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Analyse de La Fraction Phénoliques Des Huiles D'olive Vierges PDF
Analyse de La Fraction Phénoliques Des Huiles D'olive Vierges PDF
169-196
Article original
Introduction
Lhuile dolive vierge est obtenue uniquement par des procds physiques (lavage, broyage,
malaxage, centrifugation, dcantation...) dans des conditions notamment thermiques qui n'entranent
pas d'altration de l'huile. Ces procds la diffrencient des autres huiles alimentaires qui, pour la
grande majorit d'ente elles, sont raffines. Les procds mis en uvre lui confrent une
composition originale avec environ 98% de triglycrides et 2% de composs mineurs. Ces derniers
appartiennent des familles trs diverses telles que : hydrocarbures (avec une prpondrance du
squalne de 0,3 1,2 g/100g), tocophrols, strodes, alcools aliphatiques, composs volatils,
composs phnoliques
Les composs phnoliques, improprement appels souvent polyphnols , sont responsables de la
bonne stabilit loxydation des huiles dolive vierges. Outre leur proprit anti-oxydante, ils
de la varit de l'olive ;
du degr de maturit des olives (la teneur baisse avec la sur-maturation des olives) ;
du niveau dinfestation des olives par la mouche Dacus oleae [1] ;
du climat ;
de la qualit du sol ;
du procd d'extraction utilis pour sparer la phase huileuse de la phase aqueuse ;
des conditions de conservation de l'huile
Diverses techniques ont t mises en uvre pour lanalyse qualitative et quantitative des composs
phnoliques :
-
galement lors de la trituration des olives et entranent la formation de composs qui contribuent
aux armes et la saveur de l'huile.
En gnral, les huiles d'olives fruit vert obtiennent les notes les plus fortes en dgustation car
elles ont des fruits plus intenses et des armes plus complexes que les huiles fruit mr et
fruit noir . Ces caractristiques sont dues leur forte teneur en composs phnoliques,
aldhydes, alcools, alcnes Cependant, une trop grande concentration en phnols donne une
amertume excessive et dplaisante, gnralement peu apprcie par les consommateurs bien quil
sagisse dun critre de "qualit" pour lhuile.
Les alcools phnoliques
OH
OH
OH
CH2-CH2-OH
CH2-CH2-OH
Hydroxytyrosol
2-(3,4-dihydroxyphnyl)-thanol
Tyrosol
2-(4-hydroxyphnyl)-thanol
OH
OCH3
COOH
CH=CH-COOH
Acide vanillique
acide 4-hydroxy-3-mthoxybenzoque
Acide p-coumarique
acide para-hydroxycinnamique
OH
OH
OCH3
OH
CH=CH-COOH
CH=CH-COOH
Acide frulique
acide 4-hydroxy-3-mthoxycinnamique
Acide cafique
acide 3,4-dihydroxycinnamique
Les flavonodes
OH
OH
OH
HO
HO
HO
OH
Lutoline
Apignine
Composs lipophiles
fruits, feuilles
huile
COOCH 3
O
HO
O
HO
OH
HO
COOCH 3
OH
O
OH
HO
OH
OH
Oluropine,
Oluropine aglycone
COOCH 3
O
O
HO
O
HO
HO
HO
O
O
OH
OH
COOCH 3
O
OH
Ligstroside
Ligstroside aglycone
OMe
HO
O
R
O
OH
OMe
R= H Pinorsinol
R= OCOCH3 1-actoxypinorsinol
La stabilit loxydation, value par le test de Swift avec le Rancimat, ne serait pas corrle avec
la teneur en composs phnoliques pour Pirisi et al. (18) ce qui est contraire aux rsultats dautres
auteurs qui trouvent que la stabilit des huiles est bien corrle avec la teneur en phnols totaux [21,
22].
Malgr ces problmes et les divergences de la littrature, Blekas et al. [14] considrent que le
dosage des phnols des huiles dolive selon FC constitue une bonne analyse de routine.
Singleton, (1965)
Montedoro, (1969)
Montedoro, (1972)
Ragazzi, (1973)
Vazquez, (1978)
Gutfinger, (1981)
Cortesi (1983)
Solinas, (1987)
Nergiz, (1991) selon [21]
Montedoro, (1992)
Tsimidou, (1992)
Favati, (1994)
Stefanoudaki, (1995)
Ac cafique
Ac gallique
Ac cafique
Tyrosol
Ac cafique
725
765
725
[21]
[33]
Ac gallique
Ac gallique
765
765
Ac gallique
Ac gallique
Ac cafique
Ac cafique
Ac gallique
Ac cafique
Ac cafique
Ac gallique
Ac cafique
Ac cafique
Ac cafique
Ac cafique
Ac cafique
Ac cafique
Ac cafique
Ac gallique
765
765
725
725
765
725
725
765
[19]
Cioni, (1998)
[34]
Caponio (1999)
[35]
Ranalli (1999)
[36]
Beltran (2000)
[37]
Capannesi (2000)
[38]
Giacometti (2001)
[39]
Lo Curto 2001)
[40]
Pellegrini selon [22], (2001)
[41]
Ranalli
[42]
Salvador (2001)
[43]
Tasioula selon [27]
[14]
Blekas (2002)
[44]
Gimeno (2002)
[45]
Gomez-Alonso (2002)
[46]
Psomiadou (2002)
[47]
Bendini (2003)
FC : Folin-Ciocalteu ; FD : Folin-Denis [13]
Ac gallique
Gallotanin
Ac gallique
Tyrosol
Ac cafique
Ac cafique
mesure
nm
765
Teneurs en phnols
en mg/kg dhuile
76-442
765
725
725
725
725
725
765
725
34,90-271,04 mg/l
50-500
44-157
180-454
260-665
35-355
50-1000
18,7-242,5
98-458
153-400
190-500
FC
FC
FC
FC
FD
FC
FC
FC
FC
FC
FD
FC
85-195
110-180
119-139
175-490
99-203
100-904
52-356
59-255
73-265
115-159
19-380
20 339
42-124
130-170
98-209
FC
FC
FC
FC
FC
FC
FC
FC
FC
FC
FC
750
Protocoles exprimentaux
Les tableaux 2 et 3 rsument les diffrents protocoles exprimentaux dcrits dans la littrature en ce
qui concerne lextraction des phnols et les conditions exprimentales de ralisation de la raction
de FC.
Tween 20
g
non
oui
non
non
non
non
non
non
0,2
Lavage
ml
Hexane 3x50
Hexane 2x2
Hexane 3x50
Hexane 1x50
Hexane* 10
puis 2x5ml
1ml ; 35%
np
1ml ; sat
5ml ; 7,5%
5ml ; 7,5%
1ml; satur
8ml ; 7,5%
1ml ; 35%
V. final
ml
10
np
25
50
50
25
20
25
Temps
min
60
np
60; obs
1 nuit
60
60
60
nm
725
np
725
765
765
725
725
725
5ml ; 10%
20
90, obs
750
Na2CO3
La trs grande diversit des conditions dextraction et des conditions de ractions sont
probablement une des causes de la variabilit des teneurs en phnols donnes dans le tableau 1.
Il devient donc ncessaire de dfinir avec prcision lensemble des conditions exprimentales du
dosage pour valuer les teneurs en phnols dans les huiles dolive.
2.2. Dosage des ortho-diphnols
Les o-diphnols sont les anti-oxydants les plus puissants (hydroxytyrosol, acide cafique).
Diffrents talons ont t utiliss en fonction des auteurs. Le tableau 4 donne les talons utiliss, la
longueur donde de mesure et le domaine de variation des teneurs.
Tableau 4 : talons, de mesure, domaine de variation
Rf.
Rfrence
talons
[27]
[49]
[50]
[51]
[14]
Gutfinger, 1981
Ranalli 1997
Mateos, 2001
Salvador, 2001
Blekas, 2002 (mthode A)
[14]
[45]
[47]
Gomez-alonso, 2002
Bendini, 2003
mesure
nm
350
Ac. cafique
Ac. cafique
Ac. cafique
Ac. cafique
Ac. 3,4-di OHPhnylAc
Ac. cafique
Ac. 3,4-di OHPhnyl Ac
Ac. cafique
Ac. gallique
370
370
350
450
350
450
370
370
Teneurs en
o-diphnols (mg/kg)
5-15
61-194
7,8 5,5
7-24
42-168
12-186
6-87
6,45-9,07
66,7-90,0
Les deux mthodes les plus utilises ont t tudies. Ces mthodes daprs la littrature seraient
spcifiques des o-diphnols.
La mthode A est base sur la formation de complexes entre les o-diphenols et les ions molybdate,
Les o-diphnols ragissent avec le molybdate pour former un complexe jaune.
La mthode B est base sur la nitration des o-diphnols avec le nitrite de sodium en prsence dions
molybdate. Ces derniers augmentent lintensit de la couleur des drivs nitrs probablement par
formation de complexes.
Le tableau 5 rassemble les diffrentes conditions analytiques de ce dosage.
Tableau 5 : Conditions de la raction de dosage des o-diphnols.
Rf. Huile Extrait
Prise
Eau Phosphate Na2MoO4 Temps
dpart MeOH
essai
pH=6,5
5%
Min
g
ml
ml
ml
0,1 M, ml
ml
nm
[27]
10
1
0,2
1
1
2
15
350
[49]
np
[50]
2,5
101
4
1
15
370
[51]
370
[14]
30
22
0,2
1
1
2
350
[14] 3
30
22
0,2
1
450
[45]
370
[47]
370
1
MeOH/H2O (1/1) ; 22ml fraction polaire dans 5 ml mthanol puis ajust 25 ml avec H2O
3
mthode B diffrente base sur la nitration en prsence de molybdate
3. Matriels et mthodes
3.1. Les chantillons
Les analyses ont port sur :
- Une huile dolive vierge dorigine espagnole ;
- Une huile monovaritale de Picholine a t conserve au laboratoire diffrentes
tempratures (- 18C, +4C et TC ambiante) depuis 2001 et labri de la lumire, les
analyses ont t effectues aprs 36 mois de stockage;
- Quatre huiles issues dolives de la varit Tanche des tats de maturit diffrents ;
- Deux huiles mono-varitales (Bouteillan et Salonenque) en vue de dterminer des profils
spcifiques.
3.2. Dosages absorptiomtriques
Extraction des composs phnoliques
10 g d'huile d'olive ( 0,01 g prs) et 10 ml de solution mthanolique (mthanol/eau; 80/20, v/v)
sont placs dans un tube centrifuger.
On agite pendant 10 minutes au Vortex. Aprs centrifugation, pendant 15 min 3800 rpm, la phase
mthanolique est rcupre et transfre dans une fiole jauge de 50 ml. Lopration est reconduite
2 fois et on complte au trait de jauge avec la solution mthanol/eau (80/20).
Dosage absorptiomtrique Folin-Ciocalteu
Une solution mre de tyrosol (Extrasynthse, 4834) 1mg/ml dans le mlange mthanol/eau (80/20,
v/v) est utilise pour prparer des solutions filles 10, 20, 80 et 200 g/ml. 2 ml de solution
extraite sont ajouts 5 ml deau distille, 1 ml de ractif et 5 ml dune solution aqueuse de Na2CO3
( 10%, p/v). Aprs agitation, la solution est laisse lobscurit avant la mesure de labsorbance
750 nm. Des quantits de ractifs de 1 5 ml de ractifs ont t utilises, des temps de contact de
8
30, 60 et 90 min ont t utiliss. Le dosage a t ensuite ralis avec 2 autres talons lacide
syringique (Fluka, 86230) et lacide 4-hydroxyphnylactique (Fluka, 56140).
Dosage absorptiomtrique des ortho-diphnols partir de la mthode A [14, 50]
Une solution mre dacide cafique (Extrasynthse, 6018) 2,617 mmol-1 dans le mlange
mthanol/eau (1/1, v/v) est utilise pour prparer des solutions filles comme dfinies dans le tableau
6. 2 ml de solution extraite sont ajouts 0,5 ml dune solution de molybdate de sodium dihydrat
( 5%, p/v, dans un mlange thanol/eau, 1/1, v/v). Le mlange est agit vigoureusement et aprs 15
minutes, l'absorbance des solutions phnoliques est mesure 370 nm. On observe une coloration
jaune plus ou moins intense.
Tableau 6 : Solutions talons
Sol. mre d'acide cafique (ml)
Volume fioles jauges (ml)
Sol. mthanolique (1:1)
Concentration en acide cafique
(10-3 mmol.l-1)
E1
0,4
20
52,33
E2
E3
E4
1
2,1
3,2
20
20
20
Complter au volume
130,83
274,75
418,67
E5
4,2
20
549,51
4. Rsultats-Discussion
4.1 tude des conditions exprimentales du dosage absorptiomtrique selon Folin-Ciocalteu
4.1.1 Influence du temps de contact et des quantits de ractifs
La figure 4 montre la variation de labsorbance dun talon de tyrosol en fonction du temps de
contact avec le carbonate de sodium en prsence de 0,5 ml de ractif de Folin et 1 ml de Na2CO3 (
7,5%, p/v).
Etalonnage TYROSOL
0,35
T = 9 0 min
0,3
0,25
T = 6 0 min
0,2
0,15
T = 3 0 min
0,1
0,05
0
0
50
100
150
200
T eneur en p p m
Le complexe color est vert. On constate quil ny a pas linarit des rponses en fonction de la
teneur en tyrosol et cela quel que soit le temps de contact lobscurit avec le carbonate de sodium.
La figure 5 montre la variation de labsorbance dun talon de tyrosol en fonction du temps de
contact avec le carbonate de sodium et une augmentation de la quantit des ractifs savoir 1 ml de
ractif de FC et 5 ml de Na2CO3 ( 7,5%, p/v).
Laugmentation de ractifs permet dobtenir la linarit de la rponse partir dun temps de contact
de 60 min Cette dure correspond au temps moyen de la plupart des mthodes dcrites dans le
tableau 3.
10
Etalonnage TYROSOL
1,20
T = 9 0 min
1,00
T = 6 0 min
0,80
0,60
T = 3 0 min
0,40
0,20
0,00
0
50
100
150
200
T eneur en p p m
y = 0,0061x + 0,0309
1,2
Absorbance
T yr o s o l
y = 0,0059x - 0,0159
0,8
0,6
A c id e S yring iq ue
y = 0,0038x + 0,0054
0,4
0,2
0
0
50
100
150
200
T e n e u r e n m g /l
La figure 6 montre linfluence du choix de ltalon sur la rponse. Les rponses diffrent en
fonction de ltalon choisi.
La tendance actuelle des ngociants est de demander une valeur minimale en phnols totaux aux
producteurs. Cette tude montre que cette exigence doit tre associe un protocole prcis
danalyse de la teneur en phnols spcifiant la nature de ltalon utilis
Nous proposons dutiliser le tyrosol comme talon car dune part il donne une rponse satisfaisante
avec le ractif de FC et dautre part parce quil est un des constituants de la fraction phnolique
dans les huiles dolive alors que celles-ci ne contiennent ni lacide 4-hydroxy phnyl actique ni
l'acide syringique.
4.2 Analyse chromatographique
La figure 7 montre un chromatogramme de la fraction phnolique dune huile dolive vierge.
Lidentification des diffrents pics a t ralise laide de composs de rfrence (tyrosol,
vaniline, ac. vanillique, ac. cafique, ac. p-coumarique, ac. frrulique, querctine, lutoline) et par
rapport aux donnes de la littrature [45, 47, 50, 53,54]. Certains composs nont pas t identifis
11
tandis que dautres nont pas une identification certaine en raison de labsence de composs de
rfrence.
Figure 7 : Chromatogramme de la fraction phnolique dune huile dolive vierge dorigine espagnole (talon 1 :
ac. syringique, talon 2 : ac. 4-hydroxy phnyl actique)
4.2.1 Influence des conditions de stockage sur la teneur en phnols dune huile dolive
(Picholine)
La figure 8 montre les variations des principaux phnols dune huile de Picholine conserve trois
tempratures diffrentes pendant 36 mois.
90.00
T ambiante
80.00
4C
Teneur en mg/Kg
70.00
-18C
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
+F
W
e
S ni n
+
ig
R
Ap
+
O
l
no
si
r
N
no
pi
)(+ lin e
o
t
Lu
e
K ti n
rc
ue
+E
C ol
ol
s
os
ro y r
Ty x yt
ro
yd
Figure 8 : volution de la composition phnolique dune huile de Picholine en fonction des conditions de stockage,
dtermination effectue par HPLC.
600
500
400
Folin-Ciocalteu
300
HPLC/UV
200
100
0
Tamb
4C
-18C
Figure 9: volution de la teneur en phnols totaux en fonction des conditions de stockage et de la mthode de dosage.
4.2.2 Influence de la maturit des olives de la varit Tanche sur la teneur en phnols des
huiles
La figure 10, montre les rsultats des dosages des phnols totaux selon FC et des o-diphnols
dtermins par absorptiomtrie sur quatre chantillons dhuiles provenant dolives de la varit
Tanche. Ces rsultats sont compars aux teneurs en phnols totaux et en ortho-diphnols dtermins
par HPLC.
En ce qui concerne les phnols totaux, dtermins selon FC, les quatre chantillons prsentent des
teneurs qui varient en sens inverse de celles dtermines par HPLC.
Les variations observes peuvent tre dues la diffrence de maturit des olives. Plus la maturit
des olives augmente, plus la teneur en phnols dtermine par HPLC diminue ce qui est en accord
avec la littrature. Le fait que la teneur en phnols, dtermine par FC, augmente montre quil y a
formation de composs secondaires doxydation qui ragissent avec ce ractif dans les conditions
prcdemment dcrites.
En ce qui concerne les o-diphnols, les dosages par absorptiomtrie ou par HPLC donnent des
teneurs faibles mais du mme ordre de grandeur. Ces dterminations qui prsentent peu de
variation, ne sont pas trs significatives pour valuer ltat de maturit des olives.
13
300
Teneurs en mg/kg
250
Ph nols par
Folin-Ciocalte u
200
Ph nols totaux
par HPLC
150
100
50
0
Ech 1
Ech 2
Ech 3
Ech 4
Figure 10 : volution des diffrentes fractions phnoliques en fonction de la maturit des olives (Tanche).
Figure 11 : Chromatogramme de la fraction phnolique dune huile dolive vierge de la varit Bouteillan.
Dautre part, cette huile est peu oxyde car les teneurs en tyrosol et en hydroxytyrosol sont faibles (
temps de rtention entre 1 et 6min).
En revanche, nous pouvons remarquer sur la figure 12 que lhuile de la varit Salonenque
analyse, a subi une oxydation importante puisque sa teneur en phnols totaux est faible (118
mg/kg)
14
Figure12 : Chromatogramme de la fraction phnolique dune huile dolive vierge de la varit Salonenque.
De plus, les teneurs en tyrosol et hydroxytyrosol sont importantes par rapport aux taux des phnols
complexes. Cette huile peut tre issue dolives trop mres, dun stockage des olives avant trituration
trop important ou de mauvaises conditions de stockage de lhuile.
Conclusion
Les mthodes absorptiomtriques danalyse de la fraction phnolique des huiles peuvent apporter
des informations sur le potentiel anti-oxydant aux producteurs, aux ngociants des cots
intressants. Il convient de prendre avec circonspection les rsultats issus de ces mesures tant que
ces mthodes ne seront pas normalises tant dun point de vue mthodologique que dun point de
vue de lexpression des rsultats.
Les rsultats prliminaires concernant le dosage de la fraction phnolique par HPLC permettent de
montrer quen plus dune teneur totale en phnols, on peut observer le "potentiel antioxydant de
lhuile" par la prsence de phnols dits complexes alors que souvent le potentiel anti-oxydant dune
huile ntait valu qu partir de composs simples comme le tyrosol et lhydroxytyrosol qui sont
en fait des composs secondaires, anti-oxydant, dj issus dune dgradation de lhuile.
Remerciements Frdrique Franceschi et Muriel Richard pour leurs collaborations techniques.
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