Rapport HAP

Devenir du pyrne dans un cosystme aquatique et impact sur les organismes vivants Programme PEVS
1
- 1 -

CNRS - PROGRAMME ENVIRONNEMENT VIE ET
SOCIETES
ECOSYSTEMES ET ENVIRONNEMENT

APPEL DOFFRES DYNAMIQUE DES CONTAMINANTS

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Titre du Projet :

DEVENIR DES HYDROCARBURES AROMATIQUES
POLYCYCLIQUES (HAP) DANS UN COSYSTME
AQUATIQUE ET IMPACT SUR LES ORGANISMES
VIVANTS :
EXEMPLE DU PYRNE

Bilan des travaux
(2001-2002)

RESPONSABLE : JOUANNEAU Yves
DRDC/BBSI, UMR CNRS 5092, CEA-Grenoble,
38054 Grenoble Cedex 09
Tel : 04 38 78 43 10
Fax : 04 38 78 51 85
Email : yjouanneau@cea.fr
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FICHE DE SYNTHSE

Programme environnement vie et socits : cosystmes et
environnement

Devenir des contaminants dans lenvironnement et effets sur les cosystmes : interactions entre
dynamiques physico-chimiques et dynamiques biologiques

Titre du projet : Devenir des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) dans un
cosystme aquatique et impact sur les organismes vivants : exemple du pyrne

Nom du responsable scientifique : Yves JOUANNEAU
Titre et fonction : Docteur es-sciences naturelles, Directeur de Recherche au CNRS (DR2)

EQUIPE PRINCIPALE :

Laboratoire de Biochimie et Biophysique des Systmes Intgrs, CNRS UMR 5092 Dpartement
de Rponse et Dynamique Cellulaires, CEA-Grenoble, 38054 Grenoble Cedex 9
Tl : 04 76 88 43 10 ; Fax : 04 76 88 51 85

EQUIPES PARTENAIRES :

Equipe 1 : Laboratoire TEPE, ESIGEC - Universit de Savoie, 73376 Le Bourget du Lac ;
Responsable : Prof. Grard BLAKE, Gerard.Blake@univ-savoie.fr

Equipe 2 : ENTPE, Laboratoire L.S.E., 69518 Vaulx en Velin Cedex ;
Responsable : Bernard CLEMENT, bernard.clement@entpe.fr

Equipe 3 : Laboratoire LCME, ESIGEC, Universit de Savoie, 73376 Le Bourget du Lac ;
Responsables : Emmanuel NAFFRECHOUX, Emmanuel.Naffrechoux@univ-savoie.fr et
Bernard DAVID, bernard.david@univ-savoie.fr

MOTS CLES : HAP, pyrne, spciation, cotoxicit, biodgradation, microcosmes,
sdiments, macrophytes, synergie plantes-microorganismes, bioaccumulation, substances
humiques, adsorption
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- 3 -
Production scientifique relative au projet P.E.V.S.

Publications :

- KRIVOBOK S., KUONY S., MEYER C., LOUWAGIE M., WILLISON J.C., JOUANNEAU
Y., Identification of pyrene-induced proteins in Mycobacterium sp.6PY1 : Evidence for two ring-
hydroxylating dioxygenases, J Bacteriol., 185:3828-3841(2003).

- JOUANNEAU Y., WILLISON J.C., KRIVOBOK S., MEYER C., CHEVRON N.,
BESOMBES J-L., BLAKE GStimulation of pyrene mineralization in freshwater sediments by
bacterial and plant bioaugmentation, en prparation. (2003).

- FANGET B., DEVOS O., NAFFRECHOUX E., Pyrene transfer from clay particles to water :
the role of humic acid, Journal of Water Science, vol.15, special n, 95-108, 2002.

Proceeding :

- BOSCHER A., DAVID B. and GUITTONNEAU S., Photodegradation of pyrene on solid
phase, 2
nd
European meeting on environmental chemistry, EMEC 2, Dijon, Ed; Elsevier, 12-15
dec. 2001.

- BOSCHER A., DAVID B., GUITTONNEAU S., SARAKHA M., Devenir photochimique du
Pyrne sur supports modles et dans des sdiments naturels, influence sur le transfert du Pyrne
entre phase aqueuse et phase solide. 1re rencontre nationale de la recherche sur les sites et sols
pollus : bilan et perspectives, Ademe, Paris, 12-13 dc. 2002.

Rapports :

- GODDE M., Evaluation de la toxicit du pyrne sur des organismes aquatiques au
moyen de tests monospcifiques, Mmoire de DEA Sciences et Techniques du Dchet,
INSA de Lyon, 53 pages., (2001).

- CAUZZI N., Devenir des hydrocarbures aromatiques polycycliques dans un cosystme
aquatique et impact sur les organismes vivants : exemple du pyrne, Mmoire de DEA
Toxicologie de lEnvironnement, Universit de Metz, 60 pages., (2002).

- CROZET K., Partition/Evolution du pyrne en milieu aquatique et biodisponibilit vis--vis de
Daphnia magna, mmoire de stage de DUT de lIUT de Gnie Biologique (option agronomie) de
Lyon I., (2003).

Communications orales :

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- CLEMENT B. Fate and toxicity of pyrene in two lake sediments with contrasted
characteristics, confrence au Sminaire scientifique Biodisponibilit des Contaminants et
Matire Organique dans les cosystmes aquatiques , Cemagref de Lyon, 27 sept. 2001.

- FANGET B., DEVOS O., NAFFRECHOUX E., Rle des acides humiques dans le
transfert des HAP entre les sdiments et leau, ColloqueFranco-Qubcois, La
pluridisciplinarit dans les problmes de lenvironnement : les interactions air sol eeau,
Qubec, 14-16 mars 2001.

- DAVID B., Mcanismes de phototransformation des HAP adsorbs sur silice et en suspension
dans leau, Journe scientifique sur limpact des HAP engendrs par le trafic routier et autoroutier
sur les cosystmes aquatiques de montagne, Chambry, 28 fev. 2002.

- BOSCHER A., DAVID B., GUITTONNEAU S., SARAKHA M., Etude du mcanisme
de photodgradation du Pyrne en solution, congrs du GRUTTEE, Paris, 10-12
septembre 2003.

- JOUANNEAU Y., KRIVOBOK S., KUONY S., MEYER C., WILLISON J.C., Pyrene
biodegradation by Mycobacterium species : identification of the catabolic enzymes involved,
First FEMS Congress of European Microbiologists, Ljubljana, Slovnie, 29 juin-3 juillet 2003.

Posters :

- BOSCHER A., DAVID B. and GUITTONNEAU S., Photodegradation of pyrene on solid
phase, 2
nd
European meeting on environmental chemistry, EMEC 2, Dijon, 12-15 dec. 2001.

- DAVID B., BOSCHER A., GUITTONNEAU S., SARAKHA M., Devenir photochimique du pyrene sur
supports modles et dans des sdiments naturels, influence sur le le transfert du pyrene entre phase
aqueuse et phase solide, 1re rencontre nationale de la recherche sur les sites et sols pollus : bilan et
perspectives, Ademe, Paris, 12-13 dc. 2002.

- BOSCHER A., DAVID B., GUITTONNEAU S., SARAKHA M., Photodegradation of pyrene in
solution, EMEC 3, Genve, 12-13 dc. 2002.

- BOSCHER A., DAVID B., GUITTONNEAU S., SARAKHA M., Photodegradation of pyrene sorbed on
mineral supports and sediments, EMEC 3, Genve, 12-13 dc. 2002.

- JOUANNEAU Y., KUONY S., MEYER C., KRIVOBOK S., Biodegradation of pyrene by a
Mycobacterium strain : identification of specific catabolic enzymes including two arene
dioxygenases, Confrence internationale l'IFP, Paris, 6-7 juin 2002.

CAUZZI N., Impact of sediment quality on the toxicity of pyrene in aquatic microcosms, 7me
congrs international de lAquatic Ecosystem Health Management Society, Lyon 15-17 sept.
2003.
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- 5 -

SOMMAIRE

RESUME................................................................................................................................................ 2
1. INTRODUCTION.............................................................................................................................. 4
2. CARACTERISATION DES SEDIMENTS....................................................................................... 8
3. FACTEURS ABIOTIQUES AFFECTANT LE DEVENIR DU PYRENE EN MILIEU AQUEUX
.............................................................................................................................................................. 12
3. 1. Spciation du pyrne en prsence de particules minrales et de MON...................................... 12
3.2. Photo-oxydation du pyrne........................................................................................................... 23
3.3. Conclusions.................................................................................................................................... 36
4. EFFETS DU PYRENE ET DE SES PRODUITS DOXYDATION SUR DES ORGANISMES
SUPERIEURS DE REFERENCE....................................................................................................... 38
4.1. Effets du pyrne lors de tests monospcifiques sur organismes de rfrence.............................. 38
4.2. Effets du pyrne sur la croissance des macrophytes .................................................................. 49
4.3 Biodgradabilit du pyrne photo-oxyd par les bactries ........................................................... 52
5. DEVENIR DU PYRENE EN MICROCOSMES CLOS................................................................. 55
5.1 Description du dispositif exprimental .......................................................................................... 55
5.2. Conditions opratoires et paramtres mesurs ............................................................................ 55
5.3 Cintiques de minralisation du pyrne ........................................................................................ 57
5.4. Bilan de transfert du pyrne et de ses produits doxydation dans les microcosmes.................... 61
5.5. Bioaccumulation du pyrne dans les plants de Phragmites australis........................................... 63
5.6. Effet de la rhizosphre sur lquilibre redox des sdiments ........................................................ 68
5.7. Identification des produits de biodgradation du pyrne ............................................................ 72
5.8. Analyses de la microflore bactrienne des sdiments contamins par le pyrne......................... 75
5.9 Conclusions .................................................................................................................................... 78
6. DEVENIR ET TOXICITE DU PYRENE EN MICROCOSMES OUVERTS............................... 83
6.1. Description des essais raliss....................................................................................................... 83
6.2. Conditions opratoires et paramtres mesurs ............................................................................ 83
6.3. Essais en petits bchers sur sdiment dop (essai mono) ............................................................. 84
6.4. Essais en microcosmes de 2 L sur sdiments dops (essais pluri1 et pluri2) ............................... 88
6.5. Discussion gnrale et conclusions............................................................................................... 99
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.......................................................................................... 105
ANNEXES.......................................................................................................................................... 109
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RESUME

Les travaux prsents dans ce rapport ont t raliss grce au soutien financier du CNRS
dans le cadre du Programme Environnement Vie et Socits, et sous la houlette du Comit
Ecosystmes et Environnement. Ces travaux sont le fruit dune collaboration entre quatre
quipes de la Rgion Rhne-Alpes pendant une priode de 2 ans (2001-2002). Les tudes ont
port sur le devenir dun hydrocarbure aromatique polycyclique (HAP) dans un cosystme
aquatique, et sur leur impact sur les organismes vivants. Pour simplifier lanalyse, et rendre
nanmoins possible une tude multi-paramtres des phnomnes, les expriences ont t ralises
en microcosmes de laboratoire composs de sdiments naturels dorigine lacustre, dorganismes
et de plantes aquatiques. Ces microcosmes ont t artificiellement contamins par du pyrne, un
HAP compos de quatre noyaux aromatiques, choisi comme molcule modle du devenir et de
leffet des HAP.
Le devenir du pyrne et la toxicit induite par ce polluant dans lcosystme sont tudis en
mesurant les paramtres suivants : rpartition du pyrne dans les trois compartiments (sdiment,
phases aqueuse et gazeuse), photo-oxydation, biodgradation par les microorganismes
(conversion en CO
2
et en mtabolites), bioaccumulation dans les organismes aquatiques de
rfrence et dans les plantes, effets sur la survie et la reproduction de ces organismes, ainsi que
sur labondance relative des bactries dgradant le pyrne. Ltude a t ralise sur deux
sdiments provenant du lac dAiguebelette (73) dont la teneur en matire organique (MO) est trs
contraste : lun est tourbeux (COT = 21%), lautre crayeux (COT = 1.3%). Les concentrations
en MO particulaire dans leau interstitielle de ces deux sdiments sont en revanche comparables
(290 et 300 mg/L respectivement).
Les mesures de partition montrent que le pyrne se retrouve quasi exclusivement adsorb aux
particules de sdiments, les concentrations rsiduelles dans la colonne deau tant trs infrieures
la limite de solubilit. Les acides humiques semblent jouer un rle mineur dans la solubilisation
aqueuse du pyrne. La lumire provoque une photo-dgradation, assez rapide quand le pyrne est
en solution dans leau, plus lente quand il est adsorb sur particules minrales, notamment quand
celles-ci sont opaques. Les produits de photo-oxydation ont t partiellement caractriss et un
mcanisme de photo-oxydation chimique du pyrne est propos. Compte tenu de la partition du
3
- 3 -
pyrne, la proportion de pyrne susceptible de subir une photo-dgradation est trs faible. A
cet gard, nous avons constat que le pyrne photo-oxyd est peu toxique pour, et biodgradable
par les bactries.
Nos tudes menes sur une srie de microcosmes contamins par du
14C
-pyrne ont rvl que (i)
les sdiments possdent une activit intrinsque de minralisation du pyrne dtectable aprs 15-
20 j. Cette activit est dorigine bactrienne, et des espces du genre Mycobacterium, isoles des
sdiments, jouent de ce point de vue un rle prpondrant. (ii) lensemencement des sdiments
par une souche tudie au laboratoire pour son aptitude dgrader le pyrne (souche 6PY1)
stimule la minralisation sur une priode de 60 j au moins (iii) les roseaux provoquent aussi une
stimulation, sans doute de manire indirecte, en vhiculant par leurs racines de loxygne dans les
sdiments, ce qui favorise la biodgradation oxydative du pyrne par les bactries. Des mesures
de potentiel redox dans les sdiments au voisinage des racines corroborent cette hypothse. (iv)
des produits doxydation du pyrne excrts par les bactries ont t identifis dans la colonne
deau. Le plus abondant dentre eux peut servir de marqueur spcifique signalant la prsence dans
lcosystme de bactries dgradant le pyrne.
La toxicit du pyrne sur les organismes aquatiques a t teste par exposition du pyrne en
phase aqueuse ou des sdiments contamins artificiellement par des doses comprises entre 2 et
200 ppm. Certains organismes y sont sensibles (daphnies, amphipodes), voire trs sensibles
(microalgues), alors que dautres ne sont que peu ou pas affects par le pyrne (chironomes,
lentilles deau, roseaux). La prsence de lumire de laboratoire, comprenant pourtant peu dUV,
suffit accrotre la toxicit du pyrne (phototoxicit) pour les organismes exposs dans la
colonne deau. Les effets du pyrne sur la survie et la croissance de lamphipode Hyalella azteca
sont plus marqus pour le sdiment crayeux. Cet effet est fonction de la teneur en MO du
sdiment qui a une forte incidence sur la partition eau/sdiment du pyrne. La relation obtenue
entre teneurs en pyrne dans leau interstitielle et survie des amphipodes suggre que la mortalit
est fortement lie la contamination de leau interstitielle. Les effets observs, pour les
amphipodes et les daphnies exposs en phase aqueuse ou dans la colonne deau au-dessus du
sdiment, peuvent tre relis aux doses de pyrne bioaccumul mesures par spectrofluorimtrie
directe. Mais le pyrne subit dans certains cas des (bio)transformations qui rendent difficile sa
quantification par cette mthode de dosage du fait de la modification du spectre dmission.
4
- 4 -
1. INTRODUCTION

Objectifs de ltude

Comme le titre lindique, notre projet a port sur le devenir et limpact des HAP dans un
cosystme aquatique naturel. Le but tait dobserver les consquences dune contamination
artificielle sur les microorganismes et des organismes aquatiques de rfrence, et danalyser
conjointement la rpartition du polluant dans les compartiments de lcosystme, ainsi que les
bio-transformations quil subit. Nous avons dune part tudi les facteurs abiotiques susceptibles
dinfluencer le devenir du polluant, cest--dire les interactions physico-chimiques polluant-
sdiments notamment ladsorption, limportance des matires organiques dans ces interactions,
et les phnomnes doxydation photochimique par la lumire. Nous nous sommes intress,
dautre part, aux facteurs biotiques impliqus, savoir la biodgradation par les
microorganismes, la toxicit vis--vis des organismes suprieurs ainsi que les processus de bio-
accumulation. Nous avons adopt une dmarche rsolument simplificatrice, en choisissant de
travailler sur des microcosmes de laboratoire, et en utilisant le pyrne, un HAP compos de
quatre noyaux aromatiques, comme molcule modle du comportement et de leffet des HAP.
Cette approche permettait de contrler plus facilement les paramtres des expriences, de pouvoir
les reproduire, et de simplifier linterprtation des rsultats. Pour des raison techniques, nous
avons limit la dure des expriences quelques semaines (2 mois maximum).

Proprits des HAP et choix du pyrne

Notre intention nest pas ici de passer en revue les connaissances sur lorigine, les proprits les
effets et la biodgradation des HAP, mais de rappeler les principales caractristiques de ce type
de polluants. Des informations plus dtailles sont donnes dans les revues cites en rfrence.
Les proprits physico-chimiques des HAP les plus courants sont indiques dans le tableau 1. Ils
sont constitus de noyaux aromatiques accols dont le nombre varie de deux pour le naphtalne
six pour le benzo(ghi)prilne. Ils diffrent galement par lagencement des noyaux aromatiques
qui peut tre linaire (anthracne), angulaire (phnanthrne) ou group (pyrne).

5
- 5 -
La prsence des HAP dans lenvironnement a deux origines principales, pyrolytique et
ptrolire. La pyrolyse, cest--dire la combustion incomplte de la matire organique fossile
(charbon, ptrole et ses drivs) ou plus rcente (bois) est lune des sources majeures de HAP.
Lactivit industrielle, le chauffage rsidentiel, les missions de vhicules moteur contribuent
de manire prpondrante la production de HAP, laquelle sajoute celle dorigine naturelle
(incendies de fort, volcans).
La distribution des HAP dans lenvironnement est fonction du mode dmission et de leurs
modes de transport. Les missions atmosphriques, dans lesquelles les HAP sont associs des
particules qui se redposent, donnent lieu une contamination disperse, qui explique
lomniprsence des HAP dans lenvironnement.

Tableau 1. Proprits physico-chimiques des HAP

HAP Masse
molaire
(g/mol)
Point de
fusion
(C)
Point
dbullition
(C)

Solubilit
a
(mg/L)

f
L
/f
S
b

log P
c

Naphtalne
1-mthylnaphtalne
128,2
142,2
80
-22
218
245
32
27
d

3,53
1
3,35
3,87
2-mthylnaphtalne 142,2 34 241 26 1,24 4,00
Acnaphtylne 152,2 82 270
e
3,93 4,61
Acnaphtne 154,2 93 279 3,42 4,71 3,92
Fluorne 166,2 116 294 1,9 7,94 4,18
Phnanthrne 178,2 100 338 1,0 5,65 4,52
Anthracne 178,2 216 340 0,07 77,5 5,54
Fluoranthne 202 107 383 0,27 7,09 5,22
Pyrne 202 150 393 0,16 19,8 5,18
Chrysne 228,2 254 441 0,006 189 5,79
Benz[a]anthracne 228,2 156 435
f
0,0057 21,6
Benzo[a]pyrne 252 179 496 0,0038 32,3 5,98

a
Solubilit dans leau 25C
b
Rapport 25C des fugacits dun HAP entre ltat liquide en surfusion et ltat solide.
c
logP est dfini comme le logarithme dcimal du coefficient de partition Kow dun compos donn dans un systme
standard diphasique octanol/eau
d
Liquide dans ltat standard
e
Se dcompose partiellement
f
Sublimable

6
- 6 -
Les HAP ont en commun dtre des molcules trs stables, peu volatiles et hydrophobes,
donc peu solubles dans leau. Ces proprits les rendent rsistantes la biodgradation naturelle
et leur temps de sjour dans lenvironnement est par consquent trs long. Bien que prsents dans
lenvironnement des concentrations gnralement faibles, les HAP peuvent saccumuler dans la
chane alimentaire en raison de leur caractre lipophile. Ces composs ont t dtects dans les
tissus humains, notamment les tissus adipeux, le sang et le lait maternel. Des expriences menes
sur animaux de laboratoire ont montr que les HAP sont lorigine de multiples pathologies :
tumeurs, affaiblissement du systme immunitaire, malformations congnitales, strilit, altration
de la thyrode. Les HAP appartiennent la classe IIA (cancrignes probable pour lhomme)
selon la classification dresse par le Centre International de Recherche sur le Cancer.
Le pyrne est constitu de 4 noyaux aromatiques et a une structure condense. Il est reprsentatif
des HAP lourds (! 4 noyaux ) avec lesquels il partage les proprits suivantes : trs hydrophobe,
peu volatil, plus rcalcitrant la biodgradation que les HAP lgers et par consquent, persistant
dans les sols et les sdiments contamins. Il est mutagne mais il nest pas considr comme
cancrigne. Ses effets sur les cosystmes sont relativement mal connus.Les bactries et les
champignons microscopiques sont les seuls organismes connus capables dutiliser le pyrne
comme source de carbone. La majorit des espces bactriennes capables de dgrader le pyrne
qui ont t dcrites sont du genre Mycobacterium et diffrent des espces dgradant les autres
HAP. Les connaissances sur le mtabolisme bactrien du pyrne sont assez rcentes et rsultent
dtudes sur des souches isoles en laboratoire. Lune des quipes participant ce projet a
notamment travaill sur lidentification des enzymes impliques dans le catabolisme du pyrne
dans une souche appele Mycobacterium gilvum 6PY1. Sur la base des tudes publies, un
schma de la biodgradation du pyrne par les bactries a t propos et est prsent en Annexe
1.

Mthodologie

Ltude a t ralise sur deux sdiments naturels provenant du lac dAiguebelette (73) daspects
trs diffrents : lun est tourbeux (COT = 21%), lautre crayeux (COT = 1.3%). Ils ont t
prlevs sur un site protg et lanalyse a montr quils ne contenaient que des traces de HAP
(Tableau 2.1). Les microcosmes tudis contenaient des sdiments surmonts dune colonne
7
- 7 -
deau, et des organismes de rfrence dont la nature et le nombre ont vari en fonction des
besoins de lexprience. Dans certains cas, du
14
C-pyrne a t utilis comme traceur radioactif
pour faciliter le suivi du polluant et de ses produits doxydation. Les paramtres suivants ont t
mesurs : rpartition du pyrne dans les trois compartiments (sdiment, phases aqueuse et
gazeuse), photo-oxydation, biodgradation par les microorganismes (conversion en CO
2
et en
mtabolites), bioaccumulation dans les organismes aquatiques de rfrence et dans les plantes,
effets sur la survie et la reproduction de ces organismes, ainsi que sur labondance relative des
bactries dgradant le pyrne. Ce projet a requis la mise au point dun grand nombre de
procdures nouvelles ou la mise en uvre de mthodes dj prouves qui sont dcrites en
annexe.
8
- 8 -
2. CARACTERISATION DES SEDIMENTS

Les sdiments slectionns pour notre tude proviennent du lac dAiguebelette (73). Ce lac reoit
les eaux de ruissellement de chausse contamine notamment par des hydrocarbures. Les
sdiments retenus pour ce programme ont t prlevs sur les berges de la grande le, situe au
sud du lac, en zone non contamine. Cette situation insulaire protge les sdiments des pollutions.
Les sdiments en situation littorale sont exposs lclairement solaire tout au long de lanne en
raison de la faible hauteur de colonne deau (40 60 cm). La transparence des eaux du lac varie
fortement en amplitude (Fig. 2.1), montrant de fortes valeurs au printemps et en hiver (entre 8 et
10 m.) et de plus faibles en t (2 4 m).

Evolution de la transparence des eaux du lac d'Aiguebelette
(disque de Secchi)
0
2
4
6
8
10
12
1
8
/
0
1
/
0
5
1
8
/
0
3
/
0
5
1
8
/
0
5
/
0
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1
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/
0
7
/
0
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1
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/
0
9
/
0
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1
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/
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1
/
0
5
1
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/
0
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/
0
6
1
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/
0
3
/
0
6
1
8
/
0
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/
0
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0
7
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0
6
1
8
/
0
9
/
0
6
1
8
/
1
1
/
0
6
temps
t
r
.

e
n

m
.

Figure 2.1 Evolution de la transparence des eaux du lac dAiguebelette en 2001 et 2002

Les sdiments de ces zones littorales sont varis et le choix sest port sur deux types de
sdiments :

- un sdiment calcaire (environ 80 85% de CaCO
3
) appel craie dans la suite de
cette tude. Ce sdiment reoit essentiellement de la matire organique dorigine
phytoplanctonique et zooplanctonique. Ces apports sont faibles ce qui a pour
9
- 9 -
incidence de donner une dominante minrale ce sdiment. Sa richesse en sels
calcaires lui confre un caractre oligotrophe en raison de la chlation facilite des
phosphates. Sa faible granulomtrie en fait globalement un sdiment de type anoxique.

- le second sdiment, appel tourbe dans la suite du rapport, reoit beaucoup de
matires vgtales et est trs riche en matires organiques si bien quil a un aspect de
vase tourbeuse fluide qui peut devenir anarobie sous 3 5 cm dpaisseur. Cette
matire est riche en produits de dcomposition des plantes susceptibles de former des
substances humiques. Ce sdiment est eutrophe, forte activit bactrienne et contient
plus dorganismes vivants que le premier.

Les sdiments ont t prlevs toujours au mme endroit au moyen dune drague main, puis
tamiss 2 mm et conservs 4C quelques mois. Les rsultats danalyse des sdiments figurent
au tableau 2.1. Les deux sdiments sont surtout contrasts par leur pH (plus lev pour la craie),
teneur en eau (la tourbe tant trs fluide), le COT (trs lev pour la tourbe comme on pouvait sy
attendre), le calcium (logiquement plus lev pour la craie). Si lon compare les teneurs en
contaminants aux seuils fournis par MacDonald et al. (2000) (TEC pour Threshold Effect
Concentration, ou concentration seuil endessous de laquelle les effets sont peu probables, et
PEC pour Probable Effect Concentration, teneur au-dessus de laquelle les effets sont trs
probables), on observe que ces teneurs sont trs infrieures ces seuils, ce qui confirme la
possibilit dutiliser ces sdiments comme sdiments de rfrence pour ltude de la toxicit du
pyrne. On remarque toutefois que le sdiment craie est systmatiquement plus contamin
que le sdiment tourbe .
La distribution granulomtrique des deux sdiments a t effectue par granulomtrie laser
(Tableau 2.2). Le sdiment Craie sapparente un sable trs fin comportant une fraction
limoneuse importante. La granulomtrie de la Tourbe est plus tale, mais il convient de
remarquer que, compte tenu de lorigine principalement vgtale de ce sdiment, lassimilation
des particules prsentes aux classes habituelles de particules minrales (sables, limons, argiles)
constitue un abus.

10
- 10 -

Tableau 2.1. Composition physico-chimique des sdiments utiliss dans le programme

Aiguebelette "craie" Aiguebelette "tourbe"
pH 20C 7.7 6.9
% eau 47.9 84.7
Fraction organique (% poids sec) 2.9 38.5
Fraction minrale (% poids sec) 97.1 61.5
Azote ammoniacal (N, % poids sec) 0.02 0.13
Azote Kjeldahl (N, % poids sec) 0.13 1.3
COT (NFU 44161, % poids sec) 1.3 20.9
Rapport C/N 9.9 16
Phosphore (P2O5, % poids sec) 0.05 0.13
Calcium (CaO, % poids sec) 32.7 5.1
Magnsium (MgO, % poids sec) 0.93 0.52
Potassium (K2O, % poids sec) 0.07 0.08
% eau 51 85
perte au feu (% poids sec) 4.89 40.48
COT par oxydation au dichromate froid 1.49 11.5
(%, poids sec)
Chrome (mg/kg MS) 18.6 30.7
Cuivre (mg/kg MS) 4.05 16.15
Cadmium (mg/kg MS) 0.415 0.72
Plomb (mg/kg MS) 3.45 7.1
Zinc (mg/kg MS) 24.9 63.85
Nickel (mg/kg MS) 3.65 10.95
HAP (g/kg sec)
Naphtalne - 1.75 +/- 0.53
Acenaphtne - 0.44 +/- 0.13
Fluorne - 0.85 +/- 0.25
Phnanthrne 0.6 +/- 0.18 5.99 +/- 1.8
Anthracne 0.05 +/- 0.02 0.49 +/- 0.15
Fluoranthne 3.12 +/- 0.94 14.41 +/- 4.32
Pyrne 2.89 +/- 0.87 12.69 +/- 3.81
Benzo(a)anthracne 2.10 +/- 0.63 3.70 +/- 1.11
Chrysne 2.74 +/- 0.82 9.79 +/- 2.94
Benzo(b)fluoranthne 6.80 +/- 2.04 23.29 +/- 6.99
Benzo(k)fluoranthne 1.89 +/- 0.57 4.61 +/- 1.38
Benzo(a)pyrne 3.71 +/- 1.11 9.29 +/- 2.79
Benzo(a,h)anthracne 0.50 +/- 0.15 16.92 +/- 5.08
Benzo(g,h,i)prylne 2.82 +/- 0.85 15.94 +/- 4.78
Indno (1,2,3-cd) pyrne 2.67 +/- 0.80 9.54 +/- 2.86
HAPs totaux 29.9 129.71

11
- 11 -

Tableau 2.2. Distribution granulomtrique des sdiments dAiguebelette (prlvements des 15 janvier 2001 et
6 mars 2001)

Tourbe 15/01/01 Tourbe 6/03/01 Craie 15/01/01 Craie 6/03/01
% particules < 2 m
(argiles) 1.40 1.46 4.88 3.81
% particules de 2 50 m
(limons) 15.06 15.43 35.65 20.79
(sables trs fins) 31.78 30.10 52.93 54.81
(sables fins) 32.09 31.77 6.54 18.46
(sables grossiers) 19.67 21.24 0.00 2.13

12
- 12 -
3. FACTEURS ABIOTIQUES AFFECTANT LE DEVENIR DU PYRENE EN
MILIEU AQUEUX

3. 1. Spciation du pyrne en prsence de particules minrales et de MON

3.1.1 Comportement du pyrne en prsence de kaolinite et dAH
Les substances humiques (SH), constituant 25 50% du carbone organique dissous (COD) des
eaux de surface (THURMAN, 1985), sont aussi prsentes dans les sdiments. Ces acides
polylectrolytiques, qualifis dhumiques ou fulviques selon leur solubilit aqueuse pH
infrieur 2, sont produits par la dcomposition des molcules organiques dorigine animale et
vgtale contenues dans les eaux. Leur structure macromolculaire polyfonctionnelle varie selon
leur origine biologique et leur processus de formation mais prsente toujours des capacits
complexantes lgard des mtaux (BUFFLE et DELADOEY, 1982) et des proprits
amphiphiles leur confrant un rle important dans le transport des micropolluants aromatiques
(RAV-ACHA et REHBUN, 1992 ; CABANISS et al., 2000). La matire humique prsente en
effet des proprits hydrophobes rendant possible les interactions solut-solut avec des
composs organiques non ioniques (PEURAVUORI, 2001).
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) interagissent avec les substances
humiques dissoutes ou fixes sur les collodes et sdiments. De nombreuses tudes ont t
ralises au cours des dernires annes, abordant les aspects thermodynamiques par la
dtermination des constantes de partition Koc entre leau et les molcules humiques
(McCARTHY et JIMENEZ, 1985 ; HERBERT et aL., 1993 ; CHEFETZ et al., 2000) ou les
aspects structuraux par ltude des relations entre le Koc et les descripteurs molculaires des
substances humiques (CHIN et al., 1997 ; PERMINOVA et al., 1999). Lhydrophobicit des
HAP leur confre galement la proprit de sadsorber sur les solides minraux en suspension
dans leau ou dposs sur le sdiment (CHIOU et al., 1998). La distribution des HAP dans
lcosystme aquatique dpend donc dun quilibre entre la fraction adsorbe sur le sdiment et
la fraction soluble lie au COD (JOHNSON et AMY, 1995).
Les substances humiques amphiphiles peuvent recouvrir les collodes minraux (argileux
ou siliceux) avec une affinit dpendante de leur poids molculaire apparent (SPECHT et al.,
2000), de la nature du minral et du pH de la solution (ZHOU et al., 1994). La nature et la
13
- 13 -
quantit de matriel humique fix au minral peut alors perturber ladsorption des HAP sur
le solide. Les diffrentes interactions entre les soluts (HAP
d
et SH
d
) et le solide peuvent se
rsumer par les quilibres suivants (1 4) :
(HAP)
d
+ (SH)
d
! (HAP-SH)
d
(1)
(SH)
d
+ solide ! SH-solide (2)
(HAP)
d
+ solide ! HAP-solide (3)
(HAP)
d
+ (SH)
d
+ solide ! (HAP-SH)
d
+ SH-solide + HAP-solide-SH (4)
Lquilibre (4) reprsente globalement les interactions des soluts humiques et aromatiques
polycycliques en phase liquide et avec le solide. La nature et la concentration de composs
humiques en solution peut ainsi influencer la thermodynamique ou la cintique de dsorption des
HAP du solide (SCHMITT et al., 1999).
Il nexiste quun nombre limit de travaux prenant en compte la complexit globale des
interactions AH-solide-HAP (BRUNK et al., 1997 ; JONES et TILLER, 1999). Notre principal
objectif est dapporter une contribution ltude des quilibres (1 4) par la modlisation des
phnomnes dadsorption des AH et des HAP sur les solides argileux et par la quantification de
linfluence des composs humiques dissous sur la dsorption des HAP. Pour cela, nous avons
utilis :
- le pyrne, HAP souvent considr comme sonde de fluorescence et possdant une forte
capacit de liaison avec les acides humiques (PERMINOVA et al., 1999, PEURAVUORI,
2001),
- un acide humique (AH) disponible commercialement et de fort poids molculaire facilitant
son adsorption sur le solide et dont laromaticit leve favorise la capacit de liaison avec les
HAP,
- la kaolinite, minral argileux prsent dans les cosystmes aquatiques et dont les dimensions
particulaires correspondent celles rencontres dans certaines eaux de surface,
- des conditions de pH (6,5) et force ionique (10
-2
M) reprsentatives de celles dune eau
naturelle superficielle.

14
- 14 -
3.1.1.1 Adsorption du pyrne sur la kaolinite
Ladsorption du pyrne sur la kaolinite est reprsente par lisotherme de la figure 3.1.
Les tests effectus (annexe 3) montrent quil est possible dadsorber efficacement le pyrne sur la
kaolinite hydrate. La premire partie de lisotherme peut sinterprter comme ladsorption de
monomre de pyrne sur les groupes siloxane hydrophobes de largile. Laugmentation brutale de
ladsorption peut correspondre la formation de microcristaux en surface du solide, comme
LABBE et REVERDY (1988) ont pu lobserver sur la laponite hydrate.
Figure 3.1 : Isotherme dadsorption du pyrne sur la kaolinite pH 6,5 - I 10
-2
M (NaNO
3
)

Cette allure atypique de lisotherme peut sapparenter celle des isothermes dadsorption
des dtergents non ioniques sur la kaolinite (KO et al., 1998). Lisotherme dadsorption du
pyrne sur la montmorillonite dans leau pure possde un profil similaire (CLEMENS et al.,
1994). Pour une concentration rsiduelle de pyrne en solution de 40 nmol.L
-1
, la quantit de
pyrne adsorb sur la kaolinite (7 nmol.g
-1
) est environ vingt fois infrieure celle fixe sur la
montmorillonite (150 nmol.g
-1
). Cette diffrence sexplique par limpossibilit de pntration de
tout solut dans lespace interfoliaire de la kaolinite (KRAEPIEL et al., 1998).
Les collodes naturels sont dans la majorit des cas revtus dun film de substances
humiques (ZHOU et al., 1994). Cette gangue organique est alors susceptible de modifier les
phnomnes de sorption des HAP sur le solide. Des essais de sorption du pyrne ont t mens
pH et force ionique identiques, en solution aqueuse dpourvue dAH, sur de la kaolinite
pralablement mise en contact avec une solution aqueuse dacide humique (selon le protocole
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 2 4 6 8 10
g-pyrne.g
-1
concentration rsiduelle de pyrne en solution (g.L
-1
)
15
- 15 -
dcrit en annexe 3). La figure 3.2 prsente lisotherme dadsorption du pyrne sur la
kaolinite recouverte dune quantit croissante dacide humique (le rapport AH/K, exprim en mg-
C/g de kaolinite, est indiqu pour quelques points exprimentaux). La quantit de pyrne
initialement en solution est identique pour tous les essais (25 g.L
-1
).
Figure 3.2 : Isotherme dadsorption du pyrne sur la kaolinite recouverte dacide humique
(rapport massique AH/kaolinite en mg-C.g
-1
) pH 6,5 - I 10
-2
M (NaNO
3
)

Lorsque la surface de la kaolinite est recouverte de composs humiques, sa capacit fixer le
pyrne est fortement modifie. Ladsorption se modlise par une loi de Freundlich Q = 0,30 C
0,50

(avec Q en g-pyr.g
-1
kaolinite et C en g-pyr.L
-1
). Les quantits de pyrne adsorb diffrent de
celles fixes sur la kaolinite pure partir dun rapport AH/K suprieur 0,40. Les molcules
dacide humique la surface de largile semblent alors perturber la formation de microcristaux
de pyrne. Le mcanisme de fixation du pyrne sur le solide ne semble pas tre comptitif
ladsorption de lAH : des mesures dabsorbance UV 280 nm nont pas mis en vidence la
dsorption des molcules humiques. Comme lont dj constat ZHOU et al. (1994), les AH
jouent un rle majeur dans le contrle des quilibres dadsorption des POH sur les particules en
suspension.

0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 2 4 6 8 10 12 14 16
g-pyrne.g
-1
(0,60)
(0,52)
(0,40)
concentration rsiduelle de pyrne en solution (g.L
-1
)
16
- 16 -
3.1.1.2 Adsorption de lacide humique sur la kaolinite
Les artes de la surface des particules de kaolinite peuvent ragir avec les fonctions
carboxyliques dprotonnes de lacide humique selon un mcanisme dchange de ligand entre le
groupe OH
2
+
de largile et COO
-
de lAH (JONES et TILLER, 1999). Lors de nos
exprimentations (annexe 3), le pH de la solution collodale de kaolinite et dacide humique varie
au maximum de 6,5 6,8. Cette variation du pH, qui diminue avec la quantit dacide humique
adsorb sur la kaolinite, nous permet de supposer un mcanisme de chimio-sorption dj propos
par dautres auteurs au vu de lendothermie de la raction dadsorption de certains acides
humiques sur largile (ZHOU et al., 1994). La figure 3.3 reprsente lisotherme dadsorption de
lacide humique sur la kaolinite 20C. Ladsorption suit une loi de Freundlich Q = 0,79 C
0,526

(avec Q en mg-C/g kaolinite sche et C en mg-C.L
-1
).

Figure 3.3 : Isotherme dadsorption des AH Aldrich sur la kaolinite 20C
(C
0
= 50 mg-AH.L
-1
= 16,2 mg-C.L
-1
) - pH 6,5 - I 10
-2
M (NaNO
3
)
-- CES dtection UV280nm COD

Les quantits maximales dAH adsorbes sur la kaolinite sont infrieures celles obtenues par
JONES et TILLER (0,2 mg-C/g contre 4,8 mg-C/g) en raison des conditions de pH et force
ionique diffrentes (6,5 et 10
-2
M dans cette tude contre 4,0 et 10
-3
M dans ltude cite en
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 2 4 6 8 10 12 14 16
COD en mg-C.L
-1
m
g
-
A
H
.
g
-
1
17
- 17 -
rfrence) et de la nature diffrente de lAH (lAH utilis par Jones et Tiller est extrait de
sol). A pH acide et force ionique faible, la protonation des AH rduit les forces de rpulsion
lectrostatique entre la molcule organique et la surface charge de la kaolinite (pH du point de
charge nulle = 4,6). A pH voisin de la neutralit, la surface du minral est charge ngativement,
de mme que la molcule humique, augmentant ainsi la rpulsion lectrostatique (SPECHT et al.,
2000). ZHOU et al. (1994) ont pu fixer 7 milligrammes dAH Aldrich par gramme de vermiculite
pH 6,5. Les surfaces spcifiques des deux argiles, dtermines par adsorption de N
2
par
mthode BET sur le solide dshydrat, sont respectivement de 7,1 m
2
.g
-1
pour la vermiculite et
15,0 m
2
.g
-1
pour la kaolinite. La quantit dAH fixe sur la kaolinite en suspension est toutefois
infrieure dun facteur 10 celle fixe sur la vermiculite. Ceci peut sexpliquer par la
modification de la surface dadsorption disponible aprs hydratation et gonflement des particules
argileuses : la vermiculite, du groupe des montmorillonodes, est capable de fixer des composs
organiques polaires entre les feuillets argileux alors que ce mcanisme dintercalation est interdit
par la structure de la kaolinite (VAN OLPHEN, 1977).
Lanalyse en CESHP (annexe 3) du surnageant de centrifugation rvle un fractionnement
en poids molculaire des acides humiques lors de ladsorption sur le solide argileux. Lvolution
des chromatogrammes en fonction de la quantit de kaolinite en contact avec la solution est
prsente sur la figure 3.4.
La diminution disymtrique du chromatogramme avec dtection UV, plus leve pour les
composs humiques de poids molculaire important, en fonction de laugmentation de la quantit
de kaolinite en suspension permet de supposer ladsorption prfrentielle de ces molcules sur les
collodes argileux. Les fractions humiques de poids molculaires suprieures 70000 Da sont
adsorbes prioritairement. Ces fractions concernent des molcules (ou des agrgats molculaires)
dacide humique peu fluorescentes ou dont la fluorescence est teinte par rabsorption
intramolculaire du rayonnement. En effet, le chromatogramme avec dtection de fluorescence de
lacide humique initial rvle uniquement des fractions de poids molculaire infrieur 50 000
Da.

18
- 18 -

Figure 3.4 : Signal de fluorescence (a) et dabsorbance (b) des chromatogrammes dexclusion strique de la fraction
dacide humique non adsorb sur la kaolinite - pH 6,5 - I 10
-2
M (NaNO
3
) Concentration initiale en AH = 50 mg.L
-
1
Volume de solution = 25 mL Masse de Kaolinite = 0,2 2,5 g.

3.1.1.3 Interaction du pyrne avec lacide humique
Linteraction en solution du pyrne avec lacide humique est tudie par la mthode dextinction
de fluorescence (annexe 3). Dans les conditions exprimentales de faible concentration en O
2

dissous et court temps dirradiation de lchantillon, il est possible de considrer que le
coefficient directeur de la fonction linaire de Stern-Volmer, reprsentant la dcroissance de la
fluorescence du pyrne en fonction de la concentration dAH, correspond au coefficient de
partage K
oc
du pyrne entre leau et lacide humique :
[ [[ [ ] ]] ]
w
w
oc
S
S
COD K
F
F
*
0
1 = == = + ++ + = == =
o F
0
et F reprsentent respectivement les intensits de fluorescence du pyrne en absence et en
prsence de linhibiteur de fluorescence AH diffrentes concentrations, [COD] la concentration
100 1000 10000 100000 1000000
masse molculaire en g.mol
-1
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

(
U
V

2
8
0

n
m
)
b
100 1000 10000 100000 1000000
masse molculaire en g.mol
-1
I
n
t
e
n
s
i
t

d
e

f
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
e

(
e
x
=
3
3
0

n
m
;

o
b
s
=
4
4
0

n
m
)
masse de
kaolinite
croissante
a
19
- 19 -
dAH en kg-C.L
-1
, S
w
et S
w
*
les solubilits respectives du pyrne (en g.L
-1
) dans leau pure
et dans une solution dAH.
Les relations linaires de Stern-Volmer de lextinction de fluorescence du pyrne par
lacide humique de la solution mre et par la fraction dacide humique non adsorbe sur la
kaolinite sont reprsents sur la figure 3.5. Les points correspondent pour chaque concentration
de carbone organique dissous aux valeurs moyennes de trois essais et les barres derreur lcart-
type.
Les pentes des droites obtenues permettent le calcul des valeurs de K
1oc
de la solution
mre dAH (1,86 10
5
) et K
2oc
des fractions humiques non adsorbes (2,95 10
5
). La valeur K
1oc
est
comparable celle prcdemment publie par PERMINOVA et al.
(2,30,3 10
5
) pour lacide humique Aldrich utilis sans purification pralable.

Figure 3.5 : Trac de Stern-Volmer de lextinction de fluorescence du pyrne par lacide humique Aldrich ( ) et
lacide humique fractionn lors de ladsorption sur la kaolinite ()

La valeur de K
2oc
obtenue pour la fraction non adsorbe des AH est en contradiction avec
la diminution de poids molculaire observe lors de ladsorption des fractions sur largile. Elle
y = 0,2928x + 1
R
2
= 0,9757
y = 0,1877x + 1
R
2
= 0,9803
0
1
2
3
4
5
6
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
mg-C/L
F0/F
20
- 20 -
peut soit traduire une meilleure accessibilit des sites hydrophobes du solut humique pour
le pyrne, soit une meilleure efficacit dextinction de la fluorescence de lHAP.

3.1.1.4 Transfert dans leau du pyrne adsorb sur les particules
La capacit des acides humiques complexer le pyrne permet de supposer que leur
nature et leur concentration en solution gouvernent les mcanismes de dsorption des HAP des
particules argileuses. La solubilisation du pyrne fix sur la kaolinite a t value par mise en
contact de largile rcupre par centrifugation en quilibre dadsorption avec les AH et le
pyrne.
Un volume de 25 mL deau ou dune solution 50 mg-AH.L
-1
est mis au contact de
largile sans agitation, durant 24 heures, pH 6,5 et force ionique 10
-2
M. Quatorze essais ont t
raliss pour des quantits dAH fixes et des masses de pyrne adsorbes variant respectivement
de 0,3 0,7 mg-C.g
-1
et de 0,2 et 1,0 g-pyr.g
-1
. La masse de pyrne remise en solution nest
affecte ni par le film organique la surface de la kaolinite, ni par la quantit de pyrne
initialement adsorbe. De plus, les quantits de pyrne re-solubilises dans leau pure (12 ng
en moyenne, avec un cart-type de 9 ng) sont comparables celles mesures dans la solution
dAH (65 ng en moyenne, avec un cart-type de 26 ng). Ces quantits ne reprsentent quune
faible fraction de la masse initialement adsorbe sur la kaolinite (respectivement 2 et 13%). Les
concentrations obtenues (2,4 nM et 12,9 nM) restent trs infrieures la limite de solubilit du
pyrne dans leau pure (802 nM).
SCHMITT et al. (1999) ont prcdemment dmontr que la cintique de dsorption du
pyrne dune phase solide quartz nest pas influence par la prsence de matire organique
naturelle (extraite de lac marcageux ou de sol). Les rsultats obtenus dans cette tude montrent
que les acides humiques nont galement quune faible incidence sur la quantit de pyrne
dsorbe dune phase solide argileuse.

3.1.2 Rpartition du pyrne dans les sdiments du Lac dAiguebelette

3.1.2.1 Rpartition du pyrne dans le cas des concentrations infrieures la solubilit
aqueuse
21
- 21 -
Afin de dterminer le comportement du pyrne vis--vis des deux sdiments
slectionns dans le cadre de cette tude, le solide brut a t mis en contact avec des solutions
aqueuses de pyrne ( concentration infrieure la solubilit de cet HAP dans leau pure).
La solution aqueuse de pyrne permet la mise en suspension du solide. Le temps de contact entre
particules et phase aqueuse est fix 24 heures, temprature de 20C, lobscurit afin de
prvenir dventuelles ractions photochimiques.
Des solutions de pyrne dans leau UHQ (50 mL 150 et 118 g/L) ont t utilises pour la mise
en suspension de 100 mg de sdiment crayeux et de sdiment tourbeux respectivement. La masse
de pyrne adsorbe (dtermine par bilan de matire aprs dosage dans la phase liquide) est gale
33 g/g de craie et 16 g/g de tourbe.
Lenregistrement du spectre de fluorescence des deux phases liquides (excitation 313
nm observation de 350 430 nm) montre que les rapports dintensit des deux bandes de
fluorescence du pyrne (I et III, 372 et 384 nm) sont conformes celui de la molcule de
pyrne environn de molcules deau (I3/I1=0,55). La matire organique humique constituant le
solide (ou fix sur celui-ci) na donc pas t remise en solution lors du contact avec le solvant
(Fig. 3.6).

Figure 3.6 : Spectres de fluorescence du pyrne aprs contact entre la solution et le sdiment

0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
350 360 370 380 390 400 410 420 430
long. onde (nm) - exc313
I
F

(
u
a
)
craie
tourbe
I
3
/I
1
= 0,55
22
- 22 -
3.1.2.2 Rpartition du pyrne pour des niveaux de contamination 2, 20 et 200 ppm
Afin dvaluer la biodisponibilit du pyrne, le solide brut a t contamin en employant
des niveaux de concentration plus leve en pyrne. La rpartition du pyrne dans les diffrentes
phases des sdiments prlevs dans le Lac dAiguebelette a t quantifie en distinguant trois
fractions : les particules du sdiment (constitu de la phase solide dcante en 2 heures dans les
flacons), la suspension collodale (constitue de leau surnageante et des particules fines non
dcantes en deux heures) et la solution aqueuse vraie (correspondant la suspension collodale
filtre 0,45 m).
Les rsultats prsents dans les tableaux ci-dessous montrent que la majorit du pyrne,
comme attendu, est fix sur les particules solides du sdiment, quelle que soit le niveau de
contamination. Le pyrne solvat par leau reprsente des concentrations fortement infrieures au
maximum de solubilit. La concentration en HAP dans la solution collodale devient importante
pour les deux types dchantillon lorsque le niveau de contamination est lev. On peut alors
vraisemblablement supposer que les sites des particules du solide accessibles au pyrne sont tous
occups ; un quilibre dynamique existe avec les sites disponibles sur les particules collodales.
Ces rsultats laissent donc supposer une fixation prfrentielle du pyrne sur le solide
dcantable. Le pyrne ne se fixerait sur les collodes en suspension quaprs saturation des sites
accessibles sur le sdiment.

Contamination 2 ppm particules du sdiment
(g/kg poids sec)
Suspension collodale
(g/L)
Solution aqueuse vraie
(g/L)
Sdiment tourbeux 380 9 1
Sdiment crayeux 1000 10 6

(g/kg poids sec)
(g/L)
(g/L)
Sdiment tourbeux 4650 10 2
Sdiment crayeux 5910 120 19

(g/kg poids sec)
(g/L)
(g/L)
Sdiment tourbeux 119 000 850 2
Sdiment crayeux 130 000 264 12
23
- 23 -

3.2. Photo-oxydation du pyrne

Ltude du devenir du pyrne dans lenvironnement sous irradiation solaire est un paramtre
important matriser. En effet, les photo-transformations reprsentent lune des principales
voies de dgradation abiotique des polluants organiques en phase aqueuse et en phase
adsorbe la surface dun support solide. Nous avons dans ce travail tudi la photo-
transformation du pyrne dans les diffrents compartiments de lenvironnement o il est
susceptible de saccumuler :
" en phase aqueuse, avec une concentration en pyrne gale sa limite de solubilit
(0,135 mgL
-1
).
" sur des supports solides modles, en phase adsorbe sche, diffrentes
concentrations : 20 ppm et 10 000 ppm de pyrne.
" sur deux types de sdiments du Lac dAiguebelette, crayeux et tourbeux.
" sur supports solides modles et les sdiments en prsence dune colonne deau, avec
les mmes taux de recouvrement.

A partir dtudes cintiques, nous avons pu dterminer les dures de demi-vie du Pyrne sur
les diffrents supports solides en prsence et en absence dune colonne deau. Un grand
nombre de photo-produits forms lors de lirradiation du pyrne ont pu tre identifis,
permettant de proposer un mcanisme de photo-dgradation du pyrne.

Du point de vue exprimental, les cintiques de dgradation du Pyrne ont t ralises en
enceinte de simulation dirradiation solaire, Suntest CPS+ ATLAS, avec une lampe arc
xnon simulant le rayonnement solaire (290 nm < <800 nm). Lnergie d'irradiation est de
765 W.m
-2
et la temprature lintrieur de lenceinte de 35 5 C. La correspondance entre
le temps dirradiation en enceinte et le temps dirradiation solaire rel en Europe centrale est :
4 h denceinte = 45 h densoleillement.

3.2.1. Devenir photochimique du pyrne en solution aqueuse

Une solution aqueuse sature de pyrne est prpare dans l'eau dsionise la concentration
de 0,135 mg.L
-1
soit 6,7.10
-7
mol.L
-1
. Comme on peut le constater sur la figure 3.7, le pyrne
disparat rapidement sous irradiation lorsqu'il est prsent en solution.
24
- 24 -

0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0 10 20 30 40 50 60 70
Temps (min)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

e
n

p
y
r
n
e

(
m
g
/
L
)

Figure 3.7 : Cintique de dgradation du pyrne dans l'eau (200 mL) sous irradiation solaire.

La cintique de photo-dgradation du pyrne dans l'eau tant une cintique d'ordre 1, il est
possible de calculer la constante de vitesse k de photo-dgradation du pyrne en solution
aqueuse par le calcul du coefficient directeur de la droite Ln (C/C
0
) = - k t. On obtient alors k
= 0,055 min
-1
. Le temps de demi-vie du pyrne en solution dans leau peut galement tre
estim :
= Ln 2 / k = 12,6 min en enceinte dirradiation soit 2,4 h densoleillement

moyen (Europe centrale). La photolyse directe du pyrne dans leau est donc relativement
rapide sous irradiation solaire, compare la demi-vie de 41 min publie prcdemment
(Smith et al 1979 ; Zepp et al 1979), mais les auteurs nont toutefois pas prcis lnergie de
la lampe.
Afin dvaluer linfluence de loxygne sur la dgradation du pyrne, des expriences
complmentaires ont t menes 254 nm dans un racteur ferm. Loxygne est en effet un
lment essentiel dans de nombreux processus de photo-dgradation direct. La figure 3.8
compare la photo-dgradation du pyrne entre une atmosphre are et oxygne.

Il apparat donc quen solution aqueuse, la photo-dgradation du pyrne est plus rapide sous
oxygne pur que sous air, ce qui confirme limportance de loxygne dans le mcanisme de
photo-oxydation.

25
- 25 -

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Temps (min)
eau are
eau + O2

Figure 3.8 : Photodgradation du Pyrne deux pressions partielles doxygne diffrentes

3.2.2. Devenir photochimique du pyrne sur supports minraux modles

3.2.2.1 Prparation et caractrisation des chantillons
Dans un premier temps, avant de travailler sur les sdiments crayeux et tourbeux du
Lac dAiguebelette, nous avons travaill sur des supports minraux modles plus simples
SiO
2
, CaCO
3
, Montmorillonite qui ont t slectionns pour leur abondance et leur
reprsentativit dans lenvironnement (Sparks 1995). La prparation des chantillons est
dcrite en annexe 4. Ltat dadsorption du pyrne sur les diffrents supports solide est
caractris par spectrofluorimtrie (Perkin-Elmer LS-5).

A la surface des supports solides, le pyrne forme des aggrgats caractriss par une bande
dmission dexcimre centre vers 480 nm, avec un lger dplacement de longueur donde
selon le support tudi. Cette mission est bien distincte de lmission molculaire 374 et
389 nm obtenue en solution dans leau 2.10
-7
mol.L
-1
. Ds que lon passe un rapport
massique de 200 et par consquent 20 ppm, le Pyrne se trouve majoritairement sous forme
molculaire. Il a donc peu tendance former des microcristaux.

3.2.2.2 Photo-dgradation du pyrne sur phase solide sche
Les cintiques de dgradation donnes ci-dessous sont compares celle obtenue lors
de lirradiation des cristaux de pyrne seuls, afin de dterminer linfluence du support sur la
photo-dgradation du pyrne (Fig. 3.9).
26
- 26 -

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Temps (min)
%

d
e

P
y
r
n
e
Montmorillonite
cristaux de Pyr
SiO2
CaCO3

Figure 3.9 : Cintiques de dgradation du pyrne adsorb sur supports secs contamins 10 000 ppm
et des cristaux de pyrne.

Aprs 4 heures d'irradiation, il sest dvelopp une coloration brune sur la silice, jaune
clair sur la calcite (Figure 3.10) et gris-vert sur la montmorillonite (non photographi), qui
montre clairement quun processus de photo-transformation du pyrne est intervenu. Sur
montmorillonite, le pyrne se dgrade 2 fois moins vite que pour les deux autres supports.
Ceci peut s'expliquer par un phnomne de comptition dabsorption entre le pyrne et l'argile
qui tous deux absorbent la lumire solaire. Largile en recouvrant le pyrne joue en fait un rle
de filtre interne.

Figure 3.10 : Pyrne sur silice (haut) et Pyrne sur calcite (bas) de t = 0 240 min de gauche droite.

Toutes les cintiques de photo-dgradation du pyrne sur support modle sec sont
d'ordre 0 apparent. Les coefficients directeurs des droites C - C
0
= - k
1
t obtenues (Tableau
3.1) correspondent aux constantes de vitesse apparentes de photo-dgradation du pyrne.
Compare la photodgradation des cristaux de pyrne seuls, ladsorption du pyrne sur
Montmorillonite entrane une diminution importante de la vitesse de disparition du pyrne, alors
que les rsultats obtenus sur SiO
2
et CaCO
3
(Tableau 3.1) prsentent une dgradation plus
rapide. Ces rsultats peuvent tre lis lintensit de la lumire diffuse la surface du solide :
27
- 27 -
SiO
2
et CaCO
3
prsentent une forte diffusion de lumire (supports blancs), tandis que la
Montmorillonite diffuse plus faiblement la lumire (support gris). Les rsultats des intensits de
diffusion de la lumire mesures par spectromtrie de fluorescence 350 nm sont prsentes dans
le tableau ci-dessous.

Tableau 3.1 : Constantes de vitesse de photodgradation du pyrne sur supports secs et humides, et intensits de
lumire diffuse la surface du solide.

Support solide
constante de vitesse
k
1

support sec
(mol.g
-1
.min
-1
)
constante de vitesse k
2

support dans leau
(mol.g
-1
.min
-1
)

k
1
/k
2

I
em
.de lumire diffuse (a.u)
support sec
exc.
= 350 nm,
em.
= 350 nm
SiO
2
1,4.10
-7
4,3.10
-8
3,3 636
CaCO
3
1,4.10
-7
4,3.10
-8
3,3 688
Montmorillonite 0,7.10
-7
1,9.10
-9
36,8 186
Cristaux de pyrne 1,0.10
-7
- - -

3.2.2.3 Photo-dgradation du pyrne sur phase solide, en prsence dune colonne deau
Aux prparations sur supports solides prcdentes, on ajoute alors 50 ml deau
dsionise constituant 3 cm de colonne deau au dessus du support. Les chantillons sont
recouverts dun film polymre transparent au rayonnement solaire empchant toute
vaporation du liquide. Avant irradiation, les chantillons sont placs lobscurit pendant 2
h, jusqu ce que lquilibre de partition soit atteint entre le pyrne prsent dans phase aqueuse
et la phase solide.
Le devenir du pyrne est alors tudi dans les deux compartiments. Adsorb sur le
support, la cintique de dgradation du pyrne suit l encore une loi dordre zro, comme observ
sur support sec. Nanmoins, les constantes de vitesse k
2
sont beaucoup moins rapides comme
indiques dans le tableau 3.1, ci-dessus.
Durant la priode dquilibre, le pyrne se solubilise en phase aqueuse jusqu
saturation. Lors de lirradiation, le pyrne se dgrade avec une cintique dordre 1 comme vu
initialement (figure 3.7). Dans la colonne deau au-dessus des trois supports tudis, les
constantes cintiques k mesures sont plus faibles que celle obtenue dans leau seule
(Tableau 3.2).
28
- 28 -

Tableau 3.2 : Comparaison des constantes de vitesse de photolyse du pyrne dans leau et dans les colonnes deau
au-dessus des supports.
Constante de photolyse k du Pyrne (min
-1
) Turbidit (FAU)
Eau 0,055 0
Colonne deau sur SiO
2
0,014 2
Colonne deau sur CaCO
3
0,009 54
Colonne deau sur Montmorillonite 0,008 50

La diminution des constantes de vitesse de photolyse du pyrne dans leau est fonction de la
turbidit (mesure par spectrophotomtrie) de la colonne deau au-dessus du support.
On remarque cependant quaprs 100 min dirradiation, il persiste toujours une concentration
rsiduelle de pyrne en solution, denviron 0,02 mg.L
-1
. Cette observation peut-tre interprte
comme tant le rsultat dun quilibre entre la vitesse de dsorption/solubilisation du pyrne du
support et la vitesse de photodgradation du pyrne.

En prsence deau, la diminution des constantes de vitesse du pyrne sur les supports
solides peut tre attribue une plus faible concentration en oxygne que dans lair (environ 36
fois moins). Loxygne O
2
joue donc un rle important dans le processus de dgradation du
pyrne. Le point positif souligner est que la photolyse du Pyrne a lieu la fois directement
dans leau et sur supports solides immergs. Cependant, la hauteur de la colonne deau pourra
limiter la photolyse du Pyrne dans le cas de lirradiation de supports solides pour lesquels la
turbidit de la colonne deau sera importante, ce qui est le cas pour le Lac dAiguebelette. Les
sdiments ne seront alors plus irradis par la lumire solaire et seul le Pyrne solubilis dans
leau et/ou adsorb sur la matire en suspension sera sujet la photolyse.

3.2.2.4 Photo-dgradation du pyrne adsorb sur les sdiments
La mme tude a t ralise sur les sdiments tourbeux et crayeux du Lac
dAiguebelette. Les sdiments ont t contamins 20 ppm pour se rapprocher le plus
possible des conditions vraisemblables de pollution environnementale. En parallle, une
exprience a t ralise avec la silice (20 ppm), lun des trois supports modles tudis
prcdemment (Fig. 3.11).
29
- 29 -

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Temps (min)
%

d
e

P
y
r
n
e
SiO
2
Craie
Tourbe

Figure 3.11 : Photolyse du pyrne adsorb sur sdiments et silice (20 ppm),
recouvert dune colonne deau de 3 cm.

Contrairement la cintique de photo-dgradation dordre zro obtenue sur silice pour
une concentration de pyrne de 10 000 ppm, on observe 20 ppm une cintique de photo-
transformation du pyrne du 1
er
ordre, semblable celle obtenue en solution aqueuse. Sur les
sdiments, la dgradation du pyrne est plus lente que sur les supports modles calcite et
montmorillonite, mais toujours dordre zro.

Il semble donc que pour la silice uniquement, aux faibles concentrations en pyrne sur
le support solide, on ait un comportement similaire celui dune solution de pyrne dilue ,
avec donc aucun effet dcran d la prsence de micro-cristaux comme observ 10 000
ppm. Le spectre de fluorescence du pyrne adsorb sur silice 200 ppm confirme dj que
cest bien la forme molculaire du Pyrne qui prdomine, quivalent au pyrne en solution.

Sur les sdiments crayeux et tourbeux, la baisse de la concentration en pyrne
nintervient pas sur la cintique de photolyse du pyrne cause de la trs forte turbidit des
sdiments qui est donc le facteur limitant de la photo-dgradation (Tableau 3.3).
Sur les sdiments et sur silice en absence deau, les cintiques conservent la mme allure, mais
sont lgrement plus rapides comme lindique les donnes du tableau 3.3.

30
- 30 -

Tableau 3.3 : Constantes de vitesse de photolyse du pyrne (20 ppm) sur sdiments et sur silice,
recouverts ou non dune colonne deau.
Support Constante de vitesse
e photo-dgradation du pyrne
Turbidit (FAU)
Sdiment tourbeux + colonne deau 5,5.10
-11
mol.g
-1
min
-1
133
Sdiment tourbeux sec 6,6.10
-11
mol.g
-1
min
-1
-
Sdiments crayeux + colonne deau 5,5.10
-11
mol.g
-1
min
-1
78
Sdiments crayeux sec 6,6.10
-11
mol.g
-1
min
-1
-
Silice + colonne deau 9,6.10
-3
min
-1
2
Silice sche 9,6.10
-3
min
-1
-

3.2.2.5 Bilan sur lvaluation des dures de demi-vie du pyrne

Le tableau ci-dessous compile les temps de demi-vie du pyrne que lon peut estimer
partir des tudes cintiques prcdentes, pour une puissance de lampe de 765 W.m
-2

correspondant un nombre de photon mis de 2,4.10
21
photon.m
-2
.s
-1
ou encore une
actinomtrie de Io=4.10
-3
Einstein.m
-2
.s
-1
.

Tableau 3.4: Temps de demi-vie du pyrne adsorb sur supports solides recouverts ou non dune colonne deau
de 3 cm.
Support : Concentration en
Pyrne (ppm)

du Pyrne (h)
support sec

du pyrne (h)
support + colonne deau
SiO
2
10 000 3 10
SiO
2
20 1 1
CaCO
3
10 000 3 10
Montmorillonite 10 000 6 221
Sdiment tourbeux 20 8,5 15
Sdiment crayeux 20 8,5 15
Cristaux de Pyr - 3 -
Pyrne dans leau 0,135 - 0,3

31
- 31 -
3.2.3. Les photo-produits du pyrne forms et le mcanisme de photolyse

3.2.3.1. Identification des photo-produits

Tous les photo-produits observs sont prsents la fois en phase aqueuse et sur phase solide.
Les quantits sont plus importantes sur les supports solides que dans leau, o le pyrne nest
prsent quen limite de solubilit.
En accord avec les tudes cintiques prcdentes et la couleur brune dveloppe la surface du
support aprs irradiation solaire, le pyrne est dgrad en plusieurs sous-produits. Les analyses
ralises en HPLC et GC/MS montrent la formation de produits plus polaires que le pyrne,
except pour un seul produit qui se trouve tre moins polaire. Dans le tableau 3.5, huit structures
de photoproduits sont proposes partir des spectres de masse et par comparaison avec les
donnes de la littrature, temps de rtention et spectre UV-Visible publis (L.Launaen et al 1995 ;
Y.Mao et al 1994).

Tableau 3.5 : Photo-produits du pyrne forms sous irradiation solaire et identifis par GC/MS et RMN.

Molcules Pic molculaire
temps de rtention GC/MS
Fragmentation Appellation
OH

m/z = 218

m/z = 189

1-hydroxypyrne
a

OH
H
H
OH
1
2
3
4 5
6
7
8

m/z = 236

m/z = 218
mz = 200

1,6 et/ou 1,8-dihydro dihydroxy
pyrne
OH
OH

O
O
H
H

m/z = 234

m/z = 234

m/z = 234

m/z = 205
m/z = 177

m/z = 205
m/z = 176

1,6- et/ou 1,8-dihydroxypyrne

3,4-dioxtane pyrne

2,2'-biformyltriphnyl
32
- 32 -

CHO
CHO

O
O

m/z = 232

m/z = 189

1,6- pyrnedione

confirm par RMN

O
O

m/z = 232

m/z = 189

1,8-pyrnedione

m/z = 402

m/z = 356, 327, 291

1,1-bipyrne
a confirm parcomparaison avec un standard en HPLC.
b confirm par RMN, cf annexe 4.

Un exemple type dattribution des pics apparaissant sur les chromatogrammes HPLC est
donn sur la figure 3.12. Seul le 1-hydroxypyrne, produit primaire, a pu tre identifi laide
dun standard commercial.

La confirmation des structures prsentes doit cependant tre poursuivie, notamment pour ce
qui est des produits polaires qui sont difficiles identifier. Le 1,1-bipyrne, dimre du pyrne,
qui nest pas un compos issu dun processus de photooxydation mettant en jeu O
2
, a t
observ sous irradiation uniquement en prsence dargile, qui semble favoriser la fromation de
ce compos par recombinaison radicalaire.

33
- 33 -

Figure 3.12 : Sparation des photo-produits par HPLC.

3.2.3.2 Mcanisme de photo-dgradation du pyrne

Deux mcanismes d'oxydation photochimique du pyrne par l'oxygne de l'air sont possibles
selon la figure 3.13. Le premier suppose une raction du pyrne avec l'oxygne singulet
1
O
2
*,
et, le second ferait intervenir le radical cation du pyrne suite un transfert de charge entre le
pyrne et loxygne [Pyr
+
, O
2
-
] (Barbas et al. 1996, Reyes et al 2000).

TIS

Figure 3.13 : Mcanisme possible de photo-dgradation du pyrne.

Pyr + SiO
2

O2/ h#
Pyr* (S
1
) Pyr* (T
1
)

O
2
O
2

Pyr
+
+ O
2
-
Pyr +
1
O
2
*

PyrOH + ... PyrOH
2
+
PyrO
2

34
- 34 -
3.2.3.2.1. Influence de loxygne singulet sur la photo-transformation du pyrne

Afin de tester si l'oxygne singulet O
2
(
1
g
) est impliqu dans le processus de dgradation, le
pyrne est irradi en prsence de rose de Bengale (RB) entre 450 et 570 nm. Le RB connu
comme photosensibilisateur produisant de l'oxygne singulet, a t coadsorb avec le pyrne sur
le support. Un film polymre a permis de filtrer les longueurs d'ondes infrieure 400 nm, et
d'irradier le RB sans toucher le pyrne selon les ractions (a-b). Dans l'tape finale (c), le pyrne
est oxid.

(a) RB + h! RB *
(b) RB * +O
2
RB + O
2
*
(c) O
2
* + pyrne pyrne oxyd

Les rsultats de cette exprience prsents dans le tableau 3.6, montrent un rendement de
photodgradation relativement faible du pyrne en prsence de RB. L'oxygne singulet ne joue
donc pas un rle significatif lors de la photo-transformation du pyrne.

Tableau 3.6 : Pyrne rsiduel aprs 4 h d'irradiation (SiO
2
10 000 ppm pyrne).

Pyrne en prsence de : SiO
2
SiO
2
+ rose Bengale SiO
2
+ HgCl
2

Pyrne rsiduel :
60 % 93 % 9,2 %

3.2.3.2.2. Dtermination de ltat excit responsable de la photo-
ractivit du pyrne

Laugmentation de la vitesse de photodgradation du pyrne en prsence de HgCl
2
, un quencher
du transfert intersystme du pyrne S
1
T
1
(Sigman et al 1998), montre que le pyrne est plus
facilement dgrad lorsque seul ltat singulet S
1
intervient. Ltat triplet T1 du Pyrne qui ragit
avec loxygne molculaire pour donner de loxygne singulet et des produits oxyds est donc
bloqu.
Ainsi, le processus de phototransformation met principalement en jeu ltat S
1
du pyrne.

35
- 35 -
3.2.3.2.3. Mcanisme de photo-transformation du pyrne

En accord avec la littrature, nous avons montr, grce une collaboration avec le Pr. Sarakha de
lUniversit Blaise Pascal, que cest bien le radical cation du pyrne Pyr
+
qui est la premire
espce forme dans le mcanisme de photooxidation du pyrne en solution, la surface de la
silice et probablement la surface des sdiments (Sigman et al 1998 ; Shallow 1991). La forte
absorption de ces derniers la longueur donde du Laser, na cependant pas permis de
caractriser la prsence du radical cation.
Le pyrne se dgrade par un mcanisme mettant en jeu un transfert dlectron entre le pyrne et
O
2
et/ou entre le pyrne et le support (Thomas et al 1988 ; David et al 1993) conduisant la
formation de Pyr
+
et de O
2
-
selon le schema suivant (Fig. 3. 14).
h
+
OH
H
2
O
OH
OH
O
O
O
O
O
2
-
, SiO
2
-
O
2
or SiO
2
H
2
O
O
2
, SiO
2
+
*
O
2
or SiO
2
H
2
O

Figure 3.14 : Mcanisme de photodgradation du pyrne adsorb sur SiO
2
.

Les principaux produits primaires forms sont des produits mono et dihydroxyls (en position
1,6- ; 1,8- ; et/ou 3,4-). Les photo-produits secondaires obtenus sont des composs carbonyls
1,6 ; 1,8 et/ou 3,4-pyrnedione.

36
- 36 -
3.3. Conclusions
Spciation du pyrne
Le pyrne sadsorbe efficacement sur la kaolinite pH 6 et force ionique 10
-2
M. La quantit
maximale adsorbe na pu tre atteinte exprimentalement, un phnomne de cristallisation de
lHAP en surface des sites hydrophobes de largile peut expliquer ce mcanisme. La prsence de
substances humiques adsorbes dans les mmes conditions de pH et de force ionique limite les
interactions du pyrne avec le solide : le phnomne peut alors tre modlis par une isotherme
de Freundlich (K
F
0,30 et n
F
2,00).
Les fonctions carboxyliques du matriel humique dissous, reprsentant plus de la moiti des
fonctions acides, sont dprotonnes dans les conditions dessai. Malgr la charge ngative de
surface ce pH, la kaolinite fixe une quantit dacide humique proche de
0,2 mg C.g
-1
. Le phnomne peut tre modlis par une loi de Freundlich de paramtres K
F
0,79
et n
F
1,90. Ladsorption sur la kaolinite entrane un fractionnement de lacide humique, dmontr
par des variations importantes de la forme des chromatogrammes dexclusion strique de la
fraction solubilise. Les composs de poids molculaire lev, qui absorbent 280 nm mais qui
fluorescent faiblement, sont fixs prfrentiellement.
Les valeurs de logKoc obtenues par trac de la relation de Stern-Volmer varient de 5,27 pour
lacide humique initial 5,47 pour la fraction dAH non adsorbe sur la kaolinite, traduisant une
capacit de liaison avec le pyrne plus importante de la fraction humique non adsorbe par
rapport lacide humique initial. Cette augmentation peut toutefois ntre due qu une meilleure
efficacit dextinction de la fluorescence du pyrne par les composs humiques non adsorbs.
La solubilisation du pyrne fix sur les particules de kaolinite laide dune solution aqueuse
contenant 50 mg.L
-1
dacide humique dissous (pH 6,5 et I 10
-2
M) est faible et comparable celle
obtenue avec leau pure. Le rle de lAH dans le transfert du pyrne du sdiment la phase
aqueuse apparat donc relativement peu important. Des essais mettant en oeuvre des solides
prlevs dans un cosystme aquatique et des substances humiques extraites deaux naturelles
sont raliser pour complter ces rsultats.
Pour les sdiments naturels utiliss dans cette tude, le pyrne se fixe efficacement sur les
particules solides dcantables. La quantit adsorbe est suprieure sur le sdiment crayeux, quel
que soit le niveau de contamination initiale de lchantillon. Les concentrations du pyrne dissous
37
- 37 -
dans leau sont toujours extrmement faibles (et trs infrieures la limite de solubilit dans
leau pure).

Devenir photochimique du pyrne
Ce travail a permis de montrer que le Pyrne se photo-transforme la surface des diffrents
supports modles et sdiments tudis et ceci la fois en phase sche et humide. La vitesse de
dgradation est plus rapide lair quen prsence dune colonne deau et dpend directement
de la couleur du support et de lintensit de lumire diffuse par celui-ci. On observe une
dgradation plus rapide du pyrne sur les supports blancs qui diffusent le mieux la lumire. En
prsence dune colonne deau, la concentration de O
2
diminue la surface du support solide et
la vitesse de dgradation du pyrne est plus lente. Le mcanisme primaire de la photo-
oxydation fait intervenir un radical cation du pyrne via son tat excit singulet par transfert
lectronique avec loxygne et probablement le support solide.
Au vu de ces rsultats, l'intensit de la lumire solaire et la concentration du milieu en
oxygne sont des paramtres importants dans le processus de dgradation abiotique du pyrne
dans lenvironnement.

38
- 38 -
4. EFFETS DU PYRENE ET DE SES PRODUITS DOXYDATION SUR DES
ORGANISMES SUPERIEURS DE REFERENCE

4.1. Effets du pyrne lors de tests monospcifiques sur organismes de rfrence

4.1.1. Objectifs des tests monospcifiques
Pralablement la mise en uvre de bioessais sur microcosmes de laboratoire, une valuation de
la toxicit du pyrne sur chacun des organismes du microcosme savre ncessaire, pour dune
part choisir au mieux la gamme de concentrations (ou la concentration) tudier en microcosmes,
et dautre part disposer de donnes permettant daider linterprtation des rsultats qui seront
obtenus en microcosmes.
Deux types de tests monospcifiques ont donc t mis en oeuvre selon le type dorganisme
considr : des tests en phase aqueuse (algues, daphnies, lentilles deau) et des tests en prsence
de sdiments (amphipodes, chironomes). Diffrents paramtres ont t tudis tels que la dure
dexposition au toxique, linfluence de lintensit lumineuse, la partition du pyrne dans les
diffrentes matrices (eau, sdiments) ou bien encore la bioaccumulation du pyrne par les
amphipodes. Les matriels et mthodes sont rappels en annexe.

4.1.2. Rsultats des tests de toxicit du pyrne en phase aqueuse sur daphnies, microalgues,
lentilles deau et amphipodes
Les tests en phase aqueuse ont permis de caractriser la toxicit du pyrne pour des organismes
qui sont en contact direct avec le contaminant. Pour les tests sur daphnies Daphnia magna
(tableau 4.1), il apparat dans un premier temps que la toxicit du pyrne augmente avec la dose
laquelle ces organismes sont exposs, rsultat attendu. L'analyse statistique des rsultats montre
par ailleurs, pour les tests daphnies, une plus grande toxicit du pyrne 48h qu' 24h (p<0.05),
autre rsultat logique. Aprs 24h d'exposition au pyrne, l'intensit lumineuse n'influe pas sur la
toxicit du pyrne, ce qui n'est pas le cas aprs 48h d'exposition (p<0.05). Nanmoins, la
phototoxicit du pyrne semble moins leve que pour le fluoranthne, HAP pour lequel la
toxicit est plus que multiplie par trois entre des conditions d'obscurit et une intensit
lumineuse de 1500 lux (Clment et al., 2000). Il convient de prciser que le terme
phototoxicit est utilis ici dans des conditions particulires de lumire fluorescente contenant
en principe peu de longueurs donde ractives et avec une irradiance assez faible puisquil faut
39
- 39 -
comparer lintensit de 1500 lux utilise ici aux 100000 lux mesurs classiquement en plein
soleil midi en t. Malgr la faible quantit dUV (10% du rayonnement total, soit 54 W/cm2
dans le domaine 220-385 nm selon Clment et al., 2000), on note quand mme une certaine
phototoxicit.

Tableau 4.1 : Valeurs des CE
50
moyennes des tests sur daphnies Daphnia magna

Conditions Nombre de tests CE
50
-24h (g/L) CE
50
-48h (g/L)
Obscurit 3 167.25 1.59 67.94 7.90
1500 Lux 2 138.85 20.42 74.05 1.89
2500 Lux 3 105.35 32.74 47.72 24.67
6000 Lux 3 161.22 16.17 44.452.59

Bien que les rsultats ne soient pas statistiquement exploitables, la toxicit du pyrne envers
lamphipode Hyalella azteca (tableau 4.2) semble tre fonction de la dure d'exposition et de
l'intensit lumineuse, notamment aprs 48h d'exposition. En effet, la CE
50
-48h est plus que
divise par deux entre les conditions d'obscurit et une intensit lumineuse de 6000 lux.
L'augmentation de la toxicit du pyrne avec l'intensit lumineuse confirme le caractre
phototoxique de cet HAP. De plus, l'volution souligne de cette mme toxicit en fonction du
temps d'exposition peut indiquer un phnomne de bioaccumulation du pyrne par les organismes
au cours de l'essai.

Tableau 4.2 : Valeurs des CE
50
des tests en phase aqueuse sur amphipodes Hyalella azteca

Conditions CE
50
24h (g/L) CE
50
48h (g/L)
Obscurit 81.48 62.56
1500 lux 79.62 41.08
3500 lux 134.16 41.23
6000 lux 77,17 25,87

A noter que Vindimian et al. (2000) rapportent, pour des organismes de type amphipode, un seuil
deffet biologique significatif de 1200 g/L pour le pyrne. Bien quils ne prcisent pas la source
de cette valeur, le fait de se trouver bien au-del de la limite de solubilit du pyrne amne
sinterroger sur les conditions dans lesquelles lessai correspondant a t ralis, moins quil ne
sagisse dune valeur extrapole.
Le test sur algues dmontre une toxicit aigu du pyrne pour Pseudokirchneriella subcapitata.
En effet, l'inhibition de la croissance algale est trs importante puisque la CE
50
est infrieure 10
g/L.
40
- 40 -
Le test sur lentilles Lemna minor, du fait de la croissance insuffisante des lentilles dans les
tmoins, aurait d logiquement tre dupliqu. Toutefois, on remarque qu'il n'y a aucun effet du
pyrne, ni sur la croissance ni sur le poids sec moyen des lentilles en fin de test, et ce pour toutes
les concentrations tudies. Des tudes menes sur une autre espce (Lemna gibba) donnent une
CE
50
-8-jours suprieure 8000 g/L (Huang et al., 1995) et une concentration sans effet observ
sur la croissance de 500 g/L (Ren et al., 1994).
La question de la stabilit du pyrne au cours des diffrents essais raliss se pose. En effet, il se
peut que le pyrne soit partiellement adsorb sur les parois en verre des flacons ou partiellement
dgrad la lumire, ce qui pourrait conduire une moindre toxicit. Une partie du pyrne
pourrait aussi s'vaporer au contact de l'air ambiant. Pour cela, nous avons ralis des mesures
pour connatre lvolution de la teneur du milieu en pyrne dans les diffrents rcipients qui
contiennent les solutions tester. Les rsultats (figure 4.1) montrent une tendance la baisse,
quil sagisse des rcipients laisss lobscurit ou de ceux laisss la lumire. Par ailleurs,
leffet de la lumire est clairement mis en vidence dans les rcipients o la surface de plan deau
claire directement est maximale (bchers). Lorsquune paroi de verre sinterpose entre la
lumire et le pyrne la photo-dgradation est bien moindre, probablement du fait du rle
protecteur du verre vis--vis des UV. Un autre essai a t men pour valuer limportance de
ladsorption du pyrne sur les parois des bchers de 2 L utiliss dans les essais en microcosmes.

Figure 4.1. Evolution du pyrne en phase aqueuse expos ou non la lumire dans diffrents types de rcipients

0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

d
e

p
y
r
n
e

(

g
/
L
)
0 24 48 72
Temps (h)
Tube obscurit
Tube lumire
Erlen obscurit
Erlen lumire
Bcher obscurit
Bcher lumire
41
- 41 -
Les rsultats (figure 4.2) montrent que les teneurs en pyrne diminuent de 58 63% en 34
jours. Seule ladsorption intervient puisque les rcipients sont couverts (pas dvaporation qui de
toutes faons conduirait concentrer le pyrne) et placs lobscurit. La stabilit de solutions
aqueuses de pyrne dans diffrents milieux (dont le milieu du test daphnies) avait t value en
parallle ltude de Vindimian et al. (2000). Les concentrations dans les solutions de lessai
daphnies se maintiennent sur 24h mais chutent aprs.

Figure 4.2. Evolution du pyrne en phase aqueuse dans les rcipients de 2 L utiliss dans les essais en microcosmes
(systmes labri de la lumire, teneurs initiales : 10 et 100 g/L)

4.1.3. Rsultats des tests en sdiments sur Chironomus riparius et Hyalella azteca

4.1.3.1. Rendements de dopage et volution/partition du pyrne au cours dun test en
sdiment
A partir des analyses de pyrne ralises sur les sdiments dops et mis sous eau 3 4 jours
loccasion du test sur amphipodes, il est possible de se faire une ide du rendement de dopage
(tableau 4.3). Il sagit en fait dune approximation puisque la dtermination du rendement de
dopage rel aurait demand deffectuer des prlvements juste aprs dopage. Si lon exclut deux
valeurs anormales , on retrouve de 74 98 % des teneurs nominales pour les deux sdiments.
Les valeurs de 4.86 mg/kg frais pour la craie et de 11.54 mg/kg frais pour la tourbe semblent
respectivement trop leve et trop faible par rapport aux teneur nominales respectives de 2 mg/kg
et 20 mg/kg, rsultat peut-tre li des problmes dchantillonnage ou analytiques.

0
50
100
150
200
250
300
350
0 15 30 45 60
Jour
U
n
i
t
s

d
e

f
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
e

r
e
l
a
t
i
v
e
10 g/L
100 g/L
42
- 42 -

Tableau 4.3 : Rendements de dopage approximatifs des sdiments et teneurs relles en pyrne des sdiments
contamins.

Teneur nominale Teneur mesure J0 Rendement de dopage
mg/kg frais mg/kg frais %
2 4.86 243.00%
Craie 20 15.14 75.70%
200 175.3 87.65%

2 1.47 73.50%
Tourbe 20 11.54 57.70%
200 194.56 97.28%

(*) : avec une teneur en eau de 38 % pour la craie et de 82.7 % pour la tourbe sur les chantillons en dbut de test.

Les rsultats exprims par rapport au poids sec du sdiment (tableau 4.4) montrent que la tourbe
est gnralement plus contamine que la craie, ce qui est normal puisque la tourbe humide
contient beaucoup plus deau que la craie. Compte tenu de labsence de rplication des mesures,
il est difficile de commenter lvolution des teneurs dans les sdiments, la plupart des rsultats
disponibles semblent montrer une relative stabilit, particulirement pour la tourbe.

Tableau 4.4. Teneurs en pyrne mesures en mg/kg sec dans les deux sdiments J0 et J14, pour les teneurs
nominales de 2, 20 et 200 mg/kg frais.

mg/kg frais Craie J0 Tourbe J0 Craie J14 Tourbe J14
2 7,84 8,50 1,40 6,30
20 24,42 66,71 20,90 62,45
200 282,74 1124,62 173,20 938,41

4.1.3.2. Rsultats des tests de toxicit monospcifiques en sdiments
L'analyse du test sur chironomes montre que le pyrne n'a aucun effet significatif sur la
croissance et la survie des larves sur la dure du test (10 jours). A noter que les seuils de toxicit
(plus faibles concentrations dans le sdiment avec effet biologique significatif) rapports par
Vindimian et al. (2000) pour divers organismes du sdiment varient pour le pyrne entre 0.053
mg/kg et 59 mg/kg (bien que cela ne soit pas prcis on peut supposer quil sagit de mg/kg de
sdiment sec). Il est remarquable qu la plus forte concentration teste dans notre tude (200
mg/kg frais en nominal soit en teneurs mesures 283 mg/kg sec pour la craie et 1125 mg/kg sec
pour la tourbe) on nait pas mis en vidence deffet sur un critre sublthal tel que la croissance
43
- 43 -
des chironomes. Il est vrai que dautres invertbrs deau douce comme Lumbriculus
variegatus (Kukkonen et Landrum, 1994) ou marins comme Rhepoxynius abronius (Swartz et al.,
1997) nont pas non plus montr une grande sensibilit au pyrne, avec respectivement un effet
de 83% sur la survie 10 jours de Lumbriculus variegatus 269 mg/kg et une CL50-10 jours de
84.3 mg/kg pour Rhepoxynius abronius.
Le test sur lamphipode Hyalella azteca a fourni des rsultats diffrents. La croissance des
organismes dans la craie n'est pas trs bonne. Cette faible croissance peut tre mise en relation
avec les teneurs relativement leves en NH
4
+
des eaux surnageantes et des eaux interstitielles qui
augmentent en cours dessai probablement du fait de lapport de nourriture. Hyalella azteca est
sensible lammoniaque total, indpendamment du pH, avec des CL50-96 h de lordre de 20 mg
N/L (Borgmann, 1994). Dans notre essai, les teneurs leves dans les eaux interstitielles de la
craie (de 8 11 mg NH
4
+
/L en fin dessai) mais aussi, dans une moindre mesure, dans celles de la
tourbe (3 4 mg NH
4
+
/L), peuvent expliquer la faible croissance des amphipodes. Si lon fait
abstraction dune valeur dammoniaque dans leau interstitielle de la tourbe 200 g/g (0.14
mg/L contre 3 4 mg/L pour les autres traitements), on obtient une corrlation inverse
significative entre la teneur en ammoniaque des eaux interstitielles en fin dessai et le poids frais
des amphipodes, qui dcrot lorsque NH
4
+
augmente, mais cela nexplique pas le poids frais
significativement diminu 20 et 200 mg/kg dans la craie (figure 4.3). Cette augmentation des
teneurs en ammoniaque et les problmes en dcoulant auraient probablement pu tre limits par
un renouvellement de leau surnageante. La contamination de la tourbe par le pyrne n'a pas
d'effet significatif sur la survie des amphipodes (figure 4.4), et naffecte significativement leur
croissance (en poids frais) qu 200 mg/kg frais. La survie des tmoins est satisfaisante
(suprieure 80 %). Il faut noter au cours du traitement des rsultats une variabilit entre
rplicats d'une mme concentration.
Des mesures de bioaccumulation ont t effectues sur des amphipodes encore vivants en fin de
test. Les rsultats (figure 4.5) montrent une accumulation croissante du pyrne avec la dose,
significative ds 2 g/g pour la craie et 20 g/g pour la tourbe. Il semble que la bioaccumulation
soit plus importante dans la craie ce qui peut en partie expliquer les effets plus nets sur la survie
et la croissance des amphipodes dans la craie.

44
- 44 -

0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 2 20 200
mg pyrne/kg sdiment frais
m
g

f
r
a
i
s
/
i
n
d
i
v
i
d
u
Tourbe
Craie
*
* *

Figure 4.3 : Poids frais de Hyalella azteca aprs 14 jours dans les deux sdiments en prsence de pyrne (moyenne
sur 3 rplicats barres dcart-type ; * effet significatif, p < 0.05)
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
0 2 20 200
S
u
r
v
i
e

H
.

a
z
t
e
c
a
,

%
Tourbe
Craie
*
*

Figure 4.4 : Survie de Hyalella azteca 14 jours dans les deux sdiments en prsence de pyrne (moyenne sur 3
rplicats barres dcart-type ; * effet significatif, p < 0.05)

0
1000
2000
3000
4000
5000
2 20 200
g
/
g

f
r
a
i
s

H
y
a
l
e
l
l
a
Tourbe
Craie

Figure 4.5: Bioaccumulation du pyrne par H. azteca en fin de test (14 jours).

45
- 45 -
Pour mieux comprendre la toxicit du pyrne vis--vis dorganismes en prsence de
sdiments, il est important de bien comprendre la partition du pyrne entre les diffrents
compartiments (sdiment, eau interstitielle et eau surnageante). Pour cela, lanalyse du coefficient
de partage (K
oc
) et des teneurs en pyrne des eaux est essentielle. A partir des rsultats de dosage
du pyrne dans les sdiments entiers et dans les eaux interstitielles, il est possible de calculer des
coefficients de partage eau/carbone organique du sdiment (Koc apparents) selon la formule
suivante issue de la thorie du partage lquilibre (Di Toro et al., 1991) :

Kp = Cs / Cd = foc * Koc

o Kp = coefficient de partage du compos hydrophobe entre leau interstitielle et les
particules du sdiment (en L/kg de carbone),
Cs = concentration dans la phase particulaire Cs (en g/kg de sdiment sec)
Cd = concentration du compos dissous dans leau interstitielle (en g/L)
foc = fraction en carbone organique du sdiment (en kg de carbone/ kg de sdiment)
Koc = coefficient de partage du compos entre leau interstitielle et le carbone organique
du sdiment (en L/kg de carbone)

En crivant que Koc = Cs / (Cd * foc) = (Cs/foc)/Cd, on exprime le fait que Koc est le rapport
entre la concentration dans le sdiment normalise par rapport au CO (soit Cs/foc cest--dire la
teneur exprime par rapport la quantit de carbone) et la concentration dans leau interstitielle.

Figure 4.6 : Valeurs de log(Koc) apparents du pyrne au cours du test Hyalella azteca J0 et J14
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
2 20 200
mg/kg sdiment frais
J0, craie
J0, tourbe
J14, craie
J14, tourbe
logKoc moyen littrature
46
- 46 -

Les valeurs de K
oc
calcules (figure 4.6) sont proches des valeurs moyennes trouves dans la
littrature (entre 3.11 et 6.51, ou 4.82 en moyenne selon Irwin et al., 1997). Nos rsultats
confirment que la majorit du pyrne se trouve adsorb sur le sdiment. Les teneurs en pyrne
des eaux surnageantes restent assez faibles (0.6 g/L au maximum en fin de test).

Tableau 4.5. Doses de pyrne dans les amphipodes en fin dessai et effets observs sur la survie et la croissance (en
gras : effets significatifs)

Par contre, les teneurs dans les eaux interstitielles sont leves (jusqu 19 g/L pour la craie en
fin de test), avec des teneurs toujours plus leves dans la craie que dans la tourbe. Sachant que
les amphipodes ont rpondu dans les tests en phase aqueuse sur 48 h partir de 20 g/L, les
teneurs mesures dans les eaux interstitielles peuvent expliquer une grande partie de la toxicit
observe au cours des essais en sdiment sur 14 jours. Si lon compare donnes de mortalit de
Hyalella azteca et doses de pyrne mesures en fin de test dans les organismes (tableau 4.5), on
constate, pour le sdiment craie, que les doses entranant des effets sont du mme ordre de
grandeur que la dose interne ncessaire pour entraner 50% de mortalit chez Diporeia spp., soit
6 mol/g poids frais dorganisme, qui est aussi la dose ncessaire pour observer des effets
narcotiques

(modifications et transformations physiques de la membrane phospholipidique par
adsorption de composs hydrophobes (apolaires)) sur une varit dorganismes (Landrum et al.,
1992, 1994). Dans le sdiment tourbeux, les rsultats de mortalit ne sont pas significatifs
(grande variabilit), par contre on a bien un effet sur la croissance pour une dose interne de 12.66
mol/g.

Doses
organismes
Mortalit
14 jours
Inhibition de croissance
mol pyr/g pf % %
0.47 13 +/- 15.3 12
Craie 1.54 43 +/- 5.8 56
23.38 63 +/- 5.8 22
0.044 17 +/- 11.6 12
Tourbe 2.32 23 +/- 5.8 25
12.66 50 +/- 26.5 61
47
- 47 -

Les carts observs entre la craie et la tourbe peuvent galement expliquer en partie la plus nette
bioaccumulation du pyrne dans la craie que dans la tourbe, puisquune plus grande partie du
pyrne est retrouve dans les eaux interstitielles du sdiment crayeux. On peut galement
remarquer une diffrence au dbut du test des valeurs de K
oc
avec celles rencontres en fin de test
pour les deux sdiments. Cela signifie probablement que lquilibre de partition du pyrne ntait
pas atteint en dbut de test.

Le tableau 4.6 rsume les paramtres prendre en compte pour interprter les effets observs
(toxicit et bioaccumulation) et discuter sur les diffrences obtenues entre les deux sdiments. Au
vu de ces rsultats, il nest pas possible dexpliquer la mortalit observe en fonction uniquement
de la teneur en pyrne exprime en mg/kg de sdiment sec. En effet, alors qu 65 mg/kg sec on
na aucun effet sur la survie et la croissance de Hyallela azteca dans la tourbe, on a dj plus de
40% de mortalit et plus de 50% dinhibition de la croissance 23 mg/kg sec dans la craie. En se
basant sur la teneur normalise par rapport au carbone organique on obtient des rsultats un peu
plus cohrents dun sdiment lautre puisque jusqu 310 mg/kg CO dans la tourbe et 350
mg/kg CO dans la craie on na pas deffet et que les premiers effets sont obtenus pour 5100
mg/kg CO en moyenne dans la tourbe et 1700 mg/kg CO dans la craie. Si lon se base sur la
teneur en pyrne en fin de test dans les eaux interstitielles, on obtient de meilleures relations de
type dose-effet en prenant en compte la survie tous sdiments confondus et la croissance dans
chaque sdiment.

48
- 48 -

Tableau 4.6. Synthse des paramtres dexposition et des effets au cours du test sur Hyalella azteca (lorsque deux valeurs sont indiques il sagit des rsultats J0 ( gauche)
et J14 ( droite) ; EI : eau interstitielle ; ES : eau surnageante ; bioacc. : bioaccumulation ; pyr : pyrne ; nd : non dtermin ; en gras : effets significatifs)

Teneur en pyrne NH
4
+
COT Survie Poids frais Teneur pyr
sdiment EI ES EI ES EI ES 14 jours 14 jours bioacc.
mg/kg frais mg/kg sec mg/kg CO g/L g/L mg/L mg/L mg/L mg/L % mg/individu g/g frais
Tourbe
0 / / / / 2.06-3.66 nd-2.93 87.41-33.95 17.66-11.23 83 5.8 1.00 0.11 /
2 8.5-6.3 41-30 0.29-0.52 0.15-0.15 0.20-3.02 nd-2.42 9.85-nd 8.42-11.49 83 11.6 0.88 0.39 8.93
20 66.7-62.5 319-299 1.56-3.92 0.35-0.21 0.23-4.39 nd-3.52 8.51-nd 7.06-11.93 77 5.8 0.75 0.43 469.63
200 1125-938 5381-4490 3.29-7.28 0.58-0.28 0.24-0.14 nd-0.11 10.18-nd 6.79-11.44 50 26.5 0.39 0.06
2556.85
Craie
0 / / / / 7.29-9.14 nd-6.28 88.51-53.84 47.38-9.88 87 5.8 0.50 0.005 /
2 7.8-1.4 603-108 0.47-1.98 0.16-0.12 0.71-7.96 nd-5.47 9.42-nd 13.31-9.78 87 15.3 0.44 0.11 94.99
20 24.4-20.9 1878-1607 3.37-16.56 0.44-0.19 0.61-8.85 nd-6.08 9.46-nd 5.13-9.88
57 5.8 0.22 0.09
311.87
200 283-173 21749-13323 2.65-19.14 0.53-0.52 0.58-10.63 nd-7.3 8.66-nd 5.52-10.5
37 5.8 0.29 0.006
4723.20

49
- 49 -

4.2. Effets du pyrne sur la croissance des macrophytes

4.2.1. Etude de la croissance de Phragmites australis en sdiments tourbeux et crayeux

Des essais prliminaires de croissance des roseaux, Phragmites australis, ont t mens sur
les deux types de sdiments provenant du lac dAiguebelette, afin de comparer les capacits
relatives de ceux-ci apporter aux plantes un support et les rserves nutritives adquates.

4.2.1.1 Conditions exprimentales, origine des plantes et paramtre mesurs
Les plantes ont t cultives dans des microcosmes en verre de 12 L de contenance avec 1 kg
de sdiments surmonts par 2 L deau du robinet. Dans chaque microcosme, 4 plants de
chaque type taient disposs ; deux microcosmes rplicats ont t effectus par type de
sdiments.
Les microcosmes ont t incubs une temprature rgule 20C, avec une alternance de 16
h de lumire du jour ( 10 000 lux) et de 8 h de nuit.
Deux types de plants ont t utiliss :
- des plants de P. australis issus de semis et ayant 4 feuilles, ayant des caractristiques
homognes ;
- des boutures provenant de cultures effectues en conditions extrieures et
possdant des caractristiques morphologiques semblables (taille, longueur de
rhizome, nombre de feuilles, etc).
On notera que les plants de P. australis utilises dans cette tude sont issus de deux
origines cologiques. Les plants issus des semis proviennent de clones poussant sur les les
du lac dAiguebelette alors que les boutures proviennent de plantes dune station
exprimentale (lit macrophytes de Curienne, 73). Ces origines diffrentes ne se sont pas
rvles spcifiquement en terme de diffrences morphologiques. La raison principale de
lutilisation des boutures est la prsence dun tissu racinaire important produisant un effet
rhizosphre ds le dbut des expriences.
La croissance des plantes a t suivie par description de chaque plant et mesure du cumul
de croissance des parties suprieures (longueur cumule des feuilles). Dautres
caractristiques ont t releves (couleur des plantes, dveloppement pour les parties visibles
des racines, existence de zones sombres ou claires dans les sdiments).

4.2.1.2 Rsultats de croissance
50
- 50 -

Les courbes de croissance, ralises au printemps 2001 de janvier mars, montrent que
les deux sdiments fournissent un support quivalent la culture des roseaux (Fig. 4.7).
Toutefois, les rsultats de croissance sur tourbe sont trs variables et dpendent
essentiellement de lenracinement primitif des pieds. Des boutures possdant des tissus
racinaires varis donnent des rsultats trs variables comme le montre la figure suivante.
Ces observations nous ont conduit utiliser, la fois, des semis et des boutures pour les
expriences dcrites ci-dessous et au chapitre 5. .
Evolution de la croissance des plants
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
1
3
/
0
3
/
0
1
2
0
/
0
3
/
0
1
2
7
/
0
3
/
0
1
3
/
0
4
/
0
1
1
0
/
0
4
/
0
1
1
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/
0
4
/
0
1
2
4
/
0
4
/
0
1
1
/
0
5
/
0
1
8
/
0
5
/
0
1
1
5
/
0
5
/
0
1
2
2
/
0
5
/
0
1
dates
tourbe
calcaire

Figure 4.7: Croissance compare des roseaux sur sdiments calcaire et tourbeux

0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
8
/
0
3
/
0
1
1
5
/
0
3
/
0
1
2
2
/
0
3
/
0
1
2
9
/
0
3
/
0
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/
0
4
/
0
1
1
2
/
0
4
/
0
1
1
9
/
0
4
/
0
1
2
6
/
0
4
/
0
1
3
/
0
5
/
0
1
1
0
/
0
5
/
0
1
1
7
/
0
5
/
0
1
2
4
/
0
5
/
0
1
Srie1
Srie2
Srie3
Srie4
Srie5
Srie6
Srie7
Srie8
Srie9

Figure 4.8: Variabilit de la croissance de P. australis sur tourbe

La croissance des plants de roseaux est plus prcoce sur le sdiment tourbeux,
mais atteint des valeurs voisines de celle obtenue sur sdiments calcaires au bout de deux
mois. Les diffrences restent significatives (seuil de validit de 2 cm), et peuvent sexpliquer
par de plus fortes teneurs en phosphore et en azote minral des sdiments tourbeux. De plus,
la compacit des sdiments calcaires est dfavorable la croissance des racines sur une
51
- 51 -

dure de trois mois (dure de lexprimentation) ; le poids moyen des plants sur tourbe
tait de 3,06 g en deux mois alors quil est de 1,29 g sur sdiments calcaires. Les rapports
biomasse souterraine/biomasse suprieure ( RB) sont les suivants :
RBc = Sdiment calcaire : 0,36
RBt = Sdiment tourbeux : 0,48

Les valeurs de ce rapport des plantes sur tourbe sont plus proche de la ralit (0,52)
que pour celle du sdiment calcaire (0,45), mais les valeurs mesures sur le terrain
doivent tre considres comme approximatives compte tenu des difficults dobtention
de toute la biomasse souterraine.

4.2.2. Effet du pyrne sur la croissance des plantes

Des boutures et semis de P. australis ont t placs sur les deux types de sdiments en
prsence de 3 concentrations de pyrne.
Les sdiments ont t contamins aux concentrations nominales de 50, 100 et 200 ppm, par la
mthode dite de wall-coating (cf Annexe 6). Les deux dernires concentrations sont
volontairement leves afin dobtenir des effets de toxicit sur les plantes. Les microcosmes
ont t placs dans des enceintes de 12 L contenant 0,5 kg de sdiments, recouvert d1 L
deau, puis incubs 20C.
Dans une premire srie expriences, on a seulement utilis des boutures comportant une
partie de rhizome obtur chaque extrmit, un chevelu racinaire abondant et des organes
suprieurs bien dvelopps .
On constate un effet ngatif trs net sur la croissance 200 ppm de pyrne dans les deux types
de sdiments (Fig.4.9). Le gain de croissance cumul en 1 mois nest que de 0,2 0,4cm
(prcision : 0,2 cm) 200 ppm, alors quil atteint respectivement 3,2 et 2,3 cm 50 et 100
ppm sur craie, 5,2 et 1,15 cm 50 et 100 ppm sur tourbe. Dans les tmoins sans pyrne les
mmes indices de croissance taient respectivement de 3,7 et 2,3 cm sur craie et sur tourbe.

52
- 52 -

Evolution de croissance des plantes en fonction des
concentrations en PYR
0
2
4
6
8
10
12
14
t0 t5 t10 t15 t20 t25 t30
temps en jours
c
r
o
i
s
s
a
n
c
e

c
u
m
u
l
e

e
n

c
m
tmoin calcaire
tmoin organique
pyrne organique 200 mg/kg
pyrne calcaire 200 mg/kg

Figur 4.9 Croissance des roseaux sur sdiments contamins par du pyrne

4.3 Biodgradabilit du pyrne photo-oxyd par les bactries

Il s'agissait de savoir si la photo-oxydation du pyrne avait un effet sur la croissance et/ou la
biodgradation par la souche de Mycobacterium 6PY1 que nous tudions.
Un essai prliminaire a t ralis sur un chantillon de pyrne photo irradi sec qui a t
dissout 1 g/L dans 15 mL d'huile de silicone. L'chantillon a ensuite t rparti dans 2
cultures : (i) une culture de 5 ml contenant du benzoate pour substrat, pour savoir si les
produits de photo-oxydation ont un effet inhibiteur sur la croissance
(ii) une culture de 10 ml sans aucune source de carbone que le pyrne irradi.
Des cultures contrles ont t menes en parallle avec du pyrne non irradi.
Les rsultats ont montr que la photo-oxydation du pyrne na que trs peu d'effets sur la
croissance. La dgradation du pyrne trait par irradiation est totale et n'est pas trs diffrente
de celle du pyrne contrle au plan cintique.
Lexprience a t renouvele en utilisant le
14
C-pyrne comme substrat. Pour cela, le
pyrne marqu a t dissout au pralable dans le milieu de culture raison de 40 Ci par litre
soit 0,145 mg/L. Aprs quoi, la moiti de la solution a t photo-irradie (lot A), le reste
servant aux tests de contrle (lot B). La solution a ensuite t rpartie dans des fioles de 25
mL bouches comportant un pige CO
2
(fioles de Warburg), raison de 5 mL par fiole, 4
fioles par lot. Pour chaque lot, trois fioles ont t inocules avec environ 5 10
8
bactries de la
53
- 53 -

souche 6PY1, une fiole non inocule servant de contrle abiotique. Les fioles ont t
incubes temprature ambiante et le
14
CO
2
pig a t quantifi par comptage.
Les cintiques de minralisation sont reproductibles et montrent que la photo-
oxydation pralable du pyrne na que peu dincidence sur la vitesse de minralisation (Fig.
4-10A). Cependant, le bilan de la minralisation aprs 24 h montre une diminution denviron
1/3 du pourcentage de biotransformation par rapport au tmoin de bactries incubes an
prsence de pyrne non photo-oxyd.
Une analyse des produits de photo-oxydation et de biodgradation a t effectue en
dbut et en fin dexprience par chromatographie couche mince et autoradiographie (Fig. 4-
10B). Le rsultat montre que lchantillon photo irradi ne contient plus de pyrne intact,
mais indique la prsence de 2 sous-produits majeurs P1 et P2 bien spars. Aprs
biodgradation, on observe la persistance du produit P1 alors que P2 disparat en grande
partie et que de nouveaux sous-produits apparaissent, dont 2 sont comparables ceux obtenus
par biodgradation du pyrne non-irradi (B1 et B2). Faute de temps, ces produits nont pu
tre identifis.

A

Figure 4-10 : Minralisation du
14
C-pyrne photo-oxyd par Mycobacterium 6PY1.
A : Comparaison des cintiques de minralisation du pyrne et de ses produits de photo oxydation.
B : Chromatographie couche mince du pyrne photo-oxyd (A
0
), ainsi que des produits hydrosolubles extraits
aprs 24 h dincubation avec la souche 6PY1 : A, photo-oxydation + biodgradation ; B, biodgradation ; T,
tmoin
14
C-pyrne non trait

0
1 10
4
2 10
4
3 10
4
4 10
4
5 10
4
0 5 10 15 20 25
1
4
C
O
2

(
c
p
m
)
Temps (h)
Pyrne
Pyrne photooxyd Pyrne photooxyd
Contrles abiotiques
B
Dpts
Pyrne
P1
B1
P2
B2
B A A
0
T
54
- 54 -

En conclusion, ces expriences montrent que les produits gnrs par photo-oxydation du
pyrne nont pas de caractre toxique vis--vis de la souche Mycobacterium 6PY1, tout au
moins aux concentrations testes. Dautre part, les sous-produits de photo-oxydation sont
dans une large mesure, mtabolisables par les bactries et peuvent leur servir de substrat
carbon pour la croissance.

55
- 55 -

5. DEVENIR DU PYRENE EN MICROCOSMES CLOS

5.1 Description du dispositif exprimental

Les expriences de minralisation ont t conduites dans des jarres transparentes dune
capacit maximale de 2,4 L, normalement destines lincubation des botes de Ptri en
anarobiose. Ces jarres peuvent tre fermes hermtiquement laide dun couvercle. Pour les
besoins de lexprience, le couvercle a t perc pour crer un orifice de 5 mm, lequel a t
obtur par un bouchon de caoutchouc. Ce dispositif a permis dalimenter la jarre ferme par
un flux dair, par le biais dun jeu de deux aiguilles entre-sortie traversant le bouchon.
Chaque microcosme exprimental tait constitu dune jarre contenant 300g de sdiment, 250
ml deau et, le cas chant, des plantes ou un amendement bactrien selon les conditions
dcrites ci-dessous.
Les microcosmes ont t placs sous une Sorbonne, dans laquelle a t install un clairage
par deux tubes fluorescents placs horizontalement, crant une lumire blanche naturelle
propre la croissance des plantes. Les microcosmes contenant des plantes ont t placs 20
cm des lampes.
Les microcosmes taient en outre relis un systme dalimentation dair par deux jeux de
tubulure souple indpendants. Le systme dalimentation dair comportait une bouteille dair
comprim, un rgulateur de dbit, un filtre microbiologique et un flacon laveur pour
humidifier lair. Sur chaque tubulure de sortie des microcosmes, une cartouche de rsine
hydrophobe destine piger le pyrne ventuellement entran sous forme darosol a t
installe. Cette cartouche tait ensuite relie deux piges CO
2
en srie, constitus de tubes
de verre 30 ml contenant respectivement 15 et 10 ml de soude 1 N. Une photographie du
dispositif exprimental est prsente la figure 5.1.

5.2. Conditions opratoires et paramtres mesurs
La prparation du microcosme et le dopage des sdiments avec le pyrne marqu au
14
C se
sont drouls selon la procdure suivante : chaque jarre vide a reu 15 mg de mlange de
pyrne froid et marqu quivalent 3 Ci (50 ppm/kg de sdiment humide). Aprs
vaporation du solvant, 300 g de sdiments ont t rpartis dans chaque jarre, et le mlange a
t homognis par incubation 3 h 100 rpm sur un agitateur rotatif.
Aprs quoi, cinq lots de microcosme ont t raliss :
56
- 56 -

- les lots A et B (3 microcosmes) ont reu 5 plants de roseaux dont 3 issus de semis, 2
boutures, ainsi que 5 lentilles deau.
- les lots B et C (2 microcosmes) ont reu un amendement de Mycobacterium 6PYI raison
de 1,4 10
7
bactries par g de sdiment humide.
-le lot D (2 microcosmes) na reu aucun supplment, et le lot E (2 microcosmes) a reu 3g/kg
de sdiment dazoture de sodium en tant quagent anti-microbien.

Figure 5.1 : Photographie du dispositif exprimental montrant les 12 microcosmes (enceintes transparentes
contenant une couche de sdiments de 2 cm surmonte dune colonne deau de 3 cm) et les tubulures dentre et
sortie dair. En arrire plan, se trouvent 2 tubes fluorescents diffusant un clairement de type lumire du jour.

Les microcosmes ont ensuite t complts par 250 ml deau strile puis ferms
hermtiquement et incubs temprature ambiante (23 2C) sous un clairement jour/nuit
de 16h/8h. Chaque microcosme a t aliment en continu par un flux dair rgul environ
1L/h ( 0,5), permettant lentranement du
14
CO
2
vers le pige alcalin. Chaque semaine, la
radioactivit accumule dans le pige a t compte et la solution de soude renouvele. Les
57
- 57 -

cartouches de rsine hydrophobe ont t renouveles et analyses pour quantifier la
fraction de pyrne entrane par arosols.

5.3 Cintiques de minralisation du pyrne

5.3.1 Essais prliminaires de minralisation du pyrne par les microorganismes des sdiments

Avant de mettre en uvre les expriences en microcosmes, des tests ont t effectus plus
petite chelle pour valuer lincidence de certains paramtres sur la dgradation du pyrne. Il
sagissait notamment de dterminer si les deux sdiments tudis contenaient des bactries
capables de dgrader le pyrne, davoir une ide de la cintique de dgradation et de connatre
leffet dun amendement de bactries slectionnes (souche 6PY1). Ces expriences ont t
conduites dans des fioles de verre closes de 250 mL contenant 20 g de sdiment, 100 mL
deau, et 50 g de pyrne marqu au
14
C. Les fioles ont t incubes temprature ambiante
et sans agitation. Un dispositif de pige CO
2
install lintrieur a permis de mesurer la
minralisation raison dune mesure par semaine (cf annexe 5 ) sur une priode de 8
semaines.
Les tests ont t raliss selon les conditions indiques dans la lgende de la Fig. 5.2. La
minralisation du pyrne a t fortement stimule par laddition de Mycobacterium 6PY1
(Fig.5.2). La cintique de minralisation dbute sans temps de latence et atteint un palier vers
le 30
me
jour. La strilisation pralable du sdiment a eu pour consquence un accroissement
de la vitesse de minralisation notamment pour le cas du sdiment crayeux. Le ralentissement
de la minralisation observ dans le cas du sdiment tourbeux (Fig. 5.2, carrs rouges) est
peut-tre d un pigeage du pyrne dans la matire organique de ce sdiment qui en contient
davantage. La minralisation par Mycobacterium a t ralentie dans les sdiments non striles,
ce qui est logique compte tenu de la comptition quexercent les autres bactries et les
prdateurs.
Dans les sdiments non amends , la minralisation du pyrne est dtectable ds le 20
me
jour.
Bien que la cintique et le taux de minralisation soient plus faibles, ce rsultat atteste de la
prsence de microorganismes aptes dgrader le pyrne dans des sdiments considrs
comme non pollus.

58
- 58 -

Figure 5.2 : Cintiques de minralisation du pyrne en fonction de la nature du sdiment, et de lamendement
avec Mycobacterium 6PY1. Au pralable, les sdiments ont t soit traits lautoclave (2 fois 15 min un jour
dintervalle ; symboles carrs), soit utiliss sans traitement (symboles ronds). Dans certains cas, les sdiments
ont t amends avec la souche Mycobacterium 6PY1 raison de 1,5 10
7
bactries par ml (I, G).

Enfin, dans les sdiments traits lautoclave, une activit de dgradation dorigine
biologique se dveloppe en fin dexprience, probablement due des microorganismes ayant
survcu la strilisation. Cette observation indique que les bactries aptes dgrader les HAP
sont relativement rsistantes la chaleur. Lors des expriences en microcosmes dcrites ci-
dessous, nous avons eu recours un autre mode de strilisation pour raliser des sdiments
tmoins abiotiques dpourvus dactivit vis vis du pyrne.

5.3.2. Cintiques de minralisation du pyrne en microcosmes

Ces expriences ont t ralises en deux sries successives comportant chacune 12
microcosmes selon les conditions opratoires dcrites ci-dessus. Dans un premier temps,
ltude a port sur le sdiment crayeux, et sest droule sur une priode de 61 jours. A la fin
de lincubation, des analyses ont t faites sur les compartiments liquides et solides pour
quantifier la rpartition de la radioactivit et dterminer la nature des composs forms par
biodgradation ( 5.4 et 5.7). Le dveloppement des plantes, leffet de la rhizosphre, la bio
accumulation dans la plante ont t mesurs ( 5.5 et 5.6). Des prlvements de sdiments ont
aussi t effectus pour analyser la microflore et valuer limpact de la contamination au
pyrne sur la diversit bactrienne ( 5.8).
0
1000
2000
3000
4000
5000
0 10 20 30 40 50 60 70
Sdiment crayeux
1
4
C
O
2

(
c
p
m

*
1
0
0
0
)
Jours
0
1000
2000
3000
4000
5000
0 10 20 30 40 50 60 70
Sdiment tourbeux
1
4
C
O
2

(
c
p
m

*
1
0
0
0
)
Jours
59
- 59 -

Lors de la deuxime srie dexprience, ralise avec le sdiment tourbeux, deux
problmes ont perturb le droulement normal des oprations : le pyrne ne sest pas
correctement mlang au sdiment lors de ltape initiale de contamination et est rest, en
grande partie, coll au fond des enceintes contenant les microcosmes. De plus, la croissance
des roseaux a t notablement perturbe, conduisant dans certains cas la mort prmature de
certaines plantes. Pour ces raisons, les rsultats de minralisation sont donns titre indicatif,
et nous navons pas fait danalyses sur les microcosmes en fin dexprience.

5.3.2.1. Sdiment crayeux
Les rsultats de minralisation du pyrne sont illustrs par la figure 5.3. Les courbes
reprsentent pour chacun des microcosmes numrots de 1 12, la quantit cumule de CO
2

radioactif en fonction du temps.

Figure 5.3 : Cintiques de minralisation du pyrne en microcosmes. La numrotation correspond aux
conditions suivantes : sdiment + plantes (1,2,3) ; sdiment + plantes + souche 6PY1 (4,5,6) ; sdiment + souche
6 PY1 (7,8) ; pas daddition (9,10) ; addition de biocide (11,12)

De manire synthtique, les donnes exprimentales appellent les commentaires suivants:

1. Les sdiments possdent une activit de minralisation du pyrne endogne qui se
manifeste au bout de 30 j environ dans les microcosmes 1-3, 9 et 10, ce qui confirme
les rsultats obtenus prcdemment (Fig. 5.2).
0
10
20
30
40
50
0 10 20 30 40 50 60 70
Microcosmes sans 6PY1
1
2
3
12
11
10
9
1
4
C
O
2

(
c
p
m

X

1
0
3
)
Jours
0
100
200
300
400
500
600
700
0 10 20 30 40 50 60 70
Microcosmes + 6PY1
4
5
6
7
8
12
1
4
C
O
2

(
c
p
m

X

1
0
3
)
Jours
60
- 60 -

2. Les roseaux ont un effet stimulant sur la minralisation dans les sdiments non
amends par la souche 6PY1. En effet, par rapport aux microcosmes non plants (9 et
10), la minralisation du pyrne est plus prcoce et la cintique apparente plus rapide
dans les microcosmes plants (1,2,3). Cette stimulation est sans doute cause par
leffet rhizosphre qui sera explicit au 5.6.
3. Lapport de bactries slectionnes (Mycobacterium 6PY1) dans le sdiment provoque
une minralisation immdiate du pyrne qui se prolonge sur au moins 61 jours, dure
de lexprience. Dans les microcosmes inoculs plants de roseaux, la cintique
apparente de dgagement de CO
2
est significativement plus lente. Cette observation,
apparemment contradictoire avec le premier point, sera discute ultrieurement.
4. En prsence de biocide (azoture de sodium) qui inhibe toute activit respiratoire, la
minralisation est ngligeable, indiquant que le pyrne nest pas dgrad de manire
significative par voie anarobie.

Ces observations confirment que les sdiments lacustres sains, cest--dire exposs un
faible niveau de contamination par les HAP, renferment nanmoins des microorganismes
capables de minraliser le pyrne. Lidentification de tels microorganismes est dcrite au
5.8.
Le temps de latence de plusieurs jours avant que la minralisation devienne dtectable
peut rsulter de laugmentation de la population de lespce ou des espce actives sur les HAP
ds lors que le substrat est en plus forte concentration, ou bien une induction de la synthse
des enzymes dgradatives, ou encore la conjonction des deux phnomnes.
Dautre part, la souche que nous avons isole au laboratoire partir dun sol pollu
(ancienne usine gaz), sest montr capable dadaptation un environnement fort diffrent
(sdiments) comme lindique la persistance de son activit de minralisation sur une priode
dau moins 8 semaines. La cintique de minralisation est cependant beaucoup plus lente que
celle mesure en culture pure (Krivobok et al. 2003), du fait de nombreux facteurs
susceptibles de ralentir la biodgradation : comptition avec les microorganismes indignes,
diffusion doxygne, bio disponibilit du pyrne, etc,.

Leffet des plantes sera discut la lumire des rsultats danalyse prsents ci-dessous.

61
- 61 -

5.3.2.2 Sdiment tourbeux
Les rsultats de minralisation sur 46 jours montrent que lintroduction de la souche 6PY1 a
un effet stimulant sur toute la dure de lexprience. Leffet des plantes nest pas probant, ce
qui nest pas tonnant compte tenu de leur mauvais tat de survie pendant lexprience.
On peut encore une fois souligner dune part lexistence ltat latent dans les sdiments de
microorganismes aptes dgrader les HAP dont le pyrne, et dautre part, la survie sur une
priode dau moins 40 jours de la souche 6PY1 dans un sdiment de nature trs diffrente.

5.4. Bilan de transfert du pyrne et de ses produits doxydation dans les microcosmes

5.4.1 Volatilisation

Les roseaux possdent un systme circulatoire (arenchyme) par lequel lair peut transiter
depuis les racines vers les parties ariennes de la plante. Ce systme est susceptible de
vhiculer des molcules sous forme gazeuse depuis les sdiments vers latmosphre et pouvait
donc causer un transfert de pyrne bien que cet HAP soit peu volatil. Le dispositif de
pigeage des molcules hydrophobes install en sortie des microcosmes (cartouche de rsine
Amberlite XAD-2) a permis dvaluer limportance des pertes de pyrne par volatilisation.
Du pyrne a effectivement t dtect mais en quantit trs faible. La masse maximale
calcule, rsultant du cumul des mesures sur 61 j dexprience, nexcde pas 0,06 % de la
quantit initiale de pyrne introduite dans les microcosmes. La cintique est plus rapide dans
les 15 premiers jours dincubation, et la prsence de plantes dans les microcosmes na eu
aucune incidence sur la volatilisation du pyrne. Les pertes de pyrne par arosols ont donc
t ngligeables au cours de lexprience.
.
5.4.2. Rpartition du pyrne et de ses sous-produits hydrosolubles dans leau et le sdiments

En fin dincubation, nous avons compar la rpartition du pyrne marqu et de ses sous-
produits doxydation dans les compartiments liquides, solides et gazeux des microcosmes. La
Figure 5.4 compare la proportion de radioactivit retrouve dans les phases gazeuse et liquide
de chaque microcosme. Lhistogramme montre que la radioactivit retrouve dans le
surnageant et dans leau interstitielle augmente de manire proportionnelle au taux de
minralisation, indiquant que la biodgradation du pyrne saccompagne de la formation des
produits marqus hydrosolubles. Lanalyse de ces produits est dcrite au 5.7.
62
- 62 -

Dans les microcosmes tmoins abiotiques (11 et 12), la quantit de pyrne marqu atteint
1,5% de la masse initiale, dont 0,6% dans le surnageant et 0,9% dans leau interstitielle. Par le
calcul, on en dduit que le pyrne atteint 0,36 mg/L dans le surnageant, soit plus de 2 fois la
limite de solubilit du pyrne dans leau. Le dpassement apparent du seuil de solubilit
pourrait sexpliquer par la prsence dans leau de matire organique dissoute (acides
humiques) laquelle les HAP sont connus pour sassocier (cf. chapitre 3).
0
2
4
6
8
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Ph. aqueuse
Ph. intersticielle
CO2
%

d
e

l
a

r
a
d
i
o
a
c
t
i
v
i
t

i
n
i
t
i
a
l
e
Microcosme

Figure 5.4 : Proportion de la radioactivit retrouve dans les phases aqueuses et gazeuses des microcosmes aprs
61 jours dincubation avec le
14
C-pyrne. Les barres rouges (CO
2
) correspondent aux valeurs cumules de
14
C0
2

pig sur 61 j. La radioactivit trouve dans le surnageant (Ph. aqueuse) et leau interstitielle a t dtermine
partir de comptages sur des fractions de 1 mL.

5.4.3. Teneur rsiduelle de pyrne dans les sdiments

La concentration rsiduelle de pyrne a t estime par HPLC et spectrophotomtrie, aprs
extraction des sdiments par le dichloromthane. La teneur en molcules marques des
sdiments a dautre part t dose par comptage de radioactivit aprs extraction par le
mthanol (Tableau 5.1). Par cette deuxime mthode, les valeurs obtenues montrent des
carts plus importants entre rplicats. Cependant, les teneurs moyennes de pyrne rsiduel
63
- 63 -

calcules partir des deux jeux de donnes sont comparables. Ces concentrations sont
plus faibles que la teneur nominale (50 mg/kg) introduite dans les sdiments au dbut de
lexprience, y compris pour les tmoins abiotiques.

Tableau 5.1 : Concentrations de pyrne rsiduel dans les sdiments aprs 61 jours
Extraction DCM/Dosage HPLC Extraction MeOH/Dosage radioactivit
Microcosme

Caractristiques mg/kg moyenne % rsiduel cpm/g
( 10
3
)
moyenne % rsiduel
1 9,790
2 21,7 7,30
3
Sdiments
+ plantes
27,0

24,35

48,7
12,78

9,95

51,8
4 20,1 5,61
5 16,8 --
6
Sdiments
+ plantes
+ souche 6PY1 15,7

17,5

35,0
7,97

6,80

35,4
7 15,9 5,43
8
Sdiments
+ souche 6PY1 15,9

15,9

31,8 4,62

5,02

26,1
9 35,4 9,63
10
Sdiments
29,9

32,7

65,4 13,0

11,3

58,7
11 30,8 9,43
12
Sdiments
+ azoture 28,3

29,5

59,0 14,73

12,1

62,9

Plusieurs explications sont possibles : (i) les mthodes employes pour lextraction et
la quantification du pyrne sous-estiment la concentration rsiduelle, (ii) une partie du pyrne
nest pas extractible car squestr dans le sdiment. Dans les microcosmes o le pyrne a t
biodgrad, il se peut aussi que du pyrne partiellement oxyd se retrouve fix par covalence
dans la matire organique (Eschenbach et al., 1998), (iii) une fraction du pyrne sest adsorb
sur les parois de lenceinte contenant les microcosmes.
Toujours est-il quune nette corrlation apparat entre le taux de minralisation, la
formation de molcules marques hydrosolubles et la diminution de la teneur en pyrne
rsiduel, les trois effets rsultant de la biodgradation bactrienne.

5.5. Bioaccumulation du pyrne dans les plants de Phragmites australis

5.5.1. Etude prliminaire de la rpartition de pyrne dans les plantes

Ces expriences ont t effectues dans des microcosmes de 12 L selon les conditions dcrites
au 4.3. Le pyrne a t incorpor aux sdiments aux concentrations de 50,100 et 200 ppm.
64
- 64 -

Aprs 20 jours dincubation, les concentrations de pyrne dans les organes suprieurs
(tiges, feuilles) et les organes souterrains des plants (rhizomes et racines) ont t analyses
aprs extraction au dichloromthane (Tableau 5.2).

Tableau 5.2: Rpartition du pyrne dans les plantes en fonction de la teneur initiale en pyrne dans les
sdiments
Conditions exprimentales Concentration du pyrne
dans les racines
(g/g)
Concentration du pyrne
dans les tiges
(g/g)
Tmoin tourbe Non dtect Non dtect
Tmoin calcaire Non dtect Non dtect
Tourbe 50 ppm 197 164
Sdiment calcaire 50 ppm 216 181
Tourbe contamin 100 ppm 341 274
Calcaire contamin 100 ppm 1157 369
Tourbe contamin 200 ppm 594 317
Calcaire contamin 200 ppm 755 347

Les rsultats mettent en vidence une accumulation systmatiquement plus leve dans les
racines et plus particulirement dans le cas des sdiments calcaires. Les concentrations sont,
pour cette srie, plus leves pour les teneurs nominales de 100 ppm alors que pour 200
ppm on constate une diminution dincorporation du pyrne qui va de pair avec lapparition
dune toxicit se traduisant par une inhibition de la croissance.

5.5.2. Rpartition de la radioactivit dans les plantes cultives sur sdiments contamins par le
14
C-pyrne

Les expriences dcrites ci-dessous concernent des microcosmes faits de sdiments craie
contamins par 50 ppm de
14
C-pyrne. Elles ont t ralises en enceintes closes de 12 L
contenant 0,5 kg de sdiments comme ci-dessus, ou bien en enceintes de 2,5 L comme
indiqu au 5.2. Le traceur radioactif a permis de connatre la rpartition du pyrne et des
molcules marques produites par bio transformation dans les diffrentes parties des plantes.
Les plants ont t mesurs et photographis, puis, en fin dexprience, analyss par
radiographie , ou bien par comptage de radioactivit dextraits en solvant des organes des
plantes. Ne sont prsents ici que les rsultats principaux.

65
- 65 -

Dune manire gnrale, les comptages de radioactivit ont montr des valeurs plus
leves la base des feuilles et galement dans la partie basale des tiges, ainsi que lillustrent
la figure 5.5. Ces rsultats mettent en vidence une accumulation non homogne de
molcules marques (pyrne + mtabolites) dans les plantes au cours des 10 15 premiers
jours de lincubation.

Figure 5.5 : Rpartition de la radioactivit dans une feuille mesure laide dun scanner

Le devenir du pyrne dans les plantes a t particulirement tudi dans le cadre des
expriences dcrites ci-dessus ( 5.1 5.4), et concernant une srie de 12 microcosmes dont 6
contenaient des plantes. Pendant la priode dincubation de 61 jours, la croissance des plantes
na pas t visiblement perturbe par la dose de pyrne introduite dans les sdiments (50 ppm
< dose de 200 ppm partir de laquelle un effet inhibiteur est mesurable, cf. 4. 3), ni par
linoculation des sdiments par la souche Mycobacterium 6PY1 (Fig. 5.6).
66
- 66 -

Figure 5.6 : Plantes en place dans le microcosme n4 aprs 61 jours dincubation. En fin dexprience, les
plantes ont t prleves, dbarrasses des sdiments, puis soumises des comptages de radioactivit soit
directement par scanner (annexe 5), soit par comptage dextraits mthanoliques aprs dcoupe et regroupement
par type dorgane (Tableau 5.3).

A la fin de lincubation, les plantes ont t prleves, mesures, peses, puis soumises une
mesure de la radioactivit incorpore soit par scanner , soit par comptage aprs
fractionnement et extraction(annexe 5). Dans ce dernier cas, les organes de toutes les plantes
dun mme microcosme ont t regroups puis extraits ensemble par le mthanol. La teneur
en pyrne des extraits organiques de plante a aussi t dtermine par dosage HPLC. Les
rsultats des analyses sont prsents dans le tableau 5.3.
La teneur en pyrne dtect dans les diffrents organes des plantes est trs diffrente selon
que les microcosmes ont t ou non inoculs avec la souche 6PY1, cest--dire selon que le
pyrne a t bio-transform ou pas. Ainsi, la concentration mesure sest avre environ 10
fois plus faible dans les plantes des microcosmes 3 6. Cependant, la radioactivit mesure
sur les mmes extraits indique un taux dincorporation quivalent, voire 1,5 2 fois suprieur,
dans les fractions provenant des microcosmes 3-6 par rapport aux fractions provenant des
microcosmes 1-3. En tenant compte de la radioactivit spcifique du
14
C-pyrne introduit
dans les microcosmes au dbut de lexprience, on peut calculer la contribution du pyrne
intact la radioactivit de chaque extrait en se basant sur les quantits doses par HPLC
67
- 67 -

(Tableau 5.3). Cette estimation indique que le
14
C-pyrne ne reprsente que 50% de la
radioactivit incorpore dans les racines, et 19-28% de celle trouve dans les tiges et les
feuilles dans le cas des plantes des microcosmes 1-3 (A noter que la concentration de pyrne
trouve dans lextrait de bases de feuilles a t probablement surestime). Dans les
microcosmes 4-6, le pyrne ne reprsente quune partie ngligeable de la radioactivit bio-
accumule.
Ces rsultats suggrent que les plantes incorporent beaucoup plus facilement les mtabolites
hydrosolubles du pyrne gnrs par biodgradation du pyrne (cf. 5.7) que le pyrne. Pour
dterminer la nature des molcules marques extraites par le mthanol, des analyses par CCM
ont t ralises dans des conditions standard (Annexe 5). Le marquage tait relativement
faible, les extraits ont du tre concentrs par vaporation avant analyse. Lautoradiographie
confirme que le
14
C-pyrne constitue une part importante de la radioactivit incorpore dans
les plantes des microcosmes 1-3 et quil est indtectable dans les plantes des microcosmes 4-
6. Dans ce dernier cas, lessentiel de la radioactivit se retrouve au point de dpt ; ceci ne
correspond aucun des mtabolites identifis dans la phase aqueuse (cf. 5.7). On peut
penser quil sagit de mtabolites lis ou squestrs dans les tissus de la plante, ou encore de
molcules marques mtabolises par les plantes.

Tableau 5.3 : Incorporation de radioactivit et de pyrne dans les organes de plantes aprs 61 j
dincubation en prsence de sdiments contamins par du
14
C-pyrne

Extraits

Microcosmes 1 3

Microcosmes 4 6 (+ Mycobactrium 6PY1)
Masse
(mg)
14
C/extr.
cpm
cpm/g
10
3

Pyrne
g/g
14
C-pyrne
a
cpm/g (%)
Masse
plante
14
C/extr.
cpm
cpm/g
10
3

Pyrne
g/g
14
C-pyrne
a
cpm/g (%)
Racines 40,8 7600 186 242 93,6 (50) 30,2 4840 160 32,2 12,4 (7,8)
Feuilles Ext. 25,4 2400 94,5 46,7 18,0 (19) 27,7 4700 170 2,23 0,86 (0,5)
Feuilles base 37,4 3600 96,3 282 109 (113) 35,7 5600 157 4,04 1,56 (1)
Tiges ext. 21,5 1640 76,3 40,3 15,5 (20) 19,6 2820 144 4,88 1,88 (1,3)
Tiges base 47,0 3700 78,7 58,2 22,4 (28) 29,7 4660 157 2,92 1,12 (0,7)
a
Radioactivt due au
14
C-pyrne calcule en se basant sur les dosages HPLC dune part et sur la
radioactivit spcifique du pyrne marqu (385 cpm/g). Le % indique la part thorique du
14
C-pyrne la
radioactivit de lextrait.

La question sest pose de savoir si les plantes pouvaient incorporer de la radioactivit sous
forme de CO
2
par photosynthse, en recyclant une partie du
14
CO
2
produit lors de la
minralisation du pyrne. Bien quon ne puisse pas lexclure priori, nous pensons que
68
- 68 -

compte tenu du balayage continuel des microcosmes par de lair, lincorporation de
radioactivit par ce biais serait ngligeable.

Lincorporation de
14C
-pyrne ou de mtabolites a aussi t tudie en fonction de la
croissance des plantes. Dans ce but, la radioactivit mesure dans les plants issus de semis a
t compare celle mesure dans les boutures. Les rsultats obtenus dans le cas du
microcosme 2, illustre le fait que la radioactivit se retrouve aux 2/3 dans les semis qui ont eu
une croissance rgulire dans le microcosme (Fig. 5.7). Les boutures, bien que pourvues
dun tissu racinaire plus important ont fix moins de pyrne. Cette observation suggre que
laccumulation du pyrne dans les tissus rsulte dun transport actif qui serait plus efficace
dans les plantes en croissance rapide (semis).

Figure 5.7 : Rpartition de le radioactivit (
14
C) dans les plantes issues de boutures et de semis aprs 61 jours
dincubation en microcosme contamin par le
14
C-pyrne ( ex. microcosme n2)

5.6. Effet de la rhizosphre sur lquilibre redox des sdiments

Dans les expriences menes en microcosmes contenant ou non des macrophytes,
notre objectif tait de mettre en vidence laction de ces plantes aquatiques sur les activits
bactriennes des sdiments. On parlera deffet rhizosphre cest--dire leur capacit
dapporter de loxygne et des nutriments proximit des racines.

14C (cpm/g) dans les plantes du microcosme 2
4%
24%
19%
10%
22%
21%
semis1
semis 2
semis3
bouture 2
bouture 13
bouture 9
69
- 69 -

5.6.1. Mise en vidence de lactivit des macrophytes: dans lespace de la rhizosphre

Lobservation des microcosmes contenant des sdiments calcaires a rvl des diffrences de
coloration dans le voisinage des jeunes racines. Les zones proximales apparaissent claires ce
qui contraste avec laspect sombre du reste des sdiments. Ces diffrences sont lies
lactivit des bactries sulfato-rductrices, qui dans la zone anoxique des sdiments,
transforment le sulfates en sulfures, lesquels prcipitent sous forme de sulfures mtalliques de
couleur sombre. Ce phnomne a notamment t dcrit par Armstrong (1978).

Figure 5.8 : Mise en vidence de zones
claires au voisinage des racines de
roseaux
Des dpts de sulfures se produisent
dans les zones anoxiques (prcipits
noirtres). Labsence de tels prcipits
linterface sdiments-eau et prs des
parties apicales des nouvelles racines,
(photographies ci-contre) indique que
ces zones ne sont pas anoxiques. La
photo du bas montre un microcosme vu
par le dessous, avec des zones claires
prs des racines et des zones sombres
anoxiques. On note galement la
prsence dune plaque ferrique (taches
de rouille caractristiques autour des
racines).

70
- 70 -

Les zones claires de la rhizosphre sont une manifestation de lactivit des plantes qui
correspond deux processus principaux :
- le rejet doxygne par la partie apicale des radicelles, rsultant dune diffusion de
lair depuis larenchyme des racines,
- lmission de composs organiques assimilables par les bactries.
Les deux phnomnes sont susceptibles dentraner une stimulation du mtabolisme
microbien et, en particulier, de la dgradation des xnobiotiques comme le pyrne .
Les flux doxygne rejets ont t mesurs dans des gammes variant de 20 35 mol
0
2
par jour suivant le potentiel redox environnant les racines (Armstrong, 1978). Les travaux
de cet auteur et ceux de Koncova (1990) ont montr que ces missions doxygne se
traduisent par une augmentation des valeurs du potentiel redox de la rhizosphre.
De mme, il a t montr que loxygne mis par les racines a un effet stimulant sur la
transformation des ions ammonium en nitrate ( Tolley et al, 1986). Ce phnomne est aussi
lorigine de la formation de la plaque ferrique visible sur la figure 5 .8. Ceci correspond des
dpts dhydroxydes de fer ou dautres mtaux sur le pourtour des poils absorbants et des
jeunes radicelles.
Dans les sdiments des microcosmes, leffet rhizosphre a pu tre quantifi en
mesurant les gradients de potentiel redox laide de micro-lectrodes. Les mesures montrent
une excellente correspondance entre zones claires et valeurs positives et vice-versa (Fig. 5.9).

Figure 5.9 : Valeurs ponctuelles du potentiel redox (en mV) dans les zones claires et sombres des sdiments
calcaires. Des valeurs positives ont t trouves dans les zones claires prs de la surface et au voisinage des
racines.

+50
-10
+80
-30
-160
-100
+140
71
- 71 -

5.6.2. Relations entre leffet rhizosphre et la stimulation de dgradation du pyrne

Les zones claires des sdiments sont donc le reflet de lactivit oxydante des racines.
Pour estimer cette activit dans les microcosmes, la proportion de zones claires a t
quantifie partir dimages du fond transparent des microcosmes. Pour cela, des
photographies ont t prises en fin dexprience (J61), et ont ensuite t soumises un
programme danalyse dimages, pour calculer le pourcentage de surface claire sur le fond des
microcosmes (tableau 5.4). Les valeurs obtenues peuvent tre considres, en simplifiant,
comme indicatrices de lactivit des racines dans chacun des microcosmes. On remarque une
rduction sensible des zones claires arobies dans le microcosme n 5, dans lequel la
minralisation du pyrne a t nettement plus lente que dans les microcosmes quivalents n 4
et 6. Ceci peut tre li la surabondance anormale dune espce bactrienne arobie dans ce
microcosme, comme lanalyse microbiologique la montr (cf. 5.8), ce qui peut avoir rduit
loxygne disponible pour les bactries dgradant le pyrne.
De plus, les diffrentes mesures effectues lors du suivi des microcosmes montrent
quil y a une bonne corrlation gnrale entre le poids des racines et la surface apparente des
zones claires (coef corr. = 0.85), ainsi quentre le poids des organes suprieurs (tiges et
feuilles) et la surface des zones claires des sdiments (coef corr. = 0,66 en gnral).

Tableau 5.4 : Mesures de la proportion des sdiments sous linfluence oxydante des racines (zones
claires) dans les microcosmes

Dans les microcosmes, les mesures de potentiel rdox effectues en fin dexprience
(J61) ont fourni les rsultats prsents dans le tableau 5.5.
Ces rsultats mettent en vidence les effets suivants :
- les plantes accentuent le contraste de valeurs de potentiel redox entre la surface des
sdiments et le fond des microcosmes ( 3 cm de profondeur environ),
Nmicrocos
me

% zones claires

1 67,62
2 57,33
3 56,27
4 54,73
5 36,84
6 54,3
72
- 72 -

- la prsence de la souche 6PY1 dans les microcosmes 4 7 ne contribue pas modifier
ces valeurs en profondeur, mais provoque une augmentation de la consommation doxygne
sous la surface des sdiments (-5 mm, tableau 5.5).
- la prsence dazoture rduit la consommation doxygne en profondeur et ltat
doxydation dans leau surnageante. Cest un rsultat attendu puisque lazoture est un
inhibiteur de la fonction respiratoire des organismes arobies.

Tableau 5.5 : Dtermination des potentiels redox des sdiments suivant la prsence ou labsence de
plantes

Ces observations soulignent limportance du dgagement doxygne dans lentourage
immdiat des racines des macrophytes sur les dgradations par les bactries arobies. Le rle
des racines a t dmontr dans des expriences de phyto-remdiation des sols contamins par
les HAP (Wetzel et al, 1997).

5.7. Identification des produits de biodgradation du pyrne

Lanalyse par chromatographie couche mince (CCM) dextraits de la colonne deau montre
que seulement trois molcules marques sont retrouves dans les microcosmes (Fig. 5.10).
Ces molcules sont absentes dans les tmoins abiotiques 11 et 12, et sont donc rvlatrices de
lactivit de biodgradation bactrienne. La molcule donnant la tache de radioactivit la plus
intense a la mme mobilit relative que lacide 4,5-diphnantroique, alors que la seconde par
ordre dintensit, forme une tache aplatie caractristique. Ces deux molcules ont t extraites
puis analyses par CPG :couple un dtecteur de masse : il sagit de lacide 4,5-
diphnanthroique et de lacide 4-phnanthroique. La troisime molcule, donnant une tache
Microcosmes Conditions Redox eau
mV
Redox surf.
sdiments
Redox sdim.
-5 mm
Redox sdim.
fond
(z.sombre)
1 Plantes +70 +80 +50 -110
2 Plantes +80 +90 +60 -200
3 Plantes +70 +75 +10 -190
4 Plantes + 6PY1 +80 +90 -20 -200
5 Plantes + 6PY1 +80 +75 -100 -190
6 Plantes + 6PY1 +80 +100 -90 -190
9 +70 +60 -50
10 +55 +50 -40
11 azoture 0 -10 -10
12 azoture +20 0 -10
73
- 73 -

beaucoup moins intense, ntait pas en quantit suffisante pour pouvoir tre identifie par
CPG-SM.

Figure 5.10 : Sparation par CCM des mtabolites du
14
C-pyrne produits dans la phase aqueuse des
microcosmes. Les conditions dextraction des mtabolites et de chromatographie sont dcrites en annexe 5. Les
molcules marques ont t rvles par autoradiographie. Des talons de pyrne, dacide phtalique, et dacide
4,5-diphnantroique ont t analyss en parallle pour connatre leur distance de migration, repre par les
flches.

Les deux produits hydrosolubles identifis dans les microcosmes sont des mtabolites
produits par la souche Mycobacterium 6PY1 lors de la croissance en culture pure sur pyrne
(Krivobok et al., 2003). Ils se forment lors de la 3
me
et de la 4
me
tape de la voie de
dgradation enzymatique du pyrne selon le schma encore provisoire donn en annexe.
Laccumulation de ces mtabolites indique que les enzymes catalysant les tapes
ractionnelles 4 et 5 ont des cintiques lentes limitant la biodgradation du pyrne. De
manire surprenante, les mmes mtabolites se sont forms dans les microcosmes non
inoculs par la souche 6PY1, suggrant que les espces bactriennes indignes des sdiments
dgradent le pyrne selon une voie mtabolique semblable celle propose pour la souche
6PY1, au moins dans ses premires tapes. Dautre part, lacide 4,5-diphnantroique apparat
comme un bon marqueur de dgradation micro biologique du pyrne.
74
- 74 -

Dans le microcosme 5, seul lacide 4-phnanthroique tait dtectable en quantit
significative (Fig. 5.10). Lors de lextraction de leau surnageante, la radioactivit na t
retenue qu 35% contrairement des taux compris entre 65 et 95% dans les autres cas. Ce
rsultat suggre que, dans ce microcosme, lacide 4,5-diphnantroique a t converti en
molcules beaucoup plus hydrophiles, peut-tre par une autre (ou des) espce(s)
bactrienne(s), absente(s) ou beaucoup moins abondante(s) dans les autres microcosmes.
Lanalyse microbiologique dcrite ci-dessous a confirm lexistence anormale de souches
aptes crotre sur milieu minimum dans le microcosme 5 ( 5.8).
On peut remarquer que le pyrne est indtectable dans les extraits deau surnageante, y
compris dans les microcosmes tmoins, o le pyrne na pas t minralis. Une partie du
pyrne a pu sadsorber sur les parois des flacons de stockage des fractions aqueuses pendant
la priode dun mois qui a prcd lanalyse. Cependant, daprs les comptages de
radioactivit des fractions retenues et non retenues lors de lextraction, les pertes par
adsorption nont pu excder 25% en moyenne.
Dans le cas des microcosmes tmoins, la radioactivit sest partag moiti-moiti entre la
fraction retenue sur colonne SPE et la fraction non retenue (cf. Annexe 5 pour plus de dtails).
La fraction non retenue pourrait contenir des complexes peu hydrophobes de pyrne avec des
acides humiques ou dautres molcules amphiphiles, la fraction retenue pouvant renfermer du
pyrne libre. Il se peut que ce pyrne libre lu en 50% mthanol se soit volatilis lors de
lvaporation du solvant, et de ce fait, nait pas pu tre dtect par CCM. Faute de temps, les
fractions reprsentant leau interstitielle nont pu tre analyses.

Les molcules marques retenues dans les sdiments ont t analyses aprs extraction
par le mthanol. Les extraits contenaient assez de radioactivit pour tre analyss directement
par CCM sans vaporation pralable. Le rsultat montre que lessentiel de la radioactivit est
associ au pyrne (Fig.5.11).
Dans les extraits correspondant aux microcosmes o la minralisation a t maximale
(4 8), une tache dacide 4,5-diphnantroique est aussi dtectable ( lexception du
microcosme 5, ce qui conforte lhypothse selon laquelle ce mtabolite a t dgrad par une
espce bactrienne qui sest dveloppe seulement dans ce microcosme).

75
- 75 -

Figure 5 .11 : Sparation par CCM du
14
C-pyrne et des mtabolites produits dans les sidments des
microcosmes. Les sdiments ont t extraits au mthanol. Les molcules marques ont t rvles par
autoradiographie.

5.8. Analyses de la microflore bactrienne des sdiments contamins par le pyrne

Les rsultats prsents jusqu prsent indiquent que les bactries jouent un rle majeur dans
la transformation du pyrne en microcosmes. Il tait donc logique danalyser le compartiment
microbien des microcosmes tudis ci-dessus. Deux approches ont t employes : la
premire est classique et repose sur des mthodes microbiologiques de comptages par
microscopie et de culture sur milieu slectif. La seconde fait appel des techniques de
biologie molculaire que nous avons du adapter. Il sagissait notamment dextraire lADN des
sdiments, amplifier des gnes cibles (ADNr 16S de ribosome) pour permettre ensuite
lanalyse de la diversit bactrienne par des techniques telles que la DGGE ou la SSCP.
Nous avons mis au point une mthode, dcrite en annexe, permettant disoler, partir de 1-2 g
de chacun des sdiments tudis, de lADN de qualit et en quantit suffisante pour amplifier
les ADNr 16S bactriens. Cependant, nous navons pas pu obtenir dimages de la diversit
bactrienne des sdiments, parce que les techniques que nous avons testes se sont avr
dlicates mettre en oeuvre (TTGE, DGGE ou SSCP).
Acide 4,5 di
phnantroique
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Pyrne
Dpts
76
- 76 -

Nous avons galement mis au point au cours de cette tude une technique de dtection
despces du genre Mycobacterium par fluorescence in situ ou FISH (fluorescence in situ
hybridization). Cette mthode permet de visualiser de manire spcifique Mycobacterium par
microscopie. Nous comptions la mettre en uvre pour quantifier ce type de bactries dans les
sdiments, et valuer la survie de la souche 6PY1 dans les microcosmes en fonction de
diffrents scnarios (effet des plantes, effet du pyrne, etc.). Faute de temps, ces analyses
nont pas t ralises.
Les rsultats prsents ci-dessous comparent la microflore bactrienne dans les microcosmes
dcrits ci-dessus 61 j dincubation. Comme les microcosmes taient clos, il ntait pas
possible de faire de prlvements pour suivre les variations de la microflore au cours de
lexprience. Il sagit donc dun constat ponctuel visant rendre compte globalement des
effets des plantes et du pyrne sur la microflore.

5.8.1. Comptages de bactries

Les rsultats des dnombrements totaux des bactries dans les sdiments par comptage
microscopique, ainsi que le dnombrement des bactries capables de dgrader le pyrne sur
milieu glos (zones de dgradation) sont montrs dans le tableau 5.4. En ce qui concerne les
comptages microscopiques, on peut constater que le nombre total de bactries dans le
sdiment est augment par l'ajout de plantes et/ou par l'ajout de Mycobacterium gilvum 6PY1.
Si on calcule la diffrence entre le nombre de bactries dans les microcosmes amends avec la
souche 6PY1 et celui trouv dans les microcosmes non amends, on trouve de 4,4 x 10
7
pour
les microcosmes avec plantes et de 3,6 x 10
7
pour les microcosmes sans plantes. Ces valeurs
sont proches du nombre de bactries ensemences initialement(souche 6PY1), estim
3,4x10
7
par g de sdiment. La proportion de bactries vivantes (colores vertes par le ractif
BacLight) tait >90% dans l'ensemble des microcosmes, l'exception du microcosme 5, dans
lequel environ 50% des bactries extraites du sdiments taient mortes (colores rouges).

Le nombre de bactries produisant des zones de dgradation du pyrne sur milieu
glos tait largement suprieur (35 70 fois) dans les sdiments des microcosmes
ensemencs avec la souche 6PY1. En revanche, le nombre absolu dtermin (1,8 x 10
6
) et 20
fois infrieur au nombre de cellules ajoutes initialement (voir paragraphe prcdente). Trois
explications sont possibles: (1) la mthode de dnombrement sous-estime le nombre de
bactries capables de dgrader le pyrne; (2) la majorit des bactries inocules (6PY1) sont
77
- 77 -

mortes au cours de l'exprience; (3) la souche 6PY1 est reste adsorbe aux particules de
sdiment ou au contraire, a migr dans le surnageant. Le dnombrement spcifique des
cellules 6PY1 par hybridation in situ pourrait aider rpondre cette question.

Tableau 5. 6 : Dnombrements bactriens dans les sdiments des microcosmes contamins par 50 ppm de
pyrne

Microcosmes

Caractristiques
Comptages microscopiques
(bactries/g sdiment)

Comptages des colonies
dgradant le pyrne
(bactries/g sdiment)

1,2,3 Sdiments + plantes 5,5 2,2 x 10
7
5,1 0,9 x 10
4

4,5,6 Sdiments + plantes + 6PY1 9,9 2,9 x 10
7
1,8 0,1 x 10
6

7,8 Sdiments + 6PY1 7,6 2,7 x 10
7
1,8 0,4 x 10
6

9,10 Sdiments seuls 4,0 0,9 x 10
7
2,6 0,7 x 10
4

11,12 Tmoins + NaN
3
2,8 0,6 x 10
7
non dtermin

5.8.2. Isolement et identification de souches

Deux souches capables de dgrader le pyrne ont t isoles des microcosmes 1 et 2,
respectivement, qui contenaient des sdiments et des plantes. La premire souche prsente
une squence du gne ARN 16S identique celle de Mycobacterium austroafricanum, ce qui
permet de l'identifier comme une souche de cette espce. La deuxime souche prsente 99,2%
d'identit de squence avec Stenotrophomonas maltophilia LMG 10857, une espce Gram
ngatif dont certaines souches sont dj connues pour dgrader des HAP (Boonchan et al.,
1998).

Dans les microcosmes ensemencs avec la souche 6PY1, 3 isolats sur 4 prsentaient
un gne ARN 16S identique celui de la souche introduite, et le 4
me
tait identique M.
austroafricanum. Enfin, sur les 5 souches isoles d'un microcosme contenant des sdiments
non amends, toutes ont t identifies comme M. austroafricanum. Il semble donc que cette
dernire espce soit indigne aux sdiments crayeux et qu'elle contribue la minralisation du
pyrne dans les microcosmes non ensemencs avec la souche 6PY1. Sur botes de Ptri
contenant du pyrne, M. austroafricanum forme des zones de dgradation plus grandes que
M. gilvum 6PY1, avec une croissance bactrienne plus abondante, ce qui favorise son
isolement.

78
- 78 -

Dans lun des microcosmes avec plantes et ensemencs avec 6PY1 (n5), une ou des
souches bactriennes capables de se dvelopper sur milieu minimum se sont multiplies en
abondance. Ces souches incapables de dgrader le pyrne ont envahi les boites de slection
sur pyrne, en utilisant peut-tre lactone rsiduel comme substrat carbon. La surabondance
de colonies sur les boites a masqu l'apparition des zones de dgradation, empchant
lisolement de souches dgradant le pyrne de ce microcosme. Le ralentissement de la
cintique de minralisation du pyrne, beaucoup plus marque dans ce microcosme (voir Fig.
5.3), serait ventuellement li au dveloppement anormal despces dominantes au cours de
lexprience, qui pourrait aussi tre lorigine de la surmortalit bactrienne constate dans
ce micocosme.

5.9 Conclusions

Biodgradation du pyrne
Nos rsultats montrent que la biodgradation du pyrne en microcosmes est exclusivement
dorigine bactrienne, quil y ait eu ou non amendement pralable avec la souche 6PY1. De ce
point de vue, la participation des champignons micromyctes apparat comme ngligeable,
bien que, dans dautres conditions, des espce fongiques aient t impliques dans la
dgradation du pyrne (Ravelet et al., 2000).
Lidentification de produits doxydation du pyrne retrouvs dans la phase aqueuse,
notamment lacide 4,5-diphnanthroque, prouve que la dgradation rsulte dune attaque
bactrienne, comme lont montr des tudes antrieures sur des souches isoles (Dean-Ross et
Cerniglia, 1996 ; Schneider et al., 1996 ; Krivobok et al., 2003). Cest la premire fois que de
tels mtabolites sont dtects directement dans un cosystme naturel : comme lacide 4,5-
diphnanthroque est facile extraire et doser par CPG, il constitue un bon marqueur
mtabolique rvlateur des bactries dgradant le pyrne dans un milieu contamin.
Nos rsultats suggrent en outre, que les autres bactries des sdiments sont incapables de
dgrader ce mtabolite. Enfin, les bactries anarobies sont sans effet sur le pyrne, puisque
linhibition du mtabolisme respiratoire (par lazoture) a pour consquence labolition de
toute biotransformation du pyrne, tout au moins pendant la priode considre. Il a t
estim que la biodgradation des HAP 2-3 cycles en anarobiose tait 1-2 ordres de
grandeur plus lente que celle observe en arobiose (Rockne et Strand, 1998).
Nous apportons la preuve que les sdiments lacustres tudis contiennent des bactries
indignes capables de minraliser le pyrne, et ce bien quils ne soient contamins que par des
79
- 79 -

traces de HAP (Tableau 1.1). Ces bactries ne sont pas dtectables immdiatement par
leur activit, mais seulement au bout de 15 j dincubation en prsence de 50 ppm de pyrne,
suggrant que ce temps de latence correspond la multiplication dans le milieu de bactries
spcialises. Du fait du caractre inductible de la dgradation, la proportion de pyrne dgrad
nexcde pas quelques pour cent au bout de 2 mois dans les microcosmes non amends en
bactries slectionnes, compar environ 15-20 % dans les microcosmes amends. A J61,
lactivit de minralisation du pyrne est encore croissante, et reprsente env. 20% de
lactivit maximale observe dans les microcosmes amends. En extrapolant lexprience, on
peut penser que la cintique de biodgradation pourrait devenir comparable celle observe
dans les microcosmes amends. Dans ce dernier cas, la cintique de minralisation du pyrne
sinflchit aprs 30-40 j, traduisant lincidence de facteurs limitant tels que la diminution de
laccessibilit des bactries leur substrat, la comptition entre espces, la prdation. La
comparaison entre le nombre de bactries (souche 6PY1) ensemences initialement et le
dnombrement de bactries dgradant le pyrne J61, laisse penser que les deux derniers
facteurs jouent un rle non ngligeable.

Effets des plantes aquatiques
Les plantes aquatiques ont un effet stimulant sur la biodgradation du pyrne, ce qui se
manifeste par une augmentation de la cintique de minralisation, accompagne par un
accroissement de la formation de mtabolites hydrosolubles (fig. 5.4) et corrobore par une
diminution de la concentration de pyrne rsiduel (tableau 5.1). Curieusement, les plantes
nont pas eu deffet stimulant dans les microcosmes amends par la souche 6PY1, provoquant
au contraire un petit ralentissement de la minralisation surtout perceptible au dbut de la
cintique. Ce rsultat un peu paradoxal est difficile expliquer : on pourrait invoquer
linhibition de la croissance de la souche 6PY1 par un produit scrt par les plantes, mais
nous navons pas test cette hypothse. En gnral, les plantes favorisent au contraire la
croissance bactrienne par les produits carbons quelles scrtent au niveau de leurs racines.
Dans certains cas, des substances dorigine vgtale stimulent de manire plus spcifique telle
ou telle fonction bactrienne, par exemple la dgradation de polluants, do lintrt de la
phytoremdiation (Singer et al., 2003). Les tudes de phytoremdiation de sols ou sdiments
contamins par des polluants organiques, notamment des HAP, sont toutefois rares et leffet
bnfique des plantes quand il est avr, nest pas bien compris.
Dans le cas prsent, les roseaux pourraient exercer leur effet stimulant de plusieurs faons :
80
- 80 -

(i) ils pourraient vhiculer par leurs racines loxygne de lair jusque dans le sdiment et
contribuer ainsi favoriser le catabolisme oxydatif du pyrne, trs dpendant de O
2
. Nos
observations indiquent de manire spectaculaire que les racines induisent une
compartimentation du sdiment crayeux en zones claires plus riches en O
2
proximit des
racines, et zones sombres anoxiques o se produit la prcipitation de sulfures mtalliques.
(ii) ils pourraient favoriser la multiplication des bactries arobies et en particulier des espces
qui sattaquent au pyrne. Les comptages de bactries J61 indiquent une lgre
augmentation du nombre total de bactries et des espces pyrne-spcifiques dans les
microcosmes contenant des plantes. Nous navons pas pu distinguer plus finement les
populations bactriennes des zones claires et des zones sombres du fait de lhomognisation
des sdiments avant chantillonnage.
Le pyrne a t retrouv dans les tissus des roseaux des concentrations variant dans une
fourchette de 50 1000 g/g de tissu sec, pour des contaminations des sdiments par le
pyrne de 50 200 ppm. Le pyrne a t principalement localis dans les racines, mais aussi
dans les parties ariennes de la plante, notamment la base des tiges et des feuilles. Cette
rpartition suggre que le pyrne emprunte le systme vasculaire de la plante, et se concentre
l o le flux vasculaire est maximal. En accord avec cette hypothse, nous avons remarqu
que les plantes en croissance rapide (issues de semis), accumulent plus de pyrne dans leurs
tissus que les plantes croissance plus lente provenant de boutures.
Les facteurs de concentration observs sont relativement faibles compars la concentration
nominale dans les sdiments. Cependant, si on prend en compte la limite de solubilit du
pyrne dans leau, soit 0,16 g/ml, et en supposant que le pyrne est transport de manire
passive dans la sve, alors laccumulation dans la plante est significative.
Quand le pyrne est mtabolis par les bactries, les plantes incorporent 8 20 fois moins de
pyrne, mais accumulent beaucoup plus de produits doxydation, mis en vidence par
marquage radioactif. Il semblait plausible que ces produits doxydation soient les mtabolites
gnrs par les bactries, plus hydrosolubles que le pyrne, et donc susceptibles de pntrer
plus facilement dans les plantes par la sve. Cependant, la nature des produits marqus
trouvs dans les tissus vgtaux diffre de celle des mtabolites secrts dans leau par les
bactries. Il pourrait sagir dadduits ou de complexe entre mtabolites et composantes des
plantes.

81
- 81 -

Devenir du pyrne
Lutilisation de traceur radioactif a permis de connatre la rpartition du pyrne et de ses
produits doxydation dans les microcosmes. Comme on pouvait sy attendre, le pyrne
introduit est rest pour lessentiel adsorb aux sdiments. Les calculs bass sur les comptages
de radioactivit dans les phases gazeuses, aqueuses, et les extraits de sdiments indiquent
quau plus 63% du carbone initialement introduit a t retrouv en fin dexprience. Cette
valeur maximale a t obtenue pour les microcosmes o la biodgradation t inhibe par
lazoture. Mme si on prend en compte des pertes possibles par adsorption du pyrne sur les
parois des microcosmes et des sous-estimations lors des comptages de radioactivit, il est peu
probable que la disparition de prs de 40% du pyrne leur soit totalement imputable.
Lhypothse la plus plausible est quune partie du pyrne reste fortement associe aux
sdiments et nest pas extractible aux solvants organiques. Cette fraction non extractible
aurait pu tre analyse laide dun appareil de minralisation quip dun dtecteur de
radioactivit, mais nous ne disposions pas dun tel appareil. De nombreuses tudes ont
montr, et il est largement reconnu, que les HAP en gnral et le pyrne en particulier sont en
partie squestrs dans les sols et les sdiments sous une forme non extractible (Eschenbach et
al., 1998 ; Richnow et al., 1998 ; Guthrie et al., 1999). La proportion de cette fraction non
extractible augmente avec le temps : par exemple, Guthrie et al. (1999) nont retrouv que 53
77% du pyrne aprs incubation de cet HAP avec des sdiments pendant 60 j. Les chiffres
que nous obtenons sont dans cette fourchette. Les mmes auteurs ont montr quune partie du
pyrne tait squestr sous forme de complexes avec les acides humiques. Dautres auteurs
ont propos que les HAP sinsinuent dans des micro-porosits des particules de sdiments ou
de sols do ils ne sont pas extractibles.
Le pyrne subit des bio-transformations qui rsultent quasi exclusivement de lactivit des
bactries des sdiments. Les bactries peuvent dgrader jusqu 20% du pyrne,
lhydrocarbure tant pour moiti minralis en CO
2
, pour une autre moiti transform en
mtabolites. Ce bilan est comparable celui que nous avons obtenu au laboratoire en culture
pure avec la souche 6PY1, ceci prs que, dans ce dernier cas, nous avons estim quenviron
1/4 du carbone du substrat est converti en biomasse.

Effets du pyrne sur la biodiversit microbienne
Limpact du pyrne sur la communaut bactrienne na t que partiellement abord lors de
cette tude, car, pour des raisons techniques voques plus haut, nous navons pas pu mettre
en uvre de mthodes danalyse globale de la diversit gntique. En gnral, les HAP
82
- 82 -

induisent des changements qui rsultent dune adaptation de la microflore o les espces
capables de les utiliser comme sources de carbone deviennent prpondrantes. Cette
adaptation a souvent pour consquence une diminution de la diversit de la communaut
bactrienne (Roling et al., 2002 : Cheung et Kinkle, 2001). Une tude rcente a montr que
les variations de la diversit bactrienne, tant aux plans qualitatif que quantitatif, taient
moins lies la prsence de polluants qu leffet rhizosphre des plantes (Siciliano et al.,
2003).
Les isolats obtenus indpendamment de microcosmes incubs dans diffrentes conditions sont
apparemment trs proches et sont presque tous apparents lespce Mycobacterium
austroafricanum. Cette espce indigne semble la plus apte sadapter la croissance en
utilisant le pyrne comme source de carbone. La majorit des espces capables de dgrader le
pyrne qui ont t isoles ce jour, bien quelles proviennent dorigines gographique et
gophysique trs diverses, appartiennent au genre Mycobacterium ou dautres bactries
gram positif taxonomiquement proches (Kastner et al., 1994 ; Cheung et Kinkle, 2001 ;
Jouanneau et al., 1999).
83
- 83 -

6. DEVENIR ET TOXICITE DU PYRENE EN MICROCOSMES OUVERTS

6.1. Description des essais raliss
Afin dtudier le devenir et les effets du pyrne dans des conditions plus ralistes que celles
offertes par les tests monospcifiques (cf 4.1), des bioessais ont t mis en uvre sur
microcosmes de laboratoire de 2 litres (Clment et Cadier, 1998). Ces microcosmes simulent
schmatiquement des cosystmes aquatiques partir dun sdiment, dune colonne deau et
dorganismes issus dlevages et de cultures et se dveloppant dans le sdiment (chironomes
et crustacs amphipodes) ou dans la colonne deau (daphnies, microalgues et lentilles deau).
Dans la mesure o lon visait galement mesurer dune part les effets du pyrne sur le
compartiment bactrien du sdiment et dautre part la bioaccumulation du pyrne par les
organismes suprieurs, un essai prliminaire (appel essai mono par la suite) en conditions
simplifies (petits bchers de 400 mL, pas dorganismes suprieurs sauf daphnies ajoutes
plusieurs reprises) sur 21 jours a t ralis. Lobjectif est ici de dfinir les paramtres
exprimentaux et mthodologiques adquats pour le suivi de la rponse des communauts
bactriennes au contact du pyrne et de la bioaccumulation dans les organismes suprieurs.
Cette tape a par ailleurs permis de choisir la concentration en pyrne utilise dans la phase
finale du travail de recherche et dans le choix dun marqueur dactivit bactrienne (activit
leucine-aminopeptidase ou activit $-D-glucosidase, Verrhiest et al., 2002) correspondant
nos critres dtude. La dernire tape est la ralisation de bioessais plurispcifiques de 28
jours (appels essais pluri1 et pluri2 par la suite) associs lutilisation de deux phases
sdimentaires dopes une concentration unique en pyrne. Paralllement au suivi des
paramtres biotiques et abiotiques retenus dans ltude, nous avons galement mis profit le
second essai pour tudier linfluence de lintroduction dune souche dgradant spcifiquement
le pyrne sur le devenir du pyrne et la rponse des organismes suprieurs.

6.2. Conditions opratoires et paramtres mesurs
Les matriels et mthodes sont prsents en annexe. Les organismes utiliss proviennent des
mmes levages et cultures que ceux utiliss dans les tests monospcifiques (cf 4.1). Les
conditions gnrales des essais en microcosmes ne sont pas trs diffrentes des essais
monospcifiques sur sdiments. Le sdiment est dop selon le mme protocole, mis sous eau
et lobscurit pendant 7 jours, puis les organismes sont introduits (J0). La colonne deau est
are par bullage et non renouvele au cours du test. Des sacrifices sont raliss intervalles
84
- 84 -

de temps rguliers (J0, J10, J21 et J28) pour permettre de rcuprer les organismes
plagiques et benthiques ainsi que des chantillons deau et de sdiments pour analyses. La
ncessit de sacrifier une partie des systmes au cours de lessai et de travailler un certain
niveau de rplication (3 rplicats par date de sacrifice et par traitement) se traduit par la mise
en place dun grand nombre de systmes (entre 36 et 48). Sont suivis sur 21 jours (essai
mono) ou 28 jours (essais pluri1 et pluri2) : la survie et la croissance des organismes
suprieurs (daphnies, lentilles deau, amphipodes, chironomes, essais pluri1 et pluri2), une ou
deux activits exo-enzymatiques ainsi que la densit bactrienne du sdiment (tous essais),
certains paramtres physico-chimiques de la colonne deau (oxygne dissous, pH,
conductivit, temprature, COT) et du sdiment (pH, perte au feu, teneur en eau, COT de
leau interstitielle, anions et cations de leau interstitielle) (tous essais), les teneurs en pyrne
dans le sdiment, leau surnageante et leau interstitielle ( J0 seulement pour lessai mono,
J0, J10, J21 et J28 pour les essais pluri1 et pluri2), les doses de pyrne bioaccumules dans les
organismes suprieurs (daphnies pour lessai mono et tous organismes pour les essais pluri1
et pluri2).
Les essais sont raliss sur le seul sdiment craie pour lessai mono (dop 0-2-20-200
mg/kg frais, concentrations nominales) et simultanment sur les sdiments craie et
tourbe pour les essais pluri1 et pluri2 (dops 0 et 50 mg/kg frais, concentration
nominale).

6.3. Essais en petits bchers sur sdiment dop (essai mono)

6.3.1. Effets sur le compartiment bactrien du sdiment
De faon globale, les niveaux dactivit leucine-aminopeptidase se sont rvls 4 fois plus
importants que les niveaux dactivit -D-Glucosidase mesurs autour des mmes dates (2
jours dintervalles maximums). Pour les deux marqueurs enzymatiques mis en uvre et pour
chacune des dates de mesures, le dopage du sdiment craie nentrane aucune variation
significative des niveaux dactivits sur la gamme 1, 10, 50, 100 et 200 mg/kg. De la mme
faon, le pyrne naffecte pas la densit bactrienne totale des sdiments pour la mme
gamme de concentrations.

6.3.2. Survie des daphnies et bioaccumulation du pyrne
De J-4 J-3 et de J-3 J0, lexposition de 24 72 h de jeunes daphnies aux sdiments
contamins na pas entran de mortalit significative (survie toujours 80%). Il en est de
85
- 85 -

mme pour les daphnies exposes 24 h de J2 J3. En revanche, J0, si sur 24 h on ne
note pas deffet significatif sur la survie, lexposition des daphnies pendant 48 h au-dessus des
sdiments ou dans les eaux surnageantes rcupres J0 et filtres 0.8 m entrane des
mortalits marques et croissantes avec la concentration. Ainsi, sur 48 h on obtient une
mortalit de 50% 100 g/g pour le sdiment. Les daphnies exposes aux eaux surnageantes
seules sont galement affectes puisque les mortalits varient entre 20 et 60%. Si lon
confronte ces rsultats de mortalit aux teneurs mesures dans ces mmes eaux on montre que
50% de mortalit est obtenu autour de 70 g/L. Il est intressant de noter que cette valeur est
identique la CE50-48 h 1500 lux de 74 g/L trouve en tests monospcifiques. Labsence
deffets sur 24 h est logique puisque la CE50-24 h du pyrne est de 105 g/L sous un
clairage de 2500 lux.
Le pyrne accumul par D. magna est dcelable partir de 10 mg/kg de sdiment, plus
rarement 1 mg/kg, mais la sensibilit de la mthode est lie au nombre de daphnies utilises.
Compte tenu des spectres dmission de fluorescence obtenus (figure 6.1) tout au long de cet
essai, trs proches du spectre du pyrne pur quelle que soit la dure dexposition des jeunes
daphnies, la mthode base sur la hauteur du pic 393 nm permet effectivement dvaluer les
doses de pyrne accumules par ces organismes. On verra que, dans les essais pluri1 et pluri2,
ce nest pas le cas pour tous les organismes.

Figure 6.1. Spectres dmission de fluorescence des extraits mthanoliques de daphnies exposes de J-4 J-3 au
cours du 1
er
essai en petits bchers versus spectre du pyrne 100 ppb dans du MeOH

La figure 6.2 synthtise les rsultats de bioaccumulation par les daphnies exposes dans les
systmes, donc exposes au pyrne du sdiment, au pyrne dissous dans la phase deau
surnageante, et au pyrne particulaire de cette mme phase. Dans lensemble on observe les
0
100
200
300
400
500
600
350 375 400 425 450 475
Longueur d'onde, nm
I
n
t
e
n
s
i
t

d
e

f
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
e
0 mg/kg
1 mg/kg
10 mg/kg
50 mg/kg
100 mg/kg
200 mg/kg
100 g/L (amplif max)
86
- 86 -

plus fortes doses bioaccumules aux plus fortes teneurs du sdiment, mais les rsultats
sont rarement significativement diffrents entre 50, 100 et 200 mg/kg, alors que les doses
bioaccumules sont significativement infrieures pour 10 mg/kg.

Figure 6.2. Evolution des doses bioaccumules chez Daphnia magna exposes 24 h aux sdiments contamins
10, 50, 100 et 200 mg/kg frais.

Sur 2 semaines la capacit de bioaccumulation volue assez peu, on note des valeurs
infrieures pour J2, qui pourraient tre dues la taille particulirement petite des daphnies
utilises ce jour-l. Il nest pas impossible que cette capacit diminue pour 10 mg/kg, alors
quelle se maintient globalement aux concentrations les plus fortes, ce qui pourrait traduire
pour ces concentrations un quilibre atteint pour le pyrne dans le systme, tout au moins
entre leau surnageante et le sdiment.
Lorsque les daphnies sont exposes aux seules eaux surnageantes aprs rcupration de
celles-ci, la bioaccumulation est moindre chez ces daphnies par rapport celles exposes aux
sdiments, mais il convient de remarquer que ces eaux surnageantes ont t filtres dans ce
type de comparaison. Un essai comparatif entre eaux filtres et eaux non filtres indique une
moindre accumulation dans les eaux filtres, ce qui permet de penser que les daphnies
ingrent de faon passive, du fait de leur comportement dorganismes filtreurs, les particules
sur lesquelles le pyrne est adsorb, et que les diffrences constates entre une exposition au
sdiment donc aux eaux surnageantes brutes et une exposition aux seules eaux surnageantes
filtres pourraient ntre dues en fait quaux particules prsentes dans les eaux surnageantes
brutes. Sagissant de tests de courtes dures sur des jeunes daphnies, il semble logique de
penser que les daphnies naugmentent pas leur exposition en allant fouiller la surface du
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
J-4 J-3 J0 J1 J2 J3 J7 J8 J14 J15
m
g

p
y
r
n
e
/
k
g

d
a
p
h

s
e
c
10
50
100
200
87
- 87 -

sdiment, surface sur laquelle elles ont peu de chance de trouver quelque chose du fait de
labsence de nourriture apporte (par exemple microalgues qui pourraient se dposer).
Labsence de diffrences significatives de bioaccumulation entre 50, 100 et 200 mg/kg
pourrait bien tre lie au fait que les teneurs en pyrne de leau surnageante prsentent
rapidement un palier partir de 50 mg/kg, comme le montrent les mesures ralises sur les
eaux surnageantes au cours de lessai (figure 6.3). Lcart systmatique entre les valeurs de
bioaccumulation obtenues 10 g/g et celles obtenues 50, 100 et 200 g/g, souvent
groupes, semble corrobor par ces rsultats danalyse, et semble confirmer que lexposition
des daphnies se fait en majeure partie via leau surnageante. Dans ces conditions il est logique
de calculer un facteur de bioconcentration partir des doses mesures dans les daphnies et des
valeurs obtenues sur les eaux surnageantes (Fig. 6.4).

Figure 6.3. Evolution des teneurs mesures dans les eaux surnageantes (g/L) en fonction des teneurs nominales
du sdiment

Figure 6.4. Teneurs mesures des eaux surnageantes J0 et facteurs de bioconcentration (log BCF) calculs
partir de ces teneurs et des doses mesures dans les daphnies exposes 24 h de (J0 J1) dans les bchers au-
dessus de sdiment contamin 10, 50, 100 et 200 mg/kg
0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
J7 J12 J14 J18
Temps (jour)
1 mg/Kg
10 mg/Kg
50 mg/Kg
100 mg/Kg
200 mg/Kg
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1 10 50 100 200
mg/kg sd. frais
g

p
y
r
n
e
/
L
3,20
3,40
3,60
3,80
4,00
4,20
4,40
4,60
pyrne eaux
surnageantes
log BCF
88
- 88 -

Si lon met de ct les rsultats 1 g/g, teneur laquelle le protocole de dosage du pyrne
chez de jeunes D. magna ne semble pas adapt (voir ci-dessus), on obtient un log BCF moyen
de 4.29 0.093 sur la base des poids secs ou encore un log BCF moyen de 3.29 0.093 sur la
base des poids frais. Cela correspond un BCF (poids frais) moyen de 1986 445 L/g trs
proche des valeurs comprises entre 1000 et 2000 L/kg obtenues par Nikkil et Kukkonen
(2001) dans des eaux de diffrentes teneurs en COD et dopes 1.2 g de pyrne/L. Dans le
travail de ces auteurs, la valeur de 2100 L/g est obtenue pour une eau de DOC < 0.2 mg/L et,
pour une eau de DOC gal 9.4 mg/L ils obtiennent environ 1900 L/g. Nos rsultats sont
galement proches des valeurs obtenues par Southworth et al. (1978) sur Daphnia pulex
expos 50 g/L. Ces auteurs obtiennent en effet un BCF (poids frais) de 2702 L/kg.
Sagissant dHAP, on parle deffets narcotiques qui se manifestent partir dune certaine
accumulation dans les tissus. Selon Landrum et al. (1991, 1994) et Driscoll et al. (1997), on
obtient 50% deffet, pour divers organismes (amphipode Diporeia par exemple) exposs des
sdiments spiks en HAP pour des doses internes voisines de 6 mol/g (poids frais
dorganisme). Si lon examine les doses internes chez les daphnies exposes de J0 J2 on
obtient 50% deffet autour de 0.7 mol/g (poids frais), en supposant que les doses mesures
J1 naugmentent pas entre J1 et J2 (les rsultats de Nikkil et Kukkonen (2001) montrent que
le palier est atteint partir de 15 heures dexposition). Dans nos conditions on obtient des
effets mdians des doses 10 fois infrieures celles obtenues sur les amphipodes de
Landrum et collaborateurs. Il est vrai que les organismes sont diffrents et les dures
dexposition galement (48 h pour les daphnies contre 31 jours pour Diporeia).

6.4. Essais en microcosmes de 2 L sur sdiments dops (essais pluri1 et pluri2)

6.4.1. Partition du pyrne dans les compartiments abiotiques

Les teneurs mesures dans les sdiments apparaissent faibles par rapport la teneur nominale
de 50 g/g poids frais (tableau 6.1). Un essai supplmentaire en bchers de 2 L mais sans
introduction dorganismes a t men par la suite. Ces valeurs conduisent estimer le
rendement de dopage de 48 ou 67% selon lessai pour la craie, alors que ce rendement tait
dau moins 76% sur le test monospcifique sur Hyalella azteca. Pour la tourbe, le rendement
est encore plus faible : 3 17% contre 58 97% sur le test monospcifique. Un essai
complmentaire de dopage a t ralis de faon approcher au mieux les rendements sur du
sdiment frachement dop (tableau 6.2). Cet essai permet, pour les deux sdiments, de
89
- 89 -

montrer une certaine htrognit de la contamination, qui peut expliquer que les
estimations de rendement puissent montrer une certaine dispersion. Cependant, les rsultats
obtenus mettent en vidence que les rendements pour la tourbe sont effectivement plus faibles
que pour la craie mais ne permettent pas dexpliquer les trs faibles valeurs obtenues pour la
tourbe lors des essais pluri1 et pluri2.

Tableau 6.1. Rsultats des analyses de pyrne pour les sdiments craie et tourbe (en mg/kg de sdiment frais) au
cours des essais pluri1 et pluri2, et lors dun essai supplmentaire sans organismes (essai contrle).

Craie Tourbe
Essai pluri1 Essai pluri2 Essai contrle Essai pluri1 Essai pluri2 Essai contrle
J-7 29.96 8.442
J0 24.08 33.6 17.199 1.37 3.9 7.25
J10 10.41 14.4 0.05 1.87
J14 21.91 1.916
J21 2.07 1.12
J28 0.62 13.188 1.96 1.332

La dcroissance importante des teneurs en pyrne dans le sdiment craie entre J0 et J28
pour lessai pluri1 et entre J0 et J12 pour lessai pluri2 est difficile expliquer. Noter que
cette dcroissance est continue et peut se modliser par un polynme du second degr (figure
6.5). Il est peu vraisemblable que la teneur totale en pyrne du sdiment puisse avoir autant
diminu par le fait de processus comme la photolyse, la biodgradation ou plus simplement la
diffusion vers la colonne deau. En effet, lclairement nest pas suffisant pour entraner, au
niveau du sdiment, une action sur le pyrne.

Tableau 6.2. Rsultats des analyses de pyrne ralises sur 3 chantillons prlevs dans du sdiment frachement
dop en pyrne

Craie Tourbe
mg/kg frais rendement (%) mg/kg frais rendement (%)
1 38.32 76.64 16.42 32.84
2 22.87 45.74 22.87 45.74
3 33.55 67.10 31.61 63.22
moyenne 31.58 63.16 23.63 47.27
SD 7.91 0.16 7.62 0.15
CV 25.05% 25.05% 32.26% 32.26%

La biodgradation, mme si elle est probablement effective comme le montrent les rsultats
obtenus dans ce travail (cf chapitre 5), ne peut prsenter de tels rendements. Enfin, la
diffusion ne peut tre que ngligeable en raison de la propension du pyrne se fixer sur les
particules du sdiment.
90
- 90 -

Figure 6.5. Evolution de la teneur en pyrne du sdiment craie au cours de lessai pluri1 (essai en
microcosmes plurispcifiques)

On peut en revanche avancer lhypothse que, du fait dun phnomne de vieillissement du
sdiment (Leppnen & Kukkonen, 2000 ; Alexander, 2000 ; Conrad et al., 2002), le pyrne
migrerait de plus en plus loin lintrieur des particules minrales et/ou organiques de
sdiment, ce qui pourrait se traduire par une extraction de moins en moins facile. La
diminution de lextractabilit chimique du pyrne du fait du vieillissement du sdiment a t
dmontre pour diffrents solvants dextraction (Conrad et al., 2002), mais la dcroissance, si
elle est significative ds 10 jours, nest pas du mme ordre de grandeur que dans notre tude
puisquil faut plusieurs mois pour diminuer par deux le rendement dextraction.

A partir des dosages de pyrne dans les eaux interstitielles (essai contrle seulement, les
dosages nayant pu se faire dans des dlais acceptables pour les essais pluri1 et pluri2) et des
teneurs mesures dans les sdiments, il est possible de calculer des Koc apparents (tableau
6.3). Les valeurs obtenues prsentent une certaine homognit mais sont infrieures celles
obtenues lors de lessai monospcifique sur Hyalella azteca, qui se situaient autour de 5 la
teneur nominale de 20 g/g poids sec (cf 4.1.3.2 et figure 6). Ces diffrences sexpliquent par
des teneurs dans les eaux interstitielles plus faibles lors de lessai monospcifique, teneurs qui
ont pu tre sous-estimes du fait de problmes de dlais danalyses et de conservation.

Les rsultats de dosage du pyrne dans les eaux surnageantes (figure 6.6) montrent une
augmentation au dbut (diffusion du pyrne du sdiment vers leau surnageantes) puis une
dcroissance partir de J4, dcroissance dans laquelle la photodgradation et ladsorption du
y = 0,0295x
2
- 1,6655x + 24,097
R
2
= 1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 10 20 30 40
Jours
g

d
e

p
y
r
n
e
/

g

d
e

s
d
.

f
r
a
i
s
Essai 2
Essai 3
91
- 91 -

pyrne sur le verre des parois jouent probablement un rle compte tenu des observations
faites prcdemment (cf 4.1.2).

Figure 6.6. Teneurs en pyrne des eaux surnageantes au cours de lessai contrle en microcosmes 2 L (pas
dorganismes)

Tableau 6.3. Log Koc apparents estims au cours de lessai en microcosmes (essai contrle) sans introduction
dorganismes (EI : eau interstitielle)

J -7 J0 J14 J28
Craie g/g poids sec 42.8 24.57 31.3 18.84
EI, g/L 96.8 62.4 68.7 46.73
log Koc 4.53 4.72 4.68 4.85
Tourbe g/g poids sec 42.21 36.25 9.58 6.66
EI, g/L 14.0 6.8 10.0 5.92
log Koc 4.16 4.47 4.30 4.53

6.4.2. Effets sur les organismes suprieurs
La contamination des sdiments par le pyrne la teneur choisie dans le cadre des ces essais
(50 g/g comme teneur nominale) a permis de mettre en vidence un certain nombre de
modifications dans le comportement gnral des systmes contamins. Les essais
monospcifiques raliss en 2001 ont montr lapparition deffets toxiques du pyrne (survie
et croissance) sur les amphipodes et les chironomes partir dune teneur dans les sdiments
de 20 g/g. Pour les essais en microcosmes plurispcifiques nous avons adopt une teneur des
sdiments gale 50 g/g de pyrne dans les systmes plurispcifiques, qui devait
logiquement permettre dobserver des effets de la contamination sur les organismes. Ce choix
prend galement en compte ladsorption potentielle du pyrne en solution sur les parois en
verre des contenants utiliss (surface plus importante que dans les essais monospcifiques),
facteur pouvant rduire sa biodisponibilit. Cette teneur devait galement nous permettre
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
J-6 J-2 J0 J4 J11 J18
p
y
r
n
e

e
a
u

s
u
r
n
a
g
e
a
n
t
e
,

g
/
L
Craie
Tourbe
92
- 92 -

dobserver des teneurs en pyrne dcelables dans les compartiments abiotiques des
microcosmes (sdiment, eaux surnageantes, eaux interstitielles).
Globalement les rsultats obtenus dans le cadre de cette tude montrent, la concentration de
pyrne nominalement introduite dans les sdiments, une gamme deffets varis de la
contamination sur les critres biologiques ltaux et subltaux retenus pour les organismes
introduits dans les systmes (tableau 6.4). La survie des daphnies est moins bonne au-dessus
du sdiment craie contamin, mais leur reproduction nest significativement affecte que
dans lessai pluri2. La contamination semble galement perturber la reproduction des
amphipodes comme le montre labsence de couple en amplexus en fin dessai dans les
systmes contamins. Des observations ralises en cours dessai ont permis de mettre en
vidence dautres diffrences comportementales entre les organismes des systmes tmoins et
contamins. La raction dvitement du sdiment observe chez les amphipodes au-dessus du
sdiment craie contamin, a galement t mise en vidence chez Lumbriculus variegatus
dans le cadre dessais de toxicit aigu portant sur un sdiment naturel contamin 100 g/g
de pyrne (Leppanen et Kukkonen, 1996). La diffrence de ractivit un stimulus lumineux
des daphnies, observe entre les systmes contamins et non contamins, bien que clairement
marque dans cette tude, nest pas voque dans la littrature.
Les essais monospcifiques navaient pas montr sur 10 jours deffet ltal ou subltal de la
contamination sur les chironomes la plus forte concentration en pyrne introduite dans ce
sdiment (200 g/g). Un des essais plurispcifiques de cette tude a permis de mettre en
vidence un effet marqu de la contamination 50 g/g sur lmergence des chironomes dans
le sdiment craie , effet cependant non confirm lors de lessai pluri2. Dune manire
globale, les tests de toxicit raliss en prsence de sdiments contamins artificiellement ont
montr un faible effet du pyrne sur la survie de diffrents organismes benthiques tel que R.
abronius et L. variegatus (Kukkonen et Landrum, 1994 ; Swartz et al., 1997), mais les
rsultats obtenus ici montrent que la survie des chironomes peut tre affecte 21 et 28 jours
par la contamination du sdiment craie (essai pluri1). Les essais monospcifiques raliss
sur Hyalella azteca ont montr que la survie et la croissance des amphipodes diminuent
sensiblement dans le sdiment craie partir de 20 g/g de pyrne et sont fortement
affectes 200 g/g (cf 4.1). La concentration intermdiaire de 50 g/g choisie pour les essais
en microcosmes affecte logiquement la survie et la croissance des amphipodes dans les
microcosmes plurispcifiques mis en place. Ce type de rsultats a t mis en vidence pour un
autre amphipode Diporeia spp, dans diffrents sdiments naturels dops des teneurs en
pyrne voisines de celle utilise dans cette tude (Landrum, 1991). Ces deux sries de tests
93
- 93 -

saccordent pour montrer une absence deffet de la contamination sur la survie et la
croissance de ces organismes dans le sdiment tourbe . Labsence de donnes concernant
les teneurs relles en pyrne des eaux interstitielles ne permet pas de raliser une analyse plus
fine de nos rsultats. Nanmoins, on peut supposer, qu la teneur de 50 g/g utilise dans
cette tude, le pyrne a adopt un comportement dans les systmes plurispcifiques similaire
ce qui a t observ dans le test monospcifique sur amphipodes, cest--dire un pigeage
plus important du pyrne par la matire organique du sdiment tourbe , se traduisant par
des teneurs plus faibles dans les eaux et, par consquent, une exposition moindre des
organismes. Le dveloppement des lentilles na pas t affect dans les microcosmes la
concentration en pyrne utilis, ce qui est logique car aucune rponse de ces organismes na
t mise en vidence dans le cadre des essais monospcifiques utilisant le sdiment craie
dop 200 g/g de pyrne.

Tableau 6.4. Synthse des perturbations ltales et subltales induites par le pyrne sur les organismes des
microcosmes aquatiques

6.4.3. Bioaccumulation du pyrne au cours des essais en microcosmes
6.4.3.1. Essai pluri1
Effets du pyrne
Organismes
Craie Tourbe
Mycobacterium 6PY1
D. magna
Survie Effet significatif Effet signif. essai pluri2 Pas deffet observ
Croissance Pas deffet observ Pas deffet observ Pas deffet observ
Reproduction
Effet signif. essai pluri2
Pas deffet observ
Effet positif sur la reproduction entre 16 et
28 jours dans craie contamine
Phototactisme ngatif positif positif
H. azteca
Survie
Essai pluri1 : effet 10
et 21 jours (70 et 53%)
Essai pluri 2:
:
effet 10, 21
et 28 jours (60 63%)
Pas deffet observ
effet positif (craie )
Croissance
Essai pluri1: : effet 21
jours (62%)
Essai pluri 2: : effet 10 et
21 jours (59 61%)
Pas deffet observ
Reproduction Effet ngatif Pas deffet observ Effet positif dtect (craie et tourbe)
Evitement du sdiment Effet ngatif Pas deffet observ Pas deffet observ
C. riparius
Survie
Essai pluri1: : effet 21 et
28 jours (22 et 28%)
Pas deffet observ Pas deffet observ
Emergence
Essai pluri1 : : effet entre
20 et 28 jours
Pas deffet observ Pas deffet observ
L. minor
Compariment bactrien
Activits enzymatiques Pas deffet observ Pas deffet observ Pas deffet observ
Densit bactrienne Pas deffet observ Pas deffet observ Lgre stimulation 28 jours
Pas deffet observ
94
- 94 -

Le suivi de la bioaccumulation par les organismes des microcosmes sest fait dune part
lors des sacrifices J10 et J21 et, dautre part, pour les daphnies seulement, chez de jeunes
individus (ge < 24 h) introduits tout au long de lessai et exposs en gnral 24 h.
Pour les organismes exposs 10 et 21 jours il na pas t possible de doser le pyrne en raison
dun spectre diffrent de celui du pyrne, prsentant deux pics 381 et 401 nm contre 373 et
393 nm pour le pyrne pur (figure 6.7). Il est cependant possible de montrer que la
fluorescence est en gnral plus leve dans les organismes exposs au sdiment craie.
Pour les jeunes daphnies introduites diffrents moments de lessai et exposes sur une dure
courte, les spectres obtenus sur les extraits sont exploitables puisque trs proches de celui du
pyrne. L aussi, les daphnies exposes dans les microcosmes sdiment craie prsentent
les teneurs les plus leves (figure 6.8). Ces teneurs diminuent significativement partir de
J10 pour tre proches de 0 partir de J16 (mme figure) ; pour la tourbe, le pyrne nest plus
dtectable ds J10 chez les daphnies exposes au sdiment tourbe . A noter que, pour la
craie, on trouve, comme dans lessai mono (cf 6.3.2 et figure 8), des valeurs le plus souvent
comprises entre 1000 et 2000 g/g sec.

Figure 6.7. Spectres dmission du pyrne extrait des larves de chironomes des microcosmes exposes 10 jours
aux sdiments au cours de lessai en microcosmes n 1 (C1 : tmoins craie ; C2 : sdiments craie
contamins 50 mg/kg de poids frais) : examen de la variabilit intra-microcosme

6.4.3.2. Essai pluri2
Les mesures ont concern uniquement les organismes introduits J0 dans les microcosmes et
leur descendance pour les daphnies.
Les mesures ont port sur les jeunes daphnies produites J8 (19/07), J11, J15, J19, et J24. Ces
daphnies ont t rcupres dans un dlai de 24 72 h aprs leur naissance. Les spectres des

0
50
100
150
200
250
300
350
400
350 400 450
longueur d'onde, nm
f
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
e

r
e
l
a
t
i
v
e
Tmoin C1.9 (1 Chiro)
Tmoin C1.9 (1 Chiro)
Essai C2.10 (1 chiro)
Essai C2.10 (1 chiro) essai 2
Essai C2.10 (1 chiro) essai 3
95
- 95 -

extraits sont tous diffrents de celui du pyrne mais identiques ceux des mres (obtenus
J12 et J21). Ces spectres prsentent un 1
er
pic 379-380 nm et un 2
me
pic entre 395 et 400
nm, alors que celui du pyrne prsente des pics 373 et 383 nm. Par ailleurs, le ratio entre les
intensits des pics (fluo(380) / fluo(399)) est en moyenne de 1.168 +/- 0.091 (avec des valeurs
peu diffrentes entre mres et jeunes), contre 1.05 +/- 0.106 pour le pyrne pur, donc un peu
plus lev en moyenne. On a vu dans les essais prcdents que les jeunes daphnies ajoutes
aux systmes et exposes au maximum 72 h prsentaient des extraits contenant du pyrne non
modifi.

Figure 6.8. Evolution au cours du temps de la bioaccumulation du pyrne par des jeunes daphnies (ge < 24 ou
48 h) introduites dans les microcosmes de lessai pluri1 et exposes 24 h sauf J-3 (72 h) et de J0 J2 (48 h) +
bioaccumulation par jeunes daphnies du mme ge exposes dans eaux surnageantes 104 g/L

Les rsultats de lessai pluri2 peuvent suggrer une exposition des embryons dans la poche
incubatrice, la dure de formation des jeunes daphnies avant leur libration par la mre tant
denviron 104 heures (Sobral et al., 2001). Dans notre cas les jeunes daphnies sur lesquelles
portent les mesures pourraient avoir t exposes 104 + 24 104 + 72 h, soit 128 176 h, soit
5 7 jours environ. Mais cette exposition serait essentiellement une exposition au pyrne
modifi (biotransform ?) transmis par la mre in utero, comme le suggrent les spectres
dmission de fluorescence, moins que la dure dexposition ne soit suffisante, mme chez
les jeunes daphnies, pour oprer une action de (bio ?)transformation du pyrne.
La prsence de pyrne chez les daphnies mres J12 est dtectable des concentrations
apparemment leves (figure 6.9), mais il ne sagit pas de pyrne pur, comme dans lessai
pluri1. Le spectre dmission dtect prsente des pics 379-380 et 395-397 nm, contre 373
et 393 nm pour le pyrne pur. En faisant lapproximation que les spectres dtects dans les
extraits de daphnies sont dus essentiellement au pyrne, on trouve des teneurs moyennes de
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
J-6 J-5 J-3
J0
J0 J0
J2
J10 J16 J21 104
g/L
g
/
g

s
e
c

d
a
p
h
Craie
Tourbe
96
- 96 -

27 +/- 9 g/g sec dans les daphnies des microcosmes tourbe contre 1051 +/- 137 g/g
sec dans celles des microcosmes craie .

Figure 6.9. Spectres dmission de fluorescence des extraits mthanoliques de daphnies mres exposes 12 jours
au cours de lessai en microcosmes n2 (sdiments craie contamins 50 mg/kg) versus spectre du pyrne 1
ppm dans du MeOH

Si lon compare ces rsultats avec ceux obtenus lors de lessai pluri1 on peut dire que les
daphnies mres des microcosmes craie ont beaucoup plus accumul en 12 jours lors de
lessai pluri2 que lors de lessai pluri1 en 10 jours (o les spectres taient peine marqus), et
que la bioaccumulation lors de lessai pluri2 par des daphnies exposes 12 jours est denviron
2 fois celle observe sur de jeunes daphnies exposes 24 h lors de lessai pluri1, sans toutefois
dpasser les doses maximales de 1500 2000 g/g sec constates lors dune exposition de
jeunes daphnies des solutions de pyrne proches de la saturation.
Comme pour les daphnies, les amphipodes J12 prsentent des spectres peu marqus dans les
microcosmes tourbe et au contraire trs nets dans les microcosmes craie mais avec un
spectre encore plus dcal que pour les daphnies (maxima 380-381 et 399-400 nm) et avec
un ratio entre les 2 pics plus lev. Si, comme pour les daphnies, on fait un calcul
approximatif, on trouve une dose moyenne de 1841 +/- 775 g/g sec pour les amphipodes des
microcosmes craie , du mme ordre de grandeur que pour les daphnies.
Les larves de chironomes exposes 12 jours prsentent des spectres galement diffrents de
celui du pyrne (pics 381 et 401 nm), mais ils sont nets pour la tourbe et pour la craie. Les
doses calcules de faon approximative sont de 13.5 +/- 4.8 pour les microcosmes tourbe
et 393 +/- 230 g/g sec pour les microcosmes craie .
0
50
100
150
200
250
300
350 375 400 425 450 475
longueur d'onde, nm
f
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
e

r
e
l
a
t
i
v
e
C2
C2
pyrne 1 ppm
C1
97
- 97 -

A J21 les spectres des organismes sont galement diffrents de celui du pyrne pur : pics
380 et 396-399 nm pour les daphnies mres, 381 et 400 nm pour les amphipodes, et 381
et 401-402 nm pour les chironomes mergs.

6.4.4. Effets sur le compartiment bactrien (sdiment)
Les rsultats obtenus lors de lessai monospcifique sur sdiment craie ont montr des
niveaux dactivit leucine-aminopeptidase trs suprieurs ceux qui ont t observs pour
lactivit -D-Glucosidase, ce qui nous a conduit conserver ce paramtre de suivi dans le
cadre des essais plurispcifiques, ceci afin de disposer dune chelle de valeurs susceptibles
de mettre en vidence les effets des traitements appliqus sur ce paramtre. Le suivi des
systmes plurispcifiques na pas mis en vidence deffets de la contamination sur les
activits exoenzymatiques du compartiment bactrien des sdiments. La densit bactrienne
des sdiments nest par non plus significativement affecte par la prsence de pyrne.
Globalement les niveaux dactivit enzymatiques leucine-aminopeptidase et -D-Glucosidase
ainsi que les densits bactriennes mesures lors des trois bioessais sont faibles : certaines
tudes ont montr des niveaux dactivits correspondants suprieurs 80 mol/h/gramme de
sdiment sec, dans des sdiments naturels frachement prlevs et dops 300 mg/kg dun
mlange de fluoranthne, de phnanthrne et de benzo(k)fluoranthne ou non dops
(Verrhiest et al., 2001). Des densits bactriennes mesures en parallle montrent des valeurs
suprieures celles obtenues dans cette tude (> 10
9
bactries/g de sdiment frais). Le
traitement appliqu aux sdiments aprs prlvement ainsi que leur stockage pendant une
dure relativement longue (5 8 mois) basse temprature et lobscurit ont probablement
affect la rponse des communauts bactriennes autochtones. De plus les conditions
exprimentales mise en place dans les systmes diffrent considrablement des conditions
environnementales des sdiments in situ.
6.4.5. Influence dune inoculation du sdiment par Mycobacterium 6PY1
Le suivi de Mycobacterium 6PY1 montre que cette souche bactrienne est capable de se
dvelopper dans les systmes mis en place avec un prfrence marque pour le sdiment
tourbe, comme le montrent les talements sur couche de pyrne ainsi que la densit
bactrienne observe 28 jours dans le traitement MT2. Au cours du deuxime essai en
microcosmes plurispcifique ralis, linoculation de Mycobacterium 6PY1 dans le sdiment
craie contamin entrane une diminution des effets de la contamination sur la survie des
amphipodes (figure 6.10 et tableau 6.4) ainsi que sur le niveau de reproduction des daphnies
(figure 6.11 et tableau 6.4). Ce type deffet nest pas constat au niveau du sdiment tourbe
98
- 98 -

contamin malgr une prsence plus forte de Mycobacterium dans ce sdiment au bout
de 28 jours.

Figure 6.10. Taux de survie des amphipodes 10, 21 et 28 jours au cours des essais pluri1 et pluri2 (moyenne
sur 3 rplicats cart type ; * effet significatif, p<0,05 ; C1 : sdiment tmoin craie ; C2 : sdiment craie dop
50 g/g ; MC2 : sdiment craie dop 50 g/g avec inoculation de Mycobacterium ; T1 : sdiment tourbe
tmoin ; T2 : sdiment tourbe dope 50 g/g ; MT2 : sdiment tourbe dop 50 g/g avec inoculation de
Mycobacterium)

Figure 6.11. Reproduction des daphnies au cours du 2
me
essai en microcosmes plurispcifiques (essai pluri2)
(C1 : sdiment tmoin craie ; C2 : sdiment craie dop 50 g/g ; MC2 : sdiment craie dop 50 g/g avec
inoculation de Mycobacterium ; T1 : sdiment tourbe tmoin ; T2 : sdiment tourbe dope 50 g/g ; MT2 :
sdiment tourbe dop 50 g/g avec inoculation de Mycobacterium)

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T1
T2
MT2
99
- 99 -

6.5. Discussion gnrale et conclusions

Partition du pyrne
La partition du pyrne a pu tre tudie dans le test sur Hyalella azteca 14 jours de la 1
re

phase (cf 4.1.3.2), mais aussi lors dun essai en microcosmes sans addition dorganismes
(essai contrle), des problmes analytiques stant poss pour les eaux interstitielles des essais
pluri1 et pluri2. Les rsultats permettent de calculer des Koc apparents qui sont proches pour
les deux sdiments des valeurs les plus leves de la littrature. Le fait de trouver des Koc
indpendants du sdiment, craie ou tourbe, est en accord avec la thorie du partage
lquilibre (Di Toro et al., 1991) qui explique la partition du pyrne entre la phase particulaire
du sdiment et leau interstitielle par la teneur en carbone organique du sdiment.
Le caractre fortement hydrophobe du pyrne entrane cependant des biais dans la mise en
uvre des essais et linterprtation des rsultats. Le dopage du sdiment selon un protocole
couramment pratiqu dans la littrature et par certains participants ce programme dans des
tudes antrieures ne semble pas adapt tous les sdiments, le rendement de dopage mais
aussi luniformit de la contamination lintrieur dun mme lot de sdiment pouvant varier
en fonction des caractristiques du sdiment. Cela ncessite des contrles analytiques pour
vrifier la teneur nominale et lhomognit de la contamination ainsi que des dopages
additionnels pour atteindre la concentration souhaite. Le second problme est li la
propension du pyrne sadsorber sur les parois des flacons au cours des essais, ce qui peut
entraner, dans leau surnageante, une minimisation de lexposition des organismes ; ce
phnomne est trs probable, mme pour des flacons en verre, car nous avons pu le vrifier
lors du stockage des eaux avant analyse, avec limpossibilit de rcuprer le pyrne en totalit
mme par un solvant puissant. Enfin, bien quil ne sagisse pas rellement dun biais, il
semble que les liaisons entre pyrne et particules du sdiment se renforcent au cours du temps
au point que le pyrne devienne de moins en moins extractable et par consquent de moins en
moins biodisponible pour les organismes du sdiment (cf 6.4.1). Ceci semble correspondre
un phnomne naturel soulign par plusieurs auteurs, mais la question se pose, lorsquon
travaille sur de telles molcules, de savoir si lon doit travailler sur un sdiment frachement
contamin ou au contraire dans lequel on a laiss se renforcer les liaisons entre contaminant et
particules pour tre plus proche des conditions rencontres dans lenvironnement.

100
- 100 -

Comparaison des rponses des organismes dans les diffrents essais
Pour le cladocre Daphnia magna, les rsultats concernant la survie dans les diffrents essais,
monospcifiques et plurispcifiques, prsentent une bonne cohrence (tableau 6.5). Le
pyrne dissous entrane les premiers effets sur la survie, sous lumire classique de laboratoire
(2000-2500 lux, soit lclairement adopt dans les essais en microcosmes) et aprs 48 h, vers
10 g/L, avec une CE50-48 h de 28 70 g/L. Dans lessai monospcifique en prsence du
sdiment craie et sous clairage de 2000 lux, on note 50% de mortalit chez de jeunes
daphnies introduites dans les eaux surnageantes et exposes 48 h au-dessus du sdiment
contamin 100 mg/kg, ce qui correspond une teneur mesure de leau surnageante de 70
g/L. Dans ces conditions, on a pu montrer que les doses mesures dans les daphnies vont de
1500 2000 g/g sec. Dans lessai plurispcifique pluri1, on ne note aucune mortalit dans
les microcosmes contenant du sdiment tourbe contamin 50 mg/kg. La teneur dans
leau surnageante na pas pu tre mesure pour les raisons indiques ci-dessus, mais des
mesures de doses accumules par de jeunes daphnies montrent que ces doses sont infrieures
250 g/g sec partir de J0 pour devenir ngligeables par la suite. Lors de lessai pluri2 on
note cette fois une survie moins bonne dans les microcosmes tourbe en prsence de
pyrne ; labsence de mesures des teneurs en pyrne de leau et des daphnies (il y a
accumulation mais le pyrne a t biotransform) ne permet pas dexpliquer cette plus grande
sensibilit, qui est peut-tre rapprocher de teneurs mesures du sdiment de lessai pluri2
suprieures celles de lessai pluri1.

Tableau 6.5. Relations entre effets du pyrne sur la survie de Daphnia magna, teneurs en pyrne dans leau
et/ou dans les daphnies, pour les diffrents essais mens (ND : mesure non dtermine)

Effets observs Doses daphnies correspondantes
Essai monospcifique "eau" 1er effets 10 g/L
50% d'effet entre 28 et 70 g/L
ND

Essai monospcifique "craie" 50% d'effet 70 g/L 1500-2000 g/g sur 15 jours

Essai pluri1 "craie" effets ds J3, teneurs inconnues 500-1400 g/g sur 10 jours

Essai pluri2 "craie" effets ds J5, teneurs inconnues ND

Essai pluri1 "tourbe" pas d'effets < 250 g/g puis ngligeables ds J2

Essai pluri2 "tourbe" effets ds J8, teneurs inconnues ND

101
- 101 -

Pour les microcosmes craie , les effets sur la survie de D. magna observs ds J3 pour
lessai pluri1 et partir de J5 pour lessai pluri2 sont rapprocher des doses de pyrne
mesures dans de jeunes daphnies introduites au cours de lessai pluri1. Ces doses sont
comprises entre 500 et 1400 g/g entre J0 et J10, valeurs susceptibles dentraner des effets au
vu des rsultats de lessai monospcifique rappels ci-dessus, et deviennent ngligeables au-
del de 10 jours, ce qui pourrait expliquer que la survie samliore considrablement aprs
rintroduction de daphnies J13 (essai pluri1). Les effets observs sur la survie ne se
traduisent pas ncessairement par des effets sur la reproduction (en raisonnant sur la base du
nombre de jeunes par mre) ; cest le cas des microcosmes craie de lessai pluri1 et des
microcosmes tourbe de lessai pluri2.
Lalgue microscopique Pseudokirchneriella subcapitata, pour laquelle la CE50-72 h est
infrieure 10 g/L, sest montre trs sensible au pyrne. Limpossibilit de suivre la densit
algale dans les essais plurispcifiques du fait de teneurs en chlorophylle insuffisantes et dun
dpt des algues sur le sdiment et les parois, na pas permis de vrifier cette sensibilit au
cours de ces essais.
La lentille deau Lemna minor, pourtant organisme chlorophyllien comme
Pseudokirchneriella subcapitata, nest pas sensible au pyrne, nos rsultats tant corrobors
par la littrature. Cette absence de sensibilit a pu tre vrifie au cours des diffrents essais
mens.
Pour les organismes exposs aux sdiments dops en pyrne, amphipodes et chironomes, il
est possible de comparer les rsultats de survie et de croissance des essais monospcifiques et
plurispcifiques (tableau 6.6). Sur la gamme 2-20-50-200 mg/kg le pyrne na pas eu deffet
sur la survie et la croissance (10 ou 12 jours) de C. riparius sur lensemble des essais mis en
uvre. Les seuls effets observs concernent la survie et lmergence partir de 20 jours dans
lessai pluri1. Les teneurs en pyrne des eaux interstitielles estimes partir dun autre essai
(essais pluri) pourraient expliquer ces effets, car elles sont leves. Le pyrne dans le
sdiment tourbe na deffet sur la survie et la croissance de lamphipode Hyalella azteca
qu partir de 200 mg/kg poids frais (soit 1000 g/g en poids sec). Il est vrai que les teneurs
en sdiment mesures dans les essais plurispcifiques taient particulirement faibles au
regard de la dose nominale de 50 mg/kg poids frais, ce qui ne permet pas de prciser ce qui se
passe entre 63 et 1000 g/g poids sec. Dans le sdiment craie les effets sur la survie et la
croissance de H. azteca sexercent ds 20 g/g poids frais (nominal), soit ds 21 mg/kg sec
(mesur), et les rsultats de lessai monospcifique et des essais plurispcifiques sont peu
prs concordants sur ce point.
102
- 102 -

Tableau 6.6. Rsultats de survie et de croissance des amphipodes et chironomes au cours des diffrents
essais en sdiments, avec teneurs nominales et mesures des sdiments, et teneurs mesures ou estimes (par la
thorie du partage lquilibre) des eaux interstitielles (
(1)
J0 et J14,
(2)
J0-J10-J21-J29,
(3)
teneurs estimes
partir de lessai contrle,
(4)
J0-J12, caractres gras : rsultats significativement diffrents des tmoins)

Teneur sdiment (mg/kg frais) 0 2 20 50 200
Craie
Teneur sd mesure (mg/kg sec) essai mono 7.8-1.4
(1)
20.9-24.4
(1)
173-283
(1)
Teneur sd mesure (mg/kg sec) essai pluri1 34-15-3-1
(2)

Teneur sd mesure (mg/kg sec) essai pluri2 2.4-11.6
(4)

teneur eau interst. mesure essai mono 0.5-2 3.4-16.6 2.7-19.0
teneur eau interst. estime essai pluri1 et 2 62.4-68.7-46.7
(3)

C. riparius
survie (% )essai mono 10 j 98 +/- 5 95 +/- 7 96 +/- 7 100 +/- 0
survie (%) essai pluri1 10 j 76 +/- 14 25 +/- 37
survie (%) essai pluri2 12 j 74.7 +/- 4.6 80 +/- 6.9
poids sec (mg/larve) essai mono 10 j 1.15 +/- 0.08 1.42 +/- 0.14 1.41 +/- 0.07 1.45 +/- 0.19
poids sec (mg/larve) essai pluri1 10 j
poids sec (mg/larve) essai pluri2 12 j 0.54 +/- 0.1 0.84 +/- 0.4

H. azteca
survie (% )essai mono 14 j 87 +/- 6 87 +/- 15 57 +/- 6 37 +/- 6
survie (%) essai pluri1 10 j 76.7 +/ 12 6.7 +/- 5.8
poids sec (g/ind.) essai mono 10 j 103 +/- 1.26 95.6 +/- 18.9 57.5 +/- 22.4 65 +/- 7.1
poids sec (g/ind.) essai pluri1 10 j 65 +/- 8.3 632 +/- 91
poids sec (g/ind.) essai pluri1 21 j 368 +/- 33.5 139 +/- 104
poids sec (g/ind.) essai pluri2 12 j 109 +/- 29 42 +/- 22

Tourbe
(1)
66.7-62.5
(1)
9.1-0.3-7.5-13.1
(2)
1125-938
(1)
(4)

teneur eau interst. mesure essai mono 0.3-0.5 1.6-3.9 3.3-7.3
teneur eau interst. estime essai pluri1 et 2 6.8-10-5.92
(3)

C. riparius
survie (% )essai mono 10 j 90 +/- 11.5 82.5 +/- 23.6 97.5 +/- 5 93.3 +/- 11.5
poids sec (mg/larve) essai mono 10 j 1.09 +/- 0.13 1.05 +/- 0.15 1.22 +/- 0.23 1.30 +/- 0.01
poids sec (mg/larve) essai pluri1 10 j
poids sec (mg/larve) essai pluri2 12 j 0.26 +/- 0.02 0.30 +/- 0.06

H. azteca
survie (% )essai mono 14 j 83 +/- 5.6 83 +/- 11.6 76.7 +/- 5.6 50 +/- 26.5
poids sec (g/ind.) essai mono 10 j 199 +/- 12 188 +/- 85 166 +/- 77 99 +/- 61

103
- 103 -

* Relation entre bioaccumulation du pyrne et survie des organismes
Pour Daphnia magna, il a t possible, loccasion de lessai monospcifique en petits
bchers sur sdiment craie dop ( essai mono ), de montrer qu une dose de 0.7 mol/g de
poids frais (soit 140 g/g frais quivalant environ 1400 g/g sec) correspond un effet de
50% sur la survie sur 48 h de jeunes daphnies. Dans les microcosmes de lessai pluri1 on a
mesur sur de jeunes daphnies ajoutes des doses de pyrne pur (non significativement
transform) allant de 2400 g/g sec au dbut de lessai 500 g/g sec 16 jours aprs. Mme
aux plus fortes doses accumules (1700 et 2400 g/g sec) aucun effet sur la survie na t
constat, probablement d une exposition de seulement 24 h.
Pour tous les organismes des microcosmes exposs plus de 5 jours, il na pas t possible de
doser le pyrne accumul en raison de phnomnes de (bio)transformation qui se traduisent
par un spectre diffrent (dcalage des deux pics vers les longueurs donde croissantes et
augmentation du ratio entre pics). Sil sagit bien de biotransformation, tous les organismes
du microcosme, daphnies, chironomes et amphipodes, sont capables dune telle activit sur le
pyrne. C. riparius est effectivement connu pour dvelopper une importante activit de
biotransformation du pyrne (Guerrero et al., 2002), et les rsultats de Gourlay et al. (2002)
montrent que Daphnia magna, si elle a peu deffet sur le fluoranthne, serait capable de
biotransformer le benzo(a)pyrne. Cette quipe a galement travaill sur le pyrne et montr,
comme dans notre tude, un spectre diffrent du pyrne bioaccumul. Elle a galement mis en
vidence, comme dans le cas du benzo(a)pyrne, une forte fluorescence de la phase rcupre
dans leau et une moindre fluorescence de la phase dichloromthane, ce qui tend prouver
que le produit driv du pyrne est plus polaire, donc bien le rsultat dune transformation
biologique.
Compte tenu de ce phnomne de (bio)transformation il nest pas possible de quantifier les
doses des composs (pyrne + mtabolites) qui fluorescent, mais, en raisonnant sur la
fluorescence maximale (pic vers 400 nm) ramene au poids des organismes et en comparant
avec les tmoins, il est possible dapprcier si les doses sont faibles, modres ou leves
(tableau 6.7). Dune faon gnrale, les doses diminuent dans le temps, et plus vite dans les
microcosmes tourbe que dans les microcosmes craie. Les donns analytiques manquent, mais
il est vraisemblable que, dune part le pyrne en phase dissoute a tendance diminuer dans le
temps et, dautre part, des phnomnes de squestration le rendent de moins en moins
biodisponible donc bioaccumulable. Les caractristiques du sdiment tourbe (COT lev)
exacerbent ces phnomnes fortement lis la matire organique. Cest dailleurs la raison
104
- 104 -

pour laquelle la bioaccumulation est systmatiquement plus leve dans les microcosmes
craie.

Tableau 6.7. Synthse des rsultats de bioaccumulation et de survie des organismes exposs au pyrne dans les
deux essais plurispcifiques

Essai pluri1 Essai pluri2
de J-6 J0 pour la tourbe et de J-6 J10 pour la craie : de J8 J21 pour la craie et la tourbe :
bioaccumulation leve du pyrne par les jeunes daphnies bioaccumulation significative mais modre du pyrne
ajoutes et exposes 1 3 jours, sans biotransformation par jeunes daphnies nes dans les systmes
bioaccumulation plus leve dans la craie et exposes 24 72 h aprs naissance
effet sur la survie des daphnies dans la craie ds J3

pyrne biotransform; effet significatif sur la survie
pour les deux types de sdiment
A J10 chez organismes exposs 10 jours : A J12 chez organismes exposs 12 jours :
* daphnies mres : doses faibles dtectes dans la craie * daphnies mres : doses leves dans craie, non
pyrne biotransform, survie < 20% J10 significatives dans tourbe
rien de significatif dans tourbe, survie de 60 90% pyrne biotransform

survie de 80% dans craie (>95% dans craie tmoin)
de 70% dans tourbe (85% dans tourbe tmoin)
* amphipodes : doses leves dans la craie, pyrne
biotransform
* amphipodes : doses leves dans la craie, pyr.
biotransform
survie 10% dans la craie survie 20 30% dans la craie, 72 92% dans tourbe
* chironomes : pyrne biotransform dtect dans la craie
et la tourbe
* chironomes : pyrne biotransform dtect dans la
craie et la tourbe
mais doses assez faibles, quoique plus fortes dans la craie

doses moyennes fortes dans la craie, faibles dans
tourbe
survie 68% 76%

survie 4% dans microcosme craie o la bioacc est plus
leve, 52 96% ailleurs
A J21 chez organismes exposs 21 jours : A J21 chez organismes exposs 21 jours :
* daphnies mres : pyrne non dtect

* daphnies mres : pyrne biotransf. dtect dans la
craie
survie 50 100% survie de 50% dans microcosme craie o bioacc. leve
100% ailleurs
* amphipodes : pyrne non dtect * amphipodes : pyrne biotransf. dtect dans la craie
survie 20% dans craie et 0 100% dans tourbe survie 20 40% dans la craie, 80 100% dans la tourbe
* chironomes : pyrne biotransform dtect dans la craie

* chironomes : pyrne biotransform dtect dans la
craie et la tourbe
mais doses assez faibles mais doses assez faibles, plus fortes dans tourbe
survie 36-40% survie 48 76%

105
- 105 -

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109
- 109 -

ANNEXE 1

OH
OH
H
H
OH
OH
OH
OH
OH
OH
H
H
1
O COOH
OH
OH
COOH
COOH
CHO
COOH
COOH
OH
OH
COOH
COOH
1
O
COOH
OH
COOH
OH
OH
C
O
O
H
H
OH
CHO
10
2
3
4
5
6
1
3,4-Dihydroxyphenanthrene
Phenanthrene
Phenanthrene cis-3,4-dihydrodiol
o-Phthalic acid
2-Carboxybenzaldehyde
1-Hydroxy-2-naphthoic acid
1-Hydroxy-2-naphthaldehyde
COOH
COOH
O
trans-2'-Carboxybenzalpyruvic acid
15 phdK
14 phdJ
13 phdI
12 phdH
11 phdG
9
phdF
8 phdE
7 phdABCD
Pyrene cis-4,5-dihydrodiol
4,5-Phenanthrenedioic acid
4,5-Dihydroxypyrene
Pyrene
4-Phenanthroic acid
Voie catabolique de dgradation du pyrne par les bactries du genre Mycobacterium
Les tapes 1-6 sont spcifiques de la dgradation du pyrne, les tapes 9-15 sont communes la dgradation
du phnanthrne et du pyrne, et conduisent la formaton de o-phtalate. Les gnes codant les enzymes
connues de la vois de degradation sont indiqus en italique. Selon Kanaly et Harayama (2000), Krivobok et
al. (2003).
110
- 110 -

ANNEXE 3

FACTEURS ABIOTIQUES: MATERIELS ET METHODES

Spciation du pyrne
La kaolinite ([Al
4
Si
4
O
10
(OH)
8
], kaolin blanc en poudre, Merck) est pralablement lave par cinq
rinages dans de leau UHQ (Elga Maxima), centrifuge 15 mn 3000 tr.min
-1
et sche. Cette procdure permet
dliminer les sels solubles (0,025% de Ca - 0,025% Cl - 0,1% SO
4
). Largile lave est rendue homo-ionique par
mise en suspension dans une solution aqueuse 10
-2
M de NaNO
3
dont le pH est ajust 6,5 par ajout dHNO
3

durant 1 heure. Cette opration permet llimination des cations divalents, qui pourraient dune part favoriser
ladsorption des AH sur le solide par complexation de surface, dautre par modifier la conformation des AH et
diminuer leur capacit de liaison avec le pyrne. La siccit est dtermine pour chaque essai par centrifugation
3000 tr.min
-1
durant 15 mn et schage ltuve 100C du culot de centrifugation (12 h) aprs pese. La masse
en eau reprsente environ 50% du total. Le culot de centrifugation de la suspension homo-ionique, pte de
kaolinite hydrate, est conserv 4C en flacon verre hermtiquement bouch. La distribution granulomtrique
de la solution collodale de kaolinite pH 6,5 et force ionique 10
-2
M est comprise entre 0,1 m et 70 m, avec
un maximum 8,2 m. Les particules de dimension infrieures 3,9 m reprsentent 30,1% du solide en
suspension.
Lacide humique est commercialis sous forme du sel de sodium, (lot n 61852-095, rfrence 1,675-2,
Aldrich). Un gramme de produit commercial est dissous dans environ 250 mL de solution concentre de NaOH
pH 11 durant 24 h. La solution est centrifuge 3000 tr.min
-1
durant 15 mn puis filtre 0,45 m pour
liminer les impurets insolubles en milieu basique. Les acides humiques dissous dans le filtrat sont prcipits
pH 1 en milieu HF durant 12 h (permettant la dissolution des silicates). Le prcipit rcupr aprs
centrifugation (3000 tr.min
-1
durant 15 min) est lav trois fois par 300 mL deau UHQ. Chaque lavage est suivi
dune centrifugation. Lacide humique obtenu est sch 45C durant 6 h puis conserv en flacon ferm.
Le pyrne est un HAP quatre noyaux, de masse molculaire 202 g.mole
-1
et de solubilit dans leau
162 g.L
-1
. Le produit utilis est disponible sous la rfrence 177 auprs du bureau de rfrence BCR de la
Commission de la Communaut Europenne, est utilis sans purification pralable. Une solution mre
mthanolique 125 mg.L
-1
est conserve en flacon ambr 4C.

Adsorption du pyrne sur la kaolinite
Quatorze essais correspondant des masses de kaolinite dshydrate variant de 200 2500 mg ont t raliss.
La masse adquate de pte de kaolinite hydrate est mise en suspension dans 25 mL dune solution aqueuse de
NaNO
3
10
-2
M pH 6,5 contenant 25 g.L
-1
de pyrne durant 24 h. La suspension est agite mcaniquement 2
mn toutes les 6 h puis centrifuge durant 15 mn 3000 tr.min
-1
. Le pyrne soluble dans la phase aqueuse
surnageante est extrait par 5 mL de cyclohexane sous agitation va-et-vient 100 coups.min
-1
durant 20 mn. La
phase organique rcupre est soumise un courant dazote pour vaporation du cyclohexane. Le rsidu sec est
dissous dans lactonitrile et analys par chromatographie liquide haute pression (HPLC) dtection de
fluorescence (chane Merck Hitachi L6200-A F-1080). Les conditions chromatographiques sont les suivantes :
colonne Merck Lichrospher 250-4, luant actonitrile HPLC Baker, dbit 1 mL.min
-1
, temprature 20C,
dtection de fluorescence
ex
=333 nm
obs
=382 nm.

Adsorption de lacide humique sur la kaolinite
Onze essais ont t raliss avec des masses de kaolinite dshydrate variant de 200 2500 mg. La masse de
pte de kaolinite hydrate est mise en suspension durant 24 h dans 25 mL dune solution aqueuse de NaNO
3
10
-2

M pH 6,5 contenant 50 mg.L
-1
dacide humique (soit 16,2 mg-C.L
-1
). La suspension est agite mcaniquement
2 mn toutes les 6 h puis centrifuge durant 15 mn 3000 tr.min
-1
. La phase aqueuse surnageante est alors
analyse par chromatographie dexclusion strique haute pression (CESHP) et quantification du COD.
Le poids molculaire des composs humiques a t dtermin par CESHP. Linstrumentation est constitue de la
chane chromatographique Merck-Hitachi dcrite en 2.2 et dune colonne et pr-colonne TSK G3000SW. Le
systme CESHP a t calibr selon la mthode dtalonnage dcrite par PEURAVUORI et PIHLAJA (1997). La
phase mobile est constitue dune solution de nitrate de sodium 10
-2
M pH 6,5, dont le dbit est fix
0,8 mL.min
-1
. La dtection UV est fixe 280 nm, la dtection de fluorescence est obtenue avec
ex
330 nm et
obs
440 nm. Le poids molculaire moyen en nombre est calcul selon ltalonnage logM
n
=5,34 2,85 K
AV
(R
2

0,97).
Le contenu en Carbone Organique Dissous des chantillons a t dtermin au moyen dun appareillage ralis
au laboratoire. Ce dispositif permet loxydation de la matire carbone par voie humide au moyen de
111
- 111 -

peroxydisulfate de potassium sous irradiation UV et la quantification du CO
2
form par conductimtrie
aprs redissolution et raction avec une solution titre dhydroxyde de sodium. La prcision de la mesure est de
0,1 mg C.L
-1
sur ltendue de travail (0,1 20 mg C.L
-1
).

Interaction du pyrne avec lacide humique
Les expriences de complexation du pyrne par lacide humique Aldrich ont t conduites en triplicats en flacon
en verre ambr de 60 mL, ferm par un joint PTFE. Un volume de 106L dune solution de pyrne dans le
dichloromthane 583 g.L
-1
est vapor sous lger courant dazote. Un volume de 3 mL de solution aqueuse
dacide humique (de concentration comprise entre 5 et 50 mg.L
-1
) pH 6,5 et force ionique 10
-2
M (NaNO
3
) est
ajout pour la dissolution du pyrne. Lhomognisation est favorise dans un bain ultrasons (40 kHz) durant 1
minute. Aprs 24 h de mise lquilibre, un dgazage permettant llimination de loxygne dissous (quencher
de fluorescence du pyrne) est ralis sous vide de 40 mbars pendant 3 mn. La concentration doxygne dissous
est alors infrieure 1 mg.L
-1
.
Lchantillon est regaz lazote (P
N2
1050 mbars). La mesure dextinction de fluorescence du pyrne li aux
acides humiques est ralise au moyen dun spectrofluorimtre conu au laboratoire et dcrit prcdemment
(DEVOS et al, 2000). La solution est transfre dans une cuve de quartz Suprasil miroite face arrire (semi-
micro 114 FR-QS Hellma) puis mise sous vide de 40 mbars. Les mesures de fluorescence sont ralises aprs 1
minute une longueur donde dexcitation de 313 nm (bande passante de 4 nm) et une longueur donde
dmission de 383,6 nm (bande passante de 0,5 nm). Afin de minimiser les ractions photochimiques,
lobturateur nest ouvert que pendant la mesure (1 seconde de stabilisation de la valeur du photomultiplicateur,
suivie de 8 millisecondes dacquisition du signal correspondant 50 valeurs moyennes). Les effets de filtre
interne, absorption du rayonnement dexcitation et/ou du rayonnement de fluorescence par la solution, sont
corrigs selon la mthode dcrite par PARKER (1968). Labsorbance UV a t mesure avec un
spectrophotomtre barrette de diodes Hewlett-Packard 8453 en cuve quartz Suprasil (1 cm de trajet optique).

Photo-oxydation du pyrne

Tecniques analytiques

- Le suivi analytique du pyrne et des photoproduits forms a t ralis par HPLC Waters 600E

avec un
dtecteur barette de diodes PAD 996, un luant compos dun mlange MeOH/H
2
O, avec une sparation sur
colonne C18 de 5m et de 25 cm 4,6 mm.
- La dtermination des photoproduits est ralise et GC/MS Agilent 6890 avec dtecteur 5973 MSD, quip
dune colonne HP5 de 30m0,32mm0,25m, avec une programmation de temprature de 100 220C
10C/min. La temprature de linjecteur est de 250C, les chantillons sont injects en mode splitless. Le
volume inject est de 4 L et le dbit en He de 2 mL/min.

Prparation des chantillons de pyrne sur supports solides

Les supports solides contamins la concentration de 20 ppm en pyrne (Fluka 99%) sont prpars en
mouillant le support solide avec une solution de pyrne dissous dans du cyclohexane suivi dune vaporation
du solvant au rotavapor (sans vide). Pour la contamination la concentration de 10 000 ppm de Pyrne, 10
mg de pyrne sont broys dans un mortier en prsence 1 g de support (SiO
2
(99,5%, 60-220m, SDS),
CaCO3 (Prolabo) ou Montmorillonite KSF (Aldrich)) jusqu obtention dun mlange parfaitement
homogne.
En prsence dune colonne deau dsionise, l'adsorption se fait comme prcdemment, le support dop 1%
de pyrne est plac dans un bcher contenant 50 mL d'eau distille et recouvert dun film alimentaire de type
polyester, matriau n'absorbant pas la lumire solaire. Avant d'irradier les chantillons, ceux-ci sont placs
l'abri de la lumire pendant 2 h pour assurer lquilibre de distribution du pyrne entre la phase solide et
l'eau.

Traitement des supports solides aprs irradiation

Aprs irradiation des chantillons de Pyrne adsorb sur SiO
2
, CaCO
3
et Montmorillonite, dans lenceinte de
simulation Suntest, ceux-ci sont extraits l'actone (rendement moyen dextraction 93 8 %), puis analyss
par HPLC.
Pour extraire le pyrne adsorb sur les diffrents supports secs, nous introduisons 1 g dchantillon (pyrne
+support) dans un flacon hermtique avec 10 mL dactone. Lextraction seffectue au bac ultrasons Branson
112
- 112 -

1200 (47 kHz) pendant 10 mn. Aprs dcantation, nous prlevons quelques mL du surnageant, qui sera
centrifug pendant 5 mn. Les concentrations en pyrne extrait sont dtermines par GC. A titre dexemple, les
rendements dextraction du pyrne adsorb sur les diffrents supports sont donns dans le tableau ci-dessous.

Tableau : Pourcentage moyen de pyrne extrait des supports modles.

Solvant dextraction Rendement dextraction moyen
par g de support
Pyrne sur Silice Actone (90 8) %
Pyrne sur Silice mthanol (74 6) %
Pyrne sur Calcite actone (90 8) %
Pyrne sur Montmorillonite actone (100 10) %

Lintervalle dincertitude a t calcul en utilisant la loi de Student avec un intervalle de confiance de 95%,
un nombre danalyse de n= 4 et un t
%/2,&
= 2,7764.
En prsence d'eau distille, quelques mL d'eau sont prlevs aprs irradiation avec une seringue et filtrs
l'aide d'un filtre Whatman 0,45 m. Le filtrat est analys par HPLC. L'eau est spare du support aprs
dcantation. Le support est mis scher sous hotte puis il est extrait comme prcdemment.
113
- 113 -

ANNEXE 4

BIOESSAIS MONOSPECIFIQUES : MATERIELS ET METHODES

I/ Tests en phase aqueuse

I-1/ Prparation des solutions mres tester
La gamme de concentrations raliser pour les essais en phase liquide est la suivante (exprime en g/L de
pyrne) : 0-10-18-32-56-100 et 180. Pour cela, on utilise du pyrne ltat cristallin (ALDRICH, puret 98 %)
que lon dissout dans un co-solvant qui est ici lactone. Les solutions mres sont prpares partir dune
solution initiale 1g/L. Au final, les diffrentes solutions de pyrne tester ne doivent pas dpasser 0.02 % de
solvant (soit 0.02 mL pour 100 mL). Les solutions sont alors compltes au volume adquat par le milieu
ncessaire pour la ralisation de chaque test.

I-2/ Tests sur daphnies Daphnia magna

I-2-1/ Conditions dlevage de Daphnia magna
Llevage des daphnies se fait dans des rcipients en verre transparents dune contenance de 2 L. Le milieu
dlevage est du milieu M4 (Elendt et Bias, 1990). Les solutions mres sont stockes au rfrigrateur et
renouveles tous les deux mois. Le renouvellement du milieu dlevage seffectue par moiti une fois par
semaine. Il est conseill de ne pas dpasser 25 30 individus par litre, une trop grande densit de population
pouvant entraner une dgradation de llevage. Les daphnies sont nourries chaque jour avec un mlange
dalgues vertes, Pseudokirchneriella subcapitata et Chlorella vulgaris. Les cultures algales sont rgulirement
repiques sous hotte dans le but dviter la contamination des cultures. Les cultures trs vertes sont conserves
au rfrigrateur. Dans le but de limiter la densit de population dans les diffrents levages, les jeunes daphnies
sont limines tous les jours uvrs. Les jeunes sont soit limins, soit servent au renouvellement des levages
ou encore sont utiliss pour les essais dcotoxicit.

I-2-2/ Protocole du test
Les tests dimmobilisation 24h et 48h du microcrustac D. magna sont inspirs des normes NF ISO 6341 (1995)
et AFNOR (1983). Le milieu utilis pour la ralisation des solutions tester est un milieu reconstitu partir de
quatre solutions de calcium, sodium, magnsium et potassium, de duret 250 25 mg CaCO
3
/L. Ce milieu de
dilution est prpar la veille du test et agit une partie de la nuit pour saturer le milieu en oxygne. Avant son
utilisation, le milieu est ajust pH 7.8 0.2 et filtr 0.22 m pour liminer au maximum les particules sur
lesquelles le pyrne pourrait sadsorber. Le test se droule en tubes essai contenant 10 mL de solution tester
et 5 daphnies dge infrieur 24h. Quatre rplicats sont raliss pour chaque concentration. Diffrentes
conditions sont tudies : obscurit et lumire. Pour les tests en prsence de lumire, la photopriode retenue est
16h de jour et 8h de nuit. Il sagit dun clairage fluorescent de type coolwhite mettant environ 10% dUV
( 1500 lux on mesure une irradiance de 566 W/cm
2
dans le domaine 220-1150 nm avec 54 W/cm
2
dUV(220-
385 nm), Clment et al. 2000). Les critres de validit pour ce test sont une mortalit infrieure 10 % chez les
tmoins et une CE
50
du dichromate de potassium voisine de 1 mg/L quand un test sur ce toxique est ralis.

I-3/ Test sur amphipodes Hyalella azteca

I-3-1/ Conditions dlevage de Hyalella azteca
Llevage des hyalelles se fait dans des aquariums. Le milieu dlevage est du milieu M4, le mme que celui
utilis dans le test sur daphnie. Les organismes sont nourris avec du Tetramin deux fois par semaine. Le
renouvellement du milieu se fait une fois par semaine et par moiti. Trois levages ont t raliss: un aquarium
contenant les adultes, un aquarium contenant les jeunes utiliss lors des tests, le dernier servant au
renouvellement des populations. Les jeunes organismes devant avoir un ge compris entre 7 et 14 jours, les
jeunes de laquarium pour adultes sont rcuprs une fois par semaine, le mme jour, et isols dans laquarium
114
- 114 -

pour jeunes o ils vont se dvelopper pour atteindre lge dsir pour la ralisation des tests. Les jeunes et
les adultes sont tris de la mme manire que les daphnies.

Le test sur H. azteca en phase aqueuse reprend une procdure analogue celle du test daphnie. Les rcipients
utiliss sont des Erlenmeyers de 50 mL contenant 20 mL de solution tester et 5 organismes par rcipient. Trois
rplicats sont raliss pour chaque concentration.

I-4/ Test sur lentilles deau Lemna minor

I-4-1/ Conditions de culture de Lemna minor
L. minor est plus communment appele la petite lentille deau. Llevage des lentilles se fait dans des
Erlenmeyers de 250 mL col large sous une lumire avoisinant les 3500 lux. Les milieux de culture et de
dilution (utilis dans le test) sont les mmes. Ces milieux sont prpars partir dun concentr nutritif issu de
sept solutions mres (AFNOR, 1996).Le pH du concentr nutritif est ajust si ncessaire 3.8 0.3. Le
concentr nutritif est prpar juste avant son emploi. Le milieu de culture est lui constitu 10 % de ce concentr
nutritif et 90 % deau distille. Son pH est alors ajust 5.5 0.5 puis le milieu est strilis lautoclave (120C
et 1 bar pendant 20 mn).

Avant ralisation dun test dfinitif, il est ncessaire deffectuer un test prliminaire. Les concentrations ainsi
testes lors de ce premier test sont les suivantes : 0-18-56 et 180 g/L de pyrne. Le test se droule dans des
bchers de 400 mL contenant 200 mL de solution tester. Quatre rplicats sont raliss pour chaque
concentration. Chaque rcipient contient 6 colonies de deux frondes identiques. Le test se droule sous un
clairement continu de 3500 lux. La dure du test est de 6 jours. Le comptage du nombre de frondes a lieu tous
les jours la mme heure.

I-5/ Test sur microalgues Pseudokirchneriella subcapitata

I-5-1/ Conditions de culture de Pseudokirchneriella subcapitata
Lespce utilise lors de ce test est une algue verte planctonique deau douce, Pseudokirchneriella subcapitata.
Lobservation de cette algue au microscope optique lui donne la forme dun croissant. Llevage au laboratoire
se fait dans des Erlenmeyers de 500 mL contenant le mme volume de milieu de culture. Le milieu utilis pour la
culture des algues est du milieu ISO (1989).


La gamme de concentrations teste est la mme que pour les tests sur daphnies et hyalelles. Le milieu utilis
pour la ralisation des essais est du milieu OCDE (1993). Linoculum est prlev dans une culture en phase
exponentielle de croissance. Le test se droule dans des Erlenmeyers de 50 mL contenant 20 mL de solution
tester. La densit initiale est de 10000 cellules/mL. La dure du test est de trois jours. Diffrentes intensits
lumineuses sont testes sous clairement en continu. La mesure de la densit algale se fait tous les jours la
mme heure au moyen dun compteur Coulter (modle Z1, seuil de coupure : 3.6 m).

II/ Tests sur sdiments

II-1/ Protocole de dopage des sdiments

La gamme de concentrations de pyrne retenue pour le dopage des sdiments est 0-2-20 et 200 mg/kg poids
frais. Pour le test sur chironomes, deux types de sdiments sont prpars en vue dtudier linfluence du mode de
nutrition des organismes sur leffet du pyrne :
- le premier sdiment reoit une quantit dfinie de nourriture (Ttramin) en mme temps que son
dopage est ralis.
- dans le deuxime sdiment, il ny a pas dinjection de nourriture, lalimentation des organismes se
fera quotidiennement.
Pour le test sur amphipodes, seul le deuxime type de sdiment a t test (alimentation progressive en cours de
test).
Les solutions mres de pyrne sont prpares dans lactone. Les volumes ncessaires la contamination des
sdiments sont introduits dans des flacons en verre de 1L. Les flacons ouverts sont alors mis rouler sous une
hotte pour laisser lactone svaporer et ainsi laisser se dposer le pyrne sur les parois du flacon (Ditsworth et
115
- 115 -

Schults, 1990). Aprs avoir homognis les sdiments, les quantits de sdiments et, le cas chant, de
nourriture ncessaires au test sont incorpores dans les flacons. Une fois ferms, les flacons sont mis rouler 4h.
Pour la ralisation des tmoins, le volume dactone ajout est celui correspondant la concentration maximale
(200 g/g).

II-2/ Test sur amphipodes Hyalella azteca

Les paramtres suivis lors de cet essai sont la survie et la croissance des organismes. Une mesure de
bioaccumulation a galement t effectue sur une partie des organismes le dernier jour. Les jeunes hyalelles
utilises sont en majorit ges de 7 14 jours au dbut de lessai, mais nous avons d complter avec des jeunes
de 1 7 jours (environ 3 pour 10). La dure du test est de 14 jours. Les rcipients utiliss sont des bchers de 400
mL contenant 150 g de sdiment frais. Le volume de milieu surnageant est de 200 mL (milieu OCDE (1993)
modifi : milieu OCDE + 1mL/litre de solution D (vitamines) de M4). Leau surnageante est introduite avec
prcaution de faon minimiser la remise en suspension du sdiment. Le systme est alors laiss au repos 4
jours, ce qui permet datteindre un certain quilibre dans la partition du pyrne entre les diffrentes phases. Un
clairement de 1300 1500 lux est fourni 16 h par jour. Dix individus sont introduits par bcher et quatre
rplicats sont raliss pour chaque concentration. Un contrle du pH, de la conductivit, de la temprature et de
loxygne dissous est fait rgulirement, ainsi quun dosage du NH
4
+
et une mesure de COT en dbut et fin de
test. Lalimentation des organismes se fait quotidiennement par apport de Tetramin (1 mg/individu/jour)
Pour les mesures de bioaccumulation, les amphipodes sont rcuprs, goutts entre deux feuilles de papier,
pess (poids frais) et placs par groupes de 3 dans des puits dune plaque 96 puits (Costar). 200 L de mthanol
sont ajouts dans chaque puits et une gamme de teneurs en pyrne de 0 100 mg/L dans le mthanol est ralise
en parallle sur chaque plaque. Le pyrne extrait et dissous dans le mthanol est dtect par fluorimtrie
(fluorimtre Fluostar, excitation : 355 nm ; mission : 390 nm). La quantification (doses en g pyrne/g de
matire) est ralise en transformant les units de fluorescence relative en teneurs en pyrne des solutions de
mthanol et en rapportant les quantits de pyrne extraites la biomasse frache des amphipodes. Une correction
est ralise avec des amphipodes tmoins (non contamins) pour tenir compte de leur fluorescence naturelle ainsi
que de celle du solvant.

II-3/ Test sur chironomes Chironomus riparius

II-3-1/ Conditions dlevage au laboratoire

Les chironomes (C. riparius) sont levs dans des aquariums constitus de deux lments identiques accolables,
qui contient pour lun un sdiment reconstitu base de sable et une colonne deau (milieu M4) o se
dveloppent les larves jusquau stade nymphal, le second ayant pour but de rcuprer les chironomes aprs
mergence des nymphes. Rgulirement (2 3 fois par semaine), les pontes issues de la cage o sont placs les
adultes, mles et femelles, sont rcupres puis places dans les levages pour un renouvellement des
populations ou isoles en vue de la ralisation dun test.

II-3-2 / Protocole du test

Les paramtres tests lors de cet essai sont la survie et la croissance des organismes. Les jeunes chironomes
utiliss sont des larves isoles ges de 2 4 jours aprs closion. La dure du test est de 10 jours. Les rcipients
utiliss sont des bchers de 400 mL contenant 120 g de sdiment. Le volume de milieu surnageant est de 200 mL
(milieu OCDE (1993) modifi comme pour les tests sur Hyalella azteca). Leau surnageante est introduite de
faon minimiser la remise en suspension du sdiment. Le systme est alors laiss au repos 3 4 jours. Un
clairement de 1300 1500 lux est apport 16 h/jour. Dix individus sont introduits par bcher et quatre rplicats
sont raliss pour chaque concentration. Un contrle du pH, de la conductivit, de la temprature et de loxygne
dissous est fait rgulirement, ainsi quun dosage du NH
4
+
et une mesure de COT en dbut et fin de test sur eaux
interstitielles et eaux surnageantes.. La nourriture des organismes est soit incorpore initialement au sdiment
(140 mg), soit apporte quotidiennement (1 mg/individu/jour).

II-4/ Analyses du pyrne

Un dosage du pyrne dans le sdiment, les eaux interstitielles et les eaux surnageantes a t ralis J0 (jour
dintroduction des organismes) et J14 (fin du test) au cours du test sur amphipodes. Lobjectif tait de (i) vrifier
que le rendement du dopage par la technique utilise est suffisant, (ii) connatre la partition du pyrne au moment
de lintroduction des organismes et (iii) voir comment cette partition volue sur les 2 semaines du test.
116
- 116 -

A J0, 3 rplicats de chaque concentration (2, 20, 200 mg/kg frais) ont t sacrifis. Les eaux surnageantes
ont t rcupres par siphonnage, mlanges en proportions identiques pour constituer un chantillon moyen,
filtres 0.8 m (filtres Whatman GF/F en fibre de verre ; lutilisation de filtres 0.45 m en nitrate de cellulose
peut conduire des interactions avec le pyrne) de faon doser la fraction dissoute, conserves dans des flacons
en verre labri de la lumire et 4C. Les eaux interstitielles ont t rcupres par centrifugation (4000 tr/mn
pendant 30 mn 4C) sur une partie des sdiments et ont suivi le mme processus que les eaux surnageantes.
Les sdiments frais des rplicats dun mme traitement ont t rcuprs, mlangs en proportions identiques et
40 50 g par traitement ont t conservs dans des flacons en verre labri de la lumire 4C. Les chantillons
ont t envoys au Service Central dAnalyse du CNRS de Solaize (Vernaison, 69) pour un dosage du pyrne
dans les diffrentes matrices dans un dlai de 1.5 2 mois. Lanalyse du pyrne est effectue par HPLC avec
dtecteur dUV 240 nm, sur une colonne Hypersil ODS C18 5 m (200 x 2.1 mm) et un gradient dlution
eau/actonitrile. Les chantillons deau sont injects directement, avec des volumes dinjection importants
(boucle jusqu 1500 L). Aprs homognisation des sdiments et dshydratation par addition de sulfate de
sodium anhydre ou de diatomite, le pyrne est extrait au moyen de tolune chaud et sous pression (extracteur
Dionex ASE). Les extraits sont doss selon le mme protocole que pour les chantillons aqueux.
117
- 117 -

ANNEXE 5

EXPRIENCES EN MICROCOSMES CLOS : MATERIELS ET METHODES

Dispositif exprimental et suivi analytique
Le descriptif des microcosmes et de linstallation exprimentale a dj t prsent dans le chapitre 5 de ce
rapport.
Mesure du
14
CO
2

Leffluent gazeux des microcosmes tait reli deux pige
14
CO
2
conscutifs contenant respectivement 15 et
10 ml de soude 1N. Tous les 7 jours, la solution de soude tait renouvele. La radioactivit pige a t mesure
dans des flacons scintillation contenant 1 ml de solution de chaque pige et 7 ml de cocktail scintillant (Ready
Value, Beckman). Aprs 1h une nuit dincubation pour laisser se dissiper la luminescence parasite due la
soude, la radioactivit a t dtermine laide dun compteur (Intertechnique ou Beckman). Les donnes sont
exprimes en cpm ou en pourcentage de la radioactivit initiale contenue dans le
14
C-pyrne.

Rglage et mesure des dbits dair

Le flux dair traversant les microcosmes a t mesur laide dun dbitmtre bulle de savon branch sur la
tubulure de sortie. Le dbit tait ajust entre 1 et 1,5 L/h laide dune vanne micromtrique place sur le
circuit dalimentation en air et par des pinces de Mohr sur les tubulures dentre des microcosmes.

Prparation dchantillons de sdiments, de phase aqueuse et de plantes pour analyse

En fin dincubation, soit aprs 61 jours pour les sdiments crayeux, les microcosmes ont t traits de la manire
suivante :
Les plantes et les lentilles deau ont t retires, rinces, soumises diverses mesures (comptages, longueur des
tiges et des feuilles, pese), et conditionnes sparment. Les plantes provenant de la mme srie de
microcosmes (1-3 et 4-6) ont ensuite t regroupes, puis fractionne en cinq lots selon la nature des organes :
racines, base des tiges, extrmit des tiges, base des feuilles, extrmit des feuilles. Ces lots ont ensuite t
soumis des extractions au mthanol pour doser le pyrne (HPLC) ou la radioactivit incorpore.
Prs dcantation, leau surnageante de chaque microcosme a t filtre sous vide sur des units striles
comportant une membrane 0,2 m, diam. 75 mm (Nalgene) et recueillie dans des flacons striles. Aprs
comptage de la radioactivit, les lots de phases aqueuse ont t conservs 4-7C labri de la lumire
jusquaux extractions et analyses par CCM.
Trois lots de env. 1,5 g de sdiments humides par microcosme ont t placs dans des tubes Falcon striles, puis
conservs 4-7C (comptages de bactries) ou 20C (analyses dADN).
Des lots de 50 g de sdiments humides ont t placs dans des fioles de 250 ml contenant 100 ml de Tris-HCl,
0,1 M, pH 7,5, et agits 16 h 20C puis dcants 24 h 4-7C. Le surnageant, contenant le liquide interstitiel
des sdiments, a ensuite t filtr sur microfibre de verre (filtres Whatman, type GF/B, 1 m), analys par
comptage de radioactivit, puis stock dans des tubes striles 4-7C labri de la lumire. Les sdiments ainsi
lavs et dcants ont ensuite t soumis une extraction en solvant organique.

Extractions du
14
C-pyrne et des mtabolites de leau et des sdiments

Les chantillons de sdiments ou de plantes ont t extraits sec en utilisant un appareil de Soxhlet. Le sdiment
humide (10 g) a t broy avec 30 g de sulfate de sodium anhydre puis plac en cartouches de cellulose pour
lextraction dans un appareil automatique Buchi. Lextraction a t effectue pendant 5 h par du
dichloromthane 100% ou parfois par du mthanol. Les extraits ont t concentrs au rotavapor environ 4 ml et
conservs en flacons en verre inactinique.
Les chantillons aqueux (25 40 ml) ont t acidifis avec de lacide trichloractique (0,1% final), puis dposs
sur cartouche dextraction en phase solide (SPE) de type C18U-S-500/6 (Upticlean, Interchim). Aprs lavage par
10 ml deau acidifie, les colonnes ont t lues successivement par du methanol 50% et 100% (5 ml de chaque).
118
- 118 -

Les luats 50% meOH contenant lessentiel de la radioactivit extraite, ont t vapors par lyophilisation
avant analyse par CCM.

Analyse du
14
C-pyrne et des mtabolites par chromatographie sur couche mince (CCM)
Les chantillons analyser, des extraits mthanoques, ont t dposs laide de micro pipettes en verre,
raison de 2 10 l par dpt, sur une plaque de silice 60 de 2020 cm (Merck n 1. 053735) 1 cm du bord
infrieur. Des talons des produits purs suivants ont servi de rfrence :
14
C-pyrne, acide 4,5-diphnantroque,
pyrne 4,5-dihydrodiol, acide phtalique. La plaque a t dveloppe dans une cuve de chromatographie par le
mlange hexane/actone, 8/2. Aprs schage, la plaque a t chromatographie nouveau par le mlange
benzne/actone/acide actique, 85/10/5. Aprs quoi, la plaque tait expose un film de type Kodak Biomax
pendant 1 4 semaines 20C. Le film a ensuite t rvl comme un film photographique, pour mettre en
vidence les taches radioactives.

Mthodes micro biologiques

Extraction des bactries des sdiments

Des chantillons de sdiments (1 1,5 g) ont t repris dans 3 volumes de tampon phosphate strile,
homogniss vortex pendant 10 s puis traits aux ultasons pendant 1 min dans un bain ultrasons (Fisherbrand
FB 11011). Aprs 3 cycles de ce traitement, les suspensions ont t laisses dcanter pendant 5 min et 1 ml de
la partie suprieure a t transfr dans un tube strile puis stock 4C.

Comptages au microscope

Les bactries en suspension ont t colores en utilisant le LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit
(Molecular Probes, Oregon, USA). Cent l de suspension ont t mlangs avec 100 l d'un mlange 1:1 de
SYTO 9 nucleic acid stain et de propidium iodide et incubes pendant 15 min l'obscurit. Ensuite, 5 l du
mlange sont tals sur un lame de microscope et observ par pifluorescence avec un microscope Zeiss
Axioskop (objectif Plan NEOFLUAR 40x, filtre FITC). Les cellules colores vertes (bactries vivantes) ou
rouges (bactries mortes) sont comptes sur 10 champs de vue diffrents. Le nombre total de bactries par g de
sdiment humide (N
t
) est calcul en multiplant le nombre moyen par champ (N
c
) par 10
6
(facteur de conversion
tabli par talonnage pralable avec Escherichia coli W6) et par 3,5 (facteur de dilution dtermin en supposant
un taux d'humidit des sediments de 50%).

Comptages sur botes de Ptri

Le nombre de bactries capables de dgrader le pyrne sur milieu glos a t dtermin comme suit. Des botes
de Ptri en verre contenant du milieu MSM glos ont t pralablement tales avec 1/100 de volume de
cycloheximide (5 mg/ml; strilis par filtration 0,22 m) afin d'empcher le dveloppement des moisissures.
Ensuite, une solution de pyrne 1 mg/ml dans l'actone, a t tale raison de 4 x 1 ml sur une bote de 15 cm
en diamtre contenent 100 ml de milieu glos, en laissant vaporer l'actone sous Sorbonne entre chaque
talement. Enfin, sur la couche blanche de pyrne ainsi forme est tal 100 l de suspension bactrienne, non
dilue ou dilue 10x et 100x dans du tampon phosphate strile. Aprs schage sous hotte flux laminaire, la
boite est referme avec du parafilm et incube dans une tuve 30C pendant 15 jours. Au bout de ce temps, le
nombre de zones translucides de dgradation dans la couche de pyrne est comptabilis et ramen la quantit
par g de sdiment humide en tenant compte de la dilution effectue. Pour les zones de petite taille, une meilleure
visualisation est obtenue en observant les botes aux UV (transilluminateur TFX-20M, 312 nm).

Isolement de souches

A partir des zones de dgradation du pyrne, des bactries ont t prlevs l'intrieur de ces zones et repiques
par talement sur une nouvelle bote de milieu glos du mme type. Ds lors qu'une croissance bactrienne tait
dcelable l'intrieur la nouvelle zone de dgradation (au bout de 10 15 jours d'incubation) les bactries ont t
tales sur milieu glos PTYG20 de manire obtenir des colonies isoles. Plusieurs colonies issues de cette
premire tape de purification sont retestes pour leur capacit de dgrader le pyrne. Des colonies positives
subissent encore deux cycles de purification (talement sur milieu PTYG20 et repiquage de colonies isoles)
afin de s'assurer de lhomognit et de la stabilit phnotypique de la souche isole. Les bactries sont
conserves -80C, sous forme de billes (Microbank
TM
Storage System, PRO-LAB Diagnostics, Canada).

119
- 119 -

Identification de souches bactriennes par squenage du gne codant pour l'ARN 16S

De l'ADN chromosomique a t isol partir de cellules cultives sur milieu PTYG20 glos, en utilisant la
mthode dcrite par Beji et al. (1987). Le gne codant pour l'ARN ribosomal 16S a t amplifi par PCR et
squen selon Moun et al. (2000). La squence obtenue a t utilise pour interroger les bases de donnes de
squences nucliques (Genbank) en utilisant le programme BLAST, afin d'identifier l'espce ou la souche
bactrienne la plus proche.

Mthodes de biologie molculaire

Mise au point dune procdure dextraction dADN des sdiments

Lobjectif est dextraire lADN microbien du sdiment sans isolement pralable des microorganismes. La
mthode dextraction est base sur celle dcrite par Zhou et al. (1996).

Etapes dextraction
1. Lyse bactrienne in situ en prsence de lysozyme (10 mg/ml), puis de SDS (2%),
2. Trois cycles de conglation 172C/dconglation 65C ,
3. Centrifugation : extrait soluble 1,
4. Extractions phnol et chloroforme,
5. Prcipitation lisopropanol et solubilisation dans leau : extrait soluble 2

Etapes de purification
6. Filtration sur micro-colonne tamis molculaire de sephacryl S400 HR (Amersham Biosciences)
7. Purification sur micro-colonne de silice DNeasy (Qiagen)

Conditions testes

Pour chaque type de sdiment (sans ajout de pyrne), 2 lots de 5 g chacun ont t traits en parallle, dont lun a
t enrichi par Mycobacterium 6PY raison de 10
8
bactries /g.

La procdure a permis dextraire une quantit apprciable dADN partir de chacun des sdiments. Lextrait
obtenu partir du sdiment tourbeux (extrait soluble n2) est cependant contamin par une (des) substance brune
qui empchent la quantification dADN par la mesure de labsorption 260 nm.
Lors des tapes de purification, la coloration brune nest que partiellement limine sur colonne de silice.
Llimination est meilleure sur colonne de tamis molculaire qui exclut lADN et retient lessentiel de la
coloration. La purification en 2 tapes sur micro-colonnes de tamis molculaire puis de silice (DNeasy) a donn
les meilleurs rsultats.

Tableau A5 1 : Rendement dextraction et de purification dADN des sdiments crayeux et tourbeux.

Sdiment

Ext. Soluble n2

g ADN/g sdiment
Purif sur colone DNeasy

g ADN/g sdiment
Purif sur colonne S400 et
DNeasy

g ADN/g sdiment

Crayeux 16 14.6 6.8
Crayeux + Myco 23.9 15.0 11.1
Tourbeux nm nm 29.2
Tourbeux + Myco nm nm 40.0
nm : non mesurable

Pour le sdiment crayeux, le rendement de purification dADN sur les 2 colonnes partir de lextrait soluble 2
varie entre 42 et 46 %. LADN purifi partir du sdiment tourbeux est sans doute un peu surestim du fait de la
persistance de contaminants colors dans la prparation.

120
- 120 -

Tests de qualit des prparations dADN et amplification pa PCR

Les prparations dADN ont t testes dans deux types dexprience : une digestion par une enzyme de
restriction et une amplification par PCR.
Aprs digestion par lenzyme EcoR1 dans des conditions standard, les fragments dADN obtenus ont t spars
par lectrophorse sur gel dagarose et visualiss par coloration au bromure dthidium. La comparaison entre
ADN digr et non digr montre que la digestion nest que trs partielle. On peut en dduire quil y a
probablement des contaminants dans la prparation qui inhibent la digestion enzymatique.

Pour le test damplification par PCR, nous avons choisi des amorces universelles permettant damplifier tous les
gnes bactriens codant les ARN ribosomaux 16S. Deux dilutions de lADN ont t testes, 1/2 et 1/10. De
lADN purifi de Mycobacterium a servi de tmoin positif. Lanalyse des produits de PCR sur gel dagarose a
montr que seuls les extraits du sdiment crayeux ont donn un rsultat positif. Des fragments dADN de taille
moyenne env. 1,6 kb ont t obtenus, taille comparable celle du fragment amplifi partir de lADN purifi de
Mycobacterium (contrle positif). Ce rsultat a t obtenu la dilution de 1/10, la raction de PCR tant
apparemment inhibe la dilution au 1/2 par des contaminants de la prparation.

Pour amliorer la qualit de lADN obtenu, notamment partir du sdiment tourbeux, une tape supplmentaire
de purification sur colonne S400 HR a t faite. Un produit de PCR de taille correcte a alors t obtenu.

Essais danalyse de la diversit bactrienne des sdiments par TGGE ou SSCP

Lobjectif est dobtenir une image de la diversit des espces bactriennes dans les sdiments. A terme, en
comparant de telles images avant et aprs contamination par le pyrne, nous voulions observer lincidence et les
perturbation induites par cette contamination sur lquilibre et la diversit despces de la communaut
bactrienne. Au plan technique, limage est obtenue par lanalyse dun gne commun toutes les bactries et
codant une sous-unit de lARN des ribosomes (ARNr 16S). La squence nuclotidique de ce gne varie selon
lespce. Lamplification par PCR de ce gne (ou dun fragment) partir de lADN dune communaut de
bactries donne un mlange de double-brins dADNr 16S de mme taille quil est possible de sparer par
lectrophorse selon une technique initialement mise au point par Muyzer et al. (1993) et appele DGGE
(denaturing gradient gel electrophoresis). Limage obtenue est un profil de bandes dintensits variables qui est
le reflet de la diversit des espces prsentes. Une variante de cette mthode est appele TGGE (temperature
gradient gel electrophoresis). Ces techniques sparent les double-brins dADN selon les paramtres de
dnaturation (temprature), cest--dire selon les conditions partir desquelles les brins se dissocient : ces
paramtres sont directement fonction de la squence des brins dADN.
Une autre technique appele SSCP (single strand conformation polymorphism), consiste sparer les 2 brins
dADN avant de les sparer par lectrophorse.

Essais danalyse dADNr 16S par SSCP

Nous avons appliqu la mthode dcrite par Schweiger et Tebbe (1998). Celle-ci consiste amplifier un
fragment du gne ADNr 16S de 400 bp env., puis dnaturer lADN et sparer les simples brins par
lectrophorse haute rsolution. A lusage ; la mthode sest rvle dlicate mettre en uvre. Notamment
nous navons pas trouv les conditions permettant la dnaturation complte des double-brins dADN. Une autre
approche, base sur la mthode dcrite par lquipe de J.-J. Godon de Narbonne (Delbs et al . 2000), sera teste
prochainement

Essais danalyse dADNr 16S par TGGE

Sachant que ce sont souvent des bactries de type actinomyctes qui participent la dgradation du pyrne, nous
avons ralis des amplifications par PCR cibles, cest--dire destines amplifier seulement lADNr 16S de ce
type de bactries, en employant un couple damorces dADN appropri (Tableau A5.1). En parallle, des
amorces dites universelles ont t employes pour obtenir un mlange de fragments dADNr 16S reprsentatif de
tous les genres bactriens.
LADN a t extrait partir des sdiments des microcosmes 1, 6, 7, et 9 selon la mthode dcrite ci-dessus. Ces
4 prparations ont ensuite servi de matrices pour amplifier par PCR soit la rgion universelle soit la rgion
spcifique actinomyctes.

121
- 121 -

Des fragments de la taille attendue (220 bp) ont bien t obtenus avec les amorces universelles, mais seules
les prparations des microcosmes 1, 6 et 7 ont donn une bande de taille correcte (310 bp) dans le cas des
amorces spcifiques actinomyctes. Ce rsultat indique que le microcosme 9 est moins riche en bactries de ce
type. On pouvait sy attendre, car contrairement aux microcosmes 6 et 7 ; le n 9 na pas t ensemenc avec la
souche 6 PY1. La prsence dactinomyctes dans le microcosme 1 est en accord avec lisolement despces du
genre Mycobacterium dans ce cas l (cf. 5.8).

Tableau 5A.1 Amorces employes pour lamplification par PCR de fragments dADNr 16S
Amorces Squence Rgion
amplifie
Taille du
fragment
Spcificit
F341 GC
RV 518
[GC1]ACTCCTACGGGAGGCAGCAG
ATTACCGCGGCTGCTGG
341-518 217 pb universelle
R513 GC
F243
[GC2]GCCGCGGCTGCTGGCACGTA
GGATGAGCCCGCGGCCTA
243-513 310 pb actinomyctes
16SC
16SD
AGAGTTTGATCCTGGCTCA
ACGGGCGGTGTG(A/G)C
1400 pb universelle
[GC1] reprsente la squence suivante : CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG et
[GC2] : CGCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCG

Lanalyse par TGGE a t ralise laide dun appareil dlectrophorse (D-Code system, Biorad) permettant
daugmenter par gradient la temprature du bain de 50 65 C pendant la dure dlectrophorse (16 h). Les
conditions opratoires taient inspires de celles dcrites par Cheung et Kinkle (2001). En dpit de plusieurs
essais de mise au point, nous navons pas russi obtenir une image nette et exploitable : dfaut du rsulta
escompt (une srie de bandes chelonnes de bas en haut du gel dlectrophorse) les mlanges de brins dADN
provenant des microcosmes ont donn des tranes diffuses. Ces difficults techniques nous ont contraint
renoncer cette approche.

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- 122 -

ANNEXE 6

ESSAIS EN MICROCOSMES OUVERTS : MATERIELS ET METHODES

1. Elevage des organismes
Les conditions sont les mmes que celles prsentes pour les tests monospcifiques (cf annexe 4)

2. Prlvement, prparation, et dopage des sdiments
Les mthodes sont les mmes que celles prsentes pour les tests monospcifiques (cf annexe 4)

3. Mise en oeuvre des bioessais

3.1. Mise en place des phases aqueuse et sdimentaire
Le tableau 1 rsume les modalits exprimentales mises en uvre dans les bioessais prsents dans ce rapport.

Tableau 1 : Principales conditions exprimentales observes dans les bioessais durant cette tude

Bioessais Type de contenant Masse de sdiment Volume de milieu dessai
Essai mono Bcher de 400 ml 50 grammes 300 ml
Essais pluri1 et pluri2 Bcher de 2 litres 100 grammes 2 litres

La phase aqueuse utilise dans ces bioessais est un milieu de type OCDE (OCDE, 1993). Il est introduit dans les
bchers aprs introduction de la phase sdimentaire, en prenant soin de minimiser les turbulences et la remise en
suspension du sdiment. Un film alimentaire perc de quelques trous est appos sur louverture du bcher et
maintenu par un lastique. Ce film permet de limiter les pertes par vaporation et de piger les chironomes
mergents. Loxygne est dlivr par une pompe air couple un systme rpartiteur qui permet lalimentation
de plusieurs bchers. Un filtre air (maille de 0.22 m) est dispos en amont du rseau dalimentation. Pour les
essais pluri1 et pluri2, les systmes ainsi quips sont placs pendant 7 jours lobscurit et une temprature
de 20C. A lissue de cette priode, ils sont soumis un clairage de type jour long (16 h/24h) dune intensit de
2000 Lux. Pour lessai mono les systmes sont immdiatement soumis au mme clairage et des mesures sur
bactries (activits enzymatiques et densits bactriennes) et sur daphnies (bioaccumlulation) sont effectues
ds la 1
re
semaine.

3.2. Introduction des organismes (essais pluri1 et pluri2)

Les organismes sont introduits dans les microcosmes 7 jours aprs la mise en place de la phase aqueuse et de la
phase sdimentaire, lexception de la souche Mycobacterium 6PY1 qui est introduite dans le sdiment, par le
biais dune suspension incorpore de faon homogne avant adjonction du milieu dessai (donc J0).
Les caractristiques des organismes introduits dans les microcosmes sont prsentes dans le tableau 2.

Tableau 2 : Caractristiques des organismes introduits dans le cadre des bioessais plurispcifiques en
microcosmes

Organismes Caractristiques nombre
Lemna minor Colonies de 2 frondes 6
Daphnia magna Individus gs de moins 10
Hyalella azteca Individus gs de 7 14 10
Chironomus riparius Larves au deuxime stade 25
Mycobacterium 6PY1 Souche 1.5. 10
7
individus par

123
- 123 -

3.3. Paramtres et conditions de ralisation des bioessais

Durant la totalit du test, soit 28 jours, les microcosmes sont maintenus en chambre climatise 20C.
Lclairement dune intensit comprise entre 2000 lux est dlivr par des tubes fluorescents de type lumire du
jour, la photopriode est de type jour long (16 heures par jour).
Les apports en nourriture sont raliss quotidiennement par adjonction au milieu dune suspension de
TtraMin! dans de leau distille. La quantit apporte est de 5 mg par jour ; cette quantit a t retenue la
suite de lessai prliminaire sans contaminant.
Aucun renouvellement de milieu nest ralis pendant la dure des bioessais.

3.4. Suivi des paramtres physicochimiques

3.4.1. Sdiment

Le pH, la teneur en eau et la perte au feu des sdiments sont mesurs lors des sacrifices. La teneur en pyrne est
galement mesure sur un chantillon constitu par homognisation de sous-chantillons de trois grammes de
sdiment provenant des microcosmes sacrifis. Les chantillons sont envoys au Service central dAnalyses du
CNRS Solaize. Les protocoles utiliss ont t dcrits dans lannexe matriels et mthodes des essais
monospcifiques .

3.4.2. Eaux surnageantes
Le pH, la conductivit, la temprature et la teneur en oxygne dissous et le taux de saturation en oxygne dissous
sont mesurs 2 fois par semaine sur 5 microcosmes par traitement. A loccasion des sacrifices, la teneur en
chlorophylle a est mesure aprs filtration dune partie de la colonne deau (1000 1500 mL selon la densit
algale apprcie par observation visuelle), suivant la mthode ASTM (1993). Sur les eaux filtres cette
occasion, sont galement ralises lanalyse des anions et cations en solution est ralise par chromatographie
ionique sur rsine changeuse dions (analyseur de type DIONEX), le dosage du COT par oxydation sous UV du
carbone organique au persulfate de sodium et dtection infra-rouge (COTmtre LAB TOC, Spectra-
France/PPM), le dosage du pyrne (sur un chantillon constitu dun mlange deaux surnageantes de plusieurs
microcosmes sacrifis) selon le protocole prsent plus haut (annexe matriels et mthodes des essais
monospcifiques ).

3.4.3. Eaux interstitielles

Le sdiment obtenu aprs sacrifice des microcosmes est pool pour chaque traitement. Les quatre lots de
sdiment sont ensuite centrifugs 4000 tours/minute 4 C pendant 30 mn. Le sdiment de type tourbe fournit
un volume deaux interstitielles suffisant pour les analyses ultrieures. Dans le cas du sdiment de type craie, le
volume rcupr peut tre relativement faible. Il est dans ce cas ajust 100 ml avec de leau dminralise. Les
eaux interstitielles sont ensuite filtres 0.7 m sur un filtre Whatman GF/F. Les chantillons deau
interstitielles sont stocks 4 C et lobscurit. Sur ces eaux sont ralises les mesures suivantes : teneurs en
anions et cations, teneur en COT, teneur en pyrne (mme protocole que pour les eaux surnageantes).

3.5. Exposition des daphnies et dosage du pyrne bioaccumul au cours de lessai mono

3.5.1. Mode dexposition des daphnies

Les organismes utiliss dans cette partie de ltude sont des daphnies juvniles ges de moins de 48 heures
provenant des levages entretenus au laboratoire.
Le tableau 3 prsente les diffrents modes dexposition auxquels ont t soumises les daphnies ainsi que les
temps dexposition retenus. A lissue de lexposition, les daphnies survivantes sont dnombres et font lobjet de
dosages de pyrne.

Tableau 3 : Modalits et dures dexposition des organismes pour le bioessai monospcifique ((*) : eaux
surnageantes rcupres lors de sacrifices dans lesquelles les daphnies sont donc exposes en labsence de
sdiment)

Date dexposition Mode dexposition Temps dexposition
J17 J18 Eaux surnageantes (*) 24 heures
124
- 124 -

J0 J1, J0 J2, J2 J3, J7 J8, J14
J15
Eaux surnageantes (*) filtres 0,8
m.
24, 48 et 72 heures
J-4 J-3, J-3 J0, J0 J1, J0 J2,
J2 J3, J7 J8, J14 J15
Sdiment et eaux surnageantes des
microcosmes
24, 48 et 72 heures

3.5.2. Dosage du pyrne bioaccumul

Le protocole sinspire de celui de Gourlay et al. (2002). 15 17 daphnies vivantes (pralablement sches ou
humides) sont broyes dans un tube essai en verre au moyen dune tige de verre, puis 2 mL de mthanol sont
ajouts. La suspension obtenue est introduite dans une seringue et filtre 0.45 m (Minisat, SARTORIUS).
Le filtrat est ensuite introduit dans une cuve en quartz poli pour permettre la lecture de lchantillon au
spectrofluorimtre. Lexcitation du pyrne en solution est ralise une longueur donde de 332 nm ; le spectre
dmission rsultant est obtenu entre 350 et 475 nm. Le pic de fluorescence retenu pour la quantification se situe
une longueur donde de 393 nm. En parallle la lecture de chaque chantillon, une gamme talon de solutions
de pyrne dans du mthanol est galement lue afin de dterminer la relation entre fluorescence et teneur en
pyrne des solutions.

3.6. Suivi des paramtres biologiques (organismes suprieurs des essais pluri1 et pluri2)

3.6.1. Daphnies

3.6.1.1. Survie des mres
Le suivi et la numration des daphnies sont raliss par prlvement des individus au moyen dune pipette
gradue retourne. Les daphnies sont alors places dans un peu deau surnageante de leur microcosme dorigine,
puis dnombres et observes (croissance, couleur, prsence dufs chez les daphnies mres, prsence de
mles). Le milieu dessai et les daphnies sont alors rintroduits avec prcaution dans le microcosme.

3.6.1.2. Reproduction et dosage du pyrne dans les daphnies juvniles
Lors du dnombrement des adultes, les jeunes daphnies ventuellement prsentes sont dnombres aprs les
avoir rcupres par aspiration (siphonnage dune partie de la colonne deau et tamisage). Les individus issus de
microcosmes ayant reu le mme traitement sont placs dans un tube essai contenant 2 mL de mthanol 90%.
Les chantillons sont ensuite placs 4C lobscurit en attendant de fournir des mesures de bioaccumulation
du pyrne chez les jeunes daphnies.

3.6.2. Amphipodes
Le taux de survie des amphipodes est dtermin lors des sacrifices des microcosmes. Les amphipodes sont
capturs laide dune use ou dune pince la surface du sdiment et stocks dans une petite quantit deau
surnageante de leur microcosme dorigine. Les individus sont alors dnombrs et observs (croissance,
formation de couples).

3.6.3. Chironomes
Le taux de survie des larves de chironomes est dtermin lors du sacrifice des microcosmes. Les larves sont
extraites du sdiment et places dans une petite quantit deau surnageante provenant de leur microcosme
dorigine. Les individus sont alors dnombrs et observs (croissance). Les adultes qui ont merg sont tris par
sexe et dnombrs tous les jours partir de J10. Les individus sont ensuite placs dans des piluliers en
polyurthane et stocks au conglateur pour dosage ultrieur du pyrne.

3.6.4. Lentilles deau
Le dveloppement des lentilles est suivi lors du dnombrement des daphnies mres. Les colonies sont
dnombres, le nombre de frondes qui composent chaque colonie est galement relev. Une observation de
laspect gnral est ensuite ralise afin de noter lventuelle apparition de signes de dgnrescence (frondes
jaunies ou chlorotiques).

3.6.5. Mesures de poids frais et sec
Les organismes survivants sont rapidement essuys sur une feuille de papier absorbant, leur poids frais est
mesur, puis ils sont placs pendant 24 heures dans une tuve 60C. Les mesures de poids frais et sec sont
125
- 125 -

ralises sur la totalit des individus dun microcosme. Le poids moyen est obtenu par division de la valeur
obtenue par le nombre dindividus.

3.7. Suivi du compartiment bactrien

3.7.1. Activits exoenzymatiques
Les mesures dactivits enzymatiques bactriennes retenues dans cette partie de ltude sont lactivit leucine-
aminopeptidase et lactivit -glucosidase. Les protocoles de mesures mis en uvre sont bass sur lutilisation
de lpifluorescence de groupements chromophores greffs des substrats enzymatiques (tableau 4).
Lhydrolyse de ces complexes permet la libration du groupement chromophore qui met alors un rayonnement
fluorescent aprs excitation.
Tableau 4 : Substrats chromophores utiliss dans les mesures dactivits exoenzymatiques leucine-
aminopeptidase et -glucosidase.

Activit
enzymatique
Gamme talon
Concentration saturante en
substrat
Mesure de lactivit
enzymatique des
chantillons
Lecture des
chantillons
Leucine-
Aminopeptidase
7-amino-4-mthyl-
coumarine (MCA)
L-Leucine-7-amino-4-
mthyl-coumarine (Leu-
MCA)
L-Leucine-7-amino-4-
mthyl-coumarine
Excitation :
380
Emission :440
-D-glucosidase
4-Mthylumbellifrone
(MUF)
4-Mthylumbellifryl -D-
glycopyranoside (MUF-
Glp)
4-Mthylumbellifryl
-D-glycopyranoside
Excitation :
365
Emission : 460

La ralisation des mesures dactivit enzymatique comprend deux tapes :

- dtermination de la concentration saturante en substrat,
- dtermination du niveau dactivit enzymatique des chantillons en rfrence une gamme talon
de chromophore.

Les diffrentes gammes de substrats sont ralises partir de solutions mres de substrats dissous dans du
Mthylcellosolve. Les dilutions successives sont ralises avec de leau distille.
La concentration saturante en substrat est dfinie comme la concentration minimale non limitante pour les
consortiums bactriens. Cette valeur est estime graphiquement : elle correspond la plus forte concentration en
substrat utilise, avant le plateau de saturation de la courbe exprimant le niveau de fluorescence relative en
fonction de la concentration en chromophore. Cette concentration saturante, value lors de mesures
prliminaires sur des chantillons de sdiment, a t fixe 1500 mol/L pour les deux sdiments utiliss. Cette
concentration a t ensuite utilise dans lensemble des mesures effectues au cours de cette tude. Lors de la
lecture des chantillons au fluorimtre, la ralisation de tubes striles permet de saffranchir du bruit de fond de
fluorescence li la nature du sdiment. Les units de fluorescence relatives sont donc calcules par soustraction
de ces striles :

UFR (relle) = UFR (chantillon) UFR (strile)

La quantit de substrat hydrolyse par les chantillons est dtermine grce la gamme talon. Les tubes
Eppendorf sont tuvs 24 heures 105C, le poids sec des chantillons de sdiment est dtermin par
soustraction du poids des tubes vides au poids de lensemble tube + sdiment sec. Les rsultats sont exprims en
M de substrat hydrolys par heure et par gramme de sdiment sec.

126
- 126 -

3.7.2. Densit bactrienne
Lestimation de la densit bactrienne des sdiments seffectue en microscopie pifluorescence aprs marquage
des bactries au DAPI (4-6 diamidino-2-phnylindole dihydrochlorure). Le DAPI est un chromophore
fluorescent qui se fixe aux acides nucliques aprs diffusion passive dans les cellules bactriennes. Le complexe
ADN-DAPI est excit sous UV 340-380 nm. Le protocole exprimental mis en uvre figure en annexe 3 .
Le nombre total de bactries est obtenu par lquation suivante :

Nombre de bactries/g de sdiment frais = (Sf x Ve x N x D x 0,9) / (Sm x Vf)

Avec : Sf = surface utile du filtre = 176,71 mm
2
Ve = volume dextraction = 9 mL
N = nombre de bactries par champ microscopique prospect
D = dilution
Sm = Surface du champ microscopique x 1000 = 0,0314 mm
2

Vf = volume de filtration = 4,5 mL

Selon Trousselier (1985), il faut retenir la dilution permettant de compter 30 bactries par champ, et en comptant
300 bactries la prcision finale de la numration est de 10%.

3.7.3. Mise en vidence de souches dgradant le pyrne
Les souches dgradant le pyrne sont mises en vidence dans des botes de Ptri en verre contenant 30 mL dun
milieu glos sur lequel 0,175 mL dune solution de pyrne dans lactone 2 mg/l a t vapor. Pour chaque
microcosme sacrifi, 0.1 mL de suspension bactrienne dilue 100 et 1000 fois est dpos dans les botes de
Ptri strilises. Lopration est effectue sous hotte strile et dans des conditions dasepsie maximum. Les
botes sont ensuite mises en incubation 30C et lobscurit. Une observation rgulire des botes est ralise
afin de dceler le dveloppement de colonies et la disparition de lopacit due la couche de pyrne se trouvant
dpose sur le milieu glos.

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