Analyse des macromolécules

biologiques : introduction

par Fernand PELLERIN

Professeur à la faculté de Pharmacie de l’Université Paris XI

1. Produits issus des fermentations et des réactions

enzymatiques ............................................................................................ P 3 300 - 3
1.1 Préparation d’enzymes................................................................................ — 3
1.2 Spécificité des enzymes .............................................................................. — 3
2. Produits issus des protéines................................................................. — 3
2.1 Méthodes d’analyse séquentielle............................................................... — 4
2.2 Méthodes d’analyse structurale ................................................................. — 4

es biotechnologies à l’échelle industrielle connaissent depuis les années

L soixante-dix un développement constant dans tous les domaines de l’activité
chimique. Tous les secteurs ont investi des sommes considérables dans la
recherche de nouveaux produits biotechnologiques, leur développement et leur
réalisation industrielle à une très grande échelle ; ces investissements commen-
cent à porter leurs fruits avec l’arrivée sur le marché de produits qui concurren-
cent ou se substituent à ceux des industries chimiques traditionnelles. De
nouvelles matières premières sont ainsi apparues. Dans le domaine agricole, la
sélection de nouvelles variétés fait appel aux progrès de la génétique molécu-
laire et se matérialise par une amélioration de la résistance des végétaux aux
intempéries ou aux prédateurs, comme par celle du rendement. Dans le
domaine agroalimentaire, on assiste à l’élaboration de nouvelles protéines,
comme à l’accélération de la croissance des animaux d’élevage. Dans le
domaine de la santé, des progrès spectaculaires ont été enregistrés : production
en pleine extension de vaccins à partir de protéines purifiées, de peptides syn-
thétiques. De nouveaux médicaments sont obtenus par des processus
biotechnologiques : insulines, interférons, hormones antihypophysaires, etc.
L’industrie des fermentations, la production industrielle fondées sur les pro-
priétés des enzymes grâce au perfectionnement de la connaissance de leurs
fonctions et l’élucidation de leur structure, ont été rapidement suivies par le
développement des anticorps monoclonaux, les cultures cellulaires et les
recombinaisons génétiques.
Le développement des biotechnologies implique la participation de toutes les
branches de la chimie, notamment dans le cadre de l’analyse chimique. Tout
développement implique en effet un contrôle et une réglementation, d’abord
scientifique puis légale ; les biotechnologies n’y échappent pas. Le propos de
cette rubrique des Techniques de l’Ingénieur n’est pas d’entrer dans le cadre
de multiples contrôles auxquels doivent donner lieu les produits biotechnolo-
giques : microbiologiques, biologiques, immunologiques, etc., ni d’entrer dans
celui des règlements qui, sur le plan international ou européen, permettent de
mieux appréhender les problèmes et de concilier ceux qui relèvent de l’éthique
tels que ceux émanant de la CEE sous forme de directives ou de notes explica-
tives pour les médicaments d’origine biotechnologique. Sur le plan scientifique,

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les Unions Internationales se préoccupent des problèmes biotechnologiques.

Une définition précise a été donnée par la Fédération européenne et par l’Union
internationale de chimie pure et appliquée (IUPAC). Par l’application intégrée
des sciences biochimiques et microbiologiques de la génétique et du génie chi-
mique, les biotechnologies permettent le développement industriel des capa-
cités et des propriétés des micro-organismes des cultures cellulaires et des
produits qui en dérivent. La définition rejoint celle donnée en 1980 aux États-
Unis par A. Spinks dans Biotechnology reproduisant le rapport du « Joint Wor-
king Party » (HMSO Londres - Mars 1980).
La participation de la chimie analytique, qui sera développée dans cette rubri-
que, se retrouve comme une partie importante dans les développements des
biotechnologies comme dans tous les domaines de l’activité chimique.
■ Tout isolement d’une substance suppose, dans un premier temps, une appro-
che analytique qui définit les opérations d’extraction, purification, séparation et
isolement (cf. article « Identification, pureté et dosage d’une protéine » de ce
traité). Les techniques mises au point au niveau de la recherche à l’échelle ana-
lytique sont transposées dans un deuxième temps à l’échelle préparative puis
industrielle. La première étape tient une place primordiale dans le domaine des
biotechnologies ; il ne faut pas oublier que les premiers essais biologiques ou
microbiologiques sont effectués sur des quantités très réduites qui relèvent des
techniques microanalytiques ; les rendements très faibles au départ, sans
oublier le prix de revient le plus souvent très élevé des matières premières, les
techniques mises en œuvre et la haute spécialisation des chimistes analystes
prennent une place chaque jour plus importante avec un accroissement de
l’efficacité. Au niveau de la recherche, l’analyste intervient pour élucider les
structures. Il met en jeu les méthodes d’analyse les plus performantes. La spec-
trométrie de masse, utilisée pour l’identification des « petites molécules » for-
mées par la dégradation des protéines a concouru à identifier des polypeptides
de masse moléculaire allant jusqu’à 5 000 puis 15 000 et au-delà et intervient
ainsi dans l’analyse séquentielle. Les applications de l’électrospray, les techni-
ques électrophorétiques et immunotechnologiques reçoivent des applications
multiples pour élucider la structure de fragments polypeptidiques de masse
moléculaire plus élevée.
La spectrométrie de masse se développe dans le domaine des protéines et
dans celui des polysaccharides ; elle constitue ainsi dès maintenant l’outil indis-
pensable à l’étude des biomolécules par FAB-MS (couplage Fast Atom Bombard-
ment - spectrométrie de masse), ou à l’analyse des glycoprotéines ou de
protéines de masse importante par le couplage avec la « matrix assisted laser
desorption ionisation - time of flight » (MALDI-TOF).
■ Au stade du développement puis au stade industriel, l’analyse intervient dans
le contrôle des fabrications, dans la garantie de constance du produit, dans la
recherche de dérivés éventuels ; elle apporte une contribution efficace à la fabri-
cation du produit biotechnologique.
Telle est l’idée directrice à l’origine de cette rubrique sur l’analyse des poly-
mères biologiques qui implique la participation de spécialistes de disciplines
très éloignées les unes des autres.
Deux types d’exemples sont présentés dans cette introduction pour montrer
les apports de la chimie analytique et la place qu’elle tient tout en demeurant
dans le cadre strict de sa discipline : biotechnologies faisant appel à des proces-
sus de fermentation et de génie enzymatique et biotechnologique reposant sur
la recombinaison génétique ou génie génétique.

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1. Produits issus
des fermentations et des
réactions enzymatiques
Les processus fermentaires et enzymatiques sont la partie la plus
ancienne de la production des produits biologiques. On ne peut que
rappeler les boissons fermentées (vin, bière). Les techniques de
fabrication sont depuis longtemps maîtrisées et bénéficient jour
après jour des acquisitions conduisant à l’obtention d’enzymes puri-
fiées et, avec leur concours, à des produits de qualité constante.
1.1 Préparation d’enzymes
Les enzymes sont obtenues à partir d’organismes animaux, végé-
taux, microbiens dans des conditions très variées. La préparation
d’enzymes par culture microbienne doit garantir une fermentation
contrôlée et empêcher la formation de produits toxiques ou indési-
rables. La participation de l’analyste implique une adaptation des
méthodes classiques. Par exemple, les enzymes sont très souvent
immobilisées sur un support par adsorption et échange de ligands ;
des préparations sont obtenues en recourant à des mutants hyper-
producteurs d’enzymes purifiées par chromatographie d’affinité.
Cette diversité impose à l’analyste trois types de critères :
— limitation de contaminants chimiques (As, Pb, métaux lourds,
protéines étrangères) et microbiens (salmonella, coliformes...) ;
— mise en évidence des additifs et ingrédients utilisés dans la
production ; ces substances doivent être insolubles et retirées de
l’aliment lorsqu’elles ont rempli leur rôle (processing aids) ;
— recherche et limitation de produits tels que le glutaraldéhyde,
etc.
À ces essais vient évidemment se joindre le titrage de l’activité
enzymatique qui fera l’objet d’un développement particulier dans
l’article [P 3 310] Identification, pureté et dosage d’une protéine de
cette rubrique.
1.2 Spécificité des enzymes
L’exemple des produits d’hydrolyse de l’amidon (polysaccharide
constitué par la répétition d’unités monomères glucose) est particu-
lièrement démonstratif.
L’hydrolyse acide de l’amidon provoque une coupure au hasard
des liaisons α-1,4 et α-1,6 avec formation d’oligosides, de produits
secondaires et de glucose. Les enzymes agissent spécifiquement.
— L’α-amylase ou α-D-1,4-glucane-glucanohydrolase conduit à
des holosides moyens, de degré de polymérisation (D.P.) 3 et 6 : le
produit de la réaction est un mélange d’une faible quantité de glu-
cose et maltose et d’oligoholosides. Elle est le plus souvent utilisée
pour la préparation des maltodextrines.
— La β-amylase ou α-D-1,4-glucane-maltohydrolase est une exo-
amylase hautement spécifique des liaisons α-1,4 ; elle agit de façon
méthodique en libérant des molécules de maltose à partir des extré-
mités non réductrices des chaînes d’anhydroglucose. Des attaques
successives similaires se poursuivent jusqu’à une conversion totale
en maltose.
Après hydrogénation, le produit obtenu (Lycasin 80/55 de
Roquette) utilisé comme édulcorant et sucrant renferme principale-
ment 50 à 55 % de maltitol, 37 à 44 % de dérivés hydrogénés et 6 à
8 % de sorbitol (D-glucitol).
— L’amyloglucosidase ou α-1,4-glucanohydrolase est utilisée
pour la transformation quantitative du glucose ; elle catalyse la rup-
ture des liaisons α-1,4, α-1,6 et α-1,3.
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L’α-1,6-amyloglucosidase conduit au glucose et à des disacchari-
des à base d’isomaltose ; par hydrogénation, l’isomaltitol (gluco-
1,6-sorbitol) prédomine.
Les modalités d’attaque enzymatique ont été largement mises à
profit ; l’expérience industrielle montre que la voie enzymatique est
la méthode la plus utilisée, en réalisant divers couplages, aussi bien
pour la préparation d’hydrolysats intermédiaires que pour la con-
version totale en glucose. Elle a permis de produire des hydrolysats
aux qualités précises et contrôlables, en évitant les inconvénients
rencontrés lors de l’hydrolyse acide. On obtient ainsi des mélanges
d’oligosides et d’oses ou de leurs produits d’hydrogénation dont la
qualité est définie par les techniques analytiques.
En plus des spécifications générales et des critères technologi-
ques qui gouvernent leur emploi, la composition en « sucres »
(oses) et en produits d’hydrogénation doit être vérifiée ; les métho-
des chromatographiques apportent une contribution particulière-
ment efficace.
La chromatographie gaz-liquide des oses et osides après silylation
ou la chromatographie en phase liquide rendent aisément compte
des teneurs des divers dérivés organiques et permettent d’obtenir la
carte d’identité du produit. De nombreuses techniques ont été préco-
nisées et sont décrites dans tous les ouvrages classiques.
Les applications industrielles des réactions enzymatiques sont
multiples : synthèse d’antibiotiques et de stéroïdes, fractionnement
de la caséine du lait en polypeptides palliant les difficultés d’assimi-
lation, hydrolyse partielle ou totale des protéines en peptides ou aci-
des aminés ; autant de moyens entrant dans la pratique industrielle
et impliquant des techniques d’analyse très élaborées ; les techni-
ques chromatographiques, notamment d’exclusion, renseignent sur
la composition des mélanges obtenus et sur la dispersion molaire
des composants.
2. Produits issus
des protéines
Les macromolécules protéiques obtenues par des procédés bio-
technologiques ont connu, depuis les années quatre-vingt, un déve-
loppement considérable ; ce procédé est venu s’ajouter à la
production par extraction à partir de produits naturels, à leur modi-
fication par voie enzymatique ou à la synthèse totale d’oligopepti-
des et de polypeptides. Les procédés biotechnologiques font appel
à la culture des cellules ou des tissus in vitro comme in vivo, à leur
synthèse par voie microbiologique, aux anticorps monoclonaux
produits par des hybridomes.
Les méthodes de recombinaison génétique ou génie généti-
que dites de l’ADN recombinant sont le « résultat d’une manipu-
lation génétique dans laquelle l’ADN codant pour le produit
souhaité est introduit au moyen d’un vecteur tel qu’un plasmide
dans un micro-organisme approprié ou une lignée cellulaire
(constituant l’hôte) et où cet ADN est exprimé et traduit en
protéine. »
Cette définition proposée par la Pharmacopée Européenne met en
évidence les contraintes biologiques auxquelles les produits doi-
vent satisfaire pour caractériser le système hôte vecteur dans le cas
des médicaments produits par des processus biotechnologiques
des thérapies génique et cellulaire ; on les retrouve dans la Pharma-
copée des États-Unis (USP) et Pharmacopeial Forum et elles sont
transposables à tous les groupes de produits formés par recombi-
naison génétique.
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2.1 Méthodes d’analyse séquentielle
D’une manière générale, la qualité de tels produits implique la
maîtrise du clonage, des conditions de culture cellulaire, des condi-
tions de fabrication, de l’isolement de la macromolécule protéique,
de la détection de déviations anormales ou de la différenciation d’un
ADN normal et anormal (cf. article [P 3 305] Analyse des macromo-
lécules biologiques et applications. Généralités ). Elle impose des
contrôles à chaque niveau. La recherche de contaminants biolo-
giques tels que les virus, les rétrovirus, de composants cellulaires,
le test ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbant Assay ) relèvent
des spécialistes des techniques biochimiques, immunologiques,
radioimmunologiques, etc. Ces techniques sont décrites dans l’arti-
cle [P 3 310] Identification, pureté et dosage d’une protéine afin de
fournir aux chimistes analystes les données nécessaires à la
connaissance des phénomènes, à leur interprétation, pour leur per-
mettre d’apporter le cas échéant le concours de leur discipline.
D’une manière générale, la qualité de tels produits ne peut être
acquise par un seul test mais par la mise en œuvre d’une batterie de
tests effectués au cours de la fabrication.
Il est évident que le dosage de l’azote total exprimé en azote pro-
téique n’apporte pas une garantie suffisante. Il est nécessaire
d’effectuer divers types de contrôles (cf. article [P 3 315] Méthodes
d’analyse séquentielle des macromolécules biologiques ).
a) La chromatographie d’exclusion est appliquée à la séparation
des constituants d’un mélange de protéines à la détermination
moléculaire de chaque fraction et à la détermination de la masse
moléculaire moyenne. La comparaison des profils chromatographi-
ques montre la constance de la distribution.
b) Les acides aminés sont séparés après hydrolyse par chromato-
graphie en phase liquide ou d’échange d’ions ; les procédés aisé-
ment automatisés sont à la base de l’identification, des études de
stabilité ou de dégradation.
c) L’analyse séquentielle des acides aminés peut être effectuée à
partir de l’extrémité N-terminale selon la méthode d’Edman. L’iso-
thiocyanate de phényle se fixe sur le NH2 terminal libre de la chaîne
peptidique et, après hydrolyse, le dérivé phénylthiohydantoïne de
cet acide aminé peut être identifié. La répétition du cycle de réac-
tions permet d’identifier les uns après les autres, d’une façon
séquentielle, les acides aminés. Après attaque enzymatique par la
carboxypeptidase, les fonctions α-carboxyliques des acides aminés
sont également séparées et identifiées.
L’analyse séquentielle est complétée par la détermination de la
carte peptidique qui est un procédé d’identification, de prise
d’« empreinte digitale » contrôlant les aminoacides dans les frag-
ments de peptides formés par coupure de la molécule par action
enzymatique de différentes endopeptidases (trypsine, chymotryp-
sine...) ou de réactifs chimiques (bromure de cyanogène).
L’ensemble permet de déceler les multiples séquences qui doi-
vent être conformes à celle du produit originel et contribue à vérifier
la constance du produit en même temps qu’à établir la structure de
la macromolécule protéique.
d) L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) concourt
également à élucider les structures ; le dodécylsulfate de sodium
(SDS/PAGE) linéarise les chaînes par rupture de liaisons
hydrogène ; la présence d’un réducteur (thiol) (mercapto-2-éthanol)
dans le milieu supprime les ponts disulfure. Les données fournies
par l’électrophorèse en font le complément des techniques chroma-
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tographiques pour la séparation des polypeptides et l’établissement
de leur structure.
De nombreuses phases sont maintenant utilisées. L’électropho-
rèse capillaire est basée sur les mêmes principes que l’électropho-
rèse sur gel ; elle permet des séparations plus rapides et une
meilleure résolution avec détection directe des composés et leur
quantification.
La chromatographie sous toutes ses formes d’application appa-
raît comme la méthode indispensable à l’établissement des structu-
res comme au contrôle de la constance des fabrications.
L’isoélectrofocalisation sépare les isoformes ou les glycoformes
(variation des oses ; les protéines sont séparées en fonction de leurs
solubilités).
2.2 Méthodes d’analyse structurale
Les méthodes spectrales d’analyse, (par infrarouge, résonance
magnétique nucléaire, spectrométrie de masse), le dichroïsme cir-
culaire, la diffraction des rayons X contribuent à l’élucidation des
structures ; la thermogravimétrie, l’analyse calorimétrique différen-
tielle apportent leurs résultats.
Les méthodes chimiques traditionnelles sont également large-
ment utilisées : détermination des groupements fonctionnels thiols
libres, des oses liés aux protéines tels que les glycoprotéines, iden-
tification et dosage des additifs chimiques ajoutés comme conser-
vateurs, antioxydants, recherche et mise en évidence des produits
de dégradation. Tous ces impératifs mettent le plus souvent en
œuvre des méthodes chimiques faisant notamment appel à la spec-
trophotométrie dans le visible.
Enfin, la modélisation moléculaire intervient sous la forme d’étu-
des conformationnelles et d’optimisation des structures tridimen-
sionnelles des molécules.
Elle permet la visualisation des macromolécules, la prédiction ou
l’affinement des structures, la simulation des mécanismes d’action.
Que l’on se place au niveau de la recherche, du développement
ou du contrôle industriel, l’analyse des macromolécules obtenues
par des procédés biotechnologiques impose des contraintes très
lourdes. Dans le cadre des méthodes physiques, physicochimiques
ou chimiques d’analyse, leur mise au point comporte la validation
de tous les procédés mis en œuvre : spécificité, précision, repro-
ductibilité doivent être vérifiées à chaque niveau et lors de chaque
essai. La nécessité de disposer d’étalons de référence exige des
études faites en collaboration et une harmonisation des procédés.
Malgré toutes les contraintes rencontrées, les produits biotechnolo-
giques constituent une voie d’avenir en pleine extension. Sur le plan
de l’analyse, l’évolution conduira à améliorer la fiabilité et les per-
formances des méthodes actuelles et à en développer de nouvelles.
L’analyse de tels produits est l’affaire de toutes les disciplines
concernées ; pour sa part, le chimiste analyste apporte son expé-
rience personnelle et la parfaite connaissance de son domaine. Son
efficacité est d’autant plus grande qu’il possède une connaissance
plus claire des autres domaines concernés.
La rubrique Analyse des macromolécules biologiques et applica-
tions répond à ce double objectif. Les données biologiques étant
souvent peu familières aux chimistes analystes, on trouvera dans
l’article Généralités [P 3 305] la définition des termes utilisés.