TP n°1 

: Vérification des micro-pipettes

I) But
Vérification par méthode gravimétrique des qualités métrologiques de micro pipettes à piston.

II) A propos du pipetage

Il y a plus d’un siècle, Louis Pasteur inventait la pipette en verre pour réduire la contamination
lors du transfert échantillons. La pipette Pasteur continue à être utilisé de nos jours.
En 1972, le docteur Warren Gilson introduisit une pipette de haute précision pouvant être réglée
sur n’importe quel volume. Son originalité résidait dans le fait que pour éviter toute erreur, le volume
sélectionné était affiché sur la pipette. De nos jours Gilson est une marque présent dans le monde
entier.

III) Théorie
La séance a pour but de vérifier les qualités métrologiques des pipettes à piston, à savoir la
justesse et la fidélité de l’instrument.
Chaque élève utilisera une seule pipette sur une seule balance en effectuant 5 mesures pour
chacune des deux solutions
La justesse ou erreur systématique ou tolérance est évaluée en comparant le biais à l’erreur
maximale tolérée.
La fidélité ou erreur aléatoire ou répétabilité est quant à elle évaluée en comparant l’écart-type
expérimental à l’écart-type maximal toléré.

1) Spécifications selon la norme ISO 8655

La norme ISO 8655 indique des valeurs limites d'exactitude et de répétabilité en valeur absolue
et en valeur relative. Ces valeurs varient selon la technique utilisée (déplacement d'air, déplacement
positif, pipettes répétitives).
Les spécifications des constructeurs établies par le fabricant, garantissent, en termes
d'exactitude et de précision, la performance de toutes les pipettes d'une marque donnée, pour un
modèle donne et un volume donné.

Ces spécifications sont définies pour une utilisation des pipettes en mode direct, par méthode gravimétrique , la
température de l'eau distillée et conditions d'environnement étant stabilisées entre 15 et 30°C. Les valeurs indiquées
incluent toutes les composantes de l'erreur due a la fois au transfert de chaleur manuelle et au changement de pointe.
IMPORTANT : Pour être conforme à la norme ISO 8655, les spécifications de la pipette doivent respecter les erreurs
maximales tolérées correspondantes.
 2) Quelques formules
a) Température moyenne du liquide testé

t 1 +t 2 t1 : température de la 1ère pesée

t=
2
t2 : température de la dernière pesée

b) Moyenne des masses

n n : nombre de pesée
1
m̄= ×∑ mi
n i=1
mi : résultat de la pesée

“Exactitude” et “fidélité” sont des termes qualitatifs. Les termes quantitatifs correspondants sont
“erreur systématique” et “erreur aléatoire”.

c) Erreur systématique ou biais ou accurancy

E=V̄ −V 0 V̄ : volume moyen

Vo : volume nominal

d) Erreur systématique relative ou biais relatif

V̄ −V 0 V̄ : volume moyen
E %= ×100
V0
Vo : volume nominal

e) Écart-type expérimental σn-1 et l’incertitude type de répétabilité u ou fidélité

√
n

∑ (x i− x̄)2 σ m̄ : masse moyenne

i=1 u= n−1
σ n−1= √n
n−1 mi : masse mesurée

f) Écart-type relatif ou coefficient de variation (en %)

100×s V̄ : volume moyen

CV =
V̄
s : écart-type expérimental

g) Conversion Masse/Volume
La conversion en volume doit tenir compte de la densité du liquide ainsi que de l’évaporation
pendant le temps de cycle. Pour chaque mesure, le volume correspondant (V i) peut être calculé
comme suit :
mi : masse lue sur la balance
V i =m i×Z
: facteur de conversion intégrant la flottabilité de l'eau dans l'air, à la
Z
température et a la pression barométrique de test.
 h) Intervalle de confiance
➢ Nombre de mesure ≥ 30
L’incertitude-type élargie est Δx et elle s’exprime sous la forme Δx = k x σ où k est le facteur
d’élargissement. Il dépend du nombre de mesures.
Dans le cas d’un nombre important de mesure, on suit une loi de distribution normale
gaussienne:
-si k = 1, le niveau de confiance est de 68%, et l'intervalle est [ x̄−σ ; x̄ + σ ]
-si k = 2, le niveau de confiance est de 95%,et l'intervalle est [ x̄−2 σ ; x̄ +2 σ ]
-si k = 3, le niveau de confiance est de 99% et l'intervalle est [ x̄−3 σ ; x̄ +3 σ ]

➢ Nombre de mesure ≤ 30

Si l'on a peu d'échantillons (typiquement ≤ 30), il faut utiliser un coefficient k plus grand pour
prendre en compte l'erreur faite sur la détermination de la moyenne et de σ. Le facteur
d’élargissement k est assimilable au coefficient de Student t disponible dans la table de Student : il
varie selon le nombre de mesures n et le niveau de confiance. Typiquement on utilise les niveaux de
confiance 95% et 99% : on retient le plus souvent 95%.
L’intervalle de confiance est : x̄−k ×s≤ x̄≤ x̄ +k ×s

x̄−k ×s x̄ x̄+ k×s

 IV) Manipulation
La méthode gravimétrique est recommandée par les fabricants de pipettes et les organisations
normatives internationales. Elle est basée sur la détermination du poids des échantillons d'eau
distribues par la pipette. La mise en œuvre de cette méthode nécessite le contrôle strict des
conditions d'environnement et l'utilisation systématique d'un équipement approprie et contrôle.

1) Matériel à disposition
- quatre balances de précisions
- micropipette
- une solution d’eau distillée

Chaque élève évalue une micropipette, pour 2 volumes différents : 50% et 100% du volume
nominal (pipetage direct). Commencer par le volume le plus petit. Bien noter le n° de la micropipette.
Si le résultat d’une pesée est manifestement aberrant, ne pas le prendre en compte.

2) Obtention des données : mesurage

1) Placer une petite quantité d'eau dans le récipient de pesée (3 mm minimum).
2) Noter les conditions environnementales (température ambiante et de l'eau, hygrométrie et la
pression atmosphérique).
3) Sélectionner le volume à tester sur votre pipette à volume variables.
4) Ajuster une pointe (les spécifications constructeur ne s'appliquent que si le test est réalisé
avec les pointes préconisées par le constructeur).
5) Pre-rincer 5 fois la pointe pour équilibrer le volume mort de la pipette, sans en tenir compte
pour les calculs.
6) Changer de pointe.
7) Pre-rincer 1 fois la pointe.
8) Pipeter le volume à tester.
9) Tarer la balance.
10) Ouvrir la porte de la balance, retirer le récipient de pesée, distribuer l’échantillon, reposer sur
le plateau et fermer la porte.
11) Après stabilisation de l'affichage, noter la valeur (M i).

Répéter les étapes 6 à 11 et noter 10 mesures M 1 à M10.

 V) Deux types de pipette
1) Pipette à déplacement d’air
• Recommandé pour les échantillons aqueux et pour le travail de
laboratoire en général
• Présence d’un coussin d’air (volume mort) entre le piston de la pipette et
l’échantillon liquide
• Le piston fait partie intégrante de la
pipette

2) Fonctionnement d’une pipette à déplacement d’air

Quand on appuie sur le bouton-poussoir d’une pipette à déplacement d’air, le piston descend pour expulser l’air. L’air
est déplacé par le piston. Le volume d’air déplacé correspond au volume de liquide pipeté.
 VI) Technique de pipetage
1) Pré-rincage
On obtient une plus grande uniformité et donc une meilleure répétabilité, si les surfaces de contact sont identiques pour toutes les aliquotes. Ce résultat s’obtient grâce
à un pré-rincage avec le liquide qui sera distribué. Pour pré-rincer, aspirer le liquide dans la pointe puis le redistribuer dans le récipient d’origine ou le jeter. Le pré-rincage
est nécessaire à chaque changement de pointe et à chaque changement de volume.

2) Mode direct

La précision du mode direct repose sur la

régularité du flux et de la pression d’air (pipettes à
déplacement d'air) ou sur l’étanchéité de
l’ensemble capillaire / piston (pipettes à
déplacement positif).
 VII) Formulaire pour le relevé de vérification des pipettes
DATE : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
T° eau : . . . . . . . . . . . . . . . . . °C
Facteur Z correspondant : . . . . . . .. . . . . . en µL.mgˉ¹
N° de la pipette : … . . . . . . . . . . . . . . . . . .
PESÉES (mg) :
1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Moyenne des 10 pesées :
m̄
DATE : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
T° eau : . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . °C
Facteur Z correspondant : . . . . .. . . . . . . . . . .en µL.mgˉ¹
N° de la pipette : … . . . . . . . . . . . . . . . . . .
PESÉES (mg) :
1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Moyenne des 10 pesées :
m̄

Volume mesuré moyen : Volume mesuré moyen :

V̄ V̄

Erreur systématique ou exactitude (E): Erreur systématique ou exactitude (E):

Erreur systématique relative (E%) : Erreur systématique relative (E%) :

Erreur aléatoire (u) ou répétabilité en mg: Erreur aléatoire (u) ou répétabilité en mg:

Erreur aléatoire (u) ou répétabilité en µL : Erreur aléatoire (u) ou répétabilité en µL :

Erreur aléatoire relative ou CV Erreur aléatoire relative ou CV

Valeurs références des erreurs systématiques et aléatoires Valeurs références des erreurs systématiques et aléatoires

Intervalle de confiance Intervalle de confiance

CONFORME : 􀁓 □ OUI 􀁓 □ NON CONFORME : 􀁓 □ OUI 􀁓 □ NON

 Vérification des balances

I) Aperçu de l’appareil

II) Préparatifs avant l’étalonnage

Avant de commencer à étalonner un instrument de pesage, il faut bien se
préparer en amont et clarifier plusieurs points. Ainsi, il faut vérifier les
caractéristiques techniques de l’instrument de pesage (portée maximale,
échelon réel, les exigences d’exactitude (l’erreur maximale tolérée et
l’incertitude) ainsi que la procédure en cas de vérification non conforme (ajustages).
L’exactitude d’un instrument renvoie à la véracité des données qu’il produit
La résolution d’un instrument renvoie au plus petit incrément ou décrément de position pouvant
être mesuré par celui-ci
La précision d’un instrument de mesure de position renvoie à son degré de reproductibilité.
La linéarité d’un instrument de mesure de position renvoie à l’écart entre la sortie du transducteur
et le déplacement réel étant mesuré.
 III) Principes de base et définitions
Charge maximale (portée) : la plus grande charge susceptible d’être pesée par la balance.
Portée minimale : Valeur de la charge en dessous de laquelle les résultats des pesées peuvent
être entachés d'une erreur relative trop importante.
Justesse : Aptitude d'un instrument de mesure a donner des indications exemptes d'erreur
systématique.
Exactitude : Il s'agit de l'aptitude de la balance a fournir des résultats concordant entre la valeur
lue (indication de la balance) et la valeur vraie (poids étalon), dans des conditions normales de
fonctionnement.
Fidélité : Aptitude de la balance a donner des indications très voisines pour une même charge
déposée plusieurs fois et d'une manière pratiquement identique sur le plateau de la balance et ce,
dans des conditions d'essais raisonnablement constantes.
Échelon de vérification (e) : Valeur exprimée en unités de masse utilisée pour la classification
et la vérification d'une balance. Cet échelon sert de base a la détermination de l'erreur maximale
tolérée (EMT: différence maximale acceptable en plus ou en moins entre l'indication d'un instrument
et la valeur vraie correspondante).
Échelon réel (d) : (précision de l'affichage). Il représente la plus faible division de l'échelle ou le
dernier digit exprimé en unités de masse. A cet échelon, l'affichage doit être stable. Attention, pour
les balances à plages multiples (Dual Range), d est variable selon la plage de pesée.
Classe de la balance : fonction de la précision (type I spéciale, type II, fine, type III moyenne,
type IV ordinaire)

IV) Essai d’excentration

1) Manipulation
L’excentration est l’aptitude de la balance à fournir des résultats concordants, en modifiant le point
d’application d’une même charge.
Lors des mesures de routine, la charge à peser est rarement placée parfaitement au centre de la
cellule de pesée de l’instrument de pesage. Or il s’avère que les résultats de mesure obtenus
peuvent parfois varier légèrement en fonction de l’emplacement de la charge sur le plateau de
pesée. L’essai d’excentration consiste donc à évaluer l’influence que l’emplacement de la charge sur
le plateau aura sur le résultat de la mesure.
Lors de cet essai, la charge de référence est placée à différents endroits préalablement
déterminés de la cellule de pesée.
Pour la réalisation de cet essai, un poids (proche ou égal au tiers de la portée maximale de la
balance vérifiée) était appliqué aux quatre coins puis au centre du plateau de la balance; soit au total
cinq pesées effectuées avec une même charge pour chaque balance.

1) Tout d’abord, on place la charge (techniquement le centre de gravité de la charge) au centre

de la cellule de pesée avant de relever l’indication de mesure. Ensuite, la charge est placée à
quatre autres endroits de la cellule de pesée, comme indiqué sur l’illustration.
 2) Remettez l’indication à zéro avant le début de l’essai.
3) Déposez ensuite le poids à l’emplacement 1 et relevez l’indication.
4) Déposez le poids à l’emplacement 2, relevez l’indication.
5) Procéder ainsi de suite jusqu’à l’emplacement 5.
6) Redéposez le poids à l’emplacement 1 pour vérifier que l’indication n’a pas dérivé depuis la
première mesure. N’hésitez pas à vérifier le zéro entre chaque mesure pour vous assurer qu’il
n’a pas changé. Si nécessaire, vous pouvez remettre l’instrument à zéro entre chaque
mesure.

2) Résultats
Le choix de l’EMT tenait compte de la classe de la balance, de la masse de la charge utilisée, et
de « e »(avec« e » = 10« d »).
L’erreur sur chaque pesée était égale à la différence entre la valeur lue et la valeur nominale ou
valeur vraie ; la valeur absolue de cette différence était ensuite comparée à la valeur absolue de
l’EMT correspondante. Lorsque cet écart était inférieur ou égal à l’EMT, l’essai d’excentration sur
cette pesée était dit conforme mais quand celui-ci était supérieur à l’EMT, il y avait une non-
conformité. L’essai d’excentration est dit conforme lorsqu’il y a conformité pour chaque pesée ;
autrement l’observation d’une seule non-conformité sur une pesée rend cet essai.

V) Essai de fidélité ou répétabilité

1) Manipulation
La répétabilité est l’aptitude de la balance à fournir des résultats concordants entre eux pour une
même charge déposée plusieurs fois et d’une manière pratiquement identique sur le plateau de la
balance, dans des conditions d’essais constantes.
Les valeurs nominales des poids étalons sont choisies de manière à réaliser l’essai à la moitié de
la portée maximale (Max/2) sur six pesées consécutives pour les balances d’analyse.
La même répartition des charges sur le plateau est conservée lors de chaque application, afin de
ne pas engendrer d’erreur d’excentration.
La répétition des mesures a eu lieu dans un laps de temps et sans interruption (environ 40s dans
notre cas).
La charge à peser est placée à l’intérieur de repères centrés sur le plateau pour éviter toute
erreur liée à l’excentration. La balance est mise à zéro au début de l’essai. Entre chaque dépôt de
la charge, la balance peut être remise à zéro si nécessaire. On relève à chaque charge les valeurs
lues, après stabilisation de la balance. On corrige les valeurs de mesure de la dérive du zéro, si elle
existe.

2) Résultats
Relever l’indication pour chaque pesée sur la fiche établie à cet effet. Calculer l’écart type à l’aide

√
de la formule suivante :
s=
∑ (mi− m̄)2
n−1

L’erreur de fidélité est ensuite comparée à l’EMT correspondant. Lorsque cet écart est inférieur
ou égal à l’EMT, l’essai de fidélité est dit conforme mais quand celui-ci est supérieur à l’EMT, il y a
une non-conformité.
 VI) Essai de justesse
1) Manipulation
La justesse est l’aptitude de la balance à fournir des résultats concordants entre la valeur lue (indi-
cation de la balance) et la valeur vraie (poids étalon), dans des conditions habituelles de fonction -
nement.
Cet essai est effectué en charges croissantes. Cinq valeurs de charge sont normalement
suffisantes. Les valeurs nominales des poids étalons sont choisies de manière à permettre le relevé
des valeurs réparties sur l’étendue de mesures comme suit :
- Un point proche de la charge minimale (Min) ;
- un point proche du quart de la charge maximale (max/4) ;
- un point proche de la moitié de la charge maximale (max/2) ;
- un point proche des trois quarts de la charge maximale (3/4 max) ;
- un point proche de la charge maximale (Max).
La même répartition des charges sur le plateau de la balance est conservée lors de chaque
application, afin de ne pas engendrer une erreur d’excentration.
La balance est mise à zéro au début de l’essai. Entre chaque dépôt de charge, la balance ne doit
pas être remise à zéro. On relève à chaque charge les valeurs lues, après stabilisation de la
balance.

2) Résultats
L’erreur de justesse sur chaque pesée était égale à la différence entre la valeur lue et la valeur
nominale ou valeur vraie ; la valeur absolue de cette différence était ensuite comparée à la valeur
absolue de l’EMT correspondante.
Le choix de l’emt tenait compte de la classe de la balance, de la masse de la charge utilisée, et
de « e »(avec« e » = 10« d »).
Lorsque cet écart était inférieur ou égal à l’EMT, l’essai de justesse sur cette pesée était dit
conforme mais quand celui-ci était supérieur à l’EMT, il y avait une non-conformité. L’essai de
justesse est dit conforme lorsqu’il y a conformité pour chaque pesée ; autrement l’observation d’une
seule non-conformité sur une pesée rend cet essai non-conforme.
 Certificat de vérification balance
Identification de la balance Données
Marque : ……………….………………………... Portée Max : …………………..….………....…
Modèle : ……………….……….………………... Portée Min : ……..………..….…...……………
N° de série : …………………………………….. Classe : …………………………………………
Échelon de vérification (e) : ……..……………
Échelon réel (d) : ……………………………….
Contrôles métrologiques
Excentration
Charge proche de Max/3 : …………...………
EMT à Max/3 : ………………………………...
N° de position 1 2 3 4 5
Indication relevée
Erreur

Croquis du récepteur et positions de la charge de contrôle :

Excentration correcte : oui □ non □

Fidélité
Charge proche de Max/2 : …………...………
EMT à Max/2 : ………………………………...
Masse Indication relevée Écart maximal
Pesée 1
Pesée 2
Pesée 3 ..........................…. mg
Pesée 4
Pesée 5
Pesée 6
Fidélité correcte : oui □ non □
Justesse
Valeur nominale de l’étalon Indication relevée Erreur EMT
Zéro 0g
Charge 1 ….………….. g
Charge 2 ….………….. g
Charge 3 ……………... g
Charge 4 ……………... g
Charge 5 ……………… g
Justesse correcte : oui □ non □