Chapitre 3

ETUDE DES SITES ACTIFS

 1. SPÉCIFICITÉ DE L'ASSOCIATION PROTÉINE - LIGAND ; LE SITE ACTIF :

a. Toutes les protéines se replient dans une conformation dite native et c'est dans
cette conformation qu'elles acquièrent leur activité biologique (leur pouvoir de
catalyseur dans le cas des enzymes). Ce repliement aboutit à une structure
tridimensionnelle unique de la protéine.
b. Cette structure globale de la macromolécule permet à une région particulière,
le site actif (souvent enfoui au sein de la protéine), d'adopter elle aussi une structure
spatiale qui est reconnue par le ligand spécifique de la protéine.
c. Le site actif est constitué d'un petit nombre d'acides aminés qui sont
caractérisés par une chaîne latérale dont à la fois la nature chimique (groupement
ionisable ou polarisable) et la structure (encombrement stérique) sont particulières.
d. La stéréochimie qui résulte de cet agencement unique des acides aminés qui
constituent le site actif est la cause de la stéréospécificité de reconnaissance entre ces
acides aminés et le (ou les) ligand(s).
 e. Les enzymes ne fixent pas seulement un ligand (un substrat) ; elles le
transforment en un produit lors d'une réaction chimique. Certains aa du site
actif ont pour fonction, non pas de fixer le substrat, mais de fournir les
groupements chimiques nécessaires à la réaction catalysée par l'enzyme. Dans
le cas des enzymes, on distingue donc au sein du site actif, les acides aminés qui
constituent le site de fixation (ces acides aminés n'ont pas de fonction chimique
impliquées dans la réaction) et les acides aminés qui constituent le site
catalytique.
On peut citer divers types d'association entre une protéine et un ligand : les complexes
enzyme - substrat ; enzyme - régulateur (inhibiteur, activateur) ; antigène - anticorps ; histones
- ADN ; protéines - hormones.

Exemples :

Protéine Ligand

Carboxypeptidase b-phénylpropionate

Trypsine Butylamine

Phosphofructokinase (2 conformations) adénosine - diphosphate ADP

Homosérine déshydrogénase NADPH

Méthionine - tARN synthétase Méthionyl - Adénylate

Histone ADN

Apohémoglobine Hème
Exemple de la spécificité de l'enzyme pour un substrat
La spécificité de l'enzyme pour un substrat est telle que le changement de position d'un seul atome
d'hydrogène sur la molécule-substrat peut bloquer l'interaction avec l'enzyme, et/ou la réaction. Le bon
substrat s'insère toujours dans le site actif de l'enzyme. Lorsque le substrat est une grande molécule, l'enzyme
peut se déformer car la structure tertiaire de l'enzyme est maintenue par des liaisons faibles. Remarquez par
exemple comment l'enzyme EcoR1 s'est repliée autour de l'ADN, son substrat.

L'enzyme de restriction EcoR1 autour de son substrat, une séquence

spécifique d'ADN
 2. RAPPEL SUR LE SITE ACTIF

On définit au sein d'une enzyme le site actif comme étant un

groupement d’acides aminés déterminant dans l'espace la zone de
l'enzyme en contact direct avec le substrat. Le site actif n'est pas
forcément constitué d'un enchaînement linéaire d'acides aminés. C'est
la structure secondo-tertiaire, permettant le rapprochement de
certains aminoacides qui va former dans l'espace cette zone. La fixation
du substrat entraînera une modification de la conformation spatiale,
comme un repli de la protéine sur son substrat. On peut fréquemment
retrouver Ser, Asp, His, Tyr, Ala comme acides aminés fixant le substrat.
En général, l'enzyme est stabilisée et plus résistante aux agents
dénaturants en présence du substrat. D'un point de vue structural, on
pourra distinguer plusieurs groupes d'acides aminés :

• des groupes de contacts : c'est le site actif, correspondant à un petit

nombre d'acides aminés : un peu moins de 10;
• des groupes auxiliaires : ils auront un rôle dans le mécanisme de la
catalyse, par un effet électronique par exemple ;
• des groupes de conformation : souvent éloignés du site actif ils
assurent néanmoins la conformation spatiale de la molécule et donc la
formation du site actif ; des groupes indifférents qui n'interviendront
pas dans la réaction.
Le site actif dépend ainsi de la conformation structurale selon les critères suivants:

• L'enchaînement linéaire des acides aminés est déterminé par le génome.

• La structure secondo-tertiaire est conditionnée par la structure primaire.
• La fixation du substrat sur une enzyme est dépendante de la structure spatiale de
la molécule.
• Toute modification de la composition en acides aminés entraîne un changement
de la conformation spatiale et donc une perte de l'activité enzymatique.
• Toute modification des liaisons chimiques qui interviennent dans la structure
spatiale entraîne une perte de l'activité enzymatique (ponts disulfures, liaisons
hydrogènes).
 3. MODIFICATION DU SITE ACTIF

L’étude du site actif d’une enzyme a pour but de rechercher les AA

essentiels pour son activité. La modification peut être chimique ou bien le
plus souvent par mutagenèse dirigée ; la comparaison des activités
enzymatiques de la protéine native et de la protéine modifiée peut
apporter des informations essentielles sur le site actif de l’E.
3.1. Modification chimique

Une autre façon de contrôler l'activité d'un enzyme est de le MODIFIER CHIMIQUEMENT.
Ceci peut être effectué par une autre enzyme ajoutant par une liaison covalente un
groupement (ex: un groupement phosphate) à un autre enzyme. Cette modification peut
aussi bien réduire qu'augmenter l'activité enzymatique, dépendamment de la régulation
requise. Lorsque un retour au niveau d'activité initial est requis, une autre enzyme peut
enlever le groupement. Une enzyme sans le groupement phosphate peut être inactive et être
activée par l'addition de ce groupement, ou vice versa.

Régulation enzymatique par modification chimique.

De nombreuses molécules abîment l'ADN et peuvent être
utilisées pour effectuer de la mutagenèse :
- Désamination des bases : La désamination est une des modifications les plus
courantes de l'ADN. Les groupements amines de l'adénine, de la cytosine et de
la guanine peuvent être retirés soit spontanément soit à l'aide de nombreux
produits chimiques.

Lorsque l'adénine est désaminée, on obtient l'hypoxantine

Lorsque la guanine est désaminée on obtient la xantine
Lorsque la cytosine est désaminée on obtient l'uracile.
Plusieurs molécules peuvent être utilisées pour désaminer les bases de l'ADN :

❖ l'hydroxylamine désamine la cytosine et donc est responsable de transition GC

vers AT. Comme l'hydroxylamine ne rentre pas dans les cellules, cette molécule
ne peut être utilisée qu'in vitro.
❖ le bisulfite de sodium désamine les cytosines mais l'ADN doit être simple brin.
❖ l'acide nitreux désamine la cytosine, l'adénine et la guanine. Il peut causer des
transitions AT vers GC comme des transitions GC vers AT. De plus il est peu
spécifique et peut aussi causer des délétions.
 - Alkylation : Les agents alkylants ajoutent des groupes alkyls (CH3, CH3CH2....)
aux bases. On peut citer l’éthyle méthane sulfonate (EMS) ou la nitrosoguanine. Les
atomes les plus réactifs sont le N7 de la guanine, le N3 de l'adénine ou le O6 de la
guanine. Cette alkylation n'est souvent pas reconnue par les systèmes de
réparation et entraîne une différence d'appariement.
 - Irradiation UV : L'ADN absorbe à 260 nm du fait des doubles
liaisons conjuguées présentes sur les bases. Les photons absorbés
augmentent l'énergie des bases et les doubles liaisons peuvent
réagir avec d'autres atomes présents à proximité. L'altération la plus
souvent rencontrée est la formation de dimère de pyrimidine entre
deux bases consécutives.
 3.2. Modification par mutagenèse dirigée

On mute le gène qui code pour l’enzyme puis on fait exprimer ce gène pour créer cette
protéine mutante et caractériser son activité enzymatique. On peut remplacer un AA
donné par un autre et confirmer les résultats obtenus précédemment par les réactifs
chimiques.
La mutagenèse dirigée a pour objet de muter une séquence d'ADN à un endroit précis. Un
exemple de mutagenèse dirigée simple consiste à éliminer un site de restriction donnant
des extrémités cohésives dans un plasmide. On ouvre le plasmide au site de coupure et on
ajoute une polymérase (dépourvue d'activité 5'3' exonucléase) et des dNTP. On effectue
ensuite une ligation des extrémités devenues franches. Dans cette expérience, on ajoute
ou on retire généralement soit 2 soit 4 nucléotides. Le cadre de lecture est donc modifié
et doit être pris en compte si l’expérimentation a pour but de produire une protéine.
Lorsqu'on veut changer une ou plusieurs bases dans un plasmide, on peut partir soit d'un
ADN simple brin soit d'un ADN double brin.
Cette opération se fait dans les étapes suivantes :

a. Introduire un oligonucléotide (primer) : la mutation (rouge sur fond bleu)

correspondant à une séquence cible de la matrice d'ADN non mutée. Un
paramètre crucial pour le succès de la mutagenèse dirigée est de choisir cet
oligonucléotide mutagène. Par rapport à la séquence normale, cet
oligonucléotide va souvent différer par un seul nucléotide qui correspond à une
mutation ponctuelle, mais il peut porter aussi des mutations plus complexes.
b. la longueur minimale : des mutations ponctuelles
peuvent êtres introduites avec des oligonucléotides de 25
bases. Des mutations plus compliquées nécessitent des
amorces qui peuvent aller jusqu'à 80 bases, ce qui est
proche de la limite supérieure des synthétiseurs
automatiques.
c. Cet oligonucléotide sert d'amorce à une polymérase qui initie une
synthèse d'ADN in vitro. On produit ainsi un ADN double brin qui
porte la mutation présente au départ dans l'oligonucléotide.
d. transformation de bactéries: