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IMPLICATION DES MICROORGANISMES DANS LA PRODUCTION DES

COMPOSES PHENOLIQUES AU COURS DE LA FERMENTATION DU JUS DE
GINGEMBRE (Zingiber officinale Roscoe).

Technical Report · August 2018

DOI: 10.13140/RG.2.2.24963.32809

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2 authors, including:

Aimé Christian Kayath

Marien Ngouabi University
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 UNIVERSITE MARIEN NGOUABI
FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES

FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES

Année : 2018 No d’ordre :
MEMOIRE
Pour l’obtention du diplôme
de Master ès Sciences et Techniques
Mention : Biologie
Parcours : Sciences biologiques
Spécialité : Biologie Cellulaire et Moléculaire
Option : Biochimie et microbiologie appliquée

Présenté et soutenu publiquement

Le 13/08/2018
Par
OPA-ILOY Méddy
Titulaire d’une licence de Biologie Cellulaire et Moléculaire
THEME :

IMPLICATION DES MICROORGANISMES DANS LA

PRODUCTION DES COMPOSES PHENOLIQUES AU COURS
DE LA FERMENTATION DU JUS DE GINGEMBRE (Zingiber
officinale Roscoe).

Superviseur scientifique
NGUIMBI Etienne, Maitre de Conférences, CAMES/FST/UMNG
Directeur de mémoire
Aimé Christian KAYATH, Maitre-Assistant, CAMES/FST/UMNG
JURY
Président : Arsène LENGA, Maitre de Conférences, CAMES/FST/UMNG
Membres : Roch Fabien Niama, Maitre-Assistant, CAMES/FST/UMNG
Aimé Christian KAYATH, Maitre-Assistant, CAMES/FST/UMNG

i
 DEDICACES
Je dédie ce travail :
A mon cher père OPA Jean et à ma très chère mère MAFOUTA Colette, qui m’ont éduqué,
encadré et cru en moi. Ils m’ont appris à ne jamais baisser les bras. Que ce travail vous
honore.
A mon très cher fils ILOY Mafouta Précieux Nedhan

ii
 REMERCIEMENTS
Je remercie, le Professeur NGUIMBI Etienne d’avoir accepté de superviser ce travail, pour
ces multiples conseils, son soutien et son coup d’œil scientifique.
Au Docteur Aimé Christian KAYATH, une gratitude toute particulière pour l’honneur que
vous m’aviez faite d’être le Directeur de mon mémoire. Pour votre disponibilité, votre rigueur
scientifique de mener à bien ce projet et votre patience envers moi, Merci. Votre assistance
multiforme, vos encouragements et votre vision fédératrice ont totalement contribué à booster
ma compréhension des sciences biologiques et ont permis d’apprécier le monde merveilleux
de la recherche scientifique.
Avec vous, j’ai compris le sens de la collaboration scientifique orientée résultats. Je tiens à
remercier le Docteur GOUOLLALY TSIBA, pour ces conseils, son soutien scientifique et
sa patience.
A tous les membres du JURY, Merci d’avoir accepté de juger ce travail et d’avoir apporté
votre contribution scientifique.
Je remercie le Docteur MADZELE, Madame Dandrine, Madame Carine Bouanga, ainsi
que le staff du laboratoire de Biologie Moléculaire de l’IRSEN.
A l’ensemble du collectif des enseignants et techniciens de laboratoire du sous parcours de
Biologie Cellulaire et Moléculaire de la Faculté des Sciences et Techniques, l’addition
coordonnée de vos contenus notionnels ont fait grandir la benjamine scientifique que je suis.

A mes amis et connaissances BALOKI Tarcisse, KAYA Doria, Nguimbi Effort, LOKO
Sagesse, BOUMBA Luce, MANDAVO Laurine, MATSOUMBA Jorcia, KOUMBEMBA
Gloiriche, MALHELA Loïc, NGUIMBI Priscillia, YOULOU Syl, SOLOKA Armel,
MWANA, Lévy et OYOMBI, pour tous les moments passés ensemble, je vous en remercie.

A mes oncles et tantes : MAFOUTA Raymond, Edouard, Euriade, Blanchard, Charlin,

OKO Brice, MAFOUTA Brigitte, Faustine, Pauline, Marie, OPA Georgette, OKAKA
Prudence, IPEMBA Mireille, Bernice, Armelle, pour votre soutien familial.

A mes Frères et Sœurs : OPA Emmanuel, Junior, Prince, Tecle EBAKASSA, MAFOUTA
Naïka, Edo, Edison, Eulor, Elisa, Vince, Céline, Saha, Veronica, et les autres. Que ce
travail vous soit une fierté pour vous.

iii
 LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Place de la famille des Zingibéracées selon la classification APG IV (Gigon .F,
2012 ; Angiosperms Phylogeny Group, 2016).........................................................................6
Tableau II : Composition nutritionnelle de gingembre (Neveu et al., 2010; Kubra et Rao,
2012 ; Mahdi et al., 2013; Rashidian et al., 2014; Al-Nahain et al., 2014). ..............................7
Tableau III : Les systèmes de protection par les antioxydants .............................................12
Tableau IV : Composition du Milieu Sabouraud..................................................................15
Tableau V : Mélange réactionnel de la PCR ........................................................................17
Tableau VI : Programme PCR .............................................................................................18
Tableau VII : Séquences d’amorces spécifiques aux espèces ...............................................18
Tableau VIII : Caractéristiques culturales et morphologiques des isolats des levures...........25

iv
 LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Rhizome de Zingiber Officinale Roscoe ................................................................6

Figure 2 : Protocole de fabrication du vin de gingembre ......................................................24
Figure 3 : Boite de pétri montrant les colonies isolées du milieu Sabouraud, échantillon du
vin de gingembre ..................................................................................................................25
Figure 4 : Electrophorèse sur gel d’Agarose à 1%, après amplification en utilisant 2 couples
d’oligonucléotides des souches GS4,GS5,GS13,GS15,GS17,GS19 et GS20. ........................26
Figure 5 : Dosage du degré d’alcool des échantillons après 45 jours.....................................27
Figure 6 : Courbe d’évolution de l’acidité totale au cours de la fermentation .......................28
Figure 7 : Courbe d’évolution du pH au cours de la fermentation.........................................28
Figure 8 : Variation de la production des polyphénols en fonction du temps d’un échantillon
sucré (ES) et non sucré (ENS). .............................................................................................29
Figure 9 : Production des flavonoïdes au cours de la fermentation du jus de gingembre d’un
échantillon sucré (ES) et non sucre (ENS). ...........................................................................30

v
 LISTE DES SIGLES ET DES ABBREVIATIONS

bp « base pair » (paire de base, en Français)

ADN Acide Désoxyribonucléique
AG Acide gallique
ARN Acide Ribonucléique
ADP Adenosine Di-Phosphate
APG Angiosperms Phylogeny Group
BET Bromure d’éthidium
Cat Catéchine
cm Centimètre
CO2 Dioxyde de carbone
AlCl3 chlorure d’aluminium
HCL Chlorure d’Hydrogène
°C Degré Celsius
DO Densité Optique
dNTP Désoxyribonucléotides triphosphate
Eq Equivalent
EDTA Ethylène Diamine Tétra-Acétique
g Gramme
Na2CO3 Carbonate de sodium
h Heure

KOH hydroxyde de potassium

Kb kilo-base
Kcal Kilocalorie
L Litre
NaNO2 Nitrite de sodium
MT Marqueur de taille pour ADN
Ms Matière sèche
µM micro molaire
µL Microlitre
Mm milli molaire
Mg Milligramme
mL Millilitre
Min Minute

vi
Ng Nanogramme
Nm Nanomètre
NAD Nicotinamide adénosine di phosphate
N Normalité
PBS Phosphate Buffered Saline
Pi Phosphate inorganique
pH potentiel Hydrogène
PCR Réaction de polymérisation en chaine (Polymerase Chain Reaction, en anglais)
Rpm Round per minute (tour par minute, en français)
S Secondes

SDS sodium dodecyl sulfate

TAE Tris-Acétate-EDTA
UV ultra-violet
UFC Unité Formant Colonie

vii
Table des matières
INTRODUCTION ................................................................................................................1
1. Contexte et justification ...............................................................................................2
2. Problématique ..............................................................................................................3
3. Hypothèse ....................................................................................................................3
4. Objectif général ...........................................................................................................3
5. Objectifs Spécifiques ...................................................................................................3
CHAPITRE I : REVUE BIOBLIOGRAPHIQUE ..............................................................5
I.1. Présentation de la plante................................................................................................6
I.1.1. Description .............................................................................................................6
I.1.6. Caractéristiques organoleptiques et composition du gingembre...............................7
I.1.7. Uutilisation du gingembre ......................................................................................8
I.2. Les fermentations .........................................................................................................9
I.3. Les aliments fermentés................................................................................................ 10
I.4. Caractéristiques des levures ........................................................................................ 10
I.5. Les composés phénoliques .......................................................................................... 11
I.5.1. Les flavonoïdes .................................................................................................... 11
I.5.2. Rôle des antioxydants ........................................................................................... 12
CHAPITRE II. MATERIELS ET METHODES .............................................................. 14
II.1.Matériels .................................................................................................................... 14
II.1.1. Matériel végétal .................................................................................................. 14
II.1.2. Matériel de laboratoire ........................................................................................ 15
II.1.3. Milieux de culture ............................................................................................... 15
II.2.Méthodes .................................................................................................................... 15
II.2.1. Echantillonnage................................................................................................... 15
II.2.2. Détermination des paramètres microbiologiques ................................................. 15
II.2.3. Identification moléculaire des levures.................................................................. 16
II.2.4. Détermination des paramètres biochimiques ........................................................ 19
CHAPITRE III.RESULTATS ET DISCUSSION .......................................................... 23
III.1. Résultats................................................................................................................... 24
III.1.1. Obtention du diagramme de fermentation du vin de gingembre .......................... 24
III.1.2. Etude microbiologique ....................................................................................... 24
III.1.2. Caractères phénotypique et morphologique ........................................................ 25
III.1.3. Identification moléculaire des levures ................................................................ 26

viii
 II.2.4. Détermination des paramètres biochimiques ........................................................ 27
III.2. Discussion ................................................................................................................ 31
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ............................................................................... 33

ix
INTRODUCTION

1
 1. Contexte et justification
En République du Congo, le jus de gingembre est commercialisé localement et est fortement
consommé. Aucune étude n’a été documentée sur la fermentation du jus de gingembre, ou
encore sur la liqueur obtenue à partir de la distillation d’une boisson fermentée de gingembre.
Le gingembre est plutôt connu pour son utilisation relative aux aspects culinaires. Il est utilisé
parmi les épices caractéristiques depuis plus de 2000 ans en cuisine, le Zingiber officinale
Roscoe, communément connue sous le nom de gingembre (Birlouez, 2012, Faivre et al.,
2006, Datta et al., 2011; Elkirdasy et al. 2015; Mukherjee et al., 2014). Il comprend 47
genres et 1400 espèces (Datta et al., 2011; Elkirdasy et al., 2015; Mukherjee et al.,2014;
Nandkangre et al., 2015). Le gingembre appartient à la famille de Zingibéracées, au genre
Zingiber et à l’espèce Zingiber officinale Roscoe (Faivre et al ., 2006 ; Gigon 2012).
Largement employé dans la cuisine asiatique pour ses qualités organoleptiques et ses
capacités tant gustatives que laxatives. Le gingembre est aussi une épice médicinale aux
multiples propriétés thérapeutiques (Gigon, 2012). La composition des rhizomes de
gingembre est de 97,19% hydrates de carbone, 0,16 % de cendre, 0,55 % de graisse brute,
1,05 % de fibres brutes, 1,05% de protéine (g/100g de poids sec). La teneur des acides
organiques (mg/g de poids sec) est de 0,04 d'acide citrique, 0,02 d'acide malique, 14,13
d'acide oxalique, 0,06 d'acide succinique et 23,08 de acide tartrique (Leonel. M et al., 2015).
Le gingérol et le shogaol sont responsables du goût piquant (Yeh et al., 2014).L’analyse
chimique du gingembre indique qu’il contient plus de 400 différents composés comme les
carbohydrates (50-70%), les lipides (3-8%) (Prasad et Tyagi, 2015) de types acides oléiques
et linolénique (10%) (Gigon, 2012), des terpènes, des composés phénoliques (Prasad et
Tyagi, 2015), des vitamines et des minéraux (Kim et al., 2015), des protéines (Prasad et
Tyagi, 2015) et de l’oléorésine (Gigon, 2012). Il est généralement consommé en tant que
pâte fraîche, poudre sèche, tranches préservées en sirop, gingembre caramélisé, infusion de
thé (Sadineni et al, 2016). Dans beaucoup de pays, particulièrement en l'Inde et Chine, le
gingembre frais est employé comme aromatisant dans les boissons et beaucoup d'autres
préparations de nourriture (Shukla et Singh, 2007).

Sur la base de sa richesse en antioxydant (Vitamine E, Vitamine C, Taurine, Caroténoïdes,

Polyphénols, Minéraux et oligo-éléments), nous avons choisi de fabriquer une boisson
fermentée à base du jus de gingembre et nous allons chercher à comprendre l’évolution des
antioxydants au cours de la fermentation.

2
 2. Problématique
De nombreuses études ont été réalisées en République du Congo sur les aliments et boissons
fermentés. Ces études ont été principalement focalisées sur les aspects microbiologiques et
biochimiques. La liste des boissons fermentée ne cesse de voir le jour avec des diagrammes
de fabrication qui demeurent traditionnels. C’est le cas d’une nouvelle boisson fermentée à
base du jus de gingembre, une fermentation que nous avions réalisée dans le cadre de ce
travail. Aucune étude n’a été faite sur l’isolement et la caractérisation des microorganismes à
partir de ce type de boisson. Comme pour plusieurs boissons fermentées et consommées en
République du Congo, la valeur nutritionnelle et les qualités organoleptiques sont peu
connues. Ce travail s’inscrit dans le cadre d’une contribution à la caractérisation physico-
chimique et à la valorisation du vin de gingembre.

3. Hypothèse
La production des composés phénoliques au cours de la fermentation du jus de gingembre est
évaluée et les microorganismes impliqués dans la production de ces composés sont identifiés.

4. Objectif général
L’objectif général de ce travail est de contribuer à la valorisation du vin de gingembre et de
comprendre l’implication des microorganismes dans la production des composes phénoliques
au cours de la fermentation du jus de gingembre.

5. Objectifs Spécifiques
De manière spécifique, il s’agit de :
1. Isoler les microorganismes impliqués dans la fermentation du vin de gingembre;
2. Réaliser une caractérisation physico-chimique quant au pH, au degré d’alcool et à
l’acidité;
3. Doser les polyphénols et particulièrement les flavonoïdes au cours de la
fermentation ;
4. Identifier, par les technologies de l’ADN, les microorganismes impliqués dans la
production des polyphénols.

3
Notre travail s’articule autour de trois chapitres. Le premier chapitre est consacré à la revue
bibliographique des connaissances axées sur le gingembre, la fermentation et les aliments
fermentés, la classification des levures et les composés phénoliques.
Dans le deuxième chapitre relatif à l’étude expérimentale, nous allons décrire le matériel et les
méthodes mis en œuvre dans le cadre de la réalisation de ce travail.
Dans le troisième chapitre, les résultats obtenus y sont relatés et discutés de manière
rigoureuse.
Enfin, une conclusion récapitule les principaux résultats de ce travail, suivie de la présentation
des différentes perspectives envisagées pour la poursuite de notre thématique de recherche.

4
CHAPITRE I : REVUE BIOBLIOGRAPHIQUE

5
I.1. Présentation de la plante

I.1.1. Description

Le gingembre est une plante tropicale herbacée vivace poussant dans les régions tropicales et
humides, se dressant sur une tige de 1,50 m en moyenne, mais pouvant atteindre 3 m de haut.
La partie souterraine utilisée est le rhizome. Celui-ci se divise dans un seul plan et est
constitué de tubercules globuleux ramifiés. La peau du rhizome est beige pâle et sa chair est
jaune pâle juteuse, l’odeur est aromatique avec une saveur chaude et piquante (Gigon, 2012)
Les rhizomes sont récoltés après 9 à 10 mois (Faivre et al. 2006). Le tableau ci-dessous
reprend la classification systématique de la plante.

Figure 1 : Rhizome de Zingiber Officinale Roscoe

Tableau I : Place de la famille des Zingibéracées selon la classification APG IV (Gigon,

2012 ; Angiosperms Phylogeny Group, 2016)

Règne Plantae
Sous-règne Trachéobionta
Division Angiospermes
Classe Monocotylédones
Sous- classe Commelinidées
Ordre Zingibérales
Famille Zingibéracées
Sous famille Zingibéroïdées
Tribu Zingiberées
Genre Zingiber Mill
Espèce Zingiber officinale Roscoe

6
I.1.6. Caractéristiques organoleptiques et composition du gingembre

L’huile essentielle et l’oléorésine sont les deux produits responsables de la saveur et de

l’aigreur caractéristiques du gingembre (Kubra, 2012). L’huile essentielle de gingembre est
principalement constituée de zingiberène (28,05%), d’ar-curcumène (14,06%), de β-
bisabolène (13,15%), d’α-sesquiphellandrène (12,91%), de sabinène (9,32%) et de camphène
(4,06%) (Rashidian, 2014).

L’analyse chimique du gingembre indique qu’il contient plus de 400 différents composés, qui
sont les carbohydrates (50-70%), les lipides (3-8%) (Prasad et Tyagi, 2015) de types acides
oléiques et linolénique (10%) (Gigon, 2012), des terpènes, des composés phénoliques
(Prasad et Tyagi, 2015), des vitamines et des minéraux (Kim et al., 2015), des protéines
(Prasad et Tyagi, 2015) et de l’oléorésine (Gigon, 2012).

L’oléorésine contient des composés responsables de la saveur très marquée du gingembre.

Certains appartiennent à la famille des vanilloïdes et sont connus sous le nom de 3-, 6-, 8-, 10-
et 12-gingérols. Ces composés ont une chaîne latérale de longueur variable, respectivement de
7, 10, 12, 14 ou 16 carbones (Gigon, 2012, Ok et Jeong, 2012). Ils sont accompagnés de
gingédiols et de paradols (Gigon, 2012). Le zingérone et le shogaol sont des produits de la
dégradation du gingérol sous l’action de la chaleur (Gigon, 2012).

L’odeur et la saveur caractéristique du gingembre sont dues aux huiles volatiles

essentiellement riches en gingerols et shogaols (Prasad et Tyagi, 2015).

Tableau II : Composition nutritionnelle de gingembre (Neveu et al., 2010; Kubra et Rao,

2012 ; Mahdi et al., 2013; Rashidian et al., 2014; Al-Nahain et al., 2014).

Nutriment Quantité par 100 g % de l’apport journalier

recommandé
Energie 332 Kcal 17%
Eau 9,94 g -
Protéines 8,98 g 18%
Lipides 4,24 g 6%
Huile et sucres
Acides gras saturés 2,6 g -
Oméga 3 0,223 g 2%
Oméga 9 0,357 g -
Glucides 57,5 g 21%
Sucres 3,34 g 4%
Fibres 14,1 g 56 %
Minéraux et oligo-éléments

7
Calcium 114 mg 14%
Cuivre 0,48 mg 48%
Fer 19,8 mg 141%
Magnésium 214 mg 57%
Manganèse 33,3 mg -
Phosphore 168 mg 24%
Potassium 1320 mg 66%
Sélénium 0,70 mg 1%
Sodium 27 mg 1%
Zinc 3,64 mg 36%
Vitamines
Vitamine A 18 µg 2%
Vitamine B1 0,046 mg 4%
Vitamine B2 0,17 mg 12%
Vitamine B3 9,62 mg 60%
Vitamine B5 0,477 mg 8%

I.1.7. Utilisation du gingembre

Le gingembre est beaucoup utilisé en cuisine, frais ou séchée (Ding et al., 2012), notamment
dans la fabrication du pain, de biscuits et de desserts sous forme de cocktail, dans les mets à
base de viandes, de poissons, du poulet et dans les soupes de toute sorte (Charles, 2013).
Le gingembre est également utilisé en industrie agroalimentaire pour aromatiser les
confiseries et pour la production de boissons alcoolisées ou non alcoolisées (Sangwan et al.,
2014). La consommation de gingembre aide à lutter contre l’action des radicaux libres et de
prévenir les maladies neurodégénératives et certains cancers comme le cancer de la prostate
(Aggarwal et Shishodia, 2005; karna et al., 2012). Le gingembre a une efficacité
remarquable car il améliore l’efficacité d’un traitement du cancer cervical (Sharma et al.,
2009). Le gingembre est aussi utilisé en industrie pharmaceutique et en médecine
traditionnelle (Li et al., 2016; Makanjuola et al., 2015) pour soigner les nausées et les
vomissements ( Daily et al., 2015; Naderi et al., 2015; Prasad et Tyagi, 2015), la douleur,
le rhume (Gomar et al., 2014; Khandouzi et al., 2015), l’arthrite, les rhumatismes (Lee et
al., 2013; Mashhadi et al., 2013), les crampes, la fièvre, les infections (Danciu et al., 2015),
les troubles gastro-intestinaux (Giacosa et al.,2015; Li et al., 2016), les migraines (Gigon,
2012; Li et al.,2016), les flatulences et les coliques (Singh et al., 2014), il est considéré
comme agent de désintoxication pour les alcooliques (Motawi et al., 2011), vermifuge
(Charles, 2013; Khodaie et Sadeghpoor, 2015), il est utilisé pour soigner la constipation,
l’asthme, les maladies nerveuses, le mal de dents (Lee et al., 2013), la maladie d’Alzheimer
(Danciu et al. , 2015), les maux d’estomac, les diarrhées (Akinola et al., 2014).

8
I.2. Les fermentations
On appelle fermentation toute transformation de matières premières due au moins en partie à
l’action d’enzymes microbiennes (bactéries, levures et moisissures) (Lortal, 2015). Elle peut
être encore définie comme une réaction biochimique qui consiste à produire de l'énergie
nécessaire à partir d'un substrat organique sous l'action des enzymes microbiennes et libérer
des produits (Babacar, 2002). La fermentation constitue l’une des plus anciennes formes de
préparation et de conservation des aliments (Dirar, 1993). Elle est réalisée généralement pour
accroître la diversité dans les types d’aliments et de boissons disponibles, pour transformer
des matières premières non comestibles en aliments, pour développer une grande diversité de
saveurs, d’arômes et de textures, pour améliorer la valeur nutritionnelle, pour diminuer la
toxicité et prolonger la durée de conservation des aliments, et pour réduire le temps de cuisson
et des besoins en énergie (Steinkraus, 1996). Les fermentations sont au cœur de nos régimes
alimentaires, tant sur le plan socio-culturel que gustatif (Lortal, 2015) et parfois garants de la
sécurité alimentaire de certains pays (Motarjemi, 2002).

Il existe plusieurs types de fermentations : La fermentation alcoolique, lactique, acétique,

propionique, acide mixte, méthanique etc.
La fermentation alcoolique est très répandue chez les levures, Saccharomyces, Kluveromyces,
Brettanomyces etc. Peu de bactéries (Zymomonas mobilis, Zymomonas lindnerie,
Zymosarcina ventriculi,…) réalisent la fermentation (référence).
Dans la fermentation alcoolique par la levure, le cycle métabolique débute par la glycolyse
ou voie d’Embden-Meyerhof-Parnass. C’est ensuite l’acétaldéhyde, produit de la
décarboxylation du pyruvate, qui est l’accepteur d’électrons. La réduction de l’acétaldéhyde
est assurée par l’alcool déshydrogénase en présence de NADH.

Les souches de levures assurant la fermentation alcoolique tolèrent des concentrations élevées
d’éthanol, plus de 15% (v/v), que supportent peu de micro-organismes. Toutefois, cette
tolérance varie d’une souche à l’autre.

Certaines fermentations peuvent être dérivées du cycle de l’acide tricarboxylique ou du shunt

glyoxylique. Escherichia coli, Pseudomonas et de nombreuses espèces de moisissures sont
impliquées dans ces fermentations (KOBAWILA, 2003).
En ce qui concerne la fermentation acétique, elle provient de l’oxydation de l’alcool. Elle est
utilisée pour la production du vinaigre à partir du vin. Les bactéries acétiques du genre
Clostridium aceticum, C. thermoaceticum, Acetobacter woodi sont peu citées (Rose, 1981).

9
Les entérobactéries comme Escherichia coli, Salmonella et Enterobacter sont impliquées
dans la fermentation acide mixte (references).

I.3. Les aliments fermentés

Les aliments fermentés sont les aliments qui subissent la transformation par les
microorganismes secrétant des enzymes en particulier les amylases, protéases, lipases et les
nucléases. Ces enzymes transforment les macromolécules comme les polysaccharides, les
protéines, les lipides et les acides nucléiques en métabolites divers. L’activité enzymatique
génère des caractères organoleptiques tels les saveurs, des arômes et textures agréables et
attrayants pour la consommation humaine (Sarkar et al. ,1995).

En République du Congo les aliments fermentés sont très variés (Kayath et al,2016). Les
aliments fermentés jouent un rôle important dans le régime alimentaire au Congo Brazzaville.
Certaines céréales, fruits, légumes, tubercules et poissons servent de matières premières pour
l’atteinte de divers produits fermentés comme la bouillie, bière et autres produits. Parmi les
aliments fermentés, nous avons : la « Poto-poto » (pâte de maïs fermentée) , les « Bikedi »
(tubercule de manioc fermenté), « Ntoba bodi » (Feuilles de manioc fermentées) et le Nsamba
(vin de palme) (Kayath et al, 2016). Dans la plupart de ces aliments fermentés, les
microorganismes du genre Saccharomyces y ont été retrouvés. Dans les pays développés ces
aliments sont le plus souvent d’origine laitière et les principales bactéries impliquées dans leur
fermentation sont les bactéries lactiques qui sont actuellement utilisées comme cultures
starters dans de nombreux processus de fermentation industrielle (Lücke, 2000). Les aliments
non laitiers sont essentiellement les boissons alcoolisées (vin), la charcuterie (saucisson) et
quelques végétaux (olives, choucroute) (Vouidibio, 2016)

I.4. Caractéristiques des levures

Les microorganismes du genre Saccharomyces cerevisiae" ont la caractéristique de croitre a
des températures de 30°C et peuvent supporter des pH de l’ordre de 4,5. Leur mode de
respiration est aérobie et anaérobie facultatif. Les levures se reproduisent par multiplication
sexuée et asexuée. Elles se distinguent aussi par des caractéristiques biochimiques
particulières (utilisation des sucres) en fermentant le glucose, galactose, maltose, saccharose.
Elles ont aussi une fermentation variable pour le tréhalose et le raffinose. Les Saccharomyces

10
ont une assimilation variable pour le tréhalose, n'assimile pas le lactose (YACINE, 1993) cité
par (Bouras, Bourega et Khineche, 2006).

I.5. Les composés phénoliques

Dénommés aussi polyphénols, sont des molécules spécifiques du règne végétal et qui
appartiennent à un métabolisme secondaire (Huang et Sumpio, 2008 et Japon-Lujan et al.,
2008); ils se retrouvent dans toutes les parties de la plante, de racine jusqu'aux fruits. La
survie de la plante n’est pas dépendante de la présence de ces molécules, mais leur fonction
majeure est dans l’interaction de la plante avec son environnement (Keys et Keys, 1975).
Les polyphénols regroupent plus de 8000 molécules divisées en différentes classes chimiques
qui ont en commun: la présence dans leur structure d’au moins un cycle aromatique, lui-même
porteur d’un nombre variable de fonctions hydroxyles (OH) (Hannebelle et al., 2004).
Calabrese, (2003) a classé les polyphénols en trois principaux groupes: les Acides
phénoliques, les flavonoïdes et les Tanins. Les composés phénoliques sont synthétisés dans la
voie shitimique chez les végétaux (Crozier et al., 2006). Ils jouent le rôle d’antioxydants
naturels et suscitent de plus en plus d’intérêt pour la prévention et le traitement du cancer, des
maladies inflammatoires, cardiovasculaires et neurodégénératives. Ils sont également utilisés
comme additifs pour l’industrie agroalimentaire, pharmaceutique et cosmétique.

I.5.1. Les flavonoïdes

Les flavonoïdes sont des composés polyphénoliques comprenant 15 atomes de carbone

formant une structure C6-C3-C6, soit deux noyaux aromatique (A et B) et un hétérocycle
oxygéné (cycle C) (Chira et al., 2008). Ces molécules sont responsables des colorations
jaune, orange et rouge des végétaux notamment les fruits, les légumes et les plantes en général
(Havsteen, 2002; Ghedira, 2005). Ces sont des substances phénoliques hydroxylées connu
pour être synthétisé par les plantes en réponse à des infections microbiennes (Dixon et al.,
1983)

Les flavonoïdes interviennent dans les processus de défense contre le rayonnement UV et les
attaques des microorganismes pathogènes (Korkina et al., 1997). La classe des flavonoïdes
comporte à elle seule plus de 4000 substances qui ont été isolées et identifiées à partir des
milliers de plantes (Zough lache, 2008), elles sont divisées en plusieurs catégories dont les
principales sont les flavones, les flavonols, les flavan-3-ols, les isoflavones, les flavanones et

11
les anthocyanidines. La structure de base de ces différents flavonoïdes peut subir de
nombreuses substitutions, les groupements hydroxyles étant généralement en positions 4, 5 et
7. Ces substances existent généralement sous formes de glycosides (Afanas’eva et al., 2001).

Ils jouent un rôle très important dans le traitement du diabète (inhibant l’aldose réductase), de
la goutte (inhibant la xanthine oxydase), des inflammations (inhibant la lipoxygenase, la
phospholipase et la cyclooxygenase), des hépatites, des tumeurs, de l’hypertension
(quercétine), des thromboses (flavonols), des allergies et des affections bactériennes et viraux
(anti-HIV) (Anderson et al., 1996 ; Cowan, 1999).

Les flavonoïdes agissent aussi comme un système de défense antioxydant secondaire dans les
tissus végétaux exposés à différents stress abiotiques et biotiques (Kumar et Pandey,2013).

Les flavonoïdes inhibent la production de protéines de choc dans plusieurs lignées cellulaires
malignes, y compris le cancer du sein, la leucémie et le cancer du côlon (Davis et al.,2000).
les buveurs de vin modérés semblent également avoir un risque moindre de développer un
cancer du poumon, de l'endomètre, de l'œsophage, de l'estomac et du côlon (Koen et al.,
2005)

I.5.2. Rôle des antioxydants

Ces sont des molécules qui sont capables de neutraliser les formes actives de l’oxygène et
permet de maintenir au niveau de la cellule et de l’organisme des niveaux non cytotoxiques de
radicaux libres. Ils sont capables de stopper ces réactions en chaine en se réduisant avec les
radicaux libres et en inhibant ainsi leur action (Kara ,2015). Il existe deux moyens pour
fournir les antioxydants permettant de protéger l’organisme : les systèmes enzymatiques et les
nutriments antioxydants (Pastre, 2005).

Les antioxydants ont la capacité de contrecarrer les effets néfastes des radicaux libres dans les
tissus. Ils protègent contre le cancer, l'artériosclérose, les maladies cardiaques et plusieurs
autres maladies (Bandyopadhyay et al., 2007).

Tableau III : Les systèmes de protection par les antioxydants

Les antioxydants enzymatiques Système antioxydants d’origine

Endogènes Alimentaire
Superoxyde dismutase Vitamine E (les tocophérols)

12
 Glutathion peroxydase Vitamine C (acide ascorbique)
Catalase (s) Taurine
Lipases, protéases, endonucléase Caroténoïdes (lycopène, lutéine...)
(éliminent les molécules oxydées)
Albumine, ferritine (complexent les ions Polyphénols
divalents)
Minéraux et oligo-éléments(le sélénium)

13
 CHAPITRE II. MATERIEL ET METHODES

II.1.Matériel

II.1.1. Matériel végétal

Le gingembre a été acheté aux deux Arrondissements de Brazzaville. L’Arrondissement 2

Bacongo, au marché Total et l’Arrondissement 5 Ouenzé, au marché Texaco.

14
II.1.2. Matériel de laboratoire

Ce matériel est constitué par : l’autoclave pour la stérilisation, la verrerie, les étuves pour
l’incubation, un thermocycleur (Biorad) pour la PCR, des tubes eppendorf, des micro-tubes,
des micropipettes, des erlenmeyers, un bec bunsen, une cuve à électrophorèse, une lampe UV,
un spectrophotomètre, pour ne citer que ceux-là.

II.1.3. Milieux de culture

Dans ce travail, nous nous sommes intéressés particulièrement aux levures. Le milieu de
culture utilisé a été le Sabouraud qui permet la croissance et l’isolement d'une grande variété
de levures et moisissures. Ce milieu est supplémenté avec le chloramphénicol, un antibiotique
relativement thermostable, à large spectre, qui bloque la réaction de la peptidyltransférase
ribosomale chez les procaryotes (Dieng, 1999). Il a été utilisé dans le Sabouraud pour inhiber
la croissance des bactéries.

Tableau IV : Composition du milieu Sabouraud

Noms du milieu de culture Composition pour 1 L

- Peptone pepsique de viande.........................10g

- Glucose........................................................20g
Gélose Chloramphénicol - Chloramphénicol........................................0,5g
- Agar ............................................................15g
- pH = 7

II.2. Méthodes

II.2.1. Echantillonnage

Les échantillons ont été achetés aux marchés Texaco et Total de Brazzaville. 80 g de
tubercules de gingembre ont été lavés et broyés, puis 1L d’eau ont été ajoutés (soit 10), le
mélange a été tamisé, ensuite 120 g de sucre ont été ajoutés (soit 12%). Après agitation le
mélange a été transvasé dans une bouteille d’un litre pour le processus de fermentation, après
sept (7) jours de fermentation, le moût a été recueilli pour faire les dilutions décimales.

II.2.2. Détermination des paramètres microbiologiques

15
II.2.2.1. Isolement et purification
L’isolement a été faite par dilution au dixième soit 1 mL du moût de gingembre dans 9 mL
d’eau physiologique. Ce qui a constitué la solution mère. Après 1 minute d’homogénéisation,
des dilutions décimales en série (10-2 à 10-8) ont été préparées à partir de cette solution mère.
100 µL de chaque dilution sont étalés sur la surface de la gélose préalablement coulée et
solidifiée dans des boîtes de pétri. Puis ces boites sont incubées à 37°C en aérobiose dans
l’étuve pour la croissance des microorganismes, pendant 24 à 48 h. Les souches de levure sont
ensuite purifiées par subcultures sur gélose nutritive jusqu’à l’obtention de colonies bien
distinctes et homogènes. La purification des souches a été vérifiée par observation au
microscope optique (VISIOPTIC) à l’objectif 40x.

II.2.2.2. Caractérisation phénotypique

Les souches de microorganismes ont été identifiées par les techniques classiques de
microbiologie. Ces techniques sont basées sur la recherche d’un certain nombre de caractères
phénotypiques tels que la morphologie cellulaire et celle des colonies. A partir de l’état frais
observé au microscope optique, nous avons pu identifier les différents microorganismes.
L’état frais a été fait en utilisant un microscope optique (VISIOPTIC). La lecture de la
préparation microscopique a été faite à l’objectif 40x

II.2.3. Identification moléculaire des levures

II.2.3.1. Extraction de l’ADN des isolats

Une culture de nuit de 24h a été préalablement lancée sur bouillon LB avec les différentes
souches. 3 mL de la culture a été prélevé à l’aide d’une micropipette et centrifugé à 1000 rpm
pendant 1 minute. Le surnagent a été jeté, ensuite 200 µL de solution EP constitué de :
Chloride de sodium (200 mM), Acétate de sodium (300 mM), 20 µL de lysozyme 10 mg/ml
ont été ajoutés dans le culot contenu dans le tube eppendorf. Le mélange a été incubé dans
une étuve pendant 10 min à 37°C. 400 µL de solution de lyse (lysis binding buffer : High pure
RNA isolation kit Roche) a ensuite été ajouté au mélange. Le tout a été vortexé pendant 1 min
à l’aide d’un vortex. Le mélange a été centrifugé pendant 20 min à 10000 rpm. Le surnageant
a été prélevé et transféré dans un autre tube. Un volume de 600 µL d’éthanol (95%) à froid a
été ajouté au surnageant. Le mélange a été incubé pendant 20 min à froid à une température
de -20°C. Une centrifugation a alors été faite pendant 20 min. Le surnageant a ensuite été jeté
et un volume d’1 mL d’éthanol (95%) à froid a été ajouté. Le mélange a été incubé pendant 10

16
min à froid à -20°C. Une centrifugation du mélange a été faite à 10000 rpm pendant 10 min.
Le surnageant a été jeté. Ensuite, les tubes ont été séchés à température ambiante pendant 20
min. Enfin un volume de 40 µL du tampon d’élution a été ajouté pour diluer l’ADN.

II.2.3.2. Réalisation de la réaction de polymérisation en chaine ou

Polymerase Chain Reaction (PCR)
La Réaction de polymérisation en chaîne est basée sur l’utilisation d’une polymérase
thermostable, la Taq polymérase, la méthode consiste à amplifier spécifiquement un fragment
d’ADN afin de le rendre détectable. Le matériel de départ est un brin d’ADN bicaténaire que
l’on sépare en chauffant le mélange réactionnel. Chaque brin monocaténaire servira de
matrice pour la synthèse du gène d’intérêt. Cette technique nécessite la présence d’amorces
complémentaires à la région d’ADN que l’on souhaite amplifier ainsi qu’une ADN
polymérase. La PCR est réalisée en plusieurs étapes de manière cyclique :

 Dénaturation de l’ADN bicaténaire par élévation de température ;

 Hybridation des amorces : une amorce sens et une amorce antisens vont s’hybrider sur
les brins d’ADN et délimitent ainsi la séquence à amplifier. La température
réactionnelle doit être inférieure à la température de fusion des amorces pour permettre
leur hybridation;
 Elongation des amorces hybridées sur la matrice par l’ADN Polymérase (activité 5’-3’).

Tableau V : Mélange réactionnel de la PCR

Composition Volumes Concentrations finales

ADN matrice (dépend de l’échantillon) 2 µL 2 ng/ µL
Amorces sens et anti-sens 2 µL de chaque 0,4 µM de chaque
dNTP 1 µL 200 µM
Enzyme : OneTaq 0,25 µL 1,25 unité/50 µL de PCR
Tampon polymérase (Buffer) 5X 10 µL 1X
Ajuster avec de l’eau jusqu’à 50 µL

Le mélangé a été distribué dans les tubes PCR et placé dans un thermocycleur (BIORAD).
Les amplifications ont été réalisées selon le programme ci-dessous :

17
Tableau VI : Programme PCR

Prédénaturation Dénaturation Hybridation Elongation Elongation

Finale
95°C, 5min à 95°C à 30 sec 55°C, 30 sec 72°C, 40 sec 72°C, 10 min

25 cycles

L’identification s’est réalisée en utilisant les oligo nucléotides SbayF1/SbayR1 correspondant

à Saccharomyces bayanus et le couple d’oligo ScerF2/ScerR2 correspondant à
Saccharomyces cerevisiae (Tableau VI)

Tableau VII : Séquences d’amorces spécifiques aux espèces

Espèces Amorces Séquences des amorces (5’-3’) Taille d’amplicon
(pb)
Saccharomyces bayanus Sbay F1 GCT GAC TGC TGC TGC TGC CCC CG 275
Sbay R1 TGT TAT GAG TAC TTG GTT TGT CG
Saccharomyces cerevisiae Scer F2 GCG CTT TAC ATT CAG ATC CCG AG 150
Scer R2 TAA GTT GGT TGT CAG CAA GAT TG

II.2.3.3. Electrophorèse sur gel d’Agarose

L’électrophorèse a pour principe, la séparation des fragments d’ADN ou d’ARN, en fonction
de leur taille. L’ADN étant chargé négativement, migre du pôle négatif vers le pôle positif.
Les molécules les plus grosses sont plus freinées par le support et vont migrer moins loin que
les petites molécules.

Réactifs
- TAE 50X : 242g Tris-HCL, 100ml EDTA 0,5M pH 8,57 1mL acide acétique
glacial, ajusté à 1L avec H2O distillée
- Agarose en poudre.
- Marqueur de taille : 2-log DNA ladder (BIOKE)
- Bromure d’éthidium (BET)
- Gel Loading Dye Purple (6x), no SDS

18
Méthode

Préparation d’un gel d’agarose de 1%

1 g de poudre d’agarose ont été pesés et mis dans 100 mL de TAE 0.5 X contenus dans un
erlenmeyer, le tout est dissout au four à microonde jusqu’à obtenir un liquide limpide. La
solution de gel tiède a été coulée dans un moule et déposée trois à quatre gouttes de BET,
mélangée puis le peigne a été placé pour créer les puits. Une fois solidifié, et le peigne retiré,
le gel est plongé avec son support dans une cuve à électrophorèse contenant du TAE 0.5x.
Les échantillons et le marqueur de taille sont ensuite déposés dans les puits du gel et on fait
migrer à voltage constant (100V) pendant 40 minutes. Le gel est exposé sur une lampe
ultraviolette UV et ensuite photographié (PANASONICS).

La concentration des produits a été calculée de manière empirique comme indiqué par le
fabriquant ayant fourni le marqueur de taille (BIOKÉ)

II.2.4. Détermination des paramètres biochimiques

II.2.4.1. Distillation du vin de gingembre et calcul du degré d’alcool

A l’aide d’une éprouvette de 500 mL, 250 mL de vin fermenté de gingembre ont été mesurés,
versés dans une fiole de 1L, puis raccordé au réfrigérant. La boisson fermentée a été chauffée
jusqu’à ébullition. La distillation est arrêtée après avoir recueilli plus des 3/4 du volume
d’éprouvette. Pour cela, le chauffage est arrêté, le ballon refroidi afin d’éliminer le vin restant
et le distillat est alors ramené à la température ambiante du vin.

Le degré alcoolique légal est le pourcentage volumique d’alcool mesuré à 20°C. Après
incubation du distillat à 20°C dans un bain marie contenant des glaçons, le distillat est vidé
dans l’éprouvette rincée préalablement à l’eau distillée. L’alcoomètre est plongé dans le
distillat stabilisé, l’équilibre de température étant réalisé, on lit la graduation en bas du
ménisque. L’alcoomètre est retiré et une prise de température est effectuée.

II.2.4.2. Dosage de l’Acidité titrable au cours de la fermentation

L’acidité titrable du vin, exprimé en teneur d’acide tartrique par unité de volume est
déterminée par titrimétrie à l’aide d’une solution d’hydroxyde de sodium 0,05N, en présence

19
de phénolphtaléine à 1% comme indicateur, selon la méthode colorimétrique décrite par
(Anonyme, 1980).

Dans une bouteille, le vin a été préalablement agité pendant deux minutes pour le débarrasser
de l’anhydride carbonique ensuite 20 mL ont été mesurés dans une éprouvette graduée et
transvasés dans une fiole jaugée de 100 mL. Après agitation, une dilution au 1/5 a été réalisée
en mélangeant 20 mL du vin agité avec 80 mL d’eau distillée et le mélange a été agité. Après
agitation, une distribution de 20 mL du mélange a été faite dans 4 béchers, la mesure du pH a
été réalisé 3 gouttes de phénolphtaléine ont été ajoutées. A l’aide d’une burette chacun de
mélange a été titré avec une solution de soude (NaOH) à 0,05M, sous agitation sur un
agitateur magnétique jusqu’au virage au rose vif et le volume de NaOH correspondant est
mesuré afin de déterminer la teneur en acide totale en mg/mL d’échantillon : en raison de
quatre (4) volumes ; trois (3) Vp et un Vr (Vr : volume rapide, Vp : Volume précis), ainsi que
les mesures du pH. Les calculs ont été effectués selon la formule suivante :

Cm en acide tartrique = (en g/L), avec V = Volume de NaOH 0,05 N (en mL), Ve
= Volume d’échantillon humide (en mL) et N = Normalité de la soude (NaOH)

II.2.4.3 Détermination du pH au cours de la fermentation

Le pH du vin a été déterminé par mesure directe grâce à un pH-mètre (HANNA). Le principe
consiste à introduire l’électrode d’un pH.- mètre dans un volume bien déterminé d’échantillon
du vin. Ensuite on lit directement la valeur du pH sur le cadre du pH- mètre. L’électrode du
pH-mètre est plongée dans 20 mL du vin préalablement homogénéisé chaque jour pendant 7
jours.

II.2.4.4. Séchage et extraction des composés phénoliques

 Séchage
Les racines de gingembre ont été lavées soigneusement avec de l’eau pour les débarrasser de
toutes les impuretés et coupées en fines rondelles. Après avoir broyés ces rondelles à l’aide
d’un mortier, le broyat obtenu a été séché dans une étuve réglée à 50 °C, pendant 72 heures.

 Préparation des extraits

 Analyse quantitative des polyphénols
Les extraits devant servir à réaliser le dosage des polyphénols totaux ont été obtenus en
mélangeant 50 g de la matière végétale séchée dans 500 mL (10 %) d’eau distillée dans 2
erlenmeyers de 1L. Les mélanges sont mis en agitation pendant 72 heures, puis filtrés. Le

20
filtrat obtenu du 1er erlenmeyers est distribué dans 6 petits flacons en raison de 30 mL. Le
filtrat du deuxième erlenmeyers est chaptalisé en ajoutant 20 g du sucre (SARIS, Nkayi) (4%)
et laisser à agitation, pendant 30 min pour dissoudre complètement le sucre.

Pour chaque échantillon, T0 représente l’échantillon analysé le premier jour à l’instant de la

filtration et analysé ; T1 correspond à 4 jours de fermentation ; T2 à 8 jours de fermentation;
T3 à 12 jours de fermentation ; T4 à 16 jours de fermentation) et T5 à 20 jours de
fermentation. Les contenus des flacons T1 à T5 ont été gardés à l’abri de la lumière en attente
d’être analysé.

II.2.4.5. Dosage des polyphénols totaux et flavonoïdes par spectrométrie UV

visible (méthode quantitative)

II .2.4.5.1. Dosage des polyphénols totaux (PPT)

Le réactif utilisé est le réactif de «Folin-Ciocalteu». Le principe de la méthode est basé sur
l’oxydation des composés phénoliques par ce réactif, elle entraîne la formation d’un nouveau
complexe molybdène-tungstène de couleur bleu qui absorbe à 725 nm, le dosage de PPT est
effectué par la comparaison de la DO observée à celle obtenue par un étalon d’acide gallique
de concentration connue.

Les composés phénoliques totaux sont dosés de la manière suivante. 0,1 mL de l’extrait de
plante est introduit dans un tube Eppendorf de 2 mL, l’extrait est ensuite dilué avec 0,9 mL
d’eau distillée ensuite 0,9 mL du réactif de Folin-Ciocalteu (1N) est ajouté puis
immédiatement après il est ajouté 0,2 mL d’une solution de Na2CO3 (20%). Le mélange
obtenu est incubé à la température ambiante pendant environ 40 minutes à l’abri de la
lumière. L’absorbance est ensuite mesurée au spectrophotomètre à 725 nm (Chan et al.,
2008) contre une solution de méthanol utilisé comme blanc. Notons qu’une droite
d’étalonnage est préalablement réalisée avant l’analyse avec de l’acide gallique dans les
mêmes conditions que les échantillons à analyser. Les résultats obtenus sont exprimés en mg
équivalent acide gallique par gramme de matière sèche (E AG/g Ms).

II .2.4.5.2. Dosage des flavonoïdes totaux (FVT)

Les réactifs utilisés sont constitués de la solution incolore de nitrite de sodium (NaNO2, 5%)
et de chlorure d’aluminium (AlCl3, 10%). Le principe de la méthode est basé sur l’oxydation
des flavonoïdes par ces réactifs, elle entraîne la formation d’un complexe brunâtre qui absorbe

21
à 510 nm. La comparaison de la DO observée à celle obtenue par un étalon de catéchine de
concentration connue permet d’évaluer la teneur totale en flavonoïdes.

Les flavonoïdes totaux sont évalués par colorimétrie, dans un ballon de 10 mL sont introduits
successivement 250 μL de l’extrait et 1 mL d’eau distillée. Au temps initial (0 minute) sont
ajoutés 75 μL d’une solution de NaNO2 (5%), après 5 minutes 75 μL de AlCl3 (10 %) sont
ajoutés. Et après 6 minutes, 500 μL de NaOH (1N) sont ajoutés et 2,5 mL d’eau distillée sont
ajoutés successivement au mélange.

Une courbe d’étalonnage est élaborée avec des solutions standards de catéchine préparées à de
concentrations différentes. L’absorbance du mélange obtenue est directement mesurée au
spectrophotomètre UV-visible à 510 nm et les résultats sont exprimés en mg équivalant
catéchine/ gr de matière sèche (EC/g Ms), (Gong et al., 2012).

22
CHAPITRE III.RESULTATS ET DISCUSSION

23
III.1. Résultats

III.1.1. Obtention du diagramme de fermentation du vin de gingembre

Le vin de gingembre n’est pas une boisson locale. Nous avons essayé de fabriquer cette
boisson en réalisant la technique de chaptalisation consistant à ajouter le sucre avec le jus de
gingembre. La figure ci-dessous nous montre le diagramme de fabrication de la fermentation
du jus de gingembre (figure 2).

Figure 2 : Protocole de fabrication du vin de gingembre

III.1.2. Etude microbiologique

III.1.1.1. Dénombrement sur gélose Sabouraud Chloramphénicol

Sur la gélose Sabouraud nous avons isolés les levures. La figure 3 représente les colonies
isolées sur Sabouraud
24
 Figure 3 : Boite de pétri montrant les colonies isolées du milieu Sabouraud, échantillon du
vin de gingembre

Afin d’estimer le nombre de microorganisme appartenant au groupe des levures contenue

dans le vin de gingembre, nous avons réalisé un dénombrement sur le milieu Sabouraud. Nous
avons ainsi obtenu 4.107 UFC/Ml.

III.1.2. Caractères phénotypique et morphologique

Nous avons obtenu au total 22 isolats de levures. Les résultats sont mentionnés dans le tableau
VIII

Tableau VIII : Caractéristiques culturales et morphologiques des isolats des levures

Isolats Types de bourgeonnement Forme de cellule
GS1 Multilatéral Ovale et ronde
GS2 Multilatéral Ovale et ronde
GS3 Multilatéral Ovale et sphérique
GS4 Multilatéral Ovale et sphérique
GS5 Multilatéral Ovale et ronde
GS6 Multilatéral Sphérique et allongé
GS7 Multilatéral Ovale et ronde
GS8 Multilatéral Ovale et ronde
GS9 Multilatéral Ovale et ronde
GS10 Multilatéral Ovale et ronde
GS11 Multilatéral Sphérique et allongé
S12 Multilatéral Ovale et ronde
GS13 Multilatéral Ovale et sphérique
GS14 Multilatéral Ovale et ronde
GS15 Multilatéral Ovale et ronde
GS16 Multilatéral Ovale et ronde

25
 GS17 Multilatéral Sphérique et allongé
GS18 Multilatéral Ovale et ronde
GS19 Multilatéral Ovale et ronde
GS20 Multilatéral Ovale et sphérique
GS21 Multilatéral Ovale et ronde
GS22 Multilatéral Sphérique et allongé

III.1.3. Identification moléculaire des levures

III.1.3.1. Amplification utilisant les couples d’oligonucléotides spécifiques

En se basant sur les précédents travaux réalisés dans notre laboratoire, nous avons utilisé des
couples d’oligonucléotides spécifiques de deux (2) espèces différentes de Saccaromyces.
L’électrophorèse sur gel d’agarose révèle une bande de 150 pb correspondant à la souche S.
cerevisiae des souches GS4, GS5, GS13, GS15, GS19, et GS20. La souche GS17 est
négative (figure4)

MT 1 2 3 4 5 6 7

150pb
100pb

Figure 4 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 1%. Légende MT : marqueur de

taille Puits1 :GS4, Puits2 : GS5, Puits3 : GS13, Puits4 : GS15, Puits 5 : GS17, Puits 6 :
GS19, Puits 7 : GS20

26
II.2.4. Détermination des paramètres biochimiques

III.2.4.2. Dosage du degré alcoolique et de l’Acidité titrable au cours de la

fermentation
Comme expliqué dans les méthodes, pour doser l’alcool nous avons d’abord cherche à
distiller le vin de gingembre. Avec le distillat obtenu, nous avons réalisé le dosage de l’alcool
qui varie entre 35 et 40 % (figure 5).

Figure 5 : Dosage du degré d’alcool des échantillons après 45 jours

Afin de connaitre le type de fermentation du jus de gingembre, nous avons réalisé l’acidité
titrable. La figure 6 ci- dessous représente les teneurs en acide au cours de la fermentation.

27
 Figure 6 : Courbe d’évolution de l’acidité totale au cours de la fermentation

III.2.4.3 Détermination du pH au cours de la fermentation

Les mesures des valeurs du pH obtenus du 1er jour de la fermentation jusqu’au 7 ème de la
fermentation sont présentées dans la figure 7 ci- dessous.

Figure 7 : Courbe d’évolution du pH au cours de la fermentation

II.2.4.5. Dosages des polyphénols et des flavonoïdes par spectrophométrie

UV visible
II .2.4.5.1. Dosage des polyphénols totaux

Pour l’échantillon non sucré, la concentration en polyphénols varie de 10,18 à 14,9 mg Eq

AG/g Ms après 20 jours de fermentation. Pour l’échantillon sucré, la concentration en

28
polyphénols va de 10,82 à 18,3 mg Eq AG/g Ms après 20 jours de fermentation. On constate
que les concentrations en polyphénols de l’échantillon sucré sont plus élevées que celles de
l’échantillon non sucré.

Figure 8 : Variation de la production des polyphénols en fonction du temps d’un

échantillon sucré (ES) et non sucré (ENS).

II .2.4.5.2. Dosage des flavonoïdes totaux

Pour l’échantillon non sucré, la concentration en flavonoïdes varie de 1,39 à 2,22 mg

Eq Cat/g Ms après 20 jours de fermentation. Après 16 jours de fermentation, il y a
augmentation de la concentration soit 2,224 mg Eq Cat/g Ms (figure 9). Pour l’échantillon
sucré, la concentration en flavonoides varie de 1,31 à 2,39 mg Eq Cat/g Ms. Il y a diminution
de la concentration (Figure 9).

29
Figure 9 : Production des flavonoïdes au cours de la fermentation du jus de gingembre
d’un échantillon sucré (ES) et non sucre (ENS).

30
III.2. Discussion

Le but de de ce travail a été de valoriser le vin de gingembre et de comprendre l’implication

des microorganismes dans la production des composes phénoliques au cours de la
fermentation du jus de gingembre. Tout en fabriquant une nouvelle boisson fermentée à base
du jus de gingembre, notre travail a permis de montrer que le nombre de microorganismes
représenté par les levures est autour de 4.107 UFC/mL. Les techniques utilisant la technologie
de l’ADN ont permis d’identifier majoritairement Saccharomyces cérevisiae sur les isolats
(GS4, GS5, GS13, GS15, GS17, GS19 et GS20). Ce qui a été confirmé en réalisant
l’identification moléculaire directe, sans passer par le séquençage (Muir et al., (2011) ). Cette
étude a été réalisée en utilisant des oligonucléotides spécifiques qui sont capables d’amplifier
les gènes d’intérêt de six espèces des levures (Saccharomyces cerevisiae, S. mikatae, S.
paradoxus, S. arboricolus, S. kudrieavzevii et S. bayanus). La variabilité des microorganismes
dépend d’un échantillon à un autre. Cela va aussi dépendre de la matière première utilisé. La
valeur du nombre de microorganismes trouvés (4.107 UFC/mL) se rapproche de celles
obtenues dans l’étude microbiologique et biochimique du vin de palme, (Kobawila, 2003).
Dans cette étude les valeurs sont comprises entre 4,7.106 et 6.107 UFC/mL. Il est clair de noter
que les rhizomes du gingembre apportent les microorganismes du sol dont les levures qui font
partie de cet écosystème.

Par ailleurs, nous avons montré que le degré alcoolique, après distillation, est compris entre
35 et 45 %, similaire des résultats trouvés par Leonel et al., 2015, sur la Production de
boisson alcoolique de gingembre qui est de 40 %. Ces taux élevés s’expliquent par la présence
des microorganismes comme les levures jouant un rôle majeur dans la production en excès
d’alcool au cours de la fermentation. La chaptalisation serait donc avantageuse pour les
levures. Il est vrai que l’éthanol n’est pas réellement toxique pour l’homme à dose modérée
(moins de 0.6 g/kg/jour) (Apfelbaum et al., 1995), mais il peut se révéler néfaste chez les
consommateurs à des doses élevées qui n’ont aucune connaissance du type de fermentation.

Nous avons aussi montré que l’acidité augmente au cours de la fermentation. Il ressort que les
moyennes de l’acidité oscillent entre 1,687 et 6,431g/l. Cette acidité se rapproche à celle
obtenue par Kobawila (2003), 6,96 g/l sur le vin de palme. Cette acidité est provoquée par
l'activité fermentaire des microorganismes qui dégradent le glucose, principale substrat
majoritairement présent dans le milieu en produisant des acides qui acidifient le milieu.
Cependant, selon l’activité de croissance des microorganismes et production des acides, il en

31
résulte une augmentation d’acidité. Les pH ont présenté des valeurs descendant jusqu’à
1,6±0,1. Nos résultats de pH diffèrent des résultats obtenus par Idise et al., 2012 autour de
4,5 avec le vin d’ananas. Ce qui écarterait la fermentation purement lactique dont les pH sont
autour de 4,5. Le gingembre est riche en acide gras (acides oléique et linolénique) de type
oméga 3, et 9 (Prasad et Tyagi, 2015, Gigon, 2012). L’addition de l’action coordonnée des
enzymes secrétés par les levures contribuerait à acidifier le vin de gingembre.

Dans ce travail, nous avons montré que la production des polyphénols augmente au cours de
la fermentation. Les microorganismes seraient fortement impliqués dans ce processus (Huynh
et al., 2014). Les microorganismes du genre Saccharomyces cerevisiae isolés dans ce travail
joueraient un rôle primordial dans l’augmentation de la production des polyphénols (Petelinc
et al., 2013). Les concentrations en polyphénols de l’échantillon non sucré varient de 10,18 à
14,64 mg Eq Cat/g Ms, mais celle de l’échantillon sucré varient de 10,82 à 18,34 mg Eq
Cat/g Ms. Le sucre ajouté est un facteur important dans la croissance des levures. La forte
densité des microorganismes liée à la sécrétion des enzymes pectinolytiques et cellulolytiques
expliquerait cette augmentation. Ces enzymes sont responsables de la destruction des parois
cellulosiques des cellules végétales provoquant ainsi cette augmentation (Huynh et al., 2014).
Toutefois, nous remarquons que dans les échantillons non chaptalisés (pas de sucre ajoute), il
y a aussi augmentation des composés phénoliques totaux. Cette augmentation trouve son
explication dans la composition de la matière végétale contenant des sucres qui profitent aux
microorganismes de croître dans le milieu et utilisent ces sucres. Le gingembre contient 57g/L
en glucides (Al-Nahain et al., 2014).
Les bactéries du genre Bacillus et Lactobacillus secrèteraient aussi des enzymes
pectinolytiques et cellulolytiques. Une étude pourrait être initiée dans ce sens quant au rôle
des Bacillus spp. et Lactobacillus spp. Vu l’importance des polyphénols comme antioxydants,
on pourrait affirmer sans risque de tromper que la fermentation du jus de gingembre offre la
possibilité d’étudier les polyphénols et de les extraire.
Les concentrations en flavonoïdes de l’échantillon non sucré varient de 1, 394 à 2,224 mg
Eq Cat/g. Les concentrations en flavonoïdes de l’échantillon sucré varient de 1,311 à 2,290
mg Eq Cat/g. Cette première étude nécessite d’être approfondie en ciblant d’autres types de
polyphénols utile à contribuer dans les voies métaboliques pour une bonne santé.

32
 CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Ces travaux constituent une première contribution à la valorisation du vin de gingembre. Nous
avons essayé de mener à bien ce travail pour tenter d’obtenir une meilleure caractérisation des
microorganismes isolés à partir du vin de gingembre. On peut conclure que le vin de
gingembre est une boisson alcoolique de type acide mixte. Les résultats obtenus lors de la
présente étude ont permis d’isoler les levures du genre Saccharomyces cerevisiae par les
techniques utilisant la technologie de l’ADN. Ces levures seraient responsables de la
production des polyphénols et les flavonoïdes, de l’augmentation du taux d’alcool et de
l’acidification du vin de gingembre. La curiosité scientifique de ce travail est sans précédent
et nous stimule à réaliser des études plus approfondies orientées résultats en envisageant
plusieurs pistes telles que l’isolement et l’identification des Bacillus et Lactobacillus
impliquées dans la fermentation du vin de gingembre; le dosage des activités enzymatiques
(amylolytiques, cellulolytiques et pectinolytiques) ; la corrélation entre le type de
microorganisme et la production des polyphénols, l’extraction des polyphénols et les
conditions d’optimisation de fabrication du vin de gingembre.

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