Aix-Marseille Université, CNRS, Institut des Sciences du Mouvement

UMR 7287 & Faculté d’Odontologie de Marseille

27 boulevard Jean Moulin, 13005 Marseille
Ecole Doctorale des Sciences du Mouvement Humain (ED 463)
163 avenue de Luminy – CP 910, 13288 Marseille cedex 9

Défense et régénération pulpo-dentinaire :

activation locale du Complément
Thèse présentée et soutenue publiquement par
Pierre RUFAS
Le 16 décembre 2016
Pour obtenir le grade de Docteur des Universités
Discipline : Sciences du Mouvement Humain
Spécialité : Biomécanique

Directeur de thèse
Professeur Imad ABOUT

Composition du jury
Professeur Brigitte ALLIOT-LICHT (Nantes) Rapporteur
Professeur Jean-Christophe FARGES (Lyon) Rapporteur
Professeur José LUIS (Marseille) Examinateur
Professeur Imad ABOUT (Marseille) Directeur
 Résumé

Les lésions carieuses ou les traumatismes physiques profonds aboutissent souvent à

une destruction des fibroblastes pulpaires (FP) et des odontoblastes, et provoquent
l’activation du Complément. Le rôle du Complément dans la régénération pulpo-
dentinaire a été montré avec le fragment C5a, connu pour induire la migration des
cellules souches pulpaires (CS). Nous avons montré que le C3a participe à la
régénération pulpo-dentinaire. Après un tri cellulaire, nous avons montré l’expression
du C3aR sur les CS et les FP en culture, et aussi sur coupes de dents humaines. De plus,
les deux types cellulaires prolifèrent en présence de concentrations croissantes de
C3a. La migration cellulaire a été évaluée dans des chambres de migration
microfluidiques. Les CS sont mobilisées, tandis que les FP sont spécifiquement recrutés
par un gradient de C3a. Les complexes d’attaque membranaire (CAM) produits par les
FP a été montrée. Nous avons démontré que les FP peuvent détruire les bactéries
cariogènes S. mutans et S. sanguis. Les FP ont été incubés avec un milieu contenant du
LTA pour simuler une infection bactérienne in vitro. Nous avons montré que les
bactéries cariogènes étaient très sensibles aux surnageants des FP stimulés, soulignant
un effet létal des CAM. Des co-cultures de fibroblastes pulpaires et de bactéries ont
révélé la présence des CAM sur les bactéries. Ces résultats soulignent des rôles
inattendus du Complément pendant les étapes précoces de la régénération pulpo-
dentinaire et de la défense pulpaire. Ce travail suggère de nouvelles stratégies
thérapeutiques, où des molécules du Complément pourront être délivrées localement
pour favoriser la régénération pulpo-dentinaire.
Mots-clefs : biologie pulpaire, Complément, cellules souches, chimiotactisme,
bactéries cariogènes, CAM
 Abstract

Deep pulp physical injuries or carious lesions often lead to fibroblast cell injury and
destruction of the dentin-secreting odontoblasts, and lead to the Complement
activation. Its involvement in dentin-pulp regeneration has been shown with C5a
fragment, known to induce specific recruitment of DPSC. We show that C3a, is also
involved in dentin-pulp regeneration. After cell sorting, we highlighted C3a Receptor
expression on pulp fibroblasts and STRO-1-sorted DSPC as well as on human tooth
sections in vivo. The effect of C3a on proliferation of DPSCs and pulp fibroblasts was
shown with an increased proliferation for both cell types. Cell migration was evaluated
using microfluidic chemotaxis chambers. We showed that DPSCs were mobilized but
not specifically recruited, while pulp fibroblasts were specifically recruited following a
C3a gradient. We demonstrated that pulp fibroblasts can synthesize functional
membrane attack complex (MAC) and kill cariogenic bacteria S. mutans and S.
sanguinis. To simulate bacterial infection in vitro, pulp fibroblasts were incubated with
lipoteichoïc acid (LTA). Agar well diffusion assay showed that bacteria exposed to LTA-
conditioned media were highly sensitive, showing lethal effect of MAC. Coculture of
pulp fibroblasts and bacteria showed that MAC synthesized by pulp fibroblasts can be
directly fixed on cariogenic bacteria, after direct contact with fibroblasts. These results
underline unexpected roles of Complement system activation in early events of dentin-
pulp regeneration and pulp defense. Our findings suggest new therapeutic strategies,
where new agents can deliver specific Complement molecules to enhance dentin-pulp
regeneration.
Keywords : pulp biology, Complement, stem cells, chemotaxis, cariogenic bacteria,
MAC
SOMMAIRE

1
SOMMAIRE........................................................................................................................... 1

TABLE DES ILLUSTRATIONS .................................................................................................. 6

FIGURES ...............................................................................................................................................7

TABLEAUX ............................................................................................................................................9

AVANT-PROPOS ................................................................................................................. 10

INTRODUCTION.................................................................................................................. 13

PREMIERE PARTIE : LE SYSTEME DU COMPLEMENT .............................................. 14

I. Le système du Complément : Histoire ................................................................................... 14

II. Les 3 voies canoniques du système du Complément ............................................................. 15

A. La voie classique........................................................................................................................... 15
B. La voie des lectines ...................................................................................................................... 18
C. La voie alterne.............................................................................................................................. 21

III. Les voies effectrices communes du Complément .................................................................. 22

A. Action des C3- et C5-convertases ................................................................................................ 22
B. Le complexe d’attaque membranaire (CAM) ............................................................................... 23
C. Clivages « non-conventionnels » du C3 et du C5 ......................................................................... 26

IV. Régulation des voies du Complément ................................................................................... 27

A. Les régulateurs phares de la cascade ........................................................................................... 27
B. Les régulateurs du Complément : une liste évolutive .................................................................. 30
C. Physiopathologie du système du Complément ........................................................................... 33

V. Synthèse des molécules du Complément .............................................................................. 34

VI. Rôles du Complément ........................................................................................................... 35

A. Opsonisation des pathogènes ...................................................................................................... 35
B. Elimination directe des pathogènes par le complexe d’attaque membranaire (CAM)................ 37
C. Action des anaphylatoxines pendant l’inflammation .................................................................. 37

VII. L’anaphylatoxine C3a ............................................................................................................ 39

A. Structure du C3a .......................................................................................................................... 39

2
 B. Le récepteur au C3a (C3aR) humain............................................................................................. 41
1. Structure ................................................................................................................................. 41
2. Site de fixation du fragment C3a ............................................................................................. 43
3. Signalisation ............................................................................................................................ 44
4. Expression ............................................................................................................................... 45
C. L’axe C3a/C3aR dans le contexte de la régénération tissulaire ................................................... 47

DEUXIEME PARTIE : REGENERATION PULPO-DENTINAIRE ..................................... 49

I. Origine et structure du complexe pulpo-dentinaire ............................................................... 49

II. La régénération du complexe pulpo-dentinaire ..................................................................... 51

A. Circonstance pathologique qui induit la régénération pulpo-dentinaire .................................... 51
B. Mécanismes de la régénération pulpo-dentinaire ....................................................................... 54
1. Présence de cellules souches pulpaires au niveau périvasculaire........................................... 54
2. Signaux permettant le recrutement des cellules souches pulpaires ....................................... 55
a. Signaux séquestrés dans la dentine.................................................................................... 56
b. Signaux des cellules odontoblastiques et pulpaires ........................................................... 57
c. Signaux inflammatoires pulpaires : le système du Complément ....................................... 60

MATERIELS ET METHODES ................................................................................................ 63

I. Matériels .............................................................................................................................. 64

II. Obtention de cellules pulpaires par culture d’explants .......................................................... 64

III. Sélection cellulaire par tri magnétique .................................................................................. 66

IV. Immunocytochimie ............................................................................................................... 68

V. RT-PCR .................................................................................................................................. 69

VI. Tests de prolifération ............................................................................................................ 70

VII. Chimiotactisme en chambre micro-fluidique ......................................................................... 70

VIII. Coupes histologiques ............................................................................................................ 72

A. Procédure initiale de préparation des coupes ............................................................................. 72
B. Coloration des coupes histologiques ........................................................................................... 73

IX. Immunohistochimie .............................................................................................................. 74

3
 A. Procédure de démasquage antigénique ou « antigene retrieval » .............................................. 74
B. Marquage immunofluorescent des coupes ................................................................................. 75

X. Culture bactérienne et expérimentations .............................................................................. 77

A. Culture de bactéries Gram-positives : Protocole global .............................................................. 77
B. Tests de sensibilité des bactéries au complexe d’attaque membranaire .................................... 77
1. Stimulation par l’acide lipotéichoïque (LTA) des fibrolastes pulpaires humains..................... 77
2. Test de diffusion de puits en milieu Agar ................................................................................ 78
3. Quantification de la viabilité bactérienne par test MTT ......................................................... 79
C. Détection du CAM ........................................................................................................................ 79
1. Marquage immunofluorescent du CAM sur des co-cultures de bactéries et fibroblastes
pulpaires ........................................................................................................................................... 79
2. Détection enzymatique du CAM ............................................................................................. 80

XI. Statistiques ........................................................................................................................... 80

RESULTATS ......................................................................................................................... 81

PREMIERE PARTIE : ETUDE SUR LE FRAGMENT C3A ET LA REGENERATION PULPO-

DENTINAIRE .............................................................................................................. 82

I. Expression in vivo du Récepteur au C3a (C3aR) par les cellules de pulpe dentaire humaine. .. 82

II. Caractérisation des cultures de fibroblastes et de cellules souches pulpaires ........................ 84

III. Les cellules souches et les fibroblastes pulpaires expriment le C3aR in vitro ......................... 87

IV. Le C3a induit la prolifération des cellules souches et de fibroblastes pulpaires...................... 89

V. Le C3a mobilise les cellules souches et déclenche une migration spécifique des fibroblastes
pulpaires dépendante d’un gradient ................................................................................................... 91

DEUXIEME PARTIE : ETUDE SUR LA CAPACITE DU CAM A INHIBER LA CROISSANCE

BACTERIENNE ........................................................................................................... 96

I. L’activation du système du Complément in vivo est corrélée avec la présence de S. mutans . 96

II. La stimulation au LTA de fibroblastes pulpaires humains conduit à la formation du CAM sur
les bactéries cariogénènes à Gram positif S. mutans et S. sanguis ...................................................... 98

4
III. Les CAM produits par les fibroblastes pulpaires stimulés au LTA sont fonctionnels et peuvent
tuer S. mutans et S. sanguis .............................................................................................................. 100

IV. S. mutans et S. sanguis induisent directement la production du CAM par les fibroblastes
pulpaires. ......................................................................................................................................... 102

DISCUSSION ..................................................................................................................... 105

PERSPECTIVES .................................................................................................................. 115

Effets des biomatériaux de coiffage sur la balance inflammation/régénération .................. 116

La phagocytose médiée par le système du Complément : l’arme fatale pulpaire ? .............. 119

BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................ 121

PUBLICATIONS ................................................................................................................. 145

5
TABLE DES ILLUSTRATIONS

6
FIGURES

Figure 1 : Structure du complexe C1. _____________________________________________________ 16

Figure 2 : Etapes d'activation de la voie classique. __________________________________________ 17
Figure 3 : Structure des MBL et Ficolines. __________________________________________________ 18
Figure 4 : Exemple des étapes d'activation de la voie des lectines (MBL). _________________________ 19
Figure 5 : Suite des étapes de l'activation de la voie des lectines (MBL). __________________________ 20
Figure 6. Etapes d'activation de la voie alterne._____________________________________________ 22
Figure 7. Voies effectrices communes du Complément _______________________________________ 25
Figure 8. Régulation du système du Complément. ___________________________________________ 32
Figure 9. L'anaphylatoxine C3a. _________________________________________________________ 40
Figure 10. Structure du Récepteur au C3a (C3aR). ___________________________________________ 42
Figure 11. Illustration des différents tissus dentaires (d’après Nanci, 2013). ______________________ 50
Figure 12. Illustration d'une lésion carieuse modérée et profonde. ______________________________ 52
Figure 13. Rôles des odontoblastes dans la défense immunitaire de la pulpe dentaire (Farges et al.,
2015b). ____________________________________________________________________________ 59
Figure 14 : Récupération des pulpes dentaires et culture d'explants. ____________________________ 65
Figure 15. Principe du tri magnétique cellulaire. ____________________________________________ 66
Figure 16. Conditions expérimentales pour les cultures bactériennes et les fibroblastes pulpaires. _____ 78
Figure 17. Le récepteur au C3a est très largement distribué dans la pulpe in vivo. _________________ 83
Figure 18. Obtention et caractérisation des cultures de cellules souches et fibroblastes pulpaires
humains. ___________________________________________________________________________ 85
Figure 19. Expression des ARNm de gènes de pluripotentialité des cellules souches et des fibroblastes
pulpaires.___________________________________________________________________________ 86
Figure 20. Expressions du C3aR par les cultures de cellules souches et de fibroblastes pulpaires. ______ 88
Figure 21. Analyse de l'expression de l'ARNm du C3aR dans les cellules souches et les fibroblastes
pulpaires.___________________________________________________________________________ 89
Figure 22. Le C3a induit la prolifération des cellules souches et des fibroblastes pulpaires. ___________ 90
Figure 23. Chambre de migration microfluidique____________________________________________ 91
Figure 24. Le C3a mobilise les cellules souches pulpaires et induit la migration spécifique des fibroblastes
pulpaires selon un gradient. ____________________________________________________________ 92
Figure 25. Analyses graphiques et statistiques des migrations cellulaires. ________________________ 93
Figure 26. Détection des bactéries Streptoccocus mutans sur des coupes de dents cariées humaines. __ 97
Figure 27. Détection enzymatique du complexe d'attaque membranaire (CAM) sur les bactéries
cariogènes à GRAM positif Streptoccocus mutans et sanguis. _________________________________ 99
Figure 28. Détermination de sensibilité bactérienne de Streptococcus mutans et Streptococcus sanguis au
CAM. _____________________________________________________________________________ 101

7
Figure 29. S. mutans et S. sanguis induisent directement la formation du CAM produits par les
fibroblastes pulpaires.________________________________________________________________ 103
Figure 30. Récapitulatif des étapes précoces de la régénération pulpo-dentinaire par l’activation locale
du Complément. ____________________________________________________________________ 114
Figure 31. Sécrétion du C5a par les fibroblastes pulpaires lésés au contact des extraits de biomatériaux.
__________________________________________________________________________________ 117

8
TABLEAUX

Tableau 1. Types cellulaires exprimant le C3aR (adapté de Schraufstatter et al., 2015). _____________ 46
Tableau 2. Conditions expérimentales des anticorps primaires et secondaires en immunocytochimie. __ 68
Tableau 3. Listes des amorces utilisées en PCR. _____________________________________________ 69
Tableau 4. Procédures de coloration à l'Hématoxyline/Eosine et de Gram. _______________________ 74
Tableau 5. Conditions de saturation des marquages immunofluorescents. _______________________ 75
Tableau 6. Conditions du marquage avec l'anticoprs primaire. _________________________________ 76

9
AVANT-PROPOS

10
 Même si la dureté minérale de l’émail et de la dentine laisse penser que la
pulpe dentaire est protégée durablement de l’environnement buccal, les lésions
carieuses ou traumatiques profondes laissent entrer des bactéries cariogènes au sein
de la pulpe. La dissolution acide des structures minérales initiée par les bactéries
cariogènes compromet l’intégrité physique du complexe pulpo-dentinaire, formé par
la pulpe et la dentine. C’est alors que les mécanismes d’inflammation et de
régénération tissulaire se mettent place. La pulpe dentaire possède des cellules
souches capables de régénérer ce complexe. Déterminer par quels mécanismes les
cellules souches pulpaires sont recrutées sur le site lésionnel, tel est le principal
objectif de mes travaux de thèse.

La réponse inflammatoire est médiée par tout un arsenal cellulaire et

moléculaire, dont le système du Complément prend une part importante. Composé
d’une famille de plus de 40 protéines, son activation permet la libération de puissants
facteurs pro-inflammatoires comme les anaphylatoxines C5a et C3a. Des études
précédentes ont démontré que le fragment C5a recrute spécifiquement les cellules
souches pulpaires. De plus, les fibroblastes pulpaires ont été montrés comme étant
des cellules non-immunitaires capables de synthétiser toutes les molécules du
Complément, y compris les pores lytiques appelés « complexes d’attaque
membranaire » (CAM). Cependant, aucune information n’était disponible sur
l’implication du fragment C3a et des CAM pendant la régénération pulpo-dentinaire.

Ce travail de thèse a pour but d’apporter des réponses concrètes en

introduisant, dans un premier temps, la carte d’identité du système du Complément
par la description des étapes de son activation et de son rôle dans l’inflammation. Afin
de l’apprécier autrement que dans l’inflammation, d’autres rôles du Complément
seront abordés à travers un ensemble d’études récentes, et notamment son
implication au cours de la régénération tissulaire. Cette démarche permettra de
comprendre que le système du Complément, qui participe à l’inflammation tissulaire,
initie en même temps les mécanismes de régénération. Dans le contexte pulpo-
dentinaire, cette étude s’orientera sur l’influence du fragment C3a et des complexes

11
d’attaque membranaire dans les étapes précoces de la régénération du complexe
pulpo-dentinaire.

L’ensemble de mes travaux de recherches ont cerné le rôle du fragment C3a

dans le recrutement spécifique des fibroblastes et dans la mobilisation des cellules
souches pulpaires. De plus, mes investigations, sur la destruction des bactéries
cariogènes par les complexes d’attaque membranaire, clarifient les propriétés locales
de défense anti-bactérienne du tissu pulpaire. En se projetant dans un avenir proche,
cette étude fondamentale permettra d’améliorer les moyens thérapeutiques, en
ciblant le contrôle de l’inflammation et en favorisant la régénération du complexe
pulpo-dentinaire sur le site d’une lésion.

12
INTRODUCTION

13
 Première Partie : Le système du Complément

I. Le système du Complément : Histoire

L’histoire des sciences immunologiques nous apprend que le système du

Complément est un des tout premiers mécanismes de défense de l’hôte décrit par les
scientifiques, qui permit par la suite de poser les bases de l’immunologie moderne. A
la fin du XIXème siècle, dans une ère à l’opposé de nos actuelles technologies, les
immunologistes et microbiologistes Paul Ehrlich, Jules Bordet et George Nuttal
identifièrent un facteur dans le sérum capable de tuer des bactéries (Walport, 2001).

C’est Georges Nuttall en 1888 qui posa la première pierre de la découverte. Il fit
le constat que le sang normal de chèvre possédait une légère activité bactéricide sur le
bacille anthracite, et qu’une fois le sang chauffé à 55°C, l’activité bactéricide était
perdue. Il nomma « alnexines » les facteurs responsables de l’activité bactéricide
(Nuttall, 1888). Jules Bordet vint compléter les recherches sur ces alnexines. En 1895,
en travaillant sur le sérum d’animaux immunisés, il mit en évidence le rôle de deux
composants. Il s’aperçut que le sérum d’un animal immunisé perdait ses capacités
bactéricides après un chauffage à 55°C ; mais aussi, qu’après ajout de sérum frais
normal, l’activité bactéricide était récupérée. Il en conclut qu’il se trouvait en présence
d’un composant thermostable pouvant conférer une immunité spécifique, et
également d’un composant thermolabile pouvant conférer une immunité non-
spécifique et être présent dans tous les sérums (Bordet, 1895).

La recherche sur ces facteurs présents dans le sérum fut éclairée par
l’intervention de Paul Ehrlich, en 1899. Il proposa de nommer « Ambocepteurs »
(reconnus plus tard comme les anticorps) les facteurs thermostables capables de se
lier aux bactéries et d’induire leur lyse. Il proposa également de renommer les facteurs
thermolabiles alnexines par « Complément », de par leur rôle complémentaire aux
ambocepteurs dans la lyse des bactéries. Et c’est ainsi que fut introduit pour la
première fois le terme de Complément. Ces résultats d’activités bactéricides par la

14
fixation conjointe d’anticorps et de facteur du Complément a également permis de
pointer du doigt les premiers mécanismes d’activation d’une des 3 voies du système
du Complément : la voie classique (Ehrlich and Morgenroth, 1899).

Plusieurs décennies de recherches sur le système du Complément ont permis

d’établir une implication pléiotropique de ce système dans la biologie humaine. Cette
polyvalence du Complément est liée au grand nombre de protéines et de récepteurs
qui interagissent ensemble dans le plasma et sur les membranes. Il possède un rôle
essentiel dans la défense de l’hôte contre les pathogènes par l’opsonisation et la lyse
directe de ceux-ci. Ce système produit des fragments bio-actifs qui agissent sur les
différentes phases de l’inflammation, sur le recrutement de cellules immunitaires, sur
les structures vasculaires notamment (Zipfel and Skerka, 2009).

II. Les 3 voies canoniques du système du Complément

Le système du Complément possède trois voies majeures d’activation et

d’amplification : la voie classique, la voie des lectines et la voie alterne. D’une manière
générale, les voies d’activation reposent sur une cascade d’événements protéolytiques
successifs. La signature du système du Complément réside dans le fait que des
changements de conformation des protéines vont favoriser leur activation et leur
clivage par les autres membres de la cacade, et former ainsi les protéases suivantes. Ce
déroulement permet de contrôler la cascade enzymatique de manière spécifique et
temporelle (Gros et al., 2008; Walport, 2001).

A. La voie classique

L’activation du complexe protéique C1 est le point de départ de la voie classique.

De par sa structure, le complexe C1 est décrit comme étant un « bouquet de fleur »
(Figure 1). En effet, le complexe C1 est composé d’un hexamère de molécules C1q qui
surplombe un tétramère de 2 molécules C1r et 2 molécules C1s (Janeway et al., 2001).
La molécule C1q est formée par 6 queues de collagène, chacune terminée par des

15
têtes globulaires qui contiennent des sites de fixation à l’ion Ca2+. Ces derniers
assurent notamment la stabilité des têtes globulaires lors de la reconnaissance directe
des pathogènes (Roumenina et al., 2008).

Queue collagénique
Molécule C1q
(Hexamère)
Tête globulaire

Site de fixation des

ions Ca2+

Molécules C1s
Organisées en tétramère
Molécules C1r

Figure 1 : Structure du complexe C1.

Le tétramère des 2 molécules de C1s et de C1r est au cœur du "bouquet de fleur", formé par
l'hexamère de molécules C1q. Les têtes globulaires terminent les queues collagéniques des
molécules C1q, avec la présence d’un site de fixation au Ca2+.

L’activation du complexe C1 est connue pour être dépendante de la formation

des complexes immuns (antigènes-anticorps). Les parties constantes (Fc) des
immunoglobulines (Ig) de types G et M possèdent des sites de fixations masqués pour
les têtes globulaires des molécules C1q. Lorsque les complexes immuns se forment, un
changement de conformation des parties Fc permet de démasquer ces sites de
fixations (Miletic and Frank, 1995). Une fois les molécules C1q fixées sur les parties Fc,
un autre changement de conformation intervient, permettant l’activation de la pro-
enzyme C1r. La forme active de C1r possède une activité protéase qui déclenche le
clivage et l’activation des molécules C1s. Ces dernières ont une activité sérine protéase
(Janeway et al., 2001).

16
 Les molécules C1s vont ensuite pouvoir cliver deux autres fragments : le C4 et le
C2 (Figure 2). Le clivage s’effectue en deux temps, où le fragment C4 est d’abord clivé
en C4a et C4b. Le fragment C4b se dépose ensuite sur la membrane du pathogène.
Puis, le fragment C2 s’attache au fragment C4b, et est clivé en C2a et C2b par la
molécule C1s. Les fragments C4b et C2a s’organisent ensemble pour former la C3-
convertase à la membrane du pathogène (Ehrnthaller et al., 2011).

C4
C4a C2

3
2 6
5
4
1 C1 7
C4b C4b

Membrane
pathogène

Anticorps
C4bC2a
Antigène
membranaire

Figure 2 : Etapes d'activation de la voie classique.

1 Le complexe C1 se fixe sur les complexes immuns, et le tétramère C1r/C1s s’auto-active ; 2
Le fragment C4 est clivé par C1s ; 3 Le fragment C4a est libéré ; 4 Le fragment C4b est libéré et
s’insère sur la membrane du pathogène ; 5 Le fragment C2 s’attache sur le C4b à proximité de
C1s, pour être clivé ensuite ; 6 Le fragment C2b est libéré ; 7 Le fragment C2a reste fixé à C4b
pour former la C3-convertase.

Une particularité de la voie classique peut être soulignée : l’activation de la voie

classique peut également s’effectuer de manière indépendante des complexes
immuns. En effet, les têtes globulaires des molécules C1q sont capables de se fixer sur
plus de 100 motifs infectieux de types PAMPs (pathogen-associated molecular
patterns) comme le lipopolysaccharide (LPS) ou les porines bactériennes (Albertí et al.,
1996; Kishore et al., 2004; Roumenina et al., 2008). Mais la molécule C1q est aussi
capable de reconnaître les membranes des cellules apoptotiques, grâce à l’exposition

17
des phosphatidylsérines, ou encore des cellules nécrotiques (Gaboriaud et al., 2011;
Nauta et al., 2002; Païdassi et al., 2008a). Il semblerait également que l’ADN double
brin de cellule apoptotique puisse être reconnu par la molécule C1q, et ainsi induire
l’activation de la voie classique (Païdassi et al., 2008b; Tissot et al., 2003). De plus, la
molécule C1q serait en mesure de se lier à des protéines de micro-organismes ou
humaines telle que la GAPDH (glycéraldéhyde-3-phosphate-déshydrogénase) (Terrasse
et al., 2012).

B. La voie des lectines

L’activation de la voie des lectines présente de fortes similarités avec la voie

classique, à la différence près que la voie des lectines ne requiert pas la présence
d’anticorps. Par conséquent, les éléments de la voie des lectines sont capables de
reconnaître directement une pléthore de membranes de pathogènes. Les mécanismes
d’activation de cette voie reposent sur la reconnaissance des pathogènes par des
complexes protéiques membres de la famille des collectines (comme le C1q) : la MBL
Mannan-Binding Lectin (MBL) et les ficollines (Kjaer et al., 2013; Runza et al., 2008).

MBL Queue de collagène

Homodimère de
MASPs (1 ou 2)
Domaine
globulaire CRD

Ficolines
Queue de collagène

Homodimère de
MASPs (1 ou 2)
Domaine
fibrinogène-like

Figure 3 : Structure des MBL et Ficolines.

18
 La molécule MBL possède une structure homologue au complexe C1 de la voie
classique (Figure 3). Il s’agit d’un oligomère de six queues collagéniques riches en
cystéine sur la portion N-terminale, et qui sont terminées par des domaines
globulaires. Ces derniers diffèrent cependant par la possession d’un domaine de
reconnaissance des carbohydrates, appelé domaine CRD (Carbohydrate Recognition
Domain). La présence de ces domaines CRD permet la fixation de la MBL sur les
groupes hydroxyles (-OH) des monosaccharides de pathogènes, tels que le glucose, le
mannose et la N-acétyl-glucosamine. Cette reconnaissance des sucres sur les
membranes des agents infectieux se déroule de manière calcium-dépendante
(Matsushita et al., 2013).

Les autres acteurs de la voie des lectines sont les ficolines (Figure 3). Il existe 3
types de ficolines : H, L, et M. Ce sont des complexes de 4 queues de collagènes ayant
peu de résidus cystéine en N-terminal. Chacune des sous-unités de collagène possède
des structures en C-terminal qui sont composées de domaines fibrinogène-like. Ceux-ci
ont la capacité de lier les carbohydrates portant des groupes acétyl et N-acétyl-
glucosamine présents à la surface des bactéries (Frederiksen et al., 2005; Garlatti et al.,
2007; Krarup et al., 2008).

C4 C4a C2
1 2
MASP-1 MASP-2

C4b

Carbohydrates à la membrane
des pathogènes

Figure 4 : Exemple des étapes d'activation de la voie des lectines (MBL).

1 Les oligomères MBL contenant les MASP-1 et -2 vont se fixer sur les carbohydrates de la
membrane du pathogène ; 2 La juxtaposition des MASP-1 et -2 vont permettre leur activation
et le clivage du C4. Le C4b s’insère dans la membrane et permet de recruter le C2. Les étapes
d’activation de la voie des lectines par les Ficolines sont similaires aux MBL.

19
 Que ce soit la MBL ou les ficolines, chacun de ces complexes protéiques possède
des sites de fixation pour des sérines protéases homologues à C1r et C1s, appelées
MBL-associated serine protease 1 (MASP-1) et MASP-2 (Kjaer et al., 2013). Outre leur
similarité structurelle avec la voie classique, l’activation des MASPs de la voie des
lectines est un peu différente. Les oligomères (MBL ou ficolines) sont associés dans le
plasma soit avec un homodimère MASP-1, soit avec un homodimère MASP-2. Or,
MASP-1 est nécessaire pour l’activation de MASP-2. De plus, MASP-2 peut cliver le
fragment C4 alors que MASP-1 ne possède pas cette activité. C’est pourquoi la
juxtaposition d’oligomères (Figure 4), liés à MASP-1 et à MASP-2 également, est
requise pour l’activation de MASP-2 et le clivage efficace des fragment C2 et C4 (Degn
et al., 2014; Gál et al., 2005; Héja et al., 2012; Kidmose et al., 2012).

C2b

3 4
C2a C4bC2a
MASP-1 MASP-2
C2a

C4b

C4b

Figure 5 : Suite des étapes de l'activation de la voie des lectines (MBL).

3 Le fragment C2 est clivé en C2a et C2b. Ce dernier est relargué tandis que le C2a reste fixé au
C4b ; 4 La C3-convertase C4bC2a est ainsi formée et prête pour le clivage du fragment C3.

Ainsi, une fois la MBL ou les ficolines liées à leurs propres motifs sucrés sur les
membranes des pathogènes, MASP-1 s’auto-active et va pourvoir cliver son
homologue MASP-2 (Figure 4). Après leur activation, MASP-1 et MASP-2 vont alors
cliver les fragments C4 et C2, et il pourra se former une C3-convertase (Figure 5). Cette
dernière est composée des sous-unités C4bC2a, identiques à la voie classique
(Matsushita et al., 2013).

20
 C. La voie alterne

La voie alterne est la troisième voie d’activation du système du Complément et

comporte une boucle d’amplification. Son appellation a pour origine une description
d’une voie secondaire ou « alternative » à la voie la classique. Cette voie génère une
C3-convertase bien distincte des autres voies, et vient ainsi compléter l’arsenal
enzymatique de la cascade. Cette voie comporte une activation en phase fluide (dans
le plasma) et aussi au niveau des membranes (Janeway et al., 2001).

L’activation de la voie alterne débute par l’hydrolyse spontanée d’un pont

thioester du fragment C3 dans le plasma (Figure 6), appelée également « tick-over »,
et induit la formation du fragment C3(H2O) (Pangburn et al., 1981). Cette hydrolyse
provoque d’importants changements de conformation du fragment C3 qui permettent
le recrutement et la fixation du facteur B et D, deux autres composants plasmatiques,
de manière Mg2+-dépendante. Le facteur B fixé sur le C3(H2O) est clivé par le facteur D
pour ensuite libérer le fragment Ba, et laisser la partie Bb lié au C3(H2O). La C3-
convertase de la phase fluide C3(H2O)Bb est ainsi formée et activée (Bexborn et al.,
2008; Milder et al., 2007). La rencontre de cette C3-convertase avec le fragment C3
provoque son clivage en fragments bioactifs C3a et C3b. Le fragment C3b peut alors se
lier aux membranes des pathogènes ou de l’hôte. De façon identique, les facteurs B et
D vont interagir avec le C3b pour former de nouvelles C3-convertases C3bBb, facilitant
l’amplification de la protéolyse enzymatique des fragments C3.

Cependant, la demi-vie de la C3-convertase C3bBb est de courte durée (90

secondes) (Pangburn and Müller-Eberhard, 1986). La stabilisation du complexe
enzymatique est alors requise. Elle est rendue possible par l’action de la Properdine
qui est capable de se lier au fragment C3b, et donc permet la stabilisation de la C3-
convertase C3bBb d’un facteur 5 à 10, à la surface des membranes (Fearon and
Austen, 1975). La Properdine possède également un rôle de plateforme pour
l’assemblage des C3-convertases. En effet, la Properdine serait capable de lier certains
PAMPs, comme des glycosaminoglycanes (GAGs) bactériens et faciliterait ainsi la
formation des C3-convertases (Kemper et al., 2010).

21
 Mg2+
C3 1 C3(H2O) 2

4
3
5
C3(H2O)
C3(H20)Bb
C3a

FD
FB FD Ba C3bBb
C3b
C3b
6 7 8
Membrane pathogène
Figure 6. Etapes d'activation de la voie alterne.
1 & 2 L’hydrolyse spontanée du C3 (C3(H2O)) permet le recrutement des Facteurs D et B (FD,
FB) de manière Mg2+-dépendante ; 3 Le FD coupe le FB en Ba et Bb. Le fragment Ba est
relargué alors que le fragment Bb resté fixé au C3(H2O) et forme la C3-convertase C3(H2O)Bb
de la boucle d’amplification ; 4 & 5 La C3-convertase C3(H2O)Bb clive les fragment C3 en C3a et
C3b. Le C3b se fixe sur la membrane du pathogène ; 6 & 7 Les facteurs B et D sont recrutés sur
le C3b ; 8 FD clive FB en Ba et Bb. Le fragment Bb fixé au C3b forme la C3-convertase de la voie
alterne C3bBb.

III. Les voies effectrices communes du Complément

A. Action des C3- et C5-convertases

La formation et l’activation des C3-convertases de la voie classique, des lectines

et alterne convergent vers une fonction commune qui est le clivage du fragment C3.
Etant donné la forte présence de la molécule C3 dans le plasma (1-2 mg/ml) (Lambris,
1988), un grand nombre de fragments C3a et C3b sont libérés. Le fragment C3a est un

22
fragment bioactif libre dans le plasma, tandis que le C3b se fixe aux membranes pour
agir en tant qu’opsonine, ou bien s’associe aux C3-convertases membranaires (C4bC2a
et C3bBb) pour former les C5-convertases C4bC2aC3b et C3bBbC3b (Figure 7)
(Janeway et al., 2001).

Les 3 voies d’activations passent ainsi à l’étape suivante qui implique le fragment
C5. La liaison covalente du C3b sur le complexe C4bC2a (C3-convertases de la voie
classique et des lectines) change l’affinité du complexe en faveur du fragment C5 et
permet d’augmenter d’un facteur 1000 l’activité enzymatique (Pangburn and Rawal,
2002). Concernant la fixation du C3b sur le complexe C3bBb (C3-convertase de la voie
alterne), l’affinité en faveur des molécules C5 n’est pas modifiée, et est même 6 à 9
fois plus faible (Rawal and Pangburn, 2003), par comparaison avec la voie classique.
Cependant, la Properdine stabilise la C3-convertase de la voie alterne. Par conséquent,
l’efficacité du clivage du C5, après fixation du fragment C3b sur le complexe C3bBb
(formation de la C5-convertase C3bBbC3b), est compensé par l’augmentation de sa
demi-vie (jusqu’à 30 minutes) par la Properdine (Fischer and Kazatchkine, 1983;
Medicus et al., 1976).

Les C5-convertases vont cliver le fragment C5 en C5a et C5b. Tout comme le C3a,
le fragment bio-actif C5a est libéré dans le plasma. Quant au fragment C5b, il a la
capacité de se fixer aux membranes pour permettre l’ultime étape de la cascade du
Complément. En effet, la fixation du C5b engendre la formation du complexe
d’attaque membranaire (Janeway et al., 2001).

B. Le complexe d’attaque membranaire (CAM)

Après sa fixation sur les membranes, le fragment C5b est le premier élément du
CAM où vont pouvoir s’associer le C6, le C7, le C8 et le C9 (Figure 7). La formation du
CAM ne requiert pas de clivage enzymatique après l’étape du C5. Cette association de
molécules C5b-9 conduit à la formation de pores à travers les membranes de 10 nm de
diamètre (Bubeck, 2014).

23
 La séquence d’association de protéine commence par la fixation du fragment C6
au C5b, formant un complexe hydrophile. Il s’ensuit la fixation de la molécule C7 au
C5b-6. Cette fixation induit des changements de conformations permettant
l’exposition de groupes lipophiles, ce qui assure une stabilité relative au complexe C5b-
7 à la surface des membranes (Preissner et al., 1985). Le fragment C8 se lie ensuite au
C5b-7. C’est le premier composant du CAM qui pénètre la bicouche lipidique. C’est un
hétérotrimère composé des sous-unités C8α, ß et y. Le C8α possède une homologie de
séquence avec la perforine sécrété par les lymphocytes T cytotoxiques et NK (Hadders
et al., 2007). Après la pénétration du composant C8, le complexe se complète
progressivement par la liaison de 12 à 18 molécules C9 pour former des pores
transmembranaires.

Etant donné le nombre important de molécule de C3b générées au cours de la

cascade, le nombre de complexes terminaux formés par la suite est lui aussi très
important (un C3b peut générer 1000 CAM). La formation de plusieurs CAM est
nécessaire pour induire la lyse efficace d’un pathogène (Serna et al., 2016).

24
 Voie Classique
Voie Alterne
Voie des Lectines

1 2 2 1
C3 C5 C5 C3

Membrane
C4bC2a C4bC2aC3b pathogène C3bBbC3b C3bBb
C5-convertase C5-convertase

Echanges d’ions =
choc osmotique
C6 C7 C8 C9

3 5
4

Membrane pathogène Complexe d’Attaque

Membranaire (CAM)
C5b-9

Figure 7. Voies effectrices communes du Complément

1 Les C3-convertases des voies classiques, des lectines et alterne vont cliver le fragment C3 en
C3a et C3b ; 2 Le fragment C3b va s’associer aux C3-convertases pour former le C5 convertase
de la voie classique et des lectines C4bC2aC3b, ainsi que la C5-convertase de la voie alterne
C3bBbC3b ; 3 Les C5-convertases vont alors cliver le fragment C5 en C5a et C5b. Les fragments
C6, C7, C8 vont être recrutés pour initier la formation du Complexe d’Attaque Membranaire
(CAM) ; 4 12 à 18 molécule de C9 sont recrutés au niveau du C5b-C8 ; 5 L’ensemble du
complexe C5b-9 forme un pore stable à la membrane du pathogène. Ce pore induit une lyse
par choc osmotique, provoquée par un échange de métabolites intra- et extracellulaire.

25
 C. Clivages « non-conventionnels » du C3 et du C5

L’efficacité du système du Complément est renforcée par l’existence de voies

parallèles d’activation dans le plasma qui sont capables de cliver les fragments C3 et
C5. La première démonstration fut proposée par le groupe de Huber-Lang et
collaborateurs, en 2006. Leurs travaux ont mis en évidence le clivage du fragment C5
par la thrombine, en C5a et C5b. La thrombine est une protéine membre du système
de coagulation dont le site de clivage sur le C5 est le même que celui de la C5-
convertase. Les fragments ainsi générés ont les même propriétés biologiques que ceux
libérés au cours de la cascade (Huber-Lang et al., 2006). D’autres membres du système
de coagulation comme les Facteurs IXa, XIa, Xa, et la plasmine sont aussi impliqués
dans le clivage des fragments C3 et C5 (Amara et al., 2010).

A propos du fragment C3, le clivage hors de la cascade est réalisé notamment par
la thrombine et la plasmine. Il s’est avéré qu’en présence de C3, la thrombine et la
plasmine sont capables de générer le fragment C3a. Ce dernier possède des propriétés
biologiques car, une fois libéré du fragment C3, il induit une activité chimiotactique sur
des cellules de la lignée HMC-1 (monocytes humains) (Amara et al., 2010). Le clivage
par la plasmine, la thrombine ou même par le Facteur Xa du fragment C3 génère le
C3a-, le C3b-, l’iC3b-, le C3c- et le C3dg-like. Ces fragments possèdent des similarités
avec ceux produits au cours de la cascade mais ne sont pas identiques (Amara et al.,
2008; Tornetta et al., 1997). La présence de ces voies parallèles d’activation démontre
un lien étroit entre deux puissants systèmes plasmatiques : le Complément et la
coagulation. De façon identique au système du Complément, les clivages des
fragments du Complément ont lieu au site d’activation de la coagulation.

De plus, certains leucocytes renferment une machinerie permettant un clivage

intracellulaire des fragments C3 et C5. Les cellules phagocytaires, types macrophages
ou polymorphonucléaires, sont en mesure de cliver le fragment C5 en C5a bioactif par
une sérine protéase liée à leur membrane (Huber-Lang et al., 2002). Les cathepsines L
à activité sérine protéase des lymphocytes T sont capables de cliver le fragment C3 en
C3a biologiquement actif. En effet, le C3a généré par les cathepsines L est déterminant

26
pour la survie et la différentiation des cellules T de type Th1 (Liszewski et al., 2013).
Ces clivages intracellulaires sont la démonstration d’une activation des fragments C3 et
C5 indépendante du plasma.

IV. Régulation des voies du Complément

Le système du Complément possède un important potentiel d’activation par

l’existence de ces boucles d’amplifications, permettant la création de plateforme
membranaire pour la formation de nombreuses C3-convertases. C’est pourquoi, le
système du Complément nécessite d’être régulé négativement. Cette régulation fait
intervenir des facteurs solubles et membranaires, agissant en synergie en tant que co-
facteurs. Les 3 voies d’activation du Complément sont concernées, suggérant une
régulation fine de ce système (Figure 8).

A. Les régulateurs phares de la cascade

La dissociation enzymatique est l’objectif principal pour ralentir les signaux en

vue d’une résolution de l’inflammation, voire d’annihiler la cascade en cas
d’amplification excessive des signaux sur les cellules de l’hôte. Ce phénomène
implique des facteurs solubles comme :

La C1-Inh (C1-Inhibitor) : est une molécule de la famille des serpines. La C1-Inh

se lie directement aux sérines protéases C1r et C1s du complexe C1 de la voie
classique. Cette fixation provoque l’inactivation et la libération du tétramère
enzymatique C1r:C1s du complexe C1 (Davis et al., 2010). De plus, les sérines
protéases MASP-1 et MASP-2 de la voie des lectines peuvent également être inactivées
de la même manière par la fixation de la molécule C1-Inh (Presanis et al., 2004).

La C4BP (C4-Binding-Protein) : est une protéine qui possède une structure

« octopus-like », avec un ensemble de chaines α et ß. Les chaînes α de C4BP ont pour
fonction de cliver simultanément 4 fragments C4b en C4c et C4d, et permet ainsi

27
d’empêcher la fixation de C2a pour former la C3-convertase. L’action de C4BP
nécessite un cofacteur : le facteur I. La C4BP est aussi capable de cliver le fragment C3b
en fragment inactif iC3b, ce qui empêche la formation à la fois des C3- et également
des C5-convertases de la voie classique (Blom et al., 1999, 2001; Hessing et al., 1990;
Ziccardi et al., 1984).

Le Facteur I : est le facteur soluble le plus sollicité pour l’inactivation des C3-
convertases de la voie alterne, et plus particulièrement dans la phase fluide. En effet,
le Facteur I possède un cofacteur soluble, le Facteur H, impliqué dans la dégradation
du C3b. Le Facteur I est une protéine à activité sérine protéase qui est sous une forme
inactive dans le plasma. Quand s’effectue une rencontre avec le Facteur H, le Facteur I
est immédiatement activé. Ainsi, la fixation des deux facteurs sur le C3b induit son
clivage en iC3b. Ce dernier est incapable de se lier au Facteur B et empêche donc la
formation des C3-convertases (Roversi et al., 2011). Son alliance pour désamorcer le
système du Complément ne se limite pas au Facteur H et implique notamment la C4BP
(voir paragraphe précédent), et bien d’autres encore.

Le Facteur H : est le régulateur clef de la boucle d’amplification de la voie

alterne. Le Facteur H rentre en compétition avec le Facteur B pour empêcher sa
fixation sur le C3b et le C3(H2O). Avec le Facteur I comme cofacteur, ils induisent la
dégradation du C3b et la dissociation de la C3-convertase C3bBb, et dans une moindre
mesure celle du complexe C3(H2O)Bb en phase fluide (Bexborn et al., 2008; Perkins et
al., 2012).

La Vitronectin et la Clusterine : sont des facteurs solubles responsables de

l’inactivation du complexe d’attaque membranaire (CAM). Ces protéines ont la
capacité de capturer les éléments du complexe C5b-9 dans le plasma, et d’empêcher
leur fixation sur une membrane. Mais surtout, ces deux facteurs sont capables de se
fixer de part et d’autre des groupes lipophiles du fragment C7, déstabilisant ainsi
l’ensemble du complexe. Ce mécanisme permet de rendre soluble le CAM et prévient
sa fixation sur les membranes (Preissner et al., 1989; Tschopp et al., 1993).

28
 Le fragment C8 : est un membre de la cascade qui serait ambivalent dans ses
fonctions effectrices. En effet, autant son rôle dans la composition du CAM est établi,
tant son rôle de régulateur de ce même complexe doit aussi être décrite. Lorsque la
formation du CAM est au stade du C5b-7, la fixation du C8 induit des changements de
conformation qui peuvent bloquer par la suite toutes possibilités pour une insertion
membranaire (Nemerow et al., 1979).

L’action de ces facteurs solubles est renforcée par une coalition de facteurs
membranaires :

Le Complement Receptor 1 (CR1) : est responsable de la protéolyse des

fragments C4b et C3b. Le CR1 (ou CD35) est un récepteur exprimé par les leucocytes,
les érythrocytes et les podocytes glomérulaires. Dans ce processus, il est un cofacteur
du Facteur I. Ils peuvent alors induire le clivage du fragment C4b en C4c et C4d. Les
CR1 et Facteur I vont induire également le clivage du C3b en iC3b, puis en C3c et C3dg
(Klickstein et al., 1988; Lambris et al., 1996).

La Membrane Cofactor Protein (MCP) : également nommée CD46, est impliquée

dans la dissociation des C3- et C5-convertases. Son expression est pan-cellulaire, mais
ne concerne pas les érythrocytes. La MCP peut se lier aux fragments C4b et C3b, et par
l’action conjointe du Facteur I et H, la MCP peut induire le clivage des 2 fragments
(Facteur I pour C4b, Facteur H pour C3b) (Barilla-LaBarca et al., 2002; Persson et al.,
2010).

Le Decay Accelerating Factor (DAF) : est une protéine fortement glycosylée qui
possède un ancre GPI (Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol). Le DAF, ou CD55, est exprimé
par la plupart des cellules (sauf les Natural Killers). Le DAF permet la dissociation des
C3- et C5-convertases par son action synergique avec le Facteur I. DAF a la capacité de
lier le fragment Bb et le fragment C3b, ayant pour conséquence une diminution
drastique de l’activité des convertases (Harris et al., 2005; Hourcade et al., 2002;
Nicholson-Weller and Wang, 1994).

29
 La Protectine (CD59) : présente également une ancre GPI insérée dans les
membranes de la majorité des types cellulaires. Le CD59 régule la formation des CAM
sur les membranes cellulaires. Le CD59 inhibe la formation des pores lytiques en
empêchant la fixation des molécules C9 sur les chaînes α des fragments C8 insérés
dans la membrane (Leath et al., 2007; Meri et al., 1990).

B. Les régulateurs du Complément : une liste évolutive

A cette liste des régulateurs phares vient s’implémenter un nombre grandissant

de protéines inhibitrices qui vont influencer la cascade à différents niveaux.

C’est le cas de la protéine soluble FHL-1 (Factor H-Like protein 1), nommée
également Reconectine. Celle-ci agit à deux niveaux dans la voie alterne
essentiellement. La FHL-1 est le co-facteur du Facteur I et permet la dégradation du
fragment C3b. De plus, la FHL-1 altère les C3- et C5-convertases en favorisant leur
dissociation, en agissant à chaque étapes de la formation de ces enzymes (Zipfel and
Skerka, 1999).

D’autres exemples d’altération de la voie alterne existent, si l’on s’intéresse

notamment au récepteur membranaire CRIg (Complement Receptor of
Immunoglobulin). Exprimé de manière exclusive par les macrophages, le CRIg favorise
la dissociation des C3- et C5-convertases de la voie alterne. Pour cela, le CRIg altère
sélectivement la capacité de liaison des sous-unités C3b des C3- et C5-convertases
avec leurs substrats, par sa liaison directe avec les chaînes ß du fragment C3b
(Wiesmann et al., 2006).

La régulation du système du Complément fait intervenir également la protéine

CFHR1, pour Complement Factor H-Related protein 1. Cette protéine appartient à la
famille du Facteur H, et présente des homologies de séquence avec celui-ci (Skerka et
al., 2013). La CFHR1 inhibe le clivage du fragment C5 par la C5-convertase par sa liaison
avec la sous-unité C3b et le fragment C5 simultanément. La CFHR1 est aussi capable

30
d’inhiber, indépendamment de l’activité des convertases, l’assemblage du complexe
C5b-C6-C7 sur une surface d’attachement. Ce qui permet de prévenir la formation du
CAM et la lyse par choc osmotique (Heinen et al., 2009).

Cette liste non-exhaustive de régulateurs du Complément souligne l’importance

d’une régulation étroite aux différentes étapes des voies d’activation. De plus, la
diversité de la régulation met en relief l’importance du Complément dans l’équilibre
physiologique des réponses inflammatoires. La moindre déficience en protéines du
Complément est la porte ouverte à des dysfonctionnements majeurs et des
pathologies graves qui mettent en péril l’homéostasie d’un organisme vivant.

31
 Voie Classique Voie des Lectines Voie Alterne

C1
C3
MBL Ficoline

C1 Inh

MCP, DAF, CR1, FH, MCP, DAF, CR1,

C4BP, FHL1, FI FHL-1, CRIg, FI
C3
C4bC2a C3bBb
C3-Convertase C3-Convertase

C3b CRIg,
C3a CFHR1

C4bC2aC3b C3bBbC3b
C5-convertase C5 C5-convertase

CFHR1
CFHR1
C5b
C6 C7
C8
C9
C5a
CD59, Clusterine,
Vitronectine
Complexe d’Attaque
Membranaire (CAM)
C5b-9 C8

Figure 8. Régulation du système du Complément.

32
 C. Physiopathologie du système du Complément

Certaines des pathologies associées au système du Complément résultent de

l’absence d’un ou de plusieurs régulateurs. Ce qui a pour conséquence de déclencher
une activation excessive du Complément. Ces pathologies, qui pèsent lourdement dans
la vie des patients qui en sont atteints mettent en lumière l’importance du
Complément dans la physiologie d’un organisme humain.

L’Hémoglobinurie Paroxystique Nocturne (HPN) est un exemple de pathologies

rares liées au Complément (Risitano, 2012). Des mutations du gène PIG-A entraîne la
perte des ancres GPI des protéines insérées dans les membranes, comme celles des
régulateurs DAF et CD59. Cette absence de régulateurs membranaires du Complément
concerne notamment les globules rouges. L’activation de la voie alterne et de sa
boucle d’amplification entraîne des dépôts de fragments C3b sur les membranes des
globules rouges. Les C3- et C5-convertases peuvent alors se former, ainsi que le
complexe d’attaque membranaire (CAM). L’absence de DAF et de CD59 entraîne alors
la lyse irréversible des globules rouges à l’intérieur des vaisseaux. Les dommages
conséquents à cette hémolyse sont importants. Cependant, le développement d’un
anticorps monoclonal anti-C5, nommé Eculizumab, a permis chez des patients HPN,
d’empêcher l’hémolyse intravasculaire et les autres séquelles associées (Rother et al.,
2007).

Un autre type d’altération de la voie alterne du Complément est décrit dans le cas
de Syndrome Urémique Hémolytique atypique (aHUS). Cette pathologie est
caractérisée par des micro-angiopathies thrombotiques rénales (Noris and Remuzzi,
2009). Ici, la perte de régulation du Complément est la conséquence de mutations
principalement sur le gène codant le Facteur H, mais aussi le Facteur I. Ainsi, le facteur
H ne peut plus lier le C3b, ni les glycosaminoglycanes des membranes cellulaires.
Quant au Facteur I, celui-ci perd son activité catalytique. Au niveau des glomérules
rénaux, ces altérations provoquent un dépôt de CAM à la surface des cellules
endothéliales entraînant par la suite la formation de micro-thrombi et une hémolyse
mécanique. Plus de 200 autres mutations ont été caractérisées à ce jour dans les cas

33
d’aHUS, soulignant des prédispositions pour le développement de cette maladie
(Roumenina et al., 2011). Le traitement par Eculizumab permet de diminuer fortement
l’activité lytique du Complément et de récupérer une fonction rénale correcte (Nester
and Brophy, 2013).

V. Synthèse des molécules du Complément

Il est acquis depuis plusieurs décennies que la majorité des molécules du

Complément présentes dans le sérum humain sont issues de la synthèse hépatique, à
l’exception près des molécules C7, C1q et du Facteur D. Des expériences de
transplantations de foies entre deux individus, ayant des polymorphismes différents
pour le fragment C3, ont démontré que 90 à 95% des molécules C3 circulantes dans le
sérum provenaient du foie (Alpert et al., 1969). Cette synthèse hépatique permet de
drainer tous les tissus en molécule du Complément dans le but d’assurer une défense
immunitaire efficace. Cependant, une synthèse extra-hépatique est nécessaire pour
produire les molécules C7, C1q et le Facteur D. Cette synthèse s’effectue dans des sites
potentiels d’infections bactériennes ou de stress tissulaire, qui permet d’avoir un pool
basal de molécules du Complément (Li et al., 2007).

La synthèse extra-hépatique est assurée localement par différents types

cellulaires d’origine myéloïdes ou non, et suggèrent des fonctions biologiques bien
précises, comme par exemple : la molécule C1q synthétisée localement permet
d’éliminer les complexes immuns mais aussi les cellules apoptotiques, souvent
présentes sur un site inflammatoire (Moosig et al., 2006) ; la production locale de
molécule C7 (macrophages par exemple) est un facteur limitant dans la formation du
CAM terminal et donc régule l’efficacité de la formation des pores lytiques sur la
membrane des pathogènes (Colten et al., 1979; Würzner, 2000). La synthèse des
régulateurs de la cascade du Complément est un phénomène qui conditionne
également la bonne marche d’une inflammation locale. Les monocytes, les cellules
dendritiques dérivées des monocytes ou encore les adipocytes sont capables de

34
synthétiser les Facteur I, H et Properdine (Lappin et al., 1992; Peake et al., 1997; Reis
et al., 2006).

La contribution de la synthèse locale des molécules du Complément est un vrai

atout pour promouvoir une défense efficace contre une invasion de pathogènes.
Cette synthèse locale, par divers types cellulaires, suggère également que toutes
cellules se trouvant à proximité du foyer de synthèse peuvent être activées et/ou
attirées par les molécules du Complément.

VI. Rôles du Complément

A. Opsonisation des pathogènes

Le système du Complément participe activement à l’élimination des pathogènes

par les cellules de type phagocytaire en induisant leur reconnaissance, leur ingestion et
leur destruction. Ce phénomène est médié par les opsonines C3b et C4b qui sont
capables de se fixer sur les membranes des pathogènes. Les cellules phagocytaires,
quant à elles, expriment les récepteurs au Complément (CR). L’interaction entre les
opsonines et leurs récepteurs conduit à la phagocytose des pathogènes.

Le CR1 est exprimé par les érythrocytes, les phagocytes et les podocytes
glomérulaires rénaux, et est impliqué dans la régulation des C3-convertases. Le C3b, et
le C4b dans une moindre mesure, sont capables de fixer le CR1 (CD35). Sur les
érythrocytes, le CR1 permet l’élimination des complexes immuns solubles, après
transport dans le foie et la rate par les macrophages résidents. Cette phagocytose par
les macrophages suite à l’interaction du C3b et du CR1 est rendue plus efficace par la
fixation conjointe d’IgG et de C3b sur les membranes cibles. L’opsonisation ne saurait
être optimale sans l’intervention d’autres facteurs tels que la fibronectine ou le
lipopolysaccharide (LPS) (Bohnsack et al., 1985; Griffin and Mullinax, 1990).

35
 Le CR3 et le CR4 sont des récepteurs spécifiques pour le fragment iC3b. Ces deux
récepteurs appartiennent à la famille des intégrines, et possèdent 2 chaînes a et b
importantes dans le processus d’adhésion cellulaire, par interaction avec les protéines
ICAM-1. Le CR3 (CD11b CD18) et le CR4 (CD11c CD18) partagent la même chaîne b2
(CD18). Chacune des deux chaînes possède des sites de fixation au Mg2+ essentiels
pour le fonctionnement des deux récepteurs. Le CR3 possède également un site de
fixation pour les lectines, ce qui rend plus efficace la phagocytose. Le CR3 et le CR4
sont exprimés par les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques et les
neutrophiles. Leur niveau d’expression varie selon l’état de différenciation et
d’activation des cellules. Ainsi, les macrophages, les cellules dendritiques et les
neutrophiles activés expriment un fort taux de CR3 et CR4 (Dupuy and Caron, 2008;
Ross and Vĕtvicka, 1993; Uotila et al., 2013).

D’une manière générale la phagocytose médiée par le CR3 est une réaction
lente. Les pathogènes sont internalisés par la polymérisation des fibres d’actine
induites par les petites GTPase Rho (Dupuy and Caron, 2008). Cependant, la
phagocytose des pathogènes est fortement améliorée lorsque ceux-ci sont opsonisés
par les IgG, en complément des fragments iC3b. La phagocytose devient alors plus
efficace, plus rapide notamment par l’activation d’autres petites GTPases Rac et
Cdc42. De plus, l’opsonisation des pathogènes par l’interaction CR3/iC3b peut être
améliorée par l’activation des Toll Like Receptors (TLRs), suite à la reconnaissance de
motifs pathogéniques. La phagocytose médiée par les CR3 et CR4 implique également
des stimuli pro-inflammatoires (cytokines) qui activent les cellules phagocytaires. Par
exemple, certaines cytokines inflammatoires vont pouvoir augmenter l’affinité du CR3
et CR4 pour l’iC3b et l’ICAM-1, par un changement de conformation (forme active des
intégrines) (Aderem and Underhill, 1999).

Une fois phagocytés, les pathogènes seront détruits par tout un arsenal
intracellulaire, tels que les espèces réactives de l’oxygène, lysozymes, protéases et
granules microbicides. Suite à la phagocytose par opsonisation, la fusion des
phagosomes contenant les pathogènes avec les lysosomes conduit à la lyse

36
intracellulaire de ceux-ci. L’opsonisation se termine par l’induction de l’apoptose des
cellules phagocytaires, menant ainsi l’inflammation à sa phase de résolution.

B. Elimination directe des pathogènes par le complexe d’attaque

membranaire (CAM)

Le complexe protéique terminal de la cascade du Complément, à savoir le

complexe d’attaque membranaire (CAM), est composé des fragments C5b à C9. Celui-
ci s’insère dans les membranes des pathogènes sous forme de pores de 10 nm de
diamètre (Bubeck, 2014). L’activation des 3 voies du Complément permet la synthèse
et la formation d’un grand nombre de CAM dans les membranes cibles, ce qui entraîne
une lyse par choc osmotique, c’est-à-dire une différence de gradient d’ions, de petites
molécules et d’eau, entre le milieu intra et extracellulaire. Les bactéries à Gram négatif
comme Escherichia Coli, ou encore des méningocoques sont lysés par la formation du
CAM dans leur membrane (Bhakdi et al., 1987; Lewis and Ram, 2014).

Cependant, certaines bactéries à Gram positif sont capables de réparer et de

résister aux dommages induits par le CAM. Ce dernier ne pourrait pas induire la lyse
bactérienne, à cause de la bicouche lipidique très épaisse qui compose la paroi des
bactéries à Gram positifs (Joiner et al., 1983). Berends et collaborateurs ont tout de
même démontré, après exposition avec du sérum, que les molécules du CAM peuvent
se déposer à la surface de bactéries à Gram-positif, mais celui-ci est incapable
d’induire une lyse bactérienne (Berends et al., 2013). Ce qui rend majeur l’enjeu de
comprendre comment le système immunitaire, par la production de CAM, peut la
maîtriser une infection par des bactéries à Gram-positif.

C. Action des anaphylatoxines pendant l’inflammation

Issues du clivage des fragments C3 et C5, par les C3 et C5-convertases

respectivement, les anaphylatoxines C3a et C5a jouent un rôle critique dans l’initiation
d’une inflammation au niveau local. Même s’il est capable de faire sécréter par les

37
monocytes des protéines qui inhibent leur migration, le rôle du fragment C4a dans
l’inflammation reste certainement incompris. Aucune caractérisation de récepteur au
C4a n’est répertoriée à ce jour et ne permet pas de savoir si le C4a agit comme une
anaphylatoxine telles que sont le C3a et le C5a (Barnum, 2015). Les anaphylatoxines
C3a et C5a participent à toutes les phases de l’inflammation en stimulant des cellules
immunitaires et des cellules non-myéloïdes également, qui expriment les récepteurs
au C3a (C3aR) et au C5a (C5aR).

Le C3a et le C5a induisent un « burst » oxydatif dans les macrophages, les

éosinophiles et les neutrophiles (Elsner et al., 1994a, 1994b; Murakami et al., 1993). En
se fixant sur les basophiles et les mastocytes, les anaphylatoxines vont provoquer un
relargage d’histamines qui va induire une vasodilatation, caractéristique d’une
inflammation (Kretzschmar et al., 1993; el-Lati et al., 1994). Les cellules musculaires
lisses vont également se contracter sous l’influence des fragments C3a et C5a
permettant d’augmenter la perméabilité vasculaire (Björk et al., 1985). Cette dernière
est nécessaire pour favoriser l’accès au site inflammatoire des cellules immunitaires
circulantes. L’extravasation cellulaire est rendue possible par l’effet chimio-attractant
des anaphylatoxines. Le fragment C5a est l’anaphylatoxine la plus puissante. En effet,
elle est capable d’attirer par un gradient les macrophages, les neutrophiles, les cellules
B et T activées, les basophiles ou encore les mastocytes. Ceux-ci sont également attirés
par un gradient de C3a (Aksamit et al., 1981; Ehrengruber et al., 1994; Hartmann et al.,
1997; Lett-Brown and Leonard, 1977; Nataf et al., 1999; Ottonello et al., 1999)

Les cellules immunitaires sont capables de passer du compartiment sanguin à un

compartiment tissulaire par diapédèse, impliquant des phénomènes de « rolling » et
d’adhésion cellulaire sur l’endothélium. Le fragment C3a est en mesure de stimuler les
cellules endothéliales exprimant le C3aR. La stimulation provoque une rapide
mobilisation des granules intracellulaires contenant notamment la P-Selectine
(Goligorsky et al., 2009). Les cellules endothéliales acquièrent ainsi un phénotype pro-
inflammatoire et permettent le recrutement des cellules immunitaires. Sous
l’influence du C5a et du C3a, les eosinophiles et les neutrophiles vont exprimer à leur
tour des L-selectines et le PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand-1, récepteur des P-

38
selectines sur les leucocytes), provoquant leur « rolling » sur l’endothélium (Daffern et
al., 1995; Fernandez et al., 1978). Les fragments C5a et C3a régulent également
l’expression d’intégrines, par les leucocytes, très affines pour les InterCellular Adhesion
Molecule (ICAM) endothéliales (DiScipio et al., 1999). Une fois l’adhésion des
leucocytes effectuée, l’extravasation cellulaire peut s’opérer par une migration trans-
endothéliale en direction du compartiment tissulaire.

La réputation du rôle pro-inflammatoire du fragment C3a n’est plus à faire, tant

sa description a pu faire l’objet de nombreuses études. Cependant, de récentes études
remettent en question l’action du C3a, et soulignent notamment son caractère anti-
inflammatoire (Coulthard and Woodruff, 2015). Le C3a stimule la sécrétion de
cytokines pro-inflammatoires par les monocytes/macrophages, lorsqu’une réponse
inflammatoire s’installe de manière chronique, telles que l’IL-6, le TNF-a et l’IL-1b,
participant ainsi à la progression de l’inflammation (Asgari et al., 2013; Takabayashi et
al., 1996). Or, lorsque l’inflammation est aigüe, où la réponse des
monocytes/macrophages est moins prédominante par rapport aux neutrophiles, le
C3a est capable de prévenir la mobilisation et la dégranulation des neutrophiles. Selon
la phase de l’inflammation, aigüe ou chronique, le C3a aurait une fonction
ambivalente, dépendante des types cellulaires présents pendant ces phases
(neutrophiles versus monocytes/macrophages) (Coulthard and Woodruff, 2015;
Daffern et al., 1995).

VII. L’anaphylatoxine C3a

A. Structure du C3a

La molécule C3 est codée par un gène localisé sur le chromosome 19 (Whitehead

et al., 1982). C’est une protéine de 1663 acides aminés qui possède 2 chaines
polypeptidiques a et b, de 110 et 75 kDa respectivement. A l’issu du clivage de la
protéine C3 par les C3 convertases de la cascade, le fragment bioactif C3a est libéré. Ce
dernier est une protéine de 9 kDa composée de 77 acides aminés (Hugli, 1990; Hugli

39
and Erickson, 1977; Lambris, 1988). Un important degré de similarité existe entre le
C3a et les autres anaphylatoxines (C5a et C4a) après alignement des séquences. Il
existe en effet 18% d’acides aminés identiques entre le C3a, le C4a et le C5a ; de plus,
36 % d’homologie existe entre le C3a et le C5a. Le fragment C3a possède, tout comme
le C5a, une structure secondaire composée de 4 hélices a antiparallèles stabilisées
entre elles par 3 ponts disulfures (Bajic et al., 2013; Chazin et al., 1988; Klos et al.,
2009; Nettesheim et al., 1988).

13
α1
20 α4
α2 Cys22
Cys23 Hélices α
4 26

N-terminal Ponts disulfures

Boucles peptidiques
C-terminal α3

Figure 9. L'anaphylatoxine C3a.

Comme décrit dans la figure 9, les résidus 4 à 13 forment l’hélice a1, les résidus
20 à 26 forment l’hélice a2, les résidus 36 à 40 forment l’hélice a3 et les résidus 47 à
72 forment l’hélice a4. Les hélices a sont reliées entre elles par des boucles
peptidiques, et contiennent les points d’ancrage des ponts disulfures au niveau des
Cys22-Cys49 (entre a2-a4), des Cys23-Cys56 (entre a2-a4), et des Cys36-Cys57 (entre
a3-a4) (Bajic et al., 2013). La présence de nombreux résidus Lysine et Arginine confère
une charge cationique à l’ensemble du fragment C3a, rentrant en ligne de compte lors
de la fixation du C3a sur le C3aR. Cette fixation est dépendante de la partie C-
terminale du fragment C3a où est présente une séquence de cinq peptides Leu-Gly-
Leu-Ala-Arg très conservée entre toutes les anaphylatoxines (Caporale et al., 1980).

40
 Suite au clivage enzymatique de la protéine C3, le fragment bioactif C3a est
rapidement désactivé. Des carboxypeptidases sériques de type N vont cliver l’arginine
77 sur la partie carboxy-terminale de la protéine, et former ainsi le fragment C3a-
desArg (Bokisch and Müller-Eberhard, 1970). Le clivage de l’arginine 77 est un
événement critique pour l’activité agoniste du C3a, qui n’est plus en mesure de se
fixer sur son récepteur (Wilken et al., 1999).

B. Le récepteur au C3a (C3aR) humain

1. Structure

Le C3aR est un membre de la superfamille des récepteurs couplés aux protéines

G (RCPG) de type A, comprenant notamment les récepteurs à la Rhodopsine (Findlay
and Pappin, 1986; Joost and Methner, 2002). Le C3aR est une protéine de 100 kDa,
composée de 482 acides aminés et possèdant une structure classique de RCPG avec 7
domaines transmembranaires, qui sont compris entre une région N-terminale
extracellulaire et une région C-terminale intracellulaire. Ce récepteur a pour
particularité de posséder une deuxième boucle extracellulaire très grande (ECL2)
constituée d’au moins 170 acides aminés (Figure 10), localisée entre le 4e et le 5e
domaine transmembranaire (TM4 et TM5 respectivement) (Ames et al., 1996; Crass et
al., 1996; Roglic et al., 1996).

Le C3aR subit de multiples modifications post-traductionnelles. Le récepteur au

C3a est une protéine où un fort taux de glycosylation a été démontré (Mizuno et al.,
2007). Au niveau de sa partie N-terminale (Asn 9) et de sa seconde boucle
extracellulaire (Asn 194), deux sites de N-glycosylation ont été caractérisés.
Concernant sa partie C-terminale intracellulaire, la Cystéine 468 aurait le potentiel
d’être palmitoylée in vivo (Feierler et al., 2011). Cependant, le rôle fonctionnel des
glycosylations et des palmitoylations n’ont pas été clairement établis à ce jour.

41
 Extracellulaire
S

N-terminal S
ECL2

S S

S
Membrane
M M M M M cellulaire

TM1 TM2 TM3 TM4 TM5 TM6 TM7

P
Protéine G P
P P
α β P P
γ
Intracellulaire C-terminal β-arrestine

Figure 10. Structure du Récepteur au C3a (C3aR).

Les principales modifications post-traductionnelles importantes pour la fixation du C3a sont ici
représentées, ainsi que les protéines nécessaires pour la signalisation intracellulaire. ECL2 =
2ème boucle extracellulaire ; TM = domaine transmembranaire ; G = glycosylations ; S =
sulfatations ; M = site de mutagénèse d’acides aminés à la surface extracellulaire des domaines
transmembranaires démontrant leur importance pour la fixation du C3a ; P = phosphorylations
induites par les GRKs.

De plus, certaines des tyrosines (Tyr) présentes sur la grande boucle

extracellulaire en position 174, 184, 188, 317 et 318, possèdent des sites de
sulfatation. Les travaux de Gao et collaborateurs ont démontré que la sulfatation de la
Tyr174 est un prérequis indispensable pour une liaison de haute affinité (Kd de l’ordre
de 1 nM) du fragment C3a sur le récepteur (Gao et al., 2003). En effet, le
remplacement de la Tyr174 par une phénylalanine bloque la fixation du C3a natif.
Cependant, l’utilisation de peptides analogues au C3a montre que l’activité du
récepteur ne semble pas être affectée par ce changement d’acide aminé. Ces résultats
suggèrent que la Tyr174 est un élément du site de fixation du C3a sur son récepteur, et
montrent l’existence d’autres sites impliqués dans le fonctionnement du récepteur et
la transduction du signal.

42
 Après la fixation de son ligand, les sérines et thréonines (Ser/Thr) de la partie C-
terminale du récepteur subissent de multiples phosphorylations (Langkabel et al.,
1999), médiées par des kinases couplées aux RCPG appelées GRK (G protein-coupled
kinases). Ces phosphorylations ouvrent la voie de la désensibilisation du récepteur,
permettant une diminution de son activité et favorisant son internalisation. La
mutation des 10 derniers résidus Ser/Thr en alanine, notamment les Ser 459, 465 et
470, ainsi que les Thr 463 et 466, perturbe la phosphorylation par les GRK de ces
résidus, et empêche donc l’internalisation du récepteur (Gupta et al., 2012;
Settmacher et al., 2003).

2. Site de fixation du fragment C3a

La localisation du site de fixation du C3a a fait l’objet de bons nombres d’études

et soulève encore beaucoup de questions. En effet, il semblerait que la poche de
liaison du C3a soit composée de plusieurs sites. Les parties extracellulaires des RCPG
sont connues pour contenir le site d’interaction avec le ligand, et le C3aR ne semble
pas y faire exception.

L’utilisation de récepteurs chimères, où des échanges de séquences de chaque

partie du récepteur (parties N- et C-terminales, domaines transmembranaires et
boucles extracellulaires), a permis de déterminer que la grande boucle extracellulaire
ECL2 est un élément important de la fixation du C3a (Crass et al., 1999). Même si 65
% de cette structure ne semble pas impliqué dans l’ancrage du peptide, des
mutagenèses d’acides aspartiques dans les régions N- et C-terminales de la boucle
ECL2 (162-183 et 309-332 respectivement) ont montré le rôle primordial de ces résidus
acides dans l’ancrage du cœur basique du peptide C3a (Chao et al., 1999).

Comme discuté précédemment, l’étude portant sur la sulfatation des tyrosines

(174, 184, 188, 317 et 318) de la boucle extracellulaire ECL2, et notamment la Tyr 174,
montre des sites essentiels pour l’ancrage du peptide C3a sur son récepteur (Gao et

43
al., 2003). Et c’est sans compter certains résidus (arginine (Arg) 161, Arg 340, Acide
aspartique 417, Histidine 81 et Lysine 96) des domaines transmembranaires du
récepteur qui posséderaient également un rôle dans cette fixation (Sun et al., 1999).

Ainsi, l’ensemble de ces études montrent que la boucle ECL2 possède un rôle
incontournable dans la fixation du C3a, où un cluster extracellulaire d’acides aminés
accueille le fragment C3a.

3. Signalisation

La nature propre du récepteur au C3a indique que la transduction du signal

s’effectue par l’activation de protéines G associées à la partie intracellulaire du
récepteur. D’une manière générale, la signalisation intracellulaire du C3aR est médiée
par l’activation des protéines G hétérotrimériques et la phosphorylation de la PI3K,
PKC, Akt, et des mitogen-activated protein kinases (MAPK).

Les protéines Gai, dites sensibles à la toxine pertussique, sont mobilisées

notamment dans les neutrophiles après fixation du C3a sur le récepteur. Cette
interaction provoque un afflux de calcium dans les cellules (Norgauer et al., 1993), ce
qui est également le cas pour les éosinophiles et les cellules microgliales (Elsner et al.,
1994a; Möller et al., 1997). Les protéines G dites insensibles à la toxine pertussique
sont également mobilisées après une interaction fonctionnelle entre le C3a et son
récepteur. En effet, les protéines Ga16, tout comme les protéines Ga12/Ga13 dans
les cellules endothéliales, sont impliquées dans la transduction du signal du C3aR
(Crass et al., 1996; Schraufstatter et al., 2002). Les évènements sous-jacents liés à
l’activation des protéines G font intervenir l’activation d’autres protéines telles que la
protéine kinase C, les mitogen activated protein (MAP) kinase Erk1 et Erk2 ou encore
l’axe phosphoinositide 3-kinase (PI3K) / Akt permettant par exemple la production de
cytokines, ou l’augmentation du calcium intracellulaire (Langkabel et al., 1999; Sayah
et al., 2003; Venkatesha et al., 2005).

44
 Outre son activation, le C3aR subit également une désensibilisation qui est
médiée par les b-arrestines. Ces molécules sont des adaptateurs protéiques qui ont un
rôle essentiel dans la désensibilisation des RCPG, permettant ainsi son internalisation
(Jalink and Moolenaar, 2010; Lohse et al., 1990; Wilden et al., 1986). La
désensibilisation du C3aR a été explorée dans les mastocytes notamment. Après
mutation des sites de phosphorylations sur la partie C-terminale intracellulaire du
C3aR, la fixation des b-arrestines était réduite voire complètement perdue, et
l’internalisation bloquée (Gupta et al., 2012). De même, le silencing de la b-arrestine 2
empêche l’internalisation du C3aR (Vibhuti et al., 2011). Ces résultats montrent que la
désensibilisation du C3aR implique la phosphorylation de la partie C-terminale du
C3aR, permettant la fixation des b-arrestines et donc son internalisation.

4. Expression

Au niveau génique, le récepteur au C3a humain est codé par une séquence sur le
bras court du chromosome 12 en position 13.2-3 (12p13.2-3) (Paral et al., 1998).
L’expression du gène C3ar semble être conditionnée par la fixation synergique des
facteurs de transcription c-Jun/c-Fos (AP-1) et Ets-1 sur le promoteur du gène dans les
monocytes humains, sur la portion nucléotidique - 18 à - 285 en amont du gène
(Schaefer et al., 2005).

Au niveau tissulaire, le C3aR est exprimé par de nombreux types cellulaires dans
différents tissus, tant par les cellules myéloïdes que par les cellules non-myéloïdes
comme indiqué dans le Tableau 1. L’expression du C3aR par les cellules myéloïdes
révèle encore une fois l’importance de l’axe C3a/C3aR dans les réponses
inflammatoires. De plus, son expression par des cellules de types « souches » comme
les cellules souches mésenchymateuses et neurales, montrent un rôle important de
l’axe C3a/C3aR pendant la formation et/ou la régénération d’un tissu. Les diverses
expressions du C3aR, par des tissus qui ont ou non la même origine embryologique,
démontrent que ce récepteur joue un rôle primordial dans divers processus
biologiques au sein d’un organisme humain.

45
 Cellules exprimant le Fonction du C3aR Bibliographie
C3aR
Neutrophiles Métabolisme oxydatif ; (Elsner et al., 1994b;
Rétention dans la moëlle osseuse Klos et al., 1992; Wu
et al., 2013)
Eosinophiles Chimiotactisme (Daffern et al., 1995;
DiScipio et al., 1999)
Monocytes/Macrophages Chimiotactisme ; Production de (Pan, 1998; Zwirner et
cytokines et chimiokines al., 1997, 1998)
Mastocytes Sécrétion de médiateurs (Ali et al., 2000;
inflammatoires ; Chimiotactisme Hartmann et al., 1997;
Johnson et al., 1975;
Nilsson et al., 1996)
Ostéoblastes Chimiotactisme, accélération de (Billiard et al., 2003;
l’ostéogénèse, et amélioration Ehrnthaller et al.,
de la cicatrisation osseuse in vivo 2013; Ignatius et al.,
2011a; Matsuoka et
al., 2014)
Chondrocytes Différenciation ostéogénique (Andrades et al.,
1996)
Cellules musculaires lisses Augmentation de la sécrétion de (Drouin et al., 2001;
médiateurs inflammatoires par Thangam et al., 2005)
les mastocytes
Cellules endothéliales Activation transitoire de Erk et (Monsinjon et al.,
Rho ; Production de cytokines 2003; Schraufstatter
et al., 2002)
Hépatocytes Protection contre l’apoptose ; (Markiewski et al.,
Régénération hépatique in vivo 2004; Strey et al.,
2003)
Cellules épithéliales Production de chimiokines ; (Braun et al., 2004;
rénales Transition épithélio- Thurman et al., 2007;
mésenchymateuse Wan et al., 2013)
Neurones Protection contre la mort (Bénard et al., 2004)
cellulaire
Cellules souches Chimiotactisme ; Protection (Moll et al., 2011;
mésenchymateuses contre l’apoptose ; Production Schraufstatter et al.,
(MSC) de facteurs angiogéniques 2009)
Cellules souches neurales Augmentation de la (Rahpeymai et al.,
(NSC) neurogenèse ; Augmentation du 2006)
chimiotactisme et de la
différenciation
Tableau 1. Types cellulaires exprimant le C3aR (adapté de Schraufstatter et al., 2015).

46
 C. L’axe C3a/C3aR dans le contexte de la régénération tissulaire

La large distribution du C3aR à travers différents tissus, d’origines

embryologiques différentes parfois, suggère que le fragment C3a a la possibilité d’agir
efficacement au niveau local et systémique par le biais de son récepteur.

Le fragment C3a, connu pour son rôle de médiateur pro-inflammatoire, mais

aussi pour son implication relativement récente dans les processus anti-inflammatoire,
participe activement à la régénération tissulaire, comme le fragment C5a. Plusieurs
études ont notamment révélé la capacité du C3a et du C5a à stimuler de manière
synergique ou non une pléiade de cellules souches ou progénitrices, et plus
précisément à induire leur migration sur des sites lésionnels, leur prolifération et leur
différenciation.

Les cellules souches ou progénitrices qui dérivent du mésoderme de l’embryon

apparaissent comme des cibles pertinentes sur lesquelles le C3a et le C5a peuvent agir.
Les études portant sur la régénération hépatique ont clairement mis en évidence le
rôle des anaphylatoxines dans ce processus. Après une agression toxique induite dans
le foie de souris déficientes en C3 et C5 causant des dommages tissulaires importants,
l’injection intra-péritonéale de C3a et C5a a permis de stimuler les étapes précoces de
la régénération hépatique, et donc améliorer la survie des souris (Strey et al., 2003).
Dans le contexte de la régénération osseuse, le fragment C5a est capable d’induire la
migration des ostéoblastes, dans un modèle de fracture in vitro (Ignatius et al., 2011b).
De plus, les fragments bioactifs C3a et C5a sont requis pour promouvoir la
régénération osseuse dans un contexte inflammatoire. En effet, il a été montré que la
régénération est dépendante de la sécrétion de facteurs pro-inflammatoires IL-6 et IL-
8 par les ostéoblastes et la formation d’ostéoclastes. Cette production de cytokines est
significativement augmentée par une stimulation à l’IL-1b. Ce contexte pro-
inflammatoire créé favorise l’interaction ostéoclaste/ostéoblaste nécessaire pour la
reconstruction du tissu osseux (Ignatius et al., 2011a).

47
 D’autres tissus sont concernés par l’implication du facteur C3a dans le
recrutement de cellules souches. Chez l’embryon de poulet, le fragment C3a a la
capacité d’induire la régénération de la rétine. Haynes et collaborateurs ont souligné le
rôle du C3a dans le recrutement des cellules souches/progénitrices résidentes de l’œil
permettant la régénération complète de la rétine dans un contexte inflammatoire.
Cette stimulation des cellules souches/progénitrices de l’œil par le C3a est dépendante
de l’activation de la voie STAT3 (Haynes et al., 2013). Les cellules souches
mésenchymatteuses (CSM), d’origine mésodermique, sont également mobilisées par le
fragment C3a. Des études sur la migration cellulaire collective ont permis de
démontrer qu’un gradient de C3a était en mesure de co-attirer des clusters cohésifs de
CSM, pendant la formation de la crête neurale (Carmona-Fontaine et al., 2011).

Ces précédentes études viennent confirmer le rôle du C3a dans le recrutement

de cellules souches mésenchymateuses. Schraufstatter et collaborateurs ont
développé leur recherche sur les liens étroits entre les CSM et les facteurs du
Compléments (Schraufstatter et al., 2015). Ils ont notamment mis en évidence que les
CSM humaines sont attirées par des gradients de C3a, et de C5a, sur les sites
lésionnels, où la mobilisation et le recrutement de CSM est nécessaire pour la
réparation/régénération tissulaire. De plus, la migration des CSM induite par les
facteurs C3a et C5a a provoqué une phosphorylation prolongée des protéines
intracellulaires ERK1/2 et Akt, ainsi qu’une translocation du C3aR dans le noyau
(Schraufstatter et al., 2009).

L’ensemble de ces études souligne combien l’axe C3a/C3aR est un point

important du recrutement de cellules souches d’origine mésenchymateuse
notamment, nécessaire pour la régénération tissulaire. Comme décrit précédemment,
la pléiotropie de l’expression du C3aR au sein des tissus humains ne peut pas laisser
indifférent lorsque l’on s’intéresse au domaine de la régénération. C’est pourquoi, les
études concernant la mobilisation et le recrutement des CSM renforcent l’idée
suivante : un tissu ayant un pool de cellules souches exprimant le C3aR, est un tissu qui
possède un réel potentiel de régénération à ne pas sous-estimer, mais bien à explorer.

48
 Deuxième partie : Régénération pulpo-dentinaire

I. Origine et structure du complexe pulpo-dentinaire

La pulpe dentaire est un tissu d’origine ecto-mésenchymateuse de la crête

neurale. C’est le tissu conjonctif qui occupe la portion centrale de la dent, au niveau de
la couronne, ainsi que dans les racines (pulpe camérale et pulpe radiculaire
respectivement). La pulpe dentaire est caractérisée par la présence d’un important
réseau vasculaire et nerveux, au cœur de ce tissu. Les principales cellules qui
composent la pulpe dentaire sont les fibroblastes pulpaires. Ces cellules sont
étroitement organisées en réseaux, connectées entre elles par des jonctions
intercellulaires (interaction cellule-cellule), et également connectées à la matrice
extracellulaire (MEC) qu’elles sécrètent (interaction cellule-matrice). Cette MEC est
composée de collagène de type I, III, V et VI, de fibronectine et de protéoglycanes
(Goldberg and Smith, 2004).

La pulpe dentaire est aussi composée d’odontoblastes sécréteurs de dentine,

sous-jacente à l’émail. Des fibres nerveuses (fibres mylénisées A-d et A-b, amyléniques
C) sont présentes et sont responsables notamment de la sensibilité pulpaire et de la
motricité vasculaire (Byers, 1984). Les cellules endothéliales assurent un apport
nutritionnel et en oxygène aux autres cellules pulpaires. Les cellules
immunocompétentes sont essentielles pour agir lors d’une inflammation du tissu
pulpaire comme les macrophages, les cellules dendritiques, les lymphocytes B et T
(CD4 et CD8). Egalement, des cellules souches pulpaires péri-vasculaires résident dans
la pulpe (Jontell et al., 1998; Nanci, 2013).

Au cours du développement de la pulpe dentaire, des cellules vont pouvoir se

différencier en odontoblastes matures qui vont pouvoir sécréter une structure
minérale tubulaire et une trame organique, et former ainsi la dentine. C’est une
structure à l’interface de la pulpe et de l’émail au niveau coronaire, et à l’interface de
la pulpe et du cément au niveau radiculaire (Figure 11A). La couche d’odontoblastes

49
est étroitement intriquée dans la dentine, car ceux-ci ont leurs prolongements qui
parcourent les tubuli dentinaires (Figure 11C). La dentine est composée à 70 % de
structures inorganiques, 20 % de molécules organiques et de 10 % d’eau. La partie
inorganique est composée de cristaux d’hydroxyapatite. La partie organique est
composée en majorité par des molécules de collagène (type 1 principalement, avec
une faible quantité de type III et V), mais aussi par des protéines non collagéniques
telles que : DPP (Dentin Phosphoprotein/Phosphophoryn), DSP (Dentin SialoProtein),
DGP (Dentin GlycoProtein), Ostéonectine, Ostéocalcine, Ostéopontine, BSP (Bone
SialoProtein) (Nanci, 2013).

A B

C
Dentine

Complexe
Odontoblastes pulpo-
dentinaire

Pulpe

Figure 11. Illustration des différents tissus dentaires (d’après Nanci, 2013).
Coupe transversale (A) et radiographie aux rayons X (B) d’une dent entière humaine. (C)
Microscopie optique d’une coupe histologique de dent humaine (coloration
Hématoxyline/Eosine), focalisée sur le complexe pulpo-dentinaire.

50
 Outre la présence de ces protéines, la dentine renferme également de
nombreuses molécules biologiquement actives telles que les facteurs de croissances,
de type Transforming Growth Factor (TGF)-b1 et 3, ou même le Bone Morphogenic
Protein (BMP)-7. Ces facteurs de croissance sont impliqués dans la régénération
pulpaire, la différenciation des odontoblastes et l’angiogenèse (Cassidy et al., 1997;
Finkelman et al., 1990; Vaahtokari et al., 1991). D’autres facteurs emprisonnés dans la
dentine ont été identifiés comme l’Insuline-like Growth Factor (IGF)-1, le Skeletal
Growth Factor (SGF/IGF)-II, le Platelet-Derived Growth Factor (PDGF)-AB, le basic
Fibroblast Growth Factor (FGF)-2 et Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)
(Finkelman et al., 1990; Roberts-Clark and Smith, 2000).

De par leur proximité histologique et leur lien étroit sur le plan biologique, la
pulpe et la dentine sont plus communément regroupées sous le terme de complexe
pulpo-dentinaire (Figure 11C). Lorsque l’intégrité physique et biologique de ce
complexe est compromise, par une lésion carieuse ou traumatique, ou encore par une
procédure de restauration clinique, les mécanismes de régénération pulpo-dentinaire
se mettent en place. Cette régénération a pour but de remplacer le plus rapidement
possible la couche d’odontoblastes sécréteurs de dentine, faisant appel à une nouvelle
population de cellules appelées cellules odontoblast-like.

II. La régénération du complexe pulpo-dentinaire

A. Circonstance pathologique qui induit la régénération pulpo-dentinaire

Le complexe pulpo-dentinaire peut être l’objet de diverses pathologies pouvant

induire sa destruction partielle ou totale, comme un traumatisme physique, une
procédure de restauration réalisée par le clinicien, ou encore par la pathologie buccale
la plus courante chez l’homme : la pathologie carieuse. Selon son état d’avancement,
la lésion carieuse peut être réversible, par l’induction des mécanismes de régénération
pulpo-dentinaire. La pathologie carieuse est liée à une infiltration de bactéries
cariogènes, à Gram-positif le plus souvent, au sein des structures dentaires. Les

51
bactéries cariogènes ont la capacité de sécréter des protéases et des molécules acides
qui vont dissoudre l’émail puis la partie minérale de la dentine. De cette manière, les
bactéries vont pouvoir aisément infiltrer la dent à travers les tubuli dentinaires, grâce à
l’expression de protéines d’adhésion au collagène. Lorsque l’infiltrat bactérien atteint
la pulpe, celui-ci peut aboutir à des dommages tissulaires profonds, jusqu’à la nécrose
complète de la pulpe (Love and Jenkinson, 2002).

C’est pourquoi on peut distinguer deux types de lésions qui font suite à une
pathologie carieuse. Dans certains cas, les lésions carieuses sont faibles voire
modérées (Figure 12A). La dentine est une structure vulnérable face à des bactéries
cariogènes qui sécrètent des acides à haut pouvoir de dissolution. Ici, les bactéries
n’ont pas atteint la pulpe, mais l’acidification qu’elles engendrent dans la dentine
provoque une réactivation et une augmentation de l’activité sécrétoire des
odontoblastes. De cette manière, les odontoblastes vont sécréter une dentine appelée
réactionnelle ou tertiaire, à une vitesse plus importante que celle de la formation de la
dentine primaire ou secondaire (Smith et al., 1995a). Cette sécrétion de dentine
réactionnelle par les odontoblastes est soutenue par la présence locale de TGF-b1
(Kalyva et al., 2010; Sloan and Smith, 1999). Cette synthèse de la dentine permet de
ralentir la progression des bactéries cariogènes et d’isoler le tissu pulpaire des toxines
bactériennes.

A B
d
d

Figure 12. Illustration d'une lésion carieuse modérée et profonde.

Coloration hématoxyline/éosine de coupes de dents cariées ayant soit une lésion carieuse
modérée (A), soit une lésion carieuse profonde (B). d, dentine ; p, pulpe. Tête de flèche :
dentine réactionnelle. Echelles : 200 µm.

52
 Cependant les effets de cette imperméabilisation sont temporaires, car
l’infiltration bactérienne est capable de gagner du terrain. Dans ce cas, la lésion
carieuse devient sévère et très profonde (Figure 12B). Les bactéries sont à l’origine de
la destruction du complexe pulpo-dentinaire. Les odontoblastes détruits ne sont plus
en mesure de protéger la pulpe par la sécrétion de dentine réactionnelle. Ce qui
expose la pulpe à l’environnement buccal très hostile, en raison de sa population
microbienne très variée. Lors d’une infiltration bactérienne profonde, les dommages
cellulaires concernent également les fibroblastes pulpaires, les réseaux vasculaires et
nerveux (Goldberg et al., 2008; Smith et al., 1995b; Tziafas, 1995).

C’est au cours de ces lésions que les mécanismes de régénération pulpo-

dentinaire se mettent en place. Les odontoblastes détruits peuvent être remplacés en
regard du site de la lésion, par une nouvelle génération d’odontoblastes appelés les
odontoblast-like cells. Ces cellules sont capables de sécréter une dentine qui est
appelée dentine « réparatrice » permettant de protéger la pulpe de l’environnement
buccal. Le stade ultime de ce processus est la formation d’un pont dentinaire capable
de s’opposer à la diffusion des toxines bactériennes et à l’infiltration des bactéries
(Tziafas et al., 2000). Les odontoblastes-like cells sont issues de la différenciation des
cellules souches pulpaires qui ont été recrutées sur le site de la lésion (Shi and
Gronthos, 2003a; Téclès et al., 2005). Ce qui laisse penser que d’autres types
cellulaires peuvent être recrutés pour combler le tissu pulpaire manquant à la suite
d’une lésion carieuse, par exemple.

Les pertes cellulaires subies par une infiltration bactérienne massive déclenchent
une réponse inflammatoire locale sur le site de la lésion. Classiquement, cette
inflammation passe par 3 phases : vasculaire, cellulaire et de résolution. C’est au cours
de la phase de résolution que les mécanismes de régénération tissulaire s’organisent.
La régénération est dépendante de la mise en place d’une réponse inflammatoire.
Cependant si la réponse inflammatoire est trop forte, et ne parvient pas à s’équilibrer
pour s’orienter vers une phase de résolution, le tissu enflammé entre alors dans une
phase néfaste de nécrose.

53
 B. Mécanismes de la régénération pulpo-dentinaire

1. Présence de cellules souches pulpaires au niveau périvasculaire

L’identification d’un pool de cellules souches a eu un grand intérêt ces dernières

années pour comprendre comment la régénération tissulaire s’organise au sein de la
pulpe. Le tissu pulpaire est un tissu dit « spécialisé », qui peut être soumis à un
renouvellement cellulaire dans certaines conditions inflammatoires. Les cellules
souches pulpaires forment une population de cellules périvasculaires, capables de se
différencier in vitro en des cellules qui ont un phénotype odontoblastique, avec un
corps cellulaire polarisé et une accumulation de nodules minéralisés (About et al.,
2000a; Couble et al., 2000; Tsukamoto et al., 1992).

Les cellules souches ont été identifiées au sein de la pulpe humaine. Ce sont des
cellules mésenchymateuses multipotentes, c’est-à-dire capables de se différencier en
plusieurs types cellulaires issus du même feuillet embryonnaire. Suite à une division
asymétrique, ces cellules ont également la possibilité de s’auto-renouveler, assurant
un pool basal de cellules souches (Gronthos et al., 2000). Les cellules souches pulpaires
adultes ont un potentiel de différenciation important, tout de même inférieur à celui
des cellules souches embryonnaires pluripotentes. Les cellule souches pulpaires sont
capables de se différencier en adipocytes, en chondrocytes, en cellules neuronales et
en odontoblastes en présence de milieux de différenciation appropriés in vitro,
suggérant la nécessité de signaux permettant la différenciation des cellules souches en
cellules différenciées (d’Aquino et al., 2007; Gronthos et al., 2002; Huang et al., 2009;
Laino et al., 2005; Zhang et al., 2006)

L’état souche des cellules présentes en périphérie des vaisseaux dans la pulpe
est conditionné par un matériel génétique composé des facteurs de transcription tels
que OCT4, NANOG et Sox2. Ces facteurs de transcription identifiés comme des facteurs
de pluripotentialité garantissent un état indifférencié aux cellules souches. Des
marqueurs de surfaces spécifique des CSM sont exprimés par les cellules souches
pulpaires comme STRO-1, CD146, CD105, CD44, 3G5, CD29, Nestin ou encore Flk1

54
(About et al., 2000b; Huang et al., 2009; Shi and Gronthos, 2003b). Plusieurs études in
vivo ont confirmé la capacité des cellules souches pulpaires à se différencier en
odontoblastes sécréteur de dentine. Des expériences de transplantation d’un mélange
de cellules souches pulpaires STRO-1+ et d’hydoxyapatite/phosphate tricalcique
(HA/TCP) dans des souris immunodéprimées, ont montré une synthèse d’une structure
rappelant le complexe pulpo-dentinaire, avec des tubuli dentinaire similaires à ceux
observé in vivo (Batouli et al., 2003; Gronthos et al., 2000).

Le pool périvasculaire de cellules souches n’est pas l’unique lieu de la dent

pouvant contenir des cellules à fort potentiel de différenciation. Le ligament
parondontal (Bi et al., 2007; Seo et al., 2004) contient des cellules souches, mais aussi
la papille apicale (Rubio et al., 2005; Sonoyama et al., 2008), et même les follicules
entourant les germes dentaires (Morsczeck et al., 2005). Cependant, la localisation des
autres réservoirs de cellules souches semble incompatible avec la régénération des
odontoblastes sécréteurs de dentine. C’est pourquoi, dans le contexte de la
régénération pulpo-dentinaire, les cellules souches STRO-1+ périvasculaires
apparaissent comme la source principale impliquée dans la reformation du tissu.

2. Signaux permettant le recrutement des cellules souches pulpaires

Lors d’une lésion tissulaire importante dans un tissu conjonctif tel que la pulpe
dentaire, les mécanismes de régénération engendrent la mobilisation, la migration, la
prolifération et la différenciation cellulaire, mais aussi une réaction inflammatoire qui
permet la sécrétion de molécules par les cellules immunitaires et d’autres types
cellulaires. Ces signaux sont également importants pour l’étape précoce de la
régénération pulpo-dentinaire pour le recrutement des cellules souches, et leur
différenciation en odontoblast-like cells.

55
 a. Signaux séquestrés dans la dentine

Le tissu dentinaire représente un réservoir naturel de facteurs dits de

régénération, qui sont responsables du recrutement cellulaire et sont pour la plupart
des facteurs de croissance. Parmi ces facteurs, on retrouve le TGF-b1 connu pour
induire un processus de régénération pulpo-dentinaire (Cassidy et al., 1997; Smith et
al., 2001). Il induit la sécrétion des constituants de la matrice extracellulaire par les
cellules mésenchymateuses (Ignotz and Massagué, 1986). Le TGF-b1 n’est pas sécrété
sous une forme libre active, mais sous forme inactive lié à des protéines qui ont une
forte affinité pour les constituants matriciels de la dentine. Ainsi, le TGF-b1 peut être
séquestré dans la dentine. Cette présence dans la dentine permet au TGF-b1 d’être
libéré sous sa forme active lors de la dissolution de la dentine par les métabolites
acides des bactéries cariogènes. De ce fait, le TGF-b1 peut influencer les étapes
précoces de la régénération pulpo-dentinaire. Ce facteur est capable d’induire la
différenciation des cellules souches pulpaires en odontoblast-like cells et d’induire la
sécrétion de dentine tubulaire (Dobie et al., 2002).

Le FGF-2 (basic Fibroblast Growth Factor) est une protéine qui se lie également à la
matrice dentinaire. Une fois secrété le FGF-2 se lie aux héparanes sulfates et se
retrouve piégé dans la dentine, et peut être libéré par des héparanases ou la plasmine
du système de coagulation (Ornitz, 2000). Le FGF-2 possède un rôle de facteur pro-
angiogénique et de facteur de croissance pour les fibroblastes de tissus conjonctifs,
comme la pulpe dentaire (Gerwins et al., 2000; Mutsaers et al., 1997).

Ces facteurs de croissances ont été identifiés comme étant des facteurs
chimiotactiques, capables de mobiliser et d’induire la migration des cellules souches
pulpaires des niches périvasculaires sur le site lésionnel (Howard et al., 2010). L’étude
de l’encapsulation du TGF-b1 et FGF-2 a permis de démontrer que la libération
prolongée et contrôlée de ces deux facteurs induisait la migration des cellules souches
pulpaires STRO-1+ (TGF-b1), ainsi que la prolifération des fibroblastes pulpaires (FGF-

56
2) (Mathieu et al., 2013). Ces résultats soulignent l’importance des deux facteurs dans
les étapes précoces de la régénération pulpo-dentinaire.

Le VEGF est également présent dans la dentine. Il s’agit du facteur pro-

angiogénique par excellence, capable de promouvoir la prolifération et la migration
des cellules endothéliales (Roy et al., 2006). Lors d’une lésion carieuse, le taux
d’expression du VEGF est augmenté au niveau des cellules pulpaires. Cette
augmentation du VEGF sur le site carieux serait la conséquence d’une stimulation des
cellules pulpaires par les motifs à la surface des bactéries cariogènes (Botero et al.,
2003).

b. Signaux des cellules odontoblastiques et pulpaires

Il est intéressant de noter que la dentine n’est pas le seul réservoir de facteur de
croissance. En effet, les fibroblastes pulpaires, cellules de soutien et majoritaire de la
pulpe, sécrètent in vitro les facteurs FGF-2, VEGF et PDGF après une lésion
traumatique. De la même manière, les cellules endothéliales avoisinantes sécrètent les
facteurs VEGF et FGF-2, après une lésion traumatique (About, 2011; Tran-Hung et al.,
2008a). Ces sécrétions de facteurs de croissances et pro-angiogéniques constituent un
environnement local propice à la régénération pulpo-dentinaire.

Cependant, les premières cellules responsables de la régénération de la dentine

sont les odontoblastes. En effet, les odontoblastes représentent une première ligne de
défense lors d’une lésion carieuse. Ces cellules expriment les Toll-like Receptor (TLRs)
2 et 4 (Jiang et al., 2006; Veerayutthwilai et al., 2007), impliqués dans la
reconnaissance de motifs présents à la surface des bactéries Gram-positives et Gram-
négatives respectivement. Les TLRs appartiennent à la grande famille des Pattern
Recognition Receptors (PRRs) (Beutler, 2009; Kawai and Akira, 2010; Kumar et al.,
2011) qui s’activent lors d’un contact avec des structures moléculaires communes à
certains microorganismes, regroupés sous le nom de Pathogen-Associated Molecular
Patterns (PAMPs). Dans les lésions carieuses modérées, les TLRs 2 sont fortement

57
exprimés sur les odontoblastes situés en face de cette même lésion (Farges et al.,
2009).

Les TLRs activés vont ensuite via leurs voies de signalisation permettre la
sécrétion de molécules antimicrobiennes par les odontoblastesn (Figure 13). Ceux-ci
sont capables de synthétiser des beta-défensines (BD) et également de l’oxyde nitrique
(NO). La BD-2, inductible, possède un rôle antibactérien contre Streptococcus mutans
et également un rôle pro-inflammatoire en induisant la sécrétion d’IL-6 et d’IL-8 par les
odontoblast-like cells (Dommisch et al., 2007; Lee and Baek, 2012; Shiba et al., 2003;
Song et al., 2009). Le NO est quant à lui synthétisé par les NO Synthases (NOS). Il a été
montré que la NOS 2 inductible était rapidement exprimé dans les tissus pulpaires
enflammés (Di Nardo Di Maio et al., 2004; Kawanishi et al., 2004; Kawashima et al.,
2005; Korkmaz et al., 2011; Law et al., 1999). Le NO stimule la production de CXCL8 par
les cellules pulpaires in vitro, ce qui a été corrélé à une accumulation de cellules
immunitaires dans la pulpe, comme les neutrophiles et les macrophages (Kawanishi et
al., 2004; Kawashima et al., 2005; Min et al., 2008). Enfin, le NO a été démontré
comme un élément important dans l’inhibition de la croissance de S. mutans, ce qui
pourrait limiter la progression des bactéries cariogènes dans les canalicules dentinaires
(Farges et al., 2015a).

58
Figure 13. Rôles des odontoblastes dans la défense immunitaire de la pulpe dentaire (Farges
et al., 2015b).
L’infiltration des bactéries cariogènes dans les tubuli dentinaires déclenche la sécrétion de
molécules anti-bactériennes (points bleus) par les odontoblastes en regard de la lésion
carieuse. En même temps, cette stimulation bactérienne provoque la sécrétion de médiatieurs
pro-inflammatoires (points verts) par le versant pulpaire des cellules.

Pour résumer (Figure 13), les odontoblastes font office de barrière lors d’une
lésion carieuse modérée, se limitant à la dentine. De plus les odontoblates vont initier
la réparation de la dentine par la sécrétion d’une dentine réactionnelle. Si la lésion est
plus profonde, d’autres cellules et d’autres signaux vont prendre le relais.

La pulpe dentaire possède tout un réseau de cellules immunitaires qui lui permet
d’être dans un état permanent de vigilance, afin de prévenir une éventuelle invasion
de bactéries cariogènes. De récentes études ont permis de quantifier la proportion des
cellules immunocompétentes dans des pulpes dentaires humaines saines, estimée à
1% du nombre total, et tous les compartiments (innée et adpatatif) semblent être
représentés (Gaudin et al., 2015). Les pulpes dentaires saines possèdent des
Lymphocytes T (CD4, CD8, Tregs, NKT), des monocytes, des natural killer, des

59
lymphocytes B et des cellules dendritiques. Lors d’une inflammation aigüe, déclenchée
par une invasion de bactéries cariogènes, les proportions de ces cellules varient en
fonction du temps (Renard et al., 2016). Des modèles expérimentaux de pulpites
induites dans des pulpes d’incisives de rat par du lipopolysaccharide (LPS) ont permis
de démontrer que les pourcentages de granulocytes et de cellules dendritiques sont
augmentés après 9 heures d’exposition au LPS, jusqu’à revenir à leur niveau de base 3
jours après. Pas d’augmentation de cellules T, ni de cellules NK n’a été constatée, mais
une population mixte de cellules myèloïdes (R7/3- 3.2.3low) à différents stades de
différenciation a considérablement augmenté en nombre. La présence de ces
précurseurs de granulocytes, de macrophages et de cellules dendritiques indique la
mise en place d’une régulation de la réponse inflammatoire. De plus, les mêmes
auteurs ont montré l’augmentation d’expression de gènes tels que IL6, IL1-b, TNF-a,
CCL2, ou encore iNOS et même IL-10 par les leucocytes après stimulation au LPS. En
conclusion, l’initiation de la réponse inflammatoire ainsi que sa résolution sont mises
en place par les cellules immunocompétentes de la pulpe dentaire.

c. Signaux inflammatoires pulpaires : le système du Complément

Une régénération tissulaire implique un recrutement de cellules souches.

Lorsque l’intégrité du complexe pulpo-dentinaire est menacé par l’infiltration de
bactéries cariogènes, de nombreux remaniements cellulaires interviennent, synonyme
d’une étroite collaboration entre inflammation et régénération (Cooper et al., 2010).
Au cours de celle-ci, des médiateurs inflammatoires sont sécrétés permettant
d’orchestrer toutes les phases de l’inflammation, de l’initiation à sa résolution. La
réponse inflammatoire tissulaire est conditionnée par l’activation du système
immunitaire. Dans un premier temps, c’est le système immunitaire inné qui intervient
dans l’inflammation. Comme décrit dans la première partie de l’introduction, le
système du Complément est un acteur du système immunitaire innée, dont
l’implication dans les processus de régénération a clairement été établie par le
recrutement de cellules souches mésenchymateuses notamment. Dans le contexte de
la régénération pulpo-dentinaire, des travaux antérieurs de notre laboratoire ont

60
démontré que l’activation du Complément était requise pour induire le recrutement
des cellules souches pulpaires.

Ces travaux ont mis en lumière le rôle clef des cellules de soutien de la pulpe, à
savoir les fibroblastes pulpaires. Après stimulation avec des motifs bactériens comme
l’acide lipotéichoïque (LTA) et le lipopolysaccharide (LPS), ces travaux ont montré que
les fibroblastes pulpaires sont capables de synthétiser toutes les molécules du
Complément in vitro. La production de C5a a été quantifiée par test ELISA et confirmée
par immunofluorescence. Une augmentation significative de C5a après 20 minutes de
stimulation par LTA et LPS a été détectée. Par marquage immunofluorescent, la
présence de la molécule C5a, puissant médiateur de l’inflammation et facteur
chimiotactique, a été confirmée in vivo dans la pulpe et au niveau des odontoblastes.
De plus, le complexe d’attaque membranaire (molécules C5b-9) est également
synthétisé par les fibroblastes pulpaires après stimulation au LTA et LPS (Chmilewsky
et al., 2014a, 2015). Ces résultats ont, pour la première fois, montré que des cellules
non immunitaires de la pulpe, sont aptes à synthétiser des molécules du Complément
en réponse à des stimuli bactériens.

Un des aspects fondamentaux de la régénération, la migration cellulaire, a été

étudiée récemment. En utilisant des chambres de migrations microfluidiques in vitro,
les travaux de Chmilewsky et collaborateurs ont montré que les cellules souches
pulpaires, mais pas les fibroblastes, sont attirées par un gradient de C5a. Cette
migration est rendue possible par l’expression du C5aR par les cellules souches
dentaires uniquement. L’utilisation d’un antagoniste spécifique du C5aR, le W54011, a
permis de confirmer que la migration induite par le gradient de C5a était spécifique.
Ainsi, l’ensemble de ces résultats montrent que l’activation du système du
Complément permet d’induire la migration des cellules souches pulpaires par un
gradient de C5a (Chmilewsky et al., 2013). Les étapes précoces de la régénération
pulpo-dentinaire sont ainsi amorcées. Ces travaux suggèrent que lors d’une lésion
carieuse profonde, les bactéries cariogènes vont stimuler la production des molécules
du Complément par les fibroblastes pulpaires en regard de la lésion. Ceci aura pour
conséquence le recrutement des cellules souches pulpaires des niches périvasculaires

61
vers le site de la lésion, où ces cellules pourront se différencier en odontoblast-like
cells et proliférer, afin de remplacer les odontoblastes détruits par l’invasion
bactérienne.

Cependant, le système du Complément sécrète d’autres fragments bioactifs au

cours de la cascade. C’est le cas du fragment C3a qui, comme pour le C5a, est une
anaphylatoxine responsable de l’initiation et de la médiation de la réponse
inflammatoire. De plus, le C3a est également impliqué dans le recrutement des cellules
souches mésenchymateuses. C’est pourquoi, les travaux antérieurs soulèvent la
question suivante : le fragment C3a synthétisé par les fibroblastes pulpaires peut-il
induire le recrutement des cellules souches pulpaires et/ou des fibroblastes eux-
mêmes ?

Un autre point mérite notre attention. Lors d’une lésion carieuse profonde,
l’infiltrat bactérien provoque de nombreux dommages cellulaires. Or, la régénération
pulpo-dentinaire ne peut se faire en l’absence d’un contrôle de l’inflammation due à
l’infiltration des bactéries cariogènes. La cascade du Complément produit un complexe
terminal sous forme de pores lytiques (CAM) capable de s’insérer dans les membranes
de pathogènes, et d’induire leur lyse par choc osmotique. Comme souligné
précédemment, la majorité des bactéries cariogènes sont Gram-positives et le CAM
semble ne pas pouvoir s’insérer efficacement dans les parois épaisses de ces bactéries
pour induire leur lyse. Ce qui soulève une autre question : le complexe d’attaque
membranaire synthétisé par les fibroblastes pulpaires peut-il détruire les bactéries
cariogènes ?

62
MATERIELS ET METHODES

63
 I. Matériels

Tous les plastiques, les milieux, les additifs (pénicilline, streptomycine,

fungizone, L-glutamine, pyruvate de sodium, sérum de veau fœtal) et la trypsine,
utilisés pour la culture cellulaire, proviennent de chez Dominique Dutscher (Brumath,
France). L’anticorps dirigé contre le STRO-1, et les protéines recombinantes humaines
C3a et CD59 proviennent de chez R&D systems (Lille, France). L’anticorps dirigé contre
le C3aR utilisé en immunocytochimie provient de chez Santa Cruz Biotechnologie
(Heidelberg, Allemagne). Les anticorps dirigés contre le C3aR utilisé en
immunohistochimie, le marqueur FSP (spécifique des fibroblastes) et Streptococcus
mutans proviennent de chez Abcam (Paris, France). Tous les anticorps secondaires
proviennent de chez Life technologies (Saint-Aubin, Fance). Tous les produits
chimiques proviennent de chez Carlo-Erba (Val-de-Reuil, France). Les colorations
histologiques hématoxyline/éosine et de Gram proviennent de chez Sigma-Aldrich (St.
Louis, MO, USA)

II. Obtention de cellules pulpaires par culture d’explants

Les dents sont récupérées en bloc opératoire chez des adolescents nécessitants
une extraction des troisièmes molaires pour des raisons orthodontiques. Les dents
sont placées dans un milieu MEM (minimal essential medium) complet enrichi en
antibiotiques (Pénicilline 200 UI/ml, streptomycine 200 UI/ml, fungizone 100 µg/ml), L-
gutamine 2 mM et 10% SVF (sérum de veau fœtal). Les dents sont transportées du bloc
opératoire au laboratoire dans un délai de temps très court. Les pulpes dentaires sont
ensuite récupérées pour la culture d’explants tissulaire.

Pour cela, les dents sont manipulées dans des conditions d’asepsie optimales.
Les dents sont nettoyées et coupées à l’aide d’une fraise boule montée sur un contre-
angle rouge à très grande vitesse, sous irrigation de liquide physiologique stérile
(Figure 14). La découpe est réalisée au niveau du collet de la dent permettant de
séparer la couronne des racines. À l’aide d’une sonde dentaire et d’une précelle, la

64
pulpe dentaire est prélevée et immédiatement placées dans un milieu enrichi en
antibiotiques, comme décrit précédemment.

A B

C D

Figure 14 : Récupération des pulpes dentaires et culture d'explants.

Après nettoyage, les dents sont découpées (A), les pulpes récupérées (B) et coupées finement
(C). Les explants de pulpes sont ensuite recouverts de milieu de culture complet (D).

La culture d’explants de pulpe est réalisée sous hotte à flux laminaire. Les
pulpes sont émincées sous forme de très fins morceaux à l’aide de lames de scalpels.
Les fins morceaux de pulpes sont ensuite dispersés dans des boîtes de pétri. Les
explants sont ensuite cultivés dans un milieu de culture complet (MEM, 10% SVF,
Pénicilline 100 UI/ml, streptomycine 100 UI/ml, fungizone 100 µg/ml, L-gutamine
1mM) pendant 7 jours dans un incubateur humide à 37°C et 5% de C02. Durant cette
période, les cellules prolifèrent autour des explants de pulpes pour atteindre une très
forte densité. Au terme de cette période, les cellules pulpaires sont ensuite décollées
avec une solution de trypsine/EDTA 0,25% et placées dans des flasques T75 cm2 pour
promouvoir leur prolifération. Le décollement des cellules et l’ensemencement dans
de nouvelles flasques sont des procédures qui font partie d’un protocole de routine
pour permettre d’accroître le nombre de cellules. Chaque passage cellulaire est réalisé
en incubant les cellules avec la trypsine/EDTA pendant 5 minutes à 37°C. Ensuite, du
milieu complet est ajouté, et les cellules sont centrifugées à 1200 tours/minute

65
pendant 5 minutes. Puis, les culots cellulaires sont resuspendus dans un milieu
complet, et les cellules sont réparties équitablement dans des flasques T75.

III. Sélection cellulaire par tri magnétique

Les cellules souches dentaires représentent une faible proportion des

populations cellulaires présentes au sein de la pulpe. C’est pourquoi il est nécessaire
d’isoler ces cellules par un tri cellulaire. Les cellules pulpaires sont triées sur la base du
marqueur de cellules souches mésenchymateuses STRO-1 par une sélection positive à
l’aide de billes magnétiques, selon les instructions du fournisseur (Dynal, Oslo,
Norvège). Comme il s’agit d’une sélection dite indirecte, la procédure de tri cellulaire
comporte 3 étapes (Figure 15).

1 IgM de souris anti- Anticorps de rat 2

STRO-1 humain anti-IgM de souris
Trypsine/EDTA 0,25 %
+ Centrifugation

Cellules
Complexes pulpaires
d’anticorps 10x106 cellules/ml
dans tampon
Dynal

3
Cellules souches
STRO-1 positives

Cellules STRO-1
négatives (Fibroblastes)
Mélange Cellules/
Complexes

Figure 15. Principe du tri magnétique cellulaire.

1 La première étape du tri cellulaire consiste à former des complexes d’anticorps anti-STRO-1
et d’anticorps couplés à des billes magnétiques ; 2 Les cellules pulpaire sont décollées et
resuspendues à 10x106 cellules/ml dans du tampon Dynal ; 3 Les complexes d’anticorps et les
cellules sont ensuite mélangés, puis placés sur un support magnétique permettant de séparer
les cellules souches STRO-1 positives des fibroblastes STRO-1 négatifs.

66
 Dans un premier temps, les complexes anticorps anti-STRO-1/anticorps couplés à
des billes magnétiques sont réalisés. Pour cela, un mélange de 1 µg d’anticorps (IgM
de souris anti-STRO1 humain) pour 25 µl d’anticorps de rat anti-IgM de souris couplés
aux billes magnétiques (4x108 billes/ml) est réalisé à 4°C sous agitation pendant 30
minutes. Les complexes ainsi formés sont ensuite lavés 3 fois pour éliminer l’excédent
d’anticorps avec un tampon Dynal (PBS / 0,1% BSA / 2mM EDTA) pH=7,4. Les
complexes sont ensuite resuspendus dans le tampon Dynal (25µl de tampon pour 1 µg
d’IgM anti-STRO-1).

Ensuite, les cellules pulpaires sont préparées pour le tri. Les cellules pulpaires
sont décollées avec de la trypsine/EDTA 0,25% (1 ml/ 75 cm2) pendant 5 minutes à
37°C. Les cellules sont reprises dans du milieu complet et centrifugées à 1200
tours/minutes. Après centrifugation, les culots cellulaires sont repris dans un tampon
Dynal à 10x106/cellules par ml.

Les complexes et les cellules étant prêts, l’ultime étape du tri peut alors se faire.
Les complexes anticorps anti-STRO-1/ anticorps couplés aux billes et les cellules
pulpaires sont mélangés ensemble à une concentration de 10x106 cellules pour 25 µl
de complexe, à 4°C sous agitation pendant 30 minutes dans un tube de 15 ml. La
séparation des cellules souches pulpaires exprimant STRO-1 du reste des cellules
s’effectue à l’aide d’un support magnétique DynaMagTM 15. De cette manière, les
complexes d’anticorps fixés sur les cellules souches pulpaires vont piéger celles-ci au
contact du support magnétique ; les cellules souches vont se retrouver collées au paroi
du tube, formant ainsi la fraction positive. Les autres cellules, majoritairement des
fibroblastes, vont se retrouver dans le surnageant non-retenu (fraction négative). Ce
surnageant est récupéré et les cellules STRO-1 négatives sont remises en cultures dans
des flaques avec un milieu complet. Quant à elles, les cellules souches STRO-1 sont
lavées 4 fois avec un tampon Dynal puis sont remises en culture dans un milieu
complet.

67
 IV. Immunocytochimie

Des doubles marquages immunofluorescents sont réalisés in vitro sur cellules

pour permettre la visualisation en microscopie à fluorescence des protéines de
surface. Le tableau 2 ci-après récapitule les anticorps dirigés contre les cibles étudiées,
leurs anticorps secondaires, ainsi que leurs isotypes contrôles.

Anticorps primaires Anticorps Concentrations Contrôles

secondaires
Alexa fluor
Mouse anti-human 488 goat anti-mouse 5 µg/ml Omission de
STRO-1 IgM IgM l’anticorps primaire
Mouse anti-human 488 goat anti-mouse 5 µg/ml Omission de
FSP IgM IgM l’anticorps primaire
Rabbit anti-human 594 goat anti-rabbit 2 µg/ml Normal rabbit IgG
C3aR IgG IgG
Tableau 2. Conditions expérimentales des anticorps primaires et secondaires en
immunocytochimie.

Les cellules souches et les fibroblastes pulpaires sont ensemencés dans des
lames de culture en verre 8 puits, et placées dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2
pendant 24 heures. Les cellules sont ensuite lavées 3 fois au PBS, puis sont fixées 20
minutes avec de la PFA (paraformaldéhyde) à 4%, à une température de 4°C. Les sites
de fixation non-spécifiques sont par la suite saturés pendant 1 heure avec un tampon
PBS / BSA 0,5% ; puis après 3 lavages au PBS, l’anticorps primaire ou un isotype
contrôle est incubé 2 heures avec les cellules. Après lavages au PBS, les cellules sont
incubées avec 5 µg/ml d’anticorps secondaire pendant 45 minutes et 1 µg/ml de DAPI.
Pour effectuer les doubles marquages STRO-1 / C3aR et FSP / C3aR, les anticorps
primaires, puis secondaires sont incubés simultanément. Les lames de culture des
cellules sont lavées 3 fois au PBS et sont montées avec une lamelle à l’aide d’un liquide
de montage aqueux (Glycergel Mounting Medium, Dako, Carpinteria, USA).

68
 V. RT-PCR

Les ARNs totaux sont isolés à partir des cultures de cellules souches et de
fibroblastes pulpaires, en utilisant le mini Kit ARN PureLink (Life Technologies, Oslo,
Norvège). Chaque échantillon d’ARNs (2 µg) sont rétro-transcrits avec un système de
rétro-transcription AMV (Promega, Madison, WI, USA). Ensuite, l’amplification des
fragments de cDNA est effectuée grâce au kit Platinium PCR Supermix (Life
Technologies, Oslo, Norvège) en suivant les recommandations d’utilisation. Les PCR
sont effectuées avec les cycles suivants : 95 °C 5 minutes, 30 x (95°C 30 secondes, 55°C
30 secondes, 72°C 45 secondes), 72°C 12 minutes. Enfin, les produits PCR sont séparés
sur un gel d’agarose à 1%, et visualisés avec un E-gel Imager (Life technologies, Oslo,
Norvège). Les séquences des amorces sont listées dans le tableau 3 :

AMORCES SEQUENCES
C3aR-1 5’-CGCGAAATCTTCACTACAGACAACC-3’
C3aR-2 5’-TCACCTAGTGATCGTTATTGCCACGA-3’
OCT3/4-1 5’-CAGTGCCCGAAACCCACAC-3’
OCT3/4-2 5’-GGAGACCCAGCAGCCTCAAA-3’
KFL4-1 5’-GGGAGAAGACACTGCGTCAA-3’
KLF4-2 5’-TCCAGGTCCAGGAGATCGTT-3’
SOX2-1 5’-GTTGCCTGGCTTCTCTTTTG-3’
SOX2-2 5’-GCTGATTGGTCGCTAGAAAC-3’
NANOG-1 5’-AAGGTCCCGGTCAAGAAACAG-3’
NANOG-2 5’-CTTCTGCGTCACACCATTGC-3’
GAPDH-1 5’-GAAGGTGAAGTTCGGAGTC-3’
GAPDH-2 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’
Tableau 3. Listes des amorces utilisées en PCR.

69
 VI. Tests de prolifération

Les cellules souches et les fibroblastes pulpaires sont ensemencés séparément

dans des plaques 96 puits à une concentration de 9000 cellules/cm2 et sont incubés
toute une nuit dans un incubateur à 37°C 5% CO2, pour permettre l’adhésion et la
récupération cellulaire. Les cellules sont ensuite lavées 3 fois au PBS pour enlever
d’éventuelles traces de sérum, et sont stimulées avec 200 µl de MEM +/- des
concentrations croissantes de hrC3a (200, 1000 et 2000 ng/ml) pendant 3 et 7 jours, à
37°C et 5% de CO2.

Au terme des stimulations, les cellules sont lavées au PBS puis incubées 2 heures
(37 °C 5% de CO2) avec 100 µl de MEM contenant 5 mg/ml de MTT (3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide). Les succinates
déhydrogénases mitochnodirales des cellules vivantes vont alors réduire les anneaux
de tétrazolium en cristaux de formazan de couleur violette. Ces cristaux sont ensuite
dissous par l’ajout de 100 µl de DMSO pur dans chaque puits. De cette manière la
quantité relative de cellules vivantes est déterminée par l’analyse des densités
optiques à l’aide d’un spectrophotomètre (Metertech S960, Bioblock, Strasbourg,
France). Les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules vivantes par rapport à
la condition contrôle (cellules stimulées au MEM seul).

VII. Chimiotactisme en chambre micro-fluidique

La migration des cellules souches et fibroblastes pulpaires a été analysée dans

des chambres microfluidiques de chimiotactisme (IBIDI, Marne-la-Vallée, France).
L’architecture de ces chambres de migration permet l’établissement d’un gradient
stable et linéaire de facteurs chimiotactiques. Les chambres sont constituées d’un
canal central qui sépare deux réservoirs. Les facteurs chimiotactiques sont injectés
dans un des deux réservoirs, et les cellules d’intérêt sont ensemmencées dans le canal
central. Le gradient va pouvoir s’établir dans le canal central (Zengel et al., 2011).

70
 Les cellules souches ou les fibroblastes pulpaires sont ensemencés dans le canal
central à raison de 2,5.106 cellules/ml dans 6 µl de MEM contenant 6% de Matrigel (BD
Biosciences, Rungis, France). Les chambres de migration sont ensuite incubées 3
heures (37°C, 5% CO2) pour permettre l’adhésion cellulaire et la prise du gel. Puis, le
réservoir de droite est rempli avec 60 µl d’une solution de MEM contenant 200 ng/ml
de protéine recombinante humaine C3a. Le gradient va s’établir naturellement dans le
canal central. Les conditions contrôles vont correspondre au remplissage du réservoir
de droite par 60 µl de MEM seul. De plus, la spécificité de la migration sera contrôlée
par l’addition de 1 µM de l’antagoniste spécifique du C3a (SB290157) (Ames et al.,
2001) dans le canal central.

La migration des cellules est observée par l’utilisation de la microscopie optique

et d’une caméra (AxioCam Observer A1, Carl Zeiss). Les migrations sont observées avec
un objectif x5 par la prise de photos toutes les 15 minutes pendant 48 heures. Les 192
images, pour chaque condition répétée 3 fois, sont analysées par un pointage manuel
de 50 cellules avec l’aide du logiciel Image J (National Institutes of Health, Bethesda,
USA), plugin "Manual Tracking" (Fabrice Cordelières, Institut Curie, France). Les
coordonnées des cellules ainsi recueillies sont reportées dans des graphiques avec
axes des abscisses et des ordonnées. Ces graphiques sont obtenus à l’aide du logiciel
fournit par IBIDI, Chemotaxis and Migration Tool 2.0. Les profils de migrations des
cellules sont alors analysés statistiquement. Deux outils sont nécessaires pour réaliser
cela : les COM (Center of Mass) et les FMI (Forward Migration Index).

Les COM correspondent à la moyenne des positions spatiales des cellules. En

utilisant les coordonnée x et y, le déplacement du COM est calculé par la différence
entre les valeurs du centre de masse en position initiale (t = 0h) et en position finale (t
= 48h). Ce paramètre nous indique si il y a eu migration cellulaire ou non, et nous
informe sur la tendance de cette migration (vers le compartiment du C3a ou non). Des
valeurs de COM proche de 0 indiquent qu’aucune migration n’a eu lieu.

Les FMI sont calculés à partir des coordonnées x et y du point terminal de la

cellule, divisé par la distance totale de la migration de cette cellule à 48h. Le FMI est

71
calculé en moyenne, pour toutes les cellules, et correspond aux coordonées cellulaires
qui sont parallèles (FMIx) et perpendiculaire (FMIy). Un FMIx supérieur à un FMIy
suggère que les cellules migrent selon un gradient et non pas de manière aléatoire.

VIII. Coupes histologiques

A. Procédure initiale de préparation des coupes

A partir de dents saines, cariées, et de pulpes de dents saines, des coupes

histologiques sont réalisées, après inclusion en paraffine. Pour cela, les dents et pulpes
dentaires subissent, dans un premier temps, une étape de fixation au formol 4%
pendant 7 jours. La dent étant composée de structure minérale, la découpe de celle-ci
n’est rendue possible qu’après déminéralisation de l’émail et de la dentine. Ainsi, les
dents sont plongées dans une solution de déminéralisation rapide Decalcifier II (Leica
Microsystemes, Rueil-Malmaison, France) à base de formiate de sodium (acide
formique). Seules les pulpes dentaires ne subissent pas cette étape. Le degré de
déminéralisation des dents est contrôlé régulièrement par radiographie aux rayons X,
où la radio-clarté des tissus dentaires est le signe d’une déminéralisation efficace. Afin
d’éliminer toute trace d’acide, les dents sont rincées à l’eau courante pendant 24
heures.

Les tissus biologiques sont en majorité composés d’eau, et doivent donc être
déshydratés pour permettre une meilleure imprégnation des tissus par la paraffine.
Les dents et les pulpes sont déshydratées par des passages successifs dans des bains
d’alcool croissants à 70, 95 et 100%, par tranche de 24 heures chacun. Puis les dents et
les pulpes sont ensuite plongées dans un bain de xylène pour permettre la clarification
des structures restantes. Les dents et les pulpes sont ensuite immergées dans deux
bains de paraffine liquide chauffée à 60°C, de 24 heures chacun. La mise en bloc de
paraffine est réalisée dans des moules où les dents et les pulpes sont orientées pour
faciliter la lecture des coupes histologiques.

72
 Les échantillons sont ensuite découpés à l’aide d’un microtome (Minot Leitz
1512, Leica Microsystèmes, Rueil-Malmaison, France). Les rubans de coupes (4 ou 5
coupes) de 7 µm d’épaisseur sont déposés avec une goutte d’eau distillée sur des
lames en verre SuperfrostTM Ultra Plus (Dominique Dutscher, Brumath, France). Les
lames sont placées sur une plaque chauffante à 46°C pendant 20 minutes, puis 30
minutes dans une soufflerie à 60°C pour permettre l’évaporation de l’eau et donc un
séchage complet des lames. Les lames sont coupées en séries et référencées selon
l’ordre de la découpe du bloc.

B. Coloration des coupes histologiques

De par la nature hydrophile des colorants histologiques, les procédures de

coloration sur des coupes de tissu en paraffine nécessitent une étape de
réhydratation. Les coupes de dents et de pulpes sont d’abord déparaffinées par 3
bains de xylène de 5 minutes chacun. Puis les coupes sont réhydratées par des bains
de 5 minutes d’alcool décroissant à 100, 95 et 70%. Enfin, les coupes sont plongées
pendant 10 minutes dans un bain d’eau distillée.

Dans ce travail, la coloration de routine utilisée est l’hématoxyline/éosine. La

nature acide de l’éosine va permettre de distinguer le cytoplasme et la matrice
extracellulaire en rose dans un tissu. A contrario, l’hématoxyline est un colorant plutôt
basique qui permet d’identifier les noyaux cellulaires, en se fixant directement aux
acides nucléiques. Une coloration de Gram a été employée sur les coupes de dents
cariées. Cette coloration permet de différencier les bactéries à Gram positif (violet) des
bactéries à Gram négatif (rose). La différence entre les deux types de bactéries est
basée sur la composition en peptidoglycanes et le nombre de paroi. Les bactéries à
Gram positif ont une multitude de peptidoglycanes sur leur unique paroi, tandis que
les bactéries à Gram négatif possèdent plusieurs parois mais une faible quantité de
peptidoglycanes en surface. Les deux procédures de coloration sont décrites dans le
tableau 4.

73
Hématoxyline / Eosine Coloration de Gram
Hématoxyline de Harris, 2 minutes Crystal violet, 1 minute
Bain d’eau distillée, 5 minutes Lavage à l’eau distillée
Eosine, 2 minutes Solution iodée de Gram, 5 minutes
Bain d’eau distillée, 5 minutes Lavage à l’eau distillée
Alcool 70%, 5 minutes Différentiation dans l’alcool 100%
Alcool 95%, 5 minutes Lavage à l’eau distillée
Alcool 100%, 5 minutes Safranine, 30-60 secondes
Xylène, 2 minutes Lavage à l’eau distillée
Tartrazine, 5-10 secondes
Lavage alcool 100%
Xylène
Après coloration, les lames sont montées avec une lamelle à l’aide d’un liquide de
montage Lemonvitrex (Carlo Erba) et laissées 24 heures à température ambiante.
Tableau 4. Procédures de coloration à l'Hématoxyline/Eosine et de Gram.

IX. Immunohistochimie

Des immunomarquages sur coupe sont réalisés, après réhydratation des coupes
comme vu précédemment au paragraphe « Coloration des coupes histologiques ».

A. Procédure de démasquage antigénique ou « antigene retrieval »

Lors de la fixation des tissus biologiques, le formol modifie la conformation des

protéines. En effet, le formol entraine la formation de nouvelles liaisons entre les
protéines, créant un maillage au sein des tissus et permettant leur solidification.
Cependant, les épitopes deviennent moins accessibles pour les anticorps. Ainsi, une
étape de démasquage est nécessaire pour améliorer l’exposition des épitopes. Les
coupes de dents et de pulpes sont plongées dans une solution de 1 mM Tris/0.1 mM
acide éthylène-di-amino-tétra-acétique (EDTA)/0.5% Tween chauffée à 98°C pendant

74
10 minutes. Un retour à température ambiante est ensuite atteint en laissant les
coupes dans la solution de démasquage pendant 20 minutes.

B. Marquage immunofluorescent des coupes

Dans un premier temps, les sites de fixation non spécifique sont bloqués à l’aide
d’un tampon de saturation PBS / Caséine 0,25% ou PBS / BSA 0,5%, à température
ambiante, comme résumé dans le tableau suivant :

Cibles antigéniques Tampon Incubation

STRO-1 PBS / BSA 0,5% 1 heure
C3aR PBS / BSA 0,5% 1 heure
FSP PBS / BSA 0,5% 1 heure
C5b-9 PBS / Caséine 0,25% 15 minutes
S. mutans PBS / Caséine 0,25% 15 minutes
Tableau 5. Conditions de saturation des marquages immunofluorescents.

Ensuite, les coupes de dents et de pulpes sont incubées avec l’anticorps primaire,
dilué dans une solution de PBS / BSA 0,1%, comme décrit dans le tableau 6.

75
Cibles antigéniques Concentration (µg/ml) Incubation

STRO-1 5 2 heures, température

ambiante
C3aR 2 2 heures, température
ambiante
FSP 5 2 heures, température
ambiante
C5b-9 50 1 heure, température ambiante
S. Mutans 50 1 heure, température ambiante
Tableau 6. Conditions du marquage avec l'anticoprs primaire.

Pour les doubles marquages STRO-1 / C3aR ou FSP / C3aR, les anticorps
primaires sont incubés simultanément sur les coupes histologiques. Les coupes sont
lavées 3 fois au PBS et l’incubation avec les anticorps secondaires correspondants est
réalisée. Ceux-ci sont dilués dans une solution de PBS / BSA 0,1%, et sont déposés sur
les lames dans les conditions décrites au paragraphe « Immunocytochimie ». Dans
chaque dilution d’anticorps, 1µg/ml de DAPI est ajouté, et l’ensemble est incubé 45
minutes sur les coupes à température ambiante. Les lames sont montées et observées
par microscopie à fluorescence.

Concernant les doubles marquages C5b-9 et S. mutans, l’incubation avec

l’anticorps anti-C5b-9 humain suivi de l’anticorps secondaire fluorescent est réalisée
en premier. Après lavage au PBS, l’incubation avec l’anticorps anti-S. mutans avec son
anticorps secondaire et 1 µg/ml de DAPI est ensuite effectuée.

76
 X. Culture bactérienne et expérimentations

A. Culture de bactéries Gram-positives : Protocole global

Les souches de Streptococcus mutans (ATCC No. 31383) et Streptococcus sanguis

(ATCC No. BAA-1455) ont été ensemencées sur gélose en Agar de Columbia (COS).
Chaque souche a été isolée à partir d’une unique colonie et repiquée dans un milieu
liquide de Lennox Broth (LB).

B. Tests de sensibilité des bactéries au complexe d’attaque membranaire

1. Stimulation par l’acide lipotéichoïque (LTA) des fibrolastes pulpaires

humains

Les fibroblastes pulpaires humains sont cultivés dans des plaques 12 puits. Une
fois les fibroblastes pulpaires à confluence, les cellules sont lavées 3 fois avec du PBS.
La stimulation consiste à incuber les cellules avec 500 µl/puits d’un milieu dépourvu de
sérum, contenant ou non du LTA à 1µg/ml (InvivoGen, San Diego, USA), pendant 20
minutes. Les surnageants de stimulation sont ensuite collectés et sont utilisés pour la
culture avec les bactéries. Dans la suite de ce travail, les milieux seront nommés milieu
stimulé ou milieu non-stimulé au LTA. Les conditions expérimentales sont résumées
dans la figure 16.

77
 ± LTA
Milieux conditionnés
Fibroblastes pulpaires humains

Bactéries cariogènes

Détection CAM Viabilité Bactérienne Inhibition croissance bactérienne

sur bactéries Test MTT Test diffusion en Agar

Figure 16. Conditions expérimentales pour les cultures bactériennes et les fibroblastes
pulpaires.

2. Test de diffusion de puits en milieu Agar

La sensibilité de nos échantillons bactériens en présence des milieux

conditionnés (stimulés/non stimulés au LTA) a été évaluée en utilisant une méthode de
diffusion dans un milieu agar. Les souches S. mutans et S. sanguis sont cultivées dans
un milieu LB à une DO 0.5 selon les normes MacFarlane de turbidité des suspensions
bactériennes. Les bactéries sont ensuite ensemencées en monoculture à la surface de
boîtes en agar COS (100 mm de diamètre). L’excès de l’inoculum bactérien est aspiré,
et la surface est séchée en plaçant les boîtes dans un incubateur à 37°C pendant 15
minutes. Les boîtes inoculées avec les bactéries sont percées en surface de l’agar à
l’aide d’un embout pour former des puits de 6 mm de diamètre. Les puits sont ensuite
remplis avec 100µl de chaque milieu conditionné décrits en haut de ce paragraphe,
avec ou sans CD59 (6 µg/ml). Les boîtes sont ensuite incubées dans un incubateur à
37°C sur une nuit. Les résultats sont visualisés par la présence ou non d’une zone
d’inhibition de croissance autour des puits contenants un échantillon de milieu.

78
 3. Quantification de la viabilité bactérienne par test MTT

La viabilité des souches bactériennes a été déterminée en utilisant un test basé

sur leur assimilation du MTT (Tunney et al., 2004; Wang et al., 2010). Les bactéries
sont cultivées dans des plaques 96 puits à une concentration de 106 cellules/ml dans
25 µl de milieu LB. Les milieux conditionnés (stimulés ou non au LTA), en présence de 6
µg/ml de CD59 ou non, sont ajoutés (25µl), et les bactéries sont ainsi cultivées sur la
nuit à 37°C pour permettre la croissance bactérienne. Après lavage au PBS, les
bactéries sont incubées 2 heures à 37°C avec le 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyl tetrazolium bromide (5 mg/ml). Les surnageants sont ensuite enlevés et 100
µl de diméthyl sulfoxyde 100 % sont ajoutés dans chaque puit. L’absorbance de chaque
puit est ensuite mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaque à une longueur d’onde
de 550 nm. Les résultats sont exprimés en pourcentage d’absorbance mesurée pour
les bactéries traitées versus les bactéries contrôles non-traitées

C. Détection du CAM

1. Marquage immunofluorescent du CAM sur des co-cultures de bactéries

et fibroblastes pulpaires

Les fibroblastes pulpaires sont cultivés dans des chambres de cultures 8 puits en
verre jusqu’à atteindre 50% de confluence. Les cellules sont lavées avec du PBS, et
cultivées avec 106 bactéries par millilitre, dans un milieu MEM sans sérum, pendant 0
ou 30 minutes à 37 °C. Les cellules et les bactéries sont ensuite fixées avec de la PFA à
4% pendant 20 minutes à 4°C. Les sites de fixation non spécifiques sont par la suite
bloqués avec un tampon PBS/BSA 1% pendant 45 minutes à température ambiante.
Les cellules et les bactéries sont co-incubées pendant 1 heure avec une IgG de lapin
anti-CAM humain (5µg/ml) et une IgM de souris anti-FSP humain (2,5µg/ml) ou leurs
isotypes contrôles. Enfin, après lavages, les cellules et bactéries sont incubées pendant
45 minutes avec des IgG de chèvre anti-IgG de lapin couplées à l’Alexa Fluor 594 (2
µg/ml) ; et des IgM de chèvre anti-IgM de souris couplées à l’Alexa Fluor 488 (2 µg/ml)

79
et avec 1 µg/ml DAPI. Les lames sont ensuite montées et observées par microscopie à
fluorescence.

2. Détection enzymatique du CAM

Les bactéries sont cultivées dans des plaques 96 puits dans 25 µl d’un milieu LB à
une concentration de 106 cellules /ml. Puis sont ajoutés à ce milieu, 25 µl de milieux
stimulés ou non au LTA, en présence ou non d’inhibiteur de la formation du CAM, le
CD59 (6 µg/ml). Après 30 minutes d’incubation à 37 °C, les bactéries sont lavées avec
du PBS et sont fixées avec de la PFA à 4%, pendant 30 minutes à 4°C. A température
ambiante, les sites de fixations non-spécifiques sont ensuite bloqués avec du PBS/BSA
1% pendant 45 minutes. Puis, les bactéries sont co-incubées pendant 1 heure avec une
IgG de lapin anti-CAM humain (50 µg/ml). Après lavage, les bactéries sont incubées
avec une anti-IgG de lapin biotinylée (2 µg/ml) pendant 2 heures. Après lavage, la
visualisation de la réaction s’effectue par l’ajout de la peroxydase de Raifort (HRP)
couplée à la streptavidine (20 minutes) et de son substrat le TMB (20 minutes). Enfin,
les densités optiques sont mesurées avec un lecteur de micro-plaque (∑960 ;
Metertech, Taipei, Taïwan)

XI. Statistiques

La répétition au moins 3 fois des expériences a permis d’assurer la

reproductibilité des résultats présentés. De cette manière, la significativité des
données a pu être analysée (MiniTab 12.0). Après un test de Shapiro-Wilk, les
données recueillies ont une distribution qui suit la loi normale. De plus, le test
d’homoscédasticité de Bartlett montre que les variances entre les données sont
égales. C’est pourquoi les échantillons ont été comparés avec un t-Test de Student.
Une valeur de p < 0,05 est considérée statistiquement significative.

80
RESULTATS

81
Première partie : Etude sur le fragment C3a et la régénération pulpo-
dentinaire

I. Expression in vivo du Récepteur au C3a (C3aR) par les cellules de pulpe

dentaire humaine.

La première étape de mon travail de thèse a été de caractériser in vivo

l’expression du récepteur au C3a au sein de la pulpe dentaire. Pour cela, nous avons
réalisé des immunomarquages sur des coupes de pulpes en utilisant des anticorps anti-
C3aR, anti-FSP (marqueur des fibroblastes) et anti-STRO-1 (marqueur des cellules
souches pulpaires). Les zones choisies pour l’observation en microscopie à
fluorescence sont représentées par les encadrés bleus et verts, correspondants à deux
zones distinctes comme montré sur la coupe de pulpe colorée en hématoxyline/éosine
(Figure 17A). Le récepteur au C3a est très largement exprimé par les cellules pulpaires
(Figure 17B à 17I). Les fibroblastes pulpaires, cellules majoritaires de la pulpe dentaire,
expriment le FSP (Figure 17B et 17H, vert) et le C3aR (rouge, 17E et 17H). De la même
manière, les cellules souches périvasculaires (Figure 17C, 17F, 17I) expriment le C3aR
(rouge) et le STRO-1 (tête de flèche, vert). Ces marquages sont spécifiques comme
l’indiquent les contrôles isotypiques négatifs (Figure 17D, 17G).

82
Figure 17. Le récepteur au C3a est très largement distribué dans la pulpe in vivo.
Coloration Hématoxyline/Eosine (A) et doubles marquages immunofluorescents sur coupes de
tissus pulpaires humains (B à I). Des images représentatives de coupes de pulpes sont choisies
pour les doubles marquages FSP (B, vert), C3aR (E, rouge) et leur superposition (H). De la
même manière, des images représentatives sont choisies pour les doubles marquages STRO-1
(C, vert), C3aR (F, rouge), et leur superposition (I). Les têtes de flèches indiquent la localisation
périvasculaire des cellules STRO-1 positives. Aucun marquage n’est observé dans les coupes
contrôles (D & G). Les noyaux sont colorés avec du DAPI (bleu). Echelles : A = 200 µm ; B-I = 20
µm.

83
 II. Caractérisation des cultures de fibroblastes et de cellules souches
pulpaires

Pour étudier l’expression du récepteur sur les fibroblastes et les cellules souches
pulpaires séparément, nous avons effectué un tri cellulaire à l’aide de billes
magnétiques pour isoler les deux populations. Le tri magnétique est réalisé en utilisant
des anticorps anti-STRO-1. Après le tri, les populations de cellules triées STRO-1-
positives et négatives sont cultivées en milieu complet. Les deux populations
cellulaires sont alors caractérisées in vitro (Figure 18 et 19). Après 4 jours de culture,
les cellules isolées STRO-1-positives s’organisent en colonies cellulaires (Figure 18Aa et
18Ab), appelées CFU (Colony Forming Unit). Nous avons caractérisé l’expression du
marqueur de cellules souches mésenchymateuses STRO-1 par marquage
immunofluorescent. Les cellules triées positivement expriment le marqueur STRO-1
(Figure 18Ac). Ce marquage est spécifique, comme l’indique notre contrôle négatif
(Figure 18Ad). Nous avons aussi caractérisé les cellules triées de la fraction négative.
Après 4 jours de culture, les cellules STRO-1-négatives possèdent un aspect
fibroblastiques (Figure 18Ba et 18Bc). Nous avons marqué ces cellules avec le
marqueur de fibroblastes FSP (Fibroblast Surface Protein). Toutes les cellules STRO-1-
négatives expriment le marquer FSP, suggérant ainsi que ces cellules sont des
fibroblastes (Figures 18Bc et 18Bd).

84
 A

a b
CFU CFU

c d

B
a b

c d

Figure 18. Obtention et caractérisation des cultures de cellules souches et fibroblastes

pulpaires humains.
(A) Les cellules souches pulpaires sont isolées à partir de tissu pulpaire humain par isolation
positive magnétique avec l’utilisation d’anticorps anti-STRO-1. (a, b) Images par contraste de
phases des cultures de fractions STRO-1-positives. Les cellules triées STRO-1-positives ont une
organisation caractéristique de CFU in vitro. L’efficacité du tri cellulaire a été vérifiée par un
marquage immunofluorescent. Toutes les cellules triées STRO-1-positives expriment le
marqueur STRO-1 (c, vert), comme le confirment le contrôle négatif (d). (B) Les cellules de la
fraction négative ont été cultivées (a, b) et caractérisées par marquage immunofluorescent.
Ces cellules expriment un marquage FSP intense (c, vert), par comparaison au contrôle négatif
(d). Ceci indique que les cellules STRO-1-négatives sont majoritairement fibroblastiques.
Echelles: 200 µm (Aa, Ba) ; 50 µm (Ab, Bb) ; 40 µm (Ac, Ad, Bc & Bd). Les noyaux sont marqués
au DAPI (bleu).

85
 Les résultats des immunomarquages ont été par la suite confirmés par l’analyse
de l’expression des ARNm de gènes de pluripotentialité (Figure 19). Les deux types
cellulaires ont des profils d’expression opposés d’ARNm de KFL4, NANOG, OCT3/4 et
SOX2. Les cellules souches pulpaires ayant la capacité d’être pluripotentes expriment
tous les ARNm des gènes cités précédemment (Figure 19A). Cependant, les
fibroblastes pulpaires, étant des cellules différenciées, n’expriment pas d’ARNm de
KFL4, NANOG, OCT3/4 et SOX2 (Figure 19B).

A Cellules Souches B
Fibroblastes Pulpaires
Pulpaires

Figure 19. Expression des ARNm de gènes de pluripotentialité des cellules souches et des
fibroblastes pulpaires.
(A) Les produits de RT-PCR (ARNm) obtenus à partir des cellules STRO-1-positives concernant
les gênes de pluripotentialité KFL4, NANOG, OCT3/4 et SOX2 confirment qu’elles sont des
cellules souches pulpaires. (B) De la même manière, les produits de RT-PCR obtenus à partir
des cellules STRO-1-négatives confirment qu’elles sont des fibroblastes. Les sondes du gêne
GAPDH sont utilisées comme contrôle d’expression interne.

Ces étapes préliminaires de tri cellulaire et de RT-PCR, nous permettent d’établir

et de travailler sur deux cultures de population cellulaires distinctes, les cellules
souches et les fibroblastes pulpaires, nécessaires pour la suite de l’étude.

86
 III. Les cellules souches et les fibroblastes pulpaires expriment le C3aR in
vitro

Nous avons confirmé l’expression de récepteur au C3a sur chacun des deux types
cellulaires. Un double marquage immunofluorescent STRO-1/C3aR et FSP/C3aR est
réalisé respectivement sur les cellules souches et les fibroblastes pulpaires (Figure 20).
Les cellules souches pulpaires, exprimant le marqueur STRO-1 (Figure 20a), expriment
le récepteur au C3a (Figures 20c et 20e). Les fibroblastes pulpaires, exprimant le
marqueur FSP (Figure 20b), montrent également une expression de C3aR (Figures 20d
et 20f). Les marquages immunofluorescents sur les cultures de cellules souches et de
fibroblastes pulpaires sont spécifiques comme l’indique l’absence de signal dans les
conditions contrôles (Figures 20g et 20h, respectivement).

87
 Cellules souches Fibroblastes
pulpaires pulpaires
a b

c d

e f

g h

Figure 20. Expressions du C3aR par les cultures de cellules souches et de fibroblastes
pulpaires.
Des doubles marquages immunofluorescents ont été réalisés sur les cellules souches et
fibroblastes pulpaires en culture. Les cellules souches pulpaires expriment le marqueur STRO-1
(a) ainsi que le C3aR (c), comme le confirme la superposition d’image (e) et le contrôle négatif
(g). De plus, les fibroblastes pulpaires expriment le marqueur FSP (b) et le C3aR (d), et
confirmé par la superposition d’image (f) et le contrôle négatif (h). Les noyaux sont colorés au
DAPI (bleu). Echelles : 40 µm (a, c, e, g) ; 20 µm (b, d, f, h).

88
 Nous avons ensuite confirmé ces résultats par l’analyse des niveaux d’expression
d’ARNm du C3aR dans chacun des deux types cellulaires, par RT-PCR. Ainsi, les cellules
souches et les fibroblastes pulpaires expriment le C3aR (Figure 21).

Cellules souches Fibroblastes

pulpaires pulpaires

C3aR
GAPDH

Figure 21. Analyse de l'expression de l'ARNm du C3aR dans les cellules souches et les
fibroblastes pulpaires.
Le niveau d’expression des ARNm du C3aR est analysé par RT-PCR dans les cultures de cellules
souches (gauche) et les fibroblastes pulpaires (droite). La GADPH est utilisée comme contrôle
interne du niveau d’expression des ARNm.

Les résultats observés in vivo sur coupe de pulpe humaines, et ceux observés in
vitro sur les deux populations de cellules soulignent leur cohérence, et par conséquent
l’expression commune du C3aR sur les cellules souches et les fibroblastes pulpaires.

IV. Le C3a induit la prolifération des cellules souches et de fibroblastes

pulpaires.

Les phénomènes de régénération tissulaire sont notamment caractérisés par une

prolifération cellulaire locale. Etant donné que les cellules pulpaires expriment le C3aR,
nous avons émis l’hypothèse que le C3a pourrait induire leur prolifération. Nous avons
ainsi incubé les deux types cellulaires avec 200, 1000 et 2000 ng/ml de protéine C3a
recombinante humaine (Figure 22). Après 3 jours d’incubation, nous avons quantifié la
prolifération cellulaire en utilisant un test MTT de viabilité cellulaire. Les résultats du

89
test MTT sont présentés en pourcentage du contrôle, qui est une condition où les
cellules sont incubées en absence de C3a.

A
Cellules Souches Pulpaires
150

Exprimée en % du contrôle
Prolifération Cellulaire
* *
100

50

C3a
0
200 1000 2000
ng/ml

B
Fibroblastes Pulpaires
150
*
Exprimée en % du contrôle
Prolifération Cellulaire

100

50

0
C3a
200 1000 2000
ng/ml

Figure 22. Le C3a induit la prolifération des cellules souches et des fibroblastes pulpaires.
Les cellules souches et les fibroblastes pulpaires sont incubés avec des concentrations
croissantes de C3a pendant 3 jours, avant que les tests MTT ne soient réalisés. Les cellules
souches (A) et les fibroblastes pulpaires (B) ne prolifèrent pas avec du C3a à 200 ng/ml. Les
deux types cellulaires prolifèrent à 1000 ng/ml et 2000 ng/ml de C3a, hormis pour les
fibroblastes pulpaires à 2000 ng/ml de C3a. Les résultats sont exprimés en moyennes +/-
Standard Error of the Mean (SEM) (n=3) (* = p-value < 0,05).

Aucune différence de prolifération n’est observée en présence de C3a à 200

ng/ml. En revanche, la prolifération des cellules souches est significativement
augmentée en présence de 1000 et 2000 ng/ml de C3a (117.59 ± 4.75; 117.85 ± 3.40
respectivement, p < 0,05), par comparaison au contrôle (Figure 22A). La prolifération
des fibroblastes pulpaires observée pour 1000 ng/ml de C3a est significativement
augmentée (121.45 ± 7.62; p < 0,05), mais pas pour 2000 ng/ml de C3a (Figure 22B).

90
 V. Le C3a mobilise les cellules souches et déclenche une migration
spécifique des fibroblastes pulpaires dépendante d’un gradient

La migration cellulaire est un autre phénomène important dans la régénération

tissulaire. Les cellules souches et les fibroblastes pulpaires exprimant le C3aR, nous
avons donc étudié la capacité des deux types cellulaires à migrer selon un gradient de
C3a. Pour cela, des chambres microfluidiques de chimiotactisme ont été utilisées
(Figure 23).

Figure 23. Chambre de migration microfluidique

Vue schématique (gauche) et par microscopie (droite) d’une chambre de chimiotactisme. Les
cellules sont ensemencées dans le canal central (Connecting Slit), et les réservoirs latéraux
sont ensuite remplis, avec du milieu contenant du C3a à droite (vert) et du milieu MEM seul à
gauche (blanc).

Les moyennes des positions spatiales de toutes les cellules (coordonnées x et y)

correspondent au centre de masse (COM) de toutes les cellules. Le déplacement du
COM est la différence entre les valeurs initiales et les valeurs finales du COM. Pour
chaque condition, une expérience représentative est présentée dans les plots de
trajectoire cellulaire (Figure 24). Lorsque nous avons rempli les réservoirs avec du
MEM seul, les cellules souches (Figure 24A) et les fibroblastes pulpaires (Figure 24D)
ont observé des mouvements aléatoires. Leur COM est resté en position centrale. De
manière surprenante, quand nous avons induit un gradient de C3a (vert), les cellules
souches pulpaires n’ont pas migré (Figure 24B), aucun déplacement du COM n’a été

91
observé (rond rouge). Cependant, une augementation de mouvements aléatoires a été
observée. Les fibroblastes pulpaires se sont fortement déplacés vers le réservoir
contenant le C3a, comme souligné par le déplacement du COM (Figure 24E, rond
rouge).

A B C
Cellules
souches
pulpaires

D E F
Fibroblastes
pulpaires

Figure 24. Le C3a mobilise les cellules souches pulpaires et induit la migration spécifique des
fibroblastes pulpaires selon un gradient.
La migration a été analysée dans les chambres microfluidiques en opérant un suivi par
imagerie cellulaire en microscopie optique. Plots représentatifs des migrations cellulaires
soumises à un gradient de C3a. Les moyennes des positions spatiales (coordonnées x et y) sont
utilisées pour calculer le COM pour chaque expérience (rond rouge). (A-C) Plots représentatifs
des cellules souches pulpaires. Les cellules souches pulpaires exprimant le C3aR sont
mobilisées et montrent des mouvements aléatoires, mais ne migrent pas en fonction d’un
gradient de C3a (B), comme décrit par la position centrale du COM. (D-F) Plots représentatifs
des fibroblastes pulpaires. Les fibroblastes pulpaires exprimant aussi le C3aR migrent
spécifiquement vers le réservoir contenant le C3a (E). Le COM se déplace sur le côté droit (sur
l’axe des x), dans la direction du gradient de C3a. En l’absence de gradient de C3a (D), le COM
reste dans le centre du plot, ce qui n’indique aucun déplacement cellulaire. (C, F) La présence
de l’inhibiteur SB290157 dans le CS réduit nettement les mouvements aléatoires des cellules
souches pulpaires (C) et la migration des fibroblastes pulpaires (F), ce qui suggère un effet
spécifique du C3a.

92
 Afin de confirmer le déplacement des fibroblastes pulpaires, nous avons analysé
graphiquement et statistiquement les déplacements cellulaires (Figure 25). L’analyse
graphique des cellules souches pulpaires ne montre aucun déplacement significatif du
COM (Figure 25A). En revanche, nous avons observé une différence statistiquement
significative concernant le déplacement du COM des fibroblastes pulpaires vers le
réservoir contenant le C3a (Figure 25B).

Cellules souches Fibroblastes

pulpaires pulpaires

A + C3a B + C3a
MEM + C3a MEM + C3a
+ SB290157 + SB290157
Displacements COM (µm)

x y x y x y x y x y x y
C D
*
FMI

x y x y x y x y x y x y

Figure 25. Analyses graphiques et statistiques des migrations cellulaires.

Lorsque le gradient de C3a est généré dans le CS, seul le COM des fibroblastes pulpaires (B)
démontre un déplacement statistiquement significatif vers l’axe des x, par comparaison avec
les cellules souches pulpaires (A). Le FMIx du déplacement des fibroblastes pulpaires (D) est
significativement supérieur au FMIy, ce qui montre que les fibroblastes pulpaires migrent en
fonction d’un gradient de C3a. Les histogrammes représentent des moyennes +/- SEM (n=3) (*
= p-value < 0,05).

Afin de déterminer si les cellules souches et les fibroblastes pulpaires migrent

selon un gradient de C3a, l’analyse statistique du Forward Migration Index parallèle
(FMIx) et perpendiculaire (FMIy) au gradient, correspondant aux directions selon l’axe
des x et y respectivement, est réalisée. Un FMIx supérieur au FMIy suggère que les

93
cellules migrent selon un gradient. Alors qu’aucune différence statistiquement
significative n’est observée entre le FMIx et le FMIy des cellules souches pulpaires
(Figure 25C), le FMIx des fibroblastes pulpaires (Figure 25D) est statistiquement
supérieur au FMIy (x = 0.21 ± 0.03; y = -0.02 ± 0.01; p < 0,05).

Pour confirmer l’implication de la liaison entre le C3a et son récepteur dans la

migration (Figure 24 et 25), nous avons ajouté dans le canal central (bleu) un
antagoniste spécifique du C3aR (SB290157) (Ames et al., 2001). Dans cette condition,
la migration des fibroblastes pulpaires est complètement inhibée (Figures 24Bf, 25B et
25D) et les mouvements aléatoires des cellules souches pulpaires ont diminué (Figures
24Bc, 25A et 25C). Ainsi, les cellules souches pulpaires sont mobilisées par le C3a,
tandis que les fibroblastes pulpaires migrent spécifiquement selon un gradient de C3a.

94
 Résumé première partie :

• Les fibroblastes pulpaires expriment le FSP, et expriment aussi le C3aR sur des coupes de
pulpes de dents humaines. D’après nos connaissances, c’est la première fois que
l’expression du C3aR est démontrée dans le tissu pulpaire. Cette expression du C3aR a été
confirmée in vitro par RT-PCR et par un double marquage immunofluorescent sur les
cellules souches STRO-1 positives et sur les fibroblastes exprimant le FSP.

• Mes résultats démontrent que le fragment bioactif C3a est impliqué dans la prolifération
des cellules souches et des fibroblastes pulpaires.

• Lorsque les deux types cellulaires ont été soumis à un gradient de C3a dans les
expériences de migration, les cellules souches pulpaires ont été mobilisées de façon
aléatoire, tandis que les fibroblastes pulpaires ont suivi spécifiquement le gradient de C3a.
La migration ainsi observée est très clairement due à la fixation du C3a sur son récepteur.
Après addition de l’antagoniste spécifique du C3a (SB290157) dans le canal central, la
migration des fibroblastes pulpaires a été inhibée.

95
 Deuxième partie : Etude sur la capacité du CAM à inhiber la
croissance bactérienne

I. L’activation du système du Complément in vivo est corrélée avec la

présence de S. mutans

Sachant que le système du Complément à la possibilité d’être activé localement,

nous avons supposé dans un premier temps que cette activation pouvait être la
conséquence de la présence de bactéries cariogènes. Les images histologiques
montrent une perte partielle de la dentine au niveau de la lésion carieuse, ainsi qu’une
infiltration bactérienne dans les tubuli dentinaires. De plus, une sécrétion de dentine
réparatrice peut être observée sous le site de la lésion carieuse. Le tissu pulpaire
possède une apparence de tissu sain (Figure 26A et 26B). Les bactéries à Gram positif
ont été détectées dans les tubuli dentinaires des coupes de dents cariées (Figure 26B).

Des marquages immunofluorescents ont été réalisés pour identifier S. Mutans

sur les mêmes coupes de dents cariées. Ainsi, nous avons démontré un marquage
intense au niveau de la lésion carieuse (Figure 26C). A l’aide d’un grossissement plus
fort, nous avons montré que la présence de S. mutans dans les tubuli dentinaires
(Figure 26E) est corrélée avec un marquage intense du Complexe d’Attaque
Membranaire (CAM) (Figures 26F et 26G). La présence des bactéries à Gram positif S.
mutans dans la dentine est corrélée avec l’activation du Complément dans les dents
cariées humaines.

96
 A B

d
d
*
*

p p

C D

d d

* *

p p

E F

G H

Figure 26. Détection des bactéries Streptoccocus mutans sur des coupes de dents cariées
humaines.
Images représentatives des colorations hématoxyline/éosine (A) et de Gram (B) sur coupe de
dents cariées. La coupe montre une dentine partiellement détruite par la lésion carieuse une
infiltration bactérienne dans la dentine, une synthèse de dentine réparatrice et une pulpe
encore saine. Un marquage violet intense a été observé dans la coupe de dents cariée,
indiquant la présence de bactéries à Gram positif (B). (C-H) Marquage immunofluorescent de
S. mutans (rouge) et du Complexe d’Attaque Membranaire (CAM) (vert) sur la dent cariée (C,
E, F, G) et leurs isotypes contrôles (D, H). Les noyaux sont colorés au DAPI (bleu). Un marquage
intense de S. mutans a été observé sur le site de la lésion de la dent cariée (C), qui est
clairement visible à plus fort grossissement dans les tubuli dentinaires (E) et qui est également
corrélé avec un marquage intense du CAM (F, G). (G) Superposition de (E) et (F). Les têtes de
flèches indiquent les lésions carieuses ; les astérisques montrent la dentine réparatrice ; d,
dentine ; p, pulpe. Echelles : 500 µm (A, B, C, D), 50 µm (E, F, G, H).

97
 II. La stimulation au LTA de fibroblastes pulpaires humains conduit à la
formation du CAM sur les bactéries cariogénènes à Gram positif S.
mutans et S. sanguis

Dans un travail antérieur, il a été démontré que les fibroblastes pulpaires étaient
capables de synthétiser toutes les molécules du Complément, y compris les molécules
C5b-9 composant le CAM (Chmilewsky et al., 2014a). C’est pourquoi, nous voulions
éclaircir la question suivante : Est-ce que les molécules du CAM sont capables de se
former sur les bactéries cariogènes S. mutans et S. sanguis ?

Nous avons incubé les bactéries cariogènes pendant 30 minutes au contact de

milieu provenant des cultures de fibroblastes pulpaires stimulés à l’acide
lipotéichoïque (LTA) (milieux conditionnés au LTA). En utilisant un test de détection
enzymatique, nous avons observé une augmentation significative (Figure 27) de la
fixation du CAM sur S. mutans et S. sanguis (0,492 ± 0,1039 ; 0,431 ± 0,02638
respectivement) (p < 0,05). Cette augmentation est 5 fois plus grande que celle
observée dans la condition où les milieux conditionnés sont du MEM seul, sans LTA.
Lorsque l’inhibiteur de la formation du CAM (CD59) est ajouté simultanément avec les
milieux conditionnés, la fixation du CAM est significativement inhibée sur S. mutans et
S. sanguis (0,193 ± 0,0639 ; 0,198 ± 0,0315 respectivement) (p < 0,05). Ainsi, nous
avons clairement démontré que les CAM synthétisés par les fibroblastes pulpaires
peuvent se fixer sur les bactéries cariogènes à Gram positif S. mutans et S. sanguis.

98
 0,7

Expression du CAM (DO 650 nm)

* *
0,6

0,5 * *

0,4

0,3

0,2

0,1

0
Milieux LTA - + + - + +
conditionnés CD59 - - + - - +

S. mutans S. sanguis

Figure 27. Détection enzymatique du complexe d'attaque membranaire (CAM) sur les
bactéries cariogènes à GRAM positif Streptoccocus mutans et sanguis.
Après un contact des bactéries cariogènes avec les milieux conditionnés au LTA, une
augmentation significative de la fixation des CAM sur les bactéries a été observée, par
comparaison à la condition des milieux conditionnés sans LTA (n=3) (* = p < 0,05). Cette
fixation a été complètement inhibée après l’ajout simultané de l’inhibiteur CD59.

99
 III. Les CAM produits par les fibroblastes pulpaires stimulés au LTA sont
fonctionnels et peuvent tuer S. mutans et S. sanguis

Nous avons ensuite exploré l’hypothèse selon laquelle les CAM produits par les
fibroblastes pulpaires stimulés au LTA, sont fonctionnels et ont la capacité de tuer les
bactéries cariogènes Gram-positif S. mutans et S. sanguis.

Nous avons testé la sensibilité des bactéries au contact de milieux conditionnés

au LTA en utilisant une méthode de diffusion en puits d’agar (Figure 28A). Les résultats
ont montré que la croissance des bactéries est homogène autour des puits remplis
avec des milieux conditionnés sans LTA, montrant ainsi l’absence d’un quelconque
effet inhibiteur sur la croissance bactérienne. Cependant, quand nous avons rempli les
puits avec des milieux conditionnés au LTA, la croissance de S. mutans et S. sanguis
autour des puits a été fortement inhibée. Lorsque nous avons co-incubé les mileux
conditionés au LTA avec l’inhibiteur CD59, les zones d’inhibition de croissance autour
des puits ont nettement disparu pour S. mutans et S. sanguis.

Nous avons ensuite confirmé ces résultats en quantifiant la viabilité bactérienne

par un test MTT (Figure 28B). De cette manière, les milieux conditionnés au LTA ont
statistiquement diminué la viabilité de S. mutans et S. sanguis (50,41 ± 6,73 ; 50,20 ±
3,55 respectivement) L’ajout de CD59 a permi d’abolir cette diminution de viabilité, qui
a pu être partiellement recouvrée pour S. mutans et S. sanguis (75,54 ± 2,10 ; 73,65 ±
4,16 respectivement).

100
 Milieux Conditionnés
A
LTA-free LTA LTA + CD59

S. mutans
S. sanguis

B 120
Viabilité bactérienne (exprimée comme %
de la viabilité bactérienne dans un milieu

100

* *
80
LB)

60 * *

40

20

0
LTA - + + - + +
Milieux
conditionnés CD59 - - + - - +
S. mutans S. sanguis

Figure 28. Détermination de sensibilité bactérienne de Streptococcus mutans et

Streptococcus sanguis au CAM.
(A) Images représentatives du test de diffusion en puits d’agar. S. mutans et S. sanguis ne sont
pas sensibles aux milieux conditionnés sans LTA, mais sont sensibles aux milieux conditionnés
avec LTA. La sensibilité des bactéries aux milieux conditionnés avec LTA diminue après l’ajout
de CD59. (B) Quantification de la sensibilité de S. mutans et S. sanguis avec un test MTT. Le
nombre de bactéries vivantes détectées après incubation simultanée avec les milieux
conditionnés au LTA et le CD59 est significativement plus élevé que sans CD59 (n=3) (* = p <
0,05).

101
 IV. S. mutans et S. sanguis induisent directement la production du CAM
par les fibroblastes pulpaires.

L’acide lipotéichoïque utilisé dans cette étude pour stimuler les fibroblastes
pulpaires et permettre la production de CAM est un motif de bactéries à Gram positif.
Nous avons clairement montré la formation fonctionnelle du CAM sur les bactéries
cariogènes à Gram positif. C’est pourquoi, nous avons cherché à savoir si S. mutans et
S. sanguis pouvaient directement stimuler la production de CAM.

Nous avons abordé cette question en réalisant des co-cultures de fibroblastes

pulpaires humains et de bactéries S. mutans et S. sanguis. Nous avons ensuite évalué
la formation des complexes d’attaque membranaire (CAM) par immunofluorescence.
Aucune formation de CAM n’a été détectée sur les co-cultures contrôles fixées
immédiatement après ajout des bactéries sur les cellules (Figure 29A, E, I, M).
Cependant, après une incubation de 30 minutes, un marquage intense du CAM a été
observé sur les bactéries (Figure 29B, F, J, M). Nous avons confirmé la formation du
CAM sur les bactéries en observant une diminution significative de marquage après
ajout de CD59 dans les co-cultures (Figure 29C, G, K, O). Ces marquages sont
spécifiques comme l’indique les contrôles isotypiques (Figure 29D, H, L, P).

Ces résultats montrent que les bactéries cariogènes à Gram positif S. mutans et
S. sanguis stimulent directement la production du CAM par les fibroblastes pulpaires.

102
 0 min 30 min

+ CD59 Contrôles négatifs

A B C D
S. mutans

E F G H

I J K L
S. sanguis

M N O P

Figure 29. S. mutans et S. sanguis induisent directement la formation du CAM produits par
les fibroblastes pulpaires.
Des doubles marquages immunofluorescents ont été utilisés pour visualiser le marqueur FSP
en vert et le CAM en rouge à 0 minute (A, E, I, M) et à 30 minutes (B-D, F-H, J-L, N-P) des co-
cultures de fibroblastes humains et de S. mutans et S. sanguis en l’absence (A, B, E, F, I, J, L, M)
ou en présence (C, G, K, O) de CD59. Les co-cultures de fibroblastes et des bactéries peuvent
être observées dans toutes les conditions en images par contraste de phase (E-H, M-P). Aucun
immunomarquage n’a été observé dans les conditions contrôles (A, E, I, M) ou avec un isotype
(D, H, L, P). Un marquage de CAM intense en rouge a été observé sur les bactéries après 30
minutes de co-culture (B, J). La formation du CAM sur les bactéries a été confirmée par une
diminution significative de marquage après l’addition de CD59 dans les co-cultures (C, K).
Echelles : 500 µm.

103
 Résumé résultats : Deuxième partie

• In vivo, sur coupe de dents cariées, la présence de S. mutans est corrélée à une
synthèse des CAM au niveau de la lésion carieuse par marquages immunofluorescents.

• En développant un système de détection enzymatique original, mes résultats

démontrent in vitro que la stimulation des fibroblastes pulpaires par le LTA, conduit à
la synthèse et à la formation des CAM sur les bactéries cariogènes S. mutans et S.
sanguis.

• Les CAM produits par les fibroblastes stimulés au LTA sont fonctionnels, car ils peuvent
inhiber la croissance de S. mutans et S. sanguis, démontré par un test MTT et un test
de diffusion en puit d’agar.

• Les modèles de co-cultures entre les fibroblastes pulpaires et les bactéries cariogènes
montrent que S. mutans et S. sanguis peuvent induire directement la production des
CAM par les fibroblastes pulpaires.

104
DISCUSSION

105
 Ces travaux de thèse ont mis en évidence l’implication de l’activation locale du
système du Complément dans la régénération pulpo-dentinaire d’une part, et dans la
défense contre les bactéries cariogènes d’autre part.

Le système du Complément a longuement été cité comme un mécanisme de

l’immunité innée impliqué dans le recrutement de cellules inflammatoires, dans la
perméabilisation et la dilatation des vaisseaux sanguins ou encore dans la sécrétion de
cytokines pro-inflammatoires (Cochrane, 1968; Johnson et al., 1975; Schumacher et
al., 1991). Cependant, des études récentes ont démontré l’implication de l’activation
du système du Complément pendant les processus de régénération tissulaire (Ignatius
et al., 2011a, 2011b; Mastellos et al., 2013; Rutkowski et al., 2010; Schoengraf et al.,
2013; Schraufstatter et al., 2015; Strey et al., 2003). De nombreuses études ont
montré la capacité du C5a et du C3a à induire la migration des cellules souches vers les
sites lésionnels, et leur capacité à induire leur prolifération et différenciation. Les
cellules souches dérivant du mésoderme embryonnaire semblent être des cibles
pouvant repondre au C3a et au C5a. C’est le cas par exemple des cellules souches
adultes neuronales chez la souris, qui expriment des C3aR fonctionnels, où la fixation
spécifique du C3a déclenche leur migration et leur différenciation (Shinjyo et al.,
2009). De plus, l’implication de l’activation du système du Complément pendant la
régénération pulpo-dentinaire a également été décrite par le recrutement des cellules
souches pulpaires via un gradient de C5a (Chmilewsky et al., 2013).

Le tissu pulpaire possède une conformation architecturale particulière. Au cours

des lésions carieuses profondes ou des blessures traumatiques, la couche
d’odontoblastes et le tissu pulpaire (fibroblastes, cellules nerveuses et endothéliales)
peuvent être partiellement détruits. Une nouvelle génération d’odontoblastes et la
prolifération de fibroblastes pulpaires sont alors requis pour remplacer le tissu
endommagé. Des travaux antérieurs de notre laboratoire ont démontré que, après
l’activation du Complément, les cellules souches pulpaires migrent selon un gradient
spécifique de C5a (Chmilewsky et al., 2013, 2014a). Ce qui rend légitime l’étude d’un
autre composant du Complément, le fragment C3a.

106
 Les protéines du Complément comme le C3 sont connues pour être synthétisées
dans le foie et par les cellules immunitaires. Ces protéines sont libérées dans le plasma
où leur activation conduit généralement à la formation du fragment bioactif C3a. De
manière intéressante, des travaux récents ont démontré que les fibroblastes pulpaires
sont l’unique type cellulaire non-immunitaire et non-hépatique capable de synthétiser
toutes les molécules du Complément et leur activation, produisant ainsi des fragments
bioactifs tels que le C5a et le C5b-9 (Chmilewsky et al., 2014a, 2014b, 2015; Jeanneau
et al., 2015). Étant donné que les fibroblastes pulpaires synthétisent le C5a, et sachant
que le C3a est le premier fragment produit par l’activation du Complément, nous
avons émis l’hypothèse que le C3a peut être produit par les fibroblastes et peut jouer
un rôle dans la régénération pulpo-dentinaire.

Dans mon travail de thèse, le C3a a été ajouté aux cellules souches et
fibroblastes pulpaires pour étudier leur possible rôle dans les étapes précoces de la
régénération pulpo-dentinaire. La prolifération des cellules souches et des fibroblastes
pulpaires en réponse au C3a a été analysée dans un premier temps. Nous avons
montré que les cellules souches et les fibroblastes pulpaires prolifèrent en réponse à
une stimulation de 1000 ng/ml de C3a. Cette prolifération est une étape indispensable
à la régénération pulpo-dentinaire. Le fait que la prolifération des fibroblastes
augmente significativement à 1000 ng/ml, et non à des concentrations plus élevées,
est probablement du à l’inhibition de contact parmi les cellules quand elles atteignent
une forte densité. Quand nous avons ensuite étudié le recrutement cellulaire, nos
résultats ont montré que les cellules souches sont mobilisées, mais ne migrent pas en
fonction d’un gradient de C3a. Nous avons émis l’hypothèse que cette mobilisation
était nécessaire, car une mobilisation des cellules souches est indispensable à leur
migration.

Enfin, la valeur ajoutée de cette première partie de mon travail de thèse est de
montrer que les fibroblastes pulpaires sont un autre type cellulaire qui peut être
mobilisé par un fragment bioactif du Complément. Ces résultats montrent que les
fibroblastes pulpaires exprimant le C3aR in vitro et in vivo, migrent selon un gradient

107
de C3a, souligné notamment par l’inhibition de la migration après blocage de
l’interaction entre le C3a et son récepteur sur ces cellules.
En conclusion, ces résultats montrent que le C3a augmente significativement la
prolifération des fibroblastes et des cellules souches pulpaires. Ils montrent également
que le C3a mobilise les cellules souches pulpaires et induit la migration spécifique des
fibroblastes pulpaires selon un gradient de C3a. L’ensemble de ces données souligne
un rôle significatif du fragment C3a dans les étapes précoces de la régénération pulpo-
dentinaire.

Cependant, nous devons garder à l’esprit que la régénération pulpo-dentinaire

peut intervenir une fois l’élimination des bactéries cariogènes effectuée, ou du
moins, une fois la progression des bactéries arrêtée.

Nous avons examiné si l’activation du système du Complément dans la pulpe

dentaire était impliquée dans l’inhibition de la croissance des bactéries cariogènes.
Outre la production de C3a, la formation des complexes d’attaque membranaire
(CAM) est un autre produit issu de l’activation du Complément. Ces complexes sont
connus pour induire la lyse des pathogènes par leur insertion dans les parois
bactériennes (Berends et al., 2013). Nous avons vérifié la formation de ces complexes
in vivo, dans les coupes de dents cariées, sur les bactéries cariogènes S. mutans, et
nous avons démontré leur présence sur le site de la lésion carieuse. Ce résultat est en
accord avec des travaux antérieurs qui ont montré la présence de S. mutans dans les
sites carieux après une culture in vitro et des réactions de PCR (Loesche, 1986; Martin
et al., 2002). De manière inattendue, ce résultat est la première démonstration directe
de la présence de S. mutans dans les lésions carieuses sur des coupes histologiques. De
plus, nous avons montré la présence des CAM situés sur S. mutans dans les sites
carieux, par un double marquage immunofluorescent sur S. mutans et les CAM. Cette
expérience de localisation des CAM ne s’est faite uniquement que sur S. mutans, car
aucun anticorps commercial n’est disponible pour détecter S. sanguis.

Cette observation de la formation des CAM sur les bactéries cariogènes in vivo
peut être due à la production locale du Complément, connaissant la propension des

108
fibroblastes pulpaires à activer le Complément après stimulation bactérienne et
l’apport plasmatique du Complément dans d’autres tissus (Brodsky, 2015; Chmilewsky
et al., 2014a). Pour confirmer que les fibroblastes pulpaires produisent eux-mêmes
tous les éléments requis pour la formation de CAM fonctionnels, les cellules sont
incubées dans un milieu sans sérum avec du LTA, motif bactérien des bactéries Gram-
positives. Nous avons spécialement développé un test enzymatique de détection in
vitro pour quantifier la formation directe des CAM sur les bactéries cariogènes, qui
sont cultivées dans des milieux conditionnés obtenus des fibroblastes pulpaires
stimulés. De cette manière, nous avons démontré la fixation directe des CAM sur S.
mutans et S. sanguis. Quand les bactéries cariogènes ont été incubées avec le CD59
(inhibiteur de la formation des CAM) dans les milieux conditionnés au LTA, la fixation
des CAM a été réduite de façon significative, ce qui indique la fixation spécifique des
CAM sur ces bactéries.

Nous avons ensuite examiné les effets de la fixation des CAM sur la viabilité de S.
mutans et S. sanguis en utilisant une méthode de diffusion en puit d’agar (qualitative)
et un test MTT (quantitatif). Avec la méthode qualitative, nous avons montré que la
fixation des CAM sur S. mutans et S. sanguis inhibe leur croissance. Ces résultats sont
corrélés au test quantitatif MTT qui a démontré une diminution significative de la
viabilité bactérienne. L’utilisation de l’inhibiteur de la formation des CAM (CD59), dans
les milieux conditionnés au LTA, a permis de confirmer que l’inhibition de croissance et
la diminution de la viabilité bactérienne sont dues à la fixation spécifique des MAC sur
les parois des bactéries cariogènes.

Afin de compléter l’investigation des liens directs entre la fixation des CAM
produits par les fibroblastes pulpaires et la destruction des parois bactériennes, nous
avons réalisé des co-cultures de bactéries cariogènes et de fibroblastes pulpaires. Les
fibroblastes ont été ensemencés dans un milieu sans sérum ; les bactéries cariogènes
ont ensuite été ajoutées et des doubles marquages FSP et CAM immunofluorescents
ont été réalisés. Ainsi, nous avons établi que la formation des CAM était clairement
visible après 30 minutes d’incubation avec S. mutans et S. sanguis. L’ajout de CD59
dans les co-cultures a permis d’inhiber la formation des CAM sur les parois des

109
bactéries. Ce système de co-culture nous a montré que lorsque les fibroblastes
pulpaires sont mis en présence de bactéries cariogènes, ces cellules produisent tous
les composants du Complément requis pour la formation du CAM sur les parois des
bactéries. Même si ce point n’a pas été abordé dans mon travail de thèse, il est
intéressant de noter qu’une partie des bactéries cariogènes sont Gram-négatives
(Martin et al., 2002). De ce fait, nous pouvons supposer que la fixation et la
fonctionnalité des CAM sur ces bactéries seraient similaires à ce que l’on peut trouver
dans d’autres études (Berends et al., 2015; Tomlinson et al., 1989). En tout état de
causes, ces résultats mettent en avant les fibroblastes pulpaires, comme le type
cellulaire de la pulpe capable de contrôler directement l’évolution du processus
inflammatoire et la progression bactérienne.

L’activation du système du Complément par les fibroblastes fournit un lien direct

entre l’inflammation de la pulpe et ses propriétés de régénération. Tandis que le C5a
est impliqué dans la migration des cellules souches pulpaires, et que le C3a peut
recruter les fibroblastes pulpaires, la formation des complexes d’attaque membranaire
sur les bactéries cariogènes apparaît comme un prérequis important pour l’induction
de la régénération pulpo-dentinaire. À partir de ces résultats, nous pouvons
comprendre et décrire les évènements précoces de cette régénération (Figure 28).

Tout commence lors d’une lésion carieuse profonde ou d’un traumatisme

physique dentaire (blessure, procédure de restauration clinique). L’environnement
buccal hostile, regorgeant de bactéries Gram-positives et négatives entre autres, est la
source majeure des complications rencontrées, par l’ouverture d’une brèche dans
l’émail. Les bactéries cariogènes vont se déposer, proliférer et commencer à dissoudre
les structures minérales de la dent (Figure 30). La structure tubulaire de la dentine
n’est pas un avantage quand une infiltration bactérienne intervient. En effet, les
bactéries cariogènes vont pouvoir fragiliser la dentine en s’immisçant dans les
canalicules dentinaires, tout en sécrétant des acides à haut pouvoir de dissolution. Les
tubuli dentinaires sont le refuge des prolongements odontoblastiques. Lorsque ceux-ci
sont au contact des bactéries, l’activité sécrétoire des odontoblastes est augmentée,
et une dentine réactionnelle est sécrétée, protégeant la pulpe de l’infiltration

110
bactérienne (Smith et al., 1995a). De plus, les odontoblastes vont également sécréter
des chimiokines pro-inflammatoires par l’activation de leur Toll-like Receptor (TLR) 2
(Farges et al., 2011). Ces chimiokines, comme le CCL2, le CXCL1, CXCL2, CXCL8, et
CXCL10 induisent l’activation et le recrutement des cellules dendritiques immatures et
l’élimination des pathogènes (Farges et al., 2011, 2013; Keller et al., 2010). Dès lors
que les bactéries progressent profondément au contact du complexe pulpo-dentinaire,
l’intégrité de ce dernier est fortement compromise. La masse bactérienne s’installe et
aboutit à des dommages tissulaires importants, mais cette invasion peut être
contrôlée par les fibroblastes pulpaires. Les bactéries cariogènes vont stimuler
l’activation du Complément et permettre la synthèse des complexes d’attaque
membranaire (CAM) par les fibroblastes. Ces complexes ont la capacité de détruire les
bactéries cariogènes S. mutans et S. sanguis par exemple. De cette manière,
l’inflammation qui en découle peut-être relativement maitrisée pour permettre
l’initiation des étapes de régénération pulpo-dentinaire.

En même temps que les fibroblastes pulpaires luttent contre les bactéries
cariogènes via la production des CAM, les odontoblastes, les fibroblastes pulpaires et
le paquet vasculo-nerveux sous-jacent, qui ont été détruits, peuvent être remplacés.
Plusieurs événements vont suivre pour combler et régénérer un tissu fonctionnel. Une
nouvelle génération d’odontoblastes est requise pour protéger la pulpe des bactéries
par la synthèse d’une dentine réparatrice (Massler, 1967; Silverstone, 1973). Pour cela,
les fibroblastes pulpaires vont produire les fragments C3a puis C5a, et vont s’établir
des gradients à partir des sites de la lésion carieuse. Le C3a va mobiliser les cellules
souches pulpaires périvasculaires, et le C5a va les attirer selon un gradient spécifique
vers le site carieux. De plus, le C3a va également attirer les fibroblastes avoisinants par
un gradient spécifique, pour combler le site carieux. Le fragment C3a induira la
prolifération des cellules souches et des fibroblastes pulpaires sur le site de la lésion.
Ces migrations et proliférations cellulaires représentent le point de départ de la
régénération pulpo-dentinaire. Une fois arrivées en regard de la carie, les cellules
souches pulpaires vont pouvoir se différencier en odontoblast-like cells, et vont ainsi
produire de la dentine réparatrice. Cette protection minérale de la pulpe dentaire est

111
alors assurée dans un environnement débarrassé des bactéries par l’activation locale
du système du Complément.

Les bactéries cariogènes provoquent une perte partielle du tissu pulpaire, y

compris les vaisseaux et les cellules nerveuses. Lors de la dissolution de la dentine, les
facteurs pro-angiogéniques tels que le TGF-b1, le FGF2, le PDGF et le VEGF vont
assurer la régénération vasculaire. Hormis ceux séquestrés dans la dentine, les
fibroblastes pulpaires vont synthétiser ces facteurs pro-angiogéniques, permettant la
régénération des vaisseaux, le recrutement des cellules souches pulpaires, mais aussi
la prolifération des fibroblastes pulpaires (About, 2011; Botero et al., 2003; Mathieu et
al., 2005, 2013; Tran-Hung et al., 2006, 2008b).

Enfin, le système vaso-moteur et sensitif de la dent peut être altéré lors d’une
lésion carieuse ou d’un traumatisme profond. Les fibroblastes pulpaires seront en ligne
de mire pour induire la régénération nerveuse au niveau pulpaire. En effet, des travaux
récents ont montré que les fibroblastes pulpaires expriment le C5aR après stimulation
par des bactéries cariogènes in vivo et in vitro, et l’interaction directe entre le C5a
(produit par les fibroblastes également) et son récepteur induit la production de BDNF
(Brain-Derived Neurotrophic Factor). De cette manière, ce facteur neurotrophique
induit la croissance nerveuse, notamment par la formation de neurites (Chmilewsky et
al., 2016).

Mon travail de thèse a permis de comprendre le rôle essentiel des fibroblastes

pulpaires au carrefour de l’inflammation et de la régénération pulpo-dentinaire. Les
retombées cliniques de ce travail se traduisent par une meilleure compréhension des
cas de pulpites réversibles, où le pronostic pulpaire est engagé, mais qui peut être
amélioré par le maintien de la vitalité du tissu pulpaire résiduel. Outre ses capacités à
synthétiser la dentine réparatrice, la pulpe dentaire possède le potentiel de se
protéger par l’inhibition directe de la croissance des bactéries cariogènes, par
l’induction du renouvellement des odontoblastes et des fibroblastes, du réseau
vasculaire et des cellules nerveuses.

112
A E
1
D

CAM

2
C3aC5a
C3aC5a
C3a 3
C5a
C3a
C5a
C3a C5a
C5a C3a
C3a

C3a

C3a
C5a

C5a

113
Figure 30. Récapitulatif des étapes précoces de la régénération pulpo-dentinaire par
l’activation locale du Complément.
(Schémas d’une coupe de couronne dentaire). (A) 1 Une lésion (carieuse, traumatique) (noir)
ouvre une brèche dans l’émail, et laisse entrer des bactéries cariogènes (vert). Ces dernières
vont dissoudre l’émail et la dentine, et provoquer une perte des odontoblastes et des
fibroblastes pulpaires. 2 L’entrée des bactéries dans la pulpe entraîne une stimulation des
fibroblastes en regard de la lésion. Ceux-ci vont pouvoir sécréter toutes les molécules du
Complément, dont les complexes d’attaque membranaire (CAM). Ces derniers entraînent
l’inhibition de la croissance des bactéries cariogènes et permettent un contrôle de l’infection.
3 De manière concomitante, les fragments C3a et C5a sont sécrétés. (B) 4 Le C3a va mobiliser
les cellules souches des niches périvasculaires et induire leur prolifération (cellues bleues),
ainsi que celle des fibroblastes pulpaires (cellules bleues). Les gradients de C3a (bleu) et C5a
(jaune) vont s’établir à partir du site de la lésion. Le gradient de C3a est responsable de la
migration des fibroblastes pulpaires ; le gradient de C5a est responsable de la migration des
cellules souches pulpaires. 5 Les fibroblastes et les cellules souches, une fois sur le site de la
lésion, ont le potentiel de combler le tissu détruit par l’infection bactérienne, et de régénérer
la couche d’odontoblastes par la différenciation des cellules souches en odontoblast-like cells.
Ainsi, cette nouvelle génération d’odontoblastes va pouvoir sécréter la dentine « réparatrice »
(rose vif). E : émail ; D : dentine ; P : pulpe.

114
PERSPECTIVES

115
Effets des biomatériaux de coiffage sur la
balance inflammation/régénération

Il est bien établi que certaines classes de biomatériaux peuvent déclencher la

cascade du Complément, par la présence de groupements libres -OH, -NH3, -COOH, et
d’ion Ni2+ ou de Co2+ (Acevedo and Vesterberg, 2003; Nilsson et al., 2010). De plus, lors
de la procédure de restauration, la préparation de la dent induit un traumatisme
mécanique aboutissant à une perte cellulaire par nécrose et/ou apoptose. Ces
évènements engendrent eux-aussi l’activation du système du Complément (Gewurz et
al., 1993; Korb and Ahearn, 1997; Verhoven et al., 1995). Etant donné que dans la
thérapeutique des lésions carieuses ces matériaux sont placés au contact de la pulpe,
nous avons exploré l’influence des biomatériaux de coiffages pulpaires sur la balance
inflammation/régénération du complexe pulpo-dentinaire par l’activation du système
du Complément.

Ainsi, nous avons développé un modèle in vitro nous permettant de comparer la

sécrétion d’un facteur du Complément (C5a) par les fibroblastes pulpaires (Figure 31),
induite par des extraits de Biodentine (silicate), de Théracal (un matériau hybride
silicates tricalciques / résines) et de XénoIII (résines). Afin de se rapprocher des
conditions cliniques, nous avons associé, aux différentes conditions de biomatériaux,
des lésions mécaniques sur les fibroblastes pulpaires. Ainsi, nous avons montré que le
Théracal et le XénoIII augmentent la sécrétion de C5a par les fibroblastes pulpaires
lésés, mais pas le Biodentine.

116
 **

Pourcentage du contrôle (Fibroblastes pulpaires lésés)

160
*
140

120 *

100%
100
* Contrôle

80

60

40

20

0
Non injured
Intacts Injured
Lésés Biodentine™ TheraCal® Xeno®III

Figure 31. Sécrétion du C5a par les fibroblastes pulpaires lésés au contact des extraits de
biomatériaux.
Les fibroblastes pulpaires lésés sont incubés avec les extraits de biomatériaux (0,05 cm2/ml)
pendant 30 minutes. Les fibroblastes pulpaires intacts et lésés sont cultivés dans du milieu
MEM. Les données sont exprimées en pourcentage des cellules lésées. Les lésions augmentent
la sécrétion de C5a. Quand les fibroblastes sont lésés et incubés avec les extraits de
biomatériaux, la sécrétion de C5a augmente significativement sauf avec le Biodentine. La
sécrétion de C5a est le plus fortement augmentée avec le XénoIII, suivi de près par le Théracal
(n=3, p < 0,05).

Ces résultats soulèvent alors une autre question : la sécrétion de C5a observée
influence-t-elle la régénération ou plutôt l’inflammation pulpaire ? Des
expérimentations sont en cours au sein de notre laboratoire pour tenter d’y répondre.
Après avoir caractérisé l’expression du récepteur au C5a par immunofluorescence,
nous avons mis au point des expériences de migration cellulaire en chambre de
Boyden avec des cellules inflammatoires THP-1 (Monocytes/Macrophages) d’une part,
et des cellules souches pulpaires d’autre part. Nos résultats préliminaires montrent
que l’incubation des fibroblastes lésées avec les extraits du Théracal et de XénoIII, mais
pas le Biodentine, provoquent une diminution de la migration des cellules souches
pulpaires. De plus, le Biodentine et le Théracal, placés au contact des fibroblastes,
diminuent la migration des cellules inflammatoires THP-1.

117
 Cette étude complémentaire à mon travail de thèse, démontre que l’activation
du système du Complément par les différents biomatériaux est impliquée dans la
migration de cellules de l’inflammation (THP-1) et des cellules souches pulpaires,
confirmant ainsi un lien étroit entre les deux processus. Cette activation du système du
Complément est directement liée aux fibroblastes pulpaires lésés qui produisent
toutes les molécules du Complément. De plus, ces résultats montrent combien le choix
des matériaux peut être déterminant dans la balance inflammation/régénération du
complexe pulpo-dentinaire. Ces résultats seront complétés par une étude de la
sécrétion du C3a par les fibroblastes pulpaires lésés, en fonction des différents types
de biomatériaux, à l’aide d’un dosage ELISA.

L’effet du C3a sécreté sur la migration des fibroblastes pulpaires, qui expriment
le C3aR, sera également étudié en chambre de Boyden. Des fibroblastes pulpaires
pourront être ensemencés dans la partie inférieure de la chambre, en plaque 12 puits,
puis lésés mécaniquement. Des extraits de biomatériaux seront ensuites ajoutés sur
les fibroblastes. Ensuite, d’autres fibroblastes seront ensemencés dans la partie
supérieure. La migration sera ensuite évaluée après 24 heures, grâce à une coloration
Hématoxyline/Eosine et à une observation par microscopie optique.

118
La phagocytose médiée par le système du
Complément : l’arme fatale pulpaire ?

Le système du Complément possède une multitude de mécanismes aboutissant à

l’élimination directe des pathogènes. La production des CAM par les fibroblastes
pulpaires, suite à une stimulation de bactéries cariogènes, en est un exemple très
concret comme démontré dans mon travail de thèse (Jeanneau et al., 2015). Le
système du Complément peut également déclencher la phagocytose de ces même
pathogènes par les cellules immunitaires notamment ; mécanisme connu sous le nom
d’opsonisation (Janeway et al., 2001). Le fragment C3b est l’opsonine libérée au cours
de la cascade du Complément, et bon nombre de cellules immunitaires, dont les
phagocytes, possèdent des récepteurs pour cette opsonine. Etant donné que les
fibroblastes pulpaires synthétisent ce fragment, il serait intéressant de savoir si le C3b
favorise la phagocytose des bactéries cariogènes par les cellules immunitaires dans le
contexte d’une inflammation pulpaire. La réponse à cette question permettrait de
comprendre si l’activation du système du Complément diminue l’inflammation par
l’augmentation de l’activité phagocytaire des cellules immunitaires.

De plus, les liens étroits qui existent entre la régénération et l’inflammation sont
entretenus par l’activité des fibroblastes pulpaires. Ces derniers sont capables de
synthétiser les molécules du CAM et ainsi induire la lyse des bactéries cariogènes. C’est
pourquoi, nous pourrions investiguer sur un possible rôle de phagocytose des
bactéries par les fibroblastes pulpaires. Nous pourrions dans un premier temps
caractériser le CR1 (ou CD35), qui est un récepteur du C3b, sur les fibroblastes. Comme
décrit dans l’introduction, le C3b est un fragment relargué après le clivage du fragment
C3. Le C3b est aussi appelé opsonine, car il est impliqué dans phagocytose médiée par
le Complément, autrement dit l’opsonisation. Le dépôt de C3b sur les pathogènes
permet, via le CR1, de déclencher la phagocytose. Une des caractéristiques principales
de ce phénomène est l’internalisation des pathogènes par des phagocytes
professionnels dans des phagosomes. Le pH à l’intérieur de ces vésicules va

119
progressivement diminuer au fur et à mesure que des lysosomes vont fusionner avec
celles-ci. L’acidité interne des phago-lysosomes va permettre l’élimnation efficace des
pathogènes.

De cette manière, nous pourrions étudier la fixation du C3b sur les bactéries
cariogènes S. mutans et S. sanguis par immunofluorescence, ou par cytométrie de flux.
Afin d’étudier le phénomène de phagocytose par les fibroblastes pulpaires, nous
pourrions utiliser un marqueur de pH (pHRodoTM) qui devient fluorescent quand
l’acidité augmente. Ainsi, nous souhaiterions proposer un modèle de phagocytose de
bactéries cariogènes, marquées au pHRodoTM, par les fibroblastes pulpaires
préalablement ensemencés. L’origine du C3b, permettant la phagocytose, pourra être
une protéine recombinante, ou alors provenant de la sécrétion des fibroblastes
pulpaires eux-mêmes, suite à la stimulation des bactéries cariogènes. La phagocytose
pourra ensuite être suivie par microscopie à fluorescence.

De plus, il serait intéressant de savoir si les fibroblastes, comme certaines

cellules immunitaires, sont en mesure de migrer vers un site contenant des bactéries
cariogènes. Nous pourrions proposer une étude en matrice de collagène de type
Matrigel. Sur une lame en verre 1 puit, nous pourrions déposer une fine couche de
matrigel au fond de la lame. Des bactéries cariogènes pourront ensuite être déposées
d’un côté de la lame, et des fibroblastes pulpaires ensemencés du côté opposé. Les
bactéries et les fibroblastes pulpaires seront déposés dans une goutte de Matrigel.
Ainsi, la migration des fibroblastes pourra être appréciée par mircoscopie optique.

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Journal of Dental Research
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Can Pulp Fibroblasts Kill Cariogenic © International & American Associations
for Dental Research 2015

Bacteria? Role of Complement Activation Reprints and permissions:

sagepub.com/journalsPermissions.nav
DOI: 10.1177/0022034515611074
jdr.sagepub.com

C. Jeanneau1, P. Rufas1, C. Rombouts1, T. Giraud1,2, J. Dejou1,2,

and I. About1

Abstract
Complement system activation has been shown to be involved in inflammation and regeneration processes that can be observed
within the dental pulp after moderate carious decay. Studies simulating carious injuries in vitro have shown that when human pulp
fibroblasts are stimulated by lipoteichoic acid (LTA), they synthetize all complement components. Complement activation leads to the
formation of the membrane attack complex (MAC), which is known for its bacterial lytic effect. This work was designed to find out
whether human pulp fibroblasts can kill Streptococcus mutans and Streptococcus sanguinis via complement activation. First, histological
staining of carious tooth sections showed that the presence of S. mutans correlated with an intense MAC staining. Next, to simulate
bacterial infection in vitro, human pulp fibroblasts were incubated in serum-free medium with LTA. Quantification by an enzymatic assay
showed a significant increase of MAC formation on bacteria grown in this LTA-conditioned medium. To determine whether the MAC
produced by pulp fibroblasts was functional, bacteria sensitivity to LTA-conditioned medium was evaluated using agar well diffusion
assay and succinyl dehydrogenase (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide [MTT]) assay. Both assays showed that
S. mutans and S. sanguinis were sensitive to LTA-conditioned medium. Finally, to evaluate whether MAC formation on cariogenic bacteria,
by pulp fibroblasts, can be directly induced by the presence of these bacteria, a specific coculture model of human pulp fibroblasts and
bacteria was developed. Immunofluorescence revealed an intense MAC labeling on bacteria after direct contact with pulp fibroblasts.
The observed MAC formation and its lethal effects were significantly reduced when CD59, an inhibitor of MAC formation, was added.
Our findings demonstrate that the MAC produced by LTA-stimulated pulp fibroblasts is functional and can kill S. mutans and S. sanguinis.
Taken together, these data clearly highlight the function of pulp fibroblasts in destroying cariogenic bacteria.

Keywords: carious decay, inflammation, membrane attack complex, dental pulp, Streptococcus mutans, microbial viability

Introduction the required signals for eliminating invading pathogens and

altered host cells. The complement system can be activated
It has long been established that bacterial infiltration through mainly by infectious agents but also by traumatic injuries. Its
the dentin into the pulp leads to tooth decay and pulp inflamma- activation, through 3 main pathways—the classic pathway, the
tion. During the decay process and after enamel destruction, alternative pathway, and the lectin pathway (Murphy 2012)—
bacteria and their toxins reach the odontoblasts, which express leads to the production of potent inflammatory mediators, the
Toll-like receptors, Nod-like family receptors, and transient formation of the cytolytic membrane attack complex (MAC)
potential channel receptors, by which these cells recognize bac- (Tomlinson 1993), and the recruitment of immune cells by the
teria to control inflammation and pain (El Karim et al. 2011; release of anaphylatoxins such as C3a and C5a (Ehrengruber
Keller et al. 2011; Farges et al. 2013). The continuous progres- et al. 1994; Hartmann et al. 1997; Nataf et al. 1999). Moreover,
sion of cariogenic bacteria leads to a partial destruction of this recent studies have connected complement activation in cari-
protective odontoblast cell layer and allows bacteria to reach ous lesions to early steps of dentin-pulp regeneration. Indeed,
the pulp. While severe tooth decays often lead to pulp necrosis, it has been demonstrated that complement activation is
under mild/moderate carious decays, a dentin bridge can be involved in pulp progenitor cell recruitment. This migration
observed in vivo. This bridge protects the healthy pulp and sep- seems to be guided by a gradient of complement soluble active
arates it from the bacterial invasion (Kidd and Fejerskov 2004).
This raises questions about the mechanisms involved in dentin
bridge formation and those involved in arresting the bacterial 1
Aix Marseille Université, CNRS, ISM UMR 7287, Marseille, France
progression and the resulting associated pulp inflammation. 2
APHM, Hôpital Timone, Service d’Odontologie, Marseille, France
The complement system, a crucial component of innate
Corresponding Author:
immunity and inflammation (Ricklin et al. 2010; Sarma and I. About, Institut des Sciences du Mouvement (ISM), UMR 7287 CNRS
Ward 2011), is among the most rapid and powerful cascades in & Université d’Aix-Marseille, Faculté d’Odontologie, 27 BD Jean Moulin,
the plasma. It has long been recognized that after infection or 13385 Marseille cedex 5, France.
tissue damage, the complement system immediately provides Email: imad.about@univ-amu.fr

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146
2 Journal of Dental Research
fragment C5a (Chmilewsky et al. 2013; Chmilewsky, Jeanneau,
Dejou, et al. 2014) from their niches to the injured site (Shi and
Gronthos 2003; Téclès et al. 2005).
Investigation of complement system activation has demon-
strated human pulp fibroblasts to be the first nonimmune cells
capable of producing all components required for efficient
complement system activation (Chmilewsky, Jeanneau,
Laurent, et al. 2014). Reverse transcription–polymerase chain
reaction analyses have demonstrated that under serum-free
condition, primary cultures of human pulp fibroblasts express
all complement proteins. Stimulation of human pulp fibro-
blasts with lipoteichoic acid (LTA), a complex component of
Gram-positive bacteria cell wall, leads to the release of C5a
fragment and the formation of MAC (Chmilewsky, Jeanneau,
Dejou, et al. 2014). Taken together, these data indicate that
complement activation can be simultaneously involved both in
the initiation of dentin-pulp regeneration process via C5a pro-
duction and in the control of inflammation via the cytolytic
MAC formation. These studies suggest that Gram-positive car-
iogenic bacteria, such as Streptococcus mutans (Loesche 1986;
Martin et al. 2002) and Streptococcus sanguinis (Kidd and
Beighton 1996; Bourbia et al. 2013), could activate the com-
plement produced by pulp fibroblasts (Chmilewsky, Jeanneau,
Dejou, et al. 2014). Our hypothesis was that Gram-positive
cariogenic bacteria may induce complement activation by pulp
fibroblasts and that the produced MAC is able to directly kill
these cariogenic bacteria.
Materials and Methods
Reagents
Cell culture materials and reagents were obtained from
Dominique Dutscher (Brumath, France). Fetal bovine serum
(FBS) was from Life Technologies (Saint-Aubin, France).
MAC antibody, fibroblast surface protein 1 (Fsp-1) antibody,
S. mutans antibody, and all isotype controls were obtained
from Abcam (Paris, France). Secondary antibodies were
obtained from Life Technologies (Saint-Aubin, France).
Chemicals were from Carlo-Erba (Val-de-Reuil, France).
Molar Teeth Collection
Human immature third molars, freshly extracted for orthodon-
tics reasons, and carious teeth were obtained in compliance
with French legislation (informed patient consent and institu-
tional review board approval of the protocol used). Teeth were
fixed and routinely processed as described (Téclès et al. 2005).
Immunohistochemistry
Before teeth were stained, antigen retrieval was performed at
98°C for 30 min in 1 mM Tris/0.1 mM ethylenediaminetet-
raacetic acid (EDTA)/0.5% Tween, and nonspecific binding
sites were blocked with phosphate-buffered saline (PBS)/0.25%
casein for 15 min at room temperature. Sections from carious
teeth were incubated for 1 h at room temperature with rabbit
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immunoglobulin G (IgG) anti-human MAC (50 µg/mL) or con-
trol IgG, followed by secondary antibody Alexa Fluor 488 goat
anti-rabbit IgG (2 mg/mL) for 45 min. After washing steps in
PBS, the same tooth sections from carious teeth were incubated
for 1 h at room temperature with rabbit IgG anti–S. mutans
(50 µg/mL) or control IgG, followed by secondary antibody
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (2 mg/mL), and with
1 mg/mL 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) counterstain
for 45 min. Some sections were stained with hematoxylin-eosin
(H&E) or a tissue Gram stain kit (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, USA) according to the manufacturer’s instructions.
Primary Pulp Cell Cultures
Human pulp cells were prepared from immature third molars,
freshly extracted for orthodontics reasons in compliance with
French legislation, by the explant outgrowth method (About
et al. 2000). Cells were cultured in minimum essential medium
(MEM) supplemented with 10% FBS, L-glutamine 2 mM,
gentamycin 50 µg/mL, and amphotericin B 0.25 µg/mL at
37°C in a 95% air:5% CO2 atmosphere.
Pulp Fibroblast Isolation and Characterization
by Immunofluorescence
Pulp fibroblasts were isolated from primary pulp cell cultures as
previously described (Chmilewsky, Jeanneau, Dejou, et al.
2014). For detection by fluorescence microscopy, cells were
grown in 8-well glass culture chambers to 70% confluence. For
detection by flow cytometry, 106 cells were washed in PBS,
trypsinized, and resuspended in 1 mL of PBS. For both, cells
were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) for 15 min at 4°C,
and nonspecific binding sites were blocked with 1% bovine
serum albumin (BSA) for 1 h. Then cells were incubated for 1 h
with 2 mg/mL mouse IgM anti-human Fsp-1 or the control IgM
isotype. After washing, the cells were incubated 45 min with
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgM (2 mg/mL) and with 1 mg/mL
DAPI counterstain for fluorescence microscopy.
LTA Stimulation of Human Pulp Fibroblasts
Human pulp fibroblasts were grown in 12-well plates. At sub-
confluence, cells were washed 3 times with PBS and then incu-
bated in 500 µL of serum-free medium per well with or without
LTA (Invitrogen, San Diego, CA, USA) (1 µg/mL). After
20 min, the supernatants were harvested and used for the fol-
lowing experiments. This supernatant is called LTA or LTA-free
conditioned medium in the next steps (Fig. 1).
Gram-positive Bacteria Culture
Strains of S. mutans (ATCC No. 31383) and S. sanguinis
(ATCC No. BAA-1455) were obtained from ATCC (Manassas,
VA, USA). A single colony of each strain was isolated from
Columbia agar (COS) (BioMérieux, Marcy l’Etoile, France)
plate cultures and subcultured in Lennox Broth base (LB)
medium (Life Technologies).
147
Can Pulp Fibroblasts Kill Cariogenic Bacteria?
MAC Enzymatic Detection
Bacteria were cultured into 96-well plates at 106 cells/mL in
LB medium (25 µL) and LTA or LTA-free conditioned medium
(25 µL), with or without CD59 (R&D Systems, Lille, France)
(6 mg/mL), an inhibitor of MAC formation. After 30 min of
incubation at 37°C, bacteria were washed with PBS and fixed
with 4% PFA for 30 min at 4°C. Then, nonspecific binding
sites were blocked with 1% BSA for 45 min. Bacteria were
coincubated for 1 h with rabbit IgG anti-human MAC (50 mg/mL)
and visualized by biotinylated anti-rabbit IgG (2 µg/mL, 2 h)
followed by streptavidin–horseradish peroxidase (20 min)
and 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) substrate solution
(20 min) (BD Biosciences, Le Pont de Claix, France). Optical
densities were measured at 650 nm and recorded with a micro-
plate reader (S960; Metertech, Taipei, Taiwan) (Fig. 1).
Agar Well Diffusion Assay
The antibacterial activity of the samples was determined by
using the agar well diffusion method (Fig. 1). S. mutans and
S. sanguinis, grown to a density of a 0.5 MacFarlane Standard
in LB medium, were spread over the surface of 100-mm COS
agar plates. The excess inoculum was aspirated, and the plate
surface was dried by placing the plate in an incubator (37°C)
for 15 min. Plates inoculated with the bacteria had 6-mm wells
cut into the surface of the agar using a cork borer. The wells
were filled with 100 µL of each conditioned media (with or
without 6 mg/mL CD59). All plates were incubated (37°C)
overnight. The presence of a clear zone around the sample
solution containing wells was analyzed.
MTT Quantification Assay
Bacteria viability has been investigated using 3-(4,5-dimethyl-
thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) quanti-
fication assay (Tunney et al. 2004; Wang et al. 2010). Bacteria
were cultured into 96-well plates at 106 cells/mL in LB medium
(25 µL) and LTA or LTA-free conditioned medium (25 µL),
with or without CD59 (6 mg/mL), and were incubated over-
night to allow bacterial growth. After PBS washing, bacteria
were incubated with 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl
tetrazolium bromide (50 mg/mL) (Sigma-Aldrich) and incu-
bated for 2 h at 37°C. Supernatants were removed, and 100 µL
of dimethyl sulfoxide 100% was added to each well. For each
well, absorbance at 550 nm was recorded with a microplate
reader. Results were expressed as the percentage absorbance of
experimental versus untreated bacteria (Fig. 1).
MAC Immunofluorescence Staining on
Bacteria/Pulp Fibroblasts Coculture
Pulp fibroblasts were grown in 8-well glass culture chambers
to 50% confluence. Cells were rinsed with PBS and cultured
with 106 bacteria per milliliter, in serum-free MEM medium,
for 0 or 30 min at 37°C. Cells and bacteria were fixed with 4%
PFA for 20 min at 4°C. Then, nonspecific binding sites were
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3
Figure 1. Experimental procedure. To simulate a bacterial infection in
vitro, human pulp fibroblasts were incubated in serum-free medium with
or without lipoteichoic acid (LTA). The supernatants were harvested
and are designated conditioned medium for following experiments.
Bacteria were grown in conditioned media, and the presence of
membrane attack complex (MAC) on their surface was quantified by an
enzymatic assay. To determine whether the MAC produced by human
pulp fibroblasts is functional, we tested bacteria sensitivity to LTA-
conditioned medium using the agar well diffusion method. To quantify
bacterial growth inhibition, a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl
tetrazolium bromide (MTT) assay was used.
blocked with 1% BSA for 45 min. Cells and bacteria were coin-
cubated for 1 h with rabbit IgG anti-human MAC (5 mg/mL) and
mouse IgM anti-human Fsp-1 (2.5 mg/mL) or the respective
isotypes. After washing, the cells were incubated 45 min with
Alexa Fluor 594 anti-rabbit IgG (2 mg/mL), Alexa Fluor 488
anti-mouse IgM (2 mg/mL), and 1 mg/mL DAPI counterstain
for fluorescence microscopy.
Statistical Analysis
All experiments were repeated at least 3 times, and statistical
significance (P < 0.05) was determined using Student’s t test to
compare the different treatments and their respective controls.
Data are expressed as means ± standard deviation.
Results
Complement Activation In Vivo Is Correlated
With Presence of S. Mutans
A partial destruction of the dentin could be observed at the cari-
ous site. This was illustrated on histological images by partial
dentin tissue loss and bacterial infiltration into dentin tubules.
Reparative dentin secretion was observed under the carious site,
and the pulp tissue had a sound appearance (Fig. 2A, B). Gram-
positive bacteria were detected in dentin tubules of carious teeth
sections (Fig. 2B). Immunofluorescence staining was used to
identify S. mutans on the same teeth. Intense labeling was
observed at the injured site of carious teeth (Fig. 2C). At higher
magnification, the presence of S. mutans in dentin tubules was
observed (Fig. 2E) and correlated with an intense MAC staining
(Fig. 2F, G). The presence of Gram-positive bacteria S. mutans
in the dentin is correlated with complement activation in human
carious teeth and MAC formation.
148
4 Journal of Dental Research
Figure 2. Detection of Streptococcus mutans in human carious teeth
sections. Representative images of hematoxylin-eosin staining
(A) and Gram staining (B) on carious teeth. The section shows a
partially destroyed dentin by the carious lesion, bacterial infiltration into
the dentin, reparative dentin synthesis, and a sound pulp tissue. Intense
purple labeling, indicative of the presence of Gram-positive bacteria,
was observed in carious teeth (B). (C–H) Immunostaining of S. mutans
(red) and MAC (green) in carious teeth (C, E, F, G) and isotype controls
(D, H). Nuclei were counterstained with 4′,6-diamidino-2-phenylindole
(DAPI) (blue). Intense S. mutans labeling was observed at the injured site
of carious teeth (C), which is clearly visible at higher magniication in
dentin tubules (E), correlated with an intense membrane attack complex
(MAC) staining (F, G). G is a merge of E and F. Arrowheads indicate
caries lesions; asterisk indicates reparative dentin; d, dentin; p, pulp.
Scale bars: 500 µm (A, B, C, D), 50 µm (E, F, G, H).
LTA Stimulation of Human Pulp Fibroblasts
Leads to MAC Formation on Cariogenic Gram-
positive Bacteria, S. Mutans and S. Sanguinis
Immunofluorescence analysis by microscopy (Fig. 3A, B) or
flow cytometry (Fig. 3C) showed that all cells used in these
experiments expressed Fsp-1, and hereafter these cells are des-
ignated as pulp fibroblasts.
When cariogenic bacteria were incubated for 30 min with
LTA-conditioned medium obtained from pulp fibroblast cul-
tures, a significant increase of MAC fixation on both S. mutans
and S. sanguinis was observed by the enzymatic assay (Fig. 3D).
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This increase was 5-fold higher than that obtained with LTA-
free conditioned medium. When CD59 was added to the LTA-
conditioned medium, MAC fixation on both S. mutans and S.
sanguinis was significantly inhibited. Addition of CD59 to
LTA-free medium had no effect on MAC synthesis or fixation
on S. mutans and S. sanguinis (data not shown).
MAC Produced by LTA-stimulated Human
Pulp Fibroblasts Is Functional and Kills
S. Mutans and S. Sanguinis
To determine whether MAC produced by human pulp fibro-
blasts is functional, we tested bacteria sensitivity to LTA-
conditioned medium using the agar well diffusion method (Fig.
4A). Growth of S. mutans and S. sanguinis around the wells
filled with LTA-free conditioned medium was homogeneous,
showing the absence of any growth inhibitory effect. However,
when bacteria were subjected to LTA-conditioned medium, a
growth inhibition was observed with both S. mutans and
S. sanguinis. This is clearly visible in bacteria culture plates by
the absence of bacterial growth around the wells containing the
LTA-conditioned medium. When bacteria were coincubated
with LTA-conditioned medium and CD59, this inhibition zone
almost disappeared with both S. mutans and S. sanguinis.
These results correlate well with the MTT-quantified viabil-
ity of these bacteria under the same conditions (Fig. 4B).
Indeed, LTA-conditioned medium significantly decreased bac-
teria viability of both S. mutans and S. sanguinis, as determined
by the MTT assay. Adding CD59 to the LTA-conditioned
medium abolished the abovementioned decrease in bacterial
viability. CD59 added to LTA-free medium had no effect on
bacterial growth.
S. Mutans and S. Sanguinis Directly Induce
Production of MAC by Human Pulp Fibroblasts
To determine whether these Gram-positive cariogenic bacteria
were able to directly induce complement protein production by
human pulp fibroblasts, MAC formation was evaluated in
cocultures of human pulp fibroblasts and S. mutans or S. san-
guinis. No MAC formation was detected on control cocultures
fixed immediately after adding bacteria on cells (Fig. 5A, E, I,
M). However, after coculture for 30 min, an intense MAC label-
ing was observed on bacteria (Fig. 5B, F, J, N). The formation
of MAC on bacteria was confirmed by a significant decrease in
MAC labeling when CD59, used as a MAC formation inhibitor,
was added to the coculture (Fig. 5C, G, K, O). No labeling was
observed with control isotypes (Fig. 5D, H, L, P).
Discussion
This work demonstrates clearly that cariogenic bacteria stimu-
late local complement synthesis by pulp fibroblasts and pro-
duction of a functional MAC that inhibits cariogenic bacterial
growth.
149
Can Pulp Fibroblasts Kill Cariogenic Bacteria?
Figure 3. Characterization of human pulp fibroblast by
immunofluorescence. Fibroblast surface protein 1 (Fsp-1) (green)
was detected by immunofluorescence microscopy on the cell surface
(A); no immunostaining was observed in the control condition with a
control isotype (B). Nuclei were counterstained with 4′,6-diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (blue). Representative flow cytometry histograms
of Fsp-1 staining performed on pulp fibroblasts (C). The fluorescence
profile of Fsp-1–positive cells (green) is significantly shifted to the
right of the control (gray) (*P < 0.05, n = 3). (D) Enzymatic detection
of membrane attack complex (MAC) formation on cariogenic Gram-
positive bacteria, Streptococcus mutans, and Streptococcus sanguinis. After
contact of cariogenic bacteria with lipoteichoic acid (LTA)–conditioned
medium, a significant increase of MAC fixation on bacteria was observed
compared with that detected in LTA-free medium. This fixation was
inhibited upon coincubation of bacteria with CD59 (*P < 0.05, n = 3).
Previous work has reported pulp fibroblasts as the only
nonimmune cells capable of synthetizing all complement pro-
teins and subsequent complement activation (Chmilewsky,
Jeanneau, Dejou, et al. 2014). This activation has been demon-
strated by the production of C5a, which is one of the comple-
ment biologically active fragments, by pulp fibroblasts.
Recently, it has been demonstrated that this fragment is
involved in one of the early steps of dentin-pulp regeneration,
namely, the selective recruitment of pulp progenitor cells to the
C5a production site following a gradient (Chmilewsky et al.
2013). It should be remembered, however, that dentin-pulp
regeneration occurs after the elimination of cariogenic bacteria
or, at least, after the arrest of their progression toward the pulp.
With this in mind, we examined whether complement activa-
tion in the dental pulp is also involved in cariogenic bacteria
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5
Figure 4. Determination of Streptococcus mutans and Streptococcus
sanguinis sensitivity to membrane attack complex (MAC) produced
by lipoteichoic acid (LTA)-stimulated human pulp fibroblasts. (A)
Representative images of agar well diffusion assay. S. mutans and
S. sanguinis were resistant to LTA-free conditioned medium but
sensitive to LTA-conditioned medium. Furthermore, proliferation
sensitivity decreased after addition of CD59 to LTA-conditioned
medium. (B) Quantification of S. mutans and S. sanguinis sensitivity using
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)
assay. The number of living bacteria detected after incubation with both
CD59 and LTA-conditioned medium was signiicantly higher (*P < 0.05,
n = 3) than that without CD59.
growth inhibition. Beside C5a production, MAC formation is
another end-product of complement activation. This complex
is known for its capacity to induce cytolysis via its direct fixa-
tion on bacteria walls (Berends et al. 2013; Berends et al.
2015). To check whether this complex is formed in carious
teeth, we first examined the presence, in vivo, of cariogenic
S. mutans and demonstrated their presence at the carious site.
This result is in agreement with previous work which reported
the presence of S. mutans in carious lesions by taking samples
from carious sites followed by in vitro cultures or identifica-
tion by polymerase chain reaction (Loesche 1986; Martin et al.
2002). Surprisingly, and to the best of our knowledge, our
work is the first to demonstrate S. mutans directly in carious
tissue histological sections. Interestingly, immunofluorescence
revealed that MAC was localized on S. mutans in carious teeth
as demonstrated by double-immunofluorescence of both anti-
bodies directed against MAC and to S. mutans. In this work,
150
6 Journal of Dental Research

Figure 5. Streptococcus mutans and Streptococcus sanguinis directly induce membrane attack complex (MAC) production by human pulp fibroblasts.
Immunofluorescence double staining was used to visualize fibroblast surface protein 1 (Fsp-1) in green and MAC in red at 0 min (A, E, I, M) and
30 min (B–D, F–H, J–L, N–P) of cocultures of human pulp fibroblast and S. mutans or S. sanguinis in the absence (A, B, E, F, I, J, M, N) or presence (C,
G, K, O) of CD59. Cocultures of fibroblasts and bacteria can be observed in all conditions on phase-contrast images (E–H, M–P). No immunostaining
was observed in control conditions (A, E, I, M) or with an isotype (D, H, L, P). An intense MAC red labeling was observed on bacteria after 30 min of
coculture (B, J). The formation of MAC on bacteria was confirmed by a signiicant decrease in staining upon addition of CD59 in the cocultures (C, K).
Scale bars: 500 µm.

MAC localization was investigated only on S. mutans in cari-
ous teeth because antibodies to S. sanguinis are not commer-
cially available.
The observed MAC fixation on cariogenic bacteria in our
work in vivo could be due to complement activation from
plasma as observed in all other tissues (Brodsky 2015). To
check whether pulp fibroblasts themselves produce all ele-
ments required for the formation of a functional MAC, the
cells were incubated in serum-free medium with LTA, a motif
of Gram-positive bacteria. An enzymatic detection assay was
specifically developed to quantify MAC formation directly on
cariogenic bacteria, which were cultured in conditioned
medium obtained from LTA-stimulated pulp fibroblasts. This
assay demonstrated the direct fixation of MAC on S. mutans
and S. sanguinis in vitro. When these cariogenic bacteria were
coincubated with CD59, a MAC formation inhibitor, in
LTA-conditioned medium, MAC fixation was drastically
reduced indicating the specificity of MAC fixation on these
cariogenic bacteria.
Next, we evaluated the effect of MAC fixation on S. mutans
and S. sanguinis viability in a qualitative and quantitative man-
ner using the agar well diffusion method and the MTT assay,
respectively. With the first method, we demonstrated that MAC
fixation on both S. mutans and S. sanguinis led to growth inhi-
bition. This qualitative finding correlates with the quantitative
MTT assay, which showed a significant decrease in bacterial
viability. LTA-conditioned medium containing CD59, an
inhibitor of MAC formation used as control in both assays,
confirmed that the observed growth inhibition and decreased
bacterial viability are indeed directly linked to a specific MAC
fixation on cariogenic bacteria walls. To further demonstrate
this direct MAC fixation on bacteria walls and subsequent

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151
Can Pulp Fibroblasts Kill Cariogenic Bacteria?
destruction of bacteria directly by pulp fibroblasts via comple-
ment activation, a specific eukaryote/prokaryote culture tech-
nique was developed. For this purpose, pulp fibroblasts were
plated in serum-free medium, and cariogenic bacteria were
then added to these cells followed by immunofluorescence
labeling of Fsp-1 and MAC. Our data show that MAC forma-
tion was clearly visible after 30 min on bacteria in the cocul-
tures on both S. mutans and S. sanguinis. Adding CD59 to this
coculture inhibited MAC formation on these bacteria. Although
the production levels of all complement components were not
determined directly, this coculture system indicates that when
pulp fibroblasts are subjected to cariogenic bacteria, they pro-
duce the complement components required for direct MAC
fixation on cariogenic bacteria. In this work, we tested MAC
fixation and functional activity on Gram-positive cariogenic
bacteria. It should be noted that some Gram-negative bacteria
(Martin et al. 2002) are also cariogenic. Although Gram-
negative cariogenic bacteria were not included in our work, we
speculate that MAC fixation and function would be similar to
what has been reported in other studies (Tomlinson et al. 1989;
Berends et al. 2015). Overall, our work clearly shows that pulp
fibroblasts play a significant role in the control of the bacterial
progression and the inflammatory process. As such, it partly
elucidates why dentin regeneration can be observed directly
under carious lesions and how arrested caries can be frequently
observed in vivo.
Many studies have been devoted to understanding the mech-
anisms underlying the pulp/dentin inflammation/regeneration
relationships, and many of these studies focused on the role
played by the odontoblasts. These cells are able to synthesize
mineralized tissues either within the dentin tubules (Massler
1967; Levine 1974; Stanley et al. 1983) or at the pulp periphery
facing the carious/traumatic site (reactionary/reparative dentin).
This tertiary dentin has a significant role in protecting the pulp
from bacteria infiltration (Massler 1967; Silverstone 1973) as
reviewed by Goldberg and Smith (2004). Also, recognition of
LTA/Toll-like receptor-2 leads to odontoblast production of
various proinflammatory chemokines including CCL2, CXCL1,
CXCL2, CXCL8, and CXCL10 and promotes immature den-
dritic cell recruitment and elimination of pathogens (Durand
et al. 2006; Staquet et al. 2008; Farges et al. 2009; Keller et al.
2010; Keller et al. 2011). In line with these reports, our study,
showing cariogenic bacteria growth inhibition, demonstrates
the existence of an additional pulp protection/defense mecha-
nism by pulp fibroblasts via complement activation.
Complement activation by pulp fibroblasts provides a link
between pulp inflammation and its regeneration capacity.
Indeed, while C5a has been demonstrated to be involved in
pulp progenitor recruitment to initiate the regeneration pro-
cess, MAC formation and subsequent pathogen growth inhibi-
tion appear as prerequisites to pulp-dentin regeneration within
the pulp inextensible environment.
Taken together, these data provide valuable information on
the essential functions of pulp fibroblast at the crossroads of
inflammation and regeneration and clearly highlight the poten-
tial targeting of these cells in dentin-pulp regeneration. This
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7
work implies that in cases of reversible pulpitis, clinical out-
come can be improved by maintaining the vitality of the resid-
ual pulp tissue. Indeed, we demonstrate that in addition to its
capacity to synthesize reparative dentin, the remaining pulp
tissue has the potential to protect the pulp by directly inhibiting
cariogenic bacterial growth. As a consequence, pulp inflamma-
tion will decrease, and this is a prerequisite to dentin-pulp
regeneration.
Author Contributions
C. Jeanneau, contributed to conception, design, data acquisition,
analysis, and interpretation, drafted and critically revised the man-
uscript; P. Rufas, contributed to data acquisition, analysis, and
interpretation, drafted the manuscript; C. Rombouts, contributed
to data analysis and interpretation, drafted and critically revised
the manuscript; T. Giraud, contributed to data acquisition, drafted
the manuscript; J. Dejou, contributed to data interpretation, criti-
cally revised the manuscript; I. About, contributed to conception,
design, data analysis, and interpretation, drafted and critically
revised the manuscript. All authors gave final approval and agree
to be accountable for all aspects of the work.
Acknowledgments
The authors thank Dr. Jean-Charles Gardon for providing the third
molars used in this work. This work was supported by institutional
funding from Aix-Marseille University and CNRS. The authors
declare no potential conflicts of interest with respect to the author-
ship and/or publication of this article.
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153

Complement C3a Mobilizes Dental Pulp Stem
Cells and Specifically Guides Pulp Fibroblast
Recruitment
Pierre Rufas, MSc,* Charlotte Jeanneau, PhD,* Charlotte Rombouts, PhD,*
Patrick Laurent, PhD,*† and Imad About, PhD*
Abstract
Introduction: Complement activation is considered a
major mechanism in innate immunity. Although it is
mainly involved in initiating inflammation, recent data
reported its involvement in other processes such as tis-
sue regeneration. In the dental pulp, complement C5a
fragment has been shown to be involved in the recruit-
ment of dental pulp stem cells (DPSCs). This study
sought to investigate the possible role of C3a, another
complement fragment, in the early steps of dentin-
pulp regeneration. Methods: Expression of C3a recep-
tor (C3aR) was investigated by immunofluorescence
and reverse transcriptase polymerase chain reaction
on cultured pulp fibroblasts, STRO-1–sorted DPSCs, as
well as on human tooth sections in vivo. The effect
of C3a on proliferation of both DPSCs and pulp fibro-
blasts was investigated by MTT assay. Cell migration
under a C3a gradient was investigated by using
microfluidic chemotaxis chambers. Results: C3aR was
expressed in vivo as well as in cultured pulp fibroblasts
co-expressing fibroblast surface protein and in DPSCs
co-expressing STRO-1. Addition of recombinant C3a
induced a significant proliferation of both cell types.
When subjected to a C3a gradient, DPSCs were mobi-
lized but not specifically recruited, whereas pulp fibro-
blasts were specifically recruited following a C3a
gradient. Conclusions: These results provide the first
demonstration of C3aR expression in the dental pulp
and demonstrate that C3a is involved in increasing
DPSCs and fibroblast proliferation, in mobilizing DPSCs,
and in specifically guiding fibroblast recruitment. This
provides an additional link to the tight correlation be-
tween inflammation and tissue regeneration. (J Endod
2016;42:1377–1384)
Key Words
Chemotaxis, complement, dentin-pulp, microfluidics,
regeneration
From the *Aix Marseille Universit!e, CNRS, ISM, Institute of Movement Sciences; and †APHM, Service d’Odontologie, H^opital Timone, Marseille, France.
Address requests for reprints to Prof Imad About, Institut des Sciences du Mouvement (ISM), UMR 7287 CNRS and Universit!e d’Aix-Marseille, Facult!e d’Odontologie,
27 BD Jean Moulin, 13385 Marseille, France. E-mail address: imad.about@univ-amu.fr
0099-2399/$ - see front matter
Copyright ª 2016 Published by Elsevier Inc, on behalf of American Association of Endodontists.
http://dx.doi.org/10.1016/j.joen.2016.06.011
JOE — Volume 42, Number 9, September 2016
Regenerative Endodontics
D eep pulp traumatic
injuries and carious
lesions often lead to odon-
Significance
Knowledge from this work could contribute in the
development of therapeutic agents to target pulp
toblast destruction and
fibroblasts to locally synthetize C3a. This could
fibroblast injury. After an
be used in future tissue engineering strategies for
inflammatory stage, a new
enhancing dentin-pulp regeneration.
generation of odontoblast-
like cells is required to
initiate pulp/dentin complex regeneration (1). This process requires the presence of
dental pulp stem cells (DPSCs) and their proliferation and migration from the perivas-
cular niche to the injury site (2, 3). This also requires proliferation of pulp fibroblasts at
the injured site or their recruitment from adjacent sites to replace the missing pulp. These
initial steps are critical in dentin/pulp regeneration. In a final step, the damaged dentin is
then replaced by a reparative dentin secreted by newly differentiated odontoblast-like
cells from DPSCs.
Complement system belongs to the innate immune system and plays a major role
in inflammation and immunity (4, 5). More than 40 proteins orchestrate versatile
functions of the complement system. They notably allow clearance of immune
complexes and damaged cells, trigger destruction of pathogens, and induce the
recruitment of immune cells (6). This proteolytic cascade rapidly releases various
inflammatory mediators such as anaphylatoxins (C3a, C4a, and C5a) and leads to
the formation of membrane attack complex C5b-9 on the pathogen surface (6, 7). It
has been demonstrated that carious injury, which is the most common human
pathologic condition, activates the complement system. In addition, under bacterial
stimulation, pulp fibroblasts have been shown as the first non-immune cells that secrete
all functional complement proteins (8). After complement activation, recent data have
shown that cariogenic bacterial growth is inhibited by membrane attack complex for-
mation. Furthermore, C5a secretion induces DPSC migration in a gradient-dependent
manner (9, 10).
C3a is another complement component released at the early beginning of the com-
plement activation cascade. C3a is a small peptide of 77 amino acids that binds its
cognate receptor, the C3a receptor (C3aR) (11, 12). C3a is known to induce
migration and activation of leukocytes, trigger smooth muscle cell contraction, and
increase endothelial permeability (13–16). C3aR belongs to the G-protein coupled
receptor family. It has been clearly established that C3aR is widely expressed by
many immune and non-immune cells (17). The large distribution of C3aR within
most tissues allows C3a to act efficiently during tissue development and regeneration.
It has been shown that C3a fragment is involved in embryonic chick retina regeneration
Complement C3a Initiates Dentin/Pulp Regeneration 1377
154
Regenerative Endodontics
(18) by stimulating resident stem/progenitor cells. Furthermore, a
study on collective cell migration showed that complement C3a gradient
can co-attract cohesive clusters of migrating mesenchymal stem cells
(MSCs) during neural crest formation (19). Similarly, it has been
reported that human MSCs are chemoattracted by C3a and C5a to injury
sites, where mobilization and recruitment of MSCs are required for
wound healing (20). Thus, C3a/C3aR interactions represent one of
the major pathways involved in tissue regeneration. However, little is
known about its involvement during pulp/dentin complex regeneration.
This study was sought to check whether C3a could be involved in the
initial steps of dentin-pulp regeneration.
Materials and Methods
Reagent
Cell culture materials and reagents were from Dominique
Dutscher (Brumath, France). C3aR, fibroblast surface protein (FSP)
antibodies, and all isotype controls were from Abcam (Paris, France).
STRO-1 antibodies and recombinant human C3a were from R&D Sys-
tems (Lille, France). Secondary antibodies were obtained from Life
Technologies (Saint-Aubin, France). Chemicals were from Carlo-Erba
(Val-de-Reuil, France).
Immunohistochemistry
Pulps were extracted from human immature third molars that
were freshly extracted for orthodontic reasons in compliance with
French legislation (informed patients’ consent and institutional review
board approval of the protocol used). Pulps were fixed and routinely
processed as described (3). Before pulp sections were stained, antigen
retrieval was performed as described (9). Sections were incubated for
2 hours at room temperature with mouse immunoglobulin Ig M anti-
human FSP (5 mg/mL) and rabbit IgG anti-human C3aR (2 mg/mL)
or control isotypes. This was followed by 45-minute incubation with
secondary antibody Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (2 mg/mL)
and Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (1.25 mg/mL) and counter-
stained with 1 mg/mL 40 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Some
sections were stained with hematoxylin-eosin.
Primary Pulp Cell Cultures
Primary pulp cells were prepared from immature third molars
by the explant outgrowth method (21). The teeth were obtained
from 3 different donors for each experiment (4 molars/donor).
Pulp cells were cultured in minimal essential medium (MEM) as
described (9).
Magnetic Cell Sorting
STRO-1 pulp stem cells were sorted from cell cultures with mouse
anti-human STRO-1 IgM antibodies and immune magnetic beads
according to the manufacturer’s protocol (Dynal, Oslo, Norway). Cell
sorting was performed in triplicate on cell cultures at passages 1–5.
STRO-1–sorted cells are referred to as DPSCs. Each of the following
experiments was performed in triplicate on the same passage (2–6)
on DPSCs versus STRO-1–negative cells.

Figure 1. Expression of C3aR is a common feature of the pulp in vivo. Hematoxylin/eosin (A) and immunofluorescence (B–I) double staining of human pulp
tissue section. Blue and green boxes indicate selected areas for FSP and STRO-1 immunofluorescence double staining. Representative images are given for pulp
tissue sections double stained for FSP (B, green) and C3aR (E, red) and their merge (H). Double staining was performed as well for STRO-1 (C, green) and C3aR
(F, red) and their merge (I). Arrowheads indicate STRO-1–positive cells located in the perivascular region. No immunostaining was observed in controls (D and
G). (A) Scale bar = 200 mm. (B–I) Scale bars = 20 mm.

1378 Rufas et al. JOE — Volume 42, Number 9, September 2016

155
 Regenerative Endodontics

Figure 2. Expression of C3aR on DPSCs and pulp fibroblasts. (A) DPSCs were isolated from human pulp tissue by magnetic positive isolation using STRO-1
antibodies. (a and b) Phase-contrast images of STRO-1–positive fractions. STRO-1–sorted cells formed a characteristic CFU organization in vitro (arrows).
Efficient cell isolation was confirmed by immunofluorescence staining. All STRO-1–sorted cells expressed STRO-1 marker (c, green), compared with the negative
control (d). RT-PCR (e) products from STRO-1–sorted cells for KFL4, NANOG, OCT3/4, and SOX2 confirmed that these were DPSCs. (B) Cells from the STRO-1–
negative fraction were expanded (a and b) and immunostained. These negative cell fractions exhibited intense FSP staining (c, green), compared with the nega-
tive control (d). This indicated that STRO-1–negative cells were mainly fibroblastic. RT-PCR (e) confirmed that STRO-1–negative cells do not express stem cell
markers. (Aa and Ba) Scale bars = 200 mm. (Ab and Bb) Scale bars = 50 mm. (Ac, Ad, Bc, and Bd) Scale bars = 40 mm. Nuclei were stained with DAPI (blue).
GAPDH was used as housekeeping control (continued).

Immunofluorescence Double Staining
Cells were grown in 8-well glass culture chambers. Subconfluent
cells were fixed (4% paraformaldehyde) for 20 minutes at 4! C, and
nonspecific binding sites were blocked with 0.5% bovine serum albu-
min for 1 hour. Then cells were incubated for 2 hours simultaneously
with mouse IgM anti-human STRO-1 (5 mg/mL) or mouse IgM anti-
human FSP (5 mg/mL) and rabbit IgG anti-human C3aR (2 mg/mL)
or control isotypes. After washing, the cells were incubated 45 minutes
with Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM (1.25 mg/mL) and Alexa
Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (1.25 mg/mL) and counterstained with
1 mg/mL DAPI.
Microfluidic Chemotaxis Assays
Migration of pulp fibroblasts and DPSCs was analyzed by using live-
cell tracking in 3-dimensional microfluidic chemotaxis chambers
(IBIDI, Marne-la-Vall!ee, France) as described (9, 22). Cells (2.5 "
106/mL) were seeded in the connecting slit (CS) with or without
1 mmol/L C3aR specific antagonist SB290157 (Merck Millipore,

JOE — Volume 42, Number 9, September 2016 Complement C3a Initiates Dentin/Pulp Regeneration 1379

156
Regenerative Endodontics

Figure 2. (Continued). (C) Immunofluorescence double staining was performed on DPSCs and pulp fibroblasts. DPSCs (a) and pulp fibroblasts (b) showed
high expression of STRO-1 and FSP (green), respectively. Both DPSCs (c) and pulp fibroblasts (d) expressed C3aR (red). Merged pictures show expression of C3aR
on DPSCs (e) and pulp fibroblasts (f), respectively, as compared with negative controls (g and h). Nuclei were counterstained with DAPI (blue). (a, c, e, and g)
Scale bars = 40 mm. (b, d, f, and h) Scale bars = 20 mm. (D) RT-PCR products confirmed C3aR expression in DPSCs (left) and pulp fibroblasts (right). GAPDH
was used as housekeeping control.

1380 Rufas et al. JOE — Volume 42, Number 9, September 2016

157
 Regenerative Endodontics
Nottingham, UK). A gradient of chemoattractant was then created in the
CS by the application of C3a-containing MEM (200 ng/mL) in the first
reservoir and MEM in the second reservoir. Controls were
performed with both reservoirs filled with MEM. Images were taken
every 15 minutes during a period of 48 hours. Migration of 50 cells/
experiment was analyzed with IBIDI Chemotaxis and Migration Tool
2.0 software.

Proliferation Tests
DPSCs and pulp fibroblasts were seeded separately into 96-well
plates at 9000 cells/cm2 and incubated overnight to allow cell attach-
ment and recovery. After washing with phosphate-buffered saline, cells
were stimulated with MEM containing increasing C3a concentrations
(200, 1000, and 2000 ng/mL). After incubation for 3 days, MTT assay
was performed as described (23). Results were expressed as percent-
age of controls (untreated cells).

Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

Total RNAs were isolated from DPSCs and pulp fibroblasts by
using a PureLink RNA mini kit (Life Technologies). RNA samples
(2 mg) were reverse-transcribed by using a reverse transcription
AMV system (Promega, Madison, WI). Primer sequences are listed in
Supplemental Table S1. (Supplemental Table S1 is available online at
www.jendodon.com.) Polymerase chain reaction (PCR) conditions
were performed as described (9).

Statistical Analysis
All experiments were repeated 3 times to compare the different
treatments and their respective controls. Data are expressed as
means ! standard error of the mean. Statistical significance was set
at P < .05.
Results
C3aR Expression in the Human Dental Pulp
Two random areas of the dental pulp were selected from
hematoxylin-eosin sections (Fig. 1A) for immunofluorescence analysis.
Fluorescence images show FSP expression on pulp fibroblasts
(Fig. 1B), whereas STRO-1 is expressed in the perivascular area
(Fig. 1C) as compared with control isotypes (Fig. 1D). C3aR is widely
expressed in the dental pulp cells (Fig. 1E and F) as compared with con-
trol isotypes (Fig. 1G). Merge images show that C3aR is co-expressed
both in fibroblasts (Fig. 1H) and in DPSCs (Fig. 1I).
C3aR Is Expressed in Cultured DPSCs
and Pulp Fibroblasts
After 4 days of culture, STRO-1–sorted cells established colony-
forming units (CFUs) characteristic of stem cells (Fig. 2Aa and b). After
expansion, all expressed STRO-1 marker (Fig. 2Ac) as compared with
negative control (Fig. 2Ad). Reverse transcriptase (RT)-PCR analysis re-
vealed that STRO-1–sorted cells expressed 4 stem cell transcription fac-
tors: KLF4, NANOG, OCT3/4, and SOX2 (Fig. 2Ae). The STRO-1–negative
cell population had a fibroblastic appearance (Fig. 2Ba and b). Immu-
nofluorescence showed that they express FSP (Fig. 2Bc) as compared
with the negative control (Fig. 2Bd). Moreover, RT-PCR did not show
expression of stem cell transcription factors (Fig. 2Be). Therefore,
the STRO-1–sorted cells will be designated as DPSCs and the
STRO-1–negative cells as pulp fibroblasts. All DPSCs and pulp fibro-
blasts expressed C3aR as confirmed on STRO-1/C3aR (Fig. 2Ca, c, e)
Figure 3. C3a induced DPSC and pulp fibroblast proliferation. DSPCs and
pulp fibroblasts were incubated with increasing C3a concentrations for
3 days before MTT assays were performed. Data are expressed as percentage
of control. (A and B) DPSCs and pulp fibroblasts did not show any prolifera-
tion with C3a at 200 ng/mL. However, C3a significantly increased DPSC prolif-
eration at 1000 and 2000 ng/mL. Pulp fibroblast proliferation significantly
increased in C3a medium at 1000 ng/mL. No increase was observed at
2000 ng/mL. Bars represent mean values ! standard error of the mean
(n = 3) (*P < .05).
and FSP/C3aR (Fig. 2Cb, d, f) double immunostaining images as
compared with control isotypes (Fig. 2Cg and h). C3aR was also de-
tected by RT-PCR analysis on both DPSCs and pulp fibroblasts (Fig. 2D).
C3a Induces Fibroblasts and DPSC Proliferation
No increase in cell proliferation was observed when DPSCs and
pulp fibroblasts were incubated with C3a at 200 ng/mL. However, a sig-
nificant increase in DPSC proliferation was observed after 3 days in
response to C3a at 1000 and 2000 ng/mL (P < .05, n = 3) as compared
with the control. C3a induced a significant increase in pulp fibroblast
proliferation at 1000 ng/mL (Fig. 3).
C3a Mobilizes DPSCs and Triggers a Gradient-dependent
Specific Migration of Pulp Fibroblasts
The ability of DPSCs and pulp fibroblasts to migrate following a
gradient of C3a was investigated by using a microfluidic chemotaxis
chamber (Fig. 4A). The spatial averages of all cell positions (x and y
coordinates) correspond to the center of mass (COM) of all cells.
The displacement of COM was the difference between the initial
and the end COM values. For each condition, 1 representative exper-
iment is presented in cell trajectory plots (Fig. 4B). When both

JOE — Volume 42, Number 9, September 2016 Complement C3a Initiates Dentin/Pulp Regeneration 1381

158
Regenerative Endodontics

Figure 4. C3a mobilized DPSCs and provided a specific gradient for pulp fibroblast migration. Cell migration was studied by using 3-dimensional microfluidic
chemotaxis chambers and was recorded by using live-cell tracking microscopy. (A) Schematic (left) and microscopic (right) views of a chemotaxis chamber.
Seeding of pulp fibroblasts into CS is followed by C3a-MEM filling of the right-side reservoir (green). (B) Representative plots of cell migrations submitted to
a C3a gradient. Spatial average positions (x and y coordinates) of cells were used to calculate the COM for each experiment (red dots). (a–c) Representative
plots of DPSCs. Although DPSCs express C3aR, they were mobilized and show random movements but did not migrate under a C3a gradient (b), as illustrated
by the COM central position. (d–f) Representative plots of pulp fibroblasts. C3aR-expressing pulp fibroblasts specifically migrate toward the C3a-filled reservoir
(e). COM shifts on the right side (x axis) in the direction of C3a gradient. In the absence of a C3a gradient (d), COM remains in the plot center, indicating no cell
displacement. (c and f) Presence of the inhibitor SB290157 in the CS clearly reduces random movements of DPSCs (c) and migration of pulp fibroblasts (f),
suggesting a specific effect of C3a. (C) Graphical and statistical analyses of cell migration. When C3a gradient is generated, only the COM of pulp fibroblasts
(b) shows a statistically significant displacement toward the x axis, compared with DPSCs (a). Although no significant displacement was obtained with DPSCs
(c), the FMIx of pulp fibroblast displacements (d) is significantly higher than FMIy, indicating that pulp fibroblasts migrate according to a C3a gradient. Bars
represent mean values ! standard error of the mean (n = 3) (*P < .05).
159
1382 Rufas et al. JOE — Volume 42, Number 9, September 2016

reservoirs were filled with MEM (gray), a random movement of
DPSCs (Fig. 4Ba) and pulp fibroblasts (Fig. 4Bd) was observed;
the COM remained in a central position (red dots). Surprisingly,
when C3a gradient was applied (green), DPSCs showed random
movements but did not migrate (Fig. 4Bb); no COM displacement
was observed (red dot). However, pulp fibroblasts promptly moved
toward C3a filled reservoir as demonstrated by the COM displace-
ment (Fig. 4Be, red dot). Graphical analyses (Fig. 4Ca) of DPSCs
did not reveal any significant COM displacement. However, a signif-
icant statistical difference was clearly observed for pulp fibroblast
COM displacement toward C3a (Fig. 4Cb).
To determine whether DPSCs and pulp fibroblasts migrate accord-
ing to a C3a gradient, forward migration indexes parallel (FMIx) and
perpendicular (FMIy) to the gradient, corresponding to x and y direc-
tions, respectively, were investigated. An FMIx higher than FMIy suggests
that cells migrate following a gradient. Although no statistical signifi-
cance was observed between FMIx and FMIy for DPSCs (Fig. 4Cc),
FMIx of pulp fibroblasts (Fig. 4Cd) was significantly higher than FMIy
(P < .05).
Moreover, we examined whether the interaction between C3a and
its cognate receptor was specific. For this purpose, we added C3aR
specific antagonist (SB290157) (24) within the CS (blue). Under this
condition, pulp fibroblast migration was completely inhibited
(Fig. 4Bf, Cb, and Cd), and the random movements of DPSCs decreased
(Fig. 4Bc, Ca, and Cc). Thus, DPSCs were mobilized by C3a, whereas
only pulp fibroblasts migrated following a specific C3a gradient.
Discussion
Data from this study clearly indicate that the complement-derived
C3a is involved in both DPSCs and fibroblast proliferation and in pulp
fibroblast recruitment following a C3a gradient. This is demonstrated on
pulp sections where pulp fibroblasts expressing FSP also express C3aR.
To our knowledge, this is the first time that expression of C3aR is
demonstrated within the pulp tissue. This is confirmed in vitro by
RT-PCR and immunofluorescence double staining, which show DPSCs
co-expressing STRO-1 and C3aR and fibroblasts co-expressing FSP and
C3aR. Surprisingly, when both cell types were submitted to a C3a
gradient, random cellular movement was observed for DPSCs that did
not follow the C3a gradient, whereas pulp fibroblasts specifically
migrated following the C3a gradient. This mobilization of stem cells
from their environment may be required as an initial step for them to
subsequently follow a C5a gradient. During complement activation,
C3a is the first active fragment to be produced, and this is followed
by C5a. Thus, although C3a first mobilizes stem cells, C5a provides
the chemotactic gradient for their migration (9).
The observed migration was clearly due to C3a fixation on its
receptor. When C3aR specific antagonist (SB290157) was applied in
the CS, the pulp fibroblast migration was inhibited.
Complement system has been largely reported as a mechanism
of innate immunity. However, recent data reported on the implication
of complement activation during tissue regeneration processes
(25–31). Moreover, involvement of complement activation in dentin
pulp regeneration has also been described by the recruitment of
DPSCs by a C5a gradient (9). Many studies focused on the ability of
C5a and C3a to induce stem cell migration to injured sites and the ability
to induce their proliferation and differentiation. Stem cells derived from
embryonic mesoderm appear to be relevant targets of C3a and C5a. This
is the case for adult mouse neural stem cells, expressing a functional
C3aR (32), where the specific binding of C3a triggered their migration
and differentiation.
JOE — Volume 42, Number 9, September 2016
Regenerative Endodontics
The pulp tissue has a particular conformational architecture.
Because the pulp is located within an inextensible environment, the bal-
ance between inflammatory and regeneration signals reviewed in the
Journal of Endodontics (33) is crucial in the regeneration process.
Although regeneration can be hindered by severe inflammation, mild
inflammatory reactions might be beneficial for the regeneration process
(33). During deep carious decay or traumatic injuries, the odonto-
blastic layer and pulp tissue can be partially destroyed. New generation
of odontoblasts and proliferation of pulp fibroblasts are then needed to
replace the destroyed tissue. Previous studies have shown that after
complement activation, DPSCs migrate responding to a specific C5a
gradient (8, 9), legitimizing the study of the role of another
complement component, the C3a fragment. This study first checked
whether C3a could induce DPSC and pulp fibroblast proliferation.
Results show that both DSPCs and pulp fibroblasts proliferate in
response to C3a stimulation at 1000 ng/mL. This represents a major
requirement for dentin-pulp regeneration because proliferation of
both cell types is required to regenerate the destroyed pulp tissue.
The fact that fibroblast proliferation significantly increased with C3a
at 1000 ng/mL but not at a higher concentration may be due to contact
inhibition among these cells when they reach a high density.
Complement proteins including C3 are known to be synthesized in
the liver and immune cells (34). They are released into the plasma
where their activation leads to the formation of the bioactive C3a frag-
ment. In this experimental work, C3a was added to DPSCs and pulp
fibroblasts to investigate its possible role in the initial steps of dentin-
pulp regeneration. Interestingly, recent studies demonstrated that
pulp fibroblasts represent the only non-immune and non-hepatic cell
type capable of synthesizing all complement proteins and their activa-
tion leading to the release of active fragments such as C5a and C5b-9
(8, 10, 35, 36). Because pulp fibroblasts have been shown to
produce C5a (8) and because C3a is the first fragment to be released
after complement activation, this fragment might be produced locally,
in addition to its release from plasma, by the fibroblasts to regulate
the dentin-pulp regeneration process.
Finally, the added value of this study is to demonstrate the pulp
fibroblast as another cell type that could be mobilized by a complement
active fragment. Indeed, this study shows that pulp fibroblasts that
express C3aR both in vitro and in vivo follow a C3a gradient, as
demonstrated by inhibiting this migration on blocking the interaction
between C3a and its receptor on these cells. These results also clearly
demonstrate that C3a significantly increased pulp fibroblast and DPSC
proliferation. Overall, this study underlines a significant role for
the complement C3a fragment in the initial steps of dentin-pulp regen-
eration.
Acknowledgments
The authors thank Dr Jean-Charles Gardon for providing the
teeth.
This work was supported by Aix-Marseille Universit!e and
CNRS.
The authors deny any conflicts of interest related to this study.
Supplementary Material
Supplementary material associated with this article can be
found in the online version at www.jendodon.com (http://dx.doi.
org/10.1016/j.joen.2016.06.011).
Complement C3a Initiates Dentin/Pulp Regeneration 1383
160
Regenerative Endodontics
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