structuri de legIturS, proteina Hl precum gi un numdr variabil de perechi de nucleotide (0 - 100).Histona HJ.posedd trei situsuri de legare prin intermediul cdrora se conecteazi doi nucleozomi adiacenli. Astfei in zona centrali a structurii H1 se afld a9ape nucleozom. Celelalte doui situsuri numitul miez, care se ataqeazd
6aO celuli umani obignuiti ^re un diametru de 20 pm. Materialul genetic cu 3.10spb consti din 23 de perechi de molecule bicatenare de ADN, care existd sub forma de cromosomi. Lungimea medie a unui cromosomestede 3.10e / 23 = 1,3.108 pb. La o distanla de 0,34 nm / pb in conformalia B a cateneiva corespundeaproximativ 5 cm per cromosom. Cei 46 de cromosomi vor aveain total, conform acestuicalcul 2,30 m. Pentru ca acest material sd poatd intra in celuld este nevoie de reducerea cu cinci ordine de mi.rime a lungimii materialului genetic. 65Perechi debaze

Acizi nucleict . Structure acizilor nucleici

34r

sunt capetele N- respectiv C- terminale ale catenei polipeptidice. Ele interacfioneazecu rniezurile H1 atagatenucleozomilor aldtura;i.
Ouplex ADN " Histona Hl

Nucleozom

T Miezu!nucleozomic formatdin octarnerul histonic Fig. 5.21. Structura unui nurleozom izolat

O dubla catend ADN, apare astfel ca o ingiruire de nucleozomi (care au aspectul unor mdrgele pe o afe). Dublul helix care leagi doi nucleozomi adiacenli poartd numele de ADN de legatura (linker). Daci dublul helix in conformafie ideald (Watson-Crick) avea un diametru de 2 nm, girul polinucleozomic, saufilamentul de cromatind, va avea un diametm de 11 nm, iar lungimea sa se reduce. Filamentul de cromatind nu esteo structurd ideal5, deoarecelungimeaADN-ului linker estevariabila. De asemenease intdlnesc po4iuni fdrd nucleozomi, in care exista proteine de legiturd nehistonice.Acestezone sunt hipersensibilela acliunea nucleazelor. La rdndul sdu, girul polinucleozomic se aranjeaze intr-o structurd superhelicoidald cunoscuti sub numele de solenoid sau fibrd de cromatind. Dianetrul acestei structuri ajunge la 30 nm. Suprahelixulformat confine in medie cca. gasenucleozomi pe spird. ln continuare fibrele de cromatind se vor aranja in structuri mai compacte cu aspectde bucle (anse),al cdror diametru mediu este de cca. 300 nm. Acesteanse,la rdndul lor se aranjeazd.instructuri cu grad mai mare de

342

Elementede biochimie .I.

compactitate, numite heterocroma.tina, structuri cu un diametru de cca. 700 nm, care in cursul diviziunii celulare vor atinge forma maxim condensatdnumiti cromosorn Diametrul acesteistructuri de cca. 1400 nm (1,4Fm) o face bine vizibildla microscopul optic. ln alte faze ale ciclului celular decdt diviziunea, aspectul microscopic aI materialului genomic estedifuz. 5.3.I.B. Superhelixuri. Topoizomeri Si topoiznmeraze
l0 15

zo
I

25

A. Forma liniarl a unui dublu ]tclix ADN 23.. I

l5 B. Fomra circularl relaxatli

15

to D. Formacircularl rclaxattrdc supraheiixncgativ (suprarilsucire de dreapta)

C. Formaoirculardtensionati prin incizic - der[suchea a dou6spirc - sudatc

Fig.S. 22. Formarea superhelixurilor (suprardsucirilor)

ADN-ul dublu catenar se poate prezenta gi sub formi circulari inchisd, cum este cazul marii majoritdfi, dacd nu a tuturor cromosomilor bacterieni.Plasmidele, care sunt purtatorii unei informalii genetice secundarela bacterii, sunt tot molecule de ADN circulare.Chiar ADN-ul liniar poate fi considerat o structurd cu capetelefixate, datoritd asocialiilor cu proteinele. Tuturor acestor forme le este caracteristicun anumit numd,r de spire dependent de numirul nucleotidelor gi de tipul catenelor (A, B sau Z). Acest numdr de spire nu poate fi modificat decdt prin incizia unei catene urmati de rdsucireasau derdsucireaacesteiagi, final, de sudarea capetelor libere. Prin aceste rdsuciri - derdsuciri se creeazd. o tensiune in structura moleculei de ADN, care este compensatd prin aparilia unor suprardsuciri ale intregului dublu helix, in sens opus rS.sucirii cauzi. Considerim un dublu helix de 260 pb, forma B. PlecAndde la valoarea medie de 10,4 nucleotide per spir6, acest dublu helix liniar ipotetic va aveain forma sa relaxate 260 I 10,4= 25 de spire (F1g.5.20.A). Prin le-

Acizi nucleici . Structura acizilor nucleici

343

garea celor patru capete (2x2), se va obtine un dublu helix relaxat tot cu 25 de spire (Fig.S.20.8). Dacd inainte de legareacapetelor doud spire se vor desfdqura, se ob(Fig.5.20.C), 23 un dublu va avea doar helix circular tensionat care fine de spire. La acelagiefect se poate ajunge gi plecdnd de la dublul helix circular prin incizia unei catene, derS.sucirea a doud spire, urmatd de sudarea celor doud capete rdmase libere. Structura este tensionati, deoarecenu se mai pot stabili toate legdturile de hidrogen posibileintre perechile de baze opuse, ceea ce conferd structurii un excesenergetic fafa de forma relaxati. Aceastd structure tensionatd va trece spontan intr-o structur5,relaxatdprin suprainf[gurarea dublului helix asuprasine-insugi, desigur in sens invers rdsucirii care a creat tensiuneainiliald (Fig.5.20.D) Cuantificarea helicitatii diferitelor forme ale ADN-ului circular sau liniar cu capetelefixate se face prin intermediul unor parametri topologici: L Numdrul de legare (,,linking number" - L) desemneazi numdrul de spire spre dreapta, formate de o monocatend.de ADN tn iurul celei complementare,Atunci cdnd axa dublului helix este constrdnsasa rdmdnd pland.ln exemplul considerat, formele A gi B au L = 25, in timp de formele C gi D au L = 23. Conformerii care diferd prin valoarea lui L poartd mrmele de topoizomeri. Interconversia topoizomerilor se face cu ajutorul unor enzime specializate, topoizomerazele. 2. Numdrul de suprar{suciri (,,vwithenumber" - \d) desemneazi numdrul de spire pe care dublul helix le executdasupralui. Prin aceasta dublul helix nu mai poate adopta o structuri pland. Semnul acestui parametru este negativ in cazul in care rotafia are loc spre dreapta, deci cAnd este cauzat de o structura tensionati plani rezultatd prin derisucire, gi pozitiv in caz contrar. In exemplul considerat pentru structura D parametrul W= - 2. 3. Numdrul de rdsuciri (,,twist number" - T) desemneazdnumdrul total de spire helicoidale. Tot in exemplul de mai sus,pentru conformafia B: W=0, l=25i pentru conformafia C: W=0, T= 23, iar pentru conformafia D: W=-2, T=25. Intre acegtiparametri, dupd cum se observd,existdo relafie simpld: L=T+W Prin aparilia suprardsucirilor sau a suprahelixurilor, cregtegradul de compactitate al ADN-ului (scadevolumul ocupat), astfelincdt wteza de

i44

Elemente de biochimie,l.

migrarein cdmp centrifugal,respectivin c6.mpelectriccre$te.De fapt, pe bazaacestei proprietdfiobservate de Jerome VINOGRAD, in 1963, au fost demaratecercetdrile asupraformelor de suprahelixaleADN-ului. Gradul de suprarisucire poate fi de asemenea cuantificatprin densitateade suprariisucire(o). Aceastase definegteca raport intre diferenpa dintre numerelede legarealeformei suprarisucite (Ld gi aleformei originareIa, gi Ia:

o=kl=
Lo
Lt=o

? ffi?"*F
|@

K . (.,H
Ll=nrl

Fig.S.23. Modul dc acfturu al topoitnmerarplor de tip I.

ln exernplul considerat valoarea sa este{23..2s) I 2s =-0.0g. pentru majoritatea moleculelor deADN naturaleo arevaloarea mediede -0,06. Valoarea negativd atestd cd formelesuprahelicate seobfin prin despiralarea conformerilorinifiali. suprardsucirile negativepregdtesc dublul helixADN pentru procesecarepresupunsepararea celor cloui catene: replicare,recombinaregi transcriere.Supraheiixurile pozitive sunt de asemenea compacte, dar procesulde separare estemai dificil decatin cazulsuprahelixuluinegativ.

'-L^
l-"

J n/'

I *l:"

f-;.-2

*P-".-r"' /gY I

Fig, 5. 24. Mecankmulde qcfiuru alnpoiz,omerazelor

Acizi nucleici. Structuraacizilor nucleici

345

Topoizomerazelesunt enzime care modificd numerul de legare,sau altfel spus, fie introduc, fie eliminf, suprarflsucireaduplexului ADN circular ori cu capetelefixe. Dupd cum ele realizeazdsectiunea uneia sau a ambelor catene ale dublului helixADN, topoizomerazelesunt de tip I respectivde tip II. Topoizomerazele de tip I se mai numesc gi enzime de relaxare,intruc6.tele reduc densitatea de suprar5.sucire. Ele acfioneazdsecvenfial. Inilial, are loc scindareaunei legdturi fosfoesterice dintr-o monocatend. Energia chirnicd a legdturii se conservd prin formarea unui conjugat topoizomerazal - ADN, prin intermediul unui rest de tirosinf, care va participa la o reacfie de transesterificare, Capdtul secfionat aI ADN-ului liber (capatul3'-OH), va putea suferi o rotalie liberd in jurul cateneiintacte, dupd care printr-o noud reacgiede transesterificareare loc alipigi Fg. 5.24.). rea fragmentelorde catenl qi eliberarea enzimei.(Fig.5.23
Ciraa

'c/
I

/-_:\

'+

6p!q.ADNcircuLr

IrSrilgirszoi

n.

i-w' \C/
t

Socdoroa abpkroluid copotoloa lo{tiorrtc dcplsrErlo

t?
l{
ADP+P rn'&nci ib po Dcoprindcroa Optcrutngarnult ncgdiv Suducrcrpotclc &pk"nlui Fig.5.25.Modul de acfiune al topoizomerazelor de tip II

Topoizomerazetede tip II, secfioneazdambelecatene ale duplexului ADN. Celemai cunoscute sunt girazele.Ele introduc suprarisuciri, intrun proces defavorizat energetic.De aceeaactiunea lor este cuplat[ cu hidroliza ATP. Introducerea unei suprardsuciri intr-un dublu helix cu o = 0,06,necesitdaproximativ g kcal.mol-t. O astfel de enzim6, binecunoscutd, este giraza din E coli, care este un tetramer format din doui

346

Elementede biochimie .I.

perechi de subunitifi identice. Una dintre subunitdli are masa de 105 kD, iar cealaltdde 105 kd. Interacfiunea primard dintre enzimd gi dubla catend conste in infdgurarea pe o porfiune de aproximativ 200 pb in jurul proteinei. In aceast5, structurd, legareaATP-ului declangeazd procesul de clivare al ceior doui cateneADN, odatd cu a tetramerului AABB in dimeriiAB AB. Situsul de clivare de pe o catendADN, estedeplasatcu patru nucleotide de cei de pe cealaltdcatend. Capetele5'-fosfat secfionate vor fi legate de cdte un rest de tirosind de pe cdte o subunitate A. Aceasti legare a ambelor capete ale secfiunii impiedicd pierderea de suprahelicitate.In continuare, unul dintre capetelefixate se va deplasa printr-o migcare de rotatie (doar in sensul realizdrii unei suprar5.suciri negative), in jurul porfiunii intacte, cele doud capete revenind una ln apropierea celeilalte.ln aceastdconformalie, are loc hidroliza ATP-ului legat de enzimd, care duce la reformarea legdturilor fosfodiestericedin cele doud catene si totodatd refacereastructurii tetramerice a enzimei qi disocierea acesteia de peADN (Fig.5.25.) 5.3.2.Structura secundard gi te4iard a acizilor ribonucleici (ARN) Dacd pentru ADN, starea ,,normald",adici majoritari, este de dublu helix (duplex),pentru ARN, stareacea rnai frecvent intdlnit[ este aceea de monocatend. Excepfiile observate,apar pe porliuni de catend de ARN, at6.tintracatenar cdt gi intercatenar.Catenelepartenere pot fi atat ARN, cdt gi ADN (hibrizii ADN-ARN joaca un rol important in hibridizarea acizilor nucleici). Zonele dublu catenare (inter- sau intra- catenare se formeazd tot prin imperechereabazelor complementareA-T(U) respectiv G-C. Deoareceprezen{a hidroxilului din pozitia 2' impiedicd porfiunea dublu catenarasd adopte o conformafie de tip B, in structurile de tip duplex ale ARN se intilnesc conformalii de tip A, cu I1 pb per spird gi cu bazele puternic deplasatede la perpendicularitateafafd de planul dublului helix. S-au sistematizattrei tipuri principale de ARN, ce diferd intre ele prin rolul jucat in sinteza proteici: ARN mesageri (m"4.RM, ARN de transport (fARM gi ARN ribozomali (rARM. C6,teva dintre caracteristicile esenliale ale acestora, relevate din bacteria Escherichiacoli sunt prezentate in tabelul5.4. Pe ldngi acestea mai existi gi ARN de masd micd snRNA (small nuclear ribonucleic acids) sau scRNA (small citosolic ribonucleic acids), care au rol in procesareaacizilor ribonucleici de transport.

Acizi nucleici . Struttura acizibr nucleici

347

Tabelul5.4.Tipuri de ARN 0nEscherichia coli

Tip

Funcfie

Nurnlr Intensitate relatlv la Diversitate relativi de Stabllitate de total ARN nucleotide sintezl % o/o
celular instabil perioada de injumdtd[ire de 1 -3 min stabil

Con$nut

transporta ridicati informatia mARN (cAtew mii de la ADN la

rihozomi

500- 6000

40-50

detipuri) 2800 1540 120

75-90

rARN

3 specii: intra in 23S structura 163 ribozomilor 5S transportd aminoacizii pAni la

rih6Tnm

50

90

trARN

50-60

stabil

5.3.2.I. ARN mesageri (nARN) Poartd informafia continuta intr-o secvenfdde ADN, sub forma unei secvenfetranscrise, similard celei inifiale. Secvenfaunui mARN66este similard.celei originale. Diferenfele intre catena matrifA (ADN) $i cea copie (ARN) constau in inlocuirea deoxiribozei din ADN cu riboza in mARN Ei inlocuirea timinei din ADN cu uracilul in mARN. Ulterior, mARN-ul replicd, se va traduce intr-o secvenfede aminoacizi, care va forma noua catend polipeptidicd sintettzatd.. catene polipeptiAceast5. dicd sintetizati reprezinti expresia, sau forma exprimatA a inforrnaliei geneticestocatein ADN (in geni). Degi intensitatea relativa de sintezd este mare, corespunzatoarenevoilor constante ale celulei pentru diferite proteine, confinutul momentan de mARN este redus, durata de viatrda acestuia fiind mult mai micd faf[ de celelaltedoui tipuri. Aceastase exp[ce prin hidroliza imediati a mARN-ului dupa indeplinirea rolului s6.u,pdni la nucleotidele componente, care vor servi ca materie prim6 pentru noi procese de transcriere.Faptul cd fiecdrei proteine (secvenfe proteice) ii corespunde justifici o secven{dde mARN diversitatea moleculard a acestui tip de ARN.
66Procesul de sintezi al unei catene de nARN dupi modelul unei anumite secvenle din ADN poartd numele de transcriere qi va fl descris in detaliu in Vol II la capitolul de sintezaproteici.

348

Elementede biochimie .I.

La eucariote, mARN se sintetizeaze i\ nucleu, (transcriere), se transferdin citosol, se atageazdpe ribosomi unde participd ca model (matri;a; la sinteza noii catene polipepticidice in cursul procesului de traducere.
3' OH A Punct de atagare

Bucla anticodon

Cbdon

Fig.S. 26.Modelul plan al unei molecule de I-ARN

Structura mARN este monocatenare. Pot exista insd zone limitate ca lungime, in special la procariote in care apar legdturi intracatenare (porliuni stereocomplemetare cu baze perechi A-U EiG-C), care conferd structurii locale aspectulunei agrafede pdr (hair pin). Structura mARNului estedificil de explorat datoritd instabilitdlii acesteia. 5.3.2.2. ARNde transport sa,ude transfer (IARN) Au rolul de a transporta aminoacizii din citosol, pdnd la locul sintezei catenei polipeptidice, ribosomul. Aici, tot datoritd tARN, aminoacizii sunt ordonafi in catena polipeptidicd in formare, pe baza secvenfei nucleotidice din mARN care se gdsegteata9at de ribosom. Acesta le conferd caracteristicade moleculi adaptor intre catena de mARN gi catenapolipetidicd. Pentru realizareaacestorprocesefiecare acid ribonucleic de transfer poseddcapacitateade recunoagtere a unei anumite secvenge de nucleotide din mARN gi in acelagi timp de legarea unui anume aminoacid. Pe ldngd funcfiile de recunoagterea secvenfelor nucleotidice din mARN qi de legarea aminoacizilor, tARN-ul mai indeplineqte func$a de activator al moleculei de aminoacid care va intra in reacfia de policondensare.Aceasta pentru cd aminoacidul va fi transportat prin legare

Acizi nucleici. Structuraacizilor nucleici

349

esterice la IARN,(pentru detalii vezi sinteza proteice). Structura tARN asigurdindeplinirea funcfiilor sale. Fa{d de variabilitatea mare a mARN, numirul de specii de tARN la nivel celular estelimitat la cca.40 cu varialii relativ mici intre specii.

)H,

-rr"^J-.I i,Y\ =^^l

r/)r"\

H:\

R:A/ ^l

N I Prbod

,ta"norinl <jl

(i6A) N6lzopentenihdenozinl o

l-Metiladenozinl(mf .4') o
Hrctr-\-\

tl
,. 1

tl

'T\
.N

n-'A"-\.. til)
\..^N'

\,4*/ ^t
Ribozi l-Metilinozin{ (ml l) o
.r\".-\.-\

iil\

Ribozt

Guanozinl (G)

rnorinltrttu

*i^Y\
"'\-A-A^/ i'l
CI.lr Rtbozi

tl

tl
*^f

*r^

iil)

\2,N2 Dimctilguanozine(nfl'2G;

t-u"titguano,il:i;, ",
il

tl
*l\_,-a*,

os ilHll

tll

Rrboa

"2-'? l,o"Ribotimidins (T)

NH]

n,,Af'H I l.,H oA*/-'"

*,A I ./-"
I

ll

^,'\'*0"-

.2-?
H

Uridinr (L')

PseudouridinafP) o,n,o,l l*1,",,o, o-t,"".,l|'iuo-u,

NH.

l^4 ttl ?'--.'e,

Rrboa

t"

{oYo' "2t") Lo"s-metitcitidins (mS C)

Citidins (C)

2-Tiocitidine (t-C)

Fig. 5.27. Baze atipice intAhite tn moleculele de IARN

Moleculele de IARN posedA caracteristici comune, pe langa aspectele particularecarele deosebesc.

350

Elementede biochimie ,1.

Moleculele de IARN sunt formate dintr-un numdr timitat de nucleotide (73-94).Unele dintre acestea se gdsesc imperecheate. ln componenfa tARN se glsesc nucleotide cu baze atipice, Numdrul lor variazl de reguld intre 7 gi 15. Cele mai frecvent intd]nite sunt prezentate in Fig.5.27. Multe dintre acestea sunt derivafi metilafi sau dimetilali ai bazelor A, U, C gi G. Bazele atipice au potenfialul de formare a perechilor alterat. Mai mult, modificirile sterice, electronice gi mai pulin cele lipofile permit o modulare mai rafinatd a interac{iunii cu proteinele ribosomale, cu sintetazelecare acfioneazi in decursul sintezei proteice. Capitul 3'-OH terminal are intotdeauna secvenfade baze CCA, iar capatul 5'-fosforilat are in majoritatea cazurilor un rest de acid guanilic. Fiecaremoleculi de tARN are patru zone dublu helicate, care conferd un aspect de frunza de trifoi cu patru foi pentru molecula forfatd si apari in plan (Fig. 5.26.).Structura realizatd prin formarea celor patru zone de duplex delimiteazl patru bucle: bucla TYC, aI cdrei nume derivd de la secvenla obligatorie ribotimind-pseudouracil-citozind,o bucld suplimentard de lungime variabiLd(bra; suplirnentar),bucla anticodon, care conline o secvenfi de trei nucleotide, KYZ, strict stereocomplementard cu o secvenfA corespunzdtoare (codon) din mARN.Codonul estela rdndul s6u integrat intr-un motiv comun: 5' - - - - Pirimidina (facultatiu metilatd) - Uracil- X-Y-Z- Purind - - - - 3' modifi cdtd-Bazd uar iab il"d

I:ig.S.28.Schema deprincipiu Simodelulspalial al unei molecule de IARN

Acizi nucleici . Structura acizilor nucleici

3Sr

Ultima structure esrc bucla DHU care contine mai multe resturi de dihidrouracil in moleculd. structurii terStructura tridimensionali, (Fig.5.28)corespunzdtoare fiare, a fost rezolvatd pentru prima dati in anui 1974,prin studiile de difraclie de raze X efectuate pe IARN al fenilalaninei din drojdie. Ea are form;r literei L (vizut[ in spaliu) si rezultd prin stabilirea unor legdturi de hidrogen intre nucleotidele din bucla D, cu cele din buclele suplimentard, respectivdin ceaTYC. Perechilede bazeintre caresestabilesc Iegdturilede hidrogen nu sunttotdeauna cele canonice (A-Tpi G-C). La un capdt al ,,L"-ului se gisegte zona de legare a aminoacidului (secvenfaCCA 3'OH- terminall), iar la cealaltd extremitatese glseqte bucla anticodon. lntre cele doud zone distanfa estede aproximativB0A. Collul literei esterealizat de buclele D gi TYC. 5.3.2.3.ARNribozomal (rARN) Formeazdmasa principald a ribozomilor. Acesfiasunt organitecelulare situate in citoplasmd formate din acid ribonucleic (65 %) qi din proteine. Studiul ribozomilor a ardtat cd structura acestora esteformatd clin doud subunitdli ribonucleoproteice asociateprin legdturislabe,intre care existdun spafiu in care poate intra mARN-ul. Aceste doud subunitifi diferd intre ele prin mase moleculari cuantificatdprin constanta de sedimentareSvedberg. Constantade sedimentareS, esteo mdrime care se utilizeazain cazul deterntindrilor cornparatiuede masd molard a unor moleculeprin mdsurarea uitezei de deplasare a substanlei tntr-un cdmp ultracentrifugal Ea sedetermind cu ajutorul expresiei:

S_

( D 2. r

10t3

tn care u esteuiteza de deplasare a substanpeitn cm . s-' in cA.mpul centrtfugal creat la @rotalii pe secundd tntr-un rotor cu razn r (cm). Constanta de sedimentare ua depinde direct de masa particulei, de densitatea acesteia,de formd, qi inuers de densitatea mediului in care are loc centrifitgarea. Ea este o mdsurd reproductibila pentru determinareatn acelea;i cortdi;ii legatede mediul de sedimentare a masei rnoleculare Si a formei, pentru cd la aceea;i masd molard constanta de sedimentareua auea ualori cu atdt mai mari cu cdt abaterea de laforma sfericdvafi' mai mare. De exemplu o substantd.care ua auea,o uitezd de sedimentarede

352

Elementede biochimie ,I.

3,4 .10-5cm .{r tnft-o ultracentrifugd cu turafia d,e 75.A00rotlrnin ua, aueaconstanta de sedimentare:

S_

3,4.10-5

= 27S 1013

[:tloo)' t \60)
Cu titlu informativ, in cazul bacilului Escherichiacoli,unribozom (70 S) esteformat din doud subunitdli (50 S Ei30 S).Datorite deosebirilorde form5,intre acestesubunitdli constanta de sedimentare a ribozomului nu este aditivd. Subunitateamicd (S) este formatd dintr-un rARN (165) care confine 1542 nucleotide 9i 21 de r-proteine diferite, notate Sf - SzL (S de la small).Acestansambluare masade cca.900.000 daltoni. Subunitatea mare (L de la large), este formatd din doud catene rARN (5S cu 120 de nucleotide gi 23S cu 2904 nucleotide) gi 34 de rproteine dintre care patru identice.
Procariote Eucariote

70s
5s s0 s tli;s 34 r-proteine

r----f

80s

30s l6s
2 I r-proteine

>-_<

\t

* t liltrt
45 r - proteine

l5s

40s l8 s
33 r- proteine

I-ig.S.29. Compozisia rARN In pro- Si eucariote

5.3.2.4. Acizi rib onucleici de masd micd ( snRN A) La eucariote,in urma procesului de transcriereapare un ARN primar care conline secvenfeinformafionale numite exoni care se vor exprima in proteine precum gi secvenleintercalate,numite introni. AcestmARN primar va suferi un proces de excizie - splicing (vezi Vol II), in urma cdruia intronii vor fi excizatri(indepdrtafi prin secfiuni la ambele capete) iar capetelelibere ale exonilor se vor suda. La acest proces participe o serie de structuri ribonucleoproteice,numite snurps (small ribonucleoprotein particles), in constitufia cdrora intrd catene scurte, cu pdnd la 300 de nucleotide, foarte bogate in acid uridilic. Aceste componente ribonucleoproteice au rolul de a catalizaprocesul, identificdnd 9i apropiind punctele de secfiune gi de sudare, iar pe de alti parte, realizdnd procesulde hidrolizd propriuzis.

Acizi nucleici . Ilidroliza acizilor nucleici

35V

5.4.Hidroliza acizilor nucleici

5.4.1.Hidroliza acidd Eibazicd a acizilor nucleici

o. \
-/

r{

t---o---\--l topo.'
+

,o--,o rn'r',')ri(;ztu)

i
"'\

+
oll

\6.

'**Ho"

l---

t-'-o'--

Fig.S.30.HidrolizttARl{ tn cqtalizd bazicd generald

Acizii gi bazele pot afecta legdtura N- glicozidicd respectiv legdtura fosfodiestericddin acizii nucleici, Datoritd asimetrieilegd,turiifosfodiesterice, la scindareahidroiiticd a unei legdturi fosfodiestericepot rezulta doud tipuri de capete: capetele3' OH terminale, notate prin convenlie cu a,sicapete5' C)Hterminale, notate cu b. Cu alte cuvinte, in functie de legdtura fosfoestericd hidrolizatd,,se vor obline capete 5' fosfat,in cazul a, respectivcapete3'-fosfat in cazul b. ARN-ul, datoritd prezenlei hidroxilului din pozitia 2', este sensibil la ac{iunea hidroxizilor. lonul hidroxil acfioneazd asupra hidrogenului hidroxilic din pozi{ia 2', md.rind nucleofilicitatea atomului de oxigenoT care va ataca atomul de fosfor, cu ruperea legdturii b gi formarea unui diester ciclic. Acest esterva fi hidrolizat cu ruperea fle a legd.turiicu oxigenul legat de pozilia 2' fie legdturii cu oxigenul legat de pozifia 3', rezultdnd final un amestecde nucleozid 2'9i 3' fosfafi (Fig.5.30)ARN-ul este stabil la acliunea acizilor diluagi, in timp ce ADN-ul chiar in prezenfd, de HCI lmM, va suferi reacfii de depurinare, ca rezultat al clivirii legdturilor N-glicozidice ale guaninei respectiv adeninei. Aceastd
o'Acest exemplu ilustreazd,mecanismul de catalizdbazicd generald (vezi capitolul 4)

354

de biochimie,l, Elemente

depurinare are loc datoriti bazicitdfii mai pronunlate a purinelor decdt a pirimidinelor. Prin protonarea nucleului purinic se creeazdun centru incd.rcat pozitiv care atrage electronii legdturii N- glicozidice sfdrgind prin a o rupe. Acest efect nu este observat la ARN, deoarece prin protonarea hidroxilului 2' se echilibreazd efectul atr[gdtor al bazelor protonate. Cunoagterea acestor proprietd{i este deosebit de utili in operaliiie de manipulare ale acizilor nucleici, atdt prin precaufiile de pH care trebuie luate pentru a evita hidrolizele nedorite, cdt gi pentru descompunereaARNnedorit intr-o probd care mai confineADN. 5.4.2.Hidroliza enzimaticd a acizilor nucleici Enzimele care hidrolizeazd, acizii nucleici sunt numite nucleaze.EIe fac parte din clasa fosfodiesteraze\or, reacfia catalizatd fiind aceea de hidrolizi a legdturii fosfodiester dintre doud nucleotide adiacente.De asemenea,dupa pozifia nucleotidelor la care are loc scindarea distingem exonucle'aze, c6.ndse formeazl o nucleotidd, (exciziaunei nucleotide terminale), respectiv endonucleazecflnd are loc scindareaunei legdturi in mijlocul catenei, rezultdnd un amestec de oligonucleotide. Important de relinut cd exonucleazelepot scinda fie legdturi de tip a, (ac{ionA.nd la capitul 3' terminal) fie realizeazdhidroliza legdturilor de tip b la capdtul5' al cateneipolinucleotidice. 5.4.2. 1. Specificitatea nucleaaelor Preferinla nucleazelorfafd de ADN estecaracteristicd ADN-azelor, in timp ce pentru ARN este caracteristic[ ARN-azelor.Dacd. aceastdpreferinfd nu existdenzirnelesunt numite pur gi simplu nucleaze.NucleazeIe pot manifesta preferinfd pentru o secvenfdnucleotidicd dintr-un acid monocatenar,sau bicatenar,fiind notate cu prefixeless respectivds (de la singlestrand;i double strand). De asemenea preferinla nucleazelor se poate manifesta pentru o anumiti baz6,azotatd sau pentru anumite secvenfede patru pdnd la opt baze, cair: cazul enzimelor de restricfie. Exonucleazelepot realiza secvenfialdepolicondensareaacizilor nucleici. Cele mai utilizate exonucleaze utilizate in practica de laborator suntfosfodiesteraza din ueninul de ;arpe care este o ,,a" exonucleazi ce formeazd S'-nucleotide gi fosfodiesteraza din splina bouind care este o ,,b" exonucleazl,formdnd 3'-nucleotide. Ambele pot cliva atat ADN cat (nucleaze). Cele 9i ARN, de unde denumirea generici de fosfodiesteraze doud enzime au o acfiune complementarS.

Acizi nucleici. Hidroliza acizilor nucleici

355

Nucleazele suntinstrumente de lucru pentru disecfia qi manipularea ,,in vitro" Ei ,,in vivo" a acizilornucleici.In Tab.S.4. se prezintdcdteva din nucleazele celemai comunutilizate.
Tab.5.4.Nucleazp utilizate fretvent tn practica de laborator

Fosfodie raz inul ste a dinven de$arpe Fosf od ieste raz a din splina bovine Endonucleaze ARN-aza A (pancreas) ARN-aza din Bacillus subtilis ARN-aza Tr ARN-aza Tz ADN-aza | (pancreas) ADN-aza ll (splind, timus, Sfaphl/ococus aureus) Nucleaza Sl

ADN, ARN ADN,ARN ARN ARN ARN ARN ADN ADN ADN,ARN

a D 0 b
h

incepe dela capiful3'terformand minal 5'-nucleotide incepe dela capetul 5'ter formind minal 3'-nucleotide pirimldinA 3'-POr pwinl 3 -POr guanini 3'-POr 3'-POr adeninl pirimidine gi CliveazA intre purine, secJioneazi dsADN, formAnd 3'OH libere capete oligoprodugi cliveazd doar ssADN, ssARN

b a

ARN-utr A (pmuaticd)

Fig.S.31.

ARN-azeIe sunt mult utilizate in laborator, cea mai cunoscuti fiind ARN-azaA din pancreasul bovin, o enzime de tip ,,b" care cliveaz5.legiturile fosfodiestericede ldnga bazelepirimidinice (Fi9.5.3,1). O particularitate a acesteienzime este termostabilitateadeosebitd., care o face sd reziste chiar la temperaturi de 100"C, fdrd sd-gi piardd activtatea. ARN-azadinBacillus subtilis are o specificitateasemenetoare, diferenfa fiind cd ea cliveazelegdturile fosfodiesterde lAngdbazelepurinice.

356

Elemente de biochimie,l.

ARN-azele sunt respandite in toate materialele biologice. Aceasta creeaz6. dificultdli in izolarea ARN-ului intact. Extrem de sensibil la acpare cd estemARN, de aceeasunt necesareprecaufii ARN-azelor fiunea deosebite. ADN -azelehidr olizeazd. acizii deoxiribonucleici. Dintre acesteaADNaza tip lizolatd. din pancreasul bovin EiADN-aza tip II provenind dintro mare variatate de surse precum splini, timus sau din bacteria StaphyIococus antreus sunt cele mai comun cunoscute gi utilizate. ADN-aza tip I esteo endonucleazl.de tip ,,a" care formeazl,capete3'-OH libere intre purine 9i pirimidine. ln concentrafii mici este utilizatd pentru a introduce semisecliuni aleatoare,cu capete 3'-OH terminale in dublul helix al materialului genetic.Acestaesteun precursor important in oblinerea ADN-ului marcat radioactiv necesarin secvenfierea ADN-ului sau pentru alte scopuri analitice. ADN-aza de tip II este o endonucleazd. de tip 3'-POa care formeazd capete teramestecuri de oligonucleotide cu ,,b" minale. Enzimele de restricfie sunt endonucleaze izolate in special din bacterii, sectioneazddublul helix pe ambele catene.Temenul de 'enzimede restric;ie' este in legiturd cu func1ia protectoare exercitatd in celula procarioti, aceeade a cliva ADN-ul striin pdtruns in celuli, in portriuni mici, inofensive. Activitatea enzimelor de restric{ie poate fi mai complexd decdt a celorlalte nucleaze,prin asociereala func1iahidroliticd gi a unor func{ii de metilare specifici a ADN-ului. Multe dintre enzimele de restricfie necesitd asistenfa energeticd a ATP-ului. ln funclie de acestecaracteristicienzimele de restrictie se sistematizeazdintrei categorii: Tip I: necesiti asistenfa ATP, dar cliveazd dublul helix aleatori de asemenearealizeazi modificdri ale catenei ADN prin intermediul reac;iilor de metilare. Tip II: nu necesite asistenlaATP, nu modificd prin metilare ADN-ul dar recunosc si scindeazd, ADN-ul la secvente precise de 4-6 sau B deoxiribonucleotide. Tip III, se deosebescde tipul I prin recunoa$terea secvenfeide legare. Cele mai utile in practica laboratorului de biologie celulard sunt enzimele de tip II. Aceasta datoriti extraordinarei specificitA$,hpsei de modificare a produsului de hidrolizi gi relativei ugurinfe in separaregi purificare, ceeace le face disponibile comercial.

Acizi nucleici . Hidroliza acizilor nucleici

357

Enzimele de restricgie, cu foarte puline excepfii,sunt de tip ,,a",producdnd capete3'-OH libere.

5"ram GA-A-T-T{rv,t, 3f
tt

3,aaaar GT-T-A-A-CI\^^# 5 Fig.S.32.

Secvenfarecunoscuti, specific[ pentru fiecare tip particular de enzimd.de restriclie are pe ambele catene o structura palindromicdas. De exemplu enzima de restriclie din Escherichiacoli, cunoscute sub numele de cod EcoR[,recunoagtesecven{5hexanucleotidicdprezentatdin Fig.5.32.: De remarcat faptul cd secvenfa celor doud por{iuni este identicd atunci cdnd citirea se facein acelagi senspe ambelecatene5'-3' sau 3'5'. Acesttip de structurdposeddo axe de simtrie de ordinul llScindarea acestesecventese face pe ambele cateneintre G giA (F1g.5.33):

,t 5'w6:-4-a-1-'p-6w3'
rtttl rltttl tttllt

I I

,. .-, {wc t-----> cd(l'

I t

I wC-T-T-i\-n-Cw5

trllltll

+ I

r i W C T T -A-A I

5 A-A-T-T-1-.w3'

I
iws'

,'

Fig.S. 33.Modul de ac1iuneal enzimei EcoRI

Extremitdlile 5' sunt proeminente, pdstrdndu-gi complementaritatea atdt intre ele, dar Eifaln de alte fragmente generatein urrna acliunii aceleiagi enzime. Datoritd acesteicomplementaritafii extremit[filor ele se numesc extremitd.fi sau capete 1'-adeziue. Alte enzime de restricfie, precum Ps/I care recunoa$tesecvenfa 5'CTGCAC-3' gi cliveazd intre A gi G produce extremitdli 3'- ad.eziue. Atunci c6.ndacfiunea enzimelor de restricfie se face in centrul axei de simetrie de ordinul 2, precum in cazul enzimei Ball,atunci nu se vor genera capete adezive,bazele complementare compensindu-se reciproc,

68Un palindrom reprezintd o construclie lexicald care are acelagi sens atunci cind este citit atat de la dreapta spre st6.nga cit gi de la stdnga spre dreapta. De exemplu construcliile ,,radar",,,ana",,,tribund nu birt", ,,elefac cafele",,N{adamin Eden I'm Adam" sunt palindroame.

358

Elemente de biochimie.l,

realizdndu-sein acestmod secfionareadublului helix perpendicular pe axa acestuia. ln Tab.5.5 sunt listate cAtevadintre cele mai comune enzime de restricfie dintre cele peste 1000 caracterizate.Denumirea enzimelor de restrictie se face printr-o grupe de trei litere din care prima este caracteristicf, genului organismului de origine, urmdtoarele doui sunt prescurtdri ale numelui speciilor particulare. Deoareceun anume microorganism poate posedamai multe enzime de restriclie acestea de codificd prin ultimele simboiuri. De exemplu EcoRIsemnificd prima enzimi de restriclie izolatd din Escherichiacoli, tulpina R.
Tab, 5.5. Enzime de restrictie curent utilieate tn laborator

Enzima lzorchizomerio
Alul Aosl
Apl Asul Asull Aval Avall AvAl Bati BamHl Bci' Bgfil BsEll EsSll BsfXl Clal uoel EcoRl EcoRll Fnu4{l FnuDll HaE Haell Haelll Hhal Hindll Hindlll lful, EcoRll I

recunoscuu Secvonla
AGJCT TGCJGCA
CCIWGC

3.tffiit,ii,:17
fdrl capete adezive fdri capete adelve

GJGNCC TTJCGM 6IYCGRG GIGWCC clcTAGG TGGICCA GIGATTC TIGATCA A.IGATCT GIGTNACC cclwGG CCANNNNN],NTGG ATICGAT CTTNAG GJATTC
JCCWGG

Taql Clal,Hpall, Sall, Xhol, Xmal Sau96l adezive fdrtr capete Bctl, Sau3A, Xholl 8glll,Mbol, Xholl BamHl, Sau3A, futlt, Mbol, Xholl BamHl, Bcilt, Mbol,Sau3A,

Asyll, Hpall, fagl Ac:cl, Acyl,

Atul, Apyl Thal

GCINGC cGlcG wGGlccw RGCGCIY

us tuu \rvlJ Jr/

fdrecapete adezive fdri capete adezive ftrd capete adezive fAri capete adezive

Cfol

GTYIRAC AJAGCTT

6e izoschizomerii sunt enzime care recunosc aceleagisecvenlegi cliveazi in aceleagipozi1ii. Specificitatea poate diferi prin extinderea lungimii secvenlei recunoscute. De exemplu MboI gi Satl3.A, recunosc aceegisecvenle5'-GATC-3', pe care o scindeazi la capatul 5' al acidului guanilic, ambele fiind de asemeneaschizomeri cu BamHI care are o specificitate mai mare, recunoscdnd secvenla GGATCC,care o include pe prima. Prin clivare rezultd capete adezive complementare cu ale schizomerilor antemenliona{i.

Acizi nucleici. Determinarea structurii primare a acizilor nucleici

359

Enzima rzoschizomeriss
ilinfl Hpat Hpall Kpnl Mfrlt Sau3/ Mspi Mstl rVofl Psfl Prutt Rsal Sacl Ssll Sacll Sali Sau3A Sau96l sfr Smal Xmal Sphl Ssfl Taql Thal FnuDll Xbal Xhol Xholl Xmal Snral Xmalll Xoll

Secventa recunoscurl

3,1$i,..rfriiJ!"i
fArA capete adezive Iaql Accl, Acy1, Asy'l,Hpall, 8glll,Mbol, Xholl BamHl, Sau3A,

G1ANTC GTTTMC CTCGG ccTAClC JGATC CICGG TGCI,GCA GCJGGCCGC CTGCAJG CAGICTG GTIAC GAGCTIC CCGCTGG GITCGAC IGATC GIGNCC GG0CNNNNINGGCC CCCIGGG GCATGIC GAGCT1GG TICGA CGTCG

flri capete adezive

fdrdcapete adezive l6ri capete adezive

Xhol Aval, Xholl BanHl,futil.Mbol,Sau3A,

adezive flri capete

Asyll, Hpall, Taql Accl, Acyl, farecapete adezive Xhol Aval, Xholl Sau3A, BamF{i, fu|.l,Mbol, Aval

rjcTAGA
CITCGAG WIGATCW
v jvvuuu

c.iGGCCG cGArclG

5.5. Determinarea structurii primare a acizilor nucleici

Stabilireastructurii primare a unui acid nucleic este o problemd mai complicatA decit in cazul unei catene polipeptidice. Pe lingd importanfa cognitivApurA a structurii primare, aceastadevine indispensabild in tehnicile de manipulare a materialului genetic. Principial existd doud metode: metoda enzimaticd a lui Fred SANGER gi metoda chimicd dezvoltatd de Walter GILBERT gi Alan MAXAM. Ambele metode opereazAcu cantitAfi extrem de reduse de ADN (de ordinul nanogrameleor) astfel incdt tehnicile analitice de separare 9i detec{ietrebuie si asigurefidelitatea controlului procesului. l. Metoda enzimaticd mai este cunoscutd gi sub numele de metoda termindrii premature a cateneisau metoda dideoxi. Principiul acesteia este oblinerea prin mecanisme de replicare a 32P, care se terunor monocatene scurte de ADN, marcate radioactiv cu mina prin 2',3'-dideoxinucleotide. Aceste fragmente sunt separate

36A

Elemente de biochimie .I,

electroforetic, scanate gi pe bazainterpretf,rii hirfii oligonucleotidice se determindstructurafragmentuluinou sintetizat,identic in acelasisens cu fragmentuloriginal. s 5q1i16616:p16i3' catena de secvenlat 3 h+qr s' primer
PPP

dXTP
f ttrltr I
\ q r r u f

Seguenase 2
r-omnnnont i

ddXTP

cli nr ro

este,+zP morcot)

ddATP

ddCTP
Lr-tl--t-J-t

ddTTP cHle alcr rlrrrl cH lnneecr GAAcr lrrtrrrrrrrl

ddGTP
ddGAACT
L-J--I-IJ

cLCr onlcr Wgggffl d#9991sff-9.]

dG crelacr r--l-LJ--f-t-Ll cAAcr cLGecr

trr'rrrlr

c LLG rn n e o c T G A A c r ' ' | | | | | | | | | |

--\i\

__\_..\ -'--\ A

\ \

c
g

Sens mrgror

T A A
a:

secvenpo complementoro celei coutote in sensul sintezei

(^' T

Fig.S.34. Menda eraimaticd (SANGER) de secvenlarea catenelorADN

Concret, are loc in cadrul a patru experimente paralele policondensareaunui amestec de nucleozid trifosfafi [XTP),dintre care unul este marcat radioactiv, pentru izualizarca finald a fragmentelor. Fiecare mediu va conline c6,te un tip de 2',3' dideoxinucleotidi. Aceasta,neposedind grupare 3'-OH terminali, va putea fl inglobatd aleator in secvenfa nou sintetizatd.,doar ca ultimd componentd, deoarece sinteza

Acizi nucleici . Determinarea structurii primare a acizilor nu.cleici

t6r

noii catene fdcfindu-sein sensul 5' -+ 3' urmetoareanucleotiddnu se mai poate lega (neavdndla ce). Policondensarea serealizeazd cu o ADN polimerazi special destinatd acestui scop SEQUENASE2o'care este in fapt ADN polimeraza din bacteriofagul T7, modificatd prin tehnici de inginerie geneticd. prin inactivarea activitililor exonucleazice. Ca orice ADN polimerazd.,aceastdenzimd necesitdun primer, care se adaugd inigial.Metoda folosegtedrept primer o secvenfd oligodeoxiribonucleotidica. Concentralia2',3' dideoxinucleotidelor estealeasd astfelincdt frecventa introducerii acestei molecule sd nu fie prea mare, respectiv aceastdsubstanld sa poatd.fi intercalatd in orice pozifie corespunzdtoare. Dacd valoareaconcentraliei ar fi prea mare catenele sintetizatear fi prea scurte, iar dacd corlcentrafia ar fi prea mic[ ar exista riscul neincorporarii gi deci al imposibilitalii stop[rii reacliei. Dupd sintezd,amesteculde fragmenteledin flecareexperimentsunt supuse electroforezeipe aceeagiplac[, dar confinutul fiecirui experiment va fi plasat tn zone diferite. In funcfie de mobilitateaelectroforetici dependentdde mdrimea fiecirui fragment are loc distribuireabenzilor pe suprafa{agelului. utilizdnd proCitirea electroforegrameise face prin autoradiografie, prietatea fosforului marcat de a impresiona o placi fotosensibild. Marcdnd atdt pe linia de start cdt gi pe verticald (in funcfie de lungimea fragmentului) tipul dideoxinucleotidelorutilizate, citind electroforegrama in sensul scdderii mobilitefii electroforetice, vom avea secvenfa primard a cateneicomplemetare celeisupuseanalizei(in sensul5'-) 3', evident mai pufin primerul). Schematic, rnersul secvenfdriieste prezentat \n Fig. 5.34. O variantd a metodei SANGER utilizeazl. cu bune rezultate arabinoza, care este epimerul C-2' 'dlribozei, care se bucura de aceleagi proprietafi ca gi dideoxiriboza. Prin utilizarea unor primeri marcati, prin atagarea covalentd de compugi fluorescenfi metoda de secvenlarea putut fi automatizatd. La o operafiune de secvenfarese lucreazi cu patru tipuri de primeri, care diferd prin colorantul atagatcovalent. Fiecaretip de primer va fi asociat cu dideoxinucleozidtrifosfatul corespunzdtor. Dupd ce procesul de sintezd a fost terminat in fiecare din cele patru experimente paralele, probele se combind gi se supun electroforezei.Electroforegramaeste scanati ulterior cu un fascicol laser, care excitdnd fiecare colorant ii va provoca fluorescenfa intr-o regiune particulare a spectrului. Radialia

362

Elementede biochimie .1,

emisd, va fi captati de c5.tre o unitate de detecfie rezultatul fiind interpretat de ci,tre un software specializat. Secvenfaob{inutd cititd d.ela coadd.lacap (in ordinea cregteriimobilitafii electroforeticesau scaderii masei fragmentelor) este secvenfa complemetari celei ciutate. Viteza de lucru a unui secvenforautomat estede cca. 10000baze I zi. lI. Metoda chimicd utilizeazd.tot un ADN monocatenar, marcat la (cel mai adesea 5'-) cu fosfor radioactiv. Catena este apoi un capdtT0 scindatd aleatoriu, dar in puncte pentru care reactivii utilizali prezintd regioselectivitate.Sunt disponibile reacfii specifice pentru guanini gi reacfii specifice pentru bazele purinice. Prin diferenfa se poate stabili pozilia resturilor de adenind. De asemeneaeste disponibil5 o reacfie pentru pirimidine (C + T) care, condusfl in condilii particulare, devine regiospecificdpentru citozind. $i in acest caz, prin diferenfd se poate atribui pozitriatiminei. II.l. Clivarea la nivelul acidului guanilic, (Frg. 5.35.) se realizeazd prin tratarea catenei cu dimetilsulfat. Acestametileaz.a N7 din structura guaninei, crednd o sarcin[ pozitivi extinsd.ln prezen;a ionilor HO Ei a piperidinei are loc scindarea legaturii B-9 din nucleul purinic cu formarea unei grupdri carbonil gi ulterior desfacerea legdturii N-glicozidice precum gi a celei serniacetaiice, distrugdnd complet nucleotida inifiali. lndepdrtarea resturilor se face prin doui reacfii de p-eliminare, realizate datoriti ionului HO-. ln acestmod se vor obline doud fragmente, care vor poseda fiecare cdte o grupare fosfat la locul indepdrtdrii restului de acid guanilic (3' - fosfat gi 5' fosfat). II. 2. Clivarea simultand la nivelul acidului adenilic qi guanilic se prin tratamentul slab acid al fragmentului de ADN. In aceste realizeazd condi;ii are loc depurinarea.f)istrugerearestului de ribozd are loc la pH = 2 in prezenfdde piperidind Eiulterior de I{O-.

70matcarea se realizeazl. pe fragmentul initial de ADN, dublu catenar, prin utilizarea unei polinucleotidkinaze dintr-un fag, gi ATP, la care ultimul fosfor, (cel neadiacent nucleotidei) este 32P. Enzima transferd doar ultimul rest fosfat pe ambele capete 5'terminale ale nucleotidei.

Acizi nucleici . Determinarea structurii primare a acizilor nucletct

363

HO+

?
'll nn/\,{ Fn, *--/l ) ^

",--\--A",l,t=o

trr,J

o:lo:,|,-o

It
("" cH=p( \

r{o

6^.1fl,,)<'t,
tl:t'"r,r-*/

)H:,J
o:P'

\J

i o:i-o

?.

i-'

Fi9.5.35.Cliuarea cateneiADN la niuelul resturtIor de acid guanillc

sebazeazdt II. 3. Clivarea simultand a bazelor pirimidinice (Fi9.5.36.) pe utilizarea hidrazinei ca reactiv cu regiospecificitate corespunzitoare. Acest reactiv, printr-o adifie de tip Michael, urmatd de o substitu{ie (adifie eliminare), va favoriza actiunea piperidinei, care, precum in exemplul anterior, va excizafragmentul glucidic modificat: II.4.Clivarea regiospecifici, prin hidrazinoliza acidului citidilic. Dacd reacfia anterioard se realizeazd in prezenta de NaCI 2M, are loc protejarea timinei de actiunea hidrazinei, gi prin urmare atacul se va reallza doar asupra acidului citidilic care va fi excizat in totalitate, lasdnd ca si in cazurile precedentelibere cele doud capetefosfatate. lntocmai ca in cazul secvenfdrii enzimatice se lucreazd, cu patru experimente diferite. ln fiecare experiment, concentra{ia reactanfilor se stabilegteastfel incdt sd se realizezeun clivaj per molecul[ de ADN. Deoarecein fiecare experiment, existd insd inilial mai multe molecule identice de ADN, dupd contactul cu reactivii de clivare, ,,masade reac|ie" va confine un amestecde fragmente de lungimi diferite. Amestecui rezultat din fiecare experiment va confine intreaga serie omoloagi de fragmentediferenla dintre doi compugi omologi fiind de o nucleotidi.

364
n

Elemente de biochimie .1.

o:f

I r
[/o! \./
o:P-o-

*,. "i'
.4")

tl

il

o I

I I

I:ig.5.36. Clivarea la nivelul bazelor plrimidinice

Acest amestecpoate fi separat prin electroforezi. Tot ca 9i in cazul pe aceeagiplacd de electroforezd secvenferiiprin metoda lui SANGER, vor fi depuse separat amestecurilede fragmente rezultate de la fiecare experiment.Vizualizarea se va face tot prin autoradiografiere.Pe autoradiografievor fi vdzute doar fragmentele care pastreazi restul marcat (dacdestemarcat capdtul5' terminal, vor fi vizualizatedoar fragmentele care conlin capdtul 5' terminal gi reciproc. Evident fragmentele nemarcatevor fi invizibile). Un aspectinteresant este cd baza care se citegtepe placa autoradiograficd nu este prezente, ea fiind excizatl..Astfel fragmentul cel mai mic va con{ine obazd.neidentiflcatd.

5.6. Sintezape suport solid a oligonucleotidelor

Oblinerea de fragmente oligonucleotidice prin sintezi a devenit o necesitateodat[ cu dezvoltareatehnicilor de ampliflcare prin polimerizare in lanf, cu necesitateaoblinerii sondelor oligonucleotidicemarcate, sau pur gi simplu pentru scopuri investigalionalelegatede structur5.. Dacd sinteza MERRIFIELD a fost un model de strategie sinteticd, adoptat in cazul nucleotidelor, dificulti.file concrete cauzate de reacti-

Acizi nucleici, Sintezape suportsolid a oligonucleotidelor

365

vitatea mai mare a reactivilor nucleotidici folositi, au facut necesare adoptareaunor modalitdfi concrete de sintezi. principial sunt necesare mdsuri de blocare a gmpelor reactive, de formare a legiturilor fosfodiestericede joncfiune dintre nucleotide, de deblocarea grupdrii care urmeazi a participa la formarea noii legituri, iar final, indepdrtarea tuturor grupdrilor de blocare. In prezent se lucreazd, ca gi in cazul catenelor oligopeptidice, pe ,,automatede sintezi" de gene capabile si realizezecatenecu pdndla 150de nucleotide. f)in mai multe variante, prezenti.m varianta fosforamiditicicareeste una dintre cele mai utilizate. Schemade sintezd prezentatd in Fig. 4. Are urmitoarele particularititi: r Sensulde sintezdeste3'- 5' (opussensuluibiosintetic) r Prima deoxiribonucleotidd se afl6 atagatd de un suportinert, insolubil, de reguld sticld cu pori controlafi. o Bazele azotateale tuturor nucleotidelor sunt protejatela grup6rile amino prin benzoilare, in cazui adeninei gi al citozinei, gi prin izobutirilare in cazul guaninei. I Gruparea5'-OH se protejeazd.printritilarecu clorurd de dimetoxitritil. Reacliaare cinci etape: i. f)etritilarea capdtului 5' terminal al nucleotidei situati pe suportui solid. Aceastase realizeazd cu acid tricloroactic. 2. Reacfiade cuplare. Capdtul5'-OH terminal ai nucleotidei va reacfiona cu nucleotida (monomer). Acest compus are atagat esteric la gruparea3'-OH un rest de N,N'-diizopropil,metoxi (sau 2-cianoetiloxi) fosforamiditic. Grupdrile amino ale bazei azotate sunt blocate, de asemenea este blocatd,prin tritilare gi gruparea 5'-OH. Reacliaare loc in catalizdacidd realizat6de tetrazol. Spre deosebire de sinteza Merrifield, chiar in condiliile unui exces de monomer, reacfia nu este totale, rdmdndnd grupd.ri 5'-OH terminale nereacfionate. 3, Blocareagruparilor 5'-OH terminale nereacfionate. Aceasti operase face cu prezenfd N'metilimidazol anhidrida aceticd, in de fiune cu funcfie cataliticd. 4. Oxidareacu solufie de iod a fosforului fosfidic la fosfor fosfatic.Daci urmeazd addugareade noi nucleotide se reia ciclul de la prima etap6.Dacd nu, se trece la ultima etapd.

366

Elemente de biochimie .1,

ll
MrActt"
N,

la,c
O nt\oA*"t\
A, sj

ltt

I'il-

A
\

ct\4lr

t_..-\
\-/

ab,

derivat.

fosfor
s1

'd#\za t-.--\
@

Bb,

cl-t_cl-.t"
HN

tet ra zoI

cl-t-ol" grJ

.-<*b

,{rY

\wf L--\
r,nof,eltrrinors oe pe suport >-/ ccncGH

VO
cHpz-ro

o'"i,iioiliJ[dn--.: ^-o4o ol9'\o\

'l---o--j* F+^,r

>-/

L\f ->J

Fig.5,37.Schemade sintezd chimicd, pe supart solid, aftagmentelor oligonucleotitlice

5. Deprotejarea tuturor grupedlorblocatedin moieculd prin tratarecu solutie de amoniac.

Acizi nucleici . Sinteaape suport solid a oligonucleotid.elor

5.6.3.Amplificarea (multiplicarea enzimaticd) a fragmentelor ADN metoda PCR (PolimeraseChain Reaction sau policondensareacontrolatd enzimatic) Aparifia acestei metode a revolufionat rnetodologia manipuld,rilor genetice.Pe aceasti cale devine posibild ob{inereaunui mare numir de fragmente identice plecdnd de la un fragment inilial aflat in cantitate extrem de redusS.Amplificarea este de ordinul miliardelor de ori, iar timpul in care se realizeazd. aceastaeste de cdteva ore. A fost inventatd de Karv MULLiS in 1984.

capal5'lormnal

-?r
I

denaturare

ata'ae pimer, Ecirc, denanvpolicondensaE

Emnarc ooliconcjensaq fagmnb

l{ragmnto

tl tl
|

I lhrid

It\ -_
|tJ*n*""
| de inbres

prmri

/r

t'

It

l16ro I as dispune dc prinri)

I l(rntu

il
I tl

-1,
+l,r

ill ttl

fagmnl dofrllb(evof roglsi i 6! trEj mro pfoporlr h mlbculhoD

VJ

lll

Fig.S.38. Schema de principiu a nhnicii PCR(polyrwrase chaln reaction)

368

Elemente de biochimie .I.

AtAt principiul cdt gi realizarea practici sunt extrem de simple (F49.5.38.): Un fragment dublu catenar ADN va servi, dupi disocierea celor doud catene,drept dubld matrifa pentru ADN-polimerazd,in prezen[a unor fragmente oligonucleotidice cu rol de primeri. Primerii au o lungime de 20 -30 de nucleotide gi sunt complementari cu capetele 3'0H terminalet'. Ei se introduc in rnediu intr-un mare exces fati de fragmentul destinat amplificarii. lntr-o primd etapd are loc incdlzirea amesteculuila 95'C timp de 15 s, ceea ce duce la disociereatotala a celor doud.catene ale duplexului ADN. Prin rdcire rapidd la 54oC,se va realiza imperecherea monocatenelor intacte cu primerii, datoritd largului excesal acestora.ln a treia etapd, prin actiuneaADN polimerazei are loc sintem catenelorcomplementareastfelincdt populafia ADN destinata amplificarii se va dubla. Sintezanoilor cateneare loc la 72"C timp de aproximativ30 s. Sensulde sintezdal noilor cateneeste5' - 3', sens dictat de mecanismul de funcfionare al ADN polimerazei (vezi replicarea). O noud incdlzire la 95oC, va disocia duplexurile existente,reluAndse in acest mod un nou ciclu de sintezd.Teoretic numdrul de indivizi care pot fi obfinufi de la o monocateni este de 2n unde n este numirul de cicluri. Metoda a putut fi pusi la punct dupd descoperirea de ADN polimeraze provenind din bacterii termofile. Cea comun utilizatd este taqADN-polimeraza provenind din Thermusaquaticus.Aceastdbacterie trdieqtein ape termale la aproxinrativ65oC. Practic,cu toti componenfii mediului de reacfie, amplificarea presupune doar realizarea ciclului termic. De aceea metoda a fost pusi. la punct odati cu realizareaaparatelor de ciclare termicd pentru realizarea succesiunii:

L,,)
7r Primerii sunt fragmente monocatenare de ARN pe care are loc ata$area secvenfei oligo- sau polinucleotidice care va fi sintetizat6.. Vezi ln vol. II replicarea, Uneori, primerii sunt complementari cu o po4iune neterminal{ a catenei care serve$teca matritd. Evident sinteza monocatenei ADN, catalizatd de ADN polimerazd.se va face plecAndde la acegtiprimeri in sensul5'-3'al noii catene,respectiv3'-5'al cateneimatrili.

tuo"

Acizi nucleici . Sintezape suport solid a oligonucleotidelor

369

Dintre caracteristicilecare fac din metoda PCRun instrument redutabil in mina specialiqtiloramintim: - nu este necesari cunoastereasecvenfeiintregului fragment destinat amplificdrii, ci doar a capetelor 3' terminale ale celor doud catene, pentru oblinerea primerilor. Mai mult secvenfele cunoscutepot se nu fie capetele efective ale catenei, ci sd se situeze undeva in interiorul acestora.ln acestcaz, amplificarea se va face plecind de la acestefragmente spre interior. o iteza rnare de sintezd r specificitate conferiti de acuratefeahibridizirii la temperaturd ridicatd (54'C). Introducerea in uzul curent al acesteitehnici a simplificat extrem de mult proceselede clonare gi de secventarea ADN. Mai mult, tehnica PCRa revolufionat procedeelede diagnosticprecoce,prin identificarea unor fragmente de ADN viral sau bacterian. Astfel poate fi demonstratd. prezenla virusului SIDA inainte de aparifia rdspunsului imun. Detecfia acestorfragmente se face la concentralii incredibil de mici ale acestora, deci in fazeleincipiente ale maladiei. De asemenea testelede stabilire a paternitdfii, precum gi de identificare a unor indivizi dupd urme extrem de reduse cantitativ reprezintd alte aplicafii ale tehnicii PCR in lumea medicinii legale, pentru a aminti implicaliile oferite de identificarea modificdrilor mutafionale ale genelor, utilizate in diagnosticul precoce al cancerului dar gi in controlul terapiei acestuia. Limitirile metodei fin de lungimea fragmentului supus amplificdrii, care nu poate fi mai mare de 10000 pb, precum Ei de existenfa primerilor. Totugi progresele fdcute in sinteza fragmentelor oligonucIeotidicelasd deschisun viitor activ metodei PCR.

Bibliogrofie selectivi
Bibliogafie generald r Alberts,B. Bray, D,, Lewis,J. Raff M., Roberts,K., Watson,I.D. 1994, Molecttlar Biology of the Cell, 3rd ed., Garland Pub. Inc., New-York, London o Apps, D.K., Cohen, B.B, Steel, C.M., Biochemistry,1992; Bailliere Tindall, London o Becker, W.M., Reece,I.B., Poenie,M.F. 1995; TheWorldof the Cell,3rd ed., Benjamin i Cummigs Pub. Menlo Park,Reading,New-York o Campbell, M.K. 1995, Biochemistry, 2nd editiory Saunders College Pub, Philadelphia r Gdrban, 2., 1996, Tratat elementar de biochimie, Ed. Mirton, Tirni9Oara r Goodwin, T.W., Stumpl P.K., Mercer, 8.I., 1982,Plant biochemistry, Znd edition,PergamonPress r I-ehninger, A.L. 1987,1992, Biochtmie, Ed Tehnicd,vol 1 gi 2, Bucuregti r Neamfu,G., Cimpeanu,Gh., Socaciu, C. 1993, Biochirnieuegetala,Ed. Did gi Ped.Bucuregti, r Rawn, I.D. 1989,Biochemisrry, Neil PattersonPub., Borlington, North Carolina r Stryer,L, 1995, Biochemistry,4th ed.;W.FI. Freeman& Co.,NewYork o Tdrmure,C. 1996,Biochimiestructurald;i metabolicd,YolI., Ed. Dacia, Cluj-Napoca o Voet f)., Voet I.G. 1995, BiocherntstryZnd ed.,John Wiley & Sons,New York t Zubay G.L.,ParsonW.W.,Vance D.E. Iggb, Principles of Biochemistry; \,Vm. C. Brown Pub.Dubuque,Iowa Capitolul l. r Dumitriu S., ed. 1995, Polysaccharides in Medicinal Applications, Marcel Dekker,Ink,, Nern,York, Basel, Hong Kong o El Khadem, Hassan Saad, I9BB, CarbohvdratechemisW, Academic Press,SanDiego

Elementede biochimie .I.

r Gabius, H.J., Gabius S., lgg7, Glicosciences, Chapmann & Hall, Weinheim r Hook, M., Kjeleen, L. Iohansson, S., Robinson I. lg84, Cell_Surface Glycosaminoglycans, Ann. Rev.Biochem. 53:B4T r Neamfu, G., Irimie, Fl. 1991,Fitoregulatori de crestere,Ed.ceres, Bucuregti Capitolul2. r Op der Kamp, l.A.F.1g7g Biochem.48: , Ann. Reu. 47 r singer, s.I. Nicholson, G.L. 1972, The Fluid Mosaic Mod.et of the structureof Membranzes, Scienc e, IZ S, 720 o Stoffel, W. Sfingolipids,lgTl,Ann. Reu. Biochem.4O:57 o unvin, N. Henderson, R, tg14, The structure of proteins in biotogical membranes, SciAm., 23078 Capitolul3. s Bantca de proteine in format pdb. (protein Data gank) la adresa: http; / /www.pdb.bnl.gov/pdb-bin / pdbmain r Branden, c., Tooze, I. lgg1, Introduction to protein Structure,Garland Publishing, New York creighton, T.E. rgg}, proteins, znd edition, W.I{. Freeman& Co.,NewYork r creighton, T.E. 199o, Protein function, a practical approa.ch, 2nd edition, IRL Press,Oxford, New-york, Tokyo o creighton, T.E. rgg0, Protein structure, a practical approach, Znd, edition, IRL Press,Oxford, New-york, Tokyo r cuiban, Fl., Lupea, A. x. 1g8g,studiul structurii;i sintezapeptidelor, Ed.Academiei,Bucuregti r Peakman M., vergani D. lggz, Basic and clinical Immunologt, churchill Livingstone New-york, Edinburgh, London, Madrid, Melbourne, San Franciscoand Tokyo r Programul de vtzualizare moleculard Rasmol, care poate fi oblinut gratuit la http :/ / www. umass. edu/ microbio / rasmol/ Capitolul4. r Anderson,V. E.; LaReau,R. D. ,,HydrideTransfer catalyzed by Lactate Dehydrogenase Displays Absolute Stereospecificity at C4 of the NicotinamideRing,"J.Am. Chem.Soc.lgBB, t10,3695_3697.

Bibliografie selectiua. Sinteza, pe suport solid a oligonucleotidelor

373

r Bergmeyer,H.U. Gawehn, K. 1978,Principles of Enzymatic Analysis, VerlagChemie,Weinheim, NewYork. r Cojocaru,D.C. 1996,Biochimia vitaminelor, Ed. Gama,IaEi r Cornish-Bowden, A. 1995, Fundamentals of Enzyrne Kinetics, Rev. Ed., Portland Press,London r DeTar,D. F., Binzet,S.,Darba P.,I. Org.Chem,1985,50, 2826-2836 r Dixon, M., Webb, E.C. I979, Enzlmres, 3rd Ed.,AcademicPress,New York o Fersht, A. 1985, EnzvmeStructureand Mechanism,2nd Ed.,Freeman, NewYork., o Irimie, Fl. Morar, A. Bojin M., Catalytic antibodies, Studia Univ. Babeg-Bolyai, ser.chem 1995,40,209-252 r Neamlu, G. 1996,Substan{enaturale biologic active, Vol.I Vitamine, Ed. Ceres, Bucuresti Capitolul5. andbiologt Thechemistry o Ricb,A, Nordheiln,A..WangA. H.-J.1,1984, 791 Biochem., 53, Rev. left handed Z-DNA, Ann. of o Nifd-Lazir M, 1994,Tehnica reacyieide polimerizare tn lanl, St. cerc. biochim.37:l-2,533