Mthodes Optiques Absorption molculaire 1 Spectroscopie ultraviolet-visible Introduction Le domaine du visible et de l'UV a t abondamment tudi et ce depuis longtemps.

. Mais s'il est indispensable pour une approche exprimentale de la nature de la liaison, il est pauvre en information structurale. Son emploi est de plus en plus rserv l'analyse quantitative via la loi de Beer-Lambert. Labsorption molculaire dans le spectre ultra-violet (UV) et visible dpend de la structure lectronique de la molcule. Labsorption dnergie est quantifie et rsulte du passage des lectrons dorbitales de ltat fondamental vers celles dun tat excit dnergie suprieure. Pour beaucoup de structures lectroniques, labsorption se fait dans la partie difficilement accessible de la rgion UV.

Orbitale haute nergie

Absorption of E

Orbitale Basse nergie Etat fondamental Etat excit

En pratique, la spectromtrie UV se limite normalement aux systmes conjugus. Dans ce chapitre, nous allons mettre un accent sur les corrlations existant entre les spectres et les structures utilises en chimie organique. Un spectre UV obtenu directement partir dun instrument est simplement un graphique reprsentant lintensit dabsorption (absorption ou transmittance) en fonction de la longueur donde (ou de la frquence dabsorption). Les donnes sont frquemment converties en un graphique reprsentant labsorptivit molaire (max ou logmax) en fonction de la longueur donde. Lutilisation de labsorptivit molaire comme unit dintensit dabsorption a pour avantage que toutes les valeurs dintensits se rfrent la mme quantit despces absorbantes. Description et Dfinition

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Spectromtre UV/Visible Beckman DU640 La spectroscopie ultraviolet-visible ou spectromtrie ultraviolet-visible est une technique de spectroscopie mettant en jeu les photons dont les longueurs d'onde sont dans le domaine des ultraviolet (200 nm 400 nm), du visible, et jusqu'au proche infrarouge (750 nm -1 400 nm). Soumises un rayonnement dans cette gamme de longueurs d'onde, les molcules subissent une transition lectronique. Cette technique est complmentaire de la spectroscopie de fluorescence en ce sens que la fluorescence met en jeu des transitions depuis l'tat excit jusqu' l'tat fondamental alors que la spectroscopie d'absorption traite des transitions entre tat fondamental et tat excit Rgles gnrales. Loi de BEER-LAMBERT Quand une OEM (orbitale lectronique molculaire) est absorbe par un chantillon de matire, l'intensit de l'onde absorbe est proportionnelle l'paisseur de l'chantillon, au nombre de molcules absorbantes par unit de volume et un coefficient propre l'chantillon de matire. D'o la formule habituelle de la loi de Beer-Lambert

L'angstrm est aussi utilis (1 =10-10 m = 0.1 nm). Le visible va de 800 (rouge) 400 (bleu) nm, l'UV proche de 400 200 nm et l'UV lointain de 200 80 nm. Origine nettement de plus l'absorption important dans que le pour visible les et l'ultraviolet. ou l'IR. 1 1 L'absorption dans cette gamme d'OEM correspond des transitions de niveau d'nergie micro-ondes

Proportionnellement la diffrence d'nergie entre deux niveaux de rotation successifs compte pour 1/40 de celle entre deux niveaux de vibration et 1/1000 de celle entre deux niveaux lectroniques molculaires. Lorsque se forme une liaison entre deux atomes, il y a formation d'une orbitale molculaire rsultant du recouvrement des orbitales atomiques. Elle possde deux niveaux, un liant plus stable que les orbitales atomiques originelles et un anti-liant moins stable. Chacun ne peut recevoir que deux lectrons au plus. A l'tat fondamental les lectrons des liaisons occupent les orbitales de plus basses nergies. En prenant pour exemple les composs rencontrs en chimie organique, forms par la runion d'atomes lgers (H, C, N, O), les transitions dites " vibroniques " ont pour origine les lectrons engags dans les liaisons et , ou les doublets non-liants n, d'o le terme de spectres lectroniques. Au cours des transitions, des modifications de la polarit des liaisons surviennent, qui ont fait donner aux spectres, dans ce domaine, le nom gnrique de spectres de transfert de charge. L'absorption de photons se traduit par des transitions d'lectrons engags dans les OM situes la frontire entre les derniers niveaux occups de l'tat fondamental et les premiers niveaux non occups des tats excits. Quand un lectron est promu dans une orbitale d'nergie suprieure par effet d'un photon incident, son tat de spin est conserv, du moins dans un premier temps. C'est l'tat singulet. Ensuite, le spin peut se retourner pour donner l'tat triplet un peu plus stable (rgle de Hund). Chaque transition est caractrise la fois par sa longueur d'onde et par son coefficient d'absorption molaire, , cette longueur d'onde.

HO : plus haute orbitale molculaire occupe BV : plus basse orbitale molculaire vacante ou non occupe

1 1

- Transition

* des composs organiques se traduit par un cart important

*

La grande stabilit des liaisons OM liante

entre les niveaux orbitalaires frontires correspondants. Cette transition d'un lectron d'une dans une OM antiliante demande beaucoup d'nergie ; elle est intense et
max

situe dans le lointain UV, vers 130 nm ( de type

, thane = 135 nm, = 10 000). C'est pourquoi

les hydrocarbures saturs, tels l'hexane ou le cyclohexane, qui ne prsentent que des liaisons , sont pratiquement transparents dans le proche UV.

Le cyclohexane et l'heptane constituent de bons solvants d'un point de vue optique ; 200 nm l'absorbance est de 1, pour une paisseur traverse de 1 cm. C'est la longueur d'onde limite pour l'usage de ces solvants. Malheureusement, leur pouvoir de solvatation est insuffisant pour dissoudre les composs trs polaires. - Transition n
*

Cette transition rsulte du passage d'un lectron d'une OM non-liante n une OM antiliante
*

. Ce type de transition est rencontr, dans le cas des molcules comportent un htroatome

porteur de doublets lectroniques libres appartenant un systme insatur. La plus connue est celle qui correspond la bande carbonyle, facilement observable, situe entre 270 et 280 nm. Le coefficient d'absorption molaire est faible : pour l'thanal par exemple,
max

= 293 nm et

= 12 (thanol). La polarit de la liaison est modifie aprs absorption du photon. Ceci permet de comprendre pourquoi la nature du solvant peut influer sur la position de la bande d'absorption. - Transition n
*

Le transfert d'un lectron d'une paire libre ou doublet non liant (doublet n) des atomes O, N, S, X un niveau
*

est observ pour les alcools vers 180 nm, pour les amines vers 220 nm, = 183 nm ( =

pour les thers vers 190 nm ainsi que pour les drivs halogns. Cette transition d'intensit moyenne, se situe l'extrme limite du proche UV. Exemples mthanol : 500); ther
max max

= 190 nm ( = 2 000) ; thylamine :

max

= 210 nm ( = 800).

1 1

- Transition

Les composs, qui possdent une double liaison thylnique isole, conduisent une forte bande d'absorption vers 170 nm (thylne
max

= 165 nm, = 16 000) dont la position dpend

de la prsence de substituants htroatomiques. On voit couramment runies les quatre types de transitions ci-dessus sur un unique diagramme nergtique pour les situer les unes par rapport aux autres dans le cas gnral. - Groupements chromophores isols Les groupements chromophores des composs organiques sont, la ressemblance des fonctions, des groupements d'atomes responsables d'absorptions caractristiques. Par extension, le chromophore correspond au site qui est dans la molcule, l'origine de la transition lectronique. Les molcules appeles chromognes sont formes d'un squelette porteur d'un ou de plusieurs chromophores. Pour une srie de composs possdant le mme chromophore, la position ainsi que l'intensit des bandes d'absorption restent sensiblement constantes, sauf s'il y a accumulation de plusieurs chromophores proximit les uns des autres. Lorsque les chromophores sont isols, c'est--dire spars par au moins deux liaisons simples, on observe uniquement la superposition des effets individuels.

NOM Chromophore amine oxime nitro nitrite nitrate nitroso -NH2 -NOH -NO2 -ONO -ONO2 -N=O

max

(nm)

max

195 3000 190 5000 210 3000 230 1500 270 12

300 100

* Effets dus aux solvants: solvatochromie 1 1

La position, l'intensit et la forme des bandes d'absorption des composs en solution, diffrent lorsqu'on change de solvant. C'est une des raisons qui rendent les bibliothques de spectres UV difficilement exploitables. Ces changements traduisent les interactions physiques solut/solvant qui modifient la diffrence d'nergie entre tat fondamental et tat excit. L'tude de ces modifications permet de tirer quelques rgles gnrales. * Effet hypsochrome Il existe des transitions pour lesquelles la polarit du chromophore diminue quand on passe de l'tat fondamental l'tat excit. Il en est ainsi pour la transition n * du

carbonyle des ctones en solution. Avant absorption, la polarisation C+- O- sera d'autant plus stabilise que le compos sera en prsence d'un solvant polaire dont les molcules seront attires par effet lectrostatique autour du solut. Ceci aura pour effet de ncessiter plus d'nergie pour provoquer la transition lectronique n *, d'o un dplacement du

maximum d'absorption correspondant vers les courtes longueurs d'ondes (effet hypsochrome) comparativement la position de la bande d'absorption de ce chromophore dans un solvant non-polaire. L'tat excit tant atteint rapidement, la cage de solvant qui entoure le carbonyle n'a pas le temps de se rorienter pour stabiliser la situation aprs absorption du photon. Cet effet s'observe galement pour la transition n coefficient d'absorption . * Effet bathochrome Pour les soluts peu polaires, il n'y a pas d'effet d'orientation des molcules de solvant autour des molcules de solut. Si le moment dipolaire du chromophore augmente au cours de la transition, l'tat final sera plus solvat. On rencontre cette situation pour la transition * des hydrocarbures thylniques dont la double liaison de dpart est moins polaire avant qu'aprs absorption du photon. Un solvant polaire a donc pour effet de stabiliser la forme excite, ce qui favorise la transition: on observe un dplacement vers les grandes longueurs d'ondes. Cet effet bathochrome est dfini par rapport au spectre obtenu dans un solvant non polaire. En rsum, l'tude du dplacement et des variations d'intensit des bandes d'absorption par effet de la polarit des solvants peut aider reconnatre la nature lectronique des transitions observes. * Effet sur le coefficient d'absorption : 1 1 *. Il est accompagn d'une variation du

Lors de changement de solvant ou d'ajout de substituant sur la molcule, il peut y avoir une modification du coefficient d'extinction molaire. Si inverse, pour diminue on a alors un hypochrome, les transitions sont moins favorables et le nombre de photons absorbs diminue. L'effet qui augmente est appel effet hyperchrome. Effet Hypsochrome (Blue shift) Bathochrome (Red shift) Hyperchrome Hypochrome Consquences
max

diminue augmente augmente diminue

max

max

max

Figure. Rsum des diffrents effets de solvant ou de substituant en UV-Visible. - Chromophores des systmes conjugus Si plusieurs chromophores sont juxtaposs dans une mme molcule, l'ensemble

forme un systme conjugu de chromophores. Le spectre est fortement perturb par rapport la simple superposition des effets produits par les chromophores isols. Plus le nombre d'atomes sur lequel le systme conjugu s'tend, plus la dlocalisation spatiale des lectrons est importante et plus l'cart entre niveau fondamental et niveau excit diminue. Le spectre d'absorption est dplac "vers le rouge" (effet bathochrome) avec augmentation d'intensit (effet hyperchrome); ce phnomne est appel stabilisation par rsonance de l'tat excit. Cet effet est l'origine de la couleur de nombreux composs naturels dont les formules semidveloppes prsentent des chromophores conjugus tendus. Ainsi la couleur orange du -carotne (formule ci-dessous), provient de la runion de onze doubles liaisons conjugues entre elles
max

= 497 et 466 nm dans le chloroforme).

Figure.

- Carotne

L'absorption des composs aromatiques est beaucoup plus complexe que celle des thylniques. Plusieurs transitions, * sont observes et elles prsentent une structure 1 1

fine. La substitution du noyau modifie les bandes d'absorption de manire trs importante. Le spectre de la vapeur de benzne, obtenu partir d'un chantillon constitu d'une goutte dpose au fond d'une cuve de silice de 1 cm de trajet optique, est un excellent test pour valuer la rsolution des appareils du proche UV. * Rgles de Woodward-Fieser L'analyse structurale partir des spectres lectroniques est assez alatoire, dans la mesure o leur relative simplicit a pour corollaire un faible apport d'informations. Dans les annes 40 cependant, avant l'arrive des techniques plus puissantes d'identification de cette fin de sicle, la spectromtrie UV/Visible a t utilise cette fin. L'tude des spectres d'un grand nombre de molcules a permis d'tablir des corrlations entre structures et maxima d'absorption. Les plus connues sont les rgles empiriques, dues Woodward, Fieser et Scott, qui concernent les dines et composs carbonyls insaturs. A partir de tableaux rassemblant, sous forme d'incrments, les divers facteurs et particularits de structure prendre en compte, on peut prvoir la position de la bande d'absorption exprimentales. Applications La spectroscopie ultraviolet-visible est une mthode utilise en routine pour l'tude quantitative des solutions de mtaux de transition et des composs organiques fortement conjugus :

* de ces systmes conjugus

particuliers. La concordance est bonne entre les valeurs calcules et les positions

Les solutions d'ions de mtaux de transition peuvent tre colores (c'est--dire absorbent la lumire visible) car les lectrons des ions mtalliques peuvent tre excits d'un tat lectronique un autre. La couleur des solutions d'ions mtalliques est fortement affecte par la prsence d'autres espces, comme certains anions ou ligands. Ainsi, la couleur d'une solution dilue de sulfate de cuivre est d'un bleu trs clair ; l'ajout d'ammoniaque intensifie la couleur et modifie la longueur d'onde du maximum d'absorption (max). Les composs organiques, et en particulier ceux prsentant un haut degr de conjugaison, absorbent aussi dans les rgions visible et ultraviolette du spectre lectromagntique. Les solvants utiliss pour leur analyse sont par exemple l'eau pour les composs qui y sont solubles, ou l'thanol pour les composs organiques hydrophobes (les solvants organiques peuvent avoir une absorption UV significative : tous les solvants ne sont donc pas pertinents pour une spectroscopie UV. L'thanol absorbe trs peu la plupart des longueurs d'ondes). La polarit du solvant ou l'acidit peuvent affecter le spectre d'absorption d'un compos organique. La tyrosine, par exemple, voit son maximum d'absorption et son coefficient d'extinction molaire croitre lorsque le pH crot de 6 13 ou lorsque la polarit du solvant dcrot. 1 1

les complexes transfert de charge donnent aussi des solutions colores, mais ces couleurs sont parfois trop intenses pour tre utilises pour des mesures quantitatives, moins de diluer les solutions. La loi de Beer-Lambert indique que l'absorbance d'une solution est directement proportionnelle sa concentration. La spectroscopie UV-visible peut dont tre utilise pour dterminer cette concentration. Il est ncessaire de connatre la variation de l'absorbance avec cette concentration : ceci peut se faire partir de rfrences (tables de coefficients d'extinction molaire) ou, plus prcisment, partir de l'obtention d'une droite d'talonnage. Un spectrophotomtre UV-visible peut tre utilis comme dtecteur pour une HPLC. La prsence d'un analyte (rfrence danalyse) donne une rponse que l'on peut supposer proportionnelle la concentration. Pour des rsultats prcis, la rponse de l'instrument l'analyte dans la solution inconnue doit tre compare un talon : c'est assez similaire l'utilisation de droites d'talonnage. La rponse (la hauteur de pic) pour une concentration donne est connue sous le nom de facteur de rponse Dtermination des chromophores :

Il existe un certain nombre de chromophores "lmentaires" qui absorbent l'UV des longueurs d'ondes varies. Chromophores lmentaires > C = C < (alcne) - C C - (alcyne) > C = O (ctone) - CH = O (aldhyde) - COOH (acide) - COCl (chlorure d'acide) - CONH2 (amide) - COOR (ester) - NO2 (nitro) - N = N - (azomthane) * spectre dans le n-heptane La prsence dans une mme molcule de plusieurs de ces chromophores peut se traduire soit : (1) par une simple additivit si ces chromophores sont indpendants, 1 1 max (nm) 173* 178* 290 279 208 220 220 211 214 338 max (L.mol-1.cm-1) 10000 2000 16 15 32 100 63 57 17 4

(2) par des effets bathochromes (dplacement vers les plus grandes longueurs d'onde en UV ou vers le visible) et hyperchromes (augmentation du coefficient d'absorption molculaire) lorsque ces chromophores sont conjugus. C'est le cas des systmes diniques, polyniques, aromatiques (plusieurs liaisons >C=C<) ou rsultant de la conjugaison de chromophores diffrents. Ces interactions obissent des rgles qui permettent de prdire la zone d'absorption maximale. Les spectres dpendent galement des interactions avec le solvant. Bien videmment, dans l'eau, les spectres sont trs souvent sensibles au pH qui modifie l'ionisation de certaines fonctions chimiques. Chromophores Chromophores conjugus >C=C-C=C< (linaire) >C=C-C=O (dans un cycle) Acides nucliques Adnosine Guanosine Thymidine Cytidine ADN double brin ADN simple brin ARN Protines Liaison peptidique Pont disulfure Phnylalanine Tyrosine Tryptophane Coenzymes, hmes... Flavine NADH, NADPH Pyridoxal Hme II bande Hme II bande Soret Cis-rtinal Chlorophylle A max 220 244 260 255 265 270 260 260 260 190 250 257 275 280 450 338 390-500 550 400 498 660-680 max 30000 10000 15000 14000 10000 9000 sensible au pH 1U.D.O.=50 g/ml 1U.D.O.= 33 g/ml 1U.D.O.= 40 g/ml 4-8000 sensible la conformation 300 200 1400 sensible au pH 5600 12700 dshydrognases 6400 dshydrognases transaminases, 6000 dcarboxylases 27700 120000 (--> couleur rouge) 4200 rhodopsine 10000 (--> couleur verte) Remarques

Les donnes de ces tableaux sont tires de la rfrence suivante : Joel Janin, Mthodes biophysiques pour l'tude des biomolcules Hermann, Paris 1985 (page 131). Dosages (= applications de la loi de Beer-Lambert) : 1 1

a-Mthode directe elle consiste mesurer A et calculer c . elle ncessite de connatre le de la substance doser la longueur d'onde choisie, et de bien caler le monochromateur, car varie avec . b-Mthodes indirectes : elles ne ncessitent pas de connatre a)-Mthode par comparaison avec un talon unique: - elle consiste mesurer dans les mmes conditions l'absorbance Ad de la solution doser et l'absorbance Aet d'une solution "talon" ou "standard" de concentration connue cet, puis calculer la concentration de la solution doser cd. - elle suppose mais ne vrifie pas la linarit. b)-Mthode avec une gamme d'talonnage : - elle consiste prparer une gamme de dilutions d'une solution talon "mre", mesurer l'absorbance de chacune de ces solutions talons "filles", puis tracer la courbe d'talonnage A = f(c). L'absorbance de la solution doser est mesure dans les mmes conditions, puis reporte sur la courbe d'talonnage; on fait ainsi une dtermination graphique de la concentration de la solution doser (la gamme doit encadrer la valeur probable de la solution doser) ; - elle permet de vrifier la linarit, et tient compte des ventuelles erreurs de manipulation (trac d'une droite statistique).

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