Master de Protéomique & Master Physico-Chimie du Vivant

CORRECTION
MODULE PCV4
EPREUVE DE SPECTROMETRIE DE MASSE
Durée de l’épreuve 1H30
ANNEE UNIVERSITAIRE 2007-2008 Mercredi 24 Janvier 2008

I : Question de cours (4 points)

Question : Expliquer brièvement comment l’analyse MS d’une protéine donnée après hydrolyse
enzymatique ménagée (cinétique de digestion enzymatique) permet d’obtenir des informations sur le
degré de repliement de la molécule.
Réponse : Lors de la digestion enzymatique ménagée d’une protéine native, la cinétique de
digestion sera plus rapide pour les sites facilement accessible à l’enzyme. En revanche, si la protéine est
totalement dénaturée l’accès aux sites sera identique pour toute la protéine. L’étude pas MS des fragments
de digestion et de leur nombre ainsi que de l’évolution de ceux-ci en fonction de la cinétique de digestion
permet donc de déterminer les parties de la protéine qui sont repliées et le degré de repliement.

II : PROBLEME : Déterminations de masse (8 points)

Partie I (4 points) :
Analyse de la protéine intacte AtpH par Nano-ESI/FT-ICR MS
Question : A partir des pics dont les m/z sont donnés, déterminer la masse de la protéine et
attribuez les différents ions (type et état de charge).
Réponse : Sur le spectre il faut remarquer trois signaux qui forment une distribution à m/z
1601,684 ; 1344, 728 et m/z 2006,852. Il s’agit donc de 3 états de charge différents de la protéine. En
revanche, il faut pense que l’agrandissement qui laisse apparaître différents massifs isotopiques
correspondent probablement à des cationations ou des modifications post-traductionnelles.
Pour deux ions d’états de charge n et n+1 dont les m/z mesurés expérimentalement sont notés
respectivement M1 et M2, n peut être déterminé par
M2 −1
n= (voir cours pour schéma)
M1 − M 2
-Soit par exemple, pour l’AtpH en prenant le couple M2=1344,728 (n+1) et M1=1601,684 (n)

1344,728 − 1
Alors n = = 5,22 ≠ 5 , soit n=5
1601,684 − 1344,728

D’où l’attribution :
m/z n Ions Mw
1344, 728 6 [M+6H]6+ 8062,368
1601,684 5 [M+5H]5+ 8003,42 Mw= 8029,732 Da.
2006,852 4 [M+4H]4+ 8023,408

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Pour les ions autour du pic à m/z 1601,684 :

m/z n m/z x n ΔM Ion Espèce

1601,684 5 8008,42 0 [M+5H]5+ Espèce protonée
1604,893 5 8024,465 16,045#16 [M+5H+O]5+ Oxydation (M ou W)
1606,059 5 8030,295 21,875#22 [M+Na+4H]5+ Cationisation Na+
1609,45 5 8047,25 38,83#38 [M+K+4H]5+ Cationisation K+
1610,248 5 8051,24 47,82#22+23 [M+3H+2Na]5+ Cationisation 2Na+
+ + +
1613,639 5 8068,195 59,775#22+38 [M+3H+Na+K]5 Cationisation Na et K

Pour cette protéine sont donc observés 3 états de charge (4, 5 et 6) et l’agrandissement autour
de l’état de charge n=5 permet d’observer le composé oxydé et différemment cationisés. Nous
constatons que dans le cas présent la calibration instrumentale n’est pas très bonne puisque la
détermination de la masse à partir des différents états de charge donne de grands écarts.

Partie II (4 points) :
Analyse de deux protéines après expression d’un gène dans E. coli par Nano-ESI/FT-ICR MS

Question : Vous attribuerez les différents pics.

Réponse : De la même manière que précédemment mais en prenant garde que deux distributions de
protéines se chevauchent il est possible de déterminer les états de charge pour les deux protéines. Il faut
trouver 2 pics consécutifs qui permettent d’obtenir un n proche d’une valeur entière. Ensuite après
recalcule approximatif de la masse, il est possible d’attribuer les pics de la distribution correspondant à
cette protéine. Les pics restant appartenant à la deuxième protéine, dont il est alors possible de déterminer
les états de charge. Les résultats peuvent se résumer comme suit :

m/z Protéine n Ions Mw

1031,935 P1 26 [M+26H]26+ 26804,31
1073,176 P1 25 [M+25H]25+ 26804,4
1109,118 P2 7 [M+5H]5+ 7756,826
1117,849 P1 24 [M+24H] 24+
26804,376 P1, Mw= 26804,361 Da.
1166,406 P1 23 [M+23H]23+ 26804,338 P2, Mw= 7756,579Da
P1 22+
1219,382 22 [M+22H] 26804,404
1277,397 P1 21 [M+21H]21+ 26804,337
P2 6+
1293,722 6 [M+6H] 7756,332

Question : Vous calculerez la masse moyenne Mmoy et la masse monoisotopique Mmono de

chacune de ces protéines
Réponse : Les agrandissements autours des massifs isotopiques de deux pics permettent à la fois de
vérifier l’état de charge de ces pics mais également de distinguer la masse monoisotopique de la masse
moyenne des protéines.
Détermination des états de charge : les pics d’une distribution isotopique sont équidistants et
l’écart entre deux pics consécutifs de cette distribution permet de déterminer la quantité 1/n.

Pour le massif autour de m/z 1109,118 : l’écart de masse entre les pics du massif isotopique varie
de 0,140 à 0,145 soit n varie de 7,14 à 6,87 ce qui donne en moyenne n=7. Il s’agit d’un pic appartenant à
la protéine P2. En prenant le 1er pic de la distribution isotopique (m/z 1108, 545) il sera possible de

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déterminer la masse monosisotopique alors qu’en prenant le pic correspondant au maximum de la
distribution (1109,118) la masse moyenne sera déterminée.

P2 : M mono = (m / z mono ⋅ n) − (n ⋅ M ( H ) ) = (1108,545 ⋅ 7 ) − (7 ⋅ 1) = 7752,815

P2 : M moy = (m / z moy ⋅ n) − (n ⋅ M ( H ) ) = (1109,118 ⋅ 7 ) − (7 ⋅ 1) = 7756,826

Pour le massif autour de m/z 1117,849 : l’écart de masse entre les pics du massif isotopique donne
0,042 soit n =23,81#24. Il s’agit donc d’un pic appartenant à la protéine P1. En recalculant le 1er pic de la
distribution isotopique (m/z 1117,345_(0,042x3)=1117,219) il sera possible de déterminer la masse
monosisotopique alors qu’en prenant le pic correspondant au maximum de la distribution (1117,849) la
masse moyenne sera déterminée.

P1 : M mono = (m / z mono ⋅ n) − (n ⋅ M ( H ) ) = (1117,219 ⋅ 24) − (24 ⋅ 1) = 26789,256

P1 : M moy = (m / z moy ⋅ n) − (n ⋅ M ( H ) ) = (1117,849 ⋅ 24 ) − (24 ⋅ 1) = 26,804,376

III : PROBLEME : Déterminations de structure primaire (8 points)

Question1 : A partir de ces données attribuez les 3 ions observés en mode MS positif sur le
spectre.
Réponse 1 : Il faut remarquer que l’écart entre les ions à m/z 2592,42 et 2614,41 est de 21,99. De
plus l’étude est réalisée sur un instrument équipé d’une source MALDI. Il est donc peu probable
d’attendre des états de charge dans cette gamme de m/z. Il s’agit donc d’un ion cationisé au sodium. De
même, l’écart entre les ions à m/z 2592,42 et 2630,40 est de 37,98#38 il s’agit donc d’uun ion cationisé
par le potassium.
Soit pour récapituler :
m/z n Ions
2592,42 1 [M+H]+
2614,41 1 [M+Na]+ Mw= 2591,42 Da.
+
2630,40 1 [M+K]

Question 2 : Déterminer l’acide aminé manquant et présent 2 fois dans la séquence.

Réponse 2 : Les ions immoniums permettent de déterminer les acides aminés présents dans la
séquence.

m/z ion X fois dans la

AA
immonium séquence
30 G 1
44 A 2
70 P 2
72 V 2
101 Q 2
104 M 1
120 F 2
136 Y 1

Donc en partant de la masse totale du peptide et en soustrayant tous les AA en tenant compte du
nombre de fois où ils sont présents sans oublier de prendre le groupement Biotine-Apa N-terminal et le
groupement Apa qui relie les deux chaînes peptidiques, il est possible d’obtenir.

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 m/z ion X fois dans
Résidu Mmono résidu Mmono
immonium la séquence

30 G 1 57,021 57,021
44 A 2 71,037 142,074
70 P 2 97,053 194,106
72 V 2 99,068 198,136
101 Q 2 128,058 256,16
104 M 1 131,04 131,04
120 F 2 147,068 294,136
136 Y 1 163,063 163,063
L 1 113,084 113,084
K 2 128,095 256,19
Biot-Apa 1 358,16 358,16
Apa-2H 1 97,07 97,07
H-Nterminal
1 1 1
chaîne 2
NH2-Cterminal
1 16 16
chaîne 1
M=2277,196 Da

Soit Mmono(peptide)-M=2590,43-2277,196=313,234
Sachant que cet AA est présent 2 fois dans la séquence, cela fait donc 156,617.
L’AA en double est donc Arginine R

Question 3 : A partir de ces données déterminer les 2 séquences d’acides aminés constituant le
peptide branché et reformer le peptide entier.
Réponse 3 :

Série ion 1 :

514,14 611,3 1625,93 1722,99 1851,04 1979,04 2126,11

97,16 1014,63 97,06 128,05 128 147,07

P Branche P Q Q F

Série ion 2 :

149,07 262,16 319,18 466,25 613,32 869,43

113,09 57,02 147,07 147,07 256,11

L G F F QQ

Série ion 3 :

72,04 235,11 391,21 490,28

163,07 156,1 99,07

Y R V
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 Série ion 2 :

1804,6 1932,03 2003,72 2102,14 2201,21 2357,31

127,43 71,69 98,42 99,07 156,1

L A V V R

Il faut remarquer que les séries 1 et 2 puis 3 et 4 donnent des séquencent qui se recouvrent. Il s’agit
donc de deux séries complémentaires. Pour la série 1, il est précisé que la série commence à l’ion M/z
514,14. Il faut donc supposer qu’il s’agit de l’AA N-terminal de la branche 1 portant le groupement
Biotine-Apa. Ainsi cette série serait une série N-terminal. Le plus simple étant de supposer qu’il s’agit
d’une série b. En prenant 514,14-358,16 (b1+-Biot-Apa) le calcul donne 155,98#156 soit le 1er AA serait
une R ce qui semble cohérent.
La série 1 étant la série b alors la série 2 est la série complémentaire y.
L’ion à m/z 149,07 est donc le y1+ et permet donc de déterminer que le dernier AA de la branche 1
est 149,07-18=131,07 soit M.
On obtient alors les séquences :
Branche 1 peptide :
RPKPQQF
Et QQFFGLM
Soir RPKPQQFFLM

Pour la branche 2 qui correspondent aux série 3 et 4, le même principe est appliqué. Le peptide étant
branché par son C-term la série y est donc la série 4 et la série 3 est donc la complémentaire b.
Si la série 3 est une série b alors AA1 à une masse de 72,04-1=71,04 soit A
Les séquence partielles sont donc
AYRV
RVVAL
Soit AYRVVAL
Il manque 1 seul AA a placer (K).
Donc la Deuxième séquence complète est
Soit AYRVVALK

Finalement le peptide branché à donc la séquence suivante :

Biotine-Apa-RPKPQQFFLMCONH2
Apa
AYRVVALK

Question 4 : Donner l’acide aminé de la SP impliqué dans l’interaction au récepteur et

réciproquement celui du récepteur impliqué dans l’interaction avec le neuropeptide.
Réponse 4 : Les AA en interactions entre le peptide et son récepteur sont donc 2 lysines.

☺ FIN DU CORRIGE ☺
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