1

rotoco|e expr|menta|





I] ur|f|cat|on de |'nmog|ob|ne

I] ur|f|cat|on de |'nmog|ob|ne
a. Lavage des bllles de purlflcaLlon

- A l'alde de la 200, a[ouLez 180L de 1ampon dans le Lube !"#$%&'$() " eL dans
le Lube !"#$%&*)#+ ou !"#$%&,)--$. eL melangez en les LapoLanL.

- CenLrlfugez les deux Lubes !"#$%&'$() " eL !"#$%&*)#+0,)--$. pendanL 10
secondes a l'alde de la mlcrocenLrlfugeuse.

12%3&(45"#$+4#
$% &'(')* +,('--%- .' ()/-0/%12-)345%4*% *'1* 647%..% 1% *0)2 ,64).)8-,% 9+%4: 248%* +%
(;(% <0.4(% .741 %1 3'/% +% .7'42-% ==>
?%-(%@ .% /04<%-/.% +% .' ()/-0/%12-)345%4*% '<'12 +% .' +,('--%-A
B22%1+%@ $674#)+$8.6.2+ .7'--;2 '<'12 +704<-)- .% /04<%-/.% =

- Apres cenLrlfugaLlon, les bllles formenL un culoL au fond du Lube eL le Lampon se
Lrouve sur la phase superleure. Cn appelle ceLLe phase le surnageanL.

- Avec voLre 200 reglee sur 200L, asplrez le surnageant sans asplrer le culoL de bllles
eL Lransferez-le dans le Lube 945:.+( ". 8eallsez ceLLe eLape pour les deux Lubes
!"#$%&'$() " eL !"#$%&*)#+0,)--$. .

;++.2+$32 < 2. 7)( 7#4=.8.# =.( >$==.( =3#(?". 83"( #.+$#.@ =. ("#2)-.)2+ A B$ 83"( )8.@
7#383?"4 "2 +3"#>$==32C 2D:4($+.@ 7)( < 5.2+#$%"-.# < 23"8.)" 73"# 5"=3+.# =.( >$==.(E

b. llxaLlon de l'hemogloblne sur les bllles de purlflcaLlon

- A l'alde de la 200, prelevez 40L de l'echanLlllon du Lube L|sa eL Lransferez-le sur
les bllles de purlflcaLlon dans le Lube !"#$%-L|sa .

- lalLes de mme pour l'echanLlllon du Lube *)#+0,)--$. , que vous Lransferez sur
les bllles de purlflcaLlon dans le Lube !"#$% *)#+0,)--$. .

- 1apoLez d||catement eL regulleremenL les Lubes pendanL deux mlnuLes pour
melanger les deux phases.

;++.2+$32 < 2. 7)( +#37 F (.53".# G =.( +">.( 73"# 48$+.# ?". =.( >$==.( 2. (. 53==.2+ <
=) 7)#3$ H .==.( (.#)$.2+ 7.#9".(I

- CenLrlfugez les deux Lubes pendanL 10 secondes a l'alde de la mlcrocenLrlfugeuse.

J".==. .(+ =) 53"=."# 9.( >$==.( .+ 9" ("#2)-.)2+ )7#K( %$L)+$32 M

- Asplrez 40L de surnageant avec la 200 eL Lransferez-les dans le Lube 945:.+( G.



nb
Chaque b|nme a reu deux chant|||ons de sang pur|f|er : ce|u| de L|sa et ce|u| provenant de son
frre 8art ou de sa smur Magg|e. Vous a||ez pur|f|er ces chant|||ons af|n d'en extra|re |'hmog|ob|ne
et de suppr|mer |es autres prot|nes contam|nantes.
Vous comparerez ensu|te |es hmog|ob|nes des d|ffrents chant|||ons en |es sparant sur un ge|
d'agarose. Vous pourrez a|ors conf|rmer |e d|agnost|c de L|sa et dcouvr|r s| 8art ou Magg|e sont
porteurs de |a ma|ad|e.
Autres
prot|nes


2
c. Lavage des bllles de purlflcaLlon

- Avec la 200, a[ouLez 180L de tampon dans chacun des Lubes eL melangez en les
LapoLanL.

- CenLrlfugez les deux Lubes pendanL 10 secondes a l'alde de la mlcrocenLrlfugeuse.

- Avec la 200, prelevez 180L de surnageant eL Lransferez-le dans le Lube
945:.+( G.

N8$+.@ )>(3="6.2+ =.( +3"#>$==32( ("(5.7+$>=.( 9. #.6.++#. =.( >$==.( .2 (3="+$32E

O4#$%$.@ =D)>(.25. 9. +3"+ ("#2)-.)2+ ("# =.( >$==.(E B$ 245.(()$#.C #.&5.2+#$%"-.@ .+
7#4=.8.@ =. =$?"$9. #.(+)2+E


d. LluLlon de l'hemogloblne purlflee

- Avec la 20, a[ouLez 20L de soluLlon d'|m|dazo|e (= l'eluanL) dans les deux Lubes
!"#$%&'$() " eL !"#$%&*)#+0,)--$. .

- 1apoLez les Lubes pour melanger.

- CenLrlfugez les deux Lubes pendanL 10 secondes a l'alde de la mlcro-cenLrlfugeuse.

J".==. .(+ =) 53"=."# 9.( >$==.( .+ 9" ("#2)-.)2+ )7#K( 4="+$32 M

;++.2+$32 H P. 7)( +#)2(%4#.# 5. ("#2)-.)2+ 9)2( =. +">. F Q45:.+( G AA

- Avec la 20, Lransferez les 20L de surnageant du Lube !"#$%&'$() dans le Lube
vlde annoLe N=")+&'$() , falLes de mme pour le surnageanL !"#$%&*)#+0,)--$.
dans le Lube annoLe N=")+&*)#+0,)--$. .



nb
nb
Im|dazo|e
= |uant
=


3
+
-
II] M|grat|on sur ge| d'agarose













1] rparat|on des chant|||ons

- Avec la 20, a[ouLez 4L de b|eu de charge dans les deux Lubes N=")+( " alnsl
que dans les deux Lubes d'echanLlllons de deparL (non purlfles) L|sa , *)#+ G
3" F ,)--$. G.

- 8len homogenelser en LapoLanL.

;8.@&83"( 'D45:)2+$==32 9. *)#+ 3" ,)--$. MMM


2] Chargement du ge| d'agarose
A falre en classe enLlere :

- 8eglez la 200 sur 24L eL deposer les 4 chant|||ons dans 4 pulLs du gel
d'agarose.

R.67=$((.@ =. 7=)2 9. 947S+C .+ 23+.@ =D3#9#. 9)2( =.?".= 83"( )8.@ 9473(4 83(
45:)2+$==32( A


3] L|ectrophorse

- verlflez que les depLs se slLuenL du coLe du ple negaLlf, puls reglez le
generaLeur sur 230v eL demarrez la mlgraLlon.

- verlflez que le couranL passe en observanL la presence de bulles au nlveau des
elecLrodes.

- Lorsque la mlgraLlon esL Lermlnee, arrLez le generaLeur eL vlsuallsez les
dlfferenLes bandes.



Maintenant purifis, vous allez faire migrer les chantillons dhmoglobine sur un gel dagarose.
Le but est de mettre en vidence les diffrentes formes dhmoglobine prsentes dans les chantillons des
membres de la famille : lhmoglobine A, saine ; et lhmoglobine S, portant la mutation.
La charge globale de lhmoglobine est lgrement ngative lorsquelle est se trouve en condition basique
(pH > 7). Soumise un champ lectrique, lhmoglobine se dplacera vers le ple positif.

Pour comparer les diffrentes formes dhmoglobines (Hb-A et Hb-S), vous utiliserez un gel dagarose.
Il sagit dun milieu glos qui, en se solidifiant, forme un tamis. Vous dposerez les chantillons sur une
extrmit du gel que lon soumet au champ lectrique.
Les deux formes dhmoglobines ont un poids molculaire quasiment identique, mais la forme A possde
plus de charges ngatives que la forme S.
Quelle forme dhmoglobine migrera le plus loin travers les mailles dagarose ?

Pour alourdir les chantillons ainsi que pour suivre lavance de la migration, les chantillons
dhmoglobines purifis sont mlangs du bleu de charge.