Activit Antibactrienne de Lactobacillus Plantarum

Antibacterial activity In Lactobacillus plantarum

M. Sobh*
1
, A.Chaouch
1
, A.Echchelh
2
, H.Oudda
3
et M.Ouhssine
1


1: Laboratoire de biotechnologie, environnement et qualite, Departement de Biologie,
Faculte des sciences, universite ibn toIail, BP 133, 14000 Kenitra. Maroc
2: laboratoire de chimie physique electronique et materiaux URA CNRST, URAC-14 Maroc
BP 133, Faculte des sciences, universite ibn toIail, BP 133, 14000 Kenitra. Maroc.
3: laboratoire de separation des procedes, departement de chimie, Iaculte des sciences,
Faculte des sciences, universite ibn toIail, BP 133, 14000 Kenitra. Maroc
*Auteur correspondant : SOBH Mohammed. E-mail : Sobh72yahoo.Ir. N de
telephone : (212) 06 42 41 48 45

Rsum
Les bacteries lactiques peuvent synthetiser des substances antibacteriennes qui sont utilisees
dans la Iermentation et la bioconservation des aliments. Six souches de bacteries lactiques
Decoulant particulierement aux genres Lactobacillus, ont ete choisies a partir de saumure
d`artichauts, d`olives et carottes. La souche SMBL1 du genre Lactobacillus, a ete maintenue
pour sa puissante activite bactericide, particulierement vis-a-vis de Staphylococcus aureus
ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25921, Salmonella enteritidis et Streptococcus
agalactiae. Cette activite antibacterienne est due a une substance extracellulaire, de nature
proteique et thermoresistante.
Mots cl : bacterie lactique, bactericide, saumure, Iermentation, bioconservation.

Abstract
Lactic acid bacteria can synthesize antibacterial substances that are used in Iermentation and
Iood biopreservation. Six strains oI lactic acid bacteria arising particularly Irom the genera
Lactobacillus were chosen Irom brine artichoke, olives and carrots. SMBL1 strain oI
Lactobacillus was retained Ior its potent bactericidal activity, particularly in Iront oI
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25921, Salmonella enteritidis,
and Streptococcus agalactiae. This antibacterial activity is due to an extracellular substance oI
protein nature and thermo resistant.
Key words : Lactic acid bacteria, bactericidal, brine, Iermentation, bioconservation.

INTRODUCTION
Les bacteries lactiques rassemblent un ensemble d`especes heterogenes dont le trait commun
est la production d`acide lactique. Elles appartiennent a divers genres comme
Bifidobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus,
Streptococcus, Aerococcus, Alloicoccus et Carnobacterium.
Elles participent dans l`industrie laitiere et dans la Iermentation de beaucoup autres produits
alimentaires comme la boulangerie, saumurage des legumes, saurissage des poissons, des
viandes des salaisons, et la Iabrication du vin, etc. Elles participent a la texture, a la saveur des
aliments et a la production de composes aromatiques.
Elles Iermentent les glucides en acide lactique, d`ou une diminution du pH Iavorable pour la
conservation des aliments. Leur Iaculte antagoniste derive egalement d`une concurrence pour
les substrats (Callewaert et Vuyst, 2000), et lorsque les conditions de developpement sont
Iavorables, de l`elaboration de bacteriocines ( Piard et Desmazeaud, 1992) comme la nisine
(Hurst, 1983 ; Song et Richard, 1997).
Les bacteriocines sont des peptides antibacteriens (Klaenhamner, 1988). Elles montrent un
spectre d`activite etroit derriere des especes pathogenes (Aymerich et al., 2000).
Elles ont un optimum de stabilite, de solubilite et d'activite a pH acide. Elles sont inactivees
par les proteases et sont thermostables.
Dans le present travail, des souches de bacteries lactiques ont ete isolees pour tester leur eIIet
bactericide, leur pouvoir acidiIiant et recherche le genre des substances inhibitrices.

MATRIEL ET MTHODES
Isolement et identification des souches lactiques
Six souches de bacteries lactiques ont ete isolees a partir de trois environnements diIIerents :
saumure de carottes (SMBL1 et SMBL2), saumure d`artichauts (SMBL3 et SMBL4) et saumure
d`olives (SMBL5 et SMBL6), Seules les bacteries a Gram positiI et catalase negative ont ete
retenues. L`isolement est execute sur milieu MRS (Man Rogosa Sharp, DiIco, Detroit, Etats-
Unis) (De Man et al., 1960) solide, milieu ajuste a la recherche typique des lactobacilles. Les
cultures sont incubees 24 heures a 30C dans des botes de Petri a l`obscurite. La puriIication
est eIIectuee par cinq repiquages consecutiIs de repartition en milieu MRS solide. La
conservation se Iait sur milieu MRS incline a 4C en tubes a essais a l`obscurite.
L`identiIication est etablie en se basant sur des caracteres morphologiques et divers caracteres
biochimiques : catalase, temperature de croissance, production de gaz carbonique,
Iermentation de divers sucres (Sharpe et al., 1966).

Pour l`identiIication des souches, on place 0,1 ml d`une culture de 24 heures a 30C dans les
puits d`une galerie API 20E (Bio Merieux) / B. Apres 24 heures d`incubation, l`identiIication
des souches est eIIectuee selon la reIerence du Iabricant qui a montre que cette souche est
lactobacillus plantarum.

PH des bactries lactiques en milieu MRS liquide

Les six souches bacteriennes ont ete cultivees 48 h sur milieu MRS liquide dans des Iioles de
100 ml, a 30C + 2C et a l`obscurite.
Les pH initial et Iinal sont mesures a l`aide d`un pH-metre type Orion Research a electrode
combinee.
Le titrage de l`acidite est eIIectue sur 10 ml de culture par une solution d`hydroxyde de
sodium 0,1 N a l`aide d`une burette de Mohr a robinet, en presence d`une goutte d`une
solution methanolique de phenophtaleine a 1 utilisee comme indicateur colore.
Le pourcentage d`acidite est exprime en mg d`acide lactique (PM 90,08 g) par 100 ml de
culture. Pour l`estimer, les six souches bacteriennes ont ete cultivees deux jours sur milieu
MRS liquide dans des Iioles de 100 ml a 30C et a l`obscurite avec un pH de depart Iixe a
6,46 avec NaOH 1 N et HCL 1N.

Pouvoir antibactrien des souches

Les abondantes methodes decrites pour l`exploration de souches lactiques constructrices de
bacteriocines sont Iondees sur le principe que ces substances proteiques peuvent disperser
dans un milieu de culture solide ou semi solide qu`on inocule prealablement avec une souche
cible. La production de bacteriocine est remarquee par la possibilite inhibitrice du Iiltrat du
Micro-organisme teste sur le developpement du germe cible (Benkerroum et al., 1993).
Les six souches de bacteries lactiques apres culture sur milieu MRS deux jours a 30C sont
testees pour leur pouvoir antibacterien suivant la methode de diIIusion (Barefoot et
Klaenhammer, 1983) en milieu gelose de TSA (Tryptic Soja Agar, DiIco, Detroit, USA).
On creuse six petits puits par bote de Petri de 5 mm de diametre, a raison de quatre botes par
condition et avec trois repetitions a des temps diIIerents.
Les botes sont recouvertes par la souche pathogene Staphylococcus aureus ATCC 25923,
puis les puits sont remplis par 60 a 80 l de surnageant Iiltre, obtenu apres centriIugation
a 10 000 tours /min de 20 ml du milieu MRS cultive avec la souche lactique. Le surnageant a
ete neutralise par NaOH 0,1N de Iaon a obtenir un pH de 6,50, puis on additionne quelques
gouttes de catalase pour ecarter l`eIIet du peroxyde d`oxygene.

Apres incubation de 24h a 30 + 2C, les diametres des zones d`inhibition apparaissant autour
des puits sont mesures (moyenne de deux diametres perpendiculaires).
L`inhibition est notee positive lorsqu`elle est superieure a 1 mm (Schillinger et Luke, 1989)
Spectre antibactrien des souches fort pouvoir acidifiant
Pour les essais d`activite antibacterienne, une gamme de sept microorganismes pathogenes a
ete distinguee. Ils ont ete isoles et identiIies a partir de produits biologiques inIectes au
Laboratoire de recherche et d`analyses medicales de l`hpital Idrissi de Kenitra. Toutes ces
souches ont ete testees pour leur resistance en utilisant des galeries ATB (Bio-Merieux-
SA,France).

Tableau I : Bactries pathognes utilises dans le test.
Souches pathognes Prlvement
Gram negatiI

Escherichia coli ATCC 25921 urinaire
Klebsiella pneumoniae urinaire
Proteus mirabilis urinaire
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 de pus
Salmonella enteritidis coproculture
Gram positiI

Staphylococcus aureus ATCC 25923 urinaire
Streptococcus agalactiae vaginal

Ces sept souches sont puriIiees et conservees sur gelose nutritive inclinee TSA (Tryptic Soja
Agar) a 4C a l`obscurite. Avant leur utilisation dans les tests d`inhibition, elles ont ete
activees par transIert sur bouillon nutritiI et incubees 16 a 18 heures a 37C.
Les deux souches lactiques les plus perIormantes pour leur pouvoir acidiIiant, qui etaient
stockees a 4C, ont ete activees avant leur utilisation dans les tests d`inhibition par transIert
sur bouillon MRS, enrichi avec 2 d`extrait de levure pour optimiser le milieu de culture,
puis incubees 24 heures a 30C aIin d`obtenir des cellules jeunes avec un rendement
Maximal en substances inhibitrices. Un volume de 20 ml est centriIuge dix minutes a 10 000
tours /min. Le Iiltrat est conserve a 4C a l`obscurite apres neutralisation.
Comme precedemment, on utilise la methode de diIIusion en milieu gelose TSA pour mettre
en evidence le pouvoir bactericide.

Localisation de la substance inhibitrice de la souche SMBL1

A partir d`une culture de la souche SMBL1 en milieu MRS liquide, incubee 24 heures a 30 +
2C, un volume de 50 ml de culture est centriIuge dix minutes a 10 000 tours / min. Les tests
d`inhibition sont executes comme prealablement a la Iois sur le surnageant, representant la
partie extracellulaire, et sur le culot, correspondant a la partie cellulaire.
L`inIluence de la neutralisation et de l`addition de quelques gouttes de catalase a ete testee sur
ces deux Iractions. Pour chacun des sept pathogenes, quatre botes de Petri avec deux puits
par botes (avec et sans neutralisation et ajout de catalase) ont ete utilisees avec trois
repetitions.

Tmoignage de la prsence de bactriocines
Les bacteries lactiques peuvent produire des substances inhibitrices diIIerentes des
bacteriocines notamment l`acide lactique, l`acide acetique et les peroxydes d`oxygene. Pour
ecarter l`eIIet des acides organiques, particulierement des acides lactique et acetique, le
surnageant a ete neutralise a pH 6,5 par une solution de NaOH 0,1 N. AIin d`eliminer le
peroxyde d`hydrogene accumule dans le milieu de culture, le surnageant a aussi ete traite
deux heures par une catalase a 30C avant de proceder au test d`inhibition.
Etude de la thermostabilit de la bactriocine
Les bacteriocines etant connues pour tre des proteines resistant a des temperatures elevees,
La thermostabilite des substances inhibitrices a ete testee par chauIIage a 100C pendant
0, 15, 20 et 30 min des surnageant de la souche SMBL1. Comme auparavant, on utilise la
methode de diIIusion en milieu gelose TSA pour mettre en evidence le pouvoir bactericide sur
Staphylococcus aureus ATCC 25923 avec trois repetitions pour chaque epreuve.

RSULTATS
Activit antibactrienne et pouvoir acidifiant des six souches isoles
Les six souches de bacteries lactiques appartiennent aux genres Lactobacillus, Seulement
SMBL1 et SMBL2 presentent une Iorte activite antibacterienne contre Staphylococcus aureus
ATTC 25923 (Tableau II).
La souche SMBL1 est determinee comme Lactobacillus la plus perIormante non seulement
par son activite antibacterienne, mais aussi par son Iort pourcentage d`acidite (Tableau II).

Tableau II :
Caractristiques de six souches de bactries lactiques cultives en Milieu MRS liquide
pendant 48 heures 30C et lobscurit, avec effet Bactricide vis--vis de
Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Souches Dtermination Biotope
pH
Acidit
(%)
Catalase Gram
Effet
bactricide
initial final
SMBL1
Lactobacillus
plantarum
saumure de
carottes
6,55 3,72 1,22 - ++++
SMBL2
Lactobacillus
sp
saumure de
carottes
6,37 3,84 1,21 - +++
SMBL3
Lactobacillus
sp
Saumure
d`artichauts
6,38 4,67 0,88 - ++
SMBL4
Lactobacillus
sp
Saumure
d`artichauts
6,56 4,75 0,84 - ++
SMBL5
Lactobacillus
sp
Saumure
d`olives
6,44 4,82 0,68 - ++
SMBL6
Lactobacillus
sp
Saumure
d`olives
6,27 4,96 0,64 - ++


Spectre antibactrien des deux souches slectionnes
Les souches SMBL1 et SMBL2, retenues pour leur pouvoir acidiIiant important, possedent un
eIIet bactericide generalement eleve vis-a-vis des germes pathogenes testes (Tableau III,
Photo 1).
La souche SMBL1 presente une Iorte activite bactericide (Tableau III) Sur les deux bacteries
Gram positiI Staphylococcus aureus ATCC 25923 (zone d`inhibition de 27 mm) et
Streptococcus agalactiae (zone d`inhibition de 18 mm).
Parmi les bacteries Gram negatiI, elle est surtout active sur Escherichia coli ATCC 25921
(zone d`inhibition de 25 mm) et Salmonella enteritidis (zone d`inhibition de 17 mm).
La souche SMLBL2, presente une aussi une activite bactericide vis-a-vis des souches
pathogenes a gram Staphylococcus aureus ATCC 25923 (zone d`inhibition de 22 mm)
et Streptococcus agalactiae (zone d`inhibition de 10 mm).
Parmi les bacteries Gram negatiI, elle est surtout active sur Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853 (zone d`inhibition de 12 mm) et Escherichia coli ATCC 25921 (zone d`inhibition de 9
mm).

Tableau III :
Diamtre de la zone dinhibition de deux souches de bactries Lactiques vis--vis de sept
souches pathognes par la mthode de Diffusion sur milieu TSA aprs 24 heures 30C
lobscurit.
Souches pathognes
Diamtre dinhibition (mm)
SMBL1 SMBL2
Escherichia coli ATCC 25921 25 9
Klebsiella pneumoniae 14 7
Proteus mirabilis 15 5
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 14 12
Salmonella enteritidis 17 6
Staphylococcus aureus ATCC 25923 27 22
Streptococcus agalactiae 18 10

Photo 1 : Activite antibacterienne des souches lactiques SMBL1 et SMBL2 vis-a-vis de

Staphylococcus aureus ATCC 25923 (1), par la methode de diIIusion sur milieu Tryptic Soja
Agar apres 24 heures d`incubation a 30C a l`obscurite.

Localisation de leffet inhibiteur de la souche SMBL1

La partie cellulaire (culot) ne presente aucun resultat sur la croissance des souches pathogenes
utilisees (Tableau IV). Par contre, la partie extracellulaire correspondant au surnageant
montre une puissante aptitude antibacterien (Photo 2). Ce resultat concorde avec les travaux
realises par (Labioui et al., 2005 ; Elmoualdi et al 2006).

Tableau IV :
Activit antibactrienne des fractions extracellulaire et cellulaire de la souche smbl1 par
la mthode de diffusion sur milieu TSA aprs 24 heures dincubation a 30C.

Souches pathognes
Diamtre dinhibition (mm)
Fraction extracellulaire Fraction cellulaire
Escherichia coli ATCC 25921 22 -

Klebsiella pneumoniae 14 -

Proteus mirabilis 15 -

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 14 -

Salmonella enteritidis 17 -

Staphylococcus aureus ATCC 25923 25 -

Streptococcus agalactiae 18 -



Photo 2 : conIirmation de l`activite antibacterienne de la Iraction extracellulaire de la souche
lactique smbl1 vis-a-vis de proteus mirabilis (a gauche) et staphylococcus aureus ATCC
25923 (a droite), par la methode de diIIusion sur milieu tryptic soja agar apres 24 heures
d`incubation a 30c a l`obscurite.

Comme auparavant l`eIIet inhibiteur est dominant pour les deux souches gram positiI
Staphylococcus aureus ATCC 25923 (zone d`inhibition de 25 mm) et Streptococcus
agalactiae (zone d`inhibition de 18 mm).
Parmi les bacteries Gram negatiI, elle est surtout active sur Escherichia coli ATCC 25921
(zone d`inhibition de 22 mm) et Salmonella enteritidis (zone d`inhibition de 17 mm).

Traitement thermique de la substance inhibitrice de la souche SMBL1
Quel que soit le temps de traitement thermique a 100C, le surnageant garde son activite
antibacterienne (Photo 3).




Photo 3 : EIIet antibacterien vis-a-vis de Staphylococcus aureus ATCC 25923 de la Iraction
extracellulaire de la souche SMBL1 apres traitement Thermique a 100C par la methode de
diIIusion sur milieu Tryptic Soja Agar Apres 24 heures d`incubation a 30C a l`obscurite.
(1) : Temoin ; (2) :15 min ; (3) : 20 min ; (4) : 30 min.

DISCUSSION ET CONCLUSION
Sur six souches de bacteries lactiques isolees, l`activite bactericide et le pourcentage d`acidite
apparaissent tres variables et sans relation apparente avec le biotope. Les deux souches les
plus eIIicaces, SMBL1 et SMBL2 ne presentent pas le mme spectre d`action vis-a-vis des

bacteries pathogenes. Elles sont toutes actives sur les Gram, mais seule la souche SMBL1 est
eIIicace contre Proteus mirabilis, bacterie Gram-. Par selection a partir de divers biotopes,
il est donc possible de choisir des souches d`intert.
Les bacteries pathogenes a Gram sont generalement plus sensibles a l`eIIet bactericide des
bacteries lactiques (Onda et al., 2003). Les bacteriocines agissent en Iormant des pores dans
la membrane cytoplasmique qui entranent des dereglements des Ionctions cellulaires (Biswas
et al., 1991). Song et Richard (Song et Richard, 1997) ont montre chez Listeria, bacteries a
Gram, que les cellules resistantes aux bacteriocines ont une membrane de composition
diIIerente de celle des cellules sensibles.
L`activite bactericide de la souche SMBL1 se retrouve exclusivement dans le milieu de
culture. On a donc Iormation de substances extracellulaires.
Ces dernieres diIIerent des acides organiques et du peroxyde d`oxygene. En eIIet, la
neutralisation du surnageant et l`addition de catalase n`entranent pas de reduction du
diametre d`inhibition (Photo 2).
La suppression de l`eIIet de l`acide lactique et du peroxyde d`oxygene Iavoriserait plutt
l`activite des substances antibacteriennes.
Pour un traitement a 100C pendant 20 et 30 min, la zone d`inhibition importante conduit que
la ou les molecules inhibitrices sont thermostables. Ces speciIications Iont penser qu`on a
aIIaire a des bacteriocines (Parente et al., 1994).


RFRENCES
Aymerich (M.T.), Garriga (M.), Monfort (J.M.), Nes (I.), Hugas (M.) 2000 - Bacteriocin-
producing lactobacilli in Spanish-style Iermented sausages: characterization oI bacteriocins. -
Food Microbiol., 17(1), 33-45.

Barefoot (S.F.), Klaenhammer (T.R.) 1983 - Detection and activity oI lacticin B, a
bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus. - Appl. Environ. Microbiol., 45(6), 1808-
1815.

Benkerroum (N.), Ghouati (Y.), Sandine (W.E.), Tantaoui-Elaraki (A.) 1993 - Methods to
demonstrate the bactericidal activity oI bacteriocins. - Lett. Appl. Microbiol., 17(2), 78-81.

Biswas (S.R.), Ray (P.), Johnson (M.C.), Ray (B.) 1991 - InIluence oI growth conditions on
the production oI a bacteriocin, pediocin AcH, by Pediococcus acidilactici H. - Appl.
Environ. Microbiol., 57(4), 1265-1267.

Callewaert (R.), De Vuyst (L.) 2000 - Bacteriocin production with Lactobacillus amylovorus
DCE 471 is improved and stabilized by Iedbatch Iermentation. - Appl. Environ. Microbiol.,
66(2), 606-613.

De Man (J.C.), Rogosa (M.), Sharpe (M.E.) 1960 - A. medium Ior the cultivation oI
lactobacilli. - J. Appl. Bacteriol., 23, 130-135.

Elmoualdi.L; Labioui.H; Eyachioui.M; Ouhssine.M., 2006. Caracterisation, Iermentation
et valorization de dechets d`evisceration de volailles de kenitra, Maroc. AIrique Science,
Vol.02,N1 pp 102-115.

Hurst (A.) 1983 - Nisin and other inhibitory substances Irom lactic acid bacteria. In Branen
(A.L.), Davidson (P.M.), Antimicrobials in foods. New York: Marcel Dekker Inc., p. 327-351.

Klaenhamner (T.R.) 1988 - Bacteriocins oI lactic acid bacteria. - Biochimie, 70, 337-349.

Labioui.H.,Elmoualdi.L,El yachioui.M,et Ouhssine.M, 2005. Selection de souches de
bacteries lactiques antibacteriennes. Bull.Soc.Pharm. Bordeaux, 144(3-4), 237-250.

Onda (T.), Yanagida (F.), Tsuji (M.), Shinohara (T.), Yokotsuka (K.) 2003 - Production
and puriIication oI a bacteriocin peptide produced by Lactococcus sp. strain GM005, isolated
Irom Miso-paste. - Int. J. Food Microbiol., 2003, 87(1-2), 153-159.

Parente (E.), Ricciardi (A.), Addario (G.) 1994 - InIluence oI pH on growth and bacteriocin
production by Lactococcus lactis subsp. Lactis 140NWC during batch Iermentation. - Appl.
Microbiol. Biotechnol., 1994, 41(4), 388-394.

Piard (J.C.), Desmazeaud (M.J.) 1992 - Inhibiting Iactors produced by lactic acid bacteria.
2. Bacteriocins and other antibacterial substances. - Lait, 72, 113-142

Sharpe (M.E.), Fryer (T.F.), Smith (D.G.) 1966- IdentiIication oI the lactic acid bacteria. In
Gibbs (B.M.), Skinner (F.A.) (Eds) Identification methods for microbiologists. Part A.
London: Acad. Press,

Schillinger (U) et. Luke (F.K) 1989, Antibacterial activity oI Lactobacillus sake isolated
Irom meat. Appl. Environ . Microbiol, 55 (1989) 19011906.

Song (H.J.), Richard (J.) 1997- Antilisterial activity oI three bacteriocins used at sub
minimal inhibitory concentrations and cross-resistance oI the survivors. - Int. J. Food
Microbiol., 36(2), 155-161.