WOLLJUNG Florian VINCENT Quentin

Rapport de travaux pratiques de

MICROBIOLOGIE DES
EAUX USEES
Génie Biologique – Génie de l’Environnement

WOLLJUNG Florian VINCENT Quentin

GB2-GE-TPB

Dates : 11, 14 et 16 mars 2011

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I – But de l’expérience :

Il s’agit d’étudier la population bactérienne d’eaux usées traitées biologiquement en

les évaluant quantitativement et qualitativement. L’étude quantitative se porte sur
l’évaluation de la concentration bactérienne des eaux et l’étude qualitative sur
l’indentification de quelques souches.
Le milieu dans lequel vivent les bactéries est la boue activée. Au niveau de la station
d’épuration, elle se situe dans le bassin d’aération. Ce sont ces bactéries qui
dégradent la matière organique et assainissent l’eau. Leurs contrôles dans une
station d’épuration est essentiel afin de garantir une bonne épuration c’est pourquoi
nous sommes amenés à étudier cette population. Nous nous cantonnerons à des
analyses simples en vue d’une première approche de ces boues activées.

II – Principe :

L’analyse quantitative de la concentration bactérienne se fait par dilution en cascade.

Le principe est de diluer régulièrement un millilitre de boues activées et de compter
le nombre de bactéries en ensemençant les dilutions. Comme une colonie provient
d’une bactérie initiale, le comptage de colonies sur les boites nous permet de savoir
la concentration bactérienne dans les boues activée (on dénombre plutôt des UFC
(Unité Formant une Colonie) car deux bactéries proches peuvent former une grosse
colonie, ce qui fausse les résultats).
L’indentification de certaines souches bactériennes se fait par la détermination de
leurs caractères culturaux, morphologiques et biochimiques. Leurs caractères
culturaux se déterminent par l’observation à l’œil nu de différents paramètres
concernant l’aspect des colonies. Les caractères morphologiques s’établissent à
travers quelques observations et test rapides (coloration de Gram). Les
caractéristiques biochimiques vise à déceler la présence ou non d’arsenal
enzymatiques en mettant la souche bactérienne avec différents substrats
(éventuellement en rajoutant des molécules permettant la visualisation coloré d’une
réaction (indicateurs de pH, d’oxydoréduction …))

III – Matériels et Méthodes :

1) Le dénombrement :

Il s’agit de prélever 1 mL de boues activées et de l’introduire dans 9 mL d’eau

physiologique (dilution au 10-1). Après homogénéisation, on préleve 1 mL de la
dilution au 10-1 que l’on introduit dans 9 mL d’eau physiologique (dilution au 10-2)
etc… Nous réalisons des dilutions en cascades jusqu'à 10 -7. On ensemence ensuite
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avec 0,1 mL des dilutions 10-3 10-4 10-5 10-6 et 10-7, une boite de PCA (Plate Count
Agar) pour chaque dilution, par étalement en surface.

2) L’identification:

Il s’agit dans un premier temps de purifier la souche. Comme dans les boues activées
la population bactérienne est dense et variée, nous devons impérativement purifier
la souche que l’on souhaite identifier. Pour cela, on réalise des isolements répétitifs
jusqu'à obtenir une souche pure. Les caractéristiques morphologiques seront établies
par l’observation du type de colonie, grâce à l’état frais et la réalisation de la
coloration de Gram. Mis à part le test de la respiration enzymatique, les caractères
biochimiques seront déterminés par l’ensemencement d’une micro-galerie API.

IV – Résultats :

1) Observations générales :

Avant tout dénombrement ou identification, nous sommes amenés à observer à

l’état frais et par une coloration de Gram un échantillon de boue activée.
A l’état frais, nous observons beaucoup d’eucaryotes mobiles et de procaryotes
immobiles. Il y a présence de grand filament qui est surement de la matière
organique sous forme de floques.
A la coloration de Gram, nous constatons à la fois des bâtonnets roses (Gram –) et
des coques violet (Gram +).

2) Le dénombrement :

Dilutions 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

Nombre d’UFC 30 3 1 0 0

Dans l’analyse des eaux usées, il n’y a pas de normes concernant le nombre d’UFC
nécessaire ni de limites à prendre en compte pour les résultats.

Nous pouvons alors déterminer le nombre d’UFC par mL de boues activées:

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Avec :
∑c : somme des colonies présentes sur la boîte à prendre en compte
n1 : nombre de boîtes à prendre en compte à la première dilution effectuée
n2 : nombre de boîtes à prendre en compte à la deuxième dilution
d1 : première dilution effectuée
V : volume de l’inoculum en mL

A.N :
[UFC] = (30+3+1) * 1 = 3,1. 105 UFC/mL de boue.
-3
(1+0,1*1)*10 0,1

3) L’identification :

Lorsque nous avons fait le premier ensemencement, nous avions obtenue différents
type de colonies. Nous avons sélectionné deux types de souche que l’on nommera A
et B. Après purification, voici leurs caractéristiques culturales et morphologiques :

Caractères culturaux

Souche A B
Milieux PCA PCA

Pureté Pure1 Pure1

Taille
moyenne petite
Forme
ronde ronde
Surface
bombée bombée
Bords
réguliers réguliers
Aspect
lisse lisse
Consistance
crémeuse crémeuse
Odeur Pas d’odeur particulière Pas d’odeur particulière
Pigmentation
crème crème
Type
S S

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1 : La notion de pure indique qu’il n’y a qu’un seul type de colonie sur la gélose et
que les caractéristiques à l’Etat Frais et à la coloration de Gram montrent un
même type de souche.

Nous constatons que les caractères culturaux sont quasiment identiques entre les
deux souches étudiées A et B. Leurs différences s’observent plus lors dans les
caractères morphologiques.

Caractères morphologiques

Manipulations Etat frais /Gram Etat frais Gram

Souche Morphologie Mobilité Coloration Gram
A bâtonnet mobile rose Gram -
B bâtonnet immobile rose Gram -

La différence entre les deux souches est leur mobilité. Afin de poursuivre
l’indentification, il faut déterminer les enzymes que possèdent les souches : il s’agit
des caractéristiques biochimiques.

Caractères biochimiques

Test de l’enzyme respiratoire :

Comme nous avons des bâtonnets Gram -, le test oxydase est obligatoire. Nous avons
tout de même effectué un test catalase.

Enzyme testée Souche Observations Interprétation Conclusion

Coloration rose du Oxydation du
A Oxydase +
disque paraphénylène-diamine
Oxydase
Coloration rose du Oxydation du
B Oxydase +
disque paraphénylène-diamine
Apparition de
A 2H2O2  2H2O + O2(gaz) Catalase +
bulles
Catalase
Apparition de
B 2H2O2  2H2O + O2(gaz) Catalase +
bulles
Aucune différence n’est encore visible puisque les enzymes respiratoires sont
identiques.

 Comme il s’agit de bâtonnet Gram – et Oxydase +, nous choisissons une galerie

API 20E. Normalement, nous aurions du utiliser une galerie API 20 NE (Non
Enterobactérie) car les Enterobacteries ne possède pas l’oxydase. Mais une
galerie API 20E ou 20NE ont principalement les mêmes caractéristiques.

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Microgalerie API 20E :

Fiche API de la souche A

Fiche Api de la souche B

Les deux souches identifiées sont :

Souche A = Aeromonas hydrophila (76,5%)

Souche B = Pasteurela multocida (99,4%)

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V –Interprétations :
1) Le dénombrement :

La normalisation concernant la concentration en population bactérienne n’est pas

établie. En fait, ce paramètre est pris en compte dans la législation à travers les
caractéristiques physico-chimique des boues, c’est à dire la Matière Organique (la
MVS=Matière Volatile Solide est le caractère le plus représentatif de la biomasse
épuratoire).
Concernant la concentration obtenue, on a pu constater que les dilutions effectuées
étaient trop élevée. En effet, les eaux usées de la station de Drunsenheim sont
faiblement chargées en matière organique (résultats en adéquation avec ceux
obtenue en TP eaux usées) et de telle dilution n’était pas nécessaire.

2) L’identification:

Aeromonas hydrophila est une souche très répandue dans les boues de stations
d’épuration. Aeromonas hydrophila a une répartition géographique mondiale dans
les eaux douces, les eaux de faible salinité, la vase, les sédiments et, d’une manière
générale, l’environnement aquatique constituent l’habitat principal de ce germe.
Avec Pseudomonas sp. il s’agit d’un germe lipolytique : il dégrade les graisses présent
dans les eaux usées. Leurs présence est donc habituelle et indispensable (P.CHAPPE
La microflore des boues aérobies acclimatées à des teneurs élevées en graisses).

Cependant, l’indentification de Pasteurela multocida est beaucoup plus douteuse. Ce

germe n’est pas une bactérie habituellement rencontrée dans les boues de station
d’épuration. En effet, les Pasteurella sont des hôtes obligatoires des animaux, des
vertébrés surtout, chez qui ils se comportent comme des commensaux de la cavité
buccale et qu'on isole de la salive. Elles peuvent survivre quelque temps dans le
milieu extérieur mais ne s'y développent pas. De ce fait, leurs présences dans les
boues activées aérobie est surprenante. Nous supposons donc que l’identification est
incertaine. Il faudrait donc refaire une galerie API20E pour vérifier ce résultat.

V –Conclusions :
La concentration bactérienne dans les boues activées est d’environ 3.10 5 UFC/mL de
boue. Parmis la variété de souche présente dans les boues, nous avons indentifié
Aeromonas hydrophila et Pasteurela multocida (l’identification certaine du 2ème
germe reste sous réserve).
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