Master de Protéomique & Master Physico-Chimie du Vivant

MODULE PCV4
EPREUVE DE SPECTROMETRIE DE MASSE
Durée de l’épreuve 1H30
ANNEE UNIVERSITAIRE 2006-2007 Mercredi 20 Décembre 2006

CORRIGE

I : Question de cours (4 points)

-Désorption/ionisation Laser Assistée par Matrice (MALDI) (1,5 points):

Avantages Inconvénients
-Tolérant aux sels et contaminants -Nécessité l’utilisation d’une matrice :
-Très sensible nombreux pics dans les basses masses rendant
-Ions formés principalement monochargés les mesures difficiles dans cette gamme de
(peu d’états de charge) : spectres plus masse
facilement interprétables -Pas de couplage en-ligne avec une technique
-Peu onéreux séparative en amont (e.g. HPLC)
-Gamme de couplage plus limitée avec les
analyseurs dans le cas de l’analyse de hautes
masses

-Ionisation par Electrospray (ESI) (1,5 points):

Avantages Inconvénients

-Couplage on-line avec les techniques -Très peu tolérant aux sels et contaminants
séparatives -De nombreux états de charge : difficultés
-Très sensible d’interprétation des données
-Pas de matrice : accès facilité aux basses -Onéreux
masses
-Grande gamme de couplage

-Dans le cas où la masse d’une protéine intacte serait recherchée, quel analyseur serait le
mieux adapté pour être couplé à une source MALDI ? (1 point)
Sachant que le MALDI produits peu d’ion multichargés et peu d’états de charge même pour
une protéine comparativement à l’ESI, il faut dans ce cas disposer d’un instrument présentant une
grande gamme de masse, soit dans l’idéal un temps-de-vol (TOF). Le TOF possède en théorie une
gamme de masse illimitée, puisque la quantité mesurée est le temps de vol d’un ion entre sa
formation et son arrivée au détecteur. Les analyseurs de type FT-ICR sont encore raisonnable à
coupler au MALDI puisque la gamme de masse peu atteindre 30000. Les autres analyseurs ne
permettront pas d’analyser les protéines si la source est un MALDI.

1
II :PROBLEME : Détermination de la masse d’une protéine et de son mutant
A. G. Marshall, J. Prot Res. 2004, 3, 61

Partie I (6 points) :

-Variations ponctuelles de la séquence en AA de la protéine : 1 ou 2 AA remplacés par d’autres

-Analyse sur un ESI/FT-ICR i.e. beaucoup d’états de charge par la source ESI et très grande
résolution (i.e. précision de mesure des m/z) grâce au FT-ICR.
-Peptide issu de la maturation de l’histone H2A, 2 formes une forme classique et une variante
possédant les mutations ponctuelles.

1. Utiliser deux méthodes pour déterminer les états de charge des deux formes de la buforine.
Méthode 1 : (1,5 points)
-Pour deux ions d’états de charge n et n+1 dont les m/z mesurés expérimentalement sont notés
respectivement M1 et M2, n peut être déterminé par
M2 −1
n=
M1 − M 2
-Soit par exemple, pour le couple de la Buforine II classique M2=487,693865, n et M1=609,365375,
n+1
487,693865 − 1
Alors n = = 4,000 , soit n=4
609,365375 − 487,693865

-Le calcul peut être vérifié à partir des pics de la Buforine II sous sa forme variante avec le couple
M1=487,686585, n et M2=609,356275, n+1
487,686585 − 1
Soit n = = 4,00 , soit n=4
609,356275 − 487,686585
-Les pics dans la région des 609 ont donc un état de charge n de 4 et les pics dans la région des
m/z 407 correspondent à un état de charge n+1 de 5

-Méthode 2 : (1,5 points)

-Pour la distribution isotopique d’un composé, la différence de masse entre deux pics consécutifs du
1
massif isotopique vaut ΔM = , n étant l’état de charge.
n
-Soit par exemple ici, pour le couple m/z 487,693865 et 487,894, on obtient

1
ΔM = = 487,693865 - 487,894 = 0,2001, d’où n = 4,997 ≠ 5 , ce qui vérifie bien les
n
résultats précédemment obtenus.

-Soit par exemple ici, pour le couple m/z 609,3654 et 609,6154, on obtient

1
ΔM = = 609,3654 - 609,6154 = 0,25 , d’où n = 4 , ce qui vérifie bien les
n
-Ce qui est concordant avec les résultats précédemment obtenus avec la méthode 1.

2
2. En déduire la masse monoisotopique des deux formes de la buforine. Vous prendrez
1,007825 pour la masse de H
-La masse monoisotopique de la protéine peut être obtenue à partir de la mesure du pic
monoisotopique, soit le 1er pic de la distribution i.e. m/z 487,693865 pour la Buforine II et m/z
487,686585 pour la forme variante ou les couples m/z 609,365375 et 609,356275 (au choix).

En prenant le 1er couple,

Buforine II forme classique : (1 point)

Alors M mono = ( m / z mono ⋅ n) − ( n ⋅ M ( H ) ) = (487,693865 ⋅ 5) − (5 ⋅ 1,007825) et

M mono = 2433,4302

Buforine II forme variante : (1 point)

Alors M mono = ( m / z mono ⋅ n) − ( n ⋅ M ( H ) ) = (487,686585 ⋅ 5) − (5 ⋅ 1,007825) et

M mono = 2433,3938

3. A partir de la différence de masse entre les deux formes, en déduire l’acide aminé substitué
(1 point)

ΔM mono = 2433,4302 − 2433,3938 = 0,0364

-Le ΔM est de 36,4 mDa ce qui est très faible. En se reportant à la table de référence des AA, ilo est
possible de constater que très peu d’AA présentes des écarts de masse inférieurs à 1 Da. Pour Leu et
Ileu, ΔM est nul car il s’agit d’isomères de position. Ensuite, les seuls AA très proches en masse
sont Lysine (K) et Glutamine (Q) avec des masses respectives de 128,09496 et 128,05858.
Il est possible de vérifier que
M ( K ) − M ( Q ) = 128,09496 − 128,05858 = 0,03638 ≠ 0,0364

-La variation ponctuelle dans la séquence en AA de la protéine est le remplacement d’une lysine
par une glutamine. Ceci peut être mis en évidence grâce à l’excellente résolution des analyseurs
FT-ICR utilisés. Sur un analyseur plus traditionnel les deux formes n’auraient pu être distinguées.

Partie II (10 points) :

-2 peptides P1 et P2 de 13 AA de masses très proches.

-Analyse sur ESI/FT-ICR

1. A partir des spectres, recalculez les masses monoisotopiques de P1 et P2 et en déduire la

différence de masse entre les peptides. Calculez le pouvoir résolutif de l’instrument. (1 point)

-Calcul de l’état de charge :

Seul un état de charge pour le peptide est présent sur l’agrandissement du spectre. En revanche, la
masse des 2 1er isotopes est donnée pour les 2 peptides. Il faut donc appliquer la méthode 2
présentée précédemment.

3
-Méthode 2 :

Pour P1, m/z isotope1 vaut 662,860225 et m/z isotope 2 663,3602

Pour P2, m/z isotope1 vaut 662,861875 et m/z isotope 2 663,3619

1
ΔM = = 663,3602 - 662,860225 = 0,4999 ≠ 0,5 , d’où n=2
n
Ou
1
ΔM = = 663,3619 - 662,861875 = 0,5 , d’où n = 4 , d’où n=2 , ce qui vérifie bien les
n
résultats

-Calcul de la masse monoisotopique :

P1 :
Alors M mono = ( m / z mono ⋅ n) − ( n ⋅ M ( H ) ) = (662,860225 ⋅ 2 ) − ( 2 ⋅ 1,007825) et

M mono ( P1) = 1323,7048

P2 :
Alors M mono = ( m / z mono ⋅ n) − ( n ⋅ M ( H ) ) = (662,861875 ⋅ 2 ) − ( 2 ⋅ 1,007825) et

M mono ( P 2 ) = 1323,7081

Soit ΔM vaut 0,0033 Da ou 3,3 mDa.

-Pouvoir Résolutif :
Le pouvoir Résolutif (PR) correspond à la Masse d’un pic sur le ΔM entre deux pics consécutifs,
soit la capacité de l’instrument à séparer 2pics très proches
M ( P1) 662,860225
PR = soit ici, PR = ≠ 410733
M ( P 2 ) − M ( P1) 662,861875 − 662,860225

Comme attendu le pouvoir résolutif d’un analyseur tel le FT-ICR est très important.

2. Déterminez les acides aminés inconnus (1 point)

P1 : 1L, 1N, 1P, 1S, 1H, 1R, 1F, 1G et 3A 1L C-terminale

M mono ( P1) = 1323,7048

M ( AAinconnus) = M mono ( P1) − ( M ( L ) + M ( N )+ M ( P )+ M ( S ) + M ( H ) + M ( R ) + M (G ) + 3 ⋅ M ( A) + M (OH ) + M ( H ) )

M ( AAinconnus ) = 184,14

Soit les 2 AA sont la leucine (Mmono=113,08) et l’alanine (Mmono=71,04)

4
3. Attribuez les 2 séries d’ions. Déterminez les séquences partielles en acides aminés du
peptide P1 à partir des 2 séries d’ions fragments. Donnez la structure des ions à m/z 166,08 et
72,04.

-Attribution des séries d’ions : (0,5 point)

-La série 1 est capable de perdre facilement NH3, il s’agit probablement de la série C-terminale y. Si
la série 2 est son complémentaire alors il s’agit de la série b.
-Sachant que l’AA C-terminal de P1 est L, il est possible de vérifier cette hypothèse.
Si série y alors m/z 166,08 est y1 donc M(AA13)= 166,08-M(2H)-M(OH)=166,08-19=147,08
Il s’agit bien de F

-Séquences partielles de P1 : (1 point)

Série y :
113,09 71,04 137,06 87,03 324,19 171,06
L A H S ??~3AA ??~2AA
166,08 279,17 350,21 487,27 574,3 898,49 1069,55
71,4
A
F M(P1) 1253,67 1140,59
A 112,98
L
+
Pour b12, à m/z 1253,67 : H2 NH-CH(R2)-CO [NH-CH(R)-CO]10 -OH
+
Et la peptide intact : H NH-CH(R1)-CO-[NH-CH(R)-CO]11-OH
La différence de masse entre le peptide intact et b12 est donc de
Soit M(AA1)= M(P1)+M(H)-M(b12)=1323,7048+1-1253,67=71,035
Il s’agit donc de A
Séquence partielle :
ALA_ _ _ _ _ SHALF

Série b : (1 point)
113,09 71,04 114,04 57,02 411,22
L A N G ??~4AA
72,04 185,13 256,17 370,21 427,23 838,45
137,06
H
A 975,51

Pour b1, à m/z 72,04 : H-NH-CH(R)-+CO

Soit M(AA1)= M(b1)-M(H)=72,04-1=71,04
Il s’agit donc de A (ce qui vérifie le résultat obtenu précédemment).

Séquence partielle :
ALANG _ _ _ _H_ _ _

-Structure de m/z 166,08 : (1 point) y1+ H2+[NH-CH(R)-CO]-OH avec R=CH2-Φ

pour F

En regroupant les 2 séquences provenant des 2 peptides :

5
 ALANG _ _ _ SHALF

Compte tenu des AA présents, il manque à placer P, A, R

4. Déterminez le nombre de protons échangeables pour les deux peptides. Déterminez la

composition en acide aminé de la zone inconnue même si vous ne pouvez déterminer l’ordre
de ces acides aminés.

-Protons échangeables : (1 point)

En supposant que l’échange des H mobiles du peptide soit total,

Pour P1, m/z vaut maintenant 672,853, soit M = (672,853 ⋅ 2) − (2 ⋅ 1,007825) = 1343,69
Soit ΔM=1343,69-1323,7048=20
Il y a donc 20 protons mobiles sur P1

De la même façon, pour P2

Soit ΔM=1344,69-1323,7081=21,01#21
Il y a donc 21 protons mobiles sur P2

-Composition en AA de la zone inconnue : (0,5 point)

Les AA manquants sont P, A, et R
Si l’un des AA échange 5 protons, il s’agit donc bien de R
En MS/MS, dans la série 1

Donc ALANG(PAR)SHALF
5. Déterminez les acides aminés variant entre P1 et P2. A partir des deux séries d’ions
déterminez la séquence du peptide P2. A partir de ces données, déterminez la séquence
manquante pour le peptide P1.

-AA variant : (0,5 point)

Ions immoniums différents
P1 : m/z 70 et 120 soit en se reportant à la table des ions immoniums caractéristiques, ions
indiquant la présence de P (m/z 70) et F (m/z 120).

P2 : m/z 104 et 86 soit en se reportant à la table des ions immoniums caractéristiques, ions
indiquant la présence de M (m/z 104) et Leucine (m/z 86).

La différence entre P1 et P2 correspond à l’échange de Pet F par M et L.

Série 1 : (1 point)
113,09 71,03 137,06 87,03 156,11 71,03
L A H S R A
132,1 245,19 316,22 453,28 540,31 696,42 767,45

Séquence partielle :
_ _ _ _ _ _ARSHALL

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Série 2 : (1 point)
113,09 71,04 114,04 57,02 131,04 71,04
L A H G M A
72,04 185,13 256,17 370,21 427,23 558,27 629,31
156,1
R
A 872,44 785,41
87,03
S

Séquence partielle :
ALANGMARS _ _ _ _

Soit la séquence finale pour P2

ALANGMARSHALL

Soit la séquence finale pour P1

ALANGPARSHALF (0,5 point)

6. Après avoir donné les séquences complètes des 2 peptides, vérifiez que celles-ci sont
consistantes avec la différence de masse déterminez en 1, ainsi qu’avec le nombre de protons
échangeables déterminé en 4. Enfin, selon votre opinion lequel des deux peptides à la séquence
la plus intéressante. (1 point)

-Vérification avec question 1. :

La différence entre P1 et P2 correspond à l’échange de Pet F par M et L.

ΔM=(M(P)+M(F))-(M(M)+M(L))=97,053+147,068-131,04-113,084=0,0034 Da
ΔM=0,0034 Da
Ce qui est cohérent avec les résultats obtenus

-Nombre de protons échangeables :

P1 : composition 4A, 2L, 1N, 1G, 1P, 1R, 1S, 1H, 1F

Soit d’après le tableau en annexe:
N(HmobilesP1)= (4.1)+(2.1)+(1.3)+(1.1)+(1.0)+(1.5)+(1.2)+(1.2) +(1.1)=20 H mobiles

P2 : composition 4A, 3L, 1N, 1G, 1M, 1R, 1S, 1H

Soit d’après le tableau en annexe:
N(HmobilesP1)= (4.1)+(3.1)+(1.3)+(1.1)+(1.1)+(1.5)+(1.2)+(1.2)=21 H mobiles

-Séquence :

Celle de P2
ALANGMARSHALL

Car Alan G. Marshall est le papa du FT-ICR avec Comisarov !!!

7
☺ FIN DE L’EPREUVE ☺