UNIVERSITE SIDI MOHAMED BEN ABDELLAH

FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES DE FES

Projet de Fin d’Etudes

Licence Sciences & Techniques
Biotechnologie et Valorisation des Phyto-Ressources

Multiplication végétative in vitro du noyer à partir

du bourgeon axillaire /
Analyse de certains paramètres biochimiques chez le
prunier var. "Angeleno " soumis à une irrigation
déficitaire continue

Présenté par : ZOUHAR Manal

Encadré par :

- Dr Kajji A. (INRA-Meknès)
- Pr El Ghadraoui L. (FST-Fès)
- Dr Razouk R. (INRA-Meknès)

Soutenu le : 06/06/2018
Devant le jury composé de :

 Mr. Kajji A. (INRA-Meknès)

 Mr. El Ghadraoui L. (FST-Fès)
 Mr. Razouk R. (INRA- Meknès)
 Mme Benjelloun M. (FST-Fès)

Année universitaire : 2017/2018

 Dédicace

A mes chers parents,

Aucune dédicace ne saurait exprimer mon respect, mon amour éternel et ma
considération pour les sacrifices que vous avez consenti pour mon instruction et
mon bien être.
Que ce modeste travail soit l’exaucement de vos vœux tant formulés, le fruit de
vos innombrables sacrifices, bien que je ne vous en acquitterai jamais assez.
Puisse Dieu le plus haut, vous accorder santé, bonheur et longue vie et faire en
sorte que jamais je ne vous déçoive.

A mes chers frères : Noubir et Yassine,

En témoignage de mon affection fraternelle, de ma profonde tendresse et
reconnaissance, je vous souhaite une vie pleine de bonheur et de succès et que
Dieu, le tout puissant, vous protège et vous garde.

A tous ceux qui me sont chers et proches,

A mes chers ami(e)s, et enseignants.

Manal Zouhar
 Remerciements
Je ne saurai commencer ce rapport sans remercier ALLAH, le tout puissant, le tout
miséricordieux, qui m’a donné Grâce et bénédiction pour mener à terme ce travail.

Je tiens à remercier spécialement mon encadrant Monsieur Kajji Abdellah spécialiste en

Agrophysiologie des arbres fruitiers et coordinateur de l’unité « Agronomie et Physiologie
végétale » du Centre Régional de la Recherche Agronomique de Meknès. Tout au long de ce
travail, il a su m’apporter un soutien constant, une disponibilité, une écoute, une confiance
et des conseils précieux et avisés à la hauteur de ses compétences et de ses réelles qualités
humaines.

Mes sincères remerciements et ma gratitude vont aussi à Monsieur El Ghadraoui Lahsen

professeur au département de biologie de la faculté des sciences et technique de Fès. Je
voudrai qu’il trouve ici toute ma reconnaissance pour ses encouragements, ses conseils, ses
recommandations, le temps qu’il m’a consacré et sa bienveillance.

Je remercie également Monsieur Razouk Rachid pour ses disponibilités et ses conseils durant
ce stage.

Je souhaite aussi remercier Madame Benjelloun Meryem professeur à la faculté des sciences
et technique de Fès, qui me fait l’honneur de juger ce travail.

Ce travail n’aurait pas eu lieu sans l’aide inestimable de la doctorante Mlle Soufana Safih.
Je la remercie vivement pour le temps précieux qu’elle a bien voulu m’accorder, pour son
accueil au laboratoire de Biotechnologie, son aide sans limites et sa bonté.

Enfin, je remercie chaleureusement tout le personnel de l’INRA Meknès ainsi que mes
collègues pour leur esprit coopératif et leur aide.
 ‫ملخص‬

‫حى حمُُى يذي لذرة انبزلىق صُف أَجُهُُى يٍ خالل ححهُم ثالثت عىايم كًُُائُت لابهت نهخغُُز‪ .‬أجزَج انخجزبت فٍ بسخاٌ‬
‫انبزلىق فٍ يُطمت عٍُ حىجذاث انخجزَبُت يع حطبُك َظايٍُ نهًُاِ‪ :‬انُظاو االول (‪ ٪011‬يٍ انكًُت اإلجًانُت نهخبخز)‬
‫وانُظاو انثاٍَ (‪ ٪57‬يٍ هذِ انكًُت)‪ .‬وأظهزث انُخائج فعانُت انًعهًاث انبُىكًُُائُت انخٍ حى دراسخها نخمُُى آثار َذرة انًُاِ‬
‫عهً أشجار انبزلىق صُف أَجُهُُى‪ .‬فٍ حٍُ نى َؤثز َمص يُاِ انزٌ عهً حزاكى انسكزَاث انمابهت نهذوباٌ فٍ انفاكهت‪ .‬يٍ‬
‫َاحُت أخزي‪ ،‬نىحع فٍ انُظاو انثاٍَ سَادة طفُفت فٍ يحخىي األحًاض األيُُُت وانبىنُفُُىل‪ .‬وفًُا َخعهك بخكثُز شجزة‬
‫انجىس بىاسطت انبزعى انثاَىٌ )‪ ،(in vitro‬اباَج انذراست بأٌ انىسط ‪ DKW‬هى األكثز يالءيت نخكثُز انجىس باسخعًال‬
‫هذِ انطزَمت‪.‬‬
 Résumé

La capacité d’adaptation au déficit hydrique de la variété du prunier Angeleno a été évaluée à

travers l’analyse de trois paramètres biochimiques. L’essai a été entrepris dans un verger de
prunier en production au domaine expérimental d’Aïn Taoujdate avec l’application de deux
régimes hydriques : irrigation à la demande (100% ETc) et irrigation déficitaire (75% ETc).
Cette dernière consiste en une restriction de 75% de la dose calculée en fonction de l’ET0. Les
résultats ont montré l’efficacité des paramètres biochimiques étudiés pour l’appréciation des
effets du stress hydrique sur prunier. Chez la variété "Angeleno", la contrainte hydrique n’a
pas affecté l’accumulation des sucres solubles dans les fruits. Par contre, une légère
augmentation de la teneur en acides aminés et en polyphénols a été observée au niveau de
l’irrigation déficitaire. En ce qui concerne la multiplication in vitro du noyer, le milieu DKW
s’est révélé le plus adapté pour la multiplication in vitro. En effet, le maximum de bourgeons
axillaires développés a été observé pour ce milieu de culture.

Mots clés : Prunier, déficit hydrique, noyer, culture in vitro, bourgeons axillaires.
 Abstract

Physiological behavior of a plum cultivar ("Angeleno") submitted to water deficit adaptation

capacity of plum variety ″Angeleno″, was evaluated based on tree biochemical parameters.
The experiment has been conducted in a plum orchard by the application of two water
regimes (100% Etc and 75% ETc), respectively, full irrigation and deficit irrigation
(restriction of 75% of the amount of applied water in control trees). The variety Angeleno do
not showed any variation of total soluble sugar content of fruit. On the other hand, the result
showed an increase of amino acids content and polyphenols content of fruit. Concerning the
in vitro propagation of walnut, DKW medium seems to be the most suitable medium for it.
Indeed, the maximum of developed axillary buds has been observed for this culture medium.

Keywords: Plum, water stress, walnut, in vitro culture, axillary bud.

 Liste des figures

Figure 1 Zone d’action du Centre Régional de la Recherche Agronomique de p3

Meknès. Source : Site INRA
Figure 2 Arbre de noyer commun (Juglans regia L.) p4

Figure 3 Structure du fruit drupacé et de la graine du noyer Juglans regia L. p5

(Encyclopædia Universalis France)
Figure 4 Répartition du noyer commun (Juglans regia L.) dans le monde p6
(Monographie Noyer Ctifl)
Figure 5 Hotte à flux laminaires utilisée dans nos manipulations p12
Figure 6 Culture in vitro des explants de Juglans regia L. p14
Figure 7 Fruits du prunier cv. Angeleno p15
Figure 8 Plants du prunier au Domaine Expérimental d’ Aïn Taoujdate p15
Figure 9 Dosage des sucres totaux par la méthode au phénol-sulfurique p17
Figure 10 Dosage des polyphénols totaux par la méthode du réactif de Folin p18
Ciocalteu
Figure 11 Explants contaminés par champignons p19
Figure 12 Oxydation du milieu de culture et brunissement des explants p20
Figure 13 Débourrement d'un bourgeon axillaire sur le milieu DKW après 3 p20
semaines de l'introduction
Figure 14 Débourrement d'un bourgeon axillaire sur le milieu EG après 3 p20
semaines de l'introduction
Figure 15 Entrée en croissance du bourgeon axillaire après une semaine dans le p21
milieu DKW
Figure 16 Entrée en croissance du bourgeon axillaire après une semaine dans le p21
milieu MS
Figure 17 Variation de la teneur en sucres solubles totaux des fruits de prunier p22
("Angeleno") sous deux régimes hydriques différents (irrigation à la
demande et irrigation déficitaire)

Figure 18 Variation de la teneur en acides aminés des fruits de prunier p23

("Angeleno") sous deux régimes hydriques différents (irrigation à la
demande et irrigation déficitaire)
Figure 19 Variation de la teneur en polyphénols totaux des fruits de prunier p23
("Angeleno") sous deux régimes hydriques différents
 Liste des abréviations

INRA Institut National de la Recherche

Agronomique

CRRA Centre Régional de la Recherche

Agronomique
DPA Directions Provinciales d’Agriculture
MAPM Ministère de l'Agriculture et de la Pêche
Maritime
ONU Organisation des Nations Unies
RDI Regulated deficit irrigation
ETc Evapotranspiration de la culture
ET0 Evapotranspiration potentielle
DKW Driver and Kuniyki Walnut
MS Murashige and skoog
EG Eau gélosée
Kc Coefficient cultural
AIB Acide Indole 3-Butyrique
BAP Benzyl-amino-purine
SST Sucres solubles totaux
A.A Acides aminés totaux
HMF Hydroxy-méthylfurfural
AG Acide gallique
 Sommaire
Introduction générale ............................................................................................................... 1
Structure d’accueil : INRA...................................................................................................... 2
Synthèse bibliographique ........................................................................................................ 4
1. Généralités sur le noyer commun ....................................................................................... 4
1.1 Classification botanique .............................................................................................. 4
1.2 Description botanique .................................................................................................. 4
1.3 Origine ........................................................................................................................ 5
1.4 Marché mondial ........................................................................................................... 5
1.5 Noyer au Maroc ........................................................................................................... 6
1.6 Exigences édapho-climatiques du noyer commun ...................................................... 6
1.7 Multiplication .............................................................................................................. 7
1.7.1 Reproduction sexuée .............................................................................................. 7
1.7.2 Multiplication végétative ....................................................................................... 7
2. Prunier ................................................................................................................................. 9
2.1 Importance des rosacées fruitières au Maroc .............................................................. 9
2.2 Culture du prunier au Maroc ....................................................................................... 9
2.3 Caractères généraux du prunier ................................................................................. 10
2.4 Effet de l’irrigation déficitaire sur le prunier............................................................. 11
2.5 Caractères biochimiques en rapport avec la qualité du fruit ..................................... 11
2.5.1 Importance des composés phénoliques ................................................................. 11

Matériel et méthodes .............................................................................................................. 12

A) Micropropagation in vitro du noyer .................................................................................. 12
1. Matériel végétal ................................................................................................................ 12
2. Stérilisation du matériel .................................................................................................... 12
3. Désinfection du matériel végétal ...................................................................................... 12
4. Mise en culture .................................................................................................................. 13
B) Paramètres biochimiques du prunier ................................................................................. 15
1. Site expérimental .............................................................................................................. 15
2. Matériel végétal ................................................................................................................ 15
3. Préparation des extraits………...…………………………….…………..………………16
4. Dosage des sucres solubles totaux .................................................................................... 16
4.1 Principe ....................................................................................................................... 16
4.2 Protocole ..................................................................................................................... 16
5. Dosage des acides aminés totaux ...................................................................................... 17
6. Dosage des polyphénols totaux ......................................................................................... 17
6.1 Principe ....................................................................................................................... 17
6.2 Protocole ..................................................................................................................... 18

Résultats et discussion ............................................................................................................ 19

A) Micropropagation in vitro du noyer .................................................................................. 19
1. Infection ............................................................................................................................ 19
2. Comparaison des milieux d’initiation ............................................................................... 19
3. Comparaison des milieux de développement ................................................................... 20
B) Paramètres biochimiques du prunier ................................................................................. 21
1. Teneur en sucres solubles totaux ...................................................................................... 21
2. Teneur en acides aminés totaux ........................................................................................ 22
3. Teneur en polyphénols totaux ........................................................................................... 23
Conclusion ............................................................................................................................... 24
Annexes……………………………………………………………………………………....27
 Introduction générale

Située au centre nord du Maroc, intégrant en partie la plaine de Saïss et côtoyant les chaînes
montagneuses du Rif et du Moyen Atlas, la région de Fès-Meknès présente des atouts majeurs
pour le développement de l’arboriculture fruitière.
Le Ministère de l’Agriculture, de la Pêche Maritime, du Développement Rural et des Eaux et
Forêts accorde d’ailleurs, une attention particulière à ces cultures, notamment via une série de
mesures incluses dans le Plan régional "Maroc Vert".
Toutefois, la croissance et le développement des rosacées fruitières, entre autre le prunier,
exige un apport en eau régulier et suffisant notamment pendant la période estivale. Cependant,
la productivité reste très modeste, en raison de diverses contraintes, dont la réduction des
disponibilités en eau, qui constitue un défi majeur.
Pour satisfaire aux exigences d’une agriculture durable, l’arboriculture fruitière doit donc
mieux gérer ses besoins en intrants et faire d’importantes économies en eau, en réduisant les
apports via l’irrigation, en particulier en milieu méditerranéen.
Des techniques de gestion de l’efficience d’eau ont été mises en place à l’Institut national de
la recherche agronomique de Meknès notamment l’effet de l’irrigation déficitaire raisonnée
sur rosacées fruitières.
Les résultats obtenus ont montrés que l’eau d’irrigation peut être économisée pendant les
périodes de ralentissement de la croissance des fruits, sans qu’il y ait d’effets négatifs majeurs
sur la production et la croissance végétative des arbres.
Le présent projet de stage de fin d’étude a été effectué au sein de l’Unité Agronomie et
Physiologie Végétale relevant du Centre Régional de la Recherche Agronomique Meknès
(CRRA Meknès) est subdivisé en deux parties :
- Multiplication végétative du noyer, par culture in vitro du bourgeon axillaire.
- Analyse de quelques paramètres biochimiques des fruits de prunier soumis à l’irrigation
déficitaire.
Pour ce faire, nous avons dans un premier temps mené une recherche bibliographique sur le
noyer et le prunier, en précisant la classification, description botanique et quelques
particularités de chacun. Dans un second temps, nous avons donné notre méthodologie de
travail avec une description du matériel végétal et les conditions de culture suivis d’une
discussion des résultats obtenus. Et finalement, une conclusion générale résumant les
principaux acquis de cette étude.

1
 STRUCTURE D’ACCUEIL : INRA
C’est un établissement public, sous la tutelle du ministère Marocain de l'agriculture et de la
pêche maritime, du Développement Rural et des Eaux et Forêts. Il s'agit d'une institution de
recherche agricole et comprend des laboratoires de recherche et des stations expérimentales
réparties à travers tout le royaume.

 Centre régional de la recherche agronomique Meknès (CRRA Meknès)

Le CRRA Meknès, une institution à profond ancrage historique, développe une stratégie de
recherche actualisée pour la production agricole, connaissances et méthodes qui répondent
aux besoins de sa zone d’action qui couvre nombreuses Directions Provinciales d’Agriculture
(DPA) à savoir Boulemane, El Hajeb, Fès, Ifrane, Khénifra, Meknès, Taounate, Taza et
Sefrou.
1) Missions et zones d’action du CRRA Meknès

Le centre régional de recherche agronomique s’inscrit dans l’un des dix centres de l’Institut
National de Recherche Agronomique crée en 1989. C’est un institut visant à développer
l’agriculture durable, de par une meilleure connaissance du milieu et le développement des
technologies performantes. Pour cela les recherches du centre accompagnent la mise en œuvre
des plans régionaux adoptés dans le cadre du Plan " Maroc Vert" . Ainsi le centre intègre une
recherche ciblée sur le développement durable ;

 Gestion intégrée de l’arboriculture fruitière

 Intensification durable des grandes cultures
 Diversification des systèmes de culture
 Gestion des ressources naturelles et dynamiques des espaces montagnards
 Renforcement des capacités et transfert de technologies
Pour répondre à ces différentes missions, le CRRA de Meknès est constitués de 25 chercheurs
spécialisés dans différentes disciplines des sciences agronomiques et humaines, 10
techniciens de recherche, 1 administrateur et 42 agents.
La zone d’action du CRRA de Meknès couvre 7.3 millions d’hectares, soit 10% du territoire
national (figure 1). Les agrosystèmes dominants dans la région sont le système montagnard, le
semi-aride et le subhumide. Les conditions climatiques et édaphiques particulières dans
chaque système ont pour résultante la présence de cultures différentes selon les stations
expérimentales.

2
 Figure 1 : Zone d’action du Centre Régional de la
Recherche Agronomique de Meknès

2) Localisation et financement
Le centre de recherche dont le présent projet a été réalisé, se situe à Meknès, une des quatre
villes impériales du Maroc, qui se situe au Nord du Maroc.

La dotation financière du CRRA vient de l’Etat, c’est un établissement dépendant de la

fonction publique. Ainsi l’Etat leur octroie un budget annuel par le biais du ministère de
l’agriculture. Le centre est appelé à gérer les ressources financières d’une façon optimale pour
satisfaire les besoins en recherche.
3) Organisation
Au niveau du centre, il existe deux services : service de recherche-développement et service
administratif ; quatre unités de recherche. Le centre est équipé d’installations à ambiance
contrôlée (chambres froides, chambres de cultures, serres), de stations météorologiques,
laboratoires et de terrains agricoles d’environ 600 hectares pour la conduite des essais et la
conservation des collections vivantes réparties sur trois domaines expérimentaux.
Le présent projet de stage de fin d’étude à été réalisé au niveau de l’unité de recherche en
agronomie et physiologie végétale, sous la direction de Monsieur Kajji Abdellah,
coordinateur de cette unité, spécialisé en agrophysiologie des arbres fruitiers.

3
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

1. GENERALITES SUR LE NOYER COMMUN

1.1 Classification botanique

Embranchement : Phanérogames
S/embranchement : Angiospermes
Classe : Dicotylédones
Ordre : Juglandales
Famille : Juglandacées
Genre : Juglans
Espèce : Juglans regia L.

Figure 2 : Arbre de noyer commun (Juglans regia)

1.2 Description botanique

Le noyer commun, Juglans regia L., est la seule espèce classée dans la section des
Dioscaryons (Germain et al., 1999). Son système radiculaire pivotant avec un chevelu
abondant et ramifié, recouvert de mycorhizes. Le tronc est puissant, atteignant 4 à 5 m de
hauteur pour 6 à 8 m de circonférence et plus. Les branches à port érigé durant les 30 ou 40
premières années, prenant un aspect pleureur dans les années qui suivent (Bretaudeau et
Fauré, 1990).

4
Ses feuilles sont constituées par un petit nombre de folioles (7 à 9) qui sont peu ou pas
dentées et glabres. Ses noix ont une coque non lacuneuse, avec des cloisons primaires et
secondaire minces (figure 3).

Figure 3 : Structure du fruit drupacé et de la graine du noyer

Juglans regia L. (Encyclopædia Universalis France)

1.3 Origine

Le noyer commun, Juglans regia L. est originaire d’Asie Centrale, plus précisément des
régions montagneuses de l’ouest de l’Himalaya constituées par le Cachemire, le Tadjikistan et
le Kirghizstan (Germain et al., 1999).

1.4 Marché mondial

L’aire de culture du noyer couvre la plupart des continents, avec une prédilection pour
l’hémisphère nord (figure 4). En tête des pays producteurs viennent la Chine, les Etats-Unis,
l'Iran, la Turquie, le Mexique et l'Ukraine. Parmi ces pays producteurs, seuls les Etats-Unis
sont largement exportateurs. La France, avec une production de près de 38 000 tonnes/an ces
dernières années, se place au 2ème rang mondial, derrière les Etats-Unis pour les exportations
de noix coques, suivie de près, par la Chine, le Mexique, le Chili et l'Ukraine.

5
 Figure 4 : Répartition du noyer commun (Juglans regia L.) dans
le monde (Monographie Noyer Ctifl)

1.5 Noyer au Maroc

La culture du noyer commun (Juglans regia L.) couvre au Maroc une superficie d’environ
4500 ha avec une production estimée à 7000 t de noix non décortiquées. Les plantations
existantes sont des populations situées dans les vallées montagneuses ayant des altitudes
situées entre 1200 m et 1700 m comme celles d'Azilal, Amezmiz, Ourika, Rif, Midelt et Rich
(Oukabli et Mamouni, 2006).

1.6 Exigences édapho-climatiques du noyer commun

1.6.1 Climat
Le noyer est très sensible à l’excès d’humidité atmosphérique et est assez exigeant en chaleur,
au cours de la saison de végétation. On estime qu’il lui faut une température supérieure à
10°C, pendant au moins 6 mois. La majorité des variétés de noyer ont besoin d’une moyenne
de 800 heures de froid (inférieur à 7°C) pour assurer une production normale.
Juglans regia L. est une espèce qui peut supporter les grands froids, mais elle redoute
particulièrement les gelées printanières et les vents violents. La pluviométrie souhaitable pour
cette espèce est de 650 à 700 mm, bien répartis (Serrar, 2014).

1.6.2 Sol
Le noyer pousse dans tous les types de sols, bien que redoutant l'argile ou les terrains
compacts, ainsi que l'eau stagnante. Par contre, il s'accommode fort bien du calcaire.

6
D’autres types du sol, tels que les sols d'alluvions, silico-argileux, argilo-calcaires, les
plateaux calcaires, les sols siliceux, pierreux ou caillouteux, lui sont également favorables.

1.7 Multiplication

La multiplication du Noyer peut se faire, soit par reproduction sexuée à partir de la graine,
donc, d’un semis de noix, soit par multiplication végétative, ou asexuée par greffage ou
micropropagation.

1.7.1 Reproduction sexuée

Dans de nombreux pays, le noyer est multiplié directement par semis, ce qui conduit à une
grande hétérogénéité des vergers, car ce mode de multiplication ne permet par de reproduire à
l’identique, les caractéristiques des arbres sur lesquels, ont été collectées les semences
(Germain et al., 1999). Ces dernières sont généralement effectuées au printemps, vers la mi-
avril sur une terre suffisamment réchauffée, en disposant les noix de 4 à 5 cm de profondeur
et avec une distance sur la ligne en moyenne de 2 cm. Le délai de germination est de 3
semaines environ, avec un taux de réussite de 50 à 65 %.

1.7.2 Multiplication végétative

1.7.2.1 Greffage du noyer

Selon Bretaudeau et Fauré (1991), le greffage étant la méthode de multiplication la plus
employée, car il hâte la mise à fruit de cette espèce, en outre lui seul assure la transmission
intégrale de tous les caractères du greffon.
De nombreux types de greffes peuvent être employés. Le greffage en Cadillac sur table
racines nues est la technique la plus couramment utilisée. Il se pratique à l’intérieur en hiver,
de janvier à mars. Le greffon taillé en biseau sera inséré dans une incision au collet du porte-
greffe.

1.7.2.2 Micropropagation
La micropropagation est un mode de reproduction asexuée artificielle, elle comprend un
ensemble de méthodes faisant intervenir, d’une part des éléments d’asepsie, et d’autre part la
mise en place d’un environnement parfaitement contrôlé : milieux définis pour chaque espèce
végétale, conditions optimales de température, photopériode et d’humidité. La prolifération in
vitro est une alternative efficace par rapport aux autres méthodes de multiplication, comme le
greffage, qui est rapide et permettant une stabilité génétique.

7
 a) Facteurs de régénération et de croissance
Parmi les facteurs influant sur la régénération in-vitro, on en distingue :
Effet de l'explant
 Age physiologique et ontogénique de l'organe
Généralement, dans les cultures in vitro, les explants les plus jeunes (embryons immatures,
jeunes feuilles, méristèmes, etc.) sont les plus privilégiés. Leur état juvénile favorise plus de
possibilités de régénération (Vidalis et al., 1989). Souvent, ce sont les tissus provenant
d'embryons qui expriment le plus souvent, d'une manière nette et reproductible, l'aptitude à la
régénération, suivis de loin par les cotylédons (Saadi et Hamdani, 2007).
 Epoque du prélèvement
Ce problème se pose surtout, pour les espèces vivaces, on peut distinguer un stade de vie
active et un stade de vie ralentie de la plante, ce qui conduit les explants à développer des
réactions différentes, en culture in-vitro. Cette différence peut être expliquée par la
modification des équilibres internes des régulateurs de croissance (auxines, cytokinines,
gibbérelline) lors des différentes saisons (Vidalis et al., 1989).
Effet du milieu de culture
Avec le développement des cultures de tissus, divers milieux de base comprenant des sels
inorganiques, des composés organiques (sucres, vitamines et régulateurs de croissance) ont
été progressivement utilisés. Les milieux de culture sélectionnés doivent être adaptés aux
besoins nutritifs de la plante soumise à l'étude, afin de laisser s'exprimer pleinement son
potentiel génétique. Les principaux constituants d'un milieu de culture sont généralement,
représentés par : les macro et les microéléments, les sources carbonée et azotée, les vitamines
et régulateurs de croissance (Vidalis et al., 1989).

b) Facteurs d’incubation
 Photopériode
La lumière est un facteur déterminant pour la culture in vitro des plantes. De façon générale,
le début de croissance nécessite une faible intensité lumineuse (500 à 1000 lux) avec 12 à 16
heures de photopériode (Bommineni et Jauhar, 2003). Pour la rhizogenèse, l’auxine endogène
produite par les plantes, pourrait être plus active lorsque ces plantes séjournent à l’obscurité.
L’obscurité limite l’oxydation des composés phénoliques et optimise l’expression des
phytohormones. Ceci impliquerait que l’obscurité réduirait la dominance apicale de la pousse
primaire et favoriserait par conséquent la prolifération du tissu méristèmatique (Kone et al.,
2010).

8
  Température
Globalement, la température des chambres de culture est de l’ordre de 22° à 25°C (Kone et
al., 2010). Il a été souligné que l’incubation des vitroplants à des températures non régulières
incite la non régularité de l’évapotranspiration du plant, et par conséquent une diminution de
sa croissance (Tchetche, 2008).

2. PRUNIER

2.1 Importance des rosacées fruitières au Maroc

La diversité des conditions climatiques confère au Maroc une vocation de production de fruits
en général, et de rosacées fruitières en particulier. Ce secteur qui a connu une expansion
considérable à partir du début des années 80, fourni près de 13 Millions de journées de travail,
en milieu rural, et contribue à la satisfaction des besoins du marché local, en fruits frais et des
unités agro-industrielles. Grand utilisateur des facteurs de production (engrais, pesticides, eau,
équipement…), c’est aussi un important pourvoyeur d’activités complémentaires (à l’exemple
de l’apiculture pour la pollinisation…) et grâce à l’exportation, une source non négligeable de
devises (Mahhou, 2010).
Les rosacées fruitières occupent une superficie de plus de 134.714 ha, répartis entre rosacées à
noyau (83%) et rosacées à pépins (17%). Par le nombre élevé d’espèces qui le composent, ce
secteur intéresse plusieurs régions au niveau national avec, cependant, des pôles de
concentration principalement, au niveau de la région "Marrakech-Tensift AlHaouz", "Fes-
Meknès" et "Souss Massa Draa". L’amandier se trouve localisé principalement, au niveau des
régions "Taza-Taounate-AlHoceima", "Souss Massa Draa", ainsi que "Marrakech-Tensift
AlHaouz". La production est variable, selon l’espèce et la variété, mais reste tributaire des
conditions de culture et des conditions climatiques de l’année (MAPM, 2012).

2.2 Culture du prunier au Maroc

Selon l’ONU, la culture de prunes et prunelles au Maroc a connu un développement rapide,
passant de 8 900 ha en 2010 à 14 900 ha environ en 2016.
La production nationale oscillait au début des années 2000, entre 39 000 et 58 000 tonnes de
prunes fraiches par an. En effet, entre 2008 et 2013, la production a fortement augmenté par
rapport à 2005, mais elle a varié chaque année (entre 63000 T/an et 87000 T/an), sans que se
dégage une tendance à la hausse bien visible. Ces différences interannuelles sont dues à la

9
variabilité climatique et au phénomène de l’alternance assez fréquent chez le prunier (Oukabli
et Mamouni, 2005).

2.3 Caractères généraux du prunier

2.3.1 Exigences climatiques
Le prunier est considéré comme un arbre rustique, car il résiste aux froids de l’hiver et croit
en tous lieux. Néanmoins les exigences climatiques diffèrent, selon les groupes variétaux
(Gautier, 1988). Les pruniers européens préfèrent les climats continentaux aux hivers
rigoureux, aux saisons nettement tranchées. Les pruniers japonais se développent de
préférence, dans la zone méditerranéenne.
Le prunier se montre très sensible au gel de printemps à cause de sa floraison précoce. Il
préfère des printemps chauds et secs. Les fortes hygrométries sont favorables au
développement de maladies telles que la Rouille, Coryneum et Monilia sur fleurs (Skiredj,
Walali, 2003).

2.3.2 Influence du vent

Le prunier craint le vent et notamment le vent humide venant de la mer ou vent desséchant.

2.3.3 Adaptation au sol

Le prunier est capable de se développer sur une large gamme de sols, de préférence profonds,
bien drainés ; craint les sols légers. Par contre, il redoute les sols secs, très limoneux et sables
très fins avec un pH globalement en dessous de 6 (Bretaudeau et Fauré, 1991).
Il est à noter que les variétés européennes se comportent mieux sur des sols argileux, alors
que les variétés japonaises s’accommodent de sols légers (Skiredj, 2003).

2.3.4 Besoin en eau

La croissance des rameaux étant très rapide de mai à juillet, le prunier présente, durant cette
courte période, des besoins importants en eau (Gautier, 1988). Un volume journalier de 25 à
40 litres/ arbre est nécessaire, durant une période de 5 à 6 mois (Mai à Octobre) pour assurer
une bonne production.
Un manque d’eau en période estivale affecte le grossissement des fruits et l’élaboration des
sucres. A l’approche de la maturité, les doses d’irrigation doivent être réduites pour favoriser
l’accumulation des sucres dans le fruit et faciliter son séchage dans les fours (Oukabli et
Mamouni, 2005).

10
 2.4 Effet de l’irrigation déficitaire sur le prunier

L’irrigation déficitaire consiste à apporter un volume d’irrigation saisonnier ne satisfaisant

que partiellement, les besoins hydriques de la plante. L’une des techniques qui commence à
faire l’objet d’une certaine diffusion est celle du déficit hydrique contrôlé "Regulated deficit
irrigation (RDI)". Le concept de RDI a été proposé, la première fois par Chalmers et ses
collaborateurs (1981) pour contrôler la croissance végétative des vergers de pêcher. Ces
auteurs ont constaté qu’une économie d'eau d'irrigation, pourrait être réalisée, sans réduction
significative du rendement.
L’application de deux régimes hydriques 100% de l’ETc et 75% de l’ETc sur un verger de
prunier variété "Angeleno", dans la région de Saïss, a montré qu’une restriction hydrique
raisonnée de 75% de l’ETc, pendant la phase stationnaire du développement du fruit a permis
une augmentation du taux de sucre de 10%, par rapport au témoin 100% ETc, sans pour
autant, affecter significativement, le rendement (Kajji et al., non publié).
Et selon Dbara et ses collaborateurs (2016), le déficit hydrique n’a pas affecté l’accumulation
des sucres solubles dans les fruits sur deux variétés de poirier "Meski arteb" et "Jules Guyot".

2.5 Caractères biochimiques en rapport avec la qualité du fruit

Les fruits présentent une grande diversité de composition, de par leur richesse en composés
primaires et en métabolites secondaires. La nature et la concentration de ces composés sont
sous l’influence de l’environnement et peuvent être modulées par les pratiques culturales
(Génard et al., 2010).

2.5.1 Importance des composés phénoliques

Les composés phénoliques (8000 molécules connues) constituent l’une des principales classes
de métabolites secondaires des plantes. Leurs structures et fonctions sont très diverses. Ils
possèdent, au minimum, un cycle aromatique portant un à plusieurs groupes hydroxyles. Les
principaux polyphénols présents dans les fruits sont les acides phénols (dérivés de l’acide
benzoïque ou cinnamique), les stilbénoïdes et les flavonoïdes, dont les tanins condensés. Ces
métabolites secondaires ont un rôle antioxydant protecteur pour les végétaux, contre les
agressions de l’environnement (température, lumière) ou de pathogènes. Ils assurent d’ailleurs
aussi, ce rôle dans le corps humain (Mehinagic et al., 2011).

11
MATERIEL ET METHODES

A) MICROPROPAGATION IN VITRO DU NOYER

1. MATERIEL VEGETAL
Le matériel végétal utilisé dans le présent travail, appartient à l’espèce Juglans regia L. Il est
composé de rameaux de noyers issus de semis et contenant des bourgeons axillaires.

2. STERILISATION DU MATERIEL
Toutes les manipulations ont été réalisées dans des conditions d’asepsie absolue, les milieux
de culture, les tubes à essai et le papier filtre ont été stérilisés par autoclavage à une
température de 120°C et à une pression de 1 bar pendant 20 minutes. Les pinces et les scalpels
sont stérilisés à sec, dans une étuve à une température de 200°C, pendant 2 heures.

Les parois de la hotte à flux laminaires sont aussi désinfectées à l’éthanol 70%, ainsi que tout
le matériel et les instruments inclus dans la hotte.

Figure 5 : Hotte à flux laminaires utilisée dans nos manipulations

3. DESINFECTION DU MATERIEL VEGETAL

La stérilisation du matériel végétal est effectuée, sous hotte à flux laminaire, suivant un
protocole à base de bichlorure de mercure d’une concentration de 2g/l.

La désinfection consiste en une immersion dans l’éthanol à 70%, pendant 3 min, puis dans
une solution de bichlorure de mercure HgCl2 2g/l pendant 10 min.

12
Après immersion, trois rinçages à l’eau distillée stérile, pendant 10 min chacun, ont été
effectués.

4. MISE EN CULTURE
Les explants de bourgeons axillaires ont été introduits dans deux milieux nutritifs d’initiation
différents : Driver and Kuniyuki walnut (DKW) et l’eau gélosée (EG).

Le milieu DKW est composé d’une combinaison de minéraux, vitamines, saccharose et

complété par une auxine AIB 0.01 mg/1, et une cytokinine BAP à 1 mg/1 (tableau 1). Le pH
est ajusté à 5.6 à l’aide de la solution de NaOH 1N ou HCl 0,1N et le milieu est solidifié avec
de l’agar. L’EG est composé de 7g d’Agar et 30g de saccharose dilués dans 1 litre d’eau
distillée.

Les cultures ont été ensuite placées pendant 22 jours dans une chambre à culture à une
température de 25°C et une photopériode de 16 heures d’éclairement.

Après 3 semaines de l’introduction, les explants sains ont été transféré dans deux milieux de
développement; MS et DKW.

Tableau 1 : Composition du milieu DKW pour un volume total d’un litre et

un pH final de 5,6

Macros éléments 100 ml

Minéraux Micros éléments 100 ml
FeEDTA 20 ml
Vitamines 2 ml
Sucres Saccharose 30 g
Divers Agar 7g
Phytohormones BAP (6-benzylaminopurine) 1mg/l
AIB (acide Indole-3- 0.01 mg/l
butyrique)

13
 Figure 6 : Culture in vitro des explants de Juglans regia L.

Pour cette partie d’étude, nous avons introduit 94 explants par essais ; 20 dans le milieu DKW
et 74 dans l’EG. Dans le premier repiquage, c’est-à-dire environ trois semaines après
l’introduction, nous avons déterminé le nombre d’explants ayant démarré, parmi lesquels
nous avons distingué ceux qui sont sains de ceux qui sont contaminés par des champignons ou
des bactéries. Nous avons ainsi, comptabilisé également, le nombre d’explants non démarrés
de la même façon, et nous avons dénombré également, ceux qui ont été nécrosés par le
bichlorure de mercure. Et finalement, à partir du nombre d’explants sains et ayant démarrés,
en sachant que nous avons démarré du nombre initial des explants, nous avons pu déterminer
le taux de multiplication de chaque milieu. Celui-ci est déterminé de la façon suivante :

𝑇𝑎𝑢𝑥 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑙𝑡𝑖𝑝𝑙𝑖𝑐𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 =

De la même façon, nous avons déterminé le taux de multiplication dans les deux milieux de
développement ; DKW et MS.

14
 B) PARAMETRES BIOCHIMIQUES DU PRUNIER

1. SITE EXPERIMENTAL
La parcelle d’essai est située au Domaine Expérimental de l'Institut National de la Recherche
Agronomique (INRA) d’Aïn Taoujdate. Elle est localisée à 40 km au nord de la ville de
Meknès, dont les coordonnées sont : 33° 56' E, 5 ° 13' N, 499 m.

Le sol est de type argilo-sableux, renfermant une moyenne de 3% de CaCO3, moyennement

riche en matière organique, avec une moyenne de 2,51% dans la couche superficielle (0-30
cm) et 1.58% dans la couche profonde (30-60 cm). Le pH du sol est légèrement alcalin (7,7)
et non salin, avec une moyenne de la conductivité électrique de 0,07 ms/cm dans les premiers
60 cm.

2. MATERIEL VEGETAL
La variété de prunier "Angeleno" a fait l’objet de deux traitements hydriques appliqués à
partir de la nouaison jusqu’à l’entrée en dormance. La dose d’irrigation a été calculée, en se
basant sur l’évapotranspiration potentielle (ET0) et le coefficient cultural (Kc) (Allen et al.,
1998), selon la formule suivante : ETc = ET0 x Kc
Le dispositif expérimental est en "criss-cross ", les deux traitements hydriques sont :
- Irrigation à la demande avec une dose de 100% ETc ;
- Irrigation déficitaire avec une restriction de 75% ETc.
Le suivi a porté sur fruits de dix pruniers de cette variété. Les paramètres biochimiques
analysés sont les sucres totaux, les acides aminés totaux et les polyphénols totaux.

Figure 7 : Fruits du prunier cv. Angeleno Figure 8 : Plants du prunier au Domaine

Expérimental d’Aïn Taoujdate
15
 3. PREPARATION DES EXTRAITS
Les trois paramètres biochimiques ont été extraits en accord avec la méthode de Babu et ses
collaborateurs (2002). En effet, 50 mg de pulpe prélevées de chacun des dix fruits, qui sont
préalablement lyophilisés, ont été broyées dans un mortier en présence de 1ml d’éthanol 80%.

Les dix extraits obtenus sont centrifugés pendant 40 min, sous 4°C à 2000 tr/min et les
surnageants de la centrifugation recueillis sont ensuite, conservés à froid en attente du dosage.

4. DOSAGE DES SUCRES SOLUBLES TOTAUX

Le dosage des sucres solubles totaux a été réalisé suivant la méthode de Dubois et ses
collaborateurs (1956).

4.1 Principe
Le principe repose sur la réaction qui se déroule comme suit: l’acide sulfurique concentré
provoque, à chaud, le départ de plusieurs molécules d’eau à partir des oses. Cette
déshydratation s’accompagne par la formation d’un hydroxy-méthylfurfural (HMF) dans le
cas d’hexose et d’un furfural dans le cas d’un pentose. Ces composés se condensent avec le
phénol pour donner des complexes colorés (jaune-orangé). L’intensité de la coloration est
proportionnelle à la concentration des oses. La densité optique est mesurée à 490 nm à l’aide
d’un spectrophotomètre.

4.2 Protocole
Nous avons mis 50 μl des dix extraits dans des tubes à essai avec 0,5 ml de phénol auxquels
est ajouté 1,5 ml de H₂SO4 concentré suivi d’une agitation immédiatement. Une coloration
jaune-orangée se développe alors et reste stable pendant plusieurs heures.
Les tubes sont ensuite placés dans un bain-marie à 100°C, pendant 5 min. Après
refroidissement, la densité optique est mesurée à 490 nm, contre un blanc dans lequel, 50 μl
d’éthanol 80% a remplacé l’extrait.
Les teneurs sont déterminées en référence à une gamme étalon de glucose (Annexe 1).

16
 Figure 9 : Dosage des sucres totaux par la méthode au phénol-sulfurique

5. DOSAGE DES ACIDES AMINES TOTAUX

Les acides aminés totaux ont été dosés suivant la méthode de Yemm et Coocking (1955). En
effet, dans dix tubes, sont introduits dans l’ordre 0,5 ml d’éthanol 80%, 0,5 ml de tampon
citrate (0,2 M, pH = 5), 1 ml de solution acétonée de ninhydrine (1g de ninhydrine dans 125
ml d’acétone), 0,5 ml de chacun des dix extraits. Les mélanges obtenus sont placés dans
un bain marie à 100 °C pendant 15 mn. Après refroidissement, 8 ml d’eau distillée sont
ajoutées et l’absorbance est lue à 570 nm, contre un blanc dans lequel, l’extrait est
remplacé par l’éthanol. La teneur en acides aminés est évaluée par référence à une
courbe d’étalon réalisée avec une gamme de concentrations de glycine pure (0 à 1 g/l)
(annexe 2). Les teneurs sont exprimées en mg /g de matière sèche.

6. DOSAGE DES POLYPHENOLS TOTAUX

6.1 Principe

L'ensemble des composés phénoliques de l’extrait est oxydé par le réactif de Folin Ciocalteu.
Ce dernier est constitué par un mélange d'acide phosphotungstique (H3PW12O40) et d'acide
phosphomolybdique (H3PMo12O40) qui est réduit, lors de l'oxydation des phénols, en mélange
d'oxydes bleus de tungstène (W8O23) et de molybdène (Mo8O23). La coloration bleue produite
possède une absorption maximum aux environs de 760 nm. Elle est proportionnelle au taux de
composés phénoliques.

17
 6.2 Protocole

Le dosage des polyphénols totaux a été réalisé suivant la méthode utilisant le réactif de Folin-
Ciocalteu décrite par Singleton et Rossi (1965). Ainsi, de chaque extrait, un volume de 40 µl
est pipeté, auquel 3,16 ml d’eau ultra-pure et 0,25 ml du réactif Folin-Ciocalteu sont ajoutés.
Après 8 min, 600 µl de la solution de carbonate de sodium (20%) est ajouté, puis le mélange
est agité vigoureusement (vortex). Après 30 min d’incubation à 40 °C à l’obscurité,
l’absorbance est déterminée pour chaque solution à 765 nm contre l’ébauche (solution "0 ml")
et à température ambiante (25°C). L’absorbance étant proportionnelle à la concentration
(annexe 3).

Figure 10 : Dosage des polyphénols totaux par la méthode

du réactif de Folin Ciocalteu

18
RESULTATS ET DISCUSSION

A) MICROPROPAGATION IN VITRO DU NOYER

1. INFECTION

Les résultats obtenus après trois semaines de culture montrent que l’introduction in vitro de
Juglans regia L. à partir d’un matériel végétal mature est très délicate. En plus du problème
de contaminations par champignons (figure 11), les composés phénoliques ont inhibé
considérablement la réactivité des explants introduits in vitro (figure 12).

Figure 11 : Explants contaminés par Figure 12 : Oxydation du milieu de culture

champignons et brunissement des explants

2. COMPARAISON DES MILIEUX D’INITIATION

Tableau 2 : Effet du milieu de culture sur le taux de contamination, de nécrose et de

débourrement des explants

Milieu de Nombre Contaminations (%) Nécroses Débourrement (%)

culture d’explants (%)
cultivés
EG 74 Champignons : 24,32 28,37 47,3

DKW 20 Champignons : 10 50 35
Bactéries : 5

19
Le taux de débourrement varie entre 35 et 47,3 %, obtenus respectivement sur le milieu DKW
et l’EG. Par contre, ces débourrements ne se sont pas tous manifestés de la même façon. Les
explants ont redémarré plus rapidement sur le milieu DKW par rapport au milieu EG (figures
13 et 14). Par contre, des taux de nécroses élevés ont été enregistrés sur le milieu DKW. Ceci
pourrait être expliqué par la présence d'une ou plusieurs substances exogènes dans ce milieu
de culture qui pourrait être la cause de la nécrose.

Figure 13 : Débourrement d'un Figure 14 : Débourrement d'un

bourgeon axillaire sur le milieu DKW bourgeon axillaire sur le milieu EG
après 3 semaines de l’introduction après 3 semaines de l'introduction

3. COMPARAISON DES MILIEUX DE DEVELOPPEMENT

Les résultats obtenus après une semaine dans les milieux de développement montrent que le
milieu DKW est le mieux adapté pour le développement des bourgeons axillaires du noyer
commun par rapport au milieu MS (figures 15 et 16). En effet, le taux de multiplication dans
le milieu MS est égale à 47,2 %, par contre le milieu DKW présente un taux de 71,4 %.

20
Figure 15 : Entrée en croissance du Figure 16 : Entrée en croissance
bourgeon axillaire après une du bourgeon axillaire après une
semaine dans le milieu DKW semaine dans le milieu MS

B) PARAMETRES BIOCHIMIQUES DU PRUNIER

1. TENEUR EN SUCRES SOLUBLES TOTAUX

Les sucres solubles totaux sont des indicateurs de degrés de stress hydrique, leur
augmentation est corrélée à la sévérité du stress. Loretti et ses collaborateurs (2001) indiquent
que les sucres métaboliques (glucose, galactose, saccharose et fructose) permettent la
résistance aux différents stress.

Pour la variété étudiée, le déficit hydrique n’a pas affecté significativement l’accumulation
des sucres solubles dans les fruits (figure 17). Ce résultat obtenu est en accord avec celui
obtenu par Dbara et ses collaborateurs (2016) sur deux variétés du poirier ("Meski arteb" et
"Jules Guyot").

21
 Figure 17: Variation de la teneur en sucres
solubles totaux des fruits de prunier ("Angeleno")
sous deux régimes hydriques différents (irrigation
à la demande et irrigation déficitaire)

2. TENEUR EN ACIDES AMINES TOTAUX

Par contre, une augmentation de la teneur en acides aminés totaux a été observée au niveau de
l’irrigation déficitaire (figure 18). En effet, l’accumulation des acides aminés totaux est un
moyen adopté par les plantes en cas de stress, afin de résister aux contraintes du milieu. Ces
derniers protègent les membranes contre la déshydratation, en condition de déficit hydrique,
ils participent en grande partie à l’abaissement du potentiel osmotique (Hireche, 2006).

22
 Figure 18: Variation de la teneur en acides
aminés totaux des fruits de prunier ("Angeleno")
sous deux régimes hydriques différents
(irrigation à la demande et irrigation déficitaire)

3. TENEUR EN POLYPHENOLS TOTAUX

De même, on note une augmentation en polyphénols de 6% pour le traitement déficitaire.
Cette augmentation témoigne de l’amélioration de la qualité du fruit, en renforçant l’efficacité
anti-oxydante des fruits ayant subis une restriction hydrique (figure 19).

Figure 19: Variation de la teneur en polyphénols

totaux des fruits de prunier ("Angeleno") sous deux
régimes hydriques différents (irrigation à la
demande et irrigation déficitaire)
23
 CONCLUSION

Etant donné le faible taux de réussite de la multiplication végétative par greffage du noyer,
nous avons testé la culture in vitro du bourgeon axillaire dans l’objectif d’augmenter ce taux.

Pour ce faire, trois milieux ont été utilisés : DKW, EG et MS. Le milieu DKW s’est révélé le
milieu le plus adapté pour la multiplication in vitro du noyer. En effet, le maximum de
bourgeons axillaires a été observé pour ce milieu de culture.

Cependant, des problèmes de contaminations de différentes natures ont considérablement

affecté le développement des bourgeons ; les pertes observées sont dues à des nécroses suite
aux contaminations par champignons ou bactéries.

Les analyses biochimiques sur les fruits du prunier obtenues selon deux régimes hydriques
(100% ETc et 75% ETc) ont montré l’efficacité des paramètres biochimiques étudiés pour
l’appréciation des effets du stress hydrique sur prunier. Chez la variété "Angeleno", la
contrainte hydrique n’a pas affecté l’accumulation des sucres solubles dans les fruits. Par
contre, une augmentation de la teneur en acides aminés et en polyphénols a été observée au
niveau de l’irrigation déficitaire.

24
Références bibliographiques

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25
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applications horticoles. Lavoisier, Tec et Doc (ed). 7- 24.

26
 Annexe 1

Courbe étalon du glucose

[Glucose] (mg/ml) Absorbance à 490 nm

0,002 0,08
0,004 0,14
0,006 0,21
0,008 0,3
0,01 0,4

27
 Annexe 2

Courbe étalon de la glycine

[Glycine] en (g/l) Absorbance à 570 nm

0,25 0,025
0,5 0,048
0,75 0,073
1 0,103

28
 Annexe 3

Courbe étalon de l’acide gallique

[AG] en (mg/ml) Absorbance à 760 nm

0,0156 0,158

0,0187 0,33

0,0312 0,452

0,0375 0,622

0,0625 0,85

0,1 1,0353

0,125 1,2

29