Validation d’une méthode analytique pour le dosage de la sulfaméthoxazole

dans une forme pharmaceutique

TP 1 : Etude de la linéarité

Objectifs :
 Appliquer les tests statistiques nécessaires pour évaluer la linéarité d’une méthode
analytique ;
 Estimation et comparaison des paramètres des droites d’étalonnages de l’analyte seul et
l’analyte dans la matrice.

Validation de la méthode de dosage du sulfaméthoxazole :

1 Etude de la linéarité :
L’étude est réalisée sur le principe actif seul et la forme pharmaceutique reconstituée.
Cinq échantillons contenant respectivement environ 60, 80, 100, 120 et 140% de la
quantité théorique de principe actif sont préparés et analysés. Cette opération est répétée deux
autres fois à une raison d’une fois par jour, soit au total 30 échantillons

Etude statistique
1.1 Vérification de l’homogénéité des variances :
Principe actif seul
Tableau1 : Linéarité : données brutes (Principe actif seul)
2
niveau xij yij yi si
1 300,60 514,395
300,50 510,836
300,10 506,230
2 401,30 685,860
400,70 679,328
401,50 682,531
3 501,40 857,325
500,70 849,160
500,80 852,426
4 600,50 1025,524
601,00 1028,790
600,70 1018,992
5 700,10 1187,191
700,50 1193,723
700,50 1190,817

p. 1
 Tableau2 : Linéarité : test d’homogénéité des variances (principe actif seul)
TEST DE COCHRAN
p
2 2
s max ∑si C0 calculé C (5%)
i=1

conclusion :…………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………..
Forme pharmaceutique reconstituée :
Tableau3 : Linéarité : données brutes (Forme pharmaceutique reconstituée)
2
niveau xij yij yi si
1 300,500 514,395
300,600 507,863
300,300 506,230
2 400,700 684,227
400,400 676,062
401,500 689,126
3 500,300 845,894
500,600 857,325
500,200 849,160
4 601,200 1032,056
600,600 1012,460
600,300 1028,790
5 700,500 1208,420
700,300 1205,154
700,200 1183,925
Tableau4 : Linéarité : test d’homogénéité des variances (Forme pharmaceutique reconstituée)

TEST DE COCHRAN
p
2 2
s max ∑si C0 calculé C (5%)
i=1

conclusion :
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………..

p. 2
 1.2 Régressions linéaires :
La méthode statistique de régression des moindres carrés permet d’établir la droite
d’étalonnage et de calculer les incertitudes associées à son usage ultérieur.
Calculs des paramètres
Les calculs de la pente(a), de l’ordonnée à l’origine(b), des variances associées (Sa2,
Sb2) sont effectuées à l’aide d’un tableau dont le modèle est le suivant :

DROITE D0 - principe actif seul

2 2
a0 s a0 b0 s b0

DROITE D1 - forme pharmaceutique reconstituée

2 2
a1 s a1 b1 s b1

Tableau 6: Linéarité : calcul des sommes des carrés des écarts (Forme pharmaceutique reconstituée )

Tests d’adéquation du modèle linéaire par analyse de variance :

L’analyse des variances peut être utilisée pour tester la validité du modèle linéaire. Deux tests
de Fisher sont réalisés afin de s’assurer de :
 L’existence d’une pente significative (validité de la régression)
 Validité de la droite de régression (validité de la droite sur toute la gamme)

1.3 Vérification de l’existence d’une pente significative

Ce test consiste à vérifier l’existence d’une pente significative (régression acceptable) c’est
à dire de s’assurer que la pente provient bien de la régression et non des erreurs résiduelles.
a) Application
Les valeurs des variances résiduelles et de régression linéaire sont calculées à l’aide d’un
tableau dont le modèle est donné ci-après.

) Principe actif seul

p. 3
Source de variation SCE DDL Variances Fl F(5% )
Résiduelle
Régression (linéaire)
Totale

Tableau9 : linéarité : Test d’existence d’une pente significative (principe actif seul)
Conclusion :…………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………

) Forme pharmaceutique reconstituée.

Source de variation SCE DDL Variances Fl F(5% )

Résiduelle
Régression (linéaire)
Totale

Tableau10 : linéarité : Test d’existence d’une pente significative (Forme pharmaceutique reconstituée)
Conclusion :…………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………

1.4 Vérification de la validité de la droite de régression

Ce test consiste à vérifier la validité de la droite de régression (c’est bien une droite dans tout
le domaine choisi) c’est à dire s’assurer que la variance caractérisant l’erreur due à une erreur
de modèle est bien inférieure à l’erreur expérimentale.

a) Application :
Les valeurs des variances expérimentales et d’erreur du modèle sont calculées à l’aide d’un
tableau dont le modèle est donné ci-après.
) Principe actif seul

p. 4
 2
niveau xij yij yij yi ( yij - yi )

1 300,600 514,395
300,500 510,836
300,100 506,230
2 401,300 685,860
400,700 679,328
401,500 682,531
3 501,400 857,325
500,700 849,160
500,800 852,426
4 600,500 1025,524
601,000 1028,790
600,700 1018,992
5 700,100 1187,191
700,500 1193,723
700,500 1190,817

SCEe

Sources de variation SCE DDL Variances Fnl F(5% , 10)

Résiduelle
Expérimentale
Erreur modèle (non linéaire)

Tableau 11: linéarité : Test de validité de la droite de régression (principe actif seul)
Conclusion :…………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………

) Forme pharmaceutique reconstituée.

p. 5
 2
niveau xij yij yij yi ( yij - yi )
1 300,500 514,395
300,600 507,863
300,300 506,230
2 400,700 684,227
400,400 676,062
401,500 689,126
3 500,300 845,894
500,600 857,325
500,200 849,160
4 601,200 1032,056
600,600 1012,460
600,300 1028,790
5 700,500 1208,420
700,300 1205,154
700,200 1183,925

SCEe

Sources de variation SCE DDL Variances Fnl F(5% , 10)

Résiduelle
Expérimentale
Erreur modèle (non linéaire)

Tableau 12:linéarité : Test de validité de la droite de régression (Forme pharmaceutique reconstituée)

Conclusion :…………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………

1.5 Comparaison des droites D0 et D1 :

Ce paragraphe est réservé à la comparaison statistique entre les paramètres de la droite
Do et D1 moyennant le test de Student. Ceci, est dans le but de voir si lesdites droites sont
superposables.

p. 6
 DROITE D0 - principe actif seul
2 2
a0 s a0 b0 s b0

DROITE D1 - forme pharmaceutique reconstituée

2 2
a1 s a1 b1 s b1

a) Comparaison des pentes :

t calculée t ( 95% )
TEST DE
STUDENT

Conclusion :…………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………
b) Comparaison des ordonnées à l’origine :
t calculée t ( 95% )
TEST DE
STUDENT

Conclusion :…………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………

c) Comparaison de l’ordonnée à l’origine avec zéro

p. 7
 t calculée t ( 95% )
TEST DE
STUDENT

t calculée t ( 95% )
TEST DE
STUDENT

Conclusion :…………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………

p. 8
 TP 2 : Etude de la justesse et la fidélité

Objectifs :
 Appliquer les tests statistiques nécessaires pour évaluer la justesse et la fidélité d’une
méthode analytique ;
 Apprendre à estimer l’erreur systématique et l’erreur aléatoire d’une méthode analytique.

1. Etude de la fidélité :
L’étude est réalisée sur la forme pharmaceutique reconstituée. Sept échantillons de la
forme pharmaceutique reconstituée contenant 100% de la quantité théorique de principe actif
sont préparés et analysés. Cette opération est répétée deux autres fois à raison d’une fois par
jour. L’ensemble des résultats est rassemblé dans le tableau ci-dessous :

Tableau 1 : Fidélité : résultats ( forme pharmaceutique reconstituée, référence : )

séries essai qté introd.(mg Air qté retrouv. R%
1/1 500,30 847,527
2/1 500,30 849,160
3/1 500,10 857,325
1 4/1 500,70 854,059
5/1 501,10 858,958
6/1 500,60 860,591
7/1 500,50 857,325
1/2 500,70 856,128
2/2 500,20 854,059
3/2 500,90 849,160
2 4/2 500,60 857,325
5/2 500,40 847,527
6/2 502,30 854,059
7/2 500,40 854,059
1/3 500,50 847,527
2/3 500,10 842,628
3/3 500,30 855,444
3 4/3 501,50 858,958
5/3 500,20 849,160
6/3 500,80 857,325
7/3 501,40 860,591

1.1 Vérification de l’homogénéité des variances

p. 9
 séries essai R% 2
Rmoyi si
1/1
2/1
3/1
1 4/1
5/1
6/1
7/1
1/2
2/2
3/2
2 4/2
5/2
6/2
7/2
1/3
2/3
3/3
3 4/3
5/3
6/3
7/3

RmoyG Ecart-type

TEST DE COCHRAN
p
2 2
s max ∑si C0 calculé C (5%)
i=1

Tableau 2: Fidélité : test d’homogénéité des variances (Forme pharmaceutique reconstituée )

Conclusion :…………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………

1.3 Calcul de répétabilité et de fidélité intermédiaire :

Le calcul de la répétabilité et de la fidélité intermédiaire est réalisé à l’aide d’un tableau dont le
modèle est donné ci-après :

p. 10
 Tableau 4: Fidélité : calcul statistique (Forme pharmaceutique reconstituée)
a) Estimation de la répétabilité :

Répétabilité Variance Sr2 Sr CVr

b) Estimation de la fidélité intermédiaire :

Fidélité Sinter2 SL2 SFI2 SFI CVFI

intermédiaire

Conclusion :…………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………
2. Etude de la justesse
L’étude statistique de la justesse est réalisée après avoir vérifié que :
 La linéarité du signal pour la forme pharmaceutique reconstituée et le principe actif
seul est satisfaisante ;
 Les droites D0 et D1 sont superposables.
Cette étude statistique s’effectue sur les recouvrements entre les pesées « retrouvées » et
introduites.
2.1 Calcul du taux de recouvrement
Tableau 5 : Justesse : résultats (forme pharmaceutique reconstituée)

p. 11
 niveau xij yij Q retrouvée Recouvrement
1 300,500 514,395
300,600 507,863
300,300 506,230
2 400,700 684,227
400,400 676,062
401,500 689,126
3 500,300 845,894
500,600 857,325
500,200 849,160
4 601,200 1032,056
600,600 1012,460
600,300 1028,790
5 700,500 1208,420
700,300 1205,154
700,200 1183,925

2.2 Vérification de l’homogénéité des variances

2
niveau R% Rmoyi si
1

TEST DE COCHRAN
p
2 2
s max ∑si C0 calculé C (5%)
i=1

Tableau 6: Justesse : test d’homogénéité des variances (Forme pharmaceutique reconstituée)

Conclusion :…………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

p. 12
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………
2.3 Vérification de la validité des moyennes

Source de variation SCE DDL Variances Fl F(5% )

Expérimentale
Factorielle
Totale

Tableau 7: Justesse : test d’homogénéité des moyennes (Forme pharmaceutique reconstituée)

Conclusion :…………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………

2.4 Estimation du recouvrement moyen et de son intervalle de confiance

N R ST t(5%) IRM
min max

Conclusion :…………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………

p. 13
 TP 3 : Étude de la robustesse du dosage de lʹamiodarone par HPLC

1 Présentation de lʹétude
Lʹétude de la robustesse dʹune méthode permet de définir les variations admissibles
des paramètres opératoires critiques cʹest‐à‐dire des paramètres qui ont un effet sur la
valeur de la réponse fournie. Lʹamiodarone est une molécule utilisée dans le domaine
médical. On détermine par HPLC la concentration des solutions injectables
dʹamiodarone.
La réponse étudiée est lʹasymétrie du pic dʹamiodarone : en effet une variation de
lʹasymétrie du pic peut engendrer des erreurs dans la détermination de la
concentration en amiodarone.
Les facteurs étudiés sont le pH du tampon phosphate (A), le pourcentage dʹacétonitrile
(B) et la concentration molaire du tampon phosphate (C).
Un plan factoriel complet 23 est réalisé pour déterminer quels sont les facteurs et
interactions importants.
Les conditions du domaine expérimental sont données dans la matrice dʹexpériences
suivante.
Le schéma suivant regroupe les différents essais qui ont bien été choisis aux extrémités
du domaine dʹétude.

Numéro
A B C Asymétrie
dʹessai
1 ‐ 1 ‐ 1 ‐ 1 1,97
2 +1 ‐ 1 ‐ 1 1,72
3 ‐ 1 +1 ‐ 1 1,34
4 +1 +1 ‐ 1 1,42
5 ‐ 1 ‐ 1 +1 1,55
6 +1 ‐ 1 +1 1,82
7 ‐ 1 +1 +1 1,36
8 +1 +1 +1 1,20
Niveau ‐1 2,3 45 % 24 mmol.L‐1
Niveau +1 2,7 55 % 29 mmol.L‐1
Niveau 0 2,5 50 % 26,5 mmol.L‐1

1. Donner la matrice d’effet en variable codé

2. Donner la matrice d’expérience et d’effet en variable réelle ?

p. 14
Sachant que lʹon adopte un modèle linéaire par rapport aux coefficients :

3. Donner l’équation du modèle en variable codée et réelle ?

4. Quels sont les facteurs qui ont un impact sur la réponse ? expliquer

comment ce (ces) facteur(s) influence la réponse ?

5. La méthode est‐elle robuste ?

p. 15
TP 4 : Optimisation d’une méthode UPLC pour le dosage de sildénafil,

tadalafil, vardénafil et udénafil, dans les préparations

pharmaceutiques et les médicaments contrefaits

Objectif

Le développement analytique est une étape d’une grande importance dans le cycle de
vie d’une méthode analytique. En effet grâce à l’utilisation des plans d’expérience, la
mise au point d’une méthode devient facile à exécuter. La réalisation des expériences
permet de retrouver les valeurs optimales des variables susceptibles d’influencer la
réponse à optimiser.
Dans ce sens, nous avons choisi de passer directement à l’optimisation en nous servant
des plans de surface de réponse. Pour aboutir à cet objectif, nous nous sommes servis
du Box‐Behnken comme plans d’optimisation, ainsi, nous avons opté pour un modèle
d’ordre 2 pour obtenir une représentation optimale de la réponse dans le domaine
expérimental d’intérêt.
Lʹexpérimentation a consisté à mettre en évidence les effets de trois facteurs à savoir :
le PH, le pourcentage du modificateur organique, et le débit sur la réponse étudiée.
Nous avons utilisé le plan de Box et Behnken dans le but de chercher les valeurs
optimales des facteurs les plus influents. Ainsi, pour définir un modèle bien adapté
(Eq. 1), capable de mieux expliquer la relation qui existe entre les réponses et les
facteurs et leurs interactions.
𝑌 𝑏 𝑏 𝑋 𝑏 𝑋 𝑏 𝑋 𝑏 𝑋𝑋 𝑏 𝑋𝑋 𝑏 𝑋 𝑋 𝑏 𝑋 Eq. 1
𝑏 𝑋 𝑏 𝑋 𝑒
Où
Y étant la réponse, X1, X2, X3 correspond étroitement aux facteurs pH, proportion en
Acétonitrile et le débit, b1, b2, b3 sont les effets linéaires de ces facteurs, b11, b22, b33
leurs effets quadratiques, b12, b23, b13 correspond aux effets des interactions entre
deux facteurs et e l’erreur résiduelle.
Le choix des niveaux hauts et bas des trois facteurs retenus sont regroupées dans le (

Tableau 1) :
Le pH de la phase mobile ;
Le pourcentage du modificateur organique ;
Le débit de la phase mobile (en ml par minute).

p. 16
Tableau 1 : Facteurs indépendants et niveaux de variation retenus pour l’étude d’optimisation par le
plan de Box‐Behnken pour le dosage de quatre substances PDE‐5i
Facteurs Facteurs Niveaux de Niveaux
Unités
Indépendant codés variation codé

3.3 ‐1

pH X1 3.5 ‐ 0

3.7 1

31 ‐1

ACN X2 34 % 0

37 1

0.55 ‐1

Débit X3 0.6 (ml/min) 0

0.65 1

Les réponses choisies sont : le temps de rétention et les résolutions entre vardénafil‐
sildénafil, sildénafil‐udénafil et udénafil‐tadalafil.
Le plan d’expérience consiste donc à réaliser 15 essais, comportant trois points au
centre du domaine d’étude, afin d’estimer l’erreur expérimentale (Tableau 2).

Tableau 2 : Plan expérimental de Box‐Behnken pour le dosage des substances PDE‐5i

Essai n° X1 X2 X3 Tr R1 R2 R3
1 3,3 31 0,60 1,57 4,02 8,86 4,59
2 3,7 31 0,60 1,56 3,73 8,41 4,83
3 3,3 37 0,60 0,81 2,49 4,78 5,30
4 3,7 37 0,60 0,81 2,35 4,62 5,46
5 3,3 34 0,55 1,18 3,15 6,54 5,35
6 3,7 34 0,55 1,21 2,96 6,38 5,35
7 3,3 34 0,65 1,18 3,15 6,55 5,39
8 3,7 34 0,65 1,02 2,91 6,24 5,24
9 3,5 31 0,55 1,71 3,92 8,54 4,72
10 3,5 37 0,55 0,88 2,48 4,48 5,43
11 3,5 31 0,65 1,46 3,85 8,48 4,42
12 3,5 37 0,65 0,75 2,44 4,43 5,13

p. 17
 13 3,5 34 0,60 1,09 3,10 6,27 5,20
14 3,5 34 0,60 1,09 3,06 6,19 5,25
15 3,5 34 0,60 1,09 3,07 6,47 5,35

Recherche des conditions optimales

L’étape finale consiste à rechercher les conditions optimales pour le problème posé
c’est‐à‐dire les valeurs du pourcentage en modificateur organique (%ACN), du débit
ainsi que le pH amenant à optimiser le temps de rétention ainsi que la résolution des
quatre substances.

p. 18