Dossier scientifique

Les déficits de la chaîne respiratoire :

démarche diagnostique des cytopathies
mitochondriales
Pauline Gaignard*, Pierre-Hadrien Becker, Elise Lebigot, Patrice Thérond, Abdelhamid Slama
Service de Biochimie, CHU Bicêtre, Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, Université Paris-Sud, 78 rue du Général Leclerc,
94275 Le Kremlin-Bicêtre, France.
*Auteur correspondant : pauline.gaignard@aphp.fr (P. Gaignard).

RÉSUMÉ
La mitochondrie, « centrale énergétique » de la cellule, est au carrefour du métabolisme glucidique, lipidique et protéique
dont la finalité essentielle est la synthèse d’ATP. Cette synthèse est couplée à la consommation d’oxygène par le processus
de phosphorylation oxydative réalisée par la chaîne respiratoire (CR). Les défauts héréditaires de la CR en elle-même ou
de tous les mécanismes nécessaires à son fonctionnement sont regroupés sous le terme de « cytopathies mitochondriales ».
Ces pathologies sont de transmission maternelle (mutation de l’ADN mitochondrial) ou de transmission mendélienne
(mutation sur un des nombreux gènes nucléaires impliqués dans le fonctionnement énergétique mitochondrial). La pré-
sentation clinique de ces maladies est très variée et de nombreux diagnostics différentiels sont à évoquer. La démarche
diagnostique consiste donc en la recherche d’arguments biochimiques pour guider ou étayer les analyses moléculaires.
Un bilan d’orientation global recherchera d’abord des signes de blocage du métabolisme énergétique (hyper-lactacidémie,
cétonémie paradoxale…). Les analyses fonctionnelles spécifiques de la CR telles que l’étude des activités enzymatiques
et de la consommation d’oxygène ainsi que l’analyse de l’intégrité de l’ADN mitochondrial dans différents tissus apporte-
ront ensuite des preuves plus directes. Le diagnostic formel de cytopathie mitochondriale ne pourra cependant être posé
qu’après identification par biologie moléculaire d’un variant prouvé comme délétère.

MOTS CLÉS
◗ activités enzymatiques
◗ ADN mitochondrial
◗ chaîne respiratoire
◗ consommation d’oxygène
◗ cytopathie mitochondriale
KEY WORDS
◗ enzymatic activities
◗ mitochondrial disorders
◗ mitochondrial DNA
◗ oxygen consumption
◗ respiratory chain
© 2018 – Elsevier Masson SAS
Tous droits réservés.
ABSTRACT
Respiratory chain dysfunctions : diagnostic strategy of mito-
chondrial disorder
Mitochondria, the “powerhouse” of the cell, are at the crossroads of carbohydrate,
lipid and protein metabolisms. The respiratory chain (RC) plays a central role by
performing oxidative phosphorylation that is oxygen consumption coupled with ATP
synthesis. The inherited defects of RC itself or of all the processes involved in its
functioning are called “mitochondrial disorders”.  These diseases can be inherited
maternally (mitochondrial DNA mutation) or by mendelian patterns (mutation on
one of the many nuclear genes involved in mitochondrial bioenergetics). The clinical
presentation of the mitochondrial disorders is highly various and numerous diffe-
rential diagnoses must be considered. The diagnostic approach therefore looks for
biochemical arguments to direct or support molecular analysis. Signs of blockage
of energetic metabolism (hyper-lactacidemia, paradoxical ketonemia...) will be first
sought by global screening tests. Specific functional studies of RC (enzymatic acti-
vities and oxygen consumption in particular) and analysis of the integrity and the
quantity of mitochondrial DNA in different tissues will then provide more direct
evidence.The diagnosis of mitochondrial disorder, however, can only be confirmed
by the identification of a proven deleterious variant.

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Cytopathies mitochondriales

La synthèse énergétique Figure 1. Le métabolisme énergétique mitochondrial.

par la mitochondrie
Place de la chaîne
respiratoire mitochondriale
dans le métabolisme
énergétique
La synthèse d’ATP par la chaîne respiratoire
(CR) mitochondriale se situe au carrefour du
métabolisme des glucides, des lipides et des pro-
téines. La glycolyse cytoplasmique aboutit à la
formation de pyruvate qui pénètre dans la mito-
chondrie où il est décarboxylé en acétyl-coA (un
substrat du cycle de Krebs) par le complexe de
la pyruvate-déshydrogénase (PDH). Les acides
gras libérés lors de la lipolyse sont métabolisés
par la ␤-oxydation mitochondriale pour fournir

© service de Biochimie CHU Bicêtre

également de l’acétyl-coA. Cet acétyl-coA peut
être « stocké » sous forme de corps cétoniques
lors de la cétogenèse hépatique pour être de
nouveau libéré par cétolyse dans les tissus péri-
phériques ne réalisant pas la ␤-oxydation. Enfin,
le catabolisme des acides aminés produit de
nombreux substrats pour le cycle de Krebs. Par
la suite, les réactions d’oxydoréduction du cycle
Le métabolisme des glucides, lipides et protéines aboutit à des substrats du cycle
de Krebs fournissent des coenzymes réduites de Krebs. Le NADH et le FADH2 produits par le cycle de Krebs sont oxydés par
(NADH et FADH2) qui sont utilisées par les les complexes de la chaîne respiratoire et la force protomotrice générée permet la
complexes de la CR pour la synthèse d’ATP en synthèse d’ATP.
condition aérobie grâce au système de phospho- CoQ : ubiquinone ; Cyt c : cytochrome c ; PDH : pyruvate-déshydrogénase.
rylation oxydative (figure 1) [1].

La phosphorylation oxydative rence de concentration de protons générée entre la

La phosphorylation oxydative est le processus associant
la phosphorylation de l’ADP à l’oxydation du NADH et
du FADH2. Elle aboutit à la réduction de l’O2 en H2O
(« respiration ») et constitue la source principale d’ATP
dans les organismes aérobies.
Le transfert d’électrons des molécules de faible poten-
tiel d’oxydo-réduction NAD/NADH et FAD/FADH2
vers l’O2, molécule de haut potentiel, est assuré par
quatre complexes et deux transporteurs solubles. Le
complexe I (ou NADH-ubiquinone-réductase) catalyse
le transfert d’électrons du NADH sur l’ubiquinone et
permet le passage de protons de la matrice mitochon-
driale vers l’espace inter-membranaire. Le complexe II
(ou succinate-déshydrogénase) ne participe pas à l’éla-
boration du gradient de protons mais permet, comme
le complexe I, la réduction de l’ubiquinone en ubiquinol
par transfert des électrons du FADH2. Le complexe III
(ou ubiquinol-cytochrome c-réductase) catalyse l’oxy-
dation de l’ubiquinol et la réduction du cytochrome c
et participe également à l’élaboration du gradient de
protons. Enfin, le complexe IV (ou cytochrome c oxy-
dase) réalise l’oxydation du cytochrome c réduit et la
réduction de l’O2 en deux molécules d’H2O. La diffé-
matrice et l’espace transmembranaire est à l’origine de
la force protomotrice qui fournit l’énergie nécessaire à
la phosphorylation de l’ADP par le complexe V (ou ATP
synthase) (figure 1) [1].
La double origine génétique
des composants de la chaîne
respiratoire
Les mitochondries sont les seuls organites cellulaires qui
possèdent leur propre ADN, différent de l’ADN géno-
mique (ADNg). L’ADN mitochondrial (ADNmt) est
polyploïde, le nombre moyen de copies par cellule varie
de 1000 à 5000 selon les tissus. L’ADNmt représente
0,5 à 1 % de l’ADN total d’une cellule. C’est une molé-
cule double-brin, circulaire, de 16 569 paires de bases
avec une D-loop triple-brin qui contient des éléments
de régulation. L’ADNmt porte 37 gènes, 13 codent des
protéines de la CR, 22 des ARN de transfert (ARNt) et
2 des ARN ribosomiques (ARNr). Les 37 gènes mito-
chondriaux sont contigus, sans introns, certains même
se superposent. La séquence complète du génome mito-
chondrial humain a été publiée en 1981 [2].

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Les cinq complexes de la CR sont composés d’une C’est une pathologie évolutive qui peut survenir à tout
centaine de protéines dont seulement 13 sont codées âge de la vie. Il n’existe actuellement pas de traite-
par l’ADNmt, les autres étant codées par l’ADNg. Les ment spécifique des cytopathies mitochondriales, mais
sous-unités des complexes I, III, IV et V ont ainsi une les nombreux essais thérapeutiques en cours seront
double origine génétique (mitochondriale et nucléaire), peut-être prometteurs [3].
tandis que le complexe II est d’origine exclusivement
génomique. Il est cependant admis que plus de 1 500 Classification génétique
protéines sont aussi impliquées dans le métabolisme des cytopathies mitochondriales
mitochondrial et donc, plus ou moins directement, dans
le fonctionnement de la CR. Ces protéines sont notam- Cytopathies mitochondriales
ment impliquées dans la maintenance de l’ADNmt ou dues à une mutation de l’ADNmt
à la synthèse des protéines codées par l’ADNmt ; dans Les premières mutations pathogéniques de l’ADNmt
l’assemblage des complexes, la synthèse de co-facteurs, ont été identifiées il y a une trentaine d’années. La géné-
le transport de substrat ; dans la biogenèse (fusion/fission tique mitochondriale a trois particularités :
des mitochondries), la dynamique du réseau ◗ la transmission est exclusivement maternelle ;
mitochondrial, la formation des mem- ◗ les copies de génome mitochondrial sont
branes mitochondriales… [3]. généralement toutes identiques (homo-
Il n’existe plasmie) mais, en cas de mutation, des
Les cytopathies copies sauvages et mutées peuvent
actuellement pas de être présentes (hétéroplasmie) ;
mitochondriales traitement spécifique ◗ la ségrégation mitotique de

des cytopathies l’ADNmt est apparemment aléa-

Définition
des cytopathies mitochondriales, mais
mitochondriales de nombreux essais
Les cytopathies mitochondriales
thérapeutiques sont
peuvent être définies comme des
anomalies du fonctionnement de la en cours
CR mitochondriale d’origine héréditaire
et ayant comme mécanisme physiopatho-
logique commun le déficit en ATP. Cependant, la
découverte croissante d’interrelations entre de nom-
breux mécanismes cellulaires et la synthèse énergé-
tique mitochondriale élargit de plus en plus le champ
des « cytopathies mitochondriales » et en donner une
définition stricte est difficile. De plus, la carence énergé-
tique ne semble pas pouvoir expliquer à elle seule toute
la physiopathologie des cytopathies mitochondriales.
Le stress oxydatif et le déséquilibre entre métabolites
notamment participent aussi probablement au dévelop-
pement de la maladie [4].
La prévalence estimée des cytopathies mitochondriales
est d’environ 10 à 20 cas pour 100 000 personnes
(adultes et enfants), ce qui en fait la cause la plus fré-
quente de neuropathies héréditaires chez l’adulte [5,6].
Les cytopathies mitochondriales se caractérisent par
une atteinte clinique très hétérogène et de sévérité
variable. Les mitochondries étant des organites ubiqui-
taires, tous les organes peuvent être concernés, mais les
plus vulnérables sont ceux hautement dépendants du
métabolisme oxydatif, principalement les systèmes ner-
veux et musculaire. Une cytopathie mitochondriale est
souvent évoquée devant une association inexpliquée de
symptômes, neuromusculaires ou non, qui impliquent
des organes apparemment sans relation physiolo-
gique ou embryologique (association « illégitime ») [7].
toire, la proportion d’ADN muté
ou sauvage varie donc au cours
des divisions cellulaires.
Les mutations de l’ADNmt peuvent
affecter soit un gène codant une
protéine spécifique de la CR, ce qui se
traduira par un déficit isolé en un com-
plexe ; soit un ARNr ou un ARNt, ce qui affec-
tera la synthèse de toutes les protéines codées
par l’ADNmt et se traduira par un déficit multiple en
complexes de la CR. Le déficit fonctionnel de la CR
n’apparaît cependant qu’au-delà d’une certaine propor-
tion d’ADNmt muté dans la cellule (effet seuil). Le taux
d’hétéroplasmie étant différent pour chaque cellule,
chaque tissu n’exprime pas le déficit de la même façon.
Ceci explique en partie la grande variabilité clinique et
le caractère évolutif de ces maladies. Il est rapporté que
les mutations de l’ADNmt sont responsables d’environ
80 % des cytopathies mitochondriales chez l’adulte et
20 % de celles chez l’enfant [8,9].
Cytopathies mitochondriales
dues à une mutation de l’ADNg
Des mutations dans différents gènes portés par l’ADNg
sont retrouvées dans un nombre croissant de cytopa-
thies mitochondriales. La transmission est le plus sou-
vent autosomique récessive mais peut être également
récessive liée à l’X ou autosomique dominante.
Les mutations de l’ADNg peuvent affecter un gène
codant une des sous-unités de la CR ou une des pro-
téines accessoires jouant un rôle dans l’assemblage des
complexes, entraînant ainsi un déficit fonctionnel de ce
complexe. Les mutations nucléaires peuvent également
avoir un impact sur l’ADNmt lui-même si elles affectent

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Cytopathies mitochondriales
les enzymes impliquées dans la réplication et Figure 2. Le déséquilibre RedOx (NADH/NAD)
la traduction de l’ADNmt ou les voies de syn-
en cas de déficit de la chaîne respiratoire.
thèses du pool de nucléotides mitochondriaux.
À terme, ces déficits enzymatiques sont à l’ori-
gine d’altérations qualitatives et/ou quantitatives
de l’ADNmt et donc de déficit en plusieurs
complexes de la CR. L’expression clinique de
ces cytopathies mitochondriales, bien que d’ori-
gine nucléaire, est alors également influencée
par le taux d’hétéroplasmie et la ségrégation
mitotique aléatoire. Enfin, les mutations affec-
tant des gènes codant les nombreuses protéines
impliquées dans le fonctionnement énergétique
mitochondrial, au sens large, ont des répercus-
sions variables sur l’activité des complexes de
la CR et la stabilité de l’ADNmt [3].

© service de Biochimie CHU Bicêtre

Démarche diagnostique
des cytopathies
mitochondriales
Devant des symptômes évocateurs de cytopa-
thie mitochondriale (atteintes neurologiques,
musculaires, multi-systémiques ; hypoglycémie ;
Le blocage de la chaîne respiratoire induit un excès de NADH qui favorise la
acidose lactique), la démarche diagnostique clas- production de lactate (équilibre RedOx cytoplasmique) et de ␤-hydroxybutyrate
sique est la réalisation de bilans métaboliques de (équilibre RedOx mitochondrial).
screening permettant une première orientation ␤-DH : ␤-hydroxy-butyrate-déshydrogénase ; CoQ : ubiquinone ; Cyt c : cytochrome
puis l’étude spécifique de la CR et de l’intégrité c ; LDH : lactate-déshydrogénase ; PC : pyruvate-carboxylase ; PDH : pyruvate-
de l’ADNmt qui servent à orienter ensuite les déshydrogénase.
analyses moléculaires. Depuis quelques années
cependant, la place croissante du séquençage haut débit Les déficits de la CR ont pour conséquence l’accu-
(Next Generation Sequencing, NGS) tend à systématiser mulation en amont de NADH produit par le cycle de
les analyses moléculaires en première intention. Krebs et un défaut de consommation d’oxygène, ce qui
pourra être suspecté devant une élévation persistante
Bilans d’orientation et marquée du lactate dans le sang (> à 3 mmol/L) [11],
Equilibre RedOx associée généralement à un rapport lactate/pyru-
Le bilan RedOx consiste au dosage simultané des vate élevé (> 15). La persistance de corps cétoniques
concentrations sanguines de lactate et de pyruvate, (acétoacétate et ␤-hydroxybutyrate) en période post-
d’acétoacétate et de ␤-hydroxybutyrate dans dif- prandiale (ou cétonémie paradoxale) avec une pré-
férentes conditions métaboliques (à jeun, en pré- et dominance de ␤-hydroxybutyrate est un autre signe
post-prandial). Le rapport lactate/pyruvate reflète indi- de l’accumulation de NADH et du blocage du cycle
rectement le potentiel RedOx (NADH/NAD) cytoplas- de Krebs. Une élévation du lactate et du rapport lac-
mique et le rapport ␤-hydroxybutyrate/acétoacétate, le tate/pyruvate doit aussi être recherchée dans le LCR
potentiel RedOx mitochondrial (figure 2). Des dosages devant des signes neurologiques évocateurs. Néan-
plasmatiques de glucose, d’acides gras libres et d’ammo- moins, une augmentation du lactate n’est pas spéci-
niémie sont aussi réalisés de façon concomitante. fique des anomalies mitochondriales et les variations
Les paramètres du bilan RedOx sont peu stables (en observées doivent être distinguées des autres causes
particulier le pyruvate et l’acétoacétate) et exigent que d’hyper-lactatémies pathologiques (hypo-perfusion tis-
le prélèvement soit effectué selon des conditions pré- sulaire, maladies systémiques, erreurs innées du méta-
analytiques strictes. Le prélèvement veineux doit être bolisme,…) ou artéfactuelles (prélèvements difficiles)
réalisé de manière non traumatique et sans garrot. Le pouvant fausser l’interprétation du bilan RedOx [12].
sang recueilli doit être déprotéinisé immédiatement Il est important de noter qu’un bilan RedOx normal
dans l’acide (pour inhiber les réactions enzymatiques) ne permet pas d’exclure le diagnostic de cytopathie
puis placé dans la glace et acheminé rapidement au mitochondriale, notamment si l’atteinte est conscrite
laboratoire [10]. à un tissu. Si les arguments cliniques et paracliniques

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sont pertinents, il convient donc de poursuivre les
explorations, même si le bilan RedOx est apparem-
ment normal.
Bilan de screening métabolique
Un bilan métabolique complet (chromatographie des
acides aminés plasmatiques CAAp, chromatographie des
acides organiques urinaires CAOu, profil des acylcar-
nitines plasmatiques ACCARp) est généralement réa-
lisé lors d’une suspicion de cytopathie mitochondriale,
dans un but de diagnostic différentiel le plus souvent.
La CAAp peut montrer une augmentation de l’alanine et
de la proline plasmatiques traduisant une hyper-lactaté-
mie. Sur la CAOu, la présence en quantité anormale des
intermédiaires du cycle de Krebs peut être un
indice d’un blocage de la CR mais peut être
aussi simplement liée à une immaturité
rénale chez les jeunes enfants. Une
acidurie dicarboxylique traduisant
une inhibition secondaire de la
L’étude de plusieurs
␤-oxydation des acides gras peut
aussi être observée (le profil des tissus, si elle est
ACCARp montrera alors une possible, est en théorie
diminution de la carnitine libre au
profit des acylcarnitines). Enfin, la la plus à même
présence d’acide éthylmalonique informative
ou d’acide 3-méthylglutaconique
est assez fréquemment rapportée
dans les atteintes mitochondriales.
Toutes ces augmentations de métabo-
lites ne sont cependant pas spécifiques mais
constituent des arguments indirects pour rechercher
une cytopathie mitochondriale [12].
De nouveaux biomarqueurs sériques, le fibroblast growth
factor 21 (FGF21), et le growth differentiation factor 15 études
(GDF15) semblent plus sensibles et spécifiques que les
marqueurs actuels mais ne sont pas encore utilisés en
routine [13,14].
Imagerie cérébrale
L’IRM cérébrale est essentielle dans l’évaluation des
atteintes neuro-métaboliques et des anomalies caracté-
ristiques ont été décrites dans quelques types de cyto-
pathies mitochondriales [15]. Néanmoins, il n’existe pas
de profil spécifique commun à toutes les cytopathies
mitochondriales. Le couplage entre IRM et spectros-
copie par résonnance magnétique (MRS), qui permet la
détection de métabolites in vivo, est devenu un outil très
utile d’orientation. La présence d’un double pic carac-
téristique du lactate est le reflet d’un déficit du méta-
bolisme oxydatif cérébral. Cet examen n’est cependant
pas spécifique d’une cytopathie mitochondriale mais il
est plus sensible que la recherche d’une hyper-lacta-
torrachie [16]. Une diminution du rapport N-acétyl-L-
aspartate/créatine a aussi été rapportée dans certaines
cohortes de patients atteints de cytopathies mitochon-
driales [12].
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Études spécifiques
de la chaîne respiratoire
Choix du tissu
Dans l’idéal, le tissu à étudier est celui cliniquement
atteint, mais il n’est pas toujours accessible, notam-
ment en cas d’atteinte neurologique centrale. Le choix
se base alors à la fois sur le caractère plus ou moins
invasif du prélèvement et sur l’apport diagnostique
attendu. Le muscle squelettique, obtenu par biopsie
du deltoïde, est un des tissus qui exprime le mieux
les déficits de la CR, même si ce n’est pas systéma-
tique. Un échantillon de 100-200 mg permet de faire
toutes les analyses fonctionnelles avec les techniques
classiques. Cependant, la sédation parfois néces-
saire pour réaliser ce prélèvement chez l’en-
fant peut être un facteur limitant à son
exécution. Le foie peut être un tissu
informatif dans certaines formes
à expression hépatique, mais le
hasard de l’échantillonnage entre
des parties atteintes, en régéné-
ration ou saines peut entraîner
des interprétations erronées.
d’être L’étude sur lymphocytes, obte-
nus par isolement de 10-15 mL
de sang recueilli sur EDTA, a
l’avantage d’être peu invasive mais
seuls les déficits très profonds seront
visibles. Enfin, les fibroblastes, obtenus
par biopsie de peau sous anesthésie locale,
n’expriment pas systématiquement tous les défi-
cits mais constituent un matériel très utile pour des
analyses ultérieures (analyses moléculaires, autres
fonctionnelles…) [17]. Il est à noter que les
fibroblastes doivent être cultivés en présence d’uri-
dine et de pyruvate pour éviter la sélection négative
des cellules déficitaires [18]. En conclusion, l’étude de
plusieurs tissus, si elle est possible, est en théorie la
plus à même d’être informative.
Études fonctionnelles
Études spectrophotométriques enzymatiques
La mesure des activités des complexes est réalisée
sur tissus frais (conservé dans un tampon adéquat)
ou congelés dans l’azote liquide extemporanément
après biopsie. Les échantillons fixés pour étude ana-
tomo-pathologique ne sont pas utilisables. Une étude
enzymatique complète de tous les complexes néces-
site une quantité de prélèvement relativement faible
et est réalisable sur homogénat tissulaire (à partir de
muscle ou de foie), sur cellules entières (fibroblastes,
lymphocytes) ou sur une fraction enrichie en mito-
chondries obtenue après centrifugation différentielle.
Les activités enzymatiques sont mesurées par spec-
trophotométrie en vitesse maximale et en présence
des substrats du complexe étudié, d’éventuels inhi-
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Cytopathies mitochondriales

Figure 3. Principe du dosage enzymatique de l’activité des complexes

de la chaîne respiratoire, exemple du complexe III.

© service de Biochimie CHU Bicêtre

La vitesse de réduction du cytochrome c en présence de décyl-ubiquinol par le complexe III est mesurée par spectrophotométrie à 550
nm à 37 °C. L’inhibition du complexe IV par le KCN évite la ré-oxydation du cytochrome c. En fin de réaction, l’ajout d’antimycine, un
inhibiteur spécifique du complexe III, permet de déterminer la proportion d’activité aspécifique.
C : complexe ; Inh° : inhibition.

biteurs d’autres complexes pour éviter les réactions
parasites et d’un agent perméabilisant [19,20]. À la
fin de la réaction, l’ajout d’un inhibiteur spécifique du
complexe étudié permet de soustraire l’activité aspé-
cifique (figure 3). Une étude multicentrique a mon-
tré que les coefficients de variations moyens pour
les analyses enzymatiques dans les échantillons de
muscle sont d’environ 15 % [21]. Les résultats sont
ensuite exprimés par minute et par milligramme de
protéines et les activités des complexes sont norma-
lisées par rapport à l’activité de la citrate-synthase,
enzyme marqueur de la quantité de mitochondries.
Ce point est essentiel car la quantité de mitochon-
dries peut être très variable d’un patient à l’autre
(dans le muscle, elle dépend par exemple du degré
d’entraînement physique) [21]. Le calcul des rapports
entre les activités est aussi utile pour détecter des
déficits multiples ou peu profonds.
Études polarographiques
La polarographie consiste en la mesure par une élec-
trode de Clark de la vitesse de consommation de
l’oxygène (« respiration ») contenu dans le milieu
réactionnel en présence de différents substrats et
inhibiteurs de la CR [20]. L’analyse par polarographie
nécessite évidemment des mitochondries intactes et
donc du tissu frais (non congelé). L’analyse est réali-
sable sur cellules entières perméabilisées ou sur une
fraction enrichie en mitochondries. Les techniques sur
oxygraphe classique requièrent une quantité relative-
ment importante de prélèvement, ce qui peut parfois
être limitant. Des nouvelles méthodes d’oxymétrie à
haute résolution sont développées depuis quelques
années et permettent de diminuer considérablement
la quantité d’échantillon nécessaire et d’améliorer la
sensibilité [22].
La consommation d’oxygène est mesurée en présence
d’ADP pour stimuler la respiration puis en présence
d’un agent protonophore, appelé découplant, qui dis-
sipe chimiquement le gradient de protons entraînant
alors une dissociation entre oxydation et phospho-
rylation et une forte accélération de la consom-
mation d’oxygène. La consommation d’oxygène en
présence de pyruvate et d’un agent découplant est
ainsi le reflet des activités enzymatiques de la PDH,
des enzymes du cycle de Krebs et des complexes I,
III et IV de la CR. L’ajout de malate et de glutamate
permet ensuite de court-circuiter le complexe PDH.
L’utilisation de succinate permet d’évaluer les acti-
vités des complexes II à IV ; celle de duroquinol (un
analogue de l’ubiquinol), l’activités des complexes III
et IV ; celle de TMPD (N,N,N’,N’’-tétraméthyl-p-phény-
lènediamine, un substrat artificiel du complexe IV) et
d’ascorbate (un antioxydant), l’activité du complexe IV
isolément. L’ajout d’inhibiteur sélectif de chaque

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Figure 4. Principe de l’étude polarographique.

A : Consommation d’oxygène en présence de pyruvate et de malate + glutamate. © service de Biochimie CHU Bicêtre

B : Consommation d’oxygène en présence de succinate et de duroquinol.

La vitesse de diminution de la concentration de l’oxygène contenu dans une enceinte fermée est mesurée par polarographie à 37 °C. En
début de réaction, l’ajout d’ADP active la phosphorylation oxydative. L’activité du complexe V est ensuite inhibée par l’oligomycine et la
consommation d’oxygène résiduelle est alors le reflet de l’intégrité membranaire. Dans un troisième temps, le gradient de protons est
dissipé par un agent découplant, la vitesse de consommation d’oxygène dépend alors uniquement des vitesses d’oxydation. Ces mesures
sont réalisées en présence de différents substrats et inhibiteurs spécifiques de chaque complexe.
C : complexe ; CoQ : ubiquinone ; Cyt c : cytochrome c ; Inh° : inhibition ; PDH : pyruvate-déshydrogénase.

complexe permet de vérifier la spécificité de chaque Études protéiques

réaction. Les résultats sont exprimés en nanomoles
d’oxygène consommées par minute et par milligramme
de protéines (figure 4).
L’étude polarographique a lieu dans des conditions
plus « physiologiques » que les analyses enzymatiques
isolées et a pour intérêt de donner une vision globale
du flux de transfert d’électrons et donc de l’efficacité
de la CR.
La technique de Blue-Native PolyAcrylamide Gel Electro-
phoresis (BN-PAGE) a été développée il y a une vingtaine
d’années suite à la mise au point de colorants permettant
la migration des complexes en conditions non dénatu-
rantes. L’association d’une séparation électrophorétique
par BN-PAGE et d’un marquage immunologique permet
de détecter spécifiquement chaque complexe à l’état
natif avec des tailles de 200 à 1 000 kDa.

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Cette technique, très informative, permet de confirmer
un déficit quantitatif en un complexe (bande de faible
intensité ou absente) mais aussi de détecter des ano-
malies d’assemblage des complexes, qui se présenteront
alors sous la forme de bandes de taille inférieure à celle
attendue [23]. Dans certaines conditions analytiques,
l’analyse par BN-PAGE permet aussi de visualiser les
super-complexes, c’est-à-dire les formes multimériques
des complexes de la CR. Trois principaux assemblages
ont ainsi été décrits (super-complexes III2-IV1-2, I-III2
et I-III2-IV1-4) et il a été proposé qu’une perturbation
de la formation des super-complexes ou de la pro-
portion entre les complexes isolés et ceux assemblés
en super-complexes pourrait avoir des conséquences
pathologiques [24].
Études histologiques
Outre une plus grande probabilité d’observer un défi-
cit fonctionnel par rapport à d’autres tissus, l’obten-
tion d’un échantillon musculaire permet de réaliser une
étude histologique qui peut se révéler très informative.
La présence de fibres rouges déchiquetées (red ragged
fibers, RRF) est un signe fréquent chez l’adulte, mais plus
rare chez l’enfant, de myopathies mitochondriales. Les
RRF sont mises en évidence par coloration au trichome
de Gomori modifié et correspondent à une accumula-
tion de mitochondries à la périphérie des fibres. Il est
réalisé également le marquage immuno-histo-enzymolo-
gique de l’activité des complexes II (SDH) et IV (COX)
pour la recherche de fibres SDH- et/ou COX-négatives.
Ces anomalies histologiques ne sont pas pathognomo-
niques mais constituent une preuve supplémentaire
pour investiguer une myopathie mitochondriale [12]
(figure 5).
Figure 5. Anomalies histologiques typiques des myopathies mitochondriales.
A : Fibres rouges déchiquetées (RRF, red ragged fibers).
B : Fibres négatives pour le marquage immuno-histo-enzymologique de la cytochrome c oxydase (ou COX, complexe IV).
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Dossier scientifique
Cytopathies mitochondriales
Dosage de l’ubiquinone
ou coenzyme Q10
L’ubiquinone ou coenzyme Q10 (CoQ10) a un rôle
essentiel dans le fonctionnement énergétique mito-
chondrial comme transporteur mobile d’électrons
et comme antioxydant. Des déficits primaires dans la
voie de biosynthèse du CoQ10 ont été identifiés il y
a une dizaine d’années et entraînent des phénotypes
bien caractérisés. Ces déficits restent une cause
exceptionnelle de cytopathies mitochondriales mais
il est essentiel de les rechercher lorsque la clinique
est évocatrice car ils constituent un des très rares
cas de cytopathies mitochondriales « traitables ». Le
dosage est réalisable par LC/MS/MS (chromatogra-
phie liquide couplée à la spectrométrie de masse
en tandem) dans différents types d’échantillon bio-
logique [25]. Le muscle semble le tissu le plus adapté
pour rechercher initialement un déficit primaire en
CoQ10, tout en sachant que des déficits secondaires
en CoQ10 sont observables dans d’autres patholo-
gies. Le suivi de la supplémentation orale par CoQ10
peut ensuite être réalisé par simple dosage plasma-
tique [26].
Interprétation
Les études spécifiques de la CR sont très informa-
tives et permettent d’orienter ou de confirmer le
diagnostic moléculaire. Cependant, il faut toujours
garder à l’esprit que ces altérations de la CR peuvent
être secondaires. En effet, le fonctionnement mito-
chondrial étant au cœur du métabolisme cellulaire,
toute perturbation de celui-ci est susceptible de
modifier les activités de la CR. Ainsi des anomalies
fonctionnelles de la CR ont été décrites dans d’autres
© service de Biochimie CHU Bicêtre
33
Dossier scientifique
pathologies, neuromusculaires mais aussi hépatiques
[27,28]. Par conséquent, tant que l’étude moléculaire
n’a pas retrouvé de variant pathogène expliquant le
déficit fonctionnel observé, le diagnostic formel de
cytopathie mitochondriale ne doit pas être posé.
À l’inverse, une étude fonctionnelle ne retrouvant
pas d’anomalies ne doit pas faire exclure d’em-
blée l’hypothèse d’une cytopathie mitochondriale,
celle-ci pouvant s’exprimer différemment selon les
tissus. Selon le contexte clinique, la poursuite d’in-
vestigations fonctionnelles sur d’autres tissus ou
d’études moléculaires peut être alors parfaitement
justifiée. Enfin, comme pour de nombreux paramètres
biologiques, de mauvaises conditions pré-analytiques
(notamment un délai dans la congélation des
biopsies) peuvent induire des déficits
artéfactuels.
Étude de l’intégrité L’analyse de la
de l’ADN
mitochondrial quantité et de la
qualité de l’ADNmt est
L’étude de l’intégrité de l’ADNmt
comprend la recherche d’ano- indispensable à l’étude
malies quantitatives (déplétion)
et qualitatives (grandes délétions)
des cytopathies
qui sont le signe d’un défaut dans mitochondriales
les fonctions de biosynthèse et de
maintenance de l’ADNmt.
Recherche de déplétion
La recherche de déplétion (diminution du nombre
de copies d’ADNmt) est réalisée par PCR quantitative
(qPCR) avec un couple d’amorces situées sur l’ADNmt
et un couple d’amorces situées sur l’ADNg pour nor-
maliser au nombre de cellules [29]. La déplétion est
définie par une quantité résiduelle d’ADNmt inférieure
à 30-40 % de la normale [30]. La recherche de déplé-
tion est plus informative sur des tissus à renouvelle-
ment relativement lent (muscle, foie) que sur ceux à
renouvellement rapide (lymphocytes, culture primaire
de fibroblastes).
Recherche de délétions
La recherche de délétions de grandes tailles de
l’ADNmt est effectuée par une technique de PCR
long range. Cette technique utilise une polymérase
spécifique permettant l’élongation sur des frag-
ments de plusieurs milliers de bases. L’association
de deux couples d’amorce permet d’amplifier la
totalité des 16 569 bases de l’ADNmt. La présence
de produits de PCR de tailles inférieures à celles
attendues est le signe d’une délétion de l’ADNmt.
La délétion peut être unique ou multiple (plusieurs
bandes) et n’est pas nécessairement présente dans
tous les tissus, ce qui n’oriente pas vers les mêmes
causes moléculaires.
34 REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES • N° 501 • AVRIL 2018
Interprétation
Tout comme les études fonctionnelles, l’analyse de
la quantité et de la qualité de l’ADNmt est indis-
pensable à l’étude des cytopathies mitochondriales
mais se heurte aux mêmes écueils. Une déplétion de
l’ADNmt doit faire rechercher des mutations dans
les gènes nucléaires impliqués dans la biosynthèse de
l’ADNmt mais peut aussi être secondaire à d’autres
pathologies [27,28]. Si la présence d’une délétion
unique de grande taille oriente facilement vers cer-
tains syndromes mitochondriaux, l’interprétation de
la présence de délétions multiples est plus délicate.
Un défaut dans les gènes codant pour la maintenance
de l’ADNmt est alors à rechercher, tout en sachant
que l’accumulation de délétions de l’ADNmt
est aussi une caractéristique du vieillisse-
ment musculaire normal [31].
Places respectives
des analyses
biochimiques
et moléculaires
Avant l’utilisation récente en rou-
tine des méthodes de séquen-
çage nouvelle génération (NGS),
les places respectives des études
biochimiques et moléculaires dans
la démarche diagnostique des cyto-
pathies mitochondriales étaient assez
claires. Schématiquement, devant des signes
cliniques orientant vers un syndrome connu, la
recherche directe de l’origine moléculaire (mutations
ponctuelles ou grande délétion de l’ADNmt ; séquen-
çage par technique Sanger d’un gène nucléaire ciblé)
était totalement justifiée. En l’absence d’association
syndromique évidente, la réalisation des études fonc-
tionnelles permettait d’identifier le ou les complexes
atteints. Ainsi, en cas de déficit isolé d’un complexe, des
mutations étaient recherchées dans les gènes nucléaires
ou mitochondriaux les plus fréquemment mutés pour
ce complexe. En cas de déficit multiple, l’ADNmt était
séquencé, notamment à la recherche de mutations sur
les gènes codants les ARNt et les ARNr et surtout
lorsqu’une transmission maternelle était suspectée.
Enfin, la présence de délétions multiples ou de déplé-
tion de l’ADNmt orientait vers les gènes nucléaires
impliqués dans la réplication de l’ADNmt (principale-
ment POLG, POLG2, TWNK) ou la régulation du pool
de nucléotides (principalement DGUOK, TK2, RRM2B,
SUCLA2, MPV17) [32].
La généralisation du NGS a considérablement fait évoluer
les pratiques et l’extension des analyses d’exome à
but diagnostique va encore les bouleverser. À l’heure
actuelle, la recherche moléculaire ciblée lors de cas
syndromiques est encore une stratégie efficace, rapide et
peu coûteuse, même si de nouvelles causes moléculaires

sont régulièrement décrites. Dans les autres cas, la
recherche de mutations causales se porte d’abord sur
l’ADNmt (séquençage de la totalité de l’ADNmt par
NGS) puis sur les gènes nucléaires responsables de
cytopathies mitochondriales dont la liste ne cesse de
s’étendre. En France, les panels les plus élargis comptent
jusqu’à 300 gènes actuellement. Les études fonctionnelles
ne se situent donc plus nécessairement en amont des
études moléculaires mais plutôt en parallèle, soit pour
déterminer si une analyse moléculaire plus approfondie
est justifiée, soit pour valider la pathogénicité des variants
de signification inconnue identifiés par NGS. QQ
Liens d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de liens
d’intérêts.
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REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES • N° 501 • AVRIL 2018
Dossier scientifique
Cytopathies mitochondriales
Points à retenir
◗tLes cytopathies mitochondriales sont dues à des
mutations de l’ADN mitochondrial ou de l’ADN
génomique.
◗tUn bilan RedOx (lactate, pyruvate, corps cétoniques)
normal ne doit pas faire exclure l’hypothèse d’une
cytopathie mitochondriale.
◗tLes déficits de la chaîne respiratoire s’expriment
différemment selon chaque tissu.
◗tLes déplétions (diminutions de la quantité) ou les
délétions multiples de l’ADN mitochondrial sont dues à
des mutations dans les gènes nucléaires impliqués dans la
maintenance de l’ADN mitochondrial.
◗tSeule l’identification d’une mutation à la pathogénicité
prouvée permet d’affirmer le diagnostic de cytopathie
mitochondriale, de nombreuses pathologies pouvant
causer des déficits secondaires de la chaîne respiratoire.
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