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agronomie
Révision
Applications et potentiel des systèmes d'édition de génomes
dans l'amélioration du riz : Perspectives actuelles et futures
Javaria Tabassum 1 , Shakeel Ahmad 1,2 , Babar Hussain 3 , Amos Musyoki Mawia 1 , Aqib Zeb 1 et Luo Ju 1,*

1 State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China ;
javaria.tabassum@outlook.com (J.T.) ; shakeelpbg@gmail.com (S.A.) ; amosyokis@gmail.com (A.M.M.) ;
aqibzeb@yahoo.com (A.Z.)
2 Station de recherche sur le maïs, Institut de recherche agricole Ayub, Faisalabad 38000, Pakistan
3
Département des sciences biologiques, Université technique du Moyen-Orient, 06800 Ankara,
Turquie ; bhussain@sabanciuniv.edu
* Correspondance : luojurice@126.com ou luoju01@caas.cn ; Tél : +86-135-7570-6965

Résumé : La production et la qualité des cultures vivrières sont deux attributs majeurs qui
garantissent la sécurité alimentaire. Le riz est l'une des principales sources de nourriture qui alimente
la moitié de la population mondiale. Par conséquent, pour nourrir environ 10 milliards de personnes d'ici
2050, il est nécessaire de développer des variétés de riz à haut rendement et de qualité, à un rythme
plus soutenu. Bien que les techniques de sélection conventionnelles et de mutation aient joué un rôle
important dans le développement des variétés souhaitées dans le passé, ces techniques ne peuvent, en
raison de certaines limitations, répondre à la forte demande alimentaire de l'époque actuelle.
vérifier ou
mises à jour Cependant, la production de riz et la qualité des grains peuvent être améliorées en employant de
nouvelles techniques de sélection, telles que les outils d'édition du génome (GET), avec une grande
Citation : Tabassum, J. ; Ahmad, S. ;
efficacité. Ces outils, notamment les systèmes CRISPR (clustered, regularly interspaced short palindromic
Hussain, B. ; Mawia, A.M. ; Zeb, A. ;
repeats), ont révolutionné la sélection du riz. Le protocole de la technologie des systèmes
Ju,
L. Applications et potentiel des
CRISPR/Cas9 et ses variantes sont les plus fiables et les plus efficaces, et ont été établis dans les
systèmes d'édition de génomes dans cultures de riz. De nouveaux GET, tels que CRISPR/Cas12 et les éditeurs de bases, ont également
l'amélioration du riz : Current and été appliqués au riz pour l'améliorer. Les recombinases et les outils d'édition de base ont le
Future Perspectives. Agronomy 2021, potentiel d'effectuer des modifications plus précises et plus efficaces. En bref, dans cette revue,
11, 1359. https://doi.org/10.3390/ nous discutons des progrès réalisés dans les systèmes CRISPR, les éditeurs de base et les éditeurs
agronomy11071359 principaux, et leurs applications, pour améliorer le rendement des grains de riz, la tolérance au stress
abiotique, la qualité des grains, la résistance aux maladies et aux herbicides, ainsi que les aspects
Rédacteurs académiques : V. Mohan réglementaires et les risques associés aux plantes de riz génétiquement modifiées. Nous nous
Murali Achary et Malireddy K. Reddy
concentrons également sur les limites et les perspectives d'avenir des GET pour améliorer la
qualité des grains de riz.
Reçue : 3 juin 2021
Accepté : 29 juin 2021
Mots clés : riz ; rendement des grains ; stress abiotique ; stress biotique ; qualité des grains ;
Publié : 2 juillet 2021
sécurité alimentaire ; systèmes CRISPR/Cas ; édition de bases ; édition d'amorces
Note de l'éditeur : MDPI reste neutre
en ce qui concerne les revendications
juridictionnelles dans les cartes
publiées et les affil- iations 1. Introduction
institutionnelles. Le riz (Oryza sativa L.) est cultivé dans le monde entier et consommé par
environ 3 milliards de personnes, soit environ 50 % de la population mondiale [1,2]. Le riz est
cultivé sur 162 millions d'hectares et sa production mondiale était de 755 millions de
tonnes en 2019 (http://www.fao.org/ faostat/en, consulté le 29 juin 2021). La
Copyright : © 2021 par les auteurs. population mondiale pourrait augmenter de 9,7 à 11 milliards de personnes en 2050
Licencié MDPI, Bâle, Suisse. Cet article (https://population.un.org/wpp/, consulté le 29 juin 2021) ; une augmentation
est un article en libre accès distribué significative du rendement du riz sera donc nécessaire pour nourrir la population croissante. On
selon les termes et conditions de la estime que la demande mondiale de riz augmentera de 50 % d'ici 2050 [3]. Cependant, le
licence Creative Commons Attribution changement climatique est un facteur limitant majeur pour la production agricole et
(CC BY) (https:// l'augmentation des températures entraîne des périodes de sécheresse plus fréquentes et
creativecommons.org/licenses/by/ plus graves, ainsi que la salinisation des sols [4]. Le riz est confronté à plusieurs stress
4.0/). biotiques et abiotiques qui réduisent considérablement sa production. Environ 3 000
litres d'eau sont la minceur de sa cuticule et de la petitesse de son système racinaire ; la sécheresse peut
nécessaires pour entraîner des pertes de rendement allant jusqu'à 100 % [5]. De même, la salinité du sol pourrait
produire 1 kg de riz, réduire de 50 % la production mondiale de riz [6] et le stress dû au froid menace également la
alors qu'il s'agit d'une production et la qualité du riz [1]. Par conséquent, une augmentation de la production
espèce sensible à la de riz et une amélioration de la qualité de ses grains sont essentielles pour une vie saine et
sécheresse en raison de durable à l'avenir [2]. L'augmentation de la production de

Agronomy 2021, 11, 1359. https://doi.org/10.3390/agronomy11071359 https://www.mdpi.com/journal/agronomy

Agronomie 2021, 11, 1359 2 de 43

Le rendement du riz et le développement de plants de riz résistants au stress sont essentiels

pour la sécurité alimentaire mondiale. En outre, l'amélioration des paramètres de qualité du
grain renforce la demande des consommateurs et la valeur commerciale des variétés de riz
[7]. Auparavant, la qualité du grain de riz, la résistance au climat, la résistance aux
maladies et le rendement ont été améliorés grâce à des approches de sélection
conventionnelles (mutagénèse et hybridation). Cependant, ces techniques prennent du
temps, sont fastidieuses, nécessitent de grands cribles de mutants et sont sujettes à des biais
humains [4]. Par conséquent, des approches d'amélioration des cultures plus puissantes,
plus précises, plus rapides et plus robustes, telles que l'édition du génome, seront
nécessaires pour répondre à la demande de riz de la population mondiale en constante
augmentation (figure 1).

Figure 1. Vue d'ensemble des approches de sélection végétale pour le développement de variétés de riz avec un
rendement, une tolérance au stress et une qualité de grain améliorés. (A) Sélection conventionnelle pour l'amélioration
des cultures, par exemple l'amélioration de la qualité des grains de riz. (B) Approche de sélection par mutation pour
l'amélioration de la qualité du grain de riz. (C) Génie génétique pour incorporer le gène souhaité dans une variété de riz populaire.
(D) Application d'outils d'édition de gènes pour l'amélioration des plants de riz, par exemple en ciblant les gènes sensibles à la
qualité du grain de riz via les systèmes CRISPR/Cas. La flèche verte vers le haut indique une amélioration ou un
accroissement de la qualité du grain/du rendement/de la résistance aux maladies dans la plante. La flèche rouge vers le
bas indique que la plante est dépourvue de qualité, de rendement ou de résistance aux maladies. Q-gene, Quality gene
; Cas9, CRISPR-associated protein 9 ; Cas12a, CRISPR-associated protein 12a ; Cas12b, CRISPR-associated protein 12b ; Cas13a,
CRISPR-associated protein 13a ; Cas13b, CRISPR-associated protein 13b ; BE, Base Editors ; Trans/Recom, Transposases
ou Recombinases ; PE, Prime Editors.
Agronomie 2021, 11, 1359 3 de 43

Les techniques conventionnelles de sélection et de mutagenèse entraînent des

gènes indésirables en même temps que les gènes ciblés et prennent beaucoup de temps ;
par conséquent, elles ne répondent pas aux exigences (c'est-à-dire l'augmentation rapide de la
production et des paramètres de qualité pour faire face aux défis de la faim et de la
malnutrition dans le monde). En outre, l'hybridation est possible entre deux plantes de la
même espèce, ce qui limite l'introduction de nouveaux gènes et caractères. Les
puissantes technologies d'édition du génome (GET) s'attaquent à ces limites de la
sélection mutationnelle conventionnelle et sont capables de transférer un caractère désiré
dans n'importe quelle espèce végétale en peu de temps (Figure 1) et ont donc un grand
potentiel pour accélérer les programmes de sélection. Cependant, des informations
détaillées sur la séquence, la structure et la fonction des gènes, les nouveaux gènes et les loci
de caractères quantitatifs (QTL) responsables des caractères recherchés sont essentielles
pour l'application des GET [8]. Les GET modifient un gène spécifique du caractère
souhaité en coupant l'ADN par l'intermédiaire de nucléases spécifiques à la cible ; les
processus de sélection sont donc rapides. Les endonucléases spécifiques à un site (SSE),
c'est-à-dire les nucléases à doigt de zinc, les nucléases effectrices de type activateur de
transcription [9], ont été introduites au cours de la dernière décennie et sont largement
utilisées comme outils d'édition de gènes.
Les progrès récents en matière de GET impliquent le développement d'un système
CRISPR (clustered, regularly in- terspaced short palindromic repeats) et d'une protéine
associée à CRISPR (Cas). Il existe de multiples protéines Cas, telles que Cas8, Cas9,
Cas12a, ou Cpf1 (CRISPR de Pre- votella et Francisella1) ; des variantes incluant F. novicida
U112 (FnCpf1) et la bactérie Lachnospiraceae ND2006 LbCpf1) ; Cas12b, Cas13a, Cas13b,
des formes modifiées, c'est-à-dire, Cas9 catalytiquement morte ou déficiente en
endonucléases (dCas9), Cas9 nickase (nCas9) ; et les orthologues de Cas9, tels que
Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9), Streptococcus
thermophilus Cas9 (StCas9), Neisseria meningitides Ca9 (NmCas9), Campylobac- ter jejuni Cas9
(CjCas9), etc. [10,11]. Ils ont été utilisés pour l'édition du génome par le biais de la
technologie CRISPR afin d'améliorer de nombreux caractères chez les plantes. Parmi
ceux-ci, le système CRISPR/Cas9 est le plus adopté, le plus facile, le plus prometteur, le
plus fiable et le plus efficace pour améliorer le rendement, la résistance au stress, la
résistance aux herbicides et la qualité de l'utilisation finale dans plusieurs modèles et
plantes cultivées, comme Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Physcomitrella patens,
Camelina sativa, l'orge, le maïs/maïs, les agrumes, le concombre, le soja, le tabac, la tomate, le
blé et le riz [12]. Récemment, les systèmes CRISPR-Cas12a et CRISPR-Cas13, qui ciblent
respectivement l'ADN et l'ARN, ont été introduits pour surmonter les limites de Cas9, en
raison de leur fiabilité [13,14]. En outre, une nouvelle technique appelée édition de
base (BE), visant à améliorer les technologies d'édition en renforçant leur efficacité et
leur précision, a été introduite et appliquée à la biologie végétale [15-18]. En outre, les
recombinases et la découverte de la technologie d'édition primaire (PE) sont également
utilisées pour améliorer la compétence du système d'édition du génome [19-23]. La
figure 2 présente une comparaison détaillée des GET pré-CRISPR, des différents
orthologues de la protéine Cas, des technologies d'édition primaire et d'édition
primaire. Compte tenu de l'évolution rapide dans le domaine de l'édition du génome en
général et des technologies CRISPR en particulier, nous examinons les progrès réalisés
dans les systèmes d'édition CRISPR/Cas9, les protéines Cas modifiées, les systèmes d'édition
de la base et de l'amorce, au fil du temps, et leurs applications, afin d'améliorer le
rendement des grains de riz, la tolérance aux stress abiotiques, la résistance aux
maladies, la résistance aux herbicides et la qualité de l'utilisation finale. En raison de la
consommation directe de grains de riz par les êtres humains, l'éthique et les aspects
réglementaires des plantes de riz génétiquement modifiées par le biais des GET sont
discutés. Nous nous concentrons également sur les limites et les perspectives d'avenir
des GET pour améliorer le riz en fonction des caractéristiques susmentionnées.
Agronomie 2021, 11, 1359 4 de 43

Figure 2. Comparaison entre les différents composants de divers outils d'édition du génome. La figure présente les
modèles de différents systèmes d'édition du génome, tels que ZFN (zinc-finger nucleases), TALEN (transcription
activator-like effector nucleases), spCas9 (streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein 9), Cas12, Cas13, Base
editing, Transposases ou recombinases, et prime editing, leur évolution, leurs composants, la classe ou le type de
système d'édition, l'acide nucléique cible, la longueur de la séquence cible, le type de mutations, les réactifs et les
méthodes, ainsi que leurs avantages et inconvénients. PAM, protospacer adjacent motif ; sgRNA, single guide RNA ;
crRNA, CRISPR RNA ; Tns Proteins, Transposases proteins ; pegRNA, prime editing guide RNA ; RT, Reverse Transcription
; DNA, Deoxyribonucleic acid ; RNA, Ribonucleic acid ; RuvC, domaine endonucléasique nommé d'après une protéine
d'Escherichia coli impliquée dans la réparation de l'ADN ; HNH, domaine endonucléasique nommé d'après des résidus
caractéristiques d'histidine et d'asparagine ; HDR, réparation dirigée par homologie ; indel, insertion et/ou délétion ; CBEs, éditeurs
de bases de cytosine ; ABEs, éditeurs de bases d'adénine.

2. Amélioration des cultures de riz basée sur CRISPR/Cas9

Dans le système d'édition du génome CRISPR/Cas9, la nucléase Cas9 introduit des
cassures double brin (CDB) dans l'ADN au niveau du site cible de l'ARNg. Ces
cassures sont réparées par la voie de la jonction des extrémités non homologues
(NHEJ), ce qui entraîne des insertions ou des délétions (indels) au niveau du site
cible, supprimant ainsi le gène ciblé [12] (figure 2). Le système CRISPR/Cas9 est le GET le
plus répandu qui a été utilisé pour améliorer plusieurs caractéristiques agronomiques du riz,
telles que le rendement en grains, la tolérance au stress abiotique, la résistance aux maladies, la
résistance aux herbicides, en plus de la qualité des grains de riz (figure 3). La sélection
classique nécessite la sélection de progénitures
Agronomie 2021, 11, 1359 5 de 43

Il faut 6 à 7 ans pour obtenir le niveau d'homozygotie souhaité, alors que le système
CRISPR/Cas9 y parvient en moins d'un an, ce qui en fait un puissant outil de sélection végétale
[12]. Nous avons examiné ici les applications de CRISPR/Cas9 pour l'amélioration des
cultures de riz.

Figure 3. Cibles potentielles des systèmes CRISPR/Cas pour l'amélioration des cultures de riz. Le riz peut être amélioré
en ciblant tout régulateur négatif potentiel du rendement, de la qualité, de la tolérance aux stress biotiques et abiotiques et de la
physiologie de la plante. Des lignées mâles stériles (MS) peuvent être développées pour le développement d'hybrides en ciblant des
gènes potentiels tels que le gène 5 de la stérilité mâle thermosensible. HM, métaux lourds ; Fe, fer, Cd, cadmium ; Al,
aluminium ; Hg, mercure ; As, arsenic ; Mg, magnésium.

2.1. CRISPR/Cas9 pour améliorer le rendement en grains du riz

À ce jour, trois stratégies distinctes ont été utilisées pour améliorer le rendement
du riz en utilisant des systèmes basés sur CRISPR/Cas :

2.1.1. Améliorer l'architecture de l'usine

Au cours des années 1960, la manipulation des gènes de hauteur des plantes dans
le riz et le blé a permis de réduire considérablement la hauteur des plantes, ce qui a
entraîné une amélioration de la résistance à la verse et de la réactivité aux engrais qui a
conduit à une augmentation considérable du rendement en grains. Il s'agit de l'un des
événements les plus importants en matière d'amélioration des cultures, connu sous le
nom de "révolution verte" [24]. Par conséquent, la modification de l'architecture de la
plante de riz par l'identification de loci de caractères quantitatifs (QTL) et le transfert de
transgènes a été un objectif de sélection de premier ordre pendant des années [25-27].
Avec l'avantage supplémentaire d'être un système robuste et sans transgène,
CRISPR/Cas9 a été utilisé avec succès pour modifier l'architecture de la plante en
éditant/annulant les gènes/QTL codant pour la hauteur de la plante et le nombre de
talles, c'est-à-dire semi nain 1 (SD1) [28], STRONG CULM3/TEOSINTE BRANCH1/FINE
CULM1 (SCM3/OsTB1/FC1) [29], Gibberellin-20 oxidase-2 (OsGA20ox2) et SD1 [30].
Des mutations basées sur CRISPR/Cas9 dans deux cibles du premier codon
d'OsGA20ox2 ont réduit la longueur de la feuille étendard, le niveau de gibbérellines et la
hauteur de la plante (réduction de 22,2 %), et ont augmenté le rendement en grains de 6,0 %.
En outre, OsGA20ox2, la fructose-bisphosphate aldolase 1, la glycéraldéhyde- 3-phosphate
Agronomie 2021, 11, 1359 6 de 43

déshydrogénase, la S-adénosyl méthionine synthétase 1 et les protéines de l'ATP synthase

putative ont été régulées à la baisse chez les mutants semi-nains [30]. De même, les
mutants CRISPR SD1 présentent une résistance à la verse, une hauteur de plante semi-naine
et une augmentation de la teneur en grains.
Agronomie 2021, 11, 1359 7 de 43

Les mutants OsTB1/FC1 ont montré une augmentation du nombre de talles [29]. Dans
une autre étude, le ciblage par CRISPR/Cas9 du QTL Ideal Plant Architecture 1 (IPA1) a
entraîné une réduction de la hauteur des plantes et une augmentation du nombre de
talles, ce qui a permis d'accroître le rendement en grains [31]. De même, le ciblage du
poids du fruit du riz 4, OsFWL4 [32] par sgRNA/Cas9 a entraîné une augmentation de la
surface de la feuille étendard, de la longueur des grains, du nombre de talles et du
rendement en grains.

2.1.2. Amélioration de l'architecture de la panicule

Les caractères liés à la morphologie ou à l'architecture de la panicule, tels que la
longueur de la panicule, le poids de la panicule, la densité de la panicule, l'orientation de la
panicule (érigée ou tombante), le nombre de grains par panicule, le poids, la longueur et la
taille des grains sont les facteurs clés qui déterminent le rendement final en grains du
riz [25-27] et ont donc été une cible cruciale pour le riz à haut rendement. Plusieurs
gènes et/ou QTL pour les caractères d'architecture de la panicule ont été ciblés par le système
CRISPR/Cas9 pour améliorer le rendement en grains du riz (tableau 1). Par exemple,
l'édition multiplexée par sgRNA/Cas9 de trois régions d'architecture de la panicule, à
savoir DENSE AN D ERECT PANICLE (DEP1), Grain Size 3 (GS3), Grain number 1a (Gn1a),
et d'un QTL d'architecture végétale, Ideal Plant Architecture1 (IPA1) a permis d'améliorer
les caractéristiques de la panicule et de l'architecture de la plante. Les mutants avaient une
panicule érigée, une taille de grain et un nombre de grains améliorés, un nombre de
talles plus ou moins élevé et une hauteur de plante réduite, ce qui a permis d'améliorer
le rendement en grains [31]. De même, l'édition des gènes d'architecture de la panicule,
les gènes PIN family of auxin efflux carrier-like gene 5b (OsPIN5b) par le système sgRNA/Cas9 a
augmenté la longueur de la panicule chez les mutants par rapport aux plantes de type
sauvage, augmentant ainsi le rendement en grains du riz [33], tandis que l'édition multiplexée
par CRISPR des gènes Gn1a, DEP1 et GS3 a augmenté le nombre de grains par panicule,
l'architecture de la panicule, l'orientation de la panicule, la taille des grains et le rendement
en grains [34,35]. En outre, le ciblage par CRISPR de la largeur/du poids des grains 2, 5, 6 et 8
(GW2, GW5, GW6 et GW8) et de GS3 [36-39] a entraîné une amélioration de la largeur, du
poids, de la taille et du rendement des grains.

Tableau 1. Principaux exemples d'application du système CRISPR/Cas9 pour l'amélioration du rendement en grains du riz
et des caractéristiques connexes.

Trait ciblé Gène/s ciblé/s Promoteur Cas9/S Promoteur sgRNA/S Caractère(s) amélioré(s) chez les mutants
Ref.

gRNA1SD1 Rendement en grains,

SD1 2 × 35S pro architecture des plantes, plantes [28]
gRNA3
SE5 semi-naines, résistance à la
verse
Rendement en grains,
architecture de la plante,
OsGA20ox2 Pubi-H OsU6a OsU6b plantes semi-naines, [30]
réduction des gibbérellines et
de la longueur des feuilles en
drapeau
SCM1/SD1, gRNA1, gRNA2, Architecture de la plante, nombre de
2 × 35S pro
Architecture SCM3/OsTB1/FC1, gRNA3, gRNA4, talles, architecture des panicules, [29]
CaMV
de l'usine SCM2/APO1 gRNA5, gRNA6 panicules plus grandes, surface de la
section transversale de la tige
Rendement en grain, architecture de
OsFWL4 Maïs Ubi1 OsU6 la plante, nombre de talles, surface de la [32]
feuille étendard, grain
longueur, nombre de cellules dans la
feuille du drapeau
Rendement en grains, architecture
IPA1 Maïs Ubi1 U6a de la plante, nombre de talles, [31]
réduction de la plante
hauteur
Rendement en grains, architecture de
la plante, panicule
IPA1, GS3, DEP1, architecture, nombre de talles, taille érigé
Maïs Ubi1 U6a es,
Gn1a des grains, panicules denses et
Agronomie 2021, 11, 1359 de grains
nombre 8 de 43
[31]
OsU6 Rendement en grains, taille des
GS3, OsGW2, Gn1a p35S [37]
Architectur grains, poids des grains, nombre
e de la de grains par panicule
panicule 2 × 35S pro Rendement en grains, architecture de
OsPIN5b, GS3 OsU6a [33]
Pubi-H la panicule, longueur de la
panicule, taille des grains
GW2, 5 et 6 pUBQ OsU3, OsU6 TaU3 Rendement en grains, poids des [36]
2 × 35S grains
OsSPL16/qGW8 OsU6a Rendement en grains, poids des grains, taille des
Pubi
pro grains [38]
Agronomie 2021, 11, 1359 9 de 43

Tableau 1. Cont.

Trait ciblé Gène(s) ciblé(s) Promoteur Promoteur de Trait(s) amélioré(s) chez les Réf.
Cas9/S l'ARNg/S mutants
Rendement en grains, architecture
Gn1a, GS3 2 × 35S pro U3 de la panicule, nombre de grains par [35]
panicule, grains
taille
Rendement en grains, architecture de
Gn1a, DEP1 2 × 35S pro OsU3 la panicule, orientation de la panicule, [34]
nombre de grains
par panicule
U6a
Cytochrome P450, U6b Rendement en grains, taille des
Pubi-H [39]
OsBADH2 U6c grains, arôme
U3m (teneur en 2-acétyl-1-pyrroline
(2AP))
OsU6
PYL1, PYL4, PYL6 Maïs Ubi1 Nombre de grains, rendement en grains [41]
Signalisation OsU3
ABA
Voie OsU6a Rendement céréalier dans des
OsPYL9 PubiH [40]
d'accès OsU6b conditions normales et
limitées de disponibilité de
l'eau

2.1.3. Améliorer la voie de signalisation ABA

L'acide abscissique (ABA) est une hormone végétale importante qui joue un rôle
important dans la germination, la réponse au stress, la croissance et le développement
des plantes, et la modification de la voie de signalisation de l'ABA est donc une cible
importante pour la sélection [4]. En effet, le ciblage par le système CRISPR/Cas9 du gène
récepteur de l'ABA Pyrabactin Resistance 9 (OsPYL9) [40] a augmenté le rendement en grains
et l'édition de trois gènes, PYL1, PYL4 et PYL6 [41], a augmenté le nombre de grains de
31 %, conduisant à un rendement plus élevé chez les mutants que chez les plantes de
type sauvage. Cette nouvelle approche met donc en évidence le potentiel de la
manipulation de la signalisation pour augmenter le rendement des céréales et assurer
la sécurité alimentaire.

2.2. CRISPR/Cas9 pour un riz tolérant au stress abiotique

L'augmentation constante de la température mondiale provoque un réchauffement de
la planète, ou changement climatique, entraînant des périodes de sécheresse plus
fréquentes et la salinisation des sols [4], menaçant ainsi la production agricole. Le riz est
confronté à plusieurs stress abiotiques au cours de son cycle de vie et la sécheresse est la
menace la plus importante pour la production de riz. En effet, 3 000 litres d'eau sont
nécessaires pour produire 1 kg de grains de riz, mais son système racinaire peu profond et
sa cuticule fine en font l'une des plantes les plus sensibles à la sécheresse, qui pourrait
entraîner une perte de rendement de 100 % [5]. De même, pour les plants de riz cultivés sur
les hauts plateaux de Chine, du Japon, de Corée, etc., les températures froides pendant la
reproduction ont un effet négatif sur le rendement et la qualité des grains de riz [1]. En
outre, le riz est plus sensible au stress salin que d'autres céréales, comme le blé [42] ; la
production de riz pourrait donc être réduite de 50 % dans le monde entier [6]. La situation
se complique car la tolérance à la sécheresse et à la salinité sont des caractéristiques
complexes qui sont conférées par plusieurs gènes, protéines, protéines de transport,
facteurs de transcription (TF), transporteurs d'ions, microARN (miARN), hormones,
métabolites et ions [4,43]. Par conséquent, la sélection classique n'a qu'un succès et un
pouvoir limités pour accumuler ces gènes dans les cultivars et développer des plantes
tolérantes au stress abiotique. En tant qu'outil puissant pouvant cibler n'importe quel gène
dans n'importe quel organisme, le système CRISRP/Cas9 a été utilisé avec succès pour
améliorer la tolérance au stress abiotique chez le maïs, le riz, la tomate, le blé, Arabidopsis
thaliana et Physcomitrella patens [12,44]. En effet, plusieurs groupes ont démontré avec succès
la puissance du système CRISPR/Cas9 pour le développement d'un riz résistant au climat
(tolérant à la sécheresse, à la salinité, au froid et au stress osmotique) (tableau 2). Leurs
Agronomie 2021, 11, 1359 résultats et les approches basées sur CRISPR sont décrits ci-dessous. 10 de
43
2.2.1. Cibler la voie de signalisation ABA
L'ABA est la première ligne de défense contre le stress de la sécheresse et sa
production est l'une des premières réponses au stress de la sécheresse chez les plantes. Par
la suite, les plantes répondent au stress de la sécheresse par des cascades de signalisation
dépendantes ou indépendantes de l'ABA [4]. L'élimination par CRISPR/Cas9 de la protéine
kinase 2 activée par le stress osmotique et l'ABA (OsSAPK2) a révélé que l'OsSAPK2 jouait un
rôle dans la dormance des graines, la sécheresse, la salinité et la tolérance au stress
osmotique induites par l'ABA.
Agronomie 2021, 11, 1359 11 de
43

au riz par la signalisation ABA, le piégeage des espèces réactives de l'oxygène (ROS), la
fermeture des stomates par l'accumulation de solutés compatibles, et la régulation à la hausse
des gènes liés au stress (OsLEA3, OsbZIP23, OsRab16b, OsRab21, OsOREB1, et les canaux
anioniques lents, OsSLAC1 et OsSLAC7). Les plantes mutantes étaient plus sensibles aux
stress, mais cela a révélé le rôle critique d'OsSAPK2 dans la cascade de signalisation de
l'ABA [45]. De même, le système CRISPR/Cas9 a été utilisé pour cibler le gène récepteur
de l'ABA, OsPYL9 [40], et les plants de riz mutants présentaient une meilleure tolérance à
la sécheresse en raison d'une réduction du nombre de stomates, de la conductance stomatique,
du taux de transpiration et de la teneur en malondialdéhyde (MDA), ainsi qu'une
augmentation de la cire cuticulaire, du nombre de panicules, de la teneur en acide
abscissique (ABA), de la catalase (CAT), de la superoxyde dismutase (SOD) et du taux de
survie, par rapport aux plants de type sauvage. La tolérance à la sécheresse chez le riz a
également été améliorée par le ciblage de l'Enhanced Response to ABA1 (ERA1) par
sgRNA/Cas9 [46] en régulant la conductance stomatique.

2.2.2. Amélioration de la morphologie des feuilles

Les feuilles contrôlent l'évapotranspiration, un paramètre important pour la tolérance à la
sécheresse. C'est pourquoi la modification de la morphologie des feuilles est une stratégie
clé pour améliorer le rendement en grains et la tolérance à la sécheresse chez les
plantes. L'édition multiplexée CRISPR/Cas9 de SEMI-ROLLED LEAF 1 et 2 (OsSRL1 et
OsSRL2) [47] a conféré au riz une tolérance à la sécheresse. Les mutants présentaient
des feuilles enroulées, un nombre réduit de stomates, une conductance stomatique, un
taux de transpiration et une teneur en malondialdéhyde (MDA), par rapport aux plantes
de type sauvage. En outre, les mutants avaient un nombre de panicules, une teneur en
acide abscissique (ABA), une catalase (CAT), une superoxyde dismutase (SOD) et un taux
de survie plus élevés.

2.2.3. Cibler les microARN et les facteurs de transcription

Les miARN et les TF sont les principaux régulateurs des gènes liés au stress et
régulent à la hausse ou à la baisse les gènes clés impliqués dans les mécanismes de
tolérance au stress abiotique [4,48]. Par conséquent, l'élimination des TFs qui régulent
négativement les gènes liés à la tolérance est une stratégie fiable pour augmenter la
tolérance au stress abiotique chez le riz. En effet, l'élimination par CRISPR/Cas9 du
facteur de transcription MYB de type R2R3, OsMYB30 [32] a augmenté le rendement en
grains et la tolérance au froid chez les mutants par rapport aux plants de riz de type
sauvage. De même, l'inactivation par CRISPR/Cas9 d'un TF à doigt de zinc, la tolérance à
la sécheresse et au sel (DST) [49], et d'un miRNA, OsmiR535 [50], dans deux études
indépendantes, a amélioré la tolérance à la sécheresse, à la salinité et au stress
osmotique chez les mutants par rapport aux plantes de type sauvage. La tolérance au
stress abiotique chez les mutants a été conférée par l'amélioration de la conductance
stomatique, l'augmentation de la rétention d'eau dans les feuilles, l'architecture des feuilles,
des racines et des pousses [49,50], comme le montre le tableau 2. En outre, le knock-out basé
sur le système sgRNA/Cas9 du régulateur de réponse de type acide aminé B, OsRR22
[51] a conféré une tolérance à la salinité chez les mutants en améliorant l'architecture
des pousses ; soulignant ainsi l'utilité du ciblage des TF pour améliorer la tolérance au
stress abiotique chez le riz.

Tableau 2. Exemples de systèmes CRISPR/Cas9 pour améliorer la tolérance du riz au stress abiotique.

Stress Gène/S édité Promoteur Promoteur de Amélioration des caractéristiques des Réf.
Cas9/S l'ARNg/S mutants
Réduction de la tolérance à la sécheresse, à la
OsSAPK2 Pubi-H U3 salinité et au stress osmotique ; rôle du gène [45]
dans le piégeage des ROS,
conductance stomatique et signalisation
ABA
Tolérance à la sécheresse ; rendement en
grains, antioxydant
Sécheres OsU6a activités, teneur en chlorophylle, stomatiqu
OsPYL9 PubiH
se accumulation d'ABA, cire cuticulaire des e, taux de
feuilles, taux de survie, conductance transpirati
 OsU6b
Agronomie
on 2021, 11, 1359 12 de
[40]
43
Tolérance à la sécheresse, conductance
OsERA1 Non défini pCAMBIA1300 [46]
une sensibilité accrue à l'ABA.
stomatique,
Agronomie 2021, 11, 1359 13 de
43

Tableau 2. Cont.

Stress Gène/S édité Promoteur Cas9/S Promoteur sgRNA/S Caractères améliorés chez les mutants Ref.
Amélioration de la tolérance à la sécheresse ; Réduction du nombre
d'animaux
U6a de stomates, conductance stomatique, taux de
OsSRL1, U6b transpiration et teneur en malondialdéhyde
Pubi-H [47]
OsSRL2 U6c (MDA) ; amélioration du nombre de panicules,
U3m de la teneur en acide abscissique (ABA), de la
catalase (CAT), de la superoxyde dismutase
(SOD) et du taux de survie.
Tolérance à la sécheresse, architecture des
DST OsUBQ OsU3 [49]
feuilles, densité stomatique réduite, meilleure
rétention de l'eau dans les feuilles
Tolérance à la sécheresse, insensibilité à l'ABA,
UBI OsU3
OsmiR535 nombre de racines latérales (73% de plus), [50]
35S pro OsU6
longueur des pousses (30% de plus), longueur
des racines primaires
Tolérance réduite à la salinité et au stress
OsSAPK2 Pubi-H U3 [45]
osmotique, rôle du gène dans le
piégeage des ROS
OsRR22 OsU6a
2 × 35S pro Tolérance à la salinité, longueur des pousses,
[51]
Salinité Pubi-H poids frais et sec des pousses
et stress
DST OsUBQ OsU3 Tolérance à la salinité, tolérance osmotique [49]
osmotiq
ue Tolérance à la salinité, tolérance osmotique, pousse
UBI OsU3 longueur (86,8 %), nombre de racines latérales
OsmiR535 [50]
35S pro OsU6 (514 % par rapport à la lignée surexprimant
MIR535), longueur de la racine primaire
(35,8 %)
UBI
35S pro
OsAnn3 U3 Réponse à la tolérance au froid [52]
Stress dû au
froid
Pubi-H
2× 35S pro
OsMYB30 OsU6a Tolérance au froid [33]

2.3. CRISPR/Cas9 pour améliorer la résistance du riz aux maladies

Le mildiou de la pomme de terre en Irlande (également connu sous le nom de
Grande Famine ou de Famine irlandaise de la pomme de terre) entre 1845 et 1853, la
Grande Famine du Bengale en 1943 et le mildiou de la feuille de maïs aux États-Unis
entre 1969 et 1970 sont des exemples de mauvaises récoltes dues à des maladies végétales.
Certains de ces événements ont entraîné la mort et la migration de millions de personnes [24].
Plus de 800 millions de personnes sont sous-alimentées dans le monde à cause des maladies
des plantes [24], ce qui constitue une menace pour la sécurité alimentaire. Parmi les
diverses maladies auxquelles le riz est confronté, la brûlure bactérienne des feuilles (BLB),
causée par une bactérie Xanthomonas oryzae pv. Oryza, est l'une des maladies les plus
dévastatrices qui peut réduire le rendement en grains de 70 %
(http://www.knowledgebank.irri.org, consulté le 29 juin 2021). De même, le
champignon Magna- porthe oryzae provoque la pyriculariose du riz qui peut entraîner
une perte de rendement de 30 à 100 % [53]. Par conséquent, la gestion des maladies du
riz est cruciale pour nourrir la population croissante.
L'amélioration de la résistance des plantes aux maladies par le biais d'approches de
sélection classiques, telles que le croisement en amont, la sélection multiligne et
l'empilement de gènes de résistance (R), est un processus long et fastidieux qui prend
des années [54,55]. En revanche, le ciblage de différents facteurs et gènes de
susceptibilité (S) par le système CRISPR/Cas9 a permis d'accélérer le développement
d'une résistance à la maladie à large spectre en l'espace d'un an [12,56-60]. Sans aucun doute, la
technologie CRISPR/Cas9 a été utilisée pour développer une résistance à large spectre
contre plusieurs bactéries, champignons et virus (tableau 3). Chez le riz, deux approches
distinctes CRISPR/Cas9 ont été utilisées pour améliorer la résistance aux maladies.

2.3.1. Perturbation des gènes par ciblage de la séquence codante

Cette stratégie implique la perturbation de la séquence codante des gènes S et
CRISPR/Cas9 est utilisé pour créer des indels dans un ou plusieurs nucléotides d'exon(s) afin
d'éliminer un gène particulier. L'application la plus courante du système CRISPR/Cas9 pour
Agronomie 2021, 11, 1359 14 de
la résistance aux maladies consiste à éliminer les gènes S en ciblant la séquence codante
43
(CDS), par exemple, Le knock-out de gènes en ciblant la CDS ou les exons du facteur de
réponse à l'éthylène, OsERF922 [61], des gènes codant pour la polykétide synthase, OsRSY1 et
OsALB1 [62], et de PYRICULARIA ORYZAE RESISTANCE 21 (Pi21) [63,64] a amélioré la
résistance à la pyriculariose du riz, M. oryzae. De même, le ciblage par CRISPR des CDS ou des
exons du gène SWEET (Sugar Will Eventually be Exported Transporters) a permis
d'améliorer la résistance à la pyriculariose du riz, M. oryzae.
Agronomie 2021, 11, 1359 15 de
43

OsSWEET11 (également appelé Os8N3) [65] et OsSWEET14 [58] ont augmenté la résistance
à la brûlure bactérienne des feuilles (BLB) causée par X oryzae pv. Oryzae (XOO). En outre, le
ciblage de eIF4G [66], un gène S de l'hôte, a amélioré la résistance à la maladie du tungro du
riz (RTD) causée par le virus sphérique du tungro du riz (RTSV). La résistance à la maladie a
été observée en termes de diminution des symptômes de la maladie, d'amélioration du
rendement et des performances agronomiques.

Tableau 3. Exemples de systèmes CRISPR/Cas9 pour améliorer la résistance aux maladies du riz.

Amélioration de
Pathogèn la résistance aux Gène ciblé/S Promoteur Cas9/S Promoteur de l'ARNg/S Ref.
e maladies et aux
agents pathogènes

OsERF922 2 × 35S
OsU6a [61]
Pubi-H
pro

Fièvre du riz SNR52, U6-1,

Champignons OsALB1, OsRSY1, TrpC, TEF1 [62]
(Magnaporthe oryzae) U6-2
OsPi21 PubiH OsU6a, OsU3 [63]
OsPi21 PubiH OsU6a, OsU6b [64]
OsSWEET14,
CaMV35S U6 [67]
OsSWEET11
OsSWEET11
35S-p OsU6a [65]
ou
Os8N3
OsXa13/SWEET11 PubiH OsU6a, OsU3 [63]
Brûlure bactérienne OsSWEET11,
des feuilles
Bactérie (Xanthomonas oryzae OsSWEET13, ZmUbiP U6 [56]
s pv. Oryzae) OsSWEET14
OsSWEET11,
35S CaMV SW11, SW14 [57]
OsSWEET14
OsSWEET14 Pubi ou P35S OsU3, OsU6b, OsU6c [58]
OsSWEET14 35S, Ubi OsU3 [59]
OsXa13/ SWEET11 35S, Ubi U3, U6a [68]
Virus du tungro ZmUBI1,
Virus eIF4G TaU6 [66]
sphérique du riz CaMV35S
(RTSV)

2.3.2. Perturbation du gène par la séquence promotrice

L'édition basée sur CRISPR/Cas9 des séquences promotrices des gènes S permet de
bloquer l'expression des gènes. L'approche consiste à éditer le site de liaison de l'effecteur,
ce qui empêche le site de liaison du pathogène de se lier à la séquence du promoteur,
conférant ainsi une résistance à la maladie. L'une des premières applications du système
CRISPR/Cas9 chez les plantes en 2013 a été l'édition de la région promotrice des gènes
transporteurs de sucre OsSWEET11 et OsSWEET14 [67]. Par la suite, le ciblage par CRISPR
de la région promotrice des gènes OsSWEET14 [59], WEET11/Xa13 [63,68] et l'édition
multiplex des gènes OsSWEET11, OsSWEET13 et OsSWEET14 [56,57] ont amélioré la
tolérance à la BLB chez le riz en évitant le contact de Xoo avec les gènes S.

2.4. CRISPR/Cas9 pour un riz résistant aux herbicides

Plusieurs herbicides, tels que le "Basta" et le glyphosate N-(phosphonométhyl)
glycine, sont utilisés pour tuer les mauvaises herbes dans plus de 130 pays [69]. Il est
important que les herbicides ne tuent que les mauvaises herbes et non les plantes
cultivées. Traditionnellement, la technologie de recombinaison de l'ADN ou une approche
transgénique a été largement utilisée pour améliorer la résistance aux herbicides du
maïs, du coton et du soja [69,70]. En raison des contrôles rigoureux de biosécurité pour
les organismes génétiquement modifiés (OGM) ou les plantes transgéniques, la résistance
aux herbicides médiée par CRISPR/Cas9 est devenue plus populaire ces dernières années
[18,48,71,72]. Par exemple, l'élimination du gène de l'acétolactate synthase (OsALS) [73]
Agronomie 2021, 11, 1359 par CRISPR/Cas9 a conféré une résistance à l'imazapic (IMP) et à l'imazethapyr (IMT)16chez
de
43
des plants de riz mutants. De même, l'inactivation du gène OsALS [72] et l'édition
multiplexée des gènes OsALS et FTIP1e [18] ont conduit à une résistance accrue à l'imazapic
(IMP) et à l'imazethapyr (IMT) chez les plantes de riz mutantes.
Agronomie 2021, 11, 1359 17 de
43

les pesticides bispyribac sodium et imazamox, respectivement. En outre, un nouveau knock-

in/replacement du gène de la 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (OsEPSPS)
médié par CRISPR/Cas9 [71] a augmenté la résistance au glyphosate chez le riz.

2.5. CRISPR/Cas9 pour améliorer les paramètres de qualité du riz

La qualité du grain de riz dépend des caractéristiques susceptibles de répondre aux
demandes et aux préférences des consommateurs. Les paramètres de qualité du grain de
riz comprennent l'aspect physique, la qualité d'usinage, la cuisson, la consommation et
certaines qualités nutritionnelles [2]. L'application du système CRISPR/Cas9 à
l'amélioration de la qualité du grain de riz a accéléré la sélection du riz avec des
caractéristiques souhaitables (figure 4).

Figure 4. Stratégie générale et méthode progressive de développement d'une nouvelle variété de riz sans transgène avec des
caractéristiques souhaitables améliorées à l'aide d'outils d'édition du génome. Le processus commence par la recherche
dans les bases de données du génome du riz et l'exploration des gènes. Après avoir sélectionné le gène cible, on choisit le
site cible avec la séquence PAM (NGG). Ensuite, la séquence de liaison (présentée en couleur verte) est ajoutée sur les 5′ du site
cible. Ensuite, les vecteurs (Cas9 et sgRNA) sont construits et clonés dans un nouveau vecteur qui porte le promoteur du
virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV 35S) et le squelette du vecteur. Ensuite, la construction CRISPR/Cas9 portant la
séquence cible est transformée en riz par un canon à gènes ou par la méthode de transformation médiée par l'agrobacterium. Les
plantules positives sont criblées et phénotypées. La détection des plantes dépourvues de transgène se fait par le test
HPT (Hygromycine), le test Cas9 ou le test sgRNA. Par la suite, seules les plantes exemptes de transgènes feront l'objet
d'essais en plein champ et seront commercialisées.

2.5.1. Traits de qualité de la cuisine et de l'alimentation

Les caractéristiques de qualité alimentaire et de cuisson (ECQ) sont en tête de liste
en raison des choix des consommateurs et de la valeur économique du riz [7]. L'endosperme
du grain de riz est constitué d'amidon, c'est pourquoi la qualité du grain dépend des propriétés
physicochimiques de l'endosperme du riz, notamment la teneur en amylose (AC), la consistance
du gel et la gélatinisation (GT). Les techniques d'édition du génome ont été utilisées pour mener
plusieurs études réussies ciblant les caractéristiques de la qualité du grain de riz [74]. Dans
l'endosperme, l'AC et la GT sont régulées par le gène waxy ou Wx, la protéine de résistance aux
maladies RPM1 (RSR1) et l'amidon soluble synthase IIa (ALK/SSIIa), respectivement [75].
L'expression du gène Wx est contrôlée par une protéine FLOURY ENDOSPERM2
contenant un domaine tetratricopeptide, la protéine FLO2, et d'autres TF comme RSR1,
la granule bound starch synthase (GBSS1), un facteur de transcription MYC (OsBP-5), l'hélice-
boucle-hélice de base (OsbHLH071), la protéine répondant à l'éthylène (OsEBP-89), la glissière
Agronomie 2021, 11, 1359 18 de
43
de leucine de base58 (OsbZIP58) et le facteur de transcription MADS-box 57, OsMADS7
[76]. CRISPR/Cas9 a été utilisé pour introduire une mutation de perte de fonction dans
la protéine
Agronomie 2021, 11, 1359 19 de
43

le gène Wx pour la réduction de l'AC dans les cultivars japonica largement cultivés,
Xiushui134 et Wuyunjing7 [77]. De telles mutations conduisent au développement de
cultivars élites présentant les caractéristiques souhaitées sans perturber les autres
caractéristiques. Récemment, six nouveaux allèles Wx ont été générés en ciblant le
promoteur Wxb pour réduire l'AC dans le grain de riz. Ces allèles fournissent une
gamme d'AC qui peut être utilisée pour améliorer la qualité du riz dans le monde entier
en fonction des conditions environnementales locales et de la demande des
consommateurs [78]. De même, l'ECQ du grain de riz a été amélioré en ciblant les
transporteurs d'acides aminés putatifs 6 et 10 (OsAAP6 et OsAAP10) par le biais d'une
mutation CRISPR/Cas9. Les mutants développés en supprimant les gènes sont
dépourvus de transgène et présentent une teneur réduite en protéines du grain (GPC),
en AC et en glutéline, mais une amélioration de la QCE et de la teneur en amidon dans la
génération T1, mesurée par l'analyse rapide de la viscosité [79]. La synthèse de l'amidon est
régulée par de nombreux gènes/enzymes, ce qui rend difficile la modification de la
teneur en amidon par la sélection conventionnelle. La modification génétique des enzymes de
ramification de l'amidon 1 et 2, SBEI et SBEII, a entraîné une augmentation de l'AC et de
l'amidon résistant [80], ce qui présente des avantages pour la santé. De même, le gène
muté de l'aldéhyde déshydrogénase 2 de la bétaïne, basé sur CRISPR/Cas9. Badh2 (ajout d'une
base T dans le premier exon du gène Badh2, responsable du parfum) dans Zhonghua 11,
a amélioré le parfum du riz, une caractéristique culinaire souhaitable [81]. Dans une
autre étude, l'enzyme de débranchement de type isoamylase (ISA), responsable de la synthèse
de l'amylopectine, a été mutée via CRISPR/Cas9, créant des mutants déficients en ISA-1
(isa1), afin d'améliorer la qualité des grains grâce à un changement dans l'expression des
gènes associés à la synthèse de l'amidon, au sucre soluble total et au poids des grains [82].
Plus de détails sur les fonctions des gènes, le contexte des cultivars, Cas9,
et les promoteurs sgRNA pour l'amélioration de la qualité des grains de riz sont
présentés dans le tableau 4.

2.5.2. Aspect physique et qualité de broyage

L'apparence et la couleur des grains de riz sont des caractéristiques qualitatives
importantes qui déterminent l'acceptabilité du riz sur le marché [2]. De nombreux
gènes, dont la taille et la forme des grains affectent le rendement et la qualité, ont été
découverts et pourraient être améliorés par la technologie CRISPR (tableaux 1 et 4). Le
caractère crayeux est un attribut indésirable lié à la grande taille des grains, qui se
traduit par un rendement élevé mais une qualité médiocre, car il affecte négativement
l'apparence des grains et la mouture [83]. Le gène GS9 (gène de la forme du grain sur le
chromosome 9) a été modifié par CRISPR/Cas9 sous la forme de l'allèle gs9 chez Nipponbare,
ce qui a permis d'améliorer la forme et la qualité de l'apparence du grain, tandis que le
caractère crayeux a été réduit de manière significative [84].
La longueur et la taille des grains sont des paramètres importants de la qualité de
l'apparence et de nombreux consommateurs de riz préfèrent les grains plus longs. L'édition
de GS3 (GRAIN SIZE 3) par CRISPR/Cas9 a été utilisée pour augmenter la taille et la longueur
des grains [31,33]. Récemment, la mutagenèse médiée par CRISPR/Cas9 de trois gènes du
cytochrome P450 (Os03g0603100, Os03g0568400 et GL3.2) et du gène OsBADH2 a permis
d'augmenter la taille et le parfum des grains [39]. Dans une autre étude, l'édition du gène
OsFWL4 basée sur CRSISPR a augmenté de manière significative la longueur des grains de riz
[32], améliorant ainsi l'acceptabilité par le consommateur.

2.5.3. Traits de qualité nutritionnelle

Le fer (Fe), le zinc (Zn), l'iode, la vitamine A, le folate ou la vitamine B9 , les protéines,
les graisses et les acides aminés sont essentiels à la santé humaine, et leur carence pourrait
augmenter le risque de dépression, d'obésité, d'anémie, de diabète de type II, de
complications liées à la grossesse, de cancers et de maladies cardiovasculaires [2]. Les
mutations basées sur le labourage dans le gène de l'ADN déméthylase, OsROS1 ou TA2,
ont entraîné une augmentation des antioxydants, des lipides, des composés phénoliques,
des protéines, des fibres alimentaires, des vitamines (A, B1, B2, B3, B6 et E) et des minéraux
(calcium, Fe et Zn) dans les grains de riz [85]. Cependant, de grandes populations sont
nécessaires pour les cribles de mutants TILLING en raison de la faible efficacité de l'édition.
Agronomie 2021, 11, 1359 20 de
43
C'est pourquoi le système CRSIPR/Cas9 à haute efficacité a été utilisé à cette fin. Par
exemple, le knock-out du gène Manganèse/transporteur de métaux 5 (OsNramp5) basé sur
CRSIRP/Cas9 a permis de réduire de plus de six fois l'accumulation du métal toxique, le
cadmium (Cd), dans le grain de riz [86], alors que l'accumulation de cuivre a augmenté et
que la concentration de Zn est restée inchangée, par rapport aux plantes de type sauvage.
De même, l'édition d'OsNramp5 basée sur CRSIRP a produit des résultats similaires [87],
comme le montre le tableau 4. En outre, l'inactivation par CRISPR-Cas9 de l'inositol 1,3,4-
trisphosphate 1/6-kinase (OsITPK1-6) a conduit à une faible accumulation d'acide phytique
[87].
Agronomie 2021, 11, 1359 21 de
43

dans le grain de riz et, en fin de compte, a augmenté la disponibilité du phosphore

inorganique [88]. En outre, l'élimination du gène Orange (OsOr) du riz par CRISPR [89] et
l'insertion des gènes Calreticulin 1 (SSU-crtI) et Phytoene synthase (ZmPsy) [90] ont entraîné
une augmentation de la teneur en phosphore dans le grain de riz et, en fin de compte, une
augmentation de la disponibilité du phosphore organique [88].
β-carotène ou provitamine A dans le riz qui doit être une alternative utile au riz brun.

Tableau 4. Principales applications du système CRISPR/Cas9 pour l'amélioration de la qualité des grains de riz.

Cultivar ARNg
Traits de qualité Gène ciblé Fonction du gène Promoteur Cas9 Résultats Réf.
Contexte Promote
ur
Yanggeng-158 Transporteur
OsAAP6 Amélioration de la qualité
Nangeng-9108 d'acides CaMV35S OsU3
OsAAP10 de l'alimentation et de la
Wuyungeng-30 aminés pour [79]
cuisine
GPC
Zhonghua11, GBSS (synthèse Diminution de la
[78]
XS134 de teneur en amylose (riz
OsWaxy CaMV35S OsU6
l'amylose) glutineux)
CaMV35S OsU6
GBSS (amylose Diminution de la
XS134 (Japonica) OsWaxy [77]
synthèse) teneur en amylose (riz
glutineux)
Kitaake (Japon) OsBEIet Enzyme de
pCXUN OsU3 Teneur élevée en [80]
OsBEIIb ramification de
l'amidon amylose
Amidon
(isoamylase- Amylose réduite
Manger et Zhonghua11 ISA1 type) CaMV 35S OsU6 et l'augmentation de la [82]
cuisiner teneur totale en
qualité débranchement sucre soluble
enzymes
Aldéhyde de
bétaïne
Indica BADH2 déshydrogénase OsUbi OsU6a Parfum renforcé [81]
(riz parfumé)
Taille des grains,
Zhonghua 11 Forme élancée du
GS9, DEP1 [84]
(Japonica) grain, moins de
Architect
craie
ure de la OsUbi OsU6a
panicule
Cyt P450
Rendement en OsU6a, OsU6b, Augmentation de la
homéologues, B Pubi [39]
grains et parfum OsU6c, OsU3m taille des grains
IR-96 et du parfum
OsBADH2
Indica (VP4892) OsSPL16/GW8 Taille des grains pUbi OsU6aOsU6b Augmentation de la [38]
taille des grains
taille-3/grain
(Japonica) Grain
Zhonghua-11 OsUbi OsU6a Augmentation de la [31]
GS3/Gn la,
qualité de 2 × 35S longueur des grains
Japonaise GS3 Taille des grains 3 OsU6a Augmentation de la taille des grains
l'apparenc
Physique et nombre la Pubi-H
[33]
e
Nipponbare GW2/GW5/ OsU3, OsU6, Augmentation de la
Poids des grains OsUbi [36]
(Japonica) TGW6 TaU3 longueur et de la
largeur des grains
Japonaise OsFWL Longueur du Maïs Ubi1 OsU6 Augmentation de la [32]
grain longueur des grains
Indica OsNramp5 Accumulation de ZmUBI OsU6a Faible teneur en [87]
Cd cadmium des grains
Indica
(Huazhan et OsNramp5 Accumulation de Pubi-H OsU6a Faible teneur en [86]
Cd cadmium des grains
Nutritionnel Longke 638S)
Qualité β-carotène Augmentation de la
Protoplaste de riz OsOr teneur en β-carotène [89]
synthèse 2 × 35S OsU6-2 (provitamine A)
β-carotène
Kitaake SSU-crtI, ZmPsy
Augmentation de la [90]
teneur en β-carotène
synthèse (provitamine A)

3. L'édition primaire et les variantes Cas pour l'amélioration de la culture du riz

Le PE est un système récemment mis au point qui utilise des protéines Cas9
modifiées et un ARN guide PE (pegRNA) qui garantit que la coupure est effectuée dans
un seul brin au lieu des deux brins d'ADN dans un système CRSIRP/Cas9 traditionnel, et
améliore la précision de l'édition du génome (figure 2). Chez le riz, 179 sites hors cible
prédits ont été ciblés par la PE, c'est-à-dire 12 pegRNA et une variante de Cas9, nCas9
(H840A), mais les modifications hors cible (indels) avaient des fréquences assez faibles
Agronomie 2021, 11, 1359 de 0,00~0,23 % [91]. Cela explique la puissance du système PE pour l'édition précise,22 de
43
ciblée et exacte du génome. Le système PE peut produire 12 types de mutations
ponctuelles, y compris les six conversions de paires de bases possibles, les substitutions
de bases, les insertions et les suppressions dans le protoplaste de riz [19], ce qui en fait
un puissant système d'amélioration des cultures.
Des recherches récentes sur l'application du PE dans le riz ont été menées en
construisant les éditeurs principaux Sp-PE2 et Sp-PE3 à l'aide de la variante de Cas9,
SpCas9. Une cassette d'expression comprenant le pegRNA, le promoteur ZmUbi, OsU6
et une EGFP inactive entraînée par le promoteur CaMV35 était
Agronomie 2021, 11, 1359 23 de
43

inséré dans Sp-PE2, et Sp-PE3 a été utilisé pour observer les mutations. Sp-PE2 a une
plus grande efficacité, montrant un signal GFP fort par rapport à Sp-PE3. Ces PE ont été
utilisés pour éditer les gènes ALS et BERRANT PANICLE ORGANIZATION 1 (APO1),
générant ainsi des lignées mutantes stables [23]. De même, plant prime editor 3 version 1
(PPE3-V01) avec la RT (M- MLV) et Cas9H840A ont été optimisés pour leur application
dans les cellules de riz. Cinq sites cibles dans quatre gènes de riz (OsKO2, OsDEP1,
OsDPS, OsALS) ont confirmé les activités PE et ont trouvé des SNP et des indels à des
fréquences variables [21]. Un autre système PE (pPE2) s'est avéré être un système
efficace pour l'édition précise du génome, ciblant différents sites du génome du riz. Le système
pPE2 a donné de meilleurs résultats que le système pPE3 pour différents sites génomiques. En
outre, un système pPE2 de substitution dans lequel le gène rapporteur de la phosphotransférase
d'hygromycine (HPT) avec une substitution ACG au codon de départ (HPT-ATG) a été
incorporé dans des cellules éditées de première qualité, ce qui a permis de détecter
facilement l'édition de nucléotides et de développer de nouveaux couloirs pour l'édition
flexible dans le riz [92]. Les applications des systèmes PE et des variantes de protéines
Cas, telles que dCas9 et Cas12a/Cpf1, pour améliorer l'efficacité de l'édition du génome,
la croissance et le développement des plantes, l'architecture des plantes, la résistance
aux herbicides, etc. sont détaillées dans le tableau 5.

Tableau 5. Exemples d'application de l'édition primaire et des variantes de protéines Cas pour l'amélioration des cultures de riz.

Gène ARNg
Systèmes Cultivar utilisé Nom du gène Promoteur Cas9 Résultats Réf.
Fonction Promote
ur
Taille des grains et
OsGW7 forme, Génome multiplex
Zhonghua 11 CaMV35S OsU6a [93]
OsER1 régulation à édition
dCas9 la hausse de
OsSPL14, l'éthylène
Protoplaste de riz Générer une plus grande
La
sénescence,
architecture Ubi [94]
OsIPA, OsGRF1 suppressions
des plantes
Cas9 avec Protoplaste de riz OsAAT sénescence, Générer des messages courts et
cellule
OsNRT1.1B Ubi CaMV des suppressions plus importantes
APOBEC la mort
OsCDC48 [95]

ALS Synthèse des

Perte d'activité de
Nipponbare (Acétolactate acides aminés ZmUBI OsU6 [96]
l'ALS, mort de la
synthase) ramifiés
plante
Cas12a/Cpf1 Dense et
FnCpf1 et Protoplaste de DEP1 ériger CaMV35S OsU6 Panicule dispersée [97]
riz
CRISPR/ Panicule
LbCpf1 OsBEL, OsPDS
Bentazon-
sensible-létale,
Protoplaste de riz Gène multiplex
OsEPSPS CaMV35S OsU6 l'édition (albinos [98]
Phytoène
OsBEL OsRLK phénotype)
Désaturase
Acétolactate
synthase, Résistant aux
Protoplaste de OsALS CaMV35S
APO1 Panicule
riz OsU6 imidazolinone [23]
herbicides
l'organisation
OsPDS1 Résistance
Ubi-1 Tolérance accrue aux
Nipponbare OsACC1 aux OsU3 [92]
CaMV35S herbicides
OsWx1 herbicides
Premiers
rédacteurs , amylose
Efficacité de
Substitution de
OsALS, OsACC l'utilisation ZmUbi1 OsU6a
Protoplaste de nucléotides, [20]
OsDEP1 de l'azote OsUbq OsU3
riz résistance aux
Tolérance
herbicides
aux
herbicides
Nouveau montage
OsALS, OsKO2, Architectu OsU6
Protoplaste de riz ZmUbi1 de prime, [21]
OsDEP1, PDS re de la
architecture dense
panicule
de la panicule
 OsU3

Agronomie 2021, 11, 1359 4. Édition de base pour l'amélioration des cultures de riz 24 de
43
BE est un nouvel outil d'édition du génome qui utilise des composants CRISPR pour
introduire des mutations ponctuelles ou des variants d'un seul nucléotide (SNV) dans
le génome sans faire de DSB dans l'ADN et sans dépendre de la HDR (figure 2). Les
éditeurs de base contiennent soit des
Agronomie 2021, 11, 1359 25 de
43

La nucléase Cas altérée qui ne peut pas produire de DSB ou les protéines qui
manipulent la machinerie de réparation de l'ADN pour activer le NHEJ au lieu de l'HDR
[99]. Il existe deux types d'éditeurs de bases, à savoir les éditeurs de bases cytosine
(CBE) et les éditeurs de bases adénine (ABE). Les variantes de Cas9, telles que xCas9,
SpCas9 et SaCas9, utilisées dans la cassette des CBE ont augmenté la fréquence de mutation de
C-G en T-A jusqu'à 80 % dans le riz [100]. Des éditeurs de bases récents avec des
variantes de Cas9 (nSpCas9, nCas9, SaCas9) ont amélioré l'efficacité de l'édition des ABE
(conversions de A-T en G-C) chez les plantes, y compris le riz, pour plusieurs applications
dans l'amélioration des cultures [100,101]. L'efficacité accrue de l'ABE dans deux gènes
cibles OsSPL14 et OsSPL17, avec une meilleure compatibilité PAM dans le riz, élargit son
application à d'autres cultures [100]. L'utilisation simultanée des systèmes ABE et CBE a
permis d'obtenir de meilleures performances chez le riz [102]. La génération de
délétions plus larges et plus précises était un défi, mais elle a été rapportée en utilisant
une cassette de Cas9, d'uracil-ADN-glucosidase (UDG) et d'une lyase (site
apurinique/apyrimidinique). La génération du système de délétion induite par fusion
APOBEC-Cas9 (AFID) [95] a entraîné de grandes délétions uniformes dans les protoplastes
de riz et de blé qui peuvent être utilisées pour déterminer leurs régulations et les domaines
protéiques pour l'amélioration des cultures. Le BE a été utilisé pour améliorer le
rendement et la qualité des grains, ainsi que la résistance aux herbicides chez le riz
(tableau 6).

Tableau 6. Applications de l'édition de base pour l'amélioration des cultures de riz.

Nom du gène Fonction du gène Outil d'édition de base PAM Fenêtre d'édition (nt) Trait cible Réf.
OsCDC48,
sénescence, mort
OsNRT1.1B pnCas9-PBE CGG 3à9 Rendement [103]
cellulaire,
OsSPL14
architecture des
plantes GAG
CAG
ABE-P1 CGA
SPL14, SPL17, Poids et taille des ABE-P2 3 à 15 ans Rendement [102]
GGA
grains,
AGCG
SPL16, forme, qualité, ABE-P3
GGCG
SPL18 nombre ABE-P4
SLR1, SPL14, SPL16, Poids et taille des ABE-P5
ABE-P1
grains,
forme, qualité, NNGRRT 4à9 Rendement [17]
SPL18, SPL17 ABE-P2
nombre
APOBEC1-XTEN- AGG 5 Utilisation élevée
NRT1.1B Transporteur d'azote [104]
Cas9(D10A) GGG Efficacité
d'azote
Amidon
SBEIIb CBE TDC 5 Haute teneur [105]
en amylose
enzyme de ramification
CCA
Wx ou GBSSI Synthèse de l'amidon CBE 4 Haute teneur en amylose [106]
CGG
CGG Résistance
OsALS1 Transporteur ABC BEMGE 5-7 [107]
CAG aux
herbicide
CGG
OsALS1 Transporteur ABC CBE s [108]
TD
C Résistance
aux
herbicide
3-5
TGG 3à9 s
eABE Résistance
OsACC Résistance aux herbicides [109]
eBE3 aux
herbicide
s

%0.1. Rendement des céréales et caractères connexes

Les systèmes BE, en particulier l'ABE, ont été utilisés pour introduire des mutations
ponctuelles dans plusieurs gènes Squamosa Promoter Binding Protein-Like, tels que
OsSPL14, SPL16, SPL17 et SPL18 [16,102,103], pour cibler l'architecture de la plante, le
poids, la taille et la forme des grains, afin d'améliorer le rendement. De même, BE a été
Agronomie 2021, 11, 1359 26 de
utilisé pour cibler le transporteur de nitrate 1, Os- NRT1.1B [103,104] afin d'améliorer
43
l'efficacité de l'utilisation de l'azote par les plants de riz en tant que stratégie indirecte
pour améliorer le rendement en grains du riz.

%0.2. Qualité des grains

Certains gènes contrôlant la qualité des grains de riz ont été modifiés par BE. Par
exemple, un système efficace d'éditeur de cytosine base 3 (CBE3) a été appliqué pour
modifier simultanément trois séquences cibles dans deux gènes de riz, dont deux cibles
dans OsBEIIb (enzyme de ramification de l'amidon).
Agronomie 2021, 11, 1359 27 de
43

2b) nommé (S3 et S5), et un autre site cible (P2) dans la Phytoene Desaturase du riz
(OsPDS). Ce système a permis d'obtenir des mutations ponctuelles précises ayant une
fréquence de mutation de 19,2 %, 10,5 % et 1,0 % au niveau des cibles S5, S3 et P2,
respectivement. Les mutations résultantes dans ces gènes ont permis d'obtenir des
teneurs élevées en amylose chez le riz [105]. De même, des mutants sans transgène
produits en ciblant le gène Wx/la protéine GBSS1 à l'aide d'un système cytidine BE [106]
ont modifié la séquence d'acides aminés et altéré les teneurs en amylose des grains de
riz.

%0.3. Résistance aux herbicides

Les systèmes BE ont été utilisés pour améliorer la résistance aux herbicides chez le
riz en ciblant les gènes OsALS et OsACC [107-109]. Parmi ces systèmes, une nouvelle
stratégie de sélection basée sur l'évolution des gènes par édition de bases a été utilisée
pour cibler 3 à 5 nucléotides du gène OsALS qui confèrent une résistance à l'herbicide
bispyribac-sodium [107]. De même, le système CBE a été utilisé pour introduire une
mutation faux-sens dans deux codons du gène OsALS [108]. Cette nouvelle approche de
sélection a permis d'obtenir une résistance à cinq herbicides, à savoir le bispyribac-
sodium, le flucarbazone-sodium, l'imazapic (IMP), le nicosulfuron et le pyroxsulam.

5. Aspects réglementaires et risques associés à l'édition du génome

L'édition du génome, principalement la technologie CRISPR, a certainement un
grand potentiel pour révolutionner la science des plantes car elle peut créer des
variantes génétiques comme celles des variants naturels. La principale préoccupation
concernant ces cultures modifiées est leur réglementation dans le monde entier. La
législation et le cadre réglementaire évoluent dans différents pays ; cependant,
nous avons besoin de connaître les politiques récentes en Europe pour adopter de
nouvelles technologies [110]. L'édition du génome est catégorisée par les nucléases
dirigées par site (SDN), qui génèrent des variations dans le génome de l'hôte. Les
TALEN ou Cas9 ciblent un site spécifique générant une cassure de l'ADN qui est
altérée par le mécanisme naturel de réparation de l'ADN de la plante (figure 2). Les
SDN ont entraîné des variantes de sites cibles causant trois types de modifications,
telles que SDN-1, des changements de paires de bases dus à de petites délétions, ou
des insertions sans ADN étranger. Le SDN-2 provoque une modification spécifique
due à la recombinaison homologue en utilisant un petit modèle d'ADN, et l'approche
SDN-3 est identique au SDN-2, mais utilise un segment d'ADN plus grand [111]. Une
plante comportant un segment plus grand d'ADN étranger est identifiée comme une
plante transgénique. La législation sur la biosécurité de ces plantes est approuvée
par l'adaptation des variantes induites par la SDN dans de nombreux pays [110]. La Cour
de justice de l'Union européenne (CJUE) a classé tous les organismes modifiés par le
génome dans la catégorie des OGM.
À l'instar de l'UE, la Nouvelle-Zélande considère également les plantes modifiées
par le génome comme des OGM et réglemente ces mutants en vertu des règles de
biosécurité applicables aux OGM. Les organismes générés par mutagénèse
conventionnelle sont exemptés en raison de leur historique d'utilisation sûre. La CJUE a
eu un impact négatif sur l'innovation agricole, car seuls 8 % des brevets CRISPR
proviennent d'Europe, tandis que 60 % proviennent de Chine et 26 % des États-Unis. En
octobre 2019, l'Union européenne a demandé à mettre en évidence le statut du GETS,
qui aurait été compilé en avril 2021. L'application future de l'édition du génome, leurs
questions éthiques et sociétales, ainsi qu'un cadre d'évaluation des risques seront proposés
par l'Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA). L'Argentine suit les critères
réglementaires pour les cultures génétiquement modifiées en classant les cultures
générées par le SDN-3 dans la catégorie des OGM ; toutefois, les cultures modifiées par
le SDN-1 sont considérées comme des non-OGM. Les cultures générées par SDN-2 ne
respectent aucun critère réglementaire [112].
Le Brésil, le Chili et la Colombie suivent également les mêmes critères
réglementaires que l'Argentine. Si les plantes ne contiennent pas d'ADN étranger, elles
ne seront pas réglementées en tant qu'OGM. À l'instar des États-Unis, le Canada est
également attentif à la "nouveauté" des caractères pour l'évaluation réglementaire. Les plantes
Agronomie 2021, 11, 1359 28 de
43
multipliées par SDN-1 et SDN-2 doivent suivre la même évaluation ou réglementation
établie par l'Agence canadienne d'inspection des aliments (ACIA) et Santé Canada [113].
Le Japon applique la même règle (si les plantes n'ont pas d'ADN étranger, elles ne
seront pas réglementées en tant qu'OGM), elles sont donc réglementées en tant que
cultures conventionnelles et peuvent être consommées sans aucune évaluation de
sécurité, mais cette suggestion doit encore être adoptée officiellement par le ministère de la
santé [114]. En Australie, le Gene Technology Regulations Review a été présenté avec
des amendements mis à jour. Ces amendements classent les plantes développées selon
les normes SDN-2 et SDN-3 comme des OGM, et les plantes SDN-1 comme des non-
OGM [115], mais elles doivent encore être approuvées par le gouvernement.
Agronomie 2021, 11, 1359 29 de
43

La Chine se concentre sur les processus ou les techniques utilisés pour créer de
nouvelles variétés de cultures et apporte un soutien financier considérable. Aucune
règle n'a encore été proposée pour les cultures génétiquement modifiées, mais nous
nous attendons à ce que la Chine réglemente les cultures génétiquement modifiées de
manière obligatoire, tout comme le Japon. Récemment, la France s'est opposée à la
décision du tribunal de l'UE en ne considérant pas les GET sous les règles strictes de
biosécurité des OGM. En tant que premier producteur agricole de l'UE, elle envisagera de
modifier la décision du tribunal administratif sur les réglementations relatives aux OGM
(https://www.reuters.com/article/france- agriculture-gmo/france-backs-non-gmo-regulation-
for-crop-gene-editing-in-eu-idINL8N2JT4 A3 consulté le 29 juin 2021). Toutefois, à l'ère actuelle,
les scientifiques devraient collaborer pour exploiter le potentiel de la technologie CRISPR,
par exemple, une déclaration commune en faveur des applications agricoles soutenue
par 13 pays, dont les États-Unis, le Canada, l'Argentine, l'Australie, le Brésil, la
Colombie, la République dominicaine, le Guatemala, le Honduras, la Jordanie, le
Paraguay, l'Uruguay et le Viêt Nam. Cette déclaration est un bon signe pour
l'élimination des différences entre les pays en ce qui concerne les cadres
réglementaires, ce qui favorise l'agriculture innovante. Bien que le système CRISPR-Cas
produise des plantes transgéniques libres, la réglementation des OGM n'est acceptable
que par les sociétés scientifiques de certains pays.

6. Limites et solutions
Les GET ont un grand potentiel par rapport à la sélection conventionnelle pour
développer des variétés de riz de haute qualité en raison de leur grande efficacité, de
leur précision, de leur robustesse et de leur capacité d'édition multiplex.
Indépendamment de l'efficacité des GET (en particulier le système CRISPR-Cas) et de
leur vaste application, ils présentent encore certaines limites qui entravent leur
utilisation pour l'amélioration des cultures. Voici quelques-uns de ces obstacles :
• La perturbation/mutation du gène ciblé peut être coûteuse en termes d'aptitude,
car elle peut perturber la voie d'accès au produit ou à tout produit ou élément
impliqué dans cette voie. Un gène est lié à de nombreux autres gènes et voies de
régulation. Ce coût d'adaptation peut affecter les gènes régulant la croissance et le
développement des plantes, la carence en nutriments essentiels conduisant à des
anomalies visuelles. Afin de surmonter cette limitation, la méthode BE est
applicable, ciblant une mutation d'un seul nucléotide, échappant à la perturbation
d'autres gènes, ou ciblant le promoteur pour générer des allèles [116].
• Les "mutations hors cible" constituent une autre limitation majeure et un soutien
important à l'amélioration du système CRISPR [117]. Les modifications
involontaires ou indésirables de l'ADN créées par un ARNg trompeur ou une
méthode indépendante de l'ARNg ou des sites non spécifiques font partie des
mutations hors cible [118]. Les solutions possibles pour faire face aux mutations hors
cible et produire des cultures sans transgènes consistent à améliorer le système
CRISPR pour une édition précise et fiable, ou à développer une approche pour
identifier les mutations hors cible. Certains outils bioinformatiques ont été créés pour
détecter les mutations hors cible, à savoir Cas-OFFinder
(http://www.rgenome.net/cas-offinder/, consulté le 29 juin 2021) et CCTop
(https://crispr.cos.uniheidelberg.de, consulté le 29 juin 2021), ainsi que certains
systèmes, tels que SELEX, IDLV capture, Guide-seq, HTGTS, BLESS, Digenome-seq
[119] et DISCOVER-seq [120]. Cependant, les chercheurs doivent utiliser ces outils
en fonction de leurs besoins, en raison de leurs avantages et inconvénients spécifiques.
En revanche, les protéines Cas9 ont été modifiées pour améliorer la spécificité de la cible,
notamment eSpCas9 [121], HF-Cas9 [122], HypaCas9 [123] et Sniper Cas9 [124]. Ces
protéines Cas modifiées présentent une réduction crédible de l'activité hors cible.
La cytosine, au lieu de l'adénine, est responsable d'une mutation hors cible dans le
riz et doit donc être améliorée dans des outils tels que les éditeurs de bases [118]. En
outre, l'EP est également un outil fiable pour réduire les mutations hors cible, par exemple,
le ciblage de 179 sites hors cible prédits avec 12 pegRNA et la nickase nCas9 [91] a
entraîné 0,00~0,23 % de mutations hors cible.
• Un autre facteur limitant est l'adaptation commerciale des cultures génétiquement
Agronomie 2021, 11, 1359 30 de
43
modifiées dans certains pays et a été discuté en détail précédemment (voir les
aspects réglementaires et les risques associés à l'édition du génome). Bien que la
décision concernant les cultures génétiquement modifiées et l'utilisation des GET
soit en suspens, il existe un grand potentiel pour une sélection robuste, efficace et
respectueuse de l'environnement en vue du développement de variétés
améliorées.
Agronomie 2021, 11, 1359 31 de
43

• L'immunité des virus ADN/ARN contre les eucaryotes est une limitation cruciale du
système CRISPR/Cas9 en raison de l'écoulement et de la réplication instantanée
des virus [125]. Il existe un besoin urgent d'une version CRISPR largement
acceptable, telle que Cas13, pour surmonter ce problème. Parmi les trois protéines
(Cas13a, Cas13b et Cas13c), Cas13a est réputée pour ses réplications précises et
robustes de l'ARN et peut lutter contre les virus à ARN [126]. En bref, Cas13 serait
un meilleur choix pour cibler l'ARN viral par rapport à CRISPR/Cas9.
• Dans le cas du BE, de nombreux obstacles, tels qu'une forte activité hors cible, une
énorme fenêtre d'édition et des sites PAM limités, limitent son efficacité. Plusieurs
approches ont été utilisées pour minimiser ces limitations, notamment
l'application des systèmes REPAIR et RESCUE dans les plantes, l'altération des systèmes
CBE et ABE, la génération simultanée de mutations à plusieurs loci dans le riz [116],
comme le BE multiplex pour l'amélioration des cultures. L'approche RNP a
également surmonté les obstacles réglementaires des éditeurs de bases en
augmentant l'efficacité pour améliorer les caractéristiques agronomiques.
• Le PE présente également certains problèmes clés, notamment les déterminants
du type de cellule, l'état de la cellule, les mécanismes de réparation de l'ADN qui
décident du sort du PE productif ou improductif ou du transport de la protéine PE
ou du pegRNA pour la régulation des applications in vivo. Ce problème pourrait
être résolu en manipulant la réparation de l'ADN de manière à favoriser le
remplacement du brin édité par le brin non édité après l'insertion réussie d'un
lambeau de 3′, ou en utilisant des enzymes de transcriptase inverse plus petites.

7. Conclusions et perspectives
Les outils d'édition du génome, en particulier le système CRISPR-Cas et ses
variantes, ont fait des progrès considérables. Ces nouveaux outils ont rendu
l'amélioration des cultures plus précise, plus robuste et plus performante que les
méthodes antérieures (c'est-à-dire la sélection conventionnelle). Grâce à ses multiples
capacités d'édition du génome, c'est-à-dire l'insertion, la suppression, l'élimination de
gènes, la substitution directe à n'importe quel loci, le système CRISPR/Cas l'emporte sur
les autres GET pour le développement de plantes idéales et la domestication des
cultures, c'est-à-dire la génération du super-riz. Le système CRISPR/Cas a été utilisé
pour développer une variété présentant les changements et phénotypes souhaités dans
des variétés de riz élites déjà existantes, ce qui a permis d'améliorer la qualité des
grains de riz. Le développement d'approches polyvalentes, telles que le BE, le PE, les
transpositions CRISPR et les recombinases basées sur CRISPR, offrirait des possibilités
passionnantes en matière d'édition du génome. Elles constituent également une étape
importante permettant de modifier avec précision la séquence de n'importe quel
génome désiré et de réarranger des séquences d'ADN plus importantes. L'efficacité
d'édition de la PE peut être améliorée en utilisant un système de sélection transgénique
et une transcriptase inverse différents.
L'ajout de l'interférence CRISPR (CRISPRi) et de l'activation à médiation CRISPR
(CRISPRa) dans la famille CRISPR, en utilisant la trousse à outils dCas9, telle qu'elle a été
développée dans le maïs [127], offre un grand potentiel pour améliorer encore
l'ingénierie du génome. Le ciblage du promoteur central d'un gène par des technologies
d'édition pourrait constituer une approche fiable pour affiner l'expression d'un gène
souhaité, ce qui ouvrirait de nouvelles voies pour améliorer la qualité du grain de riz. En
outre, les méthodes de livraison nouvelles et potentielles utilisées dans les dernières
approches d'édition de gènes produiront des produits exempts de transgènes, ce qui
permettra de surmonter les problèmes d'éthique, de réglementation et de
commercialisation. L'utilisation de ces technologies d'édition en génomique
fonctionnelle associée à d'autres approches permettra de lutter contre les défis
alimentaires mondiaux et contribuera à atteindre l'objectif de la faim zéro, l'un des
objectifs de développement durable fixés par les Nations unies, d'ici 2030.
D'autre part, il est rapporté qu'un gène d'autophagie OsATG8b contrôle la qualité
des grains en plus des gènes candidats, y compris qGC10 pour la consistance du gel,
qHd2-1 et qGS-7 pour la taille des grains, l'aspect physique des grains, la qualité de la
consommation et de la cuisson [128-130]. De même, plusieurs nouveaux QTL, métaQTL,
Agronomie 2021, 11, 1359 32 de
43
ortho-MQTL et gènes candidats pour le rendement en grains et les caractéristiques
connexes, la sécheresse, la salinité et les stress thermiques ont été identifiés [131-133].
L'utilisation des dernières technologies d'édition sur ces gènes candidats/QTL a un
potentiel remarquable pour affiner le rendement des grains de riz, la tolérance aux
stress abiotiques, l'apparence des grains et l'amélioration de la qualité dans le futur
programme de sélection.
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43

Contributions des auteurs : Conceptualisation, L.J., S.A. et B.H. ; ressources et conservation des
données, A.M.M. et A.Z. ; rédaction - préparation de la version originale, J.T. et S.A. ; rédaction -
révision et édition, S.A. et B.H. ; visualisation, S.A. ; supervision, L.J. et S.A. ; acquisition des fonds,
L.J. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version publiée du manuscrit.
Financement : Ce travail a été soutenu par des subventions du Programme national de sciences et
technologies majeures sur la sélection de variétés de nouveaux organismes OGM (2016ZX08001-001), du
Fonds de recherche de base de l'institution scientifique d'intérêt public centrale (n° 2017RG008) et
du Programme d'innovation en sciences et technologies agricoles de l'Académie chinoise des
sciences agricoles (CAAS).
Déclaration du comité d'examen institutionnel : Sans objet.
Déclaration de consentement éclairé : Sans objet.
Déclaration de disponibilité des données : Non applicable.
Remerciements : Nous nous excusons auprès des collègues dont les travaux n'ont pas été cités
dans cette revue en raison du manque d'espace.
Conflits d'intérêts : Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

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