REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE DORAN

Facult des Sciences de la Nature et de la Vie Dpartement de Biotechnologie

LABORATOIRE DE BIOTECHNOLOGIE DES RHIZOBIUMS ET AMELIORATION DES PLANTES

Thse en vue de lobtention du diplme de Doctorat (LMD)

Option : Exploitation des Interactions Plantes Microorganismes

Prsente par :

Melle OUSLIM Sarah

Thme

BNL associes aux lgumineuses alimentaires (Vicia faba L) dans

louest Algrien caractrisation et importance

Soutenue le 28/04/2016 Devant le jury compos de :

Prsident : BEKKI Abdelkader Professeur Universit dOran

Examinatrice : IGHILHARIZ Zohra Professeur Universit dOran
Examinatrice : BOUABDALAH Louiza Professeur Universit dOran
Examinateur : OUANANE Sidi Mohamed Professeur Ecole Nationales Suprieure
Agronomique dAlger
Rapporteur : MERABET Chahinez Maitre de confrences(A) Universit dOran

Anne Universitaire : 2015-2016

 Ddicaces

Je ddie ce travail en premier lieu mes parents, qui ont toujours

t prsents mes cts pour me soutenir et mencourager. Je
naurais srement pas ralis ce chemin sans votre aide constante,
aujourdhui cette thse est l pour vous montrer que vos efforts ne
furent pas vains.

Je ddie ce travail mes frres Mohamed OUSLIM et Hamza

OUSLIM et ma sur Imene OUSLIM et son marieTewfik
DINAOUI et leur fils Rayane.

A ma grand-mre et tous les membres de ma famille qui mont

aide chacun de son cot. Mes tantes et mes oncles, mes cousines et
cousins.

A mes amies Samira, Sonia, Zoulikha, Afafe, Chahinez,

Amel,Hassiba, Saadia, Khadidja, Imene, Nabila, Nouria.

A Faycel notre collgue de longue date.

Remerciement
Ce travail de thse a t ralis Au laboratoire de Biotechnologie des Rhizobia et
Amlioration des Plantes lUniversit dOran 1, Algrie

Mes remerciements Sadressent particulirement madame MERABETChahinez, pour avoir

dirig ce mmoire. Je la remercie infiniment pour la confiance et le respect quelle m
toujours accord et pour les ides qui mont beaucoup aide progresser. Sa haute
comptence, ses qualits humaines, ses conseils judicieux ont t pour moi une source
inestimable de rconfort et dencouragement pour mener terme ce travail. Quelle trouve ici
lexpression de ma profonde gratitude.

Je tiens remercier en ce lieu Monsieur le Professeur BEKKI Abdelkader de mavoir

accueillie dans son laboratoire, pour sa gentillesse et son aide, et qui a bien voulu prsider ce
jury.

Je remercie galement Monsieur le Professeur LABDI Mohamed Directeur de recherche

INRAA Sidi Bel Abbes,Madame IGHIL HARIZ Zohra (Professeur
luniversitdOran),Madame BOUABDALLAH Louiza(Professeur luniversit dOran) et
Monsieur OUANANE Sidi Mohamed (Professeur lEcole Nationales Suprieure
Agronomique dAlger) pour lintrt quils ont port mon travail et pour avoir accept
dexaminer ce travail.

Monsieur et MadameLAZALI ont ts pour moi une grande source dinformation et de

soutien :quils trouvent ici ma grande sympathie et leur souhaite la russite, la joie et le
bonheur dans leur vie.

Jadresse galement ma sincre reconnaissance madame BOUKHATEMZineb Faiza,

madame BOUCHENTOUF Lielaet madame AMIR ALI Amel pour le temps, les conseils et les
encouragements quelles mont accords tout au long de ce travail et surtout pour leur
sympathie.
Je remercie monsieur le Directeur ducentre de formation professionnelle de Misserghin pour
mavoir permis de raliser les essais au champ dans son tablissement.

Je remercie toute lquipe du dpartement de Biotechnologie dOran sans oublier monsieur

MADOURIDjamel pour son aide et ses encouragements.

Je remercie mes collgues et toute lquipe du laboratoire LBPAP pour leur sympathie. .
 Rsum

Les lgumineuses alimentaires sont considres depuis longtemps comme les plantes
graines les plus cultives par lhomme. Elles jouent un rle important dans le dveloppement
de lconomie nationaledes pays du Maghreb.La fve (Vicia fabaL) est parmi les
lgumineuses alimentaires les plus cultives pour lalimentation humaine et joue aussi un rle
important dans la fertilisation des sols. Dans le but damliorer la production de cette culture
stratgique pour la scurit alimentaire dans le pays, nous avons entrepris une tude de
caractrisationphnotypique desrhizobia associes la fve dans louest algrien afin de
slectionner par la suite en serre et au champ les souches potentiellementintressantes
proposer comme inoculum biologique.Pour raliser ce travail, plusieursmissions
deprospection ont t menes dans louest algrien au cours desquellesnous avons rcolt des
plantes et desnodules de (Vicia fabaL). Les nodules ainsi rcolts nous ont servi lisolement
direct de souches de rhizobia. Une collection de 140 isolats a t obtenue et caractrise par
des tests phnotypiques.Quarante isolats prsentent une morphologie comparable celle des
rhizobia connus, les colonies obtenues prsentent une forte mucosit et nabsorbent pas du
rouge Congo.

Le test de nodulation in-vitro en conditions contrles a confirm linfectivit et lefficience

de trente souches vis--vis de leurs plantes htes et cest celles-ci qui ont t retenuespour des
tests physiologiques et biochimiques. La majorit des souches se distinguent par leur
particulire tolrance la salinit (600mM NaCl), des pHs allant de 5 11 et des
tempratures extrmes comprises de15 40C. et rsistent de nombreux antibiotiques dont
lAmpicilline.
Pour les tests dinoculation au champ, nous avons choisi trois souches de rhizobia
slectionnes sur la base de leur efficience (mesure du poids sec des parties ariennes et
racinaires) en serre sous conditions contrles et de leur particularit physiologique.

Les essais ont t mens au champ durant la saison pluvieuse dans le centre de formation de
Misserghine lOuest algrien. Cinq traitements ont t appliqus : une inoculation avec trois
souches de Rhizobiumsp. reprsentant la souche la plus effective (la souche FM.24),
moyennement effective (la souche FR36) et la moins effective (la souche FR26.4.2), un
tmoin azot et un sans azote sont inclus. Les rsultats obtenus montrent que la fertilisation
azote entraine une augmentation de la biomasse arienne et une diminution de la biomasse
nodulaire contrairement linoculation avec les souches de Rhizobium sp.quientraine une
augmentation de la biomasse racinaire et arienne,et une augmentation significative du
rendement en gousses et en graines ce qui encourage lutilisation des souches de Rhizobiums
comme inoculum biologique. Dans cet essai, la souche FM20.4 originaire de la rgion de
Mostaganem est la plus efficiente par rapport aux autres souches slectionnes et qui se sont
avres nettement moins comptitives et moins effectives que les souches indignes.

Mots cl ; Vicia faba - rhizobia- tolrance - sensibilit-symbiose infectivit-efficience-

Diversit Phnotypique - Inoculation.
 & *() &( & $ #$%!
1) 7 #$%(Vicia fabaL 6! . * 2 $ / ,-. &
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J - #FR 36 FR26.4 J. - # ?. ! 24
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J - # ?.% & ?. J 2)FR 36(FR26.4 -
>
Vicia faba L)):62 & o2 . 7 . EO d -
 Abstract

Food legumes have been considered since a long time as the most cultivated seed plants by
man. They play an important role in the development of the Maghreb countries economy.
Bean (Viciafaba L.) is among the most cultivated grain legumes for food and also plays an
important role in soil fertilization. In order to improve thisstrategic crop production for food
security, we have undertaken a study of rhizobial strains phenotypic characteristics associated
with bean in western Algeria to select afterwards in the greenhouse and field potentially
interesting strains as biological inoculum. To make this work, several exploratory missions
have been conducted in western Algeria whereweere collected plants and nodules (Viciafaba
L.). The nodules were harvested and served us for direct isolation of rhizobial strains. A
collection of 140 isolates was obtained and characterized by phenotypic testing. Forty isolates
show morphology comparable to that of known rhizobia, the obtained colonies showed mucus
production and the absence of congo red absorption.
In vitronodulationtestunder controlled conditionsconfirmedinfectivityand efficiency
ofthirtystrains with their plant host and they have been selectedfor physiologicaland
biochemical tests. The majority ofstrains were distinguished bytheir particularsalinity
tolerance(600mm NaCl) at pH ranging from 5 to11andat maximum temperaturesbetween
15to40 C. They evenfound to be resistanttosome antibiotics.
Threerhizobialstrainsfrom our collectionwere selected onthe basis of theirefficiency(a
measureof the dry weightofaerial androotparts)in a greenhouseundercontrolled conditionsand
physiologicalcharacteristicforinoculationfield trials.
The tests were conducted in the field during the rainy season inMisserghine training center in
western Algeria. Five treatments were applied: inoculation with three strains of Rhizobium sp.
(FM.24, FR36, FR26.4.2) previously selected in the greenhouse as being the most effective
(FM.24 strain), slightly effective (strain FR36) and less effective (FR26.4.2 strain), a nitrogen
and a nitrogen-free controls. The results showed that nitrogen fertilization resulted in an
increase in aboveground biomass and a decrease in biomass nodular unlike inoculation with
Rhizobiumsp strains which leads to an increase in root and stem biomass, and a significant
increase in pods and seeds yield. In this test, the strain FM20.4 native of Mostaganem region
was more efficient compared to other selected strains that have proven much less competitive
and less effective than native strains.
Keywords;Viciafaba L - rhizobia- symbiosis-Phnotypique Diversity. Inoculation.
 Table des matires
Introduction gnrale ................................................................................................................. 1

Chapitre 1 : Synthse Bibliographique

1. Importance des lgumineuses alimentaires ............................................................................ 4

2. La fve ................................................................................................................................... 4
2.1. Historique et origine ........................................................................................................... 4
2.2. Position systmatique de la fve ........................................................................................ 5
2.3. Description de la plante hte ......................................................................................... 5
2.4. Les varit de la fve ........................................................................................................... 8
2.5. Intrts culturaux de la fve ............................................................................................... 8
2.5.1. Intrt agronomique ........................................................................................................ 8
2.5.2. Intrt alimentaire ............................................................................................................ 9
2.6. Exigences de la culture des fves ........................................................................................ 9
2.6.1. Exigences pdologiques ................................................................................................. 10
2.6.2. Exigences climatiques ........................... 10
2.6.3. Exigences agronomiques ............................................................................................... 10
2.7. Production mondiale de la fve ........................................................................................ 10
2.8.Production nationale de la fve ......................................................................................... 11
2.9. Contraintes majeures de la production de la Fve ............................................................ 12
2.9.1. Principales contraintes abiotiques ............................................................................... 13
2.9.2. Principales contraintes biotiques en Algrie ................................................................ 13
3. Le microsymbionte (les rhizobia) ........................................................................................ 13
3.1. Mthodes appliques ltude de la diversit des rhizobia .............................................. 14
3.1.1. Mthodes phnotypiques ............................................................................................... 14
* Principales caractristiques phnotypiques des Rhizobia .................................................... 14
3.1.2. Mthodes gnotypiques ................................................................................................. 15
3.2. Les rhizobia associs la fve ......................................................................................... 17
4. Principales contraintes environnementales limitant la fixation symbiotique de l'azote ...... 19
4.1. Tempratureextrme.......................................................................................................... 19
4.2. Dficit hydrique................................................................................................................. 19
4.3. Effet de l'acidit sur la symbiose ...................................................................................... 20
4.4. Effet de la toxicit sur la symbiose .................................................................................. 20
4.5. Effet de la salinit sur la symbiose .................................................................................... 20
4.6. Effet de l'azote disponible sur la symbiose .................................................................... 20
5. Utilisation des engrais en Algrie ....................................................................................... 21
6. Inoculation rhizobiennne ..................................................................................................... 23
6.1. Slection des souches rhizobiennes appropries ............................................................. 24
6.2. Les diffrents types dinoculum ....................................................................................... 25
6.3. Conservation et emploi de linoculum ............................................................................. 25
6.4. Techniques dinoculation ................................................................................................. 25
6.5. Facteurs affectant la rponse linoculation rhizobienne ................................................. 26

Chapitre 2 : Diversit phnotypique et symbiotique des rhizobianodulant la fve

(Vicia fabaL) dans louest algrien

1. Introduction ................................................................................................................ 27
2. Matriel et Mthodes ......................................................................................................... 28
2.1. Prospection et chantillonnage ......................................................................................... 28
2.1.1. Sites dchantillonnage ................................................................................................ 28
2.1.2. Collecte des nodules ...................................................................................................... 30
2.1.3. Conservation des nodules .............................................................................................. 31
2.2. Isolement et purification des isolats bactriens ............................................................... 31
2.3. Vrification de la puret des isolats ................................................................................. 31
2.3.1. Observation macroscopique .......................................................................................... 31
2.3.2. Observation microscopique ........................................................................................... 31
2.3.3.Absorption du rouge Congo ....................................................................................... 31
2.3.4.Conservation des souches ............................................................................................... 32
2.4.Test dinfectivit des souches vis--vis de leur plante hte en hydroponie ...................... 32
2.4.1.Strilisation, germination et mise en culture de la fve ................................................. 32
2.4.2. Inoculation des plantes in vitro ..................................................................................... 33
2.4.3. Estimation de la croissance ............................................................................................ 33
2.4.2. Analyse statistique.......................................................................................................... 34
2.5. Caractrisation physiologique des isolats ........................................................................ 34
2.5.1. Sensibilit des souches la salinit .............................................................................. 34
2.5.2. Sensibilit des souches la temprature .......................................................................... 34
2.5.3. Sensibilit des souches au pH ..................................................................................... 34
2.5.4. Croissance sur milieu YEM contenant du Bleu de Bromothymol ............................... 34
2.6. Rsistance aux antibiotiques ............................................................................................ 35
2.7.Capacit dassimilation de substrats carbons ................................................................... 35
2.8. Analyse numrique ........................................................................................................... 35
3.Rsultats et discutions ........................................................................................................ 36
3.1. Isolement des rhizobiums ................................................................................................. 36
3.2.Caractristiques morphologiques ....................................................................................... 36
3.2.1.Caractristiques macroscopiques ............................................................................ 36
3.2.2.Caractristiques microscopiques ............................................................................. 36
3.2.2.Croissance sue YEM + rouge Congo ....................................................................... 37
3.3.Test de nodulation ............................................................................................................. 39
3.3.1.Morphologie des plantes inocules ......................................................................... 40
3.3.2.Nombre de nodules .................................................................................................. 42
3.3.3.Mesure de la hauteur des tiges ................................................................................ 42
3.3.4.Comparaison des poids secs des parties ariennes et racinaires des plantes ........... 43
3.4. tude des caractristiques physiologiques ........................................................................ 45
3.4.1Sensibilit la temprature ...................................................................................... 45

3.4.2.Sensibilit au NaCL ....................................................................................................... 46

3.4.3.Sensibilit au pH ..................................................................................................... 46
3.4.4.Croissancesur milieu YEM contenant du Bleu de Bromothymol .......................... 47
3.4.5..Rsistance intrinsque des souches aux antibiotiques ............................................ 49
3.4.6..Assimilation de substrats carbons ........................................................................ 50
3.5. Analyse numrique .......................................................................................................... 53
4.Conclusion ........................................................................................................................... 55

Chapitre 3 : Effets de la fertilisation azote, de linoculation par Rhizobium sp. sur la

production de la biomasse, la teneur en azote et le rendement de la fve dans la
wilaya dOran, Algrie.

1.Introduction ......................................................................................................................... 56
2. Matriels et Mthodes ........................................................................................................ 57
2.1.Prsentation du site exprimentale .................................................................................... 57
2.2. Analyse du sol .................................................................................................................. 59
2.2.1. Analyses physiques ....................................................................................................... 59
2.2.2. Analyses chimiques ....................................................................................................... 59
2.3. Essaiau champ ................................................................................................................... 62
2.3.1. Mise en place de lessai ....................................................................................................62

2.3.1.1. Dimension et dcoupage des parcelles ........................................................................ 62

2.3.1.2. Inoculation des graines de Vicia fabavar. aguadulce au champ ............................... 63
2.4. Paramtres de croissance analyss ................................................................................... 66
2.5. Analyse statistique des donne .......................................................................................... 66
3.Rsultats et discutions ........................................................................................................ 67
3.1. Analyses physico-chimiques du sol ................................................................................. 67
3.2.La croissance des plantes .................................................................................................. 69
3.2.1.Analyse du phnotype des plants inoculs ..................................................................... 69
3.2.2.Hauteur des parties ariennes .......................................................................................... 71
3.2.3.Mesure du poids sec des parties ariennes ...................................................................... 72

3.3. La nodulation .................................................................................................................... 74

*La biomasse nodulaire ............................................................................................................ 74
3.4.Rendement en graines et en gousses .................................................................................. 76

4.Conclusion ........................................................................................................................... 79

Conclusion gnrale et perspectives .................................................................................... 87

Rfrences bibliographiques ................................................................................................ 89
Annexes ................................................................................................................................ 124
 Liste des figures

Figure 1 : Morphologie (a, b, c) de la fve 7

Figure 2: Arbre phylogntique bas sur la sequence du gene RNAr16S (1317pb)Montrant

les relations entre Rhizobium laguerreae sp. nov. Et les especes lies troitement. La
signification de chaque branche est indique par une valeur (bootstrop)(Saidi et al.,
2014) .. 18

Figure 3 : Tendance de l'utilisation des engrais en Afrique du Nord (1990-2000).

(ASMIDAL,2004) .. 22

Figure 4 : volution de la consommation dengrais azote (N) enAlgrie 23

Figure5 :Carte gographique dAlgrie reprsentant la localisation sites dchantillonnages

(Oran, Mostaganem, Tlemcen, Mascara, Relizane et Ain Tmouchen) . 29

Figure 6 : Aspects des nodules de Vicia faba L (A) bilobs, (B) polylobs, (C) forme
indtermin ... 30
Figure 7 : Aspect des graines de Vicia fabaL .. 32

Figure 8 : Aspect des plantes de Vicia faba L aprs une semaine dinoculation dans la
chambrede culture
... 33

Figure 9 : Aspect macroscopique de la souche de la souche FT16 sur milieu YEM aprs 72H
dincubation .. 38

Figure10 :Aspect microscopique de la souche FM24 aprs coloration de

Gram.(Grossissement1000)
.. 48

Figure 11 : Aspect macroscopique de la souches FM24 sur milieu YEM contenant le rouge
Congo aprs 72H 48

Figure 12: Effet dinoculation sur les plantes . 40

Figure 13 : Aspect des racines des plantes inocules par la souche FR36 (A), FM24 (B) et le
tmoin (C) aprs 6 semaines de croissance en chambre de culture et en conditions contrles
. 41
Figure 14 : Infectivit des souches de rhizobia isoles de Vicia fabaL estime par le nombre
de nodules aprs 6 semaines de croissance en chambre de culture en conditions
contrles
. 44

Figure 15 : La hauteur des parties ariennes des plantes inocules aprs 6 semaines de
croissance en conditions contrles.44

Figure 16 : biomasse des parties ariennes et racinaires de plantes inocules aprs 6 semaines
de croissance en chambre de culture . 44

Figure 17 : Sensibilit des souches une concentration de 0.7%de NaCL . 52

Figure 18 : Sensibilit des souches au pH4... 52

Figure 19 : La croissance des souches FO4.1 et FR29.3 en milieu YEM contenant du Bleu de
Bromothymol .. 52

Figure 20 : : Exemple de rsistance et de sensibilit aux diffrents antibiotiques de la souche FR31.4

aprs une semaine dincubation. Suivant lorientation : 1 : Rsiste lAmpicilline (A) et sensible
acide Nalidixque (Na) (30g), Streptomycine (S) (10g)
.. 52

Figure 21 :Assimilation des substrats carbons (Galactose) par par diffrentes souches
tudies . 52

Figure 22 : Dendrogramme des caractres phnotypiques aprs analyse numrique par le

logiciel statistica 7.. 54

Figure 23 : Localisation de site exprimental (A : carte gographique dAlgrie, B : Carte

gographique dOran, C : photo duchamp) 58

Figure 24: Schma du dispositif exprimentalde lessai au champ

...............................................................................64

Figure 25 : Mise en place de lessai et inoculation de graines de la fve au champ 65

Figure 26 : Photos des blocs pour chaque traitement aprs 3 semaines de croissance,A :
Tmoin sans azote, B : bloc inocul par la souche FM24, C :Tmoin azot, D : bloc inocul
par la souche FR36, E : bloc inocul par la souche FR26.4.2 70

Figure 27 : Photo de la parcelle dessai aprs deux mois de croissance 71

Figure 28 :Effet de la fertilisation azote et de linoculation par Rhizobium sp.sur la hauteur des
parties arienne des plantes de Vicia faba var. aguadulce, (TA : tmoin azot, TSA : tmoin sans
azote)
...... 72
Figure 29 :Effet de la fertilisation azote et de linoculation par Rhizobium sp. sur le poids sec
des parties ariennes de la varit de Vicia faba var. aguadulc
.... 73
Figure 30 : Effet de linoculation sur la masse nodulaire de Vicia fabavar. aguadulc (TA :
tmoin azot, TSA : tmoin sans azote, inoculums bactriens : FM.24, FR.36, FR.26.4.2)
...... 75
Figure 31: Effet de la fertilisation azote et de linoculation par Rhizobium sp. sur le
rendement de la varit de Vicia fabavar. aguadulc, Rsultats de campagne agricole, 2013-
2014, mene dans le centre de formation de Messerghin TA : tmoin azote, TSA : tmoin
sans azote, les souches de Rhizobium sp. : FM24 , FR 36,FR.26.4.2
77
 Liste des tableaux

Tableau n1 : Composition de certaines graines de lgumineuses (% de la matire sche, sauf

pour acides amins exprims en g/16g N) (Feillet, 2000) 4
Tableau 2 : Composition chimique moyenne pour 100 g net de fve (Fachmann et Kraut,
2006)..
9

Tableau n 3 : La production mondiale de fve, campagne 2009/2010 11

Tableau 4 :Production de la fve verte dans louest algrien au cours des campagnes :
2008/2009 ; 2009/2010 et 2010/2011selon le Ministre de lAgriculture et du Dveloppement
Rural ... 14

Tableau 5 : Doses d'azote et de phosphore utilises en fonction de la pluviosit (INVA-ITGC,

1997) . 22
Tableau6 :Nombre disolats bactriens obtenu partir de nodules rcolts in natura dans
louest algrien 36

Tableau 7 :caractrisation physiologique des souches . 48

Tableau 8: Rsistance intrinsque des isolats tests diffrents antibiotiques 50

Tableau 9: Rsultats dassimilation de substrats carbons par les souches
..51

Tableau 10 :Les rsultats des analyses physiques dchantillons de sol prlev de la rgion de
Misserghine, Ralis LINA dAlger..68

Tableau 11 :Les rsultats des analyses chimiques dchantillons de sol prlevs de la rgion
de Misserghine, Ralis LINA dAlger... ....68

Tableau 12 : Modlisation de la variable hauteur plantes ..72

Tableau 13 : Modlisation de poids sec des parties ariennes.73

Tableau 14 : Modlisation de la variable Croissance nodule ..76

Tableau 15 : Modlisation de la variable nombre de gousses .77
Tableau 16 : Le test de Neuman-Keuls au seuil de signification de 5% pour la variable
rendement en gousses . 78

Tableau 17 : Modlisation de la variable Rendement (Nombre graines) .. 78

Tableau 18 : Le test de Neuman-Keuls au seuil de signification de 5% pour la variable

rendement en graines . 78
Introduction
gnrale
 Introduction gnrale

Introduction gnrale

La forte croissance dmographique des dernires annes a entran une forte pression sur les
ressources en terres cultivables. Laugmentation de la population a entrandu mme coup une
augmentation de la demande en produits vgtaux utiles lhomme et lanimal. Cette forte
pression sur le couvert vgtal influence la capacit des sols produire la biomasse ncessaire
aux besoins dune population de plus en plus nombreuse. Dans un tel contexte, la jachre qui
tait le moyen traditionnel de restauration de la fertilit des sols est moins pratique cause
de la forte demande en terres cultivables. De nombreuses exprimentations de longue dure
ont montr quune gestion rationnelle des engrais minraux et des amendements organiques
permettait daugmenter les rendements des cultures et de maintenir durablement la fertilit
des sols (Sdogo, 1981, 1993 ; Pichotetal., 1981 ; Berger etal., 1987 ; Pieri, 1989
;BationoetMokwunye, 1991 ; Badoetal., 1997).

Lutilisation des engrais organiques est galement faible car lagriculture nest pas
systmatiquement intgre avec llevage. Il sagit de deux types dactivits distinctes
pratiques par des acteurs diffrents. Lagriculteur ne pratique pas systmatiquement
llevage de sorte quil dispose des amendements organiques comme le fumier pour fertiliser
son champ. Aprs les rcoltes, les rsidus de plantations sont principalement consomms
durant la saison sche par les animaux transhumants, ce qui correspond une exportation
dlments nutritifs des champs.

Cette agriculture extensive trs faibles intrants sans recyclage des rsidus de rcolte entrane
des bilans ngatifs en lments nutritifs et ne permet pas dentretenir la fertilit des sols long
terme. Caractrise dagriculture minire par la FAO, ce type dagriculture a
progressivement diminu loffre en lments nutritifs des sols (Bationoetal., 1998), Face
une telle situation, il devenait urgent de dvelopper des techniques de fertilisation accessibles
aux producteurs et permettant daugmenter la production par unit de surface tout en
maintenant la fertilit des sols long terme.
Lazote et le phosphore sont les deux premiers facteurs limitant les rendements des cultures
sur les sols des zones semi-arides dAfrique de lOuest. Hien (1990), Sdogo (1981) et
Badoetal. (1997) indiquent que les teneurs en matire organiques et en azote influencent
fortement la fertilit des sols et la productivit des cultures.
Pourtant, la prsence des lgumineuses dans les systmes de culture est une opportunit pour
amliorer la fertilit des sols et les rendements des cultures. Rappelons que 79.08% du

1
 Introduction gnrale

volume en gaz N2 de la biosphre se trouve dans latmosphre constituant ainsi la principale

source dazote (Haynes, 1986). Selon une image de Foth (1990), nous vivons dans unemer
dazote alors que cet lment demeure le principal facteur limitant la croissance des plantes.
Par leur capacit fixer lazote de latmosphre grce au processus de la fixation
symbiotique, les cultures de lgumineuses peuvent amliorer le bilan de lazote dans les
systmes de cultures (Wanietal., 1995 ;Chalk, 1998). Ainsi, un systme de culture utilisant
une lgumineuse fixatrice dazote en rotation ou en association, aura probablement un
meilleur bilan en azote et une meilleure productivit.
Auparavant, trs peu de travaux ont t consacrs aux rles des lgumineuses sur la fertilit
des sols en Algrie, la plupart des recherches se sont trs souvent limites dmontrer les
effets bnfiques des rotations base de lgumineuses sur les rendements des cultures. Les
quantits dazote fix par les lgumineuses, leurs contributions en azote dans les systmes de
rotation et leurs impacts sur la nutrition azote, ont t trs peu tudies. Ces donnes sont
pourtant trs utiles pour dvelopper des rgies de fertilisation adaptes et permettant
damliorer la productivit des systmes de culture en valorisant le potentiel en azote des
lgumineuses.
En Algrie, les lgumineuses alimentaires constituent aprs les crales, la seconde source de
protines pour lalimentation humaine (elles reprsentent une source de protines
importantes, comme alternative aux protines animales), malheureusement leur production
restent toujours faible et ne satisfait pas la demande, elles reprsentaient83800 ha de la
surface agricole totale utilise (SAU) en 2011 (FAO, 2013).
Parmi ces cultures, la fve cest une des lgumineuses graineslesplus cultives dans le
monde. En 2005 les pays Mditerranens ont produits 1093000 tonnes de fves soit 25% de la
production mondiale. LAlgrie avec une production de 27000 tonnes occupe le 17merang au
niveau mondial et le 6merang au niveau continental, devance par lEthiopie (610845 tonnes),
lEgypte (297620 tonnes), leMaroc (153040tonnes), le Soudan (112500 tonnes), et la Tunisie
(45000 tonnes) (Giove et Abis, 2007).
Vu le rle important de la fve dans lalimentation humaine, les agronomes ont remarqu
depuis longtemps le rle de cette dernire dans lamlioration des sols pauvres dans les
rgions arides dAlgrie (Chafi et Bensoltane, 2009).

La quantit dN2 fixepar la fve est estime entre 240 et 325 kg ha-1 (Somasegaran et
Hoben, 1994), avec un pourcentage d'efficience (66% Ndfa; azote driv de l'air) (Jensen,
1986) et rpond 80% de ses besoins en azote (Zaptaet al., 1987). Pour cette raison, elle est

2
 Introduction gnrale

incorpore dans l'agriculture mixte traditionnelle offrant une pratique agronomique moins
chre et plus efficace en assurant une offre suffisante en N.

58 000 hectares soit 44,3% de la superficie totale agricole est rserve la culture de cette
lgumineuse en Algrie (Boussadaetal., 2004). Selon le Ministre de lAgriculture et du
Dveloppement Rural (MADR, 2010) la production de la fve dans lEst Algrien atteint
617690 quintauxalors que dans louest elle nest que de 374085 quintaux,ceci est d
principalement aux facteurs climatiques. Selon Nutman (1976) la capacitdela fve fixer
l'azotedpend de nombreux facteurs, dont les facteurs environnementauxet agronomiques.

La fve peut fixer lazoteatmosphrique grce une association symbiotique avecles rhizobia
(bactries vivant dans les nodules racinaires de cette plante)Le premier microsymbiote
identifi de cette lgumineuse est Rhizobiumleguminosarumbv. viciae(Jordan, 1984;
Shamseldinet al., 2009), dautres espces ont t dcrites par la suite dans le monde par
diffrentes techniques phnotypiques et gnotypiques mais trs peu dtudes taxonomique ont
t ralises en Algrie.

Ce prsent travail sinscrit dans le cadre de lamlioration de cette culture stratgique

notamment dans louest algrien. Notre objectif est d'valuer la diversit phnotypique et
symbiotique des bactries associes ViciafabaL, afin daugmenter sa production.

Le travail comporte trois chapitres :

Le premier chapitre correspond une tude bibliographique ayant pour but de situer le travail
dans son contexte scientifique. Elle comporte une partie sur la plante hte Vicia fabaL et les
rhizobiaassocis et une partie sur lutilisation des engrais azots en Algrie et linoculation
biologique.

Le deuxime chapitre estltude de la diverssit phnotypique et symbiotique des

rhizobianodulant la fve (Vicia fabaL) dans louest algrien.

Le troisime chapitreest rserv lessaidinoculation au champ de Vicia fabaLavec des

souches de rhizobia de notre collection compare avec des tmoins avec et sans azote.

3
Introduction gnrale

4
 Chapitre I
Synthse bibliographique
 Chapitre I

1. Importance des lgumineuses alimentaires

La famille des lgumineuses appele aujourdhui fabace (Peron, 2006), reprsente une
famille dune grande importance conomique et occupe le second rang aprs les crales
comme culture alimentaire dans le monde (Rochester et al., 2001). Les lgumineuses
alimentaires sont une importante source protique (Rugheim et al., 2012) et se prsentent
comme un substitut aux protines animales, disponibles travers les viandes rouges et
blanches qui sont difficilement accessibles de larges couches de la population, mais aussi
pour la production animale en termes de nourriture animale et de fourrages. Elles contiennent
gnralement 20-30% de protines (tableau 1).
Tableau n1 : Composition de certaines graines de lgumineuses (% de la matire sche, sauf
pour acides amins exprims en g/16g N) (Feillet, 2000).
Amidon Fibre Lipides Protine Lysine Methionine
+
Cysteine

Pois 50 15 2 22-25 7.1 2.4

Fve 43 18 2 28-32 6.5 2.1

Soja 1 22 10 35-39 4.3 2

Lupin blanc 2 20 20 36-40 6.2 2.8

Les lgumineuses prsentent toutes une particularit dans leur systme racinaire, une
symbiose avec une bactrie du sol les rhizobia, qui leur permet de bnficier de l'azote de l'air
pour leur croissance. Cela constitue en outre un apport azot non ngligeable pour la culture
(Hamadache et al., 1997 ; Solomon et Fassil Assef, 2014).
En Algrie, elles sont cultives sur les zones littorales jusquaux hauts-plateaux, on trouve de
nombreuses espces potagres comme le pois chiche, le haricot, la fve, le pois et la lentille
(Lazali, 2014).
2. La fve

2.1. Historique et origine

4
 Chapitre I

Selon Mathon (1985), la fve est une plante cultive par lhomme depuis le Nolithique (7000
ans avant J.C), elle est originaire des rgions mditerranennes du Moyen-Orient. Selon Peron
(2006), la fve, le pois et la lentille sont les plus vieilles espces lgumires introduites en
agriculture (10000 ans). Cette plante figure parmi les lgumineuses les plus anciennement
cultives, elle est cite dans la Bible comme tant dun usage frquent pour les offrandes
funraires (Laumonnier, 1979). A partir de son centre dorigine, elle sest propage vers
lEurope, le long du Nil, jusquen Ethiopie et de la Msopotamie vers lInde. LAfghanistan et
lEthiopie deviennent par la suite, les centres secondaires de dispersion (Zaidi et Mahiout,
2012). En Egypte des graines de fve ont t trouves dans les tombes de la XXIIe dynastie
des Pharaons (2002-2004 avant J.C).
2.2. Position systmatique de la fve
Daprs Dajoz (2000) la fve est classe comme suit :
Embranchement : Spermaphytes
Sous-embranchement : Angiospermes
Classe : Dicotyldones
Sous-classe : Dialyptales
Srie : Caliciflores
Ordre : Rosales
Famille : Fabaces (Lgumineuses)
Sous-famille : Papilionaces
Genre : Vicia
Espce : Vicia faba L.

2.3. Description de la plante hte

Vicia faba L est une plante herbace annuelle, tige simple, dresse, non ramifie, creuse et
de section quadrangulaire, se dressant plus dun mtre de haut du sol (Peron, 2006).
Les feuilles alternes de couleur vert glauque ou gristre composes de deux ou trois paires de
folioles opposes de forme ovale, son systme radiculaire est dvelopp et descend
profondment dans le sol (Chaux et Foury, 1994).

La fve possde des fleurs qui sont gnralement blanches avec des ailes noires, par deux
cinq petites grappes pdoncules (Guinoolhet et De Vilmorin, 1984).

5
 Chapitre I

Les fruits sont de longues gousses vertes, paisses, contenant de grosses graines ovales
(Couplen et Marm, 2009) (Figure 1).

6
 Chapitre I

Aspect des fleurs et des feuilles (a) Forme des graines (c)

Aspect des gousses (b)

Figure 1 : Morphologie (a, b, c) de la fve

7
 Chapitre I

2.4. Les varits de la fve

Il en existe 2 sous-espces, paucijuga et eu-faba. Dans la sous-espce eu-faba qui nous
intresse, on dnombre 3 groupes dfinis par la taille des graines le premier groupe comporte
des graines petites (Vicia faba minor) correspond au terme fverole utilise pour
lalimentation du btail, le deuxieme groupe est dfini par des graines moyennes (Vicia faba
equina), et il est galement destin lalimentation du btail et le troisime groupe est
caractris par de grosses graines que lon appelle communment fve (Vicia faba major)
destines la consommation humaine (Gallais et Bannerot, 1992).
Il existe quatre varits de fve :
Varits trs prcoces
On rencontre dans ce groupe le type Muchaniel. Elle a des gousses de couleur vert clair, de
20cm de longueur en moyenne, renfermant 5 6 graines blanches, elle est trs productive.
Varits prcoces
On rencontre dans ce groupe la Sville gousses longues, renferment 5 6 graines
volumineuses. Sa tige est dune hauteur de 70cm, se distinguant des autres varits par la
couleur de son feuillage, dun vert assez franc (Chaux et Foury, 1994). Ses gousses prsentent
une largeur denviron 3cm et une longueur de 25 cm (Laumonier, 1979).
Varits demi-prcoces
Les varits demi-prcoces appartiennent au type fve dAguadulc, elles sont caractrises
par une plante de vgtation haute de 1,10 1,20m, et possdent des gousses volumineuses et
trs longues, renferment 7 9 graines. Cest une varit trs productive (Chaux et
Foury 1994). Elle est introduite en Algrie, avec la Sville, dEspagne (Zaghouane, 1991).
Varits tardives

Elles ont une hauteur moyenne de 85cm, elles produisent de nombreuses gousses contenant 4
graines.
2.5. Intrts culturaux de la fve

Vicia faba L est dune importance incontestable, elle a deux intrts :

2.5.1. Intrt agronomique

Elle contribue lenrichissement des sols en lments fertilisants (Khaldi et al., 2002). Elle
est introduite en rotation avec les crales, ou elles jouent un rle non ngligeable dans

8
 Chapitre I

lenrichissement des sols en azote (Rachef et al., 2005), et grce son systme racinaire
puissant et dense elle amliore la structure du sol (Hamadache, 2003).

2.5.2. Intrt alimentaire

La fve est lune des lgumineuses graines utilise pour la consommation humaine et
animale (Goyoaga et al., 2011). Elle constitue un aliment nutritif trs important surtout pour
les populations faible revenus, qui ne peuvent pas toujours sapprovisionner en protine
dorigine animale (Daoui, 2007)

Selon Gordon (2004), cette lgumineuse est une excellente source de fibres solubles et
insolubles, de glucides complexes, de vitamines (B9 et C) et de minraux (en particulier le
potassium, le phosphore, le calcium, le magnsium, le cuivre, le fer et le zinc) et elle a une
teneur en protine trs leve (Tableau 2).

Tableau 2 : Composition chimique moyenne pour 100 g de fve (Fachmann et Kraut, 2006).

Compositions (g) Vitamine (mg)

Glucides 10,0 Acide ascorbique82, 00

Protides 5, 40 Provitamine A(carotne) 0,100
Lipides . 0,30 B1 (thiamine). 0,300
Eau 82,0 B2 (riboflavine) 0,200
Fibres alimentaire ....6,50 B3 (nicotamide)...1,800

Minraux (mg) Apports nergtiques

Potassium 210,0 K calories.. 64,00

Phosphore 105,0 K joules268,0
Calcium . 24,0
Magnsium 18,00
Soufre ... 27,00
Sodium ... 4,00
Chlore .. 14,00

2.6. Exigences de la culture des fves

9
 Chapitre I

2.6.1. Exigences pdologiques

Eau
Lespce est trs exigeante en humidit du sol surtout pendant les priodes initiales de son
dveloppement. Les phases de floraison et de dveloppement des gousses prsentent une
sensibilit leve vis--vis dun stress hydrique, raison pour laquelle il faut intervenir par
arrosage ou irrigation en cas de faibles prcipitations (Chaux et Foury, 1994).
Sol
Selon Chaux et Foury (1994), la fve ne prsente pas dexigence spcifique au regard de la
nature des sols. Cependant, la prfrence est donne au sol sablo-argileux humifi (Peron,
2006), et un pH neutre lgrement alcalin (7-8,3). Daprs (Marcel, 2002), la fve croit
mieux sur des sols texture plus lourde, mais craint les sols lgers (risque de scheresse) et
les excs de Bor.

2.6.2. Exigences climatiques

Temprature
La fve supporte les faibles geles ne dpassant pas 3 C. Les tempratures suprieures
23C sont nfastes pour la fve, elles provoquent la chute prmature des fleurs, stimulent le
dveloppement de maladies virale et fongique et rend la plante susceptible lattaque des
insectes ravageurs (Chaux et Foury, 1994) une temprature moyenne aux alentours de 13C
est optimale pour la croissance de la fve (Zerihun, 2006).

Lumire
Daprs Laumonier (1979), la fve se comporte comme une plante de jour long qui se traduit
par une exigence importante en luminosit.
2.6.3. Exigences agronomiques
Prparation du sol
Afin dassurer la plante une bonne autonomie vis- -vis de ses besoins en eau, et en raison
de son enracinement pivotant, un labour profond est conseill (Chaux et Foury, 1994).
Semis
Selon Laumonier (1979), le semis dpend des rgions et des varits, il peut seffectuer
partir du mois doctobre jusqu la fin du mois de fvrier et dbut du mois de mars. En
Algrie, le semis est ralis au mois de novembre afin dviter la scheresse printanire.
2.7. Production mondiale de la fve

10
 Chapitre I

La fve reprsente une production mondiale de 3515748 tonne. La chine est le plus grand
pays producteur avec1650000 T pour la campagne 2009/2010, puis vient lEthiopie en
deuxime position avec une production de 610845T. La France est classe en troisime
position (FAO, 2010) (Tableau 3).
Tableau 3 : La production mondiale de fve, campagne 2009/2010.
Position Pays Production (T)
1 Chine 1650000
2 Ethiopie 610845

3 France 438338

4 Egypte 297620

5 Maroc 153040

6 Australie 192000

7 Soudan 112500

8 Royaume-Uni 100000

9 Italie 97408

10 Tunisie 70210

11 Prou 69634

12 Rpublique arabe syrienne 37782

2.8. Production nationale de la fve

La nouvelle politique du Ministre de lAgriculture et du Dveloppement Rural vise un
dveloppement conomique du pays et se fixe comme objectif, la scurit alimentaire. Dans le
cadre de cette politique, dix programmes spcifiques et prioritaires ont t tablis ; ils
concernent les productions vgtales et le dveloppement des lgumes secs.
La fve est cultive dans diffrentes rgions du pays, les superficies se sont accrues de 23180
ha en 2008/2009 et ont atteint les 2483465 ha en 2010/2011. On distingue deux priodes de
semis, celle dhiver vers la fin dt pour les zones du sud, dont le dbut de la rcolte

11
 Chapitre I

seffectue au mois de novembre puis, la deuxime priode de semis au printemps pour les
zones du nord.
La zone de production de la fve en Algrie, en plus des plaines ctires, est reprsente par :
Les plaines dintrieur : Wilaya de Tlemcen, Guelma, Mascara, Boumerds et
Constantine.
Les hauts plateaux : Mda, Relizane, Ain Defla, Msila et Bouira.
Les zones du sud du pays : Biskra, Adrar et Ghardaa.

La production de la fve dans quelques rgions de louest Algrien est prsente dans le
tableau (4).

Tableau 4 : Production de la fve verte dans louest algrien au cours des campagnes :
2008/2009 ; 2009/2010 et 2010/2011 selon le Ministre de lAgriculture et du Dveloppement
Rural.

Wilaya Campagne Campagne Campagne

2008/2009 2009/2010 2010/2011

Superficie Production Superficie Production Superficie Production

(ha) (qx) (ha) (qx) (ha) (qx)

Tlemcen 1799 47900 1838 79600

1711 78500
Mascara 1544 57400 1511 68395
1823 92085

Ain
668 32112 947 44939
Timouchent 1196 148900

Relizane 640 19200 931 37240

1365 54600

2.9. Contraintes majeures de la production de la Fve

Les principales contraintes qui limitent la ralisation de plein potentiel de rendement de la
fve et de la fverole et qui provoquent une instabilit du rendement sont abiotiques et

12
 Chapitre I

biotiques. Leur importance relative, varie cependant en fonction de la localisation

gographique et des conditions agro-cologiques de la production agricole.
2.9.1. Principales contraintes abiotiques
Daprs Zaghouane (1991), en Algrie la production de la fve est limite par diffrents
facteurs environnementaux et techniques.
Contraintes environnementales
Les contraintes environnementales sexpriment notamment par :
Le gel pendant la floraison, provoquant la coulure des fleurs et la mortalit des plantes.
Le sirocco (vent chaud venant du sud), affectant la production des gousses et limitant
aussi la grosseur des graines.
Contraintes techniques
La production de semences certifies est faible, elle ne rpond pas aux besoins du pays
;
Le semis est ralis la main et le manque de main-duvre constitue une contrainte
majeure la production ;
La fertilisation minrale dont le phosphore et le potassium (P et K) est trs limite,
mme dans le secteur priv ;
La rcolte et le battage sont galement raliss la main. Labsence dun mcanisme
appropri pour la rcolte et le battage ne permet pas une meilleure maitrise de cette
opration.
2.9.2. Principales contraintes biotiques en Algrie
La fve (Vicia faba L) est soumise plusieurs maladies et ravageurs parmi lesquelles nous
pouvons citer : les insectes, les nmatodes etc. qui constituent des contraintes majeures
pour son amlioration, son dveloppement et la stabilit de la production.
3. Le microsymbiote (les rhizobia)

Les rhizobiums ou rhizobia, sont les bactries arobies du sol. Leur nom signifie
tymologiquement ce qui vit dans les racines. Les rhizobia sont les partenaires symbiotiques
des lgumineuses, ils induisent la formation des nodules lintrieur desquels ils fixent
lazote atmosphrique en Ammoniac forme utilisable par les plantes (Schultze et Kondorosi,
1998 ; Albrecht et al., 1999) en change, la plante hte fournit la bactrie un micro-habitat
favorable et les substrats carbons issus de la photosynthse (Dommergues et al., 1999).

13
 Chapitre I

La capacit des rhizobia former des nodules repose sur la prsence dans leur gnome dun
ensemble de gnes de nodulation indispensables la symbiose. Les gnes nod sont impliqus
dans la biosynthse de facteurs Nod, qui sont des lipochitooligosaccharides qui agissent
comme molcules signal et induisent la formation des nodules (Parniske et Downie, 2003 ;
Perret et al., 2000).

Pendant longtemps, les proprits symbiotiques sont restes la seule base de la caractrisation
des rhizobia mais actuellement l'on a complt l'tude classique des caractres phnotypiques
par celle de la structure gnomique (Krishnan et Bennet, 2007). La classification des rhizobia
est en constante modification et les propositions de remaniements futurs seront nombreuses
(Wang et Martinez-Romero, 2001 ; Hewedy et al., 2014),

3.1. Mthodes appliques ltude de la diversit des rhizobia

3.1.1. Mthodes phnotypiques

Les mthodes phnotypiques reposent sur la dtermination des caractristiques
morphologiques, biochimiques, et physiologiques des bactries via des techniques
standardises (Vandamme et al., 1996 ; Graham et al., 1991).
Les critres morphologiques fournissent des renseignements concernant les caractristiques de
la cellule bactrienne (forme, prsence de flagelles, coloration de Gram, prsence
dendospores) et laspect des colonies observes sur la bote de culture (taille, forme, couleur,
tat de la surface). Les principales mthodes biochimiques sont bases sur la dtermination de
lactivit de diffrents enzymes caractristiques de certains groupes de bactries.
Ltude des caractres physiologiques impliqus dans lidentification bactrienne repose sur
la dtermination de la vitesse de croissance, la sensibilit des tempratures, pH et salinit
extrmes, des antibiotiques et de mtaux lourds. Ces analyses physiologiques sont souvent
influences par les facteurs environnementaux
Les caractristiques phnotypiques classiques sont toujours admises comme tape primordiale
pour la description et lidentification des souches dune mme espce (Vandamme et al.,
1996). Il est important de noter que les taxonomistes bactriens prescrivent que ces critres
phnotypiques soient pris en compte lorsqu'un auteur veut dcrire une nouvelle espce.
*Principales caractristiques phnotypiques des rhizobia
Les rhizobiums constituent 0.1 8 % de la flore bactrienne totale du sol, ils se prsentent
sous forme de coccobacilles ou en btonnets rguliers de 0.6 0.8 m de large sur 1 4 m

14
 Chapitre I

de long (Dommergues et Mangenot, 1970 ; Vincent, 1974 ; Jordan, 1984), arobies strictes
(Pelmont, 1993), Gram ngatifs et asporuls (Jordan, 1984 ; Bekki, 1983), gnralement trs
mobiles quand ils sont jeunes grce la prsence dun seul flagelle polaire ou 2 6 flagelles
pritriches (Bergeys, 1984). Quand ils sont gs, ils possdent un ou plusieurs granules
rfringents de poly--hydroxydurate (Duhoux et Nicole, 2004).
Ces bactries se trouvent soit ltat libre ou ltat symbiotique sous forme de bactrodes
avec une taille dix fois plus grande. Ces derniers ont une forme en X, Y et T (Dommergues et
Mangenot, 1970). Sur milieu YEM glos (Vincent, 1970), ces bactries forment des colonies
de 2 4 mm de diamtre aprs 3 5 jours dincubation, de couleur blanchtre ou beige,
circulaires, convexes, semi translucides ou opaques, leves et mucilagineuses (Duhoux et
Nicole, 2004). Les rhizobiums sont des bactries msophiles, leur temprature optimale de
croissance se situe entre 25 et 30 C (Elkan, 1992), cependant certaines espces de S. meliloti
peuvent se dvelopper une temprature de 42,5C (Affiana et Alexander, 1992).

3.1.2. Mthodes gnotypiques

Le dveloppement de la biologie molculaire a permis ltude des relations phylogntiques
entre les microorganismes par lutilisation de techniques qui ciblent directement les molcules
dADN et dARN.

De nombreuses techniques ont t dveloppes et largement utilises pour dtecter des

polymorphismes dans de nombreux organismes, notamment les bactries. Parmi ces
techniques, la technique de RAPD est une raction en chane polymrase (PCR) pour dtecter
des polymorphismes dans l'ADN gnomique (Oliveira et al., 1996 ; Hewedy et al., 2014).
Labes et al. (1996) ont propos cette mthode pour l'identification et le regroupement
phylogntique des isolats de Rhizobium. La Technique RAPD-PCR fournit des informations
fiables sur la diversit des populations de Rhizobium dans les sols (Hewedy et al., 2014).
Graham et al. (1991) ont suggr des normes minimales pour la validation de nouvelles
espces bactriennes, qui sont fondes sur les caractristiques gnotypiques (squenage du
gne ARNr 16S, hybridation ADN-ADN, analyse RFLP) et la description des
caractristiques morphologiques et symbiotiques.
Les hybridations ADN/ADN sont parmi les techniques les plus importantes jusqu ce jour
pour la description dune nouvelle espce bactrienne (Graham et al., 1991 ; Vandamme et
al., 1996 ; Stackebrandt et al., 2002). Cette technique reste cependant fastidieuse et dlicate
raliser, et ne reste accessible qu un petit nombre de laboratoires spcialistes. Un autre
15
 Chapitre I

inconvnient de la technique est li la nature mme du gnome des rhizobia, qui peut tre
compos pour une grande part jusqu 50 % dADN plasmidique, par dfinition non stable
dans la cellule et qui pourrait grandement influencer les rsultats des hybridations. Ces
inconvnients laissent penser que les hybridations ADN-ADN sont appeles jouer un rle
moins prpondrant lavenir pour la description despce et plus de poids devrait tre donn
lavenir aux analyses de gntique des populations et de phylognie, bases sur des donnes
de squences de plusieurs gnes situs le long du gnome (Zakhia et de Lajudie, 2006).
Le squenage de lADNr 16S est devenu le critre le plus prcieux dans la classification
bactrienne. Les squences codant pour lARNr16S sont constitues de zones trs conserves
et de parties de squences trs variables (Woese, 1987 ; Schleifer et Ludwig, 1989 ;
Stackebrandt et Goebel, 1994). La mthode connat son extension avec la constitution de
banques de donnes rassemblant les squences de trs nombreuses espces bactriennes et qui
sont disponibles dans des bases de donnes consultables sur Internet. Il en va de mme pour
les programmes informatiques indispensables lalignement des squences, au traitement des
donnes et la construction darbres phylogntiques. Les tudes phylogntiques qui
permettent laffiliation dune espce un genre sont essentiellement bases sur la
comparaison des squences dADNr 16S.
Nanmoins, La classification actuelle des BNL repose encore sur le squenage de lADNr
16S. Cette classification est nanmoins satisfaisante car elle permet la sparation des
diffrents genres dcrits jusqu ce jour, mais tenant compte des limites cites plus haut, il
devient clair que les arbres phylogntique bass sur un seul gne ne refltent pas la relation
phylogntique et volutive entre taxons en raison de la possibilit de transferts horizontaux
de gnes, et de phnomnes de recombinaison donnant des squences mosaques (Coenye et
al., 2005 ; Vinuesa et al., 2005 ; Eardly et al., 2005).

Le dveloppement de nouvelles approches gnotypiques visant tudier les squences du

gnome entier offrent une plus grande quantit dinformation possible analyser avec le
dveloppement doutils de bioinformatique. Actuellement les structures du gnome entier de
prs de 160 bactries ont t dtermines et le squenage de plusieurs centaines de gnomes
bactriens sont en cours (Ussery, 2004). Chez les BNL, des gnomes entiers ont t
squencs : Ensifer meliloti 1021 (Galibert et al., 2001), Bradyrhizobium japonicum USDA
110 (Kaneko et al., 2002), Mesorhizobium loti MAFF303099 (Kaneko et al., 2000),
Rhizobium etli CFN42 (Gonzalez et al., 2006), Rhizobium leguminosarum 3841(Young et al.,
16
 Chapitre I

2006) et dernirement Rhizobium leguminosarum bv trifolii strain WSM2304 (Reeve et al.,

2010).

Le squenage des gnomes entiers constitue une vritable rvolution dans le domaine
bactriologique en gnral et taxonomique en particulier, de nouveaux outils sont
actuellement dvelopps en gnomique et qui permettent ltude de la diversit des rhizobia.
Les plus utilises sont la technique MLSA et les puces ADN (DNA microarrays) (Coenye et
al., 2005).

3.2. Les rhizobia associs la fve

L'une des proprits majeures de la symbiose Rhizobium-lgumineuse est sa spcificit. En

effet, chaque souche de rhizobiums ne peut infecter quun nombre limit despces de
lgumineuses. La notion de symbiovar (sv) a t introduite pour diffrencier les bactries
dune mme espce mais qui possdent une gamme dhte diffrente. Lespce R.
leguminosarum est un des exemples les mieux dcrits dans la littrature. Les symbiovars
phaseoli, trifolii et viciae nodulent rciproquement les espces des genres Phaseolus,
Trifolium et Vicia/Pisum. Cette distinction en biovars repose sur le spectre dhte qui est lui-
mme li au type de gnes symbiotiques hbergs par la souche (Jordan, 1984 ; Rogel et al.,
2011).
Plusieurs travaux ont montr une grande diversit gntique dans les populations naturelles
des rhizobiums nodulant Vicia faba L en particulier Rhizobium leguminosarum (Palmer et
Young, 2000 ; Zhang et al., 2001 ; Laguerre et al.,2003 ; Moschetti et al., 2005 ; Mutch et
Young, 2004 ; Depret et al., 2004 ; Depret et al.,2008 ; Aoki et al., 2010).
Rhizobium fabae (Tian et al., 2008) a t dcrit par la phylognie de ARNr, atpD et recA.
Cette espce isole de Vicia faba en Chine est capable de noduler le pois (Tian et al., 2008), et
son gne nodC est similaire celui du symbiovar viciae (Rogel et al., 2011).
Sadi et al., (2014) ont identifi un groupe de rhizobiums isol de la fve au Prou, l'Espagne
et la Tunisie comme une nouvelle espce du genre Rhizobium nomme Rhizobium laguerreae
sp. nov. (Figure 2) en hommage la chercheuse Giselle LAGUERRE en utilisant le gne
ribosomique ARNr 16S comme mthode rapide didentification des souches.

Zhang et al.(2015) ont propos une nouvelle espce Rhizobium anhuiense sp. nov. regroupant
quatre souches isoles de nodules racinaires de Pisum sativum et Vicia faba cultivs dans
l'Anhui et du Jiangxi provinces de Chine. Ces souches appartiennent au genre Rhizobium mais
17
 Chapitre I

taient distinctes de toutes les espces de Rhizobium connus par analyse phylogntique des
ARN ribosomique 16S et des gnes de mnage. Les gnes symbiotiques de ses souches
savoir les gnes nodC et nifH indiquaient quelles pourraient former des nodules efficaces
avec Pisum sativum et Vicia faba, et des nodules inefficaces avec Phaseolus vulgaris.

Figure 2: arbre phylogntique bas sur la sequence du gene r RNA 16S (1317pb) montrant les
relations entre les Rhizobium laguerreae sp. nov. et les especes lies troitement. La signification
de chaque branche est indique par une valeur (Saidi et al., 2014).

18
 Chapitre I

4. Principales contraintes environnementales limitant la fixation symbiotique de

l'azote

Dune manire gnrale, les tudes agronomique et cologique des rhizobiums portent non
seulement sur leurs proprits symbiotiques (pouvoir de nodulation, efficience, spcificit et
spectre dhte) mais aussi sur leur capacit dadaptation aux contraintes environnementales
qui affectent la fixation de lazote. Selon Hungria et Vargas (2000) les principaux facteurs
environnementaux limitant la relation symbiotique Rhizobium-lgumineuse sont la scheresse,
la salinit, les hautes tempratures, les pH acides extrmes. Diverses tudes ont montr que la
diversit de lespce R. leguminosarum peut tre influence par dautres facteurs biotiques et
abiotiques tels que le type de sol, le gnotype de l'hte, les pratiques agricoles, laugmentation
du taux de nitrate dans le sol, les mtaux lourds et les biocides (Palmer et Young, 2000 ;
Mutch et Young, 2004 ; Bourion et al., 2007 ; Lakzian et al., 2001 ; Depret et al., 2004).

4.1. Temprature extrme :

Les rponses la temprature varient considrablement suivant les souches. La croissance des
microorganismes dans la rhizosphre, l'infection, le dveloppement du nodule et le
fonctionnement de la symbiose seraient plus affects aux tempratures infrieures de 20C
(Reddell, 1993). De mme les fortes tempratures inhibent la nodulation (Dommergues et al.,
1999) et rduisent l'activit fixatrice de N2 (Dommergues et al., 1999, Kichou et Sahraoui,
2001 ; Mafongaya, 2004). Lorsque les tempratures du sol sont leves en surface, la
nodulation a tendance tre localise dans les horizons plus profonds (Graham, 1992).

4.2. Dficit hydrique

Un excs dhumidit ou une scheresse prolonge affecte ngativement les deux partenaires
et toutes les tapes de l'tablissement et de fonctionnement de la symbiose Rhizobia-
lgumineuse (Serraj et al., 1999 ; Reddy et al., 2003). De nombreux auteurs ont travaill sur
ladaptation des rhizobiums aux conditions de scheresse, et ont montr quil existe une
variabilit de leur tolrance face au stress (Athar et Johnson, 1997 ; Rehman et Nautiyal ,
2002 ; BenRomdhane et al., 2009). Le manque deau affecte la diversit des rhizobiums et
19
 Chapitre I

induit une diminution significative dans le nombre et le rendement des nodules (Mnasri et al .,
2007 ; BenRomdhane et al., 2009).

4.3. Effet de l'acidit sur la symbiose

Vlassak et Vanderleyden, (1997) ont rapport que la nodulation des lgumineuses est rduite
en sol acide, principalement dans les premires tapes de l'infection racinaire. La rduction de
la nodulation se manifeste trs nettement lorsque le pH du sol est <5.0 (Raddell, 1993).
L'acidit du sol provoque des troubles de la nutrition minrale, la fois chez le Rhizobium et
chez la plante hte (Skerman, 1982). Lapinskas et al. (2005) ont montr que l'acidit du sol a
t un facteur dterminant dans la propagation et l'efficacit symbiotique de Rhizobium
leguminosarum. bv.viceae.

4.4. Effet de la toxicit sur la symbiose

La toxicit du milieu (mtaux lourds, polluants) affecte moins gravement le microorganisme

lui- mme que la plante hte ou le processus de fixation de N2, c'est le niveau de tolrance de
la plante hte la substance toxique et non celui du microorganisme fixateur de N2 qui
dtermine le seuil de fixation de N2 (Dommergues et al., 1999).

4.5. Effet de la salinit sur la symbiose

L'inhibition de la nodulation et de la fixation de l'azote chez les lgumineuses sous stress

salin, peut s'expliquer en partie par l'incapacit des rhizobia survivre dans le milieu salin
(Craig et al., 1999). La salinit affecte l'initiation, le dveloppement et le fonctionnement des
nodules. L'infection semble l'tape la plus sensible au sel. Velagaleti et al. (1990) et Serraj et
al. (1994, 1995) ont montr que le NaCl inhibe l'activit de la nitrognase et la respiration des
nodules en diminuant la disponibilit de l'oxygne. La baisse de la conductance nodulaire la
diffusion de l'oxygne est responsable de l'inhibition de l'activit nitrognasique (Drevon et
al., 1995 ; Irekti et Drevon, 2003). Les plantes nodules poussent mieux que les mmes
plantes non nodules lorsqu'on les cultive dans un sol lgrement salin (Dommergues et al.,
1999).

4.6. Effet de l'azote disponible sur la symbiose

Lazote disponible (azote nitrique et azote ammoniacal) inhibe la formation des nodules et la
fixation dazote atmosphrique (Skerman, 1982 ; Dommergues, 1999). Cette inhibition
s'explique par le fait que la fixation de N2 exige plus d'nergie que l'assimilation du nitrate ou
20
 Chapitre I

de l'ammonium. L'azote disponible agit diffrents niveaux, correspondant diffrentes

tapes de l'infection, il peut y avoir :

Rduction ou suppression de la production des substances inductrices (flavonoides,

btaines).
Rduction de l'excrtion des diffrents facteurs Nod.
Non perception par la plante du signal Nod (Mckay et Djordjevic, 1993 ; Schultze et
al., 1994).

5. Utilisation des engrais en Algrie

Les fumiers et les composts sont avant tout des amendements de sol. Ils amliorent la
structure, augmentent lactivit biologique et contribuent maintenir lhumus du sol. En
marachage, ces matriaux ne sont pas seulement utiliss comme amendements, mais sont
souvent utiliss comme fertilisants. En effet, le sol a beau tre en bon tat, il faut apporter de
lazote aux lgumes et aussi du phosphore et de la potasse pour obtenir un bon rendement.
Toutefois, une fertilisation base uniquement sur les composts et les fumiers nest pas
toujours cologique ou quilibre, car les quantits de phosphore apportes au sol sont
souvent trop leves par rapport aux besoins des lgumes.
L'Algrie, malgr ses richesses, ses potentialits et ses capacits, utilise peu dengrais
comparativement au Maroc (Asmidal, 2004) (figure 3). L'utilisation semble se stabiliser
autour de 45 units d'lments nutritifs/ha. Ces dernires annes l'agriculture algrienne ne
consommait que 100000 tonnes d'lments fertilisants environ par an alors que, selon la
moyenne mondiale, la consommation devrait se situer 850000 tonnes par an (Asmidal,
2004).

Lutilisation des engrais minraux en Algrie est faible, lagriculteur des pays dAfrique
utilise moins de 10Kg / ha dengrais minraux comparativement aux pays dvelopps ou les
doses annuelles dengrais minraux appliqus peuvent atteindre 500 Kg/ ha (Van Reuler et
Prins, 1993).

Lvolution de la consommation dengrais (N, P, K) nest pas rgulire. Elle a t, durant les
40 dernires annes, modifie suite aux diffrentes politiques agricoles et aux diffrentes
phases et tapes ayant marqu la restructuration du secteur agricole (FAO, 2005).

21
 Chapitre I

Figure 3 : Tendance de l'utilisation des engrais en Afrique du Nord (1990-2000).

(ASMIDAL, 2004).

Malgr limportance de la fertilisation dans lamlioration de la production vgtale, lusage

de cette technique reste limit au niveau de lAlgrie, au vu des donnes climatiques
(pluviomtrie et eau dirrigation) et des prix levs des engrais.

L'utilisation des engrais par l'agriculture nest pas connue exactement, sauf pour les
agriculteurs chargs du programme d'intensification des crales et pour les agriculteurs
cultivant la pomme de terre. (FAO, 2005). Le tableau (5) prsente les doses d'azote et de
phosphore recommandes en fonction de la pluviosit de la rgion concerne.

Tableau 5 : Doses d'azote et de phosphore utilises en fonction de la pluviosit (INVA-ITGC,

1997).
Pluviosit < 400 mm 400-600 mm > 600 mm
Elment fertilisant N N N
kg/ha
Jachre travaille 34 67
Fourrages 34 67 100
Lgumes secs 67 100
Pomme de terre irrigue 34 67
Bl 34 67 100

Lazote est lun des facteurs les plus limitant pour la croissance des plantes, lvolution de la
consommation dengrais azot est reprsente dans la figure (4).

22
 Chapitre I

Figure 4 : volution de la consommation dengrais azote (N) en Algrie.

De nombreux sols contiennent 3 5 tonnes dazote par hectare, pratiquement sous la forme
exclusivement organique et essentiellement dans la couche laboure (25 30 cm de
profondeur).
-
Lazote minral est prsent dans le sol sous trois formes dions : nitrique (NO ou azote
2
+ -
nitreux), ammonium (NH ou azote ammoniacal), nitrate (NO ou azote nitrique). La
4 3

disponibilit en nitrate est sous la dpendance de nombreux processus comme la

minralisation et la nitrification dont lintensit dpend des facteurs climatiques (temprature,
humidit), des caractristiques du sol (texture, pH et structure du sol) et de lactivit
microbienne.
La disponibilit du nitrate est affecte par lorganisation microbienne, la dnitrification
(transformation de lazote nitrique en azote gazeux) et le lessivage (entranement du nitrate
vers le sous-sol par percolation de leau en excs, possible en priode automnale et hivernale)
(Mary et Justes, 2001).
Il existe un autre moyen dapporter de lazote aux lgumineuses par inoculation avec des
bactries symbiotiques.

6. Inoculation rhizobiennne

Linoculation des lgumineuses est le processus d'introduction dans le sol d'une souche de
Rhizobium spcifique, slectionne pour son efficacit symbiotique et son pouvoir comptitif
23
 Chapitre I

pour la nodulation. L'inoculation assure donc la prsence d'un grand nombre de rhizobia
slectionns (Sanginga et al., 1994 ; Date, 2000) qui favorise l'infection des racines, la
nodulation, la fixation de l'azote atmosphrique (Dufresne, 2004), stimule les racines et
amliore la croissance.
L'inoculation des lgumineuses avec des souches effectives provoque une amlioration du
bilan azot du sol et du rendement de croissance des lgumineuses et rduit l'utilisation de
fertilisants azots chimiques qui sont nergtiquement dispendieux et polluant. Les premiers
inoculums, constitus de bactries telluriques, qui, introduits dans les lgumineuses,
apportaient celles-ci de lazote, ont t commercialiss en 1898.
6.1. Slection des souches rhizobiennes appropries
Un inoculum est un produit contenant des microorganismes qui permettent de fixer lazote
atmosphrique.
La production dinoculum ncessite lutilisation de souche de rhizobiums spcifiques de la
lgumineuse cultiver (Cleyet - Marel, 1988 ; Vincent, 1970). Trois conditions doivent tre
remplies pour produire un inoculum avec la souche rhizobienne slectionne :
La souche de Rhizobium doit tre trs efficiente, capable de fixer l'azote avec la
lgumineuse pour laquelle l'inoculum est recommand (Kannaiyan et al., 2000),
rsistante laction ltale de divers facteurs physiques (temprature leve,
dessiccation, salinit) (Baraibar, 2000 ; Jebara et al., 2001 ; Cacciari et al., 2003 ;
Maougal, 2004) ; chimiques (pH, substances toxiques) (Cacciari et al.,2003) ou
biologiques (bactries, champignons) (Cacciari et al.,2003).
La souche de Rhizobium doit tre comptitive (Cacciari et al.,2003 ; Thiao, 2005), elle
doit tre capable de former des nodules sur le systme racinaire de la plante hte en
prsence d'autres souches de Rhizobium, et les empcher dinfecter les racines
(Catroux et al., 2001 ; Deaker et al., 2004).
La souche de Rhizobium doit prsenter un taux de survie trs lev dans le sol
(Vincent, 1970 ; Thiao, 2005), mme en absence de la plante hte et tre capable de
coloniser la rhizosphre de la plante (Laguerre et al., 2003).
Il est toujours souhaitable de tenir compte lors de la slection des souches, du niveau
de fertilit des sols o elles seront utilises. En effet, il a t dmontr que certaines
souches sont plus aptes que dautres la fixation en prsence de fortes doses dazote
combin ou dans des sols carencs en potassium (Dommergues et Mangenot, 1970).

24
 Chapitre I

6.2. Les diffrents types dinoculum

Il existe de nombreux inoculums commerciaux qui se rapprochent des principaux types
suivants (Bashan, 1998) :
Inoculum solide
Dans ce type dinoculum, la culture de rhizobiums est mlange un support finement broy,
dont le pH est proche de 6.5, qui protge les rhizobiums pendant le stockage et facilite leur
adhsion sur la graine. La tourbe non acide reste le meilleur des supports, elle nest pas
difficile obtenir et produire et elle maintient une grande concentration de bactries viables,
mais elle peut tre remplace par la vermiculite qui est facilement strilise et fournit une
aration suprieure et de lespace pour une prolifration microbienne (Graham-Weiss et al.,
1987).

Inoculum granul
Cet inoculum permet de sparer les rhizobiums de la graine si cette dernire est traite par des
insecticides. Il est constitu par des micros granules obtenus partir dun inoculum en poudre
agglomr avec des paillettes dargile (Graham-Weiss et al., 1987).
Inoculum liquide
Linoculum est constitu par la culture liquide de rhizobiums qui est dilue au moment de
lemploi. Ce produit doit tre conserv 4C (Tittabutr et al., 2007). Il peut tre ajout aux
graines avant le semis ou appliqu directement dans la raie de semis.
6.3. Conservation et emploi de linoculum
Linoculum est un produit biologique vivant qui ne peut tre stock et utilis comme un
engrais inerte, il ncessite donc certaines prcautions pour sa conservation et son emploi : La
conservation de linoculum doit se faire 4C et la temprature ne doit jamais dpasser 30C
(Maougal, 2004). Au moment de linoculation il est recommand de travailler dans un local
frais, labri du soleil. Dans tous les cas, bien lire ltiquette qui prcise le mode demploi de
linoculum, et la date limite dutilisation.
6.4. Techniques dinoculation
On distingue deux modes dinoculation :
Linoculation Directe : les graines sont enrobes dans linoculum avant le semis
(enrobage) (Kannaiyan et al.,2000).
Linoculation Indirecte : linoculation est ralise dans le sol au moment du semis
(microgranuls-inoculum liquide) (Kannaiyan et al., 2000).
25
 Chapitre I

6.5. Facteurs affectant la rponse linoculation rhizobienne

Linoculation des plantes avec des rhizobiums slectionns ne donne pas toujours leffet
positif sur les lgumineuses fixatrices dazote sur lesquelles elle a t applique (Slattery et
Pearce, 2002).
La rponse positive ou labsence de rponse linoculation peuvent dpendre soit de la
qualit de linoculum lui-mme, soit des caractristiques symbiotiques de la plante ou des
proprits du sol (Heijnen et Van Veen, 1991), soit encore dune ou plusieurs des
composantes du systme sol-plante-microorganismes (Slattery et Pearce, 2002).

26
Chapitre I

27
 Chapitre II
Diversit phnotypique et symbiotique des
rhizobianodulant la fve (Vicia fabaL) dans
louest algrien.
 Chapitre II

1. Introduction
Les associations symbiotiques fixatrices dazote sont trs diversifies et sont responsables de
prs de la moiti de la fixation biologique dazote molculaire du globe ; les plus connues et
les mieux tudies sont tablies entre des bactries du sol de type rhizobia et des plantes de la
famille des lgumineuses (de Faria et al., 1989).
Les critres dterminants la slection de bactries symbiotiques dans un cosystme reposent
non seulement sur la compatibilit avec la plante-hte, mais galement sur la capacit
dadaptation aux sols et la comptitivit vis vis des autres souches pour linfection. Cette
compatibilit est dtermine par linfectivit et lefficience qui varient en fonction de lespce
bactrienne. Elle repose aussi sur la capacitdela plante fixerla quantit dsire del'azote qui
dpend denombreux facteurs tels quel'efficacitde la souchedesymbioteet d'autres
facteursdaphiqueset environnementaux (par exemple : salinit, lacidit des sols)
Nanmoins, il est ncessaire didentifier linoculum biologique avant de lappliquer au
champ. Lidentification microbienne repose actuellement sur une approche polyphasique
(Graham et al., 1991 ; Wayne et al., 1987 ; Vandammeet al., 1996 ;Stackebrandtet al., 2002 ;
Gilliset al., 2005) faisant intervenir des caractristiques phnotypiques, gnotypiques et
phylogntiques. Jusqu la fin des annes 60, la taxonomie bactrienne tait base sur une
analyse phnotypique. Cette analyse reposait essentiellement sur ltude de la morphologie de
la cellule bactrienne; des caractristiques physiologiques et biochimiques, notamment celles
du mtabolisme des sources de carbone par emploi de galeries miniaturises (BIOLOG,
BIOTYPE, API) ; lanalyse des acides gras cellulaires (Jones et Krieg, 1984 ; Suzuki et al.,
1993) ; tude du profil protique total par SDS-PAGE (Laemmli, 1970 ; Roberts et al., 1980 ;
de Lajudie et al., 1994) et la technique de Multilocus Enzyme Electrophoresis (MEE)
(Selanderet al., 1986 ; Wang et al., 1999 ; Jebaraet al., 2001).
Dans notre tude nous avons slectionn des souches de rhizobia isols de Vicia faba L. de
diffrentes rgions de louest algrien. Ces souches ont t caractrises phnotypiquement
par tude de leur tolrance et sensibilit diffrents facteurs physiologiques et leur
mtabolisme des carbohydrates. Ces souches ont t galement testes pour leur pouvoir
infectifs vis--vis de leur plante hte en hydroponie sous conditions contrles. Ce pouvoir
infectif est ncessaire pour pouvoir classer les isolats parmi les BNL (bactrie nodulant les
lgumineuses) (Zakhia et delajeudie, 2006). Les rsultats de la caractrisation phnotypique et

27
 Chapitre II

du pouvoir infectif en condition

ditions contrles a permis de slectionner les
es meilleures
mei candidates
pour des essais en grandeur
ur nature.
nat
2. Matriels et mthodes
2.1. Prospection et chantillo
antillonnage
2.1.1. Sites dchantillonnage
nnage
La collecte des nodules partir
parti des racines de diffrentes plantes de Vicia
icia fabaL est ralise
au niveau de six sites dchanti
chantillonnage (figure 5) : Mostaganem (latitude
itude 35.93
3 et longitude
0.12 E), Oran (latitude 35.63 et longitude 0.62 W), Ain Tmouchent
ent (latitude
(la 1.11 W et
longitude 35.28), Tlemcenn (latitude
(lati 34.88 et longitude 1.32 W), Mascara
scara (latitude 35.40 et
longitude 0.14 E) etRelizane
ane (latitude
(la 35.73 et longitude 0.54 E). Cess sites se trouvent dans
des zones tage bioclimatiqu
matique semi-aride o la pluviomtrie varie entre 300-600 mm, la
temprature se situe aux environ
nvirons de 5C en hiver et varie de 32C 35C
5C en
e t. Ces rgions
sont rparties selon lchelle
elle bio
bioclimatique dHemberger de ltage aride
ide hiver
h froid jusqu
ltage humide hiver doux.
ux. Les
Le diffrents sites varient en altitude de 80 m 810 m.

La slection et lchantillonnag
llonnage des nodules doivent tre raliss durant
urant une priode bien
prcise, o la plante est enn phase
phas de floraison ; la rcolte est effectue en hiv
hiver durant le mois
de dcembre et janvier. A cette priode de lanne les nodules sont bienn dvelopps
dve et visibles
au niveau des racines et ddune couleur rougetre qui indiquee la prsence de la
Lghmoglobine ncessaire
ire la fixation active de lazote.

La collecte est ralise suivant

uivant la mthode de Vincent (1970) : Une creuse
creus denviron 15cm
au tour de la plante et 20 cm de profondeur est
ralise afin de rcuprer tout l
lappareil racinaire ;les
racines sont ensuite places
laces dans des sacs en
plastique et transportes
tes immdiatement au
laboratoire.

28
 Chapitre II

Sites dchantillonnagee (Oran,

(Ora Mostaganem, Tlemcen, Mascara, Relizane ett Ain T
Tmouchent)

Figure 5 :Carte gographique dAlg

dAlgrie reprsentant la localisation des sites
dchantillonnages(Oran, Mostagan
staganem, Tlemcen, Mascara, Relizane et Ainn TmTmouchen)

2.1.2. Collecte des nodules

29
 Chapitre II

Au laboratoire, les raciness sont rinces leau courante ; les nodules sont eensuite dtachs
1-2 cm de leur point dattache,
tache, puis rincs et schs avec du papier filtre
ltre selon
se la mthode de
Gourret et Rubulier (1985).
985). Une partie des nodosits est utilise
lise ddirectement pour
lisolement ; et lautre partie
rtie a subi
s une conservation.
Les nodules sont de diffrentes
rentes formes de type indtermin, Bilobs et polylo
polylobs(Figure 6).

A B

C
I

Figure 6 : Aspects des nodules de Vicia fabaL

(A) Bilob
ilobs, (B) polylobs, (C) forme indtermin

2.1.3. Conservation des nodules

nodu

30
 Chapitre II

Pour une conservation de longue dure, nous avons utilis un dessiccateur spcial : le chlorure
de calcium (CaCl2) anhydre qui permet une longue conservation (6 12 mois) (Vincent.,
1970).
La dessiccation est ralise dans des tubes essai rempli au de leur volume, par du CaCl2
anhydre recouvert dune couche de 1 cm de coton card, sur lequel sont dposs les nodules.
Les nodosits ainsi conditionnes sont conserves au rfrigrateur.
2.2. Isolement et purification des isolats bactriens

Les nodules sont dsinfects en surface par immersion dans de lhypochlorite de sodium 3
% (m/v) pendant 3 min. Ensuite, ils sont rincs 10 fois avec de leau distille strile pour
liminer toute trace dhypochlorite de sodium commerciale. Chaque nodule est cras dans un
tube Eppendorf contenant deux gouttes deau distille strile. Une goutte du broyat obtenu est
tale laide dune anse sur milieu YEM en bote de Ptri (Vincent, 1970) (Annexe 1).

La puret des souches est vrifie par puisement sur milieu YEM jusqu lobtention de
colonies isoles.

2.3. Vrification de la puret des isolats

2.3.1. Observation macroscopique

Il est conseill dobserver les colonies laide dune loupe binoculaire afin de vrifier leur
puret aprs puisement. Lobservation macroscopique permet de dterminer la couleur, la
taille, la forme, le contour des colonies, ainsi que la puret des souches.
2.3.2. Observation microscopique
Un contrle supplmentaire par la coloration de Gram (Annexe 2) permet de diffrencier sur
la base de la composition de la paroi cellulaire entre les bactries qui sont Gram ngatif
(comme les rhizobia) et les autres bactries Gram positif. La coloration de Gram doit son
nom au mdecin danois Hans Christian Gram qui mit au point le protocole en 1884.
2.3.3. Absorption du rouge Congo
Les colonies typiques de rhizobiums absorbent faiblement le rouge Congo (Jordan, 1984 ;
Somasegaran et Hoben, 1994) par rapport aux contaminants oles souches occupent le nodule
sans fixation de lazote.
Nous avons cultiv les souches sur milieu YEM contenant 0,0025% de rouge Congo et incub
les boites dans lobscurit 28C.

31
 Chapitre II

2.3.4. Conservation des souches

souch
Les colonies pures dont les cellules
cel sont des bacilles courts Gram ngatif,
ngat sont repiques
strilement sur milieu YEM
EM inclin
in et incubes 28C pendant 48 72 h. Les tubes sont
ensuite conservs 4C pour uune dure de 3 mois. Pour une conservation
rvation de longue dure
dpassant les 6 mois, les souches
souche sont conserves 80C dans du YEM
M liquide
liqu ensemenc et
additionn de glycrol (600 %).
2.3. Test dinfectivit des souches
sou vis--vis de leur plante hte en culture
cultur hydroponie

Les souches extraites des

es nodosits
nod de lgumineuses ne peuvent tre identifis comme
rhizobia quaprs avoir effectu
ffectu le test de nodulation, montrant leurr capa
capacit former des
nodosits sur leur plante hte, en conditions bactriologiques contrles
les (SubbaRao, 1977).
Pour raliser ce test nous avons procd comme suit :
2.3.1. Dsinfection, germinat
mination et mise en culture de la fve
Nous avons utilis pour ce tes
test une varit locale de Vicia fabaL, provenant
proven du centre de
formation professionnelle en agriculture
ag de Misserghine (Figure 7).

Figure
igure 7 : Aspect des graines de Vicia fabaL.

Les graines de Vicia fabaL.. sont dsinfectes dans de lhypochlorite

rite de
d sodium (32C)
pendant 1 min puis rinces
es 10 15 fois avec de leau distill strile afin
fin dliminer
d les traces
du dsinfectant et mises ensui
ensuite imbiber dans de leau distille strile
trile pendant 24h. Les

32
 Chapitre II

graines ainsi traites sont transf

transfres aseptiquement dans de leau glose
se 1 % et incubes
lobscurit pendant 4 jourss 28 C (Tillard et Drevon, 1988) (Annexe 3).

Aprs la germination dess grain

graines, lensemble des plantules obtenuess don
dont la longueur des
radicelles est de 2 cm sont
ont transfres
tra dans des flacons de 250 ml conte
contenant une solution
nutritive dcrite par Fahreus
us (19
(1957) (Annexe 4).

2.3.2. Inoculation des plantes

lantes in vitro

Linoculation des jeunes plants de Vicia fabaLest ralise 48 heures aprs leur transfert en
flacons opaques, avec 1 mL de culture bactrienne en phase exponentielle
ntielle de croissance, en
effectuant trois rptitionss par ssouche. Des tmoins ngatifs non inoculs
culs sont
s paralllement
considrs. Les plantes sont
ont tra
transfres dans une chambre de culturee un
une temprature de
25C, une intensit lumineuse
euse de
d 2000 lux et une photopriode de 16H (Figu
(Figure 8).

Figure 8 : Aspect
Aspe des plants de Vicia fabaL aprs une semaine
semai de
lin
linoculation dans la chambre de culture

2.3.3. Estimation de la croissance

croissa
Aprs quatre mois de croissan
oissance dans la chambre de culture les plantes
antes sont dterres, la
hauteur des parties ariennes, l poids sec de la partie arienne (PSA) et celui de la partie
nnes, le
racinaire

33
 Chapitre II

(PSR) des plantes sont mesurs ; le poids sec est obtenu par un schage des racines et des
parties ariennes (tiges et feuilles) 70C pendant 48h.
Cette mthode permet de comparer lefficience des souches inocules sur des plantes poussant
sur un milieu sans azote (Domenach et Wery, 1989).
2.3.4. Analyse statistique
Toutes les valeurs du test dinoculation reprsentent la moyenne de trois rptitions. Les
rsultats ont fait lobjet dune analyse de variance un seul facteur (effet souche). Le seuil de
la probabilit utilis pour dterminer la signifiance est P < 0.05, quand le logiciel
STATISTICA indique un effet significatif.
2.4. Caractrisation physiologique des souches

Les facteurs environnementaux affectent fortement la croissance des rhizobiums, leur survie
dans le sol et tous les aspects de la fixation symbiotique de lazote. Parmi les facteurs les plus
importants figurent le pH, la salinit et la temprature.

2.4.1. Sensibilit des souches la salinit

Ce test permet dtudier leffet du sel sur la croissance des souches. Lvaluation de la
tolrance au sel est effectue par culture des souches sur du milieu YEM glos renfermant
des teneurs croissantes en NaCl (0, 3M, 0,4M, 0,6M, 0,8M, 1M, et 1,5M). Lincubation dure
72 heures 28C. Trois rptitions sont ralises pour chaque traitement et la croissance des
souches est value par lapparition de colonies dans les boites de Ptri.
2.4.2. Sensibilit des souches la temprature
Afin de dterminer leffet de la temprature sur la croissance des souches, nous avons
cultives les souches sur milieu glos YEM et incubes diffrentes tempratures 5C,
10C, 15C, 35C, 40C et 45C (Lupwayi et Haque, 1994) pendant 72 heures.
2.4.3. Sensibilit des souches au pH
Le milieu YEM prpar est tampon quatre valeurs de pH (4, 5, 9,11). Les boites sont
ensemences avec les diffrentes souches et incubes 28C pendant 72H.
2.4.4. Croissance sur milieu YEM contenant du Bleu de Bromothymol
Chacune des souches testes est mise en culture dans des boites de Ptri contenant du milieu
YEM glos additionn de Bleu de Bromothymol (annexe 4) qui est un indicateur color de
pH. Aprs cinq jours dincubation 28C, on note si la souche a acidifi (couleur jaune) ou
alcalinis le milieu de culture (couleur bleu). Dans le cas dune acidification on parle de
34
 Chapitre II

souche de rhizobiums croissance rapide et dans le cas dune alcalinisation on parle de

Bradhyrhizobium (rhizobiums croissance lente) (Jordan 1984).
2.4.5. Rsistance aux antibiotiques

La rsistance aux antibiotiques a t frquemment utilise dans ltude des rhizobiums

comme un moyen didentification (Beck et al., 1993).
Le principe est bas sur lobservation de la croissance bactrienne en prsence des
antibiotiques par diffusion partir des disques dans le milieu YEM glos. Les antibiotiques
utiliss : Ampicilline (10g), acide Nalidixque (30g), Streptomycine (10g), Erythromycine
(15g), Ttracycline (30g), Chloranphnol (30g) et rifamycine (30g).
2.4.6. Capacit dassimilation des substrats carbons

Lassimilation de substrat carbon est dtermine sur le milieu (Hugh et Leifson, 1953)
(Annexe 5). Un indicateur de pH qui est le pourpre de Bromocresol 0,2% est ajout ce
milieu. Une solution glucidique de 10% de chaque sucre (Manitol, Sorbitol, Cellobiose,
Saccharose, Maltose, Galactose, Raffinose et Glucose) est ajoute dans 100 ml de milieu. Le
mtabolisme des sucres provoque une acidification du milieu qui se traduit par le virage de
lindicateur color vers le jaune.
2.5. Analyse numrique
Les rsultats de la caractrisation phnotypique et physiologique sont codifis sous forme
binaire et un dendrogramme phnotypique est construit par le logiciel STATISTICA7 sur la
base de 34 de caractres.

35
 Chapitre II

3. Rsultats et discussion

3.3. Isolement des rhizobiums :

Lisolement des bactries partir des nodules racinaires rcolts in natura nous a permis
dobtenir une collection de 140 isolats issus de Vicia fabaL (varit locale) partir
dchantillons de plantes provenant des six wilayas (Mostaganem, 0ran, Mascara, Relizane,
Tlemcen et Ain Tmouchent) (Tableau 6).

Tableau 6 : Nombre disolats bactriens obtenu partir des nodules rcolts in natura dans
louest algrien

Nombre de sites Nombre de plantes Nombre de nodules Le nombre total des

par site par plante souches

6 4 6 144

3.4. Caractristiques morphologiques

3.4.1. Caractristiques macroscopiques
Cinquante pour cent des souches purifies prsentent les caractristiques morphologiques des
rhizobia (Dommergues et Mangenot, 1970). Elles forment sur milieu YEM glos des
colonies homognes le long des stries, elles sont circulaires de 2 4 mm de diamtre,
contour rgulier, de surface lisse, bombe, et dune couleur blanchtre crme et marques
par une trs forte mucosit qui augmente avec le temps dincubation (Figure9). Nos rsultats
sont en accord avec ceux de Getaneh (2008) et Zerihun (2006) qui ont observ des
caractristiques similaires de Rhizobium isols de la fverole.

Selon Upchurch et Elkan (1977), Bekki (1992), Zahranet al. (1994), la viscosit des colonies
est due une production massive dexopolysaccharides qui peuvent avoir un rle dans la
tolrance des souches la salinit.

3.4.2. Caractristiques microscopiques

36
 Chapitre II

Laspect microscopique est visualis aprs coloration de Gram : 40 isolats prsentent une
forme coccobacille Gram ngatif (figure 10) le reste des isolats sont gram positif. Ces
caractres morphologiques observs sont en accord avec ceux dcrits pour des rhizobiums
(Vincent, 1970 ; Dommergues et Mangenot, 1970 ; Jordan,1984 ; De Lajudiet al.,1994 ;
Rome et al., 1996) et ce sont ces isolats que nous avons gards pour la suite du travail.

3.4.3. Croissance sur YEM + rouge Congo (0,0025%)

Le test de croissance des souches sur milieu YEM glos additionn de rouge Congo, suggre
que les souches sont pures car elles nont pas absorb le colorant (Figure 11). Ce critre a t
observ depuis longtemps chez la majorit des rhizobia (Jordan, 1984 ; Vincent, 1970) et
rcemment chez les rhizobia associs la fve dans la rgion de TahtayKoraro dans le nord-
ouest de lEthiopie (Solomon et Fassil, 2014). Nanmoins, dautres auteurs dont
Zerihun,(2006) et Getaneh, (2008) rapportent que certaines souches de rhizobiums isols de
Vicia fabaL peuvent absorber le rouge Congo.

37
 Chapitre II

Figure 9 : Aspect macroscopique de la souche FT16 sur

milieu YEM aprs 72H dincubation.

1m

Figuree 10 : Aspect microscopique de la souche FM24 aprs

col
coloration de Gram. (Grossissement1000)

Figure 11 : Aspect
Aspec macroscopique de la souchesFM24 sur milieu YEM contenant
le rouge Congo
go aprs
apr 72H

38
 Chapitre II

3.5. Test de nodulation

Deux caractristiques l'infectivit (la capacit former des nodules) et l'efficience (Capacit
fixer l'azote), sont souvent utilises pour valuer la relation cologique et volutive entre les
rhizobiums et l'hte (Brockwell, 1998). Les souches de Rhizobium ont tendance tre plus
efficientes sur lhte partir duquel elles ont t prises que sur les autres espces (Nutman,
1965), cest pour cette raison que nous avons test les proprits symbiotiques des souches sur
leur plante hte Vicia fabaL.

Aprs six semaines de croissance en chambre de culture, nous avons mesur la longueur des
tiges de chaque plante, compter le nombre de nodules forms et compar les poids secs des
parties ariennes et racinaires de toutes les plantes. Lanalyse statistique des rsultats obtenus
a t effectue laide du logiciel Statistica (Annexe 3).

Les rsultats obtenus partir du test de nodulation montrent que 30 souches sur les 40
souches testes ont renodul leur propre plante hte aprs quatre semaines de croissance.

Linfectivit des souches est un critre cl dans lauthentification des rhizobia(Ouartsi et al.,
2011), Cest pour cette raison que nous avons slectionn les souches renodulantes pour la
suite du travail. Les 10 autres souches qui nont pas rinfect leur plante hte ont t
conserves pour des tudes ultrieures notamment en biologie molculaire afin didentifier
avec prcision leur position taxonomique. Il est utile de rappeler que chez la majorit des
rhizobia les gnes symbiotiques ncessaires linfection sont ports sur des plasmides qui
peuvent tre perdus (Zhang et al.,2001).

La souche FM 24 anodul prcocement sa plante hte (20 jours aprs linoculation). Dans une
tude ralise par Heinrich et al. (2001), certaines souches de E. meliloti et R.
leguminosarumbv. viciae capables de mtaboliser la rhizopine L-3-O-methyl-scyllo-
inoasamine (3-0-MSI) profitaient dun avantage considrable dans la nodulation qui survient
14 jours aprs inoculation, les autres souches ont infect leur plante hte aprs 20 jours.

39
 Chapitre II

3.5.1. Morphologie des plantes

plant inocules

Compars aux plantes tmoins,

oins, les plantes inocules sont plus vertes et prsentent
pr un tallage
plus dvelopp (figure 12).
). Les nodules observs se situent au niveau des ra
racines secondaires
de la fve et sont de type indtermin
indte de 2 3 mm de longueur. Cette morphologie
morph des plantes
de Vicia faba L tudies est en accord avec les donnes de la littrature
re qui rapportent que les
reprsentants de cette espce
ce produisent
pr tous des nodules de types indtermi
termins (Hirsch et al.,
2001). Les nodosits sont
nt de couleur rose qui indique leur richesse
sse en leghmoglobine
compos indispensable la fixation
fixa de lazote (Blondeau, 1981) (Figure 133).

Les plantes inocules ontt montr

mont une diversit dans leurs croissance,, nombre
nomb de nodules, la
hauteur des parties ariennes et le poids sec des parties ariennes

FR36
FM24

Tmoin
oin

Figure 12 : Aspect des parties

pa arienne des plantes de Vicia fabaL.
L. inocules
ino par
les deux souches (FM24,
M24, FR36) aprs 6 semaines de croissance en chambre
cha de
culture et en conditions
ions contrles
c

40
 Chapitre II

Nodules

Nodules

Figure 13 : Aspect dess racines

racin des plantes inocules par la souche FR36 (A),
FM24 (B) et le tmoin (C) aprs
a 6 semaines de croissance en chambre
bre de culture et
en conditions contrles
3.5.2. Nombre de nodules
41
 Chapitre II

Lvaluation de linfectivit est dfinie par le nombre moyen de nodosits formes sur chaque
plante et par chaque souche (Legesse et Assefa, 2014). Lvaluation du taux de nodulation
consiste compter le nombre de nodules. Dans notre tude, sur les 40 souches testes en trois
rptitions/plante, 30 isolats ont renodulVicia fabaL mais avec une variation dans le niveau
de nodulation entre 3 et 27 nodules par plante suivant la souche inoculum.
Ainsi, la souche FM24 isole de la rgion de Mostaganem est la plus infective, avec 28
nodules/plante ; suivie par la souche FZ 7.1 provenant de Relizane avec 23 nodules. Les
souches FM24.5 et FR26.4.2 sont les moins infectives elles proviennent respectivement de
Mostaganem et Mascara (Figure14).
Le nombre moyen de nodules produit dans cette tude est infrieur celui obtenu dans
dautres tudes. Zerhou, (2006) ;Getaneh (2008) et AlemayehuWorkalemah, (2009), ont
observ un nombre de nodules suprieur 87 nodules chez la mme plante Vicia fabaL.
Selon Belay et Assefa (2011) la variation du nombre de nodules peut tre due une faible
densit de rhizobium (inoculum) ou bien l'incompatibilit des souches ou aux facteurs
daphiques qui influencent leur efficacit.

3.5.3. Mesure de la hauteur des tiges

La mesure de la hauteur des tiges est un indicateur de croissance des plantes. Dans notre
tude, les plantes inocules ont un meilleur dveloppement que le controle. Ceci se traduit par
une hauteur de tige allant de 79 90 cm chez les plantes inocules avec les souches FM24 ;
FM19.4, FZ28.4 et FR14.2 contre 52cm chez le tmoin(Figure 15).
Leffet de linoculation sur la hauteur des tiges a t observ par plusieurs auteurs.
(Merabetet al., (2007) ont obtenu une meilleure croissance de Medicago (M. ciliaris et M.
polymorpha) inocules avec des souches de Ensifer (E. meliloti et E. medicae) compare au
tmoin.
La souche FM24 est celle qui a induit la meilleure croissance arienne et cest la mme qui a
t la plus infective avec un nombre lev de nodules compar aux autres souches inoculums.
Dans la littrature certains auteurs,Aouani et al. (2003) suggre une corrlation significative
entre le nombre de nodules et la croissance vgtale chez le pois chiche (Cicer artietinum).
Drevonet al., (2003) font les mmes observations entre la croissance de lharicot et sa
nodulation en Lauragais (Tunisie).

42
 Chapitre II

3.5.4. Comparaison des poids secs des parties ariennes des plantes
De nombreuses tudes ont montr que le poids sec est un bon indicateur de l'efficacit de la
souche de Rhizobium, car il existe une relation entre la production de matire sche et la
capacit des lgumineuses fixer l'azote (Somasegaran et Hoben, 1994 ; Sorwil et Mytton,
1986 ; Pepleset al., 2002).

La matire sche des plantes inocules par les diffrentes souches est illustre dans la figure
(16). Les plantes inocules ont montr des effets significatifs en poids sec des parties
ariennes en comparaison avec le tmoin. Toutes les souches ont augment la biomasse
arienne des plantes en comparaison avec le tmoin lexception des souches FR31.4 et
FM20.4 originaires respectivement de Mascara et Mostaganem. La biomasse des parties
ariennes des diffrentes plantes inocules varie de 1.53g 0.48g. Les plantes inocules avec
la souche FC12.3.2 sont celles qui ont prsent la meilleure biomasse arienne bien que le
nombre de nodules soit faible compar aux autres plantes inocules.

Ces valeurs de la biomasse des parties ariennes sont quivalentes celles obtenues par
Solmon et Fassil (2014) en Ethiopie chez des plants de Vicia faba L dans les mmes
conditions de culture en pot, et infrieures celles obtenues par Mouafek, (2006) sur des
cultures de Vicia faba L au champ dans la rgion de Biskra. Une telle diffrence peut tre due
aux conditions de culture des plantes en pots ou en hydroponie qui semble tre limite par le
volume rduit explor par l'appareil racinaire.

Le nombre de nodules form chez une lgumineuse indique linfectivit de la souche vis--vis
de sa plante hte, nanmoins la russite de la symbiose rhizobia/ lgumineuse dpend de
lefficience de cette mme souche vis--vis de son hte. Ainsi, certaines bactries induisent
peu de nodules effectifs sur le systme racinaire de leur plante hte compar dautres
souches ineffectives mais qui induisent un grand nombre de nodules rudimentaires chez leur
hte. Dans la littrature, cette exemple est bien illustr chez Medicagopolymorpha qui
prsente une meilleure rponse linoculation par Ensifermedicae quavec Ensifermelilotiqui
induit la formation de plus de nodules mais moins efficientes (Rome et al., 1996 ; Brunel et
al., 1996 et Merabet, 2007).

43
 Chapitre II

45
40
Nombre de
35
nodosit
30
25
20
15
10
5
0

FR83

FR7.1.2

FR14.2.3

T
F0 4.1
FM 9.2
FR 26.4.2
FR 36.2
FR 81
FT 17
FZ 7.1
FC 12.3.2
FZ 28.4
FR 14.2
FT 16
FR 14.2.4
FM 20.4
FM 24
FM 19.4.2
FZ 33.4
FR 7.1
FR 7.5

FR 8
FR 29.3
FR31.4

FM20.4.2
FR26.4
FM19.4
FR36.1

FM 24.5
FR 36
-5

souche

Figure 14 : Infectivit des souches

ches de
d rhizobia isoles de Vicia fabaL estime par le nomb
nombre de nodules aprs
6 semaines de croissance en chambr
hambre de culture en conditions contrles

100
90
80
la hauteure 70
de la 60
partie 50
arienne 40
(cm) 30
20
10
0
FR 26.4.2

FR 81
FT 17

FT 16
FR 14.2.4

FR83
FR 8

FR31.4
FR7.1.2

FR26.4
FM19.4
FR36.1
FR14.2.3

FR 36
T
F0 4.1
FM 9.2

FR 36.2

FZ 7.1
FC 12.3.2
FZ 28.4
FR 14.2

FM 20.4
FM 24
FM 19.4.2
FZ 33.4
FR 7.1
FR 7.5

FR 29.3

FM20.4.2

FM 24.5

souche
Figure15 : La hauteur des parties
rties ariennes
a de plantes inocules aprs 6 semaines de croissance
cro en conditions
contrles.

2
1,8
1,6
Poids sec de la 1,4
partie 1,2
arienne (g) 1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
F0 4.1
FM 9.2
FR 26.4.2

FR 81
FT 17
FZ 7.1

FZ 28.4

FT 16
FR 14.2.4
FM 20.4
FM 24
FM 19.4.2
FZ 33.4

FR83
FR 8

FR31.4
FR7.1.2
FM20.4.2
FR26.4
FM19.4
FR36.1
FR14.2.3
FM 24.5
FR 36
T
FR 36.2

FC 12.3.2

FR 14.2

FR 7.1
FR 7.5

FR 29.3

souche

Figure 16 : Biomasse
masse des parties ariennes sches de plantes inocules
es apr
aprs 6 semaines
44
de croissance en chambre
cham de culture
 Chapitre II

3.6. Etude des caractristiques physiologiques

Les rhizobia sont exposs dans le sol laction de divers facteurs abiotiques, notamment les
sels, le pH et la temprature, qui limitent leur croissance et leur activit symbiotique avec la
plante hte (Zahran, 1999 ; Prieferet al., 2001 ; Chiminingwa et Vessey 2006 ; Brigidoet al.,
2007). Pour le bon fonctionnement de la symbiose Rhizobia- Vicia faba L, une bonne
synergie entre les deux partenaires symbiotiques et les facteurs dapho-climatiques du milieu
est indispensable. Il est donc primordial didentifier en premier lieu les Rhizobia autochtones
nouvellement isols puis slectionner ceux qui peuvent survivre et maintenir une haute
performance symbiotique sous les diffrentes contraintes de lenvironnement (El-Halili,
2006).

Le seuil de tolrance de 30 souches renodulantes des racines de Vicia fabaL aux diffrents
facteurs abiotiques a t valu. Les rsultats sont regroups dans le tableau (7).

3.6.1. Sensibilit la temprature

La croissance des bactries est influence par la temprature car, les tempratures leves
engendrent la dshydratation et la dgradation des enzymes de la voie mtabolique des
bactries, elle affecte galement la diffrenciation des rhizobia en bactroides ainsi que le
fonctionnement de la nodosit. Par contre, les basses tempratures entranent la glification de
leau cellulaire et linactivation irrversible des enzymes et elles inhibent lexpression des
gnes nodet donc linfection et la nodulation (Young et al.,2011).
La majorit de nos souches (tableau 7) se dveloppent des tempratures comprises entre 15
40 C lexception de deux souches FC12.3.2 et FR14.2.3 originaires respectivement de
Tlemcen et Mascara qui ont prsent une bonne croissance sur YEM solide 10C. Ceci est
probablement d aux conditions climatiques prsentes dans ces deux rgions situes dans
ltage bioclimatique semi-aride, caractris gnralement par des tempratures autour de 10
avec une temprature minimale absolue pouvant aller jusqu moins 6C (Anonyme 1). Dans
la littrature, les rhizobia, comme toutes les bactries du sol, peuvent tre inhibs par
l'lvation ou la diminution de la temprature d'incubation (Jordan, 1984). Dans une autre
tude, Zahran (1999) rapporte quune adaptation des tempratures leves des souches de
rhizobia pourrait tre observe et serait lie au climat d'origine, ce qui explique la croissance
de certaines souches des tempratures extrmes telle que les souches FR.26.4.2 et FM24 qui
peuvent se dvelopper 40C.
45
 Chapitre II

Les souches de notre tude sont majoritairement msophiles ceci est en accord avec les
rsultats de Belay et Assefa (2011) etLindstromet Lehtomaki (1988) qui ont montr que les
rhizobiums isols de Vicia faba L sont msophiles et capables de crotre des tempratures
allant de 10 et 37 C avec une temprature optimale de croissance de 28 C.

3.6.2. Sensibilit au NaCL

Il a t rapport que la concentration de sel peut diminuer l'efficacit de la symbiose
rhizobiums / lgumineuse et inhiber les vnements prcoces comme la chimiotaxie, la
colonisation des racines, et la formation de nodules (Hashemetal., 1998). Nos rsultats
montrent que les souches se comportent diffremment face au stress salin (figure17). La
sensibilit des souches diffrentes concentrations de NaCl reprsent dans le tableau (7)
montre que toutes les souches ont une bonne croissance sur milieu YEM additionn de 0.7%
de NaCl et que la moiti dentre elles tolre jusqu 1% de NaCl.
Berrada et al., (2012) ; Abdul Wahab et Zahran (1979) ; Zerhari et al., (2000) ont isol de
Vicia fabaL des souches qui tolrent jusqu' 5 M de NaCl. Dautre chercheurs loppos
Shamseldin et al., (2009) et Moschetti et al., (2005) ont montr que des souches isoles de
nodules Vicia faba en Egypte et en Italie ne peuvent se dvelopper quen prsence de faibles
concentrations de NaCl de lordre de 0,1 et 0,2 M de NaCl.

3.6.3. Sensibilit au pH
Lacidit du sol menace la survie des rhizobiums et affecte les signaux molculaires entre les
deux partenaires et par consquent limite la nodulation (Graham et al., 1994 ; Hungriaetal.,
2000). La fixation dazote dpend en premier lieu de ltat physiologique de la plante
(Zahranetal.,1999) et en second lieu, de lefficience des microsymbiotes (Somasegaranetal.,
1994) et en dernier de la raction entre les deux partenaires.
Nos rsultats montrent que nos souches peuvent crotresur un large intervalle de pH allant de
valeur acide alcalin modr (pH 4 11) (tableau 7) avec un optimum observ pH 7. Une
majorit des souches (90%) ont pu crotre pH 5 contre 56% tolrants un pH plus acide 4
(figure 18).

60 % des souches se sont dveloppes galement pH alcalin allant de pH 9 pH11. Nos

rsultats sont en accord avec ceux dAbdel Wahabetal. (1993) et Belay et Assefa (2011) qui
ont signal une tolrance de quelques souches associes Vicia faba des pH allant de 5 9.
Dans la mme ide Berrada et al. (2012) ont montr que les souches isoles de lgumineuses
46
 Chapitre II

alimentaires dont le pois chiche et certaines lgumineuses fourragres de la rgion de Fez ont
pu tolrs des pH de 4,8 8,8.

3.6.4. Croissance en milieu YEM contenant de Bleu de Bromothymol

Parmi les diffrences qui caractrisent les Rhizobium des Bradyrhizobium, la vitesse de
croissance in vitro qui est beaucoup plus rapide pour les premiers (temps de gnration de 3
4 heures) que celle des seconds (temps de gnration de 6 8 heures). Mais il existe dautres
caractristiques qui permettent de les distinguer comme l'acidification ou l'alcalinisation du
milieu de culture (Jordan, 1984).
Les souches croissance rapide sont considres gnralement comme des bactries
acidifiantes. Par consquent, elles devraient changer la coloration du BTB vers le jaune
contrairement aux souches croissance lente qui sont considres comme des bactries qui
alcalinisent le milieu de culture (Jordan, 1984).
Sur les 30 souches testes toutes ont produit des ractions acides sur le YEM solide + BTB
(figure 19), lexception de la souche (FR26.4) qui na produit aucune modification du pH du
milieu. Ce caractre suggre que la majorit des souches peuvent donc appartenir au genre
Rhizobium et que la souche FR26.4 est peut-tre membre du genre Bradyrhizobium. Cette
dduction reste confirmer par des mthodes plus fiables notamment celles de biologie
molculaire

Les rsultats rejoignent ceux de Adamuetal. (2001) qui ont montr que les rhizobia associes
la fve du nord de Shoa taient producteurs dacide.

47
 Chapitre II

Tableau 7 :Caractrisation physiologique des souches.

FR.26.4.2

FM19.4.2

FM20.4.2
FC12.3.2

FR14.2.4

FR14.2.3
FR7.1.2
FM .9.2

FM20.4

FM19.4

FM24.5
FR36.2

FR14.2

FR29.3
FR31.4

FR26.4

FR36.1
FZ28.4

FZ33.4
F0.4.1

FR8.1

FR7.1
FR7.5
FR8.3

FR 36
FM24
FZ7.1
FT17

FT16

FR8
Temprature
5C + - - + + + + + + + + - + + + + + + + - - - + - + - + + - +
10C + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - + - + + + + - +
15C + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + +
35C + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + +
40C + - + + - - - - - + + + + + + + + + - - + + - + + - + - + -

Tolrance la salinit
0,1% + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
0,3% + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
0,5% + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
0,6% + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
0,7% + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + +
0,8% - - + + + + + - + + + + + + + + + + + + + - + + - + + + + +
1% - - + - - + + - + + + + + - - + - + + - + - - + - - - + - +

Tolrance au pH
5 + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + - + - + + + + + + +
9 + - - + - + + - - - + - - + + + + + + + + + + + + - + - -
7 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
11 + - + + - + + - - + + - - - + + + + + + + - + + + - + - - -

4 + - - + + - - - + + - - - - + + + - + + - - + + + - + - + +
+ : Bonne croissance, - : pas de croissance,

48
 Chapitre II

3.6.5. Rsistance intrinsque des souches aux antibiotiques

La rsistance aux diffrents antibiotiques est lune des mthodes simples et rapides pour
lidentification et la caractrisation des souches rhizobienne. Les profils de rsistance des
isolats divers antibiotiques ont t tudis afin de fournir des donnes phnotypiques pour
diffrentier entre les souches isoles et pour dterminer la diversit entre les isolats
(Hewedyet al ., 2014).
La slection de souches prsentant une rsistance multiple aux diffrents antibiotiques est trs
intressante du fait que cette rsistance peut tre utilise comme un important marqueur pour
lidentification des souches et l'tude de leur diversit (Joseyetal., 1979 ; Shishido et Pepper,
1990 ; Sawadaetal., 1990).
LAntibiogramme ralis a montr que la majorit des souches prsentaient une rsistance
lAmpicilline, Streptomycine, le Chloramphnicol,l'acide Nalidixique et Erythromycine et
seulement 30 % des souches rsistantes la Ttracycline et laRifamycine(tableau 8). Un
exemple de lantibiogramme de la souche FR31.4 est reprsent dans la (figure 20). Nos
rsultats rejoignent ceux de Odeeetal., (1997) qui ont montr que les Bradyrhizobia sont plus
sensibles que les souches croissance rapide vis--vis des diffrents antibiotiques tests.
Dautre tudes telle que celles de Belay et Assefa (2011) ont montr que les isolats associs
Vicia faba L du nord Gondar affichent la plus grande rsistance la streptomycine et
chloramphenicol. Ainsi que les isolats de l'ouest de Shewa et Hararghe ont montr la capacit
de rsistance chloramphnicol mais elles sont mieux rsistantes la streptomycine
(Gentaneh,2008).
Nos rsultats de la rsistance aux antibiotiques sont similaires aux rsultats obtenus par
Joseyet al., (1979) qui ont montr que les isolats de Rhizobium leguminosarumvar viceaesont
rsistants la streptomycine et lrythromycine. Certains antibiotiques comme la kanamycine
et la streptomycine ont galement t utiliss pour dfinir les diffrents groupes de rhizobia de
Vicia fabaL isols partir des tats-Unis (Brockman et Bezdicek, 1989).
Dautres travaux raliss en Ethiopie sur les rhizobia associs la fve ont montr que les
isolats provenant Wollega ont montr une plus grande sensibilit l'rythromycine et
l'ampicilline (Girmaye, 2009)et ctait le mme cas pour la souche FM19.4.Graham et al.
(1991) ont rapport que l effet inhibiteur dun antibiotique dpend de sa nature et de sa
concentration dans le milieu et que le degr dinhibition est variable dune espce une autre
et dune souche une autre.

49
 Chapitre II

Tableau 8 : Rsistance intrinsque des isolats tests diffrents antibiotiques.

FR.26.4.2

FM19.4.2

FM20.4.2
FC12.3.2

FR14.2.4

FR14.2.3
FR7.1.2
FM .9.2

FM20.4

FM19.4

FM24.5
FR36.2

FR14.2

FR29.3
FR31.4

FR26.4

FR36.1
FZ28.4

FZ33.4
F0.4.1

FR8.1

FR7.1
FR7.5
FR8.3

FR 36
FM24
FZ7.1
FT17

FT16

FR8
Am + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + - + + + +
C - + + + + + - + - + - + - + + + + + + + - + + + + - + + + +
E + + + + + + + + - + + + + + + + + - + + + + + + + - + + + +
TE - + - - - - - - - - + - + + - - + - + + + - - - - - - + + -
Na + + - + + + + + - - + + - + - + + + - - - - - + + - + + + +
R - - - - + + - - - - - - + - - + - + - - + - - + + - - - - +
S - + + + + + + + - + + + - + + + + + + + - - + + + + + + + +
+ : rsistante, - : sensible,

Ampicilline (Am), acide Nalidixque (Na), Streptomycine (S), Erythromycine (E), Ttracycline (TE),
Chloranphnol (C) et rifamycine (R)

3.6.6. Assimilation de substrats carbons

Il a t rapport, que les Rhizobia croissance rapide sont capables de se dvelopper sur une
grande varit de substrats carbons, contrairement aux Rhizobia croissance lente dont
lhabilit assimiler diverses sources de carbone est limite.

Le mtabolisme des glucides est effectu afin de dterminer la source de carbone permettant
une bonne croissance pour les diffrentes souches tudies. Toutes les souches testes ont une
bonne croissance sur le milieu hugh et leifson additionn de glucose et mannitol. 40-63% des
souches se sont dveloppes en prsence de sorbitol, cellubiose et de maltose, 20% des
souches ont utilis le saccharose et deux souches FR14.2 et FR7.1.2 ont pu croitre en prsence
du galactose (figure 21) et seulement une souche la FR8.3 a pu croitre en prsence du
raffinose (tableau 9).

Ces rsultats sont en accord avec ce Stowers (1985), qui rapporte que tous les rhizobiums
croissance rapide, y compris Rhizobium leguminosarumbv.viceae utilisent un large ventail de
glucides comme source de carbone.

50
 Chapitre II

Tableau 9 : rsultats dassimilation de substrats carbons par les souches

FR.26.4.2

FM19.4.2

FM20.4.2
FC12.3.2

FR14.2.4

FR14.2.3
FR7.1.2
FM .9.2

FM20.4

FM19.4

FM24.5
FR36.2

FR14.2

FR29.3
FR31.4

FR26.4

FR36.1
FZ28.4

FZ33.4
F0.4.1

FR8.1

FR7.1
FR7.5
FR8.3

FR 36
FM24
FZ7.1
FT17

FT16

FR8
Assimilation des carbohydrate
manito + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
l
sorbito - - + + + - - - - + - - - - - - + - - - + + + - + - + + + +
l
cellobi - - + + + + + - - + + - - + - + + - - - + + + + + + + + - +
ose
sacchar - - + - + - - - - + + - - - - - - - - - - - - + - - - - - +
ose
maltos + - + - + + + - + + - - - - - + + - - - - - + + - + - - - -
e
galacto - - - - - - - - - + - - - - - - - - - - - - + - - - - - - -
se
raffino - - - - + - - - - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - -
se
glucos + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
e
+ : Bonne croissance, - : pas de croissance, +- : croissance intermdiaire

51
 Chapitre II

Figure 17 :Sensibilit des souches

souch de Figure 18 : Sensibilit
bilit des souches au pH4
0.7% de NaCL

s
Na

Figure 19 : La croissance
ce des
de souches
FO4.1 et FR29.3 en milieu mili
contenant du Bleu de Bromothym
othymol
Figure 20 : Exemple dee rsi
rsistance et de sensibilit aux
YEM diffrents antibiotiques de la souche FR31.4 aprs une
semaine dincubation. Suivant
Suivan lorientation : 1 : Rsiste
lAmpicilline (A) ett sensible
sens Streptomycine (S)
(10g) et acide Nalidixque
que (Na)
(N (30g),

FR14.2

FR712

Figure 21 : Assimilation des substrats carbons

Figur
(Galac
(Galactose) par diffrentes souches tudies.

52
 Chapitre II

3.7. Analyse numrique

Lanalyse numrique englobe la comparaison des caractristiques morphologiques,
physiologiques et biochimiques entre les souches prises deux deux. Cette mthode danalyse
a t utilise comme une premire mthode de caractrisation et de regroupement de
diffrentes souches non encore identifies (Zhang etal., 2002).

Les tudes physiologiques et biochimiques sont la base pour une taxonomie polyphasique
dtaille, mais ils ne peuvent pas tre utilises seuls dans l'analyse taxonomique. Cependant,
les rsultats concernant les sources de carbone, la salinit et la temprature de croissance
peuvent donner des indications sur la position taxonomique des souches (Legesse et Assefa,
2014).
Lanalyse de 34 caractres phnotypiques rsultats des tests phnotypiques raliss
(sensibilit la temprature, tolrance la salinit, sensibilit au pH du milieu de culture)
par le logiciel statistica 7 a permis dtablir un phnodendrogramme (figure 22).

Lanalyse du phnodendrogramme montre la prsence de deux grands clusters et de trois

branches spares reprsentant les souches FC 12.3.2, FT 16 et FR 8. 3.

Le premier cluster A regroupe la souche FM24.5 isole de la wilaya Mostaganem avec la

souche FR7.1 isole de Mascara et en branche part la souche FZ33.4 isole de Relizene. Les
deux premires souches ont presque les mmes caractristiques, elles sont rsistantes des pH
acides, aux tempratures extrmes, et des concentrations de NaCl allant jusqu 0.8%. Elles
prsentent des profils dantibiorsistance proches, elles se distinguent nanmoins dans leur
mtabolisme des carbohydrates, la souche FR7.1 est capable de mtaboliser le maltose et
cellobiose contrairement la souche FM 24.5.

Le deuxime cluster regroupe trois sous-groupes :

Le premier sous-groupe B compte galement deux souches FM24, FM9.2 isoles de

Mostaganem. Ces dernires peuvent tolrer une concentration de NaCl de 0.7%, croitre des
tempratures de10C et 35C et prsentent une bonne croissance pH 5 acide. Elles sont
rsistantes lAmpicilline, acide Nalidixque,Streptomycine,Erythromycine, Ttracycline
etChloranphnolet elles sont sensible la Rifamycin (3), et utilisent le mannitol et le glucose
comme source de carbone. La souche FM24 lavantage de pouvoir mtaboliser galement le
cellobiose. Dans ce groupe la souche FM24 est la plus effective des souches testes en
53
 Chapitre II

conditions contrles en chamb

chambre de culture avec Vicia faba L. (les souches
ouches de ce groupe ont
les mmes caractristiques
es physiologiques
phy avec la nouvelle souche de Rhizobium
Rh fabaesp.
nov. dcouvertes par (Tian et al.,
al 2008).

Le deuxime sous-groupe C est form de deux souches FR29.3 et FM20.4.

20.4. Ces souches sont
halotolrantes et thermophiles
hiles elles
e se sont dvelopps dans un milieu contenant
conte 1% de NaCl
et se dveloppent 40C.
C. La sensibilit de ces souches aux diffrents
rents antibiotiques est
identique. Selon Aurag ett Brhada
Brha (2005) dans des conditions extrmes,
es, en loccurrence sous
stress thermique, des souches
ches de
d rhizobia ayant une capacit suprieure
re da
dadaptation peuvent
tre slectionnes pour unee exploitation
expl effective de la fixation dazote.
Le troisime sous-groupee D est le plus grand, il regroupe 08 souches
hes FR14.2.3,
F FR31.4,
FZ28.4, FZ7.1, FR14.2, FR7.1.2,
FR7.1 FM19.4.2, FR36.2, ces souches peuvent
peuve croitre une
temprature basse 5C, elles sont
s sensibles au pH alcalin mais prsente
rsentent une tolrance
variable envers les pH acides.
ides. E
Elles utilisent le glucose et le manitol comme
omme carbohydrates en
plus du cellobiose et du sorbitol
orbitol pour les souches FR14.2.3, FR31.4, FR36.2.
R36.2.

A B C D

Figure 22 : Dendrogram
ogramme des caractres phnotypiques aprs analyse
analy
numrique par le logiciel
ogiciel statistica 7.

54
 Chapitre II

4. Conclusion

Engnral,l'tudephnotypiquea montr une grande diversit physiologique etbiochimique au

sein de la collection. En effet, lessouches tudiesont une rsistance variable l'encontredes
facteurs de stress, savoir, la temprature, le pH, la salinit, larsistance aux antibiotiques.
Cette diversit phnotypique et linfectivit et de lefficience symbiotique, nous a permis
toutefois de slectionner les bons candidats pour les essais dinoculation de Vicia fabaL au
champ.

Les souches slectionnes pour les tests au champ, vont etre considrs provisoirement
comme Rhizobiumsp. car elles ont une croissance rapide sur milieu YEM. Cependant, la
position taxonomique de ces souches doit tre ultrieurement confirme par une
caractrisation gnotypique.

55
 Chapitre III
Effets de la fertilisation azote, de linoculation par
Rhizobium sp. sur la production de la biomasse, la
teneur en azote et le rendement de la fve dans la
wilaya dOran, Algrie.
 Chapitre III

1. Introduction
Lassociation symbiotique entre les rhizobia et les lgumineuses bnfices rciproques
fournit la bactrie les ressources carbones ncessaires sa croissance, et la plante la
fixation de lazote atmosphrique essentielle son dveloppement. Cette fixation biologique
de lazote atmosphrique constitue la seule voie dentre dazote combin dans le sol, elle
reprsente aujourdhui lchelle mondiale un apport suprieur celui des engrais (Herridge
et al., 2008).
La premire application agronomique date du dbut du XX sicle, ds quil a t possible de
cultiver les rhizobia, ces bactries symbiotiques fixatrices dazote ont t apportes aux
graines des lgumineuses lors du semis. Cette inoculation reprsente la plus ancienne
application des bactries en agriculture. Utilise dans le monde entier, elle est devenue une
pratique agricole commune (Werner et Newtan, 2005 ; Lindstrom et al., 2010). Diffrentes
cultures sont inocules avec des microorganismes, les fourrages comme la Luzerne, et les
lgumineuses graine comme la fve.
La fve est une des lgumineuses alimentaires qui reprsentent une source de protine
importante la fois, pour lhomme et le btail, en particulier dans les pays pauvres, ou les
protines animales sont chres (Hubbell et Gerald, 2003). Elles fournissent galement des
matires grasses et des hydrates de carbone. En outre les lgumineuses sont riches en
minraux pour la construction des os et des vitamines essentielles pour tre en bonne sant
(Porres et al., 2003). La fve est lune des principales lgumineuses cultives en Algrie avec
58000 hectares soit 44,3% de la superficie totale rserve cette culture (Bousaad et al.,
2004).
Dans ce prsent chapitre, nous avons test leffet de diffrents traitements (apport azot,
inoculum biologique et tmoin sans azote) sur la croissance de Vicia faba var. aguadulce.
Nous avons choisi trois souches de Rhizobium sp. Caractrises phnotypiquement et
slectionnes pralablement en chambre de culture sous conditions contrles pour leurs
proprits symbiotiques avec la plante hte.
Le but vis est dvaluer les capacits symbiotiques de trois souches deffectivit diffrente en
grandeur nature.

56
 Chapitre III

2. Matriel et mthodes
2.1. Prsentation du site exprimentale

Notre travail exprimental a t effectu au niveau du centre de formation professionnelle

Agricole de Misserghine (CFPA) (figure23). Cet tablissement a servi dorphelinat et avait
pour objectif de venir en aide cette catgorie de citoyens de la rgion. Durant cette poque le
pre clment, religieux de linstitution dcouvert la clmentine en 1902 fruit de plusieurs
annes de recherche et suite la large exprience accumule dans le domaine de
lagromiculture qui devenait la principale vocation de la ville de Misserghine. La dcouverte
est parue dans la revue Horticole en 1902. En hommage son crateur, le fruit en question
porte ainsi son nom nos jours travers le monde entier.

LOrphelinat est devenu par la suite un centre dducation agricole.

Le centre est localis dans la localit de Misserghine (Latitude : 35 37' 12'' Nord Longitude
: 0 43' 48'' Ouest.) situ dans la Wilaya dOran. Cette dernire est la deuxime ville
dAlgrie. Elle stend sur une superficie de 2144 km2. Elle est limite au Nord par la
mditerrane, et lOuest par Ain Temouchent, lEst par les wilayas Mostaganem et au Sud
par les wilayas de Sidi Bel Abbes et Mascara.
Les caractristiques climatiques, notamment les tempratures et les prcipitations, sont
importantes pour notre tude et mritent quon y accorde une attention particulire.
La Wilaya dOran est une rgion climat mditerranen chaud. Daprs Aschmann (1973) les
rgions climat mditerranen dans le monde ont t identifies comme des zones dans
lesquelles au moins 65% des prcipitations tombent en hiver, les prcipitations annuelles
oscillent entre 275 et 900 mm et la temprature moyenne en hiver est infrieure 15C.
Dans les rgions mditerranennes, indpendamment de la quantit de prcipitations
moyennes annuelles, il existe toujours une priode daridit ou de scheresse estivale (Rivas-
Martinez, 1981 ; Godard et Tabeaud, 2004), et elles sont caractrises par des hivers humides
et temprs et des ts chauds et secs.
Le site dexprimentation de Misserghin possde une exploitation agricole dune superficie de
46,747 Ha rpartie en plusieurs parcelles ; parcelles pdagogiques, parcelles
dexprimentation (rserver luniversit dOran), parcelles de collection, arboretum, jardin
botanique et une parcelle de production en vraie grandeur.

57
 Chapitre III

A. Carte gographique dAlgrie

Missreghin

B. Carte gographique dOran

C. photo de la parcelle dexprimentation

Figure 23 : Localisation du site exprimental (A : carte gographique dAlgrie,

B : Carte gographique dOran, C : photo du champ).

58
 Chapitre III

Avant la mise en place des essais, un certain nombre dinformations sur le milieu taient
ncessaire pour la bonne conduite de lexprimentation notamment la composition du sol.

2.2. Analyses du sol

Des chantillons de sol (100g) sont prlevs dans quatre endroits diffrents de la parcelle
dessai 20 cm de profondeur puis sont mlangs en un seul lot. Des analyses physico-
chimiques sont effectues sur cet homognat.
Le sol a t analys pour dfinir ses caractristiques physico-chimiques. Ces analyses ont t
effectues lINA dAlger.
2.2.1. Analyses physiques (Annexe 7)
A- Analyse granulomtrique :
Lanalyse granulomtrique du sol ou encore appele analyse mcanique, ou analyse physique
a pour but de dfinir la texture dun sol, cest dire le pourcentage de ces divers constituants
(sable, limon, argile), et par l dexpliquer les proprits physiques de ce sol : son
comportement vis vis de leau, de lair et des racines et dvaluer sa stabilit structurale
c'est--dire la solidit de ltat de la structure du sol et sa rsistance aux agents de
dgradation.
Pour cette analyse, la terre fine obtenue par tamisage au tamis mailles 2mm est utilise, la
matire organique est limine par un oxydant nergique (H2O2), la dure dexposition
dpend de la teneur en matire organique (24h 48h). Les particules minrales sont ensuite
disperses laide dun dispersant alcalin (hexametaphosphate de sodium). Les particules
grossires de diamtre suprieur 50 mm sont spares par tamisage, les particules moyennes
et fines sont obtenues par la mesure de la vitesse de sdimentation (Rouiller et al., 1994)
(Annexe 7).
B- Mesure du pH
On pse 20g de terre fine (sche lair) et on leur ajoute 50ml deau distille (pour mesurer
le pHeau). Le mlange est agit pendant quelques minutes, puis laiss reposer 2h. Le pH est
ensuite mesur laide dun pH-mtre aprs une brve agitation (Callot-Dupuis, 1980).
14.2.2. Analyses chimiques (Annexe 7)

Sur lhomognat des chantillons de sol prlevs de chaque bloc ( 20 cm de profondeur), on

a effectu la mesure de la salinit, le dosage du calcaire total et actif, et enfin le dosage de
carbone et de la matire organique dans le sol.

59
 Chapitre III

A. Mesure de la conductivit lectrique

Le principe consiste dterminer la conductivit lectrique (C. E.) de leau pour dterminer la
salinit de lextrait du sol. Elle est effectue en mlangeant 1/5 du sol avec 4/5 deau distille.
Aprs une agitation de quelques minutes la solution est chauffe une temprature T (25C),
une premire lecture est ralise cette temprature (CT), puis chauffer une temprature
T(35C) une deuxime lecture est ralise avec le conductimtre (CT) (Aubert, 1978).
Le coefficient de temprature est calcul comme suite :

= (CT CT) x 100 / (T T) x CT

Le conductimtre est rgl la valeur et la mesure de la C.E. est effectue ; cette dernire
sexprime en milli Siemens (mS).
B. Dosage du calcaire total
Le calcaire joue un rle important dans la structure du sol et la nutrition minrale de la plante
mais il nest pas un constituant toujours prsent dans le sol. Par contre pratiquement tous les
sols contiennent du calcium si peu soit-il, cet lment se trouvant en particulier fix sur
largile sous forme dion calcique ou en solution sous forme de sels solubles de calcium.
Le calcaire ou carbonate de calcium, CaCO3, est un sel insoluble. Mais leau charge de gaz
carbonique peut le dissoudre lentement le transformant en un sel soluble, le bicarbonate de
calcium. Cest ainsi que peu peu le calcaire disparat dun sol donn. Mais la solution du sol
et largile gardent trs longtemps du calcium provenant de la dissolution du calcaire.
On utilise la proprit du carbonate de calcium qui se dcompose sous laction dun acide
(HCl) en eau et gaz carbonique, ce dernier est recueilli dans un tube gradu en ml (Callot-
Dupuis, 1980).

CaCO3% = (p x V) x100 / (P x v)
p : poids du CaCO3 pure utilis pour ltalonnage.
V: volume du gaz carbonique dgag par lchantillon du sol.
P : poids de lchantillon du sol.
v : volume de gaz carbonique dgag par le CaCO3.
C. Dosage du calcaire actif

60
 Chapitre III

Une partie plus ou moins importante de calcaire total se trouve ltat de fines particules
actives pour les vgtaux dans le sol, cette fraction est facilement solubilise par les eaux
riches en gaz carbonique.
On utilise la technique de Drouineau (1942) pour le dosage du calcaire actif, qui prend en
considration la proprit du calcium se combiner aux oxalates dammonium pour donner
de loxalate de calcium insoluble.
Lexcs de solution doxalate dammonium est ensuite dos par une solution de permanganate
de potassium en milieu sulfurique.

2 KMnO4 + 5(NH4)2C2O4 + 8H2SO4 2Mn SO4 + K2 SO4 + 5(NH4)2SO4 + 10CO2 + 8H2O

La teneur en calcaire actif exprime en % est obtenue partir de la formule suivante :
Calcaire actif % = (N-n) x 1.25
N-n: correspond la quantit doxalate de calcium prcipit, donc la quantit doxalate
dammonium qui a ragi avec le calcaire actif.
N: nombre de ml KMnO4 utiliss pour titrer la solution doxalate dammonium.
n: nombre de ml KMnO4 utiliss pour titrer lextrait du sol
D. Carbone total et matire organique
La teneur en matire organique totale du sol sobtient gnralement en dosant la teneur en
carbone. On estime que le rapport matire organique / carbone est peu prs constant et gal
MO/C =1.72.
Le carbone de la matire organique est oxyd par un mlange de bichromate de potassium et
dacide sulfurique (H2SO4). On admet que loxygne consomm est proportionnel au carbone
que lon veut doser.
Lexcs de bichromate inutilis dans la raction est dos par le sel de mohr.
E. Dosage de l'azote total par mthode de kjeldahl :

Le dosage se fait selon la mthode de (Kjeldahl, 1882), Le dosage se fait par la minralisation
de lchantillon en milieu acide sulfurique en prsence de cuivre et dun catalyseur. Dans les
conditions de minralisation, lazote organique est retrouv sous forme dammonium. Les
ions ammonium sont transforms en ammoniac par passage en milieu alcalin. On entrane le
NH3 la vapeur deau et on dose le condenst recueilli par dosage volumtrique acide/base.
F. Carbone total et matire organique

61
 Chapitre III

La teneur en matire organique totale du sol sobtient gnralement en dosant la teneur en

carbone. On estime que le rapport matire organique / carbone est peu prs constant et gal
MO/C =1.72. Le carbone de la matire organique est oxyd par un mlange de bichromate
de potassium et dacide sulfurique (H2SO4). On admet que loxygne consomm est
proportionnel au carbone que lon veut doser. Lexcs de bichromate inutilis dans la raction
est dos par le sel de mohr (Anne, 1945)
G. Dosage du phosphore assimilable
La mthode dOlsen est lune des diffrentes mthodes chimiques dextraction, dont le but est
destimer la part du phosphore, exprim en anhydride phosphorique (P2O5), prsent dans le
sol et susceptible de participer lalimentation des vgtaux. Cette mthode permet de mettre
en solution le P2O5 dit assimilable qui est ensuite dos par photocolorimtrie et exprim en
pour mille () de terre fine et sche, ou en ppm (parties par million) ou en mg/kg.
Le principe de la mthode dOlsen est dextraire le phosphore par agitation avec une solution
d'hydrognocarbonate de sodium pH = 8,5.

La solution alcaline d'hydrognocarbonate peut abaisser la concentration des ions calcium par
prcipitation sous forme de carbonate de calcium et celle des ions aluminium et ferriques par
prcipitation sous forme d'hydroxydes.

La concentration des ions phosphate ( = (CT' -CT) x 100 / (T-T) x CT) augmente en
consquence et le phosphore assimilable peut tre extrait de lchantillon de terre par la
solution d'hydrognocarbonate de sodium et filtration. Cette solution d'extraction tendance
dissoudre les matires organiques, elle donne parfois des extraits colors. Aussi avant de
procder la formation du bleu de molybdne, on utilise du charbon activ pour adsorber les
matires organiques solubles (le carbone activ doit tre exempt de phosphate et n'avoir
aucune action sur les ions phosphate) (Olsen, 1945).

2.3. Essai au champ

2.3.1. Mise en place de lessai

2.3.1.1. Dimension et dcoupage des parcelles

Nous avons suivi la mthode dcrite par Prvoste (2006) des dispositifs en blocs alatoires
complet pour raliser cet essai. Le dispositif comporte plusieurs blocs de parcelles o tous les
traitements figurent une seule fois. Nous avons choisi ce dispositif parce quil prsente de

62
 Chapitre III

nombreux avantages : la maitrise de lhtrognit du sol, facilite lexcution des diffrents

traitements, facilite la comparaison visuelle prcision des rsultats. Cest pour toutes ces
raisons que ce type de dispositif est trs utilis en agronomie.
Lessai comporte cinq traitements rpts quatre fois en blocs compltement alatoires. Une
superficie de 210 m2 ou il n yavait aucune culture de lgumineuse auparavant a t amnage
et prpare pour les essais et spare du reste du champ par une clture. Vingt blocs de 6 m2
spares entre elles par une alle de 1 m ont t prpars. Chaque bloc compte 5 lignes de
fve dune longueur de 3 m spares de 0.5 m entre elles et comportant des puits peu profonds
pour disposer les graines (figure 24).
2.3.1.2. Inoculation des graines de Vicia faba var. aguadulce au champ
Le premier traitement consiste en un apport dazote sous forme de nitrate dammonium, 33,5
% raison de 60 kg dazote par hectare. Le second traitement est constitu de plantes non
inocules et considr comme tmoin. Le troisime, le quatrime et le cinquime traitement
consistent en une inoculation avec Rhizobium sp., choisies parmi les souches isoles (chapitre
2) pour leurs diffrence dinfectivit et defficience avec Vicia faba L en chambre de culture
(voir chapitre 2) dans le but dvaluer le comportement de ses souches au champ.
La souche la plus efficiente en serre FM24 est originaire de Mostaganem, la souche
moyennement efficiente FR36 provient de Mascara ainsi que la souche l moins efficiente
FR26.4.2. La varit de Vicia faba var. aguadulce utilse dans lessai a t fournie par le
centre de formation de Misserghine et provient de lEspagne.
Nous avons commenc lessai par la mise en terre de trois graines de fve dans chaque trou
sur le sommet de la crte avec espacement de 0.5m entre les trous et 0,5 m entre les crtes
(Ouahmane et al., 2006), pour augmenter les chances dobtenir au moins une plante/puits,
puis inoculs au moment du semis avec 5 mL de suspension bactrienne correspondant au
N=5 de lchelle de Mc Farlande (Annexe 6). Les puits sont aussitt referms (Figure 25).
Pour viter toute contamination, les blocs lmentaires tmoins et azotes sont prpares
avant les parcelles inocules.
Les parcelles ont t irrigues immdiatement aprs le semis et ensuite irrigues 5 jours
d'intervalle. Lirrigation, le dsherbage et le binage ont t effectus manuellement.

63
 Chapitre III

1m 0,5 m

Tmoin Tmoin sans

3m Bloc I
Souche 1 Souche 3 azote Souche 2 azote

Tmoin Tmoin sans Souche 2

Souche 3 azote Souche 1 Bloc II
azote

1m

Tmoin Souche 2 Tmoin sans

Souche 3 Souche 1
azote azote Bloc III

Tmoin sans Tmoin

Souche 2 Souche 3 Souche 1
azote azote Bloc IV

Souche 1 : FR36
Souche 2 : FM24
Souche 3 : FR26.4.2

Figure 24 : Schma du dispositif exprimental de lessai au champ

64
 Chapitre III

1 : Parcelle dessai 2 : Bloc dessai

3 : Semis 4 : Inoculation par puits

Figure 25 : Mise en place de lessai et inoculation de graines de la fve au champ

65
 Chapitre III

2.4. Paramtres de croissance analyss

Les mesures ont t effectues en pleine floraison lorsque la nodulation est

potentiellement optimale (Drevon et al., 2003)
Douze plantes par traitement ont t dterres soigneusement avec une bche enfonce
profondment et remue autour du pied pour obtenir la plupart des parties racinaires o se
trouvent la majorit des nodosits. Les plantes prleves sont conserves dans des sachets
pour tre transportes au laboratoire pour le comptage des nodosits et les diffrentes
observations en cours de vgtation.

Nombre de nodosits : Les racines sont rapidement rinces leau, les nodules sont
ensuite dtachs la main et le nombre de nodosits par plante est enregistr.

Biomasse sche des parties ariennes : la matire sche des deux parties est
dtermine aprs schage l'tuve rgle 70C. Une fois les chantillons
compltement secs (on vrifie cela par une constance du poids), leur poids sec est
dtermin l'aide d'une balance de prcision lectronique.
La hauteur des parties ariennes : au stade de la floraison nous avons mesur la
longueur des tiges de chaque plante.
Calcul du rendement :
Le nombre de gousses et de graines : la rcolte les gousses sont dtaches de chaque
plante pour dterminer le rendement de chaque traitement, le nombre de graines par
gousse et galement dtermin.
2.5. Analyse statistique des donnes

Lanalyse multifactorielle de la variance (ANOVA) a t effectue pour dterminer l'effet de

chaque traitement sur les diffrents paramtres de croissance mesurs. Les comparaisons entre
les moyennes de traitements pour les diffrents paramtres mesurs ont t faites par calcul de
l'erreur-type (Gomez et Gomez, 1984). L'objectif de l'analyse statistique est de sparer la
variation due aux traitements, de la variation du au sol, au climat au site et d'autres facteurs
intrinsques.

66
 Chapitre III

3. Rsultats et discussion

Dans cette partie nous prsenterons successivement lessentiel des rsultats obtenus : les
analyses, les mesures et les observations des effets des traitements sur la croissance des
plantes et le rendement en gousses et en graines.
3.1. Analyses physico-chimiques du sol
Les analyses pdologiques et physico-chimiques dun sol donn permettent dapprcier la
fertilit naturelle dun sol, dexpliquer les dficiences de rendements et dorienter vers le
choix des cultures (Soltner, 2005). Elles permettent aussi de rechercher dventuelles
corrlations entre la prsence ou labsence des rhizobia.
A. Analyse physique
Dans la ferme exprimentale o se trouve la parcelle dessai, le type de sol est argilo -
limoneux. La teneur en argile est de 39,66 %, daprs le triangle de texture, ce type de sol est
class parmi les textures quilibres (Annexe 7) (tableau 10).

Tableau 10 : Rsultats des analyses physiques des chantillons de sol prlevs dans la
parcelle dessai. Les analyses ont t effectues lINA dAlger.

Argile (%) 39,66

Limon (%) 37,09

Sable (%) 23,25

Les sols qui contiennent une grande quantit dargile ou dhumus peuvent bnficier dun
effet tampon contre le changement de pH cause de leur capacit dchange cationique
(CEC). Cet effet tampon signifie que, lorsque le sol devient acide, la capacit tampon permet
au pH de demeurer dans la marge de neutralit pour une plus longue priode (Soltner, 2005).
Selon Jules, (1996) les terres loans argileuses constituent les meilleurs sols pour la culture de
la Vicia faba L cause de leur bonne capacit de rtention dhumidit et des lments
nutritifs.

Le pH du sol a une grande influence sur la survie et la multiplication des rhizobiums. Le pH

optimal pour les diverses phases de croissance des rhizobia peut varier, mais en gnral ce
sont des bactries neutrophiles. Des tudes ultrieures ont indiqu que les rhizobia prsentent
67
 Chapitre III

des rponses varies face aux variations du pH (Jordan, 1984 ; Glenn et Dilworth, 1994). Nos
rsultats montrent que le sol test est pH basique 7,90 et qui est daprs Jules (1996)
favorable la culture de la fve (Annexe7).

Cette valeur de pH est approprie la survie des rhizobiums (Tate III, 2000). Selon Jordan
(1984) la majorit des rhizobia peuvent tolrer des pH allant jusqu 9. Le mme rsultat a t
rapport par (Zerhari, 2000 ; Matallah et al., 2002) chez des rhizobia nodulant lAcacia et le
pois chiche. Nanmoins, ce pH alcalin bien quil naffecte pas directement la survie des
rhizobia, prsente un effet ngatif par lindisponibilit de certains minraux important pour la
croissance des rhizobia et de la plante hte comme le fer et le manganse (Bordeleau, 1994).
b) Analyse chimique
Les analyses chimiques montrent que le sol de la parcelle dessai est un peu calcaire (tableau
10). Ce type de sol se caractrise par une structure dure rduisant sa capacit de rtention
deau (Aubert, 1978).
Lazote est llment le plus variable et le plus dficient dans le sol, sa teneur dpend du
pourcentage de la matire organique, des amendements dengrais mais galement des espces
bactriennes fixatrices dazote. Dans notre cas, les teneurs en azote et en matire organique
(tableau11) sont favorables pour une production optimale des cultures en plein champ
(Berhanu, 1980), en outre la concentration du phosphore est adquate pour la croissance et la
culture des lgumineuses (Cottenie, 1980), et suffisante pour lamlioration de la nodulation
et la fixation dazote par les lgumineuses.

Tableau 11 : Les rsultats des analyses chimiques des chantillons de sol prlevs dans la
rgion de Misserghine. Analyses faites LINA dAlger.

Calcaire (%) 21,15

Matire organique (%) 1,12
Azote (g/Kg) 1,90
Phosphore total (mg/kg) 269
Phosphore assimilable (mg/kg) 14,50

68
 Chapitre III

3.2. La croissance des plantes

Aprs deux mois de culture correspondant la pleine floraison lorsque la nodulation est
potentiellement optimale (Drevon et al., 2003), nous avons dterr au hasard douze plantes
par traitement. Nous avons compt le nombre de nodules, et mesur la hauteur des parties
ariennes et la biomasse sche des parties ariennes et racinaires aprs un schage 70C
pendant 72 heures.

3.2.1. Analyse du phnotype des plants inoculs

Visuellement, des plantes inocules et tmoins ont presque le mme aspect phnotypique
(figure 26, 27). Les plantes prsentent des feuilles de couleur verte et un tallage bien
dvelopp. Les plantes prsentent des feuilles de couleur verte avec une diffrence de la
hauteur des parties ariennes qui ntait pas remarquable visuellement.

69
 Chapitre III

A B

C D

Figure 26 : photos des blocs pour chaque traitement aprs 3 semaines de

croissance A : Tmoin sans azote, B : bloc inocul par la souche FM24, C :
70
Tmoin azot, D : bloc inocul par la souche FR36, E : bloc inocul par la
souche FR26.4.2.
 Chapitre III

Figure 27 : Photo de la parcelle dessai aprs deux mois de croissance

3.2.2. Hauteur des parties ariennes

Leffet de linoculation sur la croissance des plantes htes varie en fonction des souches
bactriennes.
Les rsultats de variation de la hauteur de la tige en fonction des traitements sont prsents
dans la figure (28). Cette figure montre que lapplication de linoculation est bnfique pour
le dveloppement et la croissance des plantes par rapport la fertilisation azote, la hauteur
des tiges des plants inoculs varie de 107 cm 127.66 cm. Les plantes inocules avec les
souches FM 24 et FR.26.4.2 ont prsent la meilleure croissance avec une hauteur des tiges de
122.25cm et 127.66 cm respectivement suivies par les deux tmoins (avec et sans azote).

Il apparait ainsi un effet favorable du nitrate (starter) sur la croissance des plantes qui sest
exprim par une meilleure croissance de la partie arienne.
Nanmoins, lanalyse de la variance (Tableau 12) na pas montr une diffrence significative
au seuil de 5 % entre les diffrents traitements tudis.

71
 Chapitre III

Figure 28 : Effet de la fertilisation azote et de linoculation par Rhizobium sp.sur la hauteur des
parties arienne des plantes de Vicia faba var. aguadulce, (TA : tmoin azot, TSA : tmoin sans
azote).

Tableau 12 : Modlisation de la variable hauteur plantes

Source de variation DDL SCE CM Test F Pr

Traitements 4 3628,17 907,04 2,24 0,08
Rsidus 55 22243,83 404,43
Total 59 25872,00

La diffrence entre les traitements pour la variable des tiges nest pas significative (Pr>0.05).

Ces rsultats rejoignent ceux de Hadou et al., (2015) sur le nib qui ont montr que
linoculation rhizobienne na pas augment de faon significative la hauteur des plants Ceci
peut sexpliquer par la prsence des rhizobia indignes prsentant un nombre plus leve que
des souches de collection dont une bonne partie est d'origine trangre (Rodrguez-Navarro et
al., 1999) ou par une quantit dazote organique disponible.

3.2.3. Mesure du poids sec des parties ariennes :

Plusieurs tudes ont montr que le poids sec des parties ariennes est un bon indicateur de
l'efficacit relative de la souche, il y a une bonne corrlation entre la production de matire
sche et la capacit des lgumineuses fixer lazote atmosphrique (Somasegaran et Hoben
1994 ; Sorwil et Mytton 1986 ; Peuples et al., 2002 ; Unkovich et al., 2010).
La matire sche arienne obtenue des cultures tmoins et ensemences est illustre dans la
figure (29) et montre que ce paramtre varie en fonction des traitements. Selon
lhistogramme, le traitement azot et linoculation par la souche FM 24 ont donn une
72
 Chapitre III

meilleure biomasse estime respectivement 50.6 g 45.6 g par rapport aux autres
traitements. Cependant lanalyse statistique des donnes (tableau 13) na pas rvl une
diffrence significative entre les traitements. Ces valeurs sont suprieures celles mesures
par Mouafek (2006) sur la biomasse des parties ariennes de (Vicia faba L) inocule au
champ dans la rgion de Biskra. Une telle diffrence peut tre due aux gnotypes utiliss ou
la nature du sol et aussi la population teste.

Figure 29 : Effet de la fertilisation azote et de linoculation par Rhizobium sp. sur le poids
sec des parties ariennes de la varit de Vicia faba var. aguadulc.

Tableau 13 : Modlisation de poids sec des parties ariennes

Source de
variation DDL SCE CM Test F Pr
Traitements 4 2570,51 642,63 1,30 0,28
Rsidus 55 27195,27 494,46
Total 59 29765,78

La diffrence entre les traitements pour la variable du poids sec des parties ariennes nest pas
significative (Pr>0.05).
Les analyses des diffrents paramtres de croissance (hauteur des tiges, biomasse des parties
ariennes .) des diffrents traitements montrent un effet lgrement positif de linoculation
avec la souche FM24 compare au reste des traitements, mais qui reste faible par analyse de la

73
 Chapitre III

variance. Ceci suggre la prsence des souches de rhizobia indignes comptentes vis--vis de
lgumineuse considre.

Les bactries nodulant les racines de lgumineuses constituent un groupe trs diversifi et
ubiquiste dans les sols (OHara, 2001). Dans le cas de la fve, assez souvent, les souches ont
un pouvoir propre d'infectivit faible ou trs sensible aux contraintes environnementales, ce
qui ne permet pas une symbiose efficace fournissant des quantits substantielles d'azote la
plante hte et au sol. Mais la grande diversit des rhizobia nodulant la fve offre une
importante ressource de germoplasme naturel exploiter pour les caractristiques dsires
(Sadowsky et Graham, 1998 ; Dilworth et al., 2001), ce qui pourrait assurer le succs de
l'inoculation.

3.3. La nodulation

Les nodules observs sur le systme racinaire des plantes examines sont tous de couleur
rouge, indiquant leur richesse en leghmoglobine et donc prsentant une activit fixatrice
dazote ((Legesse et Assefa, 2014).). La forme des nodules est de type indtermin Hirsch,
(1992) ; Dommergues et al., (1999) ont signal que le type des nodosits racinaires des
lgumineuses est dtermine par la plante hte et non par la souche de rhizobia (Hirsch,1992 ;
Dommergues et al.,1999). Ainsi chez la fve, la forme de nodules gnralement observe est
de type indtermin (Corby, 1981).

*La biomasse nodulaire

L'valuation du taux de nodulation consiste dterminer le nombre des nodules forms. Dans
notre tude, le nombre de nodules prsents dans chaque plante est trs lev et donc
impossible dnombrer, nous avons donc prfr peser les nodules dtachs au lieu de les
compter
La mesure de la biomasse sche des nodules est considre comme le paramtre le plus faible
pour valuer le taux de nodulation d'une lgumineuse.
Les variations, en fonction des traitements, de la matire sche nodulaire enregistre durant la
compagne dexprimentation sont reprsentes sur la figure (30).

74
 Chapitre III

Figure 30 : Effet de linoculation sur la masse nodulaire de Vicia faba var. aguadulce
(TA : tmoin azot, TSA : tmoin sans azote, inoculums bactriens : FM.24, FR.36,
FR.26.4.2)

Il apparait, dune part, que la culture sur sol tmoin non inocul a initi la formation de
nodules sur les racines des plantes. Par comparaison avec le traitement tmoin, le traitement
azot a entrain une diminution nette de la formation et de la croissance nodulaire plus ou
moins importante.

En ce qui concerne les traitements dinoculation, linoculation avec la souche FM. 24 a

conduit une amlioration de la croissance nodulaire, par comparaison avec celle note sur le
sol tmoin. Cependant, pour les deux autres traitements dinoculation avec les souches FR.36
et FR.26.4.2 ils nont pas manifest deffet sur la croissance nodulaire. Ces rsultats montrent
que ces dernires ne sont pas comptitives par rapport aux souches indignes qui ont induit
une bonne croissance nodulaire chez le tmoin.

Lanalyse de la variance (tableau 14) na dcel aucune diffrence significative au seuil de 5

% entre les diffrents traitements tudis.

Hadou et al., (2015) nont pas observ daugmentation de la biomasse nodulaire chez le Nib
prs linoculation. Ceci peut sexpliquer que la plupart des lgumineuses hbergeant des
rhizobiums possdent un mcanisme de rgulation strict du nombre total de nodosits portes
par leur systme racinaire. Ainsi, la formation des toutes premires nodosits dclenche une
activit systmique inhibant la formation ultrieure de nodosits (Campbell, 1991 ; Hadou et
al., 2015).
75
 Chapitre III

Tableau 14 : Modlisation de la variable Croissance nodule

Source de
variation DDL SCE CM Test F Pr
Traitements 4 68,00 17,00 0,95 0,44
Rsidus 55 988,97 17,98
Total 59 1056,97

La diffrence entre les traitements pour la variable croissance nodulaire nest pas significative
(Pr>0.05).

Les souches ayant une aptitude leve survivre et une grande efficience sous les divers
stress daphiques suscitent de plus en plus d'intrt. Le type de sol peut tre lorigine de
telles diffrences, comme il a t suggr par Tellawi et al. (1986) qui ont constat que ce
facteur affecte significativement le nombre, la biomasse des nodules et labsorption de
lazote. Ou peu comptitive par rapport aux souches indignes. En effet, les producteurs ont
besoin de souches aptes survivre dans des sols contraignants, en nombre suffisant pour
fournir une population capable de bien noduler malgr les stress daphiques. Mme si
l'introduction de rhizobia performants d'origine trangre a prsent un certain succs, la
recherche de souches indignes, adaptes aux conditions locales, demeure l'approche la plus
potentiellement efficace. En effet, Rodrguez-Navarro et al., (1999) ont montr que des
rhizobia indignes prsentent une fixation d'azote plus leve que des souches de collection
dont une bonne partie est d'origine trangre. Selon ces auteurs, il existe encore une bonne
marge d'amlioration de la fixation d'azote par la slection de souches indignes appropries.
Dans la mme ide, nos rsultats montrent quen plus de la souche FM24 qui est performante,
les souches indignes mritent dtre tudies.

3.4. Rendement en graines et en gousses

A la maturit 13 semaines aprs le semis, les cultures ont t rcoltes et le rendement en

graines et en gousses pour chaque traitement a t enregistr.

La variation du nombre de gousses et le nombre de graines chez la varit de Vicia faba

aguadulc en fonction des diffrents traitements est prsente dans la figure (31). Lallure
gnrale des histogrammes montre que linoculation par la souche FM.24 saccompagne
dune augmentation importante du nombre des gousses et du nombre de graines. Pour les

76
 Chapitre III

deux paramtres tudis, lanalyse de la variance (tableaux 15 ,16) a rvl une diffrence
significative au seuil de 1 % entre les diffrents traitements tests. Ainsi, le test de Newman-
Keuls (tableaux 17, 18) au seuil de 5 % fait ressortir deux groupes homognes. Le premier
groupe comporte la souche FM.24 avec un nombre de gousses et nombre de graines le plus
lev. Les autres traitements font partie du deuxime groupe.

. Figure 31 : Effet de la fertilisation azote et de linoculation par Rhizobium sp. sur

le rendement de la varit de Vicia faba var. aguadulc, Rsultats de campagne
agricole, 2013-2014, mene dans le centre de formation de Messerghine TA :
tmoin azote, TSA : tmoin sans azote, les souches de Rhizobium sp. : FM24 ,
FR 36 , FR.26.4.2

Tableau 15 : Modlisation de la variable nombre de gousses

Source de variation DDL SCE CM Test F Pr

Traitements 4 639,93 159,98 8,51 < 0,0001***
Rsidus 55 1034,25 18,80
Total 59 1674,18
*** la diffrence entre les traitements pour la variable rendement (Nbre gousses) est
hautement significative.

77
 Chapitre III

Tableau 16 : Le test de Neuman-Keuls au seuil de signification de 5% pour la variable

rendement en gousses

Traitements Moyenne Regroupements

FM24 17,417 A
TSA 11,500 B
TA 11,333 B
FR36 10,500 B C
FR26.4.2 7,333 C

Tableau 17 : Modlisation de la variable Rendement (Nombre graines)

Source de variation DDL SCE CM Test F Pr

Traitements 4,00 6855,57 1713,89 3,37 0,02*
Rsidus 55,00 27958,17 508,33
Total 59,00 34813,73
* la diffrence entre les traitements pour la variable rendement (Nombre graines) est
significative.

Tableau 18 : Le test de Neuman-Keuls au seuil de signification de 5% pour la variable

rendement en graines

Traitements Moyennes Regroupements

FM24 59,583 A
FR36 38,583 B
TSA 37,667 B
TA 35,500 B
FR26.4.2 27,333 B

Dans la littrature, plusieurs travaux ont rapport un effet positif de linoculation conduisant
une amlioration significative du rendement en grains (Abdel-Ghaffar et al., 1981 ; Moawad
et al., 1994 ; Mpepereki et Makonese, 1994). Linfectivit des souches FR.36 (origine de
Mascara) et FR.26.4.2 (de Mascara) est diminue probablement en raison des conditions
pdoclimatiques (type de sol, temprature et pluviomtrie) ou la comptitivit avec les
souches indignes.

Des rsultats similaires ont t rapports par Osman et Mohamed (1994) ; Rugheim et
Abdelgani, (2009) et Osman et al., (2010) qui ont montr que linoculation de Vicia faba L

78
 Chapitre III

avec des souches de rhizobia a augment de manire significative le rendement de fve en

graine.

4. Conclusion

Linoculation in natura avec des souches slectionnes en serre pour leur infectivit est
important pour obtenir de bons rsultats au champ. Cependant les souches slectionnes
doivent tre comptitives avec les souches indignes et doivent tre aussi rsistantes aux
contraintes biotiques et abiotiques de la rgion.

La souche FM24 isole partir des nodules de Vicia faba L de la rgion de Mostaganem a
montr de bons rsultats en particulier en rendement des gousses et des graines. La FM24peut
tre propose comme un inoculum biologique pour la fve.

79
Conclusion gnrale
 Conclusion gnrale et perspectives

Conclusion gnrale et perspectives

Les travaux prsents dans cette tude sinscrivent dans le cadre de lamlioration de la
production des lgumineuses alimentaires en Algrie sous contraintes environnementales et
climatiques. La fixation biologique de lazote atmosphrique par la symbiose Rhizobium-
lgumineuse reprsente un intrt conomique et agronomique considrable.

Lobjectif de ce travail est la slection de couples symbiotiques rhizobia/Vicia fabaL haut

potentiel fixateur afin damliorer et daugmenter la production de la fve sans apports
dengrais azot.Pour cela, il tait important de slectionner des microsymbiotesperformants et
les caractrissavant de les utiliss comme inoculum biologique.

Pour atteindre cet objectif, nous avons men une campagne de prospection dans six rgions de
louest algrien connues pour leur culture de Vicia faba L. Nous avons rcolt quatre
chantillons de la plante dintrt de chaque site et isol 144 souches bactriennes des nodules
racinaires de ces plantes, seules quarantesouches ont t retenues daprs leur aspect
morphologique.Nous avons tudi quelques caractristiques phnotypique et physiologique de
ces souches.

Ltude phnotypique a montr que quarante isolats prsentent des caractristiques

morphologiques typiques de ceux dcrits pour les rhizobiaet seules trente souches dentre
elles sont effectives sur Vicia fabaLen conditions bactriologiques contrles et cest celles-ci
qui ont t retenues pour la suite du travail.

Ltude physiologique montre que certaines souches prsentent des caractristiques

physiologiques remarquablestelles que la rsistance plusieurs antibiotiques, leur tolrance
des concentrations levesde NaClallant jusqu 1,5M et des tempratures maximales de
40C.Ces caractres physiologiques combins aux proprits symbiotiques
lesqualifientcomme candidates potentiellespour la production dinoculum dansles conditions
environnementales dfavorables

Les souches slectionnes in vitro doivent confirmer leur infectivit et efficience au champ en
grandeur nature. Trois souches ont t slectionnes sur la base de leur efficience (mesure du
poids sec des parties ariennes et racinaires) sur Vicia fabaL en serre avec
lavaritaguadulcde Vicia faba L. Les souches choisies sont pouvoir effective diffrent
(souche FM 24 la plus effective) ceci dans le but dtudi leur comportement vis--vis de la
plante hteVicia fabavar. aguadulce, des conditions environnementales et des souches

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 Conclusion gnrale et perspectives

indignes au champ en comparaison avec leur comportement en serre sous conditions

contrles.

Nous avons inclus dans cet essai un tmoin sans inoculum et un recevant de lazote.

Les rsultats de croissance aprs deux mois de culture semblent au profit de la souche FM24
qui sest distingue par rapport lensemble des souches et sest avre la meilleure par la
nodulation, le rendement en biomasse de la partie arienne, racinaire et au stade de la maturit
physiologique par une valeur significative du rendement en gousses et en graines. Les deux
autres souches moyennement et peu effective en serre se sont avres peu comptitives au
champ vis--vis des souches indignes et ont induit un dveloppement proche de celui du
tmoin. Quant lapport azot bien quil augmente la biomasse arienne des plantes, il
diminue la biomasse racinaire en empchant la formation de nodules.

Bien que la souche FM24 ait t slectionne pour ses proprits symbiotiques et
physiologiques, elle doit tre bien identifie avant dtre utilise comme inoculum biologique.
Les perspectives envisages pour complter cette tude sont les suivantes :
* Complter ltude taxonomique des souches par ltude des caractristiques gnotypiques :
squenage des gnes dintrt (ARNr 16S, gnes de mnage)
* Etude des flores indignes prsentes dans le site dessai.
* Inoculation dautres champs potentiels pour la culture de la fve.
* Lapplication des rsultats obtenus dans les cultures en association et en rotation.
* Production dinoculum slectionn grande chelle.

Les rsultats de croissance aprs deux mois de culture semblent au profit de la souche FM 24
qui sest distingue par rapport lensemble des souches et sest avre la meilleure par la
nodulation, le rendement en biomasse de la partie arienne, racinaire et au stade de la maturit
physiologique par une valeur significative du rendement en gousses et en graines. Les deux
autres souches moyennement et peu effective en serre se sont avres peu comptitives au
champ vis--vis des souches indignes et ont induit un dveloppement proche de celui du
tmoin. Quant lapport azot bien quil augmente la biomasse arienne des plantes, il
diminue la biomasse racinaire en empchant la formation de nodules.

Bien que la souche FM24 ait t slectionne pour ses proprits symbiotiques et
physiologiques, elle doit tre bien identifie avant dtre utilise comme inoculum biologique.

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Anonyme 1:(http://www.vitaminedz.com/le-cilmat-de-tlemcen/Articles 138 240337 131.html).

116
Rfrences bibliographiques

117
Annexes
 Annexes
Annexe 1

Composition du milieu YEM (YeastExtract Mannitol) g/L

Extrait de levure ...................................... 1g

Agar-Agar ................................................15g
Mannitol ..................................................10g
Solution minrale de Bergersen 10 M..............100ml Bergersen (1961) :
KCl 1g
FeCl3 0.02g
CaCl2, 2H2O 0.53g
Na2HPO4, 12H2O 4.5g
MgSO4, 7H2O 1g
H2O distille 1000ml
H2O distille..............................................qsp 1000ml
pH (6.9 7)

Annexe 2

Coloration de Gram

1-Dposer une goutte deau sur une lame bien propre

2-Prlever un chantillon de colonie laide dune anse et mlanger avec la goutte deau,
strier et scher par passage rapide sur la flamme dun bec benzne
3-Couvrir le frottis par du violet de gentiane pendant 60 secondes
4-Laver lexcs du colorant avec de leau distille
5-Couvrir avec du Lugol pendant 30 secondes
6-Laver leau distille pendant 5 secondes
7-Rincer immdiatement le frottis avec le mlange alcool -actone ou avec de lthanol en
inclinant la lame et par goutte goutte jusqu disparition complte de la coloration violette.
-Laver leau distille pendant 5 secondes
9-Couvrir avec de la fuschine (ou safranine) pendant 60 secondes
10-Laver leau distille pendant 10 secondes et mettre la lame incline sur du papier
absorbant
11-Dposer une goutte dhuile immersion sur le frottis et observer au microscope un fort
grossissement.Les cellules Gram+ absorbent la couleur du violet de gentiane et demeurent

118
 Annexes

bleues violettes en apparence, contrairement aux cellulesGram-qui apparaissent distinctement

rostres.

Annexe 3
Eau glose (0.8%)

Agar-agar....0.8 g
Eau distille....100 ml
La solution est autoclave pendant 20 min 120C.

Annexe 4

Composition de la solution nutritive (Fahreus, 1957).

CaCl2 0.100g
MgSO4. 7H2O 0.120g
KH2PO4 0.100g
Na2HPO4.2H2O 0.150g
Citrateferrique0.005g
Solutionstockdesoligolments1.0ml

*Solutionstockdes oligolments : (g/l)

H3BO42.86g
MnSO4. 4H2O2.03g
ZnSO4.7H2O0.22g
CuSO4.5H2O0.08g
Na2MoO4. 2H2O 0.4g
Le milieu est ajust pH 7,5 puis autoclav 120C.

Annexe 5 :

Composition de milieu (Hugh et Leifson1953). 119

 Annexes

- Tryptone ......................................................... 2 g
- Bleu de bromothymol ...................................30 mg
- Chlorure de sodium .......................................5 g
- Hydrognophosphate de potassium ............... 0,3 g
- Agar-agar ...................................................... 2,5 g
Ces quantits sentendent pour 1 Ldeau distille.Ramener le pH final 7 - 7,2.

Annexe 6

Mc Farland n 5 (15 x 108 UFC/ml)

BaCl2 (1.175%) 0.5 ml

H2SO4.. 9.5 ml

Composition des standards de turbidit de McFarland

Standard de Dihydrate de Acide sulfurique Densit

turbidit chlorure de baryum (1 %), en ml approximative
numro (1,175 %), en ml correspondante de
bactries/ml
0,5 0,5 99,5 1.108

1 0,1 9,9 3.108

2 0,2 9,8 6.108

3 0,3 9,7 9.108

4 0,4 9,6 12.108
5 0,5 9,5 15.108
6 0,6 9,4 18.108
7 0,7 9,3 21.108
8 0,8 9,2 24.108

9 0,9 9,1 2 27.108

10 1 9,0 30.108

120
 Annexes
Annexe 7
Analyses physicochimiques du sol

a. Analyse granulomtrique :

La granulomtrie a t dtermine par la mthode internationale la pipette deRobinson.

- Dans un bcher de 600 ml, mettre 15g de terre fine sche et tamise.
- Ajouter 50 ml de leau oxygne (H2O2) 20 volumes.
- Recouvrir le bcher afin dviter les projections pendant la priode deleffervescence.
- Mettre le bcher sur un bain de sable dont la temprature ne dpasse pas 85CSi une
bullition trop forte se manifestait, leau oxygne se dcompose trsrapidement.Si la terre est
humifre leffervescence peut produire une mousse abondante risquantde dborder, ce
phnomne peut tre vit en ajoutant quelques gouttes dalcoolthylique.A la fin
dfervescence, faucher pendant 2 h pour liminer lH2O2 en excs et terminerpar 10 min
dbullition (on peut acclrer llimination de lexcs deau oxygne enajoutant quelques
gouttes dammoniaque).
- Sassurer que toute leau oxygne a disparu en versant quelques gouttes duliquide chaud
60C dans une solution de permanganate de potassium, enprsence deau oxygne le
permanganate de potassium se dcolore.
- Laisser refroidir puis transvaser laide dun jet de pissette dans un flacon de sdimentation
large ouverture et jaug de 750 ml.
- 15 ml dhexamthaphosphate de sodium 50 g/l. Cette solution alcaline a pour rle de
disperser les particules qui ont tendance sagglomrer.
- Complter avec de leau dminralise jusquau trait de jauge 750 ml.
- Agiter le flacon durant une heure sur un agitateur magntique.
- Porter le flacon proximit de la pipette de Robinson qui doit tre place dansune pice
temprature constante.Pour le mlange des argiles, des limons fins et des limons grossiers :
- Maintenir la temprature 20C, agiter immdiatement par retournementrpt de manire
mettre en suspension toute la terre.
- Laisser dcompter pendant 20 secondes.
- Prlever au bout de 46 secondes, 10cm de profondeur 10ml de liquide.
- Porter la capsule dans une tuve dessiccation temprature 105C.
- Aprs vaporation totale, peser la capsule et son contenu sec.
121
 Annexes

- Par diffrence avec le poids de la capsule vide, dterminer le poids P1 desdiment.

(Argile + limons fins + limons grossiers + hexamthaphosphate de sodium) contenudans 10
ml de suspension.Pour le mlange des argiles et des limons fins :
- Aprs agitation et retournement du liquide, laisser dposer durant 4 min.
- Effectuer le prlvement de 10 ml une profondeur de 10 cm aprs lasdimentation.
- Transvaser le prlvement dans une capsule en verre pyrex.
- Faire vaporer puis peser la capsule.
- Par diffrence avec le poids de la capsule vide, dterminer le poids P2 dusdiment (Argile +
limon fin + hexamthaphosphate de sodium) contenu dans10 ml de suspension.
Pour largile :
- Agiter et laisser sdimenter 8h.
- Effectuer le prlvement de 10 ml.
- Peser comme prcdemment P3 (Argile + hexamthaphosphate de sodium) dans 10 ml de
suspension.
- Verser 15 ml dhexamthaphosphate de sodium dans un flacon gaug de750 ml.
- Agiter puis faire un prlvement la pipette Robinson comme prcdemment.
- Transvaser le prlvement dans une capsule en verre pyrex.
- Faire vaporer puis peser la capsule et son contenu sec.
- Dterminer comme prcdemment le poids correspondant la surcharge
enhexamthaphosphate de sodium contenu dans 10 ml de suspension.
- Daprs les peses P1, P2, P3, calculer les taux des Argiles, limons fins etlimons grossiers.
- Tamiser et peser les sables fins et sables grossiers, pour les sables grossiersutiliser un tamis
de 200 m et pour les sables fins un tamis de 50m.

122
 Annexes

Le triangle de texture
Permet de classer les sols daprs leur composition granulomtrique

b. Dosage du calcaire total :

Dposer 1g de sol sch lair, dans un flacon puis remplir lappendice latrale duflacon avec
5 ml de HCl 0.5N, aprs avoir lier le flacon au calcimtre de Bernardamener au zro les
niveaux de leau dans la colonne et dans lampoule, verserlacide sur lchantillon, ensuite
laide de lampoule, rtablir le niveau et lire levolume de CO2 dgag (en cm3), une foie le
dgagement du CO2 termin, baisserlampoule du calcimtre jusqu ce que le niveau de cette
dernire soit dans unmme plan horizontal que celui dans la colonne, enfin dposer 1g de
CaCO3 purpour ltalonnage de lappareil tel quil provoque un dgagement gazeux.
On dtermine ainsi le taux de calcaire selon les normes proposes par (Baize, 1998).

123
 Annexes

Taux du <1% 1 5 25% 25 50 % 50 >80 %

calcaire 5% 80%

apprciati Non Peu Modrme Forteme Trs excessiveme

on calcair calcair nt nt Forteme nt
e e calcaire calcaire nt calcaire
calcaire

c. Dosage du calcaire actif :

Peser 10g de sol sch lair, les introduire dans un flacon de 500ml et y ajouter250 ml de la
solution doxalate dammonium (NH4)2C2O4 0.2N, agiter durant2h, ensuite filtrer la
solution en rejetant les premier ml du filtrat.Prlever 10ml du filtrat qui sera vers dans un
bcher de 100ml, ajouter cedernier 10ml de H2SO4au 1/10, ensuite porter le contenu du
bcher unetemprature de 60C, puis placer le bcher sur un agitateur magntique
surmonterdune burette gradue contenant le permanganate de potassium KMnO4 ensolution
dcimale, le titrage par le permanganate se fait jusqu lobtention dunecouleur rose
persistante, soit n le nombre de ml de KMnO4 vers.Titrer de la mme faon 10ml de la
solution doxalate dammonium utilise, soitN le nombre de KMnO4 vers pour le tmoin.

d. Dosage du carbone total et de la matire organique :

- Utiliser un sol finement broy et pass au tamis (0.2 mm).

- Peser 0.25g de sol, introduire la prise dans un ballon pyrex avec rfrigrantascendant,
ajouter 10 ml de solution de bichromate 8% et 15 ml dacidesulfurique H2SO4 pure.
- Porter 5 min lbullition douce.
- Laisser refroidir puis transvaser dans une fiole jauge de 200 ml, laver troisfois leau
distille, verser dans un bcher de 250ml.
- Diluer 200ml.
- Ajouter 1.5g de fluorure de sodium (FNa) en poudre par ml dacide sulfuriqueH2SO4 plus 3
4 gouttes de diphnylamine puis titrer lexcs de bichromateavec une solution de Mohr
0.2N (la couleur passe du bleu fonc aubleu-vert).
Les calculs :
1g de bichromate 0.2N oxyde 0.615mg de carbone (C)Effectuer un tmoin avec du sable
strile calcin, soit

124
 Annexes

n: la quantit de sel de Mohr vers

n : la quantit de sel de Mohr correspondant lchantillon.
C% = ( n-n) x 0.615 x 100/ 1000
Pour obtenir le taux de la matire organique, multiplier C% par 1.72.

E.Dosage du phosphore selon la mthode dOlsenet al., (1954)

Le phosphore est extrait par agitation avec une solution d'hydrognocarbonate de sodium
pH = 8,5. La solution alcaline d'hydrognocarbonate peut abaisser la concentration des ions
calcium par prcipitation sous forme de carbonate de calcium et celle des ions aluminium et
ferriques par prcipitation sous forme d'hydroxydes. La concentration des ions phosphate
augmente en consquence et le phosphore assimilable peut tre extrait de l'chantillon de
terre par la solution d'hydrognocarbonate de sodium et filtration. Cette solution d'extraction a
tendance dissoudre les matires organiques, elle donne parfois des extraits colors. Aussi
avant de procder la formation du bleu de molybdne, on utilise du charbon activ pour
adsorber les matires organiques solubles (le carbone activ doit tre exempt de phosphate et
n'avoir aucune action sur les ions phosphate).
Ractifs :
Eau dminralise
Solution d'hydroxyde de sodium (NaOH), 2 %: Dissoudre 20 g d'hydroxyde de sodium
dans une fiole jauge de 1000 ml contenant environ 800 ml d'eau dminralise.
Ajuster au volume et homogniser.
Solution d'extraction (NaHCO3) 0,5 mol.L-1:Dissoudre 42,01 g d'hydrognocarbonate
desodium p.a. scheune nuit ltuve, dans une fiole jauge de 1000 ml contenant
environ 900 ml deau dminraliser. Ajuster au pH = 8.5 avec la solution dhydroxyde
de sodium avant dajuster au volume, homogniser. Prvoir des quantits suffisantes.
Solution de molybdate d'ammonium (NH4)6Mo7O24, 4H2O), 2,5 % dans l'acide
sulfurique(H2SO4) 5 mol.L-1:Dissoudre 25 g de molybdate d'ammonium ttra hydrat
dans une fiole jauge de 1000 ml contenant 300 ml d'eau dminralise tide. Laisser
refroidir.
Ajouter lentement 282 ml d'acide sulfurique (95 %, d = 1,83) et laisser refroidir.

125
 Annexes

Ajuster au volume. Homogniser.

Conserver au rfrigrateur. Ne pas utiliser une solution vieille de plus d'un mois.
Solution de chlorure stanneux (SnCl2,2H20 ), 1 %:Dissoudre 1 g de cristaux de
chlorure stanneux dans 40 ml d'acide chlorhydrique concentr (37 %, d = 1,19) dans
une fiole jauge de 100 ml contenant dj 50 ml d'eau dminralise. Chauffer
lgrement jusqu' dissolution.
Refroidir. Ajuster au volume. Homogniser.
prparer toutes les 4 heures avec du chlorure stanneux frais. On ne doit pas
employer de vieux stocks de chlorure stanneux avant de s'tre assur de leur
concentration en ions stanneux. Le chlorure stanneux sert faire apparatre la couleur
bleue du molybdate.
Avant usage, faire un test pour rechercher d'ventuelles traces de phosphore dans le
charbon activ, en agitant 2 g de prise d'essai avec 40 50 ml de la solution
d'extraction. Filtrer et ajouter 10 ml de la solution de molybdate.
Agiter de nouveau. S'il y a formation de la couleur bleue du molybdne et que le test rvle la
prsence d'une quantit mesurable de phosphore, le stock de charbon doit tre purifi.
Agiter alors ce stock avec une quantit suffisante de la solution d'extraction.
Filtrer et laver soigneusement le charbon avec de l'eau dminralise. Rpter le test
pour s'assurer de l'absence de phosphore. Scher l'tuve. viter d'employer des
stocks de charbon fortement contamins par des phosphates.
Solution d'acide sulfurique (H2SO4), 20 %: Dans une fiole jauge de 1 000 ml
contenant environ 700 ml d'eau dminralise verser trs lentement 210 ml d'acide
sulfurique p.a. (95 %, d = 1,83). Ajuster au volume. Homogniser.
Solution mre de phosphore (P) 50 g.mL-1:Dissoudre 0,2197 g de potassium d
hydrognophosphate (KH2PO4) (phosphate mono potassique) (pralablement sch
105 C durant une nuit).Dans une fiole jauge de 100 ml contenant environ 600 ml
d'eau dminralise. Ajouter 25 ml de la solution d'acide sulfurique. Ajuster au
volume. Homogniser.
Solution fille de phosphore (P) 1 g.mL-1:Pipeter 10 ml de la solution mre et verser
dans une fiole jauge de 500 ml. Ajuster avec de l'eau dminralise.
Homogniser.Solutions talons de phosphore (P):Pipeter la pipette
respectivement 0, 5, 10, 15, 20 et 25 ml de la solution fille et verser dans une srie de
fioles jauges de 100 ml. Ajouter 5 ml de la solution d'extraction puis 10 ml de la

126
 Annexes

solution de molybdateet agiter lgrement. Quand le dgagement de gaz carbonique

s'arrte, ajuster avec de l'eau dminralise et ajouter 0,5 ml de la solution de chlorure
stanneux et agiter par renversement. On obtient ainsi des solutions talons de 0, 0.05,
0.10, 0.15, 0.20et 0.25 pg.ml -1. Attendre 15 min et passer au spectrophotomtre 660
nm dans les 20 min qui suivent.
Mode opratoire:
Avant l'extraction, la solution d'extraction doit tre porte 25 C, au bain-marie.
Peser 5 g de sol sec tamis 2 mm et letransfrer dans une bouteille agitation de 250
ml. Ajouter 100 ml de la solution d'extraction et agiter 30 min.
Filtrer dans une fiole de 100 ml.
Si le filtrat n'est pas incolore, lui ajouter 1 g de charbon de bois, agiter 3 min et filtrer
de nouveau.
Faire un tmoin avec le charbon de bois : 1 g de charbon et 100 ml de la solution
d'extraction.
Prlever 10 ml de l'extrait et verser dans une fiole jauge de 100 ml.
Calculs
Aprs lecture au spectrophotomtre, prparer un graphique sur papier millimtr.L'axe des X
tant l'absorbance et l'axe des Y la concentration de phosphore (g.mL-1) dans les solutions
talons.Tracer la droite d'talonnage et dterminer l'aide de cette droite la
concentration(pg.mL-1) de phosphore contenu dans les chantillons.
P(g. g-1) = (KV) /(AS) = 2K
O K : microgrammes de phosphore dtermins sur la courbe d'talonnage (g.ml-1),
V : volume d'extraction en ml (100 ml),
A : aliquote prleve en ml (10 ml),
S : poids de la prise de terre en g (5 g)
Interprtationsdes rsultats dudosageselon Olsen, (1954) :

La teneur du P assimilable () Interprtations

<0.05 Pauvre

0.05 0.08 satisfaisant

0.08 Trop fort

127
 Annexes

F. Dosage de lazote total selon la mthode de Kjeldahl, 1882

Lchantillon est minralis en milieu acide sulfurique en prsence de cuivre(II) et dun

catalyseur (slnium oumieux oxyde de titane moins dangereux pour lenvironnement). Dans
les conditions de minralisation, lazote organique est retrouv sous forme ammonium.
Les ions ammonium sont transforms en ammoniac par passage en milieu alcalin. On entrane
NH3 la vapeur deau et on dose le condenst recueilli par dosage volumtrique acide/base.

1. Minralisation de type classique (en milieu acide sulfurique):

La minralisation est conduite bullition douce en milieu acide sulfurique charg de sulfate
de potassium et en prsence de catalyseurs (les plus employs sont le slnium ou le dioxyde
de titane sous forme cristalline anatase mlangs du sulfate de cuivre. Ces conditions de
minralisation conduisent :
Lazote organique et (videmment) les formes NH4+sont retrouves sous forme
NH4+, NO2-et NO3-ne sont que partiellement rduits enNH4+. Leur rduction totale
implique un traitement pralable supplmentaire en milieu acide en prsence des
rducteurs acide salicylique et thiosulfate desodium;le carbone organique est retrouv
sous forme de carbone (noir) puis CO2; l'hydrogne et l'oxygne sont combins en
H2O.
Au cours de la minralisation, l'acide sulfurique se dcompose partiellement en
dioxyde et trioxyde de soufre (SO2et SO3, gaz toxiques irritants). Il y a ainsi
apparition de vapeurs blanchtres trs irritantes. La minralisation est donc conduite
avec un appareillage aspiration puis traitement des vapeurs avant rejet.
2. Alcalinisation du milieu minralis et entranement la vapeur de lammoniac
form :

NH4++ OH-NH3+ H2O

L'ammoniac (volatil) ainsi form est entran par de la vapeur d'eau (hydrodistillation), les
vapeurs, condenses par rfrigration, sont recueillies dans un milieu suffisamment acide.

3. Dosage de l'ammoniac recueilli :

128
 Annexes

3.1. Cas du dosage indirect (ou en retour):

L'ammoniac est recueilli dans une quantit connue (via la ralisation dun tmoin) et
en excs dune solution d'un acide fort. La fin de lentranement de NH3est estime en
considrant le volume de distillat recueilli ou la dure de l'opration.
Le reliquat de protons (du lexcs dacide fort) est dos par une solution titre dune
base forte. Lindicateur color de fin de dosage est le rouge de mthyle qui vire la
goutte prs la fin du dosage du reliquat de protons.
Ce type de dosage vite de faon lgante tout risque de pertes en ammoniac
distill.3.2. Cas du dosage direct:
L'ammoniac est recueilli dans de l'acide borique en solution 20 40 g/l. En gnral
on utilise 10 mL de solution borique et on recueille le distillat sous un volume de 40
100 mL. Le pK de lacide borique est de 9,23. Le pH de la solution dacide borique, en
absence dammoniac, est donc voisin de 5,0 5,4. Vers ces pH, le pouvoir tampon de
la solution borique est trs faible, elle permet ainsi dobserver le virage dindicateurs
colors dont la teinte sensible se situe vers pH 5,0 5,4, la goutte prs, avec des
solutions titres dacide fort aussi dilues que 0,02 mol/L en H+.
Le pK de NH4+/NH3est de 9,4. Si on introduit NH3, en large dfaut parrapport
lacide borique, dans une telle solution, on peut donc admettre que la totalit de
NH3se protone sous forme NH4avec augmentation du pH. On peut alors mesurer le
volume de solution titre dacide fort ncessaire pour ramener le pH la teinte de
virage dun indicateur color Istat. On a lors nH+ ajout la burette pour revenir au
virage = nNH3 distill

4. Interprtations des rsultats du dosage selon Kjeldahl, 1882 :

La teneur de lazote total () Interprtations

0.5 1 Trop faible

1 1.5 satisfaisant

1.5 2.5 Un peu fort

129
 Annexes

>2.5 Trop fort

Annexe 8

Analyse statistique avec le logiciel Statisticade leffet souche sur la croissance (Poids Sec
des Parties Ariennes et Poids Sec des Parties Racinaires, nombre de nodules et la hauteur
des parties ariennes) des plantes en serre

Synthse pour tous les Y :

PSPA BIOM NBR_N HAUTEUR

R 0,776 0,574 0,589 0,565
F 7,167 2,781 2,961 1,340
Pr> F < 0,0001 0,000 0,000 0,211

Synthse (Moyenneestime) - SOUCHE :

PSPA BIOM NBR_N HAUTEUR

F0 4.1 cde abcde bcdefg bc
FC 12.3.2 a bcdef defg c
FM 19.4.2 defghi abcdef defg bc
FM 20.4 j cdef efg bc
FM 24 bc bcdef a a
FM 24.5 hij def fg bc
FM 9.2 fghij a defg bc
FM19.4 cdefgh cdef bcdef ab
FM20.4.2 cdef ab bcdef bc
FR 14.2 cdefg abcd abc abc
FR 14.2.4 hij f bcdefg abc
FR 26.4.2 cdefghi cdef fg bc
FR 29.3 defghi cdef bcde bc
FR 36 cdefg cdef abcd bc
FR 36.2 fghij abcdef abcde abc
FR 7.1 efghi cdef bcdef bc
FR 7.5 efghi ef bcdef abc
FR 8 fghij cdef bcdef abc
FR 81 fghij abcdef cdefg bc
FR14.2.3 hij abc defg bc
FR26.4 ghij cdef bcdef bc

130
 Annexes

FR31.4 j cdef cdefg bc

FR36 cdefg cdef abcd bc
FR36.1 ab bcdef abcde bc
FR7.1.2 cdefghi cdef bcdef bc
FT 16 cdefghi abcd abcde abc
FT 17 fghij abcdef bcdefg bc
FZ 28.4 cdefg def defg ab
FZ 33.4 bc abcd defg abc
FZ 7.1 cd a ab bc
T ij cdef g bc
Pr> F 0,000 0,000 0,000 0,211
Significatif Oui Oui Oui Non

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