3ème partie (Isabelle Fournier) : Spectrométrie de Masse

Durée conseillée : environ 50 minutes.

CORRIGE
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I. Question de Cours (temps conseillé 25 min) (9 points)

Revoir cours.
Les atomes composant les biomolécules présentent des isotopes stables, de masses
atomiques différentes dans des ratios naturels différents. La combinaison de plusieurs de
ces atomes pour former les molécules CxHyNzOw conduit à la formation d’une
combinaison de molécules avec différents isotopes qui donnent naissance en
spectrométrie de masse à l’observation de massifs de pics ou massifs isotopiques.
L’allure du massif isotopique est d’autant plus complexe que le Mw du composé mesuré
est élevé et peut entraîner l’existence de massifs particuliers lorsque des atomes avec des
distributions isotopiques particulières sont présents dans la composition des molécules (eg.
Cl, Br,…). La distribution isotopique étant simplement relié aux atomes composant la
molécule et leur nombre, ces distributions peuvent être prédites par calculs et simulées.
Avec un peu d’habitude, l’allure du massif isotopique telle que observée en MS permet
sans calcul d’évaluer rapidement le Mw du composé (cf exemples du cours).
Le 1er pic de la distribution isotopique est appelé pic monoisotopique (puisqu’il
correspond à une composition unique type C12H1N14O16. La mesure du m/z de ce pic
monoisotopique permet de remonter au calcul de la Masse dite Monositopique du
composé (Mwmono). La mesure du m/z correspondant au barycentre de la distribution,
quant à lui, permet de remonter à la Masse dite Moyenne (Mwmoy) de la molécule. Si le
composé est observé sous sa forme [M+H]+ alors Mwmono=m/zmono-M(H).
Dans la source ESI, des ions fortement chargés sont formés pour les composés de
MW>1,000 Da et polaires, donc en particulier pour les biomolécules de type peptide,
protéine et oligonucléotide. Pour calculer Mw, il faut d’abord déterminer l’état de charge
n de l’ion observé (du pic). Le massif isotopique permet de déterminer l’état de charge du
pic, c ar la distance entre 2 pics consécutifs du massif isotopique est égale à 1/n. A partir
de l’état de charge en en prenant le m/zmono ou le m/zmoy il est alors possible de remonter
au calcul de Mw.
Pour les composés de Mw élevé l’état de charge moyen est plus élevé. Comme l’écart entre
les pics du massif est inversement proportionnel à l’état de charge ; pour un état de charge
n=2 ([M+2H]2+) il faut pouvoir séparer des pics espacés de 0.5. Mais pour un état de charge
n=20 ([M+20H]20+, protéine de Mw=20,000 Da par exemple) il faut pouvoir séparer des pics
espacés de 0,05. Dans ces cas, il est important de pouvoir accéder à des instruments
permettant d’accéder à une haute résolution spectrale Rs (Rs caractérise la largeur du pic) et
un haut pouvoir résolutif RP (RP caractérise l’espacement entre les pics). Ces
caractéristiques sont en particuliers liées aux analyseurs de masse équipant les instruments.
Il faut donc des analyzeurs de masse dits Haute résolution (HR) comme les instruments à
Transformé de Fourier (FT) ie. les FT-ICR ou les orbitrappes.
II. Exercice (temps conseillé 25 min) (11 points)
Dyachenko and al., Anal Chem. 2015 87(12): 6095-6102

Il s’agit de l’analyse par ESI en mode positif d’un anticorps couple à un médicament.
L’AC peut être seul ou porter plusieurs molécules de médicaments.
Il s’agit de déterminer le Mw de l’AC et le nombre de médicaments accrochés par réaction sur
l’AC.

1. Expliquer à quoi correspondent les cinq séries de pics observées Figure 2 compte-tenu de
l’instrument utilisé pour les analyses.
L’analyse est effectuée sur un instrument équipé d’une source ESI en mode positif. Compte-
tenu de la masse d’un AG de type IgG (environ 150,000 Da), il faut s’attendre à observer une
distribution d’états de charge.
Chaque série correspond à une distribution d’état de charge différente.
Série orange : AC seul sans MMAE
Série Verte : AC + X MMAE
Série Rouge : AC + Y MMAE
Série Violette : AC + Z MMAE
Série Bleue : AC + W MMAE

2. Quelle aurait été l’allure du spectre sur un instrument équipé d’une source MALDI.
La source MALDI conduit à beaucoup moins d’états de charge que la source ESI. EN général,
en MALDI, même pour les composés de Mw élevé, l’ion monochargé est toujours observé. On
se serait donc attendu à ce que les pics soient observés à des m/z plus élevés soit environ m/z
150,000 pour le monochargé de type [M+H]+, m/z 75,000 pour le [M+2H]2+, m/z 50,000 pour
[M+3H]3+ etc. On attend également une distribution d’états d charge plus restreinte. Il est
même possible de se poser la question s’il sera possible d’observer l’AC car en fonction de
l’analyseur ou de la combinaison d’analyseur utilisée des m/z aussi peuvent être ne dehors de
la gamme accessible par l’analyseur. Seuls les ToF ont une gamme de m/z accessible
totalement illimitée. Ici, l’instrument utilisé est un Q-Orbitrap conventionnel, il ne sera donc
pas possible d’observer les ions formés en MALDI su ce type d’équipement. Il ne sera donc pas
possible d’obtenir un spectre.

3. Expliquer comment à partir de ces séries de signaux il est possible de remonter à

l’attribution des pics puis au calcul de la masse.
Il est possible de déterminer le Mw d’un composé à partir de sa distribution d’états de charge. Pour cela
il faut d’abord déterminer l’état de charge n de chaque pic, ce qui est obtenu par l’utilisation de la
formule :
I
Distribution d’états
de charge
n+1
n
M 2 1
n
M1  M 2
m/z
M2 M1
Après avoir attribué les états de charge, il est possible de recalculer Mw pour chacun des pics.

Mw  n  M 1  (n  M ( H ))
4. Calculer la masse moléculaire Mw de chacun des conjugués à l’aide des données du
Tableau 1 et des Figure 2 et 3.
En démarrant avec la 1ère série, (série orange) qui, a priori, correspond à l’AC seul, et en
considérant que les ions observés correspondent à la distribution d’état de charges pour des
ions protonés :
Si l’on prend M1= 6314.03 et M2= 6050.98 alors :
M2 1 6050.98  1
n   22,99  23
M 1  M 2 6314.03  6050.98
Donc M1 correspond à [M+23H]23+ et M2 à [M+24H]24+
Et Mw  n  M 1  ( n  M ( H )  ( 23  6314 .03)  ( 23  1.01)  145199.46
D’où l’attribution suivante :
Série 1 (Orange)
m/z observé Ion Mw (Da) Mwmoy (Da)
5808.98 [M+25H]25+ 145199.25
6050.98 [M+24H]24+ 145199.28
6314.03 [M+23H] 23+ 145199.46
22+ 145199.33 Da
6600.98 [M+22H] 145199.34
6915.26 [M+21H] 21+ 145199.25
7260.98 [M+20H]20+ 145199.40

On procède de même pour les autres séries, d’où :

Série 2 (Verte)
m/z observé Ion Mw (Da) Mwmoy (Da)
5914.43 [M+25H] 25+ 147835.50
6160.82 [M+24H] 24+ 147835.44
6428.64 [M+23H] 23+ 147835.49
147835.43 Da
6720.80 [M+22H]22+ 147835.38
7040.79 [M+21H] 21+ 147835.38
7392.78 [M+20H] 20+ 147835.40

Série 3 (Rouge)
m/z observé Ion Mw (Da) Mwmoy (Da)
5788.44 [M+26H] 26+ 150473.18
25+ 150473.23 Da
6019.94 [M+25H] 150473.25
 6270.73 [M+24H]24+ 150473.28
6543.33 [M+23H]23+ 150473.36
6840.70 [M+22H]22+ 150473.18
7166.40 [M+21H]21+ 150473.19
7524.67 [M+20H]20+ 150473.20

Série 4 (Violette)
m/z observé Ion Mw (Da) Mwmoy (Da)
5889.82 [M+26H] 26+ 153109.06
6125.37 [M+25H]25+ 153109.00
6380.55 [M+24H] 24+ 153108.96
23+ 153109.05 Da
6657.93 [M+23H] 153109.16
6960.51 [M+22H] 22+ 153109.00
7291.92 [M+21H] 21+ 153109.11

Série 5 (Bleue)
m/z observé Ion Mw (Da) Mwmoy (Da)
5991.15 [M+26H] 26+ 155743.64
6230.75 [M+25H] 25+ 155743.50
6490.32 [M+24H]24+ 155743.68 155743.63 Da
6772.47 [M+23H] 23+ 155743.81
7080.26 [M+22H] 22+ 155743.50

5. Déterminer pour chaque espèce le nombre de molécules de Vedotin conjuguée.

Série 1 orange : AC seul sans MMAE, Mw=145199.33 Da
Série 2 Verte : AC + X MMAE, Mw=147835.43 Da
Série 3 Rouge : AC + Y MMAE, Mw=150473.23 Da
Série 4 Violette : AC + Z MMAE, Mw=153109.05 Da
Série 5 Bleue : AC + W MMAE, Mw=155743.63 Da

M (Série2-Série1)=147835.43-145199.33=2636.10 Da = 2 x 1318.05,
Soit 2 molécules de Vedotin.
M (Série3-Série1)=150473.23-145199.33= 5273.90 Da = 4 x 1318.47,
Soit 4 molécules de Vedotin
M (Série4-Série1)=153109.05-145199.33=7909.72=6 x 1318.29 Da,
Soit 6 molécules de Vedotin
M (Série5-Série1)= 155743.63-145199.33=10544.3=8 x 1318.29 Da,
Soit 8 molécules de Vedotin

6. En déduite à quel nombre de molécules de Vedotin correspond le conjugué le plus

représenté après la réaction de couplage
La série la plus intense est la série rouge (série 3) qui correspond donc à 4 molécules de
Vedotin attachée à l’AC.

----------------Fin 3ème partie ----------------