2.

Les vecteurs de
clonage
 Définitions : transgenèse et transgène

Transgenèse :

 introduction de caractères nouveaux dans une cellule

 processus de transformation génétique

 absence de barrière entre les espèces

Transgène : gène

 transféré à un organisme à l’aide de :

 vecteurs naturels ou artificiels

 moyens physiques ou chimiques
2. Les vecteurs de clonage
 2.1. Structure des vecteurs

gène de résistance
à une substance sites de restriction
chimique

vecteur

ORI : origine de
réplication

 zone de sites de restriction

 une origine de réplication

 utilisation de gène résistant à des substances chimiques

(ex: antibiotiques)

 utilisation du gène de la b-galactosidase

 2.2. Cellules hôtes

 différentes souche d’E.coli (DH5a, HB101, JM109…)

 levures (saccharomyces …)

 cellules animales (hamster, souris, humain…)

 2.3. Les plasmides

 molécule d’ADN circulaire double brin

 3 à 100 kb

 unité de réplication autonome :

 ORI : origine de réplication

 réplication indépendante du génome de la cellule
hôte
2.3. Les plasmides
 2.3.1. Le vecteur pBR322

 sites multiples et uniques pour enzymes de restriction connues

" polylinker " = région à sites multiple de clonage.

 Un gène de résistance à l’ampicilline (antibiotique)

 Un gène de résistance à la tétracycline (antibiotique)

2.3.1. Le vecteur pBR322
 2.3.2. Le Plasmide pUC

 des sites multiples et uniques des enzymes de restriction connues

 Un gène de résistance à l’ampicilline

 Le gène lac Z qui code pour la b-galactosidase dans l’opéron

lactose
a. L’opéron lactose
 b. Le gène lacZ

 Le gène Z (appelé lacZ) gène code pour la b-galactosidase

 Insertion du fragment d’ADN dans le plasmide pUC :

 zone du gène codant pour la b-galactosidase

 inactivation du gène

Donc

 pas insertion ADN = activité enzymatique

 insertion ADN = perte de l’activité enzymatique
 b. Le gène lacZ

Vérification de la présence ou l’absence de l’activité enzymatique

de la b-galactosidase :

 composé X-gal
 si clivé par la b-galactosidase = X-gal passe de l’incolore au bleu

 pour métaboliser le X-gal, la cellule doit être exposée à un

inducteur : IPTG (isopropylthio-b-D-galactoside).
 b. Le gène lacZ

 Colonies bleues = clones non recombinants (pas de fragment

d’ADN inséré)

 Colonies blanches = clones recombinants, insertion du

fragment d’ADN

 Sélection visuelle des bactéries transformées par les plasmides

recombinants
Le Plasmide pUC
2.3.3. Avantages et inconvénients des plasmides

Avantages :

 petite taille du vecteur

 sélection des plasmides recombinants

Inconvénients :

 faible efficacité pour la transformation des bactéries

 impossibilité d’insérer des larges fragments d’ADN
 2.4. Les bactériophages

 virus qui infectent les bactéries

 génome : 50 et 150 kb

 ADN double brin

 les extrémités de l’ADN = simples brins sur une longueur réduite

 forment des extrémités cohésives = séquences cos (cohésives)

5’-G AATTC-3’
3’-CTTAA G-5
 2.4.1. Le phage l

 génome : 50 kb

 ADN double brin

 séquences cos

 deux parties individualisées :

 tête du virus

 queue du virus
2.4.2. Multiplication du phage l
 2.4.3. Avantages et inconvénients des phages

Avantages :

 taille des fragments d’ADN insérés supérieure aux plasmides

 transformation des bactéries par les phages plus efficace

que pour les plasmides

Inconvénients :

 nombre de sites de restriction restreints

 obligation d’empaqueter l’ADN

 le maniement des phages est plus complexe

 2.5. Les cosmides

 vecteurs artificiels hybrides

 un gène de résistance aux antibiotiques (ampicilline)

 une origine de réplication

 site cos d’un phage l

 empaqueté dans la tête d’un virus l

 infecte les bactéries

2.5.1. Les cosmides
2.5.2. Avantages et inconvénients des cosmides

Avantages :

 taille des fragments insérables peut atteindre 50 kb

 transformation des bactéries par les cosmides plus

efficace que pour les plasmides

Inconvénients :

 Obligation d’empaqueter l’ADN

 2.6. Autres types de vecteurs

2.6.1. Les BAC

(chromosomes artificiels de bactéries)

 fragments d'ADN de taille 100 à 350 kb.

 2.6.2. Les YAC

 chromosome artificiel de levure

 utilisés pour insérer de l’ADN étranger dans les cellules eucaryotes

 clonage de fragments de grande taille (jusqu'à 1500kb)

 analyse des grands génomes (génome humain)

Inconvénient :

 fragments insérés subissent parfois des réarrangements

(insertions, délétions)

 pas absolument représentatifs de la région initiale introduite