PALVADEAU Noémie

RENAUDIN Alice
UE7.1 - Chimie analytique
Mme POIRIER
12/01/2022 - 8h-9h

Chromatographie 2 (suite)

D. Performances d’une colonne

3 - Hauteur équivalente à un plateau théorique (H ou HEPT)

On continue le chapitre commencé au cours précédent. On s’était arrêté aux caractéristiques de performances d’une
colonne. On avait vu 2 éléments importants : N (nombre de plateaux théoriques) et H (hauteur équivalente à un
plateau théorique). Un plateau théorique correspond à un processus d’échange entre la phase stationnaire et la
phase mobile. On avait terminé sur quelques exemples de colonnes où on avait caractérisé ce nombre de plateaux
théoriques et cette hauteur.
Le nombre de plateaux théoriques est, comme son nom l’indique, issu d’une théorie. On peut donc l’estimer
expérimentalement et son nombre est unique pour une colonne donnée. On l’estime expérimentalement de manière
à s’assurer que la valeur obtenue est fiable et que l’on puisse observer des variations de ce nombre de plateaux
théoriques au cours du temps.
En TP, on déterminera ce nombre à partir d’un chromatogramme, et à partir d’un même chromatogramme, on peut
obtenir différentes valeurs de N. C’est une estimation, et il est plus proche de la réalité quand on travaille avec une
molécule qui passe du temps dans la colonne.

4 - Perte de charge d’une colonne (ΔP)

La perte de charge d'une colonne caractérise la pression que va supporter la colonne, la pression qui a lieu dans la
colonne. Elle est régie par la loi de Darcy qui s’exprime en Pascal, qui est noté ΔP :

et Φ = facteur de résistance à l’écoulement, c’est une constante qui dépend de la forme des particules. En effet,
certaines particules sont sphériques, d’autres irrégulières. Ce facteur est d’autant plus important que la forme des
particules est irrégulière. Il est de l’ordre de 500 pour des particules sphériques et plutôt de 1 000 pour des particules
de forme irrégulières. Cela veut dire que des particules de forme irrégulières vont augmenter la pression dans le
système.

Avec l’équation, on peut dire que :

- plus l’éluant est visqueux, plus ΔP augmente
- plus la colonne est grande, plus ΔP augmente
- plus la vitesse linéaire de la phase mobile est élevée (qui dépend directement du débit), plus on augmente la
pression
- et c’est inversement proportionnelle au diamètre des particules au carré, donc si on diminue le diamètre des
particules, on augmente la perte de charge.

C’est important car en TP, les colonnes sont reliées à des petites tubulures et l’ensemble est capable de résister à une
importante valeur de pression. On ne peut pas travailler à n’importe quelle pression, la plupart des systèmes
chromatographiques vont être capables de travailler entre 100 et 500 bars. On a des systèmes capables de travailler
au-delà de 500 bars, jusqu’à 1 000 bars, c’est ce qu’on appelle les UHPLC = ultra haute performance chromatographie
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liquide, ce sont des systèmes particuliers avec des systèmes de tubulures qui peuvent supporter des pressions très
importantes.

On a dans le tableau, un exemple comparatif entre 2 systèmes :

Dans l’exemple 2, la viscosité est plus importante que l’exemple 1 car le 2 est composé de méthanol et d’eau, alors
que le 1 est constitué uniquement de méthanol, et l’eau est plus visqueuse que le méthanol.
On observe bien par une augmentation de la viscosité et par une diminution du diamètre des particules, que l’on
augmente fortement la pression ΔP.
Il faut en tenir compte car le système utilisé n’est pas forcément capable de supporter cette pression, donc c’est un
paramètre important.

C’est également un paramètre intéressant à suivre car si on a des diminutions de pression au cours du temps, cela
peut traduire des fuites ou des problèmes de débit, et si on a des augmentations, cela peut traduire des bouchages
de colonne.
On a des valeurs seuils, si ΔPexpérimental est supérieur à 1,5 fois ΔPthéorique, cela peut traduire une colonne
bouchée. A l’inverse, si ΔPexpérimental est inférieur à 0,7 fois ΔPthéorique, cela peut traduire une fuite ou un
problème de débit.

E. Données de séparation

Elles sont importantes car elles permettent de vérifier que la séparation chromatographique est efficace.
Il existe 2 grandes variables de séparation :

1 - La sélectivité (α)

La sélectivité, noté α, mesure la différence de distributions entre 2 pics successifs.

Elle est estimée graphiquement à l’aide du chromatogramme.

On utilise la formule à droite:

2
La formule signifie :
(temps de rétention du composé 2 - temps mort) / (temps de rétention du composé 1 - temps mort), ce qui revient à
faire le rapport entre le facteur de rétention du composé 2 (=K2) sur le facteur de rétention du composé 1 (=K1).

On peut trouver la sélectivité sous l’abréviation r mais c’est rarement utilisé.

Cela permet de positionner la rétention du composé 2 par rapport au composé qui le précède.
Il faut qu'elle soit supérieure à 1, car si elle est de 1, cela veut dire que les 2 composés sont superposés.

2 - Le facteur de résolution (Rs)

Le 2ème facteur est la résolution. C’est le retour à la ligne de base entre 2 composés, pics successifs. Il est calculé à
l'aide du chromatogramme.
On retrouve les valeurs que l’on peut utiliser.

La 1ère formule fait intervenir ω = largeur à la base du pic, et la 2ème fait intervenir δ = largeur à mi-hauteur.
Généralement, on utilise plutôt la 2ème formule.

Les données sont directement obtenues à l'aide du logiciel en TP.

On voit que si la somme au dénominateur des largeurs est importante, on va pouvoir recouvrir la différence obtenue
au niveau des pics. Cela traduirait une mauvaise résolution et une mauvaise estimation d’aire, qui entraîne
l'apparition d’un biais.
Avoir une bonne résolution permet donc d’avoir une bonne estimation de l’aire de chaque pic.

Ici, les pics sont mal séparés avec un chevauchement sans retour à la ligne de base entre les 2 pics. On aura donc une
surface estimée qui va être biaisée.
Il faut savoir qu’il y a une valeur seuil de 1,5. Si la résolution est inférieure à 1,5, cela signifie que l’on va avoir une
erreur sur l’aire d’environ 2,5% pour des pics de même surface et ainsi, une erreur de 2,5% sur le résultat de
concentration obtenue.

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Il existe une autre façon d’estimer la résolution.
Elle est basée sur la théorie de la chromatographie. Cette fois-ci, on est sur une détermination par le calcul et non
plus de façon graphique. Cela se fait à l'aide de la connaissance des valeurs de N, de α et de k = facteur de rétention.
Ici, on utilise la moyenne des facteurs de rétention.

En dessous, on a aussi une formule approchée que l’on peut aussi utiliser mais qui n’est pas à retenir.

C’est intéressant car cela permet de savoir comment on peut améliorer la résolution.
On peut augmenter la résolution en :
- augmentant N car on augmente l’efficacité de la colonne
- augmentant la sélectivité : on peut voir sur le graphique, une 1ère phase d’augmentation rapide puis on
atteint un plateau. Donc, à partir d’une certaine valeur de sélectivité, on va avoir un impact moindre de la
sélectivité sur la résolution. On peut dire que quand on est dans un ordre de grandeur entre 1 et 2, on peut
jouer sur la sélectivité pour augmenter la résolution.
- augmentant le facteur de rétention : au début, sur le graphique, on a aussi une phase d’augmentation très
rapide puis on a un plateau plus marqué que pour la sélectivité. Pour des composés avec des facteurs de
rétentions entre 0 et 5, on peut jouer dessus, mais au-delà de 5, cela ne sert plus à grand-chose.

Expérimentalement, on peut augmenter N en augmentant la longueur de la colonne : passer de 15 cm à 25 cm, avec

la même qualité de phase stationnaire.
C'est ce qu'on voit avec les 4 exemples de chromatogrammes :

4
Ce sont 4 colonnes différentes. La 1ère fait 5 cm, la 2ème fait 10 cm, la 3ème fait 15 cm et la dernière fait 25 cm.
On voit que lorsqu’on augmente la longueur, les pics chromatographiques sont de plus en plus étalés, donc on les
sépare mieux. Ainsi, les pics sont mieux résolus en augmentant la longueur de la colonne qui est associée à
l’augmentation du nombre de plateaux théoriques.
Donc, si on multiplie par 5 la valeur de la longueur, on multiplie par 5 la valeur de N et consécutivement, on multiplie
par √5 le facteur de résolution.

On peut voir aussi la pression qui augmente. Si on augmente par 5 la longueur, on augmente d’un facteur 5, la perte
de charge.

Pour augmenter N, on peut aussi diminuer le diamètre des particules.

En effet, H = L / N, et une autre relation est importante : H est proportionnelle au diamètre des particules (dp).
Donc, si on diminue le diamètre des particules, cela entraîne une diminution de H, ce qui aboutit à une augmentation
de N.

Avec cet exemple, si on diminue le diamètre des particules par 2, on diminue H par 2 et on multiplie N par 2, et la
résolution est multipliée par √2.
Graphiquement, en haut, on a un massif non résolu, si on diminue le diamètre, on voit que le massif est de mieux en
mieux résolu. L’estimation d’aire à 3 μm peut néanmoins être biaisée mais elle est nettement plus précise que celle
obtenue à 10 μm.
Ce qui est important aussi est que le temps de rétention des composés est le même, le diamètre des particules n’a
donc pas d’influence sur le temps de rétention pour une longueur de colonne constante.

Enfin, on peut jouer sur le facteur de rétention.

On le fait varier en jouant sur le pourcentage de solvant fort. Ce dernier est le solvant dans la phase mobile qui
présente la force éluante la plus importante. Il va rentrer en compétition avec la phase stationnaire pour les
interactions avec les solutés et plus son pourcentage est important, plus il va permettre d’éluer les composés.

Sur les différents chromatogrammes, l'eau est le solvant fort. Plus on augmente la quantité d’eau et plus on
augmente la résolution des 2 pics. On joue sur la composition de la phase mobile. A k2 = 5,7, on commence à
atteindre une résolution correcte.
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→ Les paramètres importants à retenir pour améliorer une chromatographie sont donc :
- le facteur de rétention doit être supérieur ou égal à 1
- la résolution doit être supérieure à 1,5
- le temps d'analyse total doit être le plus petit possible
Ce sont les 3 paramètres les plus importants. On peut aussi regarder la sélectivité qui doit être supérieure à 1 mais
elle a une importance moindre comparée aux 3 autres :

Ici, la sélectivité est équivalente pour les 2 situations : αA = αB.

Mais, la résolution de A est totalement différente de celle de B. Pour A, on a
un retour à la ligne de base et pas pour B. Ainsi, pour le B, la résolution sera
inférieure à 1,5.
Donc, le paramètre de résolution est plus important que la sélectivité pour
caractériser la séparation.

En TP, on fera varier les conditions de phase mobile pour voir l’impact que cela a sur la séparation et on regardera les
différents paramètres. Si la résolution est toujours supérieure à 1,5,on va pouvoir diminuer le temps d’analyse en
modifiant la composition de la phase mobile. On testera plusieurs pourcentages de solvants forts et on regardera les
variations des différents facteurs.

La façon qui nous permettra de nous placer au temps

d’analyse minimum, sera d’avoir pour le composé qui
sort en premier donc qui sera le moins retenu, un
facteur de rétention de 1.
Il faudra utiliser la construction d’un graphique avec
log(k) en fonction du pourcentage de solvant fort :

Questions Kahoot sur les premiers chapitres

1ère question

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Mots manquants :
1 - séparation
2- mélange
3 - échanges (interactions possible aussi mais pas élution)
4 - miscibles
5 - mobile
6 - stationnaire (attention pas aqueuse)

2ème question

Bonnes réponses :
1 - La nature de la phase mobile : qui peut être liquide, gazeuse ou supercritique
3 - Le procédé utilisé : qui peut être sur couche mince ou sur colonne
5 - La nature des équilibres mis en jeu : il y a l'existence de différents types d’équilibres comme le partage,
l'adsorption ou encore la filtration en fonction de la taille, qui représentent les phénomènes mis en jeu.
On peut rencontrer les interactions dans chaque type de chromatographie, donc ce n’est pas une classification.

3ème question
Nommez les méthodes de chromatographies au niveau des numéros 1 et 2.

Bonnes réponses :
1 = CPG (car pas d'interactions de la phase mobile, elle possède uniquement un rôle d'entraînement)
2 = CPL et CPS

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4ème question
Propositions de chromatographies : Chromatographie d’affinité / Chromatographie d’échange d’ions /
Chromatographie chirale / Chromatographie de partage / Chromatographie d’exclusion stérique / Chromatographie
d'adsorption

Bonnes réponses :
Fixation spécifique d’un ligand sur son récepteur → Chromatographie d’affinité
Fixation (réversible) d’un analyte sur une surface solide → Chromatographie d'adsorption
Séparation par différence de pénétration des molécules dans les pores de la PS → Chromatographie d’exclusion
stérique
Séparation des ions et des composés polaires par interactions électrostatiques avec la PS → Chromatographie
d’échange d’ions
Partage d’un soluté entre 2 phases liquides non miscibles → Chromatographie de partage
Séparation de composés racémiques → Chromatographie chirale

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5ème question
Propositions d’interactions : Forces de dispersion de London / Interactions π-π / Interactions diélectriques /
Interactions dipolaires de Keesom / Liaisons hydrogènes / Interactions dipolaires de Debye

Bonnes réponses :
Attraction entre ions de charges opposés → Interactions diélectriques
Liaison entre un atome d’hydrogène de faible densité électronique et un atome très électronégatif → Liaisons
hydrogènes
Interactions entre deux molécules polaires → Interactions dipolaires de Keesom
Induction d’un dipôle par une molécule polaire → Interactions dipolaires de Debye
Interactions entre des couches d’électrons π → Interactions π-π
Interactions entre 2 molécules non polaires → Forces de dispersion de London

(la prof va (peut-être) mettre le kahoot sur MADOC si vous voulez le refaire)

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