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.
Les expriences sur la rponse des biocapteurs en absence doxygne ont t menes
avec des solutions tampon et de glucose dsoxygnes avec de largon de qualit NERTAL
fourni par Air Liquide.
II.2.2 Appareillage
Lappareillage pour les tudes lectrochimiques consiste en un ensemble VoltaLab
TM
21 (potentiostat/galvanostat PGP201 de Radiometer Copenhagen pilot par le logiciel
VoltaMaster 1) et reli un enregistreur thermique Sefram 8400. Toutes les expriences
lectrochimiques ont t effectues dans une cellule thermostate (volume 10 ou 20 mL) et
avec un systme trois lectrodes.
Llectrode de rfrence est llectrode au calomel satur (ECS) de chez Tacussel
. La
contre-lectrode est forme dun fil de platine.
Les lectrodes de travail sont des lectrodes de platine de 1,6 mm de diamtre fournies
par BAS
.
50
La surface des lectrodes de travail a subi un traitement pralable qui consiste en un polissage
laide dune solution dalumine avec des particules de 0,05 m de diamtre et un feutre
appropri (kit de nettoyage PK-4 fourni par BAS
red
2 H
2
O + ABTS
ox
Ractifs A- Tampon phosphate 0,1 M pH 7.
B- Solution de ABTS
2 mM dans la solution A.
C- Solution de D-Glucose 1,1 M dans leau dsionise.
D- Solution de peroxydase (HRP) 2500 U.mL
-1
dilue 5 fois dans
une solution de sulfate dammonium 3,2 M.
Mlange
ractionnel
Placer dans lordre dans une cuve : 2,5 mL de solution B, 0,5
mL de solution C et 0,01 mL de solution D. Mlanger.
Mesure Immerger la biolectrode et mlanger par agitation mcanique.
Enregistrer laugmentation de labsorbance conscutive
loxydation de ABTS durant X minutes une longueur donde de 405
nm.
ABTS : 2,2-azino-bis(3thylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid)
II.2.3.3 Mesures ampromtriques
Avant chaque mesure lectrochimique, les lectrodes sont stabilises dans un tampon
phosphate 0,01 M (10 mL ou 20 mL) un potentiel de 0,65 V/ECS jusqu lobtention dun
courant rsiduel stationnaire. Des petits volumes de solution de glucose (5 300 L) sont
ensuite injects dans la cellule. Les solutions de glucose sont prpares dans de leau
dsionise et conserves au rfrigrateur. Avant utilisation, elles sont stockes 24 heures la
temprature ambiante de manire permettre lquilibre de mutarotation du glucose.
II.2.3.4 Influence de la concentration de GOD dans la solution dlectropolymrisation.
La rponse de llectrode une concentration de glucose de 5 mM a t enregistre
pour diffrentes lectrodes fabriques avec diverses concentrations de glucose oxydase dans
la solution dlectropolymrisation : 50 1000 UI. mL
-1
.
52
II.2.3.5 Influence du pH de la solution dlectropolymrisation
La rponse des biolectrodes a t mesure diffrents pH de la solution
dlectropolymrisation avec les conditions suivantes : solution tampon phosphate 20 mM pH
5 8, concentration de la solution du glucose tester : 5 mM.
II.2.3.6 Influence de la temprature
La rponse de llectrode est enregistre dans une solution danalyse contenant du
tampon phosphate 0,01 M pH 7 et du glucose 5 mM. La valeur du courant dlivr par le
biocapteur est alors releve aprs stabilisation pour chaque temprature.
II.2.3.7 Influence du pH et de la concentration de la solution tampon danalyse
La rponse de llectrode est enregistre dans chaque solution tamponne diffrents
pH de 5 8 en milieu tampon phosphate 0,01 M. La concentration de substrat est fixe
5 mM. Les lectrodes ont t testes aussi en fonction de la force ionique (0,005 M ; 0,01 M ;
0,05 M ; 0,1 M) de la solution tampon phosphate.
II.2.3.8 Choix du potentiel
La rponse de llectrode est enregistre dans une solution contenant du tampon
phosphate 0,01 M pH 7 et du glucose 5 mM. La valeur de la rponse en courant du biocapteur
est alors releve aprs stabilisation du courant pour chaque potentiel.
53
II.3 RESULTATS ET DISCUSSION
II.3.1 Optimisation des conditions dlaboration du biocapteur
Comme les performances dun biocapteur sont intimement lies au mode
dimmobilisation de lenzyme, nous avons tudi certains paramtres impliqus dans
llaboration du biocapteur.
II.3.1.1 Caractrisation du biofilm et choix des conditions dlectropolymrisation
Lors de ltape dlectropolymrisation, une quantit importante denzyme
pradsorbe peut tre relargue en solution. Ce phnomne est li au milieu lectrolytique
aqueux utilis pour la rtention de lenzyme. Lexistence dun coefficient de partage entre la
phase adsorbe et le milieu aqueux est lorigine du relargage plus ou moins rapide de
lenzyme en solution.
Le film de PEDT peut tre form par deux mthodes : soit par un balayage cyclique du
potentiel, soit par le dpt potentiel constant. La mise au point de lutilisation de ce
polymre a t faite dans le cadre dune collaboration entre notre Laboratoire et lInstitut de
Topologie et de Dynamique des Systmes (ITODYS) de lUniversit Paris VIIDenis Diderot
[94]. Limage de la figure II.4 montre la surface sensible dune lectrode de carbone vitreux
obtenue par microscopie lectronique balayage (MEB) o nous avons lectropolymris un
film de a) PEDT + PEG et b) PEDT + PEG-GOD. Nous avons utilis un angle du microscope
de 80 . Nous pouvons observer clairement le changement de la morphologie de la surface en
prsence de lenzyme.
54
Figure I I .4 : MEB des films obtenus par lectropolymrisation sur une lectrode de carbone
vitreux 1,1 V pendant 10 secondes de a) PEDT + PEG et b) PEDT + PEG-GOD avec un
angle de microscope de 80 [94].
Garreau et coll. [56, 95] ont tudi et caractris le 3,4-thylnedioxythiophne (EDT)
et le poly(3,4-thylnedioxythiophne) (PEDT) par spectroscopie Raman. La figure II.5
montre les diffrentes bandes obtenues dans une gamme de frquences de 600 1600 cm
1
.
Dans le EDT, on peut observer six bandes dominantes 1487 cm
-1
(C=C longation
asymtrique), 1424 cm
-1
(C=C longation symtrique), 1185 cm
-1
(CH
2
balancement),
891 cm
-1
, 834 cm
-1
(dformation symtrique du cycle) et 766 cm
-1
(dformation du cycle).
Dans le PEDT, on observe un pic fort 1423 cm
-1
(C=C longation symtrique).
55
Figure I I .5 : Caractrisation du monomre EDT et du polymre PEDT par spectroscopie
Raman dans une gamme de frquences de 600 1600 cm
-1
[95].
Nous avons essay la mthode du balayage cyclique du potentiel pour procder
limmobilisation de lenzyme. Nous avons fait varier le potentiel de llectrode entre 0,2 et
1,5 V/ECS une vitesse de balayage de 0,1 V/s. Cette technique a dj t utilise par
Yamato et coll. [50] pour llectropolymrisation du PEDT en prsence de poly(styrne
sulfonate) (PSS). Le voltamprogramme cyclique (figure II.6) montre un pic anodique 1,3 V
dans le premier cycle d llectropolymrisation du PEDT. Dans les cycles suivants, le
courant anodique diminue probablement cause dune suroxydation du polymre dpos.
Le nombre de cycles de llectropolymrisation dtermine lpaisseur de la couche de
polymre. Aprs avoir mesur la rponse ampromtrique des diffrents biocapteurs prpars
avec 5, 10, 15, 20 et 30 cycles, nous avons obtenu une faible rponse pour les deux premiers
et pas de rponse ou une trs faible rponse pour les deux derniers. Lexplication serait
quune couche trs paisse de polymre gne le passage du substrat travers le film polymre
pour entrer en contact avec lenzyme pige, ou bien que le produit de la raction natteint pas
llectrode pour la mme raison. Piro et coll. [57] ont utilis la mme technique pour le
greffage dun oligomre dans un film de PEDT. Ils ont vrifi quau-del de 20 cycles le film
56
devient fragile et friable, ce qui pourrait librer la protine emprisonne. Ils ont aussi montr,
par microscopie lectronique balayage (MEB), que lpaisseur du film augmente de manire
quasi-linaire avec le nombre de cycles appliqus. Pour 2 cycles, lpaisseur du film est de
0,2 0,3 m, et pour 20 cycles lpaisseur de la couche est de 5,4 m.
0
20
40
60
80
100
120
0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
Potentiel (V)
C
o
u
r
a
n
t
(
A
)
1 cycle
Figure I I .6 : Electropolymrisation par balayage cyclique du EDT en prsence de lenzyme
GOD et du poly(thylneglycol) (PEG) dans une solution tampon phosphate 0,02 M, pH 6,2.
Electrode de travail : disque de platine de 1,6 mm de diamtre. Vitesse de balayage : 0,1 V/s.
La solubilit du monomre EDT dans un milieu aqueux est relativement faible. La
solution dlectropolymrisarion a t prpare une concentration 10
-2
M du EDT, ce qui
reprsente la limite de solubilit du monomre. Lajout dans le milieu dlectropolymrisation
dun polymre hydrophile de type poly(thylne glycol) (PEG) ou polyvinylpirrolidone (PVP)
de masse molculaire comprise entre 200 et 50000 g. mol
-1
une concentration de lordre de
10
-3
M permet une augmentation de lhydrophilie du polymre dpos. Piro et coll. [57] ont
dmontr que laddition dun polymre soluble dans leau du type PEG ou PVP amliore
lincorporation des oligonuclotides dans un film de PEDT. La prsence dun polymre
57
hydrophile peut entraner la formation de microdomaines hydrophiles dans la matrice de
PEDT. La taille des microdomaines pourrait augmenter avec la masse molaire du polymre
soluble ajout. La formation de ces domaines pourrait tre essentielle pour le dplacement de
charges dans le polymre conducteur. Les films lectropolymriss en labsence des
polymres solubles dans leau montrent une permabilit trs faible aux solutions aqueuses.
Lanalyse de la surface du film par microscopie lectronique balayage montre les
diffrences de la morphologie de la surface en labsence et en prsence de PVP dans le milieu
dlectropolymrisation (figure II.7).
58
Figure I I .7 : Images obtenues par MEB des films lectropolymriss en (a) absence ou (b)
prsence de PVP de masse molaire 40000 g. mol
-1
dans le milieu dlectropolymrisation.
Nombre de cycles : 20 ; [EDT] : 3. 10
-2
M ; [oligonuclotide] : 1 M [57].
59
II.3.1.2 Evaluation de la concentration denzyme dans la solution dlectropolymrisation
Llaboration de biolectrodes sensibles et reproductibles est un enjeu majeur dans la
conception des biocapteurs. Linfluence de la quantit denzyme dpose a t tudie
travers la concentration de GOD dans la solution dlectropolymrisation. Les rsultats sont
montrs dans la figure II.8.
50
55
60
65
70
75
0 200 400 600 800 1000 1200
GOD (UI/mL)
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A
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)
Figure I I .8 : Rponse ampromtrique du biocapteur Pt/PEDT/GOD diffrentes
concentrations denzyme contenues dans la solution dlectropolymrisation. Mesures
effectues pour une concentration en glucose de 5 mM 0,65 V/ECS et 25C dans une
solution tampon phosphate 0,01 M pH 7.
Le rsultat optimal, du point de vue de la dtection, est obtenu pour un biocapteur
ralis partir dune solution dlectropolymrisation contenant une concentration denzyme
60
entre 800 et 1000 U.I. mL
-1
. Nous avons donc choisi de travailler avec une solution de
concentration 1000 U.I. mL
-1
pour la suite des expriences.
Par lutilisation du test spectrophotomtrique utilis pour la dtermination de lactivit
dune solution de GOD, il est possible de mesurer lactivit de lenzyme immobilise. Pour
cela, llectrode est plonge dans le mlange ractionnel. Les rsultats de cette tude montrent
que lactivit de llectrode est de 39 mUI. cm
-2
. La fraction de molcules denzymes
accessibles et jouant un rle comme catalyseur est de moins de 1%. Cette faible valeur peut
tre le rsultat dune dnaturation au cours de llectropolymrisation. Malgr la faible
activit de llectrode, nous verrons plus tard que la sensibilit lectrochimique obtenue en
prsence de glucose est apprciable.
II.3.1.3 Influence du pH de la solution dlectropolymrisation
Nous avons procd lvaluation de la rponse de llectrode diffrentes valeurs du
pH de la solution tampon phosphate 0,02 M utilise pour llaboration du biocapteur
Pt/PEDT/GOD. La courbe de la figure II.9 montre que l'activit de la glucose oxydase pour
une concentration du glucose de 5 mM est optimale pour un pH dlectropolymrisation de
6,0 environ. Par consquent, pour avoir des rsultats reproductibles, nous avons effectu
toutes les polymrisations lectrochimiques partir dune solution tampon de pH 6,2. Ce pH
de la solution dlectropolymrisation a dj t utilis par Yamato et coll. dans une tude de
comparaison de la stabilit entre le polypyrrole et le PEDT [50].
61
50
55
60
65
70
75
80
85
90
4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5
pH de la solution d'lectropolymrisation
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
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(
A
/
c
m
)
Figure I I .9 : Effet du pH de la solution dlectropolymrisation sur la rponse de la
biolectrode Pt/PEDT/GOD. Mesures effectues 0,65 V/ECS et 25C pour une
concentration en glucose de 5 mM dans un tampon phosphate 0,01 M pH 7.
II.3.1.4 Influence de la prsence de biomolcules sur llectroactivit du PEDT
Une fois la GOD retenue dans le film de PEDT, comme le montre la figure II.10, le
voltamprogramme obtenu par balayage en potentiel diffre nettement de celui obtenu pour le
PEDT seul. Le phnomne observ pourrait reprsenter une rduction de llectroactivit du
PEDT par la diffusion des porteurs de charges. Loxydation du polymre saccompagne de
lincorporation de contre-ions prsents dans la solution, ce qui maintient llectroneutralit du
film. La prsence denzyme peut perturber cette incorporation et provoquer une dformation
des voltamprogrammes, comme nous observons dans la figure II.10.
62
Figure I I .10 : Voltampromtries cycliques dune lectrode Pt/PEDT et dune lectrode
Pt/PEDT/GOD 50 mV/s dans un tampon phosphate 0,01 M pH 7. Matriaux dlectrodes
labors par lectropolymrisation balayage cyclique sur une lectrode de platine (diam.
1.6 mm).
II.3.1.5 Comportement des biolectrodes en prsence du substrat
Le comportement lectrochimique du biocapteur Pt/PEDT/GOD a t mis en vidence
par le trac des courbes de voltampromtrie cyclique en labsence et en prsence du glucose
(figure II.11). En prsence du glucose, la courbe montre une augmentation du courant
doxydation, phnomne li la dtection de leau oxygne par le systme rdox du
biocapteur. Le pic de rduction observ peut tre attribu la r-oxydation de la forme rduite
du cofacteur de lenzyme (FADH
2
) en prsence doxygne (accepteur naturel dlectrons).
-120
-70
-20
30
80
130
180
-0,5 -0,3 -0,1 0,1 0,3 0,5 0,7
Potentiel (V/ECS)
C
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n
t
(
A
)
Pt/PEDT/GOD
Pt/PEDT
63
Glucose + GOD(FAD) + H
2
O Acide gluconique + GOD(FADH
2
)
GOD(FADH
2
) + O
2
GOD(FAD) + H
2
O
2
H
2
O
2
2 H
+
+ O
2
+ 2 e
-
(sur llectrode de platine)
-60
-40
-20
0
20
40
60
-0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3 0.5 0.7
Potentiel (V/ECS)
C
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t
(
A
)
solution tampon
solution tampon + glucose 10 mM
Figure I I .11 : Voltampromtries cycliques dune lectrode Pt/PEDT/GOD en prsence et en
labsence du glucose, 50 mV/s dans un tampon phosphate 0,01 M pH 7. Matriaux
dlectrodes labors par lectropolymrisation balayage cyclique sur une lectrode de
platine (diam. 1.6 mm).
II.3.1.6 Rponse du biocapteur une solution de peroxyde dhydrogne
Le peroxyde dhydrogne est le produit de dcomposition de loxydation du glucose.
Il doit tre dtectable par llectrode de platine un potentiel de 0,65 V/ECS. Afin de vrifier
64
si le film PEDT/GOD permet sa diffusion jusqu llectrode, nous avons procd un essai
de rponse du biocapteur en prsence dune solution de H
2
O
2
.
La figure II.12 montre la rponse anodique de la biolectrode Pt/PEDT/GOD
diffrentes concentrations de peroxyde dhydrogne. La rponse du biocapteur est linaire
pour la dtection des petites quantits de H
2
O
2
(M). Llectro-oxydation du peroxyde
dhydrogne la surface dune lectrode de platine nest possible que si les petites molcules
de H
2
O
2
traversent le biofilm qui recouvre llectrode. En effet, la diffusion de H
2
O
2
gnr
lors de la raction enzymatique vers la surface du platine est un facteur important pour la
sensibilit de llectrode. Dans le cas dune couche enzymatique paisse, les molcules de
H
2
O
2
mettent plus de temps pour atteindre llectrode de platine, ce qui augmente le temps de
rponse du biocapteur. Quand lpaisseur du film diminue, ce phnomne prend moins
dimportance et la part de H
2
O
2
oxyde la surface de llectrode devient plus leve.
y = 0,0727x + 0,1465
R
2
= 0,9972
0
1
2
3
4
0 10 20 30 40 50
Concentration de peroxyde d'hydrogne (M)
D
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n
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c
o
u
r
a
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(
A
/
c
m
)
Figure I I .12 : Courbe dtalonnage du peroxyde dhydrogne avec une biolectrode
Pt/PEDT/GOD. Mesures effectues 0,65 V/ECS et 25C en milieu tampon phosphate 0,01 M
pH 7.
65
II.3.2 Optimisation des conditions de mesure en cellule lectrochimique
La glucose oxydase immobilise dans le PEDT a servi la conception dun capteur
ampromtrique glucose. Il est importante de dfinir des conditions optimales de mesure
lors du fonctionnement du biocapteur de manire obtenir une rproductibilit et une stabilit
maximale des mesures.
II.3.2.1 Influence de la temprature
La vitesse dune raction enzymatique est dpendante de la temprature. Nous avons
fait varier la temprature de la cellule dans un domaine compris entre 15 et 50C afin
dtudier linfluence de la temprature sur lactivit de lenzyme. Lintensit du courant
dlivr par la biolectrode a t tudie en prsence dune solution de glucose 5 mM.
Linfluence de la temprature de la cellule sur la rponse du biocapteur est montre la figure
II.13. Lintensit du courant augmente quand la temprature crot de 15 30C. Nous voyons
que la rponse ampromtrique du biocapteur prsente un maximum dintensit entre 25 et
30C. Au-del de 40C, la dnaturation thermique se produit de manire irrversible. Il est
encore possible dutiliser llectrode 35 ou 37C (temprature normale des fluides
biologiques dans le corps) malgr une sensibilit plus faible. Cependant, nous avons travaill
dans un milieu thermostat 25C afin de prolonger la dure de vie du biocapteur.
II.3.2.2 Influence du pH
Lactivit enzymatique est aussi dpendante des conditions environnementales et
spcialement du pH. Le pH du milieu peut modifier le degr dionisation des acides amins
latraux de la protine, qui peut alors tre anionique, cationique ou zwitterionique. Les
proprits intrinsques de lenzyme au niveau de son pouvoir catalytique et de sa solubilit
pourront tre diffrentes selon le domaine de pH utilis. Lactivit catalytique de la GOD en
solution est maximale pour un pH de 5,6 et sa solubilit minimale est observe autour de son
point isolectrique [96].
Dautre part, loxydation lectrochimique de leau oxygne prsente un mcanisme
faisant intervenir les protons :
66
H
2
O
2
O
2
+ 2 H
+
+ 2 e
-
Le potentiel standard, ainsi que la surtension doxydation du couple O
2
/H
2
O
2
, sont donc
dpendants du pH de la solution danalyse.
0
20
40
60
80
10 20 30 40 50
Temprature (C)
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Figure I I .13 : Influence de la temprature sur la rponse ampromtrique du biocapteur en
prsence de 5 mM de glucose pH 7. Tampon phosphate 0,01 M. Potentiel de mesure 0,65
V/ECS.
Afin dexaminer linfluence de ce paramtre sur la rponse en courant du biocapteur,
nous avons relev les intensits obtenues avec une concentration de glucose de 5 mM pour
des pH de la solution danalyse compris entre 5 et 8 (figure II.14). Lors de cette exprience, le
pH du milieu a t ajust par lutilisation du systme H
2
PO
4
-
/HPO
4
2-
.
La rponse en courant du biocapteur glucose est maximale pour un pH gal 7.
Nous observons un dplacement du pH optimum vers des valeurs plus alcalines par rapport
67
la valeur optimale de 5,6 en solution. Dans la suite de ce travail, toutes les mesures seront
ralises en milieu tampon phosphate pH 7.
0
20
40
60
80
4 5 6 7 8
pH
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)
Figure I I .14 : Influence du pH sur la rponse en courant dune biolectrode Pt/PEDT/GOD,
une concentration de glucose de 5 mM. Mesures effectues 0,65 V/ECS et 25C en milieu
tampon phosphate 0,01 M.
II.3.2.3 Influence de la concentration de la solution tampon
Nous avons procd ltude de llectrode diffrentes concentrations du milieu
tampon phosphate. A la valeur du pH de mesure, la GOD est globalement anionique et une
variation de la force ionique du milieu peut induire des modifications de charge sur la
structure de la biomolcule immobilise.
Les rsultats exposs dans la figure II.15 montrent une meilleure rponse du
biocapteur pour une concentration du sel de 0,01 M. La diminution de la sensibilit observe
la concentration de 0,005 M peut provenir dune moins bonne conductivit de llectrolyte. A
68
une concentration trs leve du sel support, lexistence dinteractions lectrostatiques entre le
polymre et lenzyme peut rduire lactivit de lenzyme. Ce phnomne a t dcrit par
dautres auteurs [90]. Nous avons donc opt pour un tampon phosphate de concentration 0,01
M pH 7 pour la suite des travaux exprimentaux. Nous avons ajout une concentration de 100
mM de KCl pour reproduire la concentration en lectrolyte du milieu cellulaire interne dans le
corps (tampon Dulbecco).
5
10
15
20
25
30
35
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Concentration de la solution tampon (M)
R
p
o
n
s
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(
A
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c
m
)
Figure I I .15 : Influence de la concentration de la solution tampon du milieu danalyse sur la
rponse dune biolectrode Pt/PEDT/GOD. Conditions opratoires : concentration du
glucose 2 mM, tampon phosphate pH 7, potentiel de mesure 0,65 V/ECS ; temprature 25C.
II.3.2.4 Influence de la concentration en oxygne du milieu danalyse
Ltape limitante de la raction enzymatique de loxydation du glucose est la
rgnration de la glucose oxydase par loxygne. Ce phnomne a t observ dans le cas
69
dune biolectrode base sur limmobilisation de la glucose oxydase dans un film de
poly(phnol) [65], ainsi quavec une biolectrode base sur limmobilisation de la glucose
oxydase dans un film de poly(pyrrole) driv [22].
Le PEDT est un bon conducteur lectronique et nous lavons choisi dans le but
dexaminer la possibilit dun transfert direct dlectrons entre le polymre et le site actif de
lenzyme. Pour vrifier la probable connexion lectrique de la GOD llectrode travers les
groupes thiophne du PEDT, nous avons essay la rponse du biocapteur dans un milieu sans
oxygne (Figure II.16 A et B)
Avant de procder la ralisation des mesures, nous avons laiss le systme sous une
atmosphre dargon pendant 20 minutes (figure II.16 A) et 60 minutes (figure II.16 B).
Les rsultats montrent que la connexion lectrique de la protine via le PEDT est
difficile, ce qui donne des rponses faibles et peu stables.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0 5 10 15 20 25
Concentration du glucose (mM)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
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u
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a
n
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(
A
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c
m
)
Argon: 20 minutes
Argon: 60 minutes
Figure I I .16 : Courbe de rponse dune biolectrode Pt/PEDT/GOD sous atmosphre
dargon. Mesures effectues 0,65 V/ECS et 25C en milieu tampon phosphate 0,01 M
pH 7 dsoxygn et agit mcaniquement. Le systme est mis sous atmosphre dargon
pendant 20 min. (A) et 60 min. (B) avant de commencer les expriences.
70
II.3.2.5 Choix du potentiel de mesure
Loxydation du glucose catalyse par la glucose oxydase conduit la formation de
peroxyde dhydrogne qui peut tre oxyd lectrochimiquement la surface dune lectrode
mtallique. Lintensit du courant mis est directement proportionnelle la concentration en
glucose prsente en solution.
H
2
O
2
2 H
+
+ 2 e
-
+ O
2
Cest ce mode de dtection ampromtrique que nous utiliserons dans la suite de ce
travail. Le potentiel de mesure a t choisi de faon tre le moins anodique possible afin de
diminuer la sensibilit du biocapteur aux autres espces interfrentes lectro-oxydables. La
rponse en courant du biocapteur pour une concentration en glucose de 5 mM a t mesure
pour des valeurs de potentiel comprises entre + 0,2 et + 0,9 V/ECS. Comme le montre la
Figure II.17, le courant augmente avec le potentiel de 0,2 0,7 V/ECS, puis il diminue
lgrement jusqu 0,9 V/ECS. Nous nous placerons 0,65 V/ECS afin dobtenir une rponse
sensible et reproductible. Il nest pas souhaitable de travailler des potentiels trop levs du
fait dune diminution probable de la slectivit de la dtection ampromtrique par lectro-
oxydation despces interfrentes prsentes dans des fluides biologiques, tels que lacide
urique ou lacide ascorbique.
+ 0,7 V
71
0
10
20
30
40
50
60
100 300 500 700
Potentiel (mV)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
Figure I I .17 : Influence du potentiel de mesure sur la rponse en courant dun biocapteur
Pt/PEDT/GOD pour 2 mM de glucose. Mesures 25C en milieu tampon phosphate 0,01 M
pH 7.
II.3.2.6 Rponse et courbe dtalonnage dune biolectrode Pt/PEDT/GOD
Dans les conditions de mesures optimales prcdemment tablies, nous allons
examiner plus en dtail la rponse du biocapteur.
La figure II.18 prsente la rponse ampromtrique caractristique dun biocapteur
Pt/PEDT/GOD. Chaque saut correspond des ajouts successifs de glucose jusqu obtenir des
concentrations cumules de substrat de 0,1 20 mM. Nous constatons que les rponses
obtenues sont stables. Si nous examinons plus prcisment le temps de rponse de ce
biocapteur, nous constatons que pour obtenir 90 % de la rponse totale, celui-ci est de
5 secondes environ. En fait, un temps de 15 secondes est ncessaire pour obtenir une rponse
stable un ajout de glucose en solution.
72
Figure I I .18 : Rponse du biocapteur Pt/PEDT/GOD des incrments successifs en glucose
de la solution danalyse jusqu obtenir des concentrations finales de 0,1 ; 0,2 ; 0,5 ; 1 ; 2 ;
5 ; 10 et 20 mM. Surface active : 0,02 cm
2
. Mesures effectues 0,65 V/ECS et 25C en
milieu tampon phosphate 0,01 M pH 7.
La figure II.19 reprsente la courbe dtalonnage du biocapteur Pt/PEDT/GOD. Cette
courbe prsente une partie linaire comprise entre 0,2 et 8 mM de glucose pour laquelle la
rponse en courant est proportionnelle la concentration du glucose. La sensibilit qui
correspond la pente de cette partie linaire est de 15,2 mA.M
-1
.cm
-2
. La saturation est
obtenue pour une concentration en glucose de 30 mM. La forme de la courbe de calibration
est semblable celle dune courbe dcrivant une catalyse enzymatique de type Michaelis-
Menten. Bartlett et Wihitaker [22] ont montr que cette limitation de la rponse du biocapteur
pour des fortes concentrations en glucose peut tre attribue, soit la saturation des sites
actifs de la protine, soit la raction limite de loxygne molculaire avec lenzyme.
0
1
2
3
1300 1800 2300 2800
Temps (secondes)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
0,05 mM
0,1 mM
0,2 mM
0,5 mM
1 mM
2 mM
5 mM
10 mM
20 mM
30 mM
73
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 5 10 15 20 25 30 35
Glucose (mM)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
y = 14,109x + 4,6851
R
2
= 0,9917
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8
Glucose (mM)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
Figure I I .19 : Courbe dtalonnage dune biolectrode Pt/PEDT/GOD. Mesures effectues
0,65 V/ECS et 25 C en milieu tampon phosphate 0,01 M pH 7.
La modlisation de la rponse du biocapteur a t ralise laide de la reprsentation
de Lineweaver-Burk (voir chapitre I). Elle permet daccder aux paramtres K
m
app
et I
max
qui
ne sont pas spcifiques de lenzyme immobilise mais plutt de lensemble de la
biomembrane. La figure II.20 prsente la linarisation de la courbe dtalonnage. La valeur du
K
m
app
dtermine partir de la figure II.19 est de 7 mM. Cette valeur est infrieure celle du
K
m
de lenzyme en solution : 33 mM [96]. Cet abaissement du K
m
sous leffet de
limmobilisation a dj t observ par dautres auteurs pour dautres systmes enzymatiques
[97].
74
y = 2,1787x + 0,0648
R
2
= 0,9877
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10 12
1/Concentration du glucose (1/mM)
1
/
C
o
u
r
a
n
t
(
1
/
A
)
0
0.3
0.6
0.9
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
1/mM
1
/
A
Figure I I .20 : Reprsentation selon Lineweaver-Burk de la courbe de calibration de la
figure II.19.
II.3.2.7 Reproductibilit de la ralisation du biocapteur
La reproductibilit du biocapteur pour les dosages de substrat a t tudie pour douze
lectrodes de mme type, mais prpares sparment. Les capteurs ont t raliss en srie, en
respectant soigneusement les mmes conditions dimmobilisation.
La figure II.21 prsente lintensit de la rponse ampromtrique de 9 lectrodes
Pt/PEDT/GOD trois concentrations diffrentes de glucose : 0,05, 1 et 5 mM.
75
0
500
1000
1500
2000
2500
0,05 1 5
Concentration du glucose (mM)
C
o
u
r
a
n
t
(
n
A
)
Figure I I .21 : Reproductibilit de la rponse du biocapteur Pt/PEDT/GOD obtenue avec 9
lectrodes prpares sparment et pour trois concentrations diffrentes de glucose.
Conditions opratoires : 0,65 V/ECS, 25C, tampon phosphate 0,01 M pH 7.
Les rsultats obtenus sont prsents dans le tableau II.1. La mthode de prparation du
biocapteur prsente une reproductibilit assez intressante si nous considrons que les
lectrodes ont t prpares partir de diffrentes solutions dlectropolymrisation et sur une
priode de trois semaines. Les carts entre les valeurs pourraient provenir dune variation du
dpt de lenzyme lors de llectropolymrisation. La reproductibilit de la rponse dune
mme lectrode est caractrise par une variation de 8,5 % obtenue sur 12 mesures
conscutives pour 5 mM de glucose.
76
Tableau I I .1 : Rsultats statistiques obtenus de ltude de la reproductibilit de la
prparation de llectrode Pt/PEDT/GOD. Pour lintervalle de confiance, nous utilisons un
niveau de confiance de 95 %, cest--dire = 0,05.
Concentration du glucose (mM)
0,05 1 5
INTERVALLE
CONFIANCE [nA]
24,1 5,3 408,1 98,7 2151 519
VARIATION [%] 22 24 24
II.3.2.8 Dure de vie et stabilit des biolectrodes Pt/PEDT/GOD
Les biocapteurs sont labors afin dtre utiliss comme outils analytiques dans divers
domaines, tels que le biomdical, le contrle de lenvironnement, ou lagroalimentaire. Donc,
la frquence des mesures, ou la manire dont sont utilises ces sondes dpend de lapplication
envisage. Ainsi, elles peuvent tre utilises, soit en continu, soit dans le cadre de tests
nombreux et rapprochs, ou encore pour un usage unique. Donc, dans ce contexte la dure de
vie et la stabilit des biolectrodes apparaissent comme lun des lments cls de leur
application grande chelle. Dans cette optique, on compare le comportement des
biolectrodes sous deux conditions diffrentes :
1- En utilisation frquente, on effectue une mesure de la rponse tous les jours.
2- En conservation longue dure, on effectue la mesure de rponse une fois par mois.
a Stabilit des biolectrodes en utilisation frquente
La stabilit de llectrode en fonction du temps a t mesure priodiquement. Nous
avons appliqu un usage intermdiaire entre le stockage de llectrode basse temprature et
son utilisation en continu. Aprs la prparation de llectrode, nous lavons utilise pendant 4
heures par jour durant une priode de 30 jours avec des concentrations diffrentes en glucose.
Entre ces manipulations et aprs cette priode, le capteur a t conserv dans le tampon
77
phosphate 4C. La figure II.22 prsente lvolution de la rponse du capteur en fonction du
temps.
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20 25 30
Temps (jours)
R
p
o
n
s
e
r
e
l
a
t
i
v
e
(
%
)
Figure I I .22 : Evolution de la rponse ampromtrique du biocapteur (rponse relative
rapporte la rponse maximale) en fonction du temps dutilisation du biocapteur. Mesures
effectues 0,65 V/ECS et 25C en milieu tampon phosphate 0,01 M pH 7
Au bout de 30 jours, nous avons observ une diminution de la rponse
ampromtrique et nous avons obtenu une rponse rsiduelle de 40 % par rapport la rponse
maximale du biocapteur. La diminution de lactivit peut sexpliquer par la dnaturation de
lenzyme proprement dite, par une altration mcanique de la biomembrane ou par la
dnaturation de lenzyme comme consquence du changement de milieu entre chaque
exprience.
78
b Stabilit des biolectrodes laisses en conservation
Dans cette tude, nous avons tudi la stabilit de llectrode pendant le stockage
une temprature de 4C dans une solution tampon phosphate pH 7. La figure II.23 prsente
lvolution de la rponse en courant au cours du temps pour des biolectrodes Pt/PEDT/GOD.
Le biocapteur labor pour cette exprience a t test vis--vis de sa rponse au
glucose (5 mM) immdiatement aprs laboration, puis toutes les quatre semaines. Le
biocapteur prsente une trs bonne rponse aprs 4 mois de stockage. Nous avons obtenu une
rponse rsiduelle de 76 % de la rponse maximale.
0
25
50
75
100
0 1 2 3 4 5
Temps (mois)
R
p
o
n
s
e
r
e
l
a
t
i
v
e
(
%
)
Figure I I .23: Evolution de la rponse 5 mM de glucose en fonction de la dure de stockage
pour le biocapteur Pt/PEDT/GOD stock 4C. Mesures effectues 0,65 V/ECS et 25C en
milieu tampon phosphate 0,01 M pH 7.
79
II.4 CONCLUSION
Tout au long de ce chapitre, nous avons prsent loptimisation dune lectrode
enzymatique pour la dtection du glucose.
Llaboration du biocapteur est base sur llectropolymrisation de films denzyme et
de 3,4-thylnedioxythiophne (EDT). Cette mthode prsente une trs grande facilit de
mise en uvre et permet de concevoir des biocapteurs avec des rponses sensibles et rapides.
Nous avons analys tous les paramtres pouvant agir, dans la pratique, sur le comportement
de lenzyme immobilise : le pH, les concentrations du substrat, du tampon phosphate, la
temprature. Cette analyse nous a permis de dterminer les conditions opratoires optimales
dutilisation de llectrode, notamment pour son intgration dans un systme de mesure en
flux continu.
Ces travaux effectus sur les capteurs glucose ont montr une trs bonne faisabilit
et aussi une bonne reproductibilit des biolectrodes. Malgr une faible quantit de lenzyme
pige la sensibilit est de 15,2 mA.M
-1
.cm
-2
, la limite de dtection de 40 M, tandis que le
domaine de linarit stend entre 0,2 et 8 mM.
Nous avons analys la possibilit dutiliser ce polymre conducteur pour effectuer la
connexion lectrique directe entre llectrode et le site actif de la GOD de faon rgnrer
lenzyme en labsence doxygne. Dans ce contexte, on na pas pu saffranchir des problmes
de connexion lectrique. Cependant ce polymre constitue un outil performant utiliser
comme support pour limmobilisation denzymes.
CHAPITRE III : REDUCTION DES INTERFERENCES LORS
DE LA DETECTION DU GLUCOSE. APPLICATION DU
SYSTEME BIOCAPTEUR-FIA POUR LE DOSAGE DU
GLUCOSE EN MILIEU BIOLOGIQUE
81
III.1 INTRODUCTION
Lune des applications potentielles des biocapteurs glucose est le suivi des
concentrations en glucose dans le corps humain. Plus particulirement, lintrt principal est
li lvolution du taux du glucose dans le sang pour le traitement des diabtiques.
Cependant, les fluides biologiques sont constitus dun mlange de molcules dont certaines
peuvent induire un courant parasite lors de la dtection ampromtrique du glucose. La
dtection ampromtrique du peroxyde dhydrogne est trs sensible mais peu slective du
fait du potentiel trs lev ncessaire son lectro-oxydation. On peut concevoir que certaines
molcules prsentes dans le sang puissent tre oxydes directement llectrode.
Lintgration des biocapteurs dans les systmes automatiss permet la conduite des
diffrentes tapes de dosage, sans intervention manuelle. Lanalyse par FIA prsente
lavantage de travailler sur de faibles volumes dchantillon, avec une vitesse limite
seulement par le temps de rponse du biocapteur. Le systme offre la possibilit de faire
successivement ltalonnage, le dosage et le lavage du capteur. Ainsi, la technique FIA est
couple avec llectrode glucose oxydase pour le dosage du glucose dans le sang [1].
Dans la premire partie de ce chapitre, nous allons utiliser deux stratgies visant
augmenter la slectivit de la biodtection. La premire utilise les proprits
lectrocatalytiques de microparticules de platine dposes sur la surface de llectrode de
manire dtecter plus efficacement le peroxyde dhydrogne. La deuxime exploite les
proprits des mdiateurs rdox co-immobiliss avec lenzyme pour assurer la connexion
lectrique des enzymes avec les lectrodes.
Lintrt des travaux prsents dans la deuxime partie du chapitre rside dans
lexploitation des proprits de llectrode glucose oxydase mise au point, notamment de
son temps de rponse trs rapide, en vue de lintgrer dans le systme FIA dune faon
performante, simple et fiable.
82
III.2 ETUDES DES ESPECES INTERFERENTES
III.2.1 Interfrences des espces lectrochimiques
Par leur spcificit, intrinsque lenzyme immobilise, et leur sensibilit, les
biocapteurs Pt/PEDT/GOD constituent des outils analytiques intressants pour le dosage du
glucose.
La finalit dun biocapteur glucose est de mesurer de faon trs slective la
concentration de ce substrat dans des fluides biologiques. Lutilisation de la glucose oxydase
permet de catalyser slectivement loxydation du glucose en gluconolactone et en eau
oxygne. Or, au potentiel doxydation de leau oxygne ( 0,5 V/ECS sur lectrode de
platine et 0,8 V/ECS sur lectrode de carbone), certaines espces prsentes dans les fluides
biologiques sont susceptibles dtre oxydes. Cette lectroactivit se traduit par lapparition
dun courant parasite perturbant la mesure.
Les interfrents lectrochimiques de la dtection du glucose pour des capteurs bass sur
l'lectro-oxydation de l'eau oxygne peuvent tre :
interfrents endognes : catcholamine, tyrosine, L-cystine, glutathion,
thymol, acide urique, NADH, acide ascorbique, hparine.
I nterfrents exognes : paractamol, acide actylsalicylique, catchol, acide
ascorbique, hparine.
Lors des tests de slectivit des biocapteurs glucose, trois interfrents modles sont
gnralement considrs. Parmi eux, deux sont endognes par nature, il sagit de lacide
urique et de lacide ascorbique (ce dernier pouvant cependant tre absorb lors dun
traitement mdical) et le dernier est exogne : le 4-actaminophne, plus connu sous le nom
de paractamol. Il faut noter que les acides ascorbique et urique sont dtects sous leur forme
anionique : lascorbate et lurate. La structure chimique de ces trois composs est reprsente
dans le tableau III.1
83
Tableau I I I .1 : Structure chimique des composs interfrents lectrochimiques dans la
dtection du glucose.
III.2.2 Optimisation de la dtection lectrochimique du peroxyde dhydrogne
La dtection du peroxyde dhydrogne, produit de la raction enzymatique, intervient
un potentiel relativement lev (>0,5 V) auquel lacide ascorbique, lacide urique et le
paractamol sont galement oxyds (autant sur platine que sur carbone). De manire
diminuer le courant parasite d aux interfrents, une des solutions envisager est la
diminution de la surtension dlectro-oxydation de leau oxygne, soit par lutilisation dun
compos rdox chimiquement oxydable afin de servir de relais dlectrons entre leau
oxygne et la surface de llectrode, soit par lutilisation de microparticules de mtaux
nobles qui modifient la surface de llectrode permettant une augmentation de lactivit
catalytique vis--vis de loxydation de leau oxygne.
Wang et col. [98] montrent la dtection slective du peroxyde dhydrogne un
potentiel faible (0-0,2 V/ECS) due lactivit catalytique de particules de ruthnium utilises
84
dans la fabrication dlectrodes imprimes destines la dtection du glucose et thanol. Li et
col. [99] et Zhang et col. [81] ont propos lutilisation dlectrodes platines pour
llaboration dun biocapteur sensible au glucose qui permet de diminuer linfluence des
interfrents lectro-oxydables. Un travail rcent de Daly et coll. [100] montre les avantages de
la technique du dpt simultan de microparticules de mtaux nobles (ruthnium, rhodium et
platine) dans llaboration des biocapteurs ampromtriques glucose. La rponse leau
oxygne, + 0,1 V, a t 200 fois plus leve que celle des interfrents ventuels.
Dautres auteurs [99, 101-103;] ont aussi dcrit une augmentation de la sensibilit
bas potentiel des biocapteurs exploitant cette technique.
III.2.3 Mdiateurs rdox pour la connexion lectrique
Les biocapteurs ampromtriques qui utilisent une enzyme oxydase pour dcomposer
un substrat travers une raction doxydation sont nombreux. Normalement, cest loxygne,
laccepteur naturel dlectrons utilis par les oxydases :
Glucose + GOD(FAD) + H
2
O Acide gluconique + GOD(FADH
2
)
GOD(FADH
2
) + O
2
GOD(FAD) + H
2
O
2
Finalement, le peroxyde dhydrogne est oxyd sur llectrode de platine :
H
2
O
2
2 H
+
+ O
2
+ 2 e
-
Pour remplacer loxygne, de nombreux travaux ont t mens sur des accepteurs dlectrons
non physiologiques, appels mdiateurs rdox. Ils ont utilis, pour ltude lectrochimique,
des systmes rdox biologiques [104]. Ceux-ci peuvent tre immobiliss, soit sur la surface de
llectrode, soit dans la couche enzymatique par des mthodes de greffage courantes :
adsorption, liaison covalente, lectropolymrisation, etc Pour amener le complexe enzyme
rduite-cofacteur vers une r-oxydation, il est possible dutiliser un accepteur dlectrons
assurant le transport dlectrons entre le site catalytique et llectrode :
Glucose + GOD(FAD) + H
2
O Acide gluconique + GOD(FADH
2
)
GOD(FADH
2
) + M
ox
GOD(FAD) + M
red
+ 2 H
+
85
Finalement, sur llectrode :
M
red
M
ox
Lutilisation des mdiateurs rdox dans la prparation de biocapteurs ampromtriques
permet de diminuer le potentiel de mesure. Cela peut rduire linterfrence des espces
trouves gnralement dans les milieux biologiques. Si la quantit de mdiateur fixe dans la
couche enzymatique est suffisante pour obtenir un biocapteur capable de rgnrer le
cofacteur et avec une sensibilit acceptable, on vite le problme des biocapteurs dpendant
de loxygne dont les variations de concentration peuvent altrer les caractristiques de la
rponse.
Pour slectionner le mdiateur le plus appropri, on utilise des techniques
lectrochimiques comme la voltampromtrie cyclique qui fournit des informations
lectrochimiques importantes sur le mdiateur tudi. En gnral, il est prfrable dutiliser
un mdiateur avec un potentiel doxydation bas et une constante de vitesse leve pour
sassurer plus tard que la rponse du biocapteur ne sera pas limite par la cintique de
llectrode [105]. En rsum, pour arriver un bon fonctionnement du mdiateur, celui-ci doit
respecter les contraintes suivantes :
* Couple rdox rversible
* Raction rapide avec lenzyme rduite
* Stabilit des formes oxyde et rduite
* Non ractif avec loxygne
* Faible potentiel de rgnration de la forme oxyde du mdiateur
* Non toxicit du compos pour des applications in vivo
De nombreux travaux ont t mens sur les mdiateurs rdox. Les composs les plus
couramment utiliss sont le ferrocne et ses drivs. Nakabayashi et coll. [70] ont incorpor le
ferrocne dans une pte de carbone pour la fabrication dun biocapteur glucose et ont russi
minimiser les courants parasites apports par lacide urique et lacide ascorbique. Ce
mdiateur rdox a par ailleurs t fonctionnalis de manire tre incorpor dans le Nafion
[106]. Vidal et col. [107] ont utilis un driv du ferrocne pig dans un film de polypyrrole
sur une lectrode de platine platin pour amliorer la slectivit et la sensibilit dun
86
biocapteur cholestrol. Les proprits rdox des colorants comme le bleu de Prusse ont aussi
t utilises pour la fabrication des biocapteurs glucose [108].
Dautres mdiateurs comme le ttracyanoquinodimthane (TCNQ) [109, 110],
ttrathiafulvalne (TTF) [111], bleu de mthylne [112], 2,6-dichlorophnolindophnol [112],
p-benzoquinone [113] ont t aussi incorpors dans une pte de carbone pour amliorer la
slectivit des biocapteurs.
Les quinones sont aussi utilises pour la connexion lectrique de la GOD llectrode.
Becerik [114] a utilis une benzoquinone pige dans un film de polypyrrole.
Serra et col. [115] ont dcrit un matriel composite (tflon/graphite/ferrocne) pour la
dtermination du L-lactate. Milagres et col. [116] ont utilis lhexacyanoferrate dans
llaboration dun biocapteur pour la dtection du salicylate.
87
III.2.4 Matriels et mthodes
III.2.4.1 Ractifs
La 1,4-benzoquinone, lacide urique, lacide L-ascorbique, le 4-actamidophnol
(paractamol) et lacide chloroplatin (H
2
PtCl
6
, 6H
2
O) sont fournis par SIGMA.
Le srum synthtique ACCUTROL
TM
normal et ACCUTROL
TM
abnormal sont
fournis par SIGMA DIAGNOSTICS.
Les autres ractifs utiliss ont dj t dcrits dans la partie exprimentale du
chapitre II.
III.2.4.2 Mthodes
a Platinisation des lectrodes
Pour cette mthode nous avons utilis une solution de H
2
PtCl
6
2 mM dans une solution
de HCl 0,1 M. Llectrodposition de microparticules de Pt sur les lectrodes est effectue
un potentiel de 0,3 V/ECS pendant 10 minutes. Les lectrodes sont ensuite rinces dans
leau dsionise.
b Prparation des biolectrodes Pt/PEDT/GOD/BQ
Les biolectrodes Pt/PEDT/GOD/BQ sont obtenues de la mme faon que celle
prsente dans la section II.2.3.1. Nous avons ajout la solution dlectropolymrisation
5 mM de la benzoquinone (BQ). Les conditions dlectropolymrisation ont dj t dcrites
dans le mme paragraphe.
88
III.2.5 Rsultats et discussion
III.2.5.1 Rponse des biolectrodes Pt/PEDT/GOD aux interfrents lectro-oxydables
Dans un premier temps, ltude de la rponse de trois interfrents (ascorbate, urate et
paractamol) sur une lectrode de platine nue a t effectue (figure III.1).
0
20
40
60
80
100
120
0 200 400 600
Concentration (M)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
AA
H2O2
AU
P
Figure I I I .1 : Courbe dtalonnage du peroxyde dhydrogne (H
2
O
2
), de lacide ascorbique
(AA), de lacide urique (AU) et du paractamol (P) sur une lectrode Pt nue. Mesures
effectues 0,65 V/ECS et 25C en milieu tampon phosphate 0,01 M pH 7.
Les interfrents considrs sont lectroactifs au potentiel de dtection du peroxyde
dhydrogne. Leur rponse est compare celle observe en prsence de concentrations
gales de peroxyde dhydrogne.
89
Ltude de linfluence des interfrents sur la rponse du biocapteur glucose a t
effectue par le trac de la courbe dtalonnage dune biolectrode en prsence (200M
durate et de paractamol et 400 M dascorbate) et en labsence dinterfrents.
Les figures III.2, III.3 et III.4 montrent quen prsence des composs lectro-oxydables, les
courants mesurs dans tout le domaine de concentration du glucose sont plus levs quen
leur absence. Le paralllisme des courbes indique que ce phnomne est indpendant de la
concentration du glucose et que le mcanisme dinterfrence mis en jeu serait lectrochimique
plutt quenzymatique. Cependant, Lowry et coll. [73] ont observ une diminution de la
rponse en prsence dascorbate dans le cas dun biocapteur labor par immobilisation de la
glucose oxydase dans une matrice de poly(phnylnediamine). Ils ont attribu cette altration
de la rponse du capteur une consommation du peroxyde dhydrogne engendre par
loxydation de lascorbate par H
2
O
2
. Palmisano et Zambonin [117] suggrent que la
diminution et linstabilit de la rponse du biocapteur au glucose en prsence dascorbate sont
dues une passivation de llectrode cause par les produits doxydation de lascorbate.
0
20
40
60
80
100
120
140
0 5 10 15 20 25
Concentration du glucose (mM)
R
p
o
n
s
e
r
e
l
a
t
i
v
e
(
%
)
Glucose
Glucose + 200 M P
Figure I I I .2 : Rponse du biocapteur Pt/PEDT/GOD au glucose en labsence ( ) et en
prsence ( ) de 200 M de paractamol. Mesures effectues 0,65 V/ECS et 25C en milieu
tampon phosphate 0,01 M, pH 7.
90
0
40
80
120
160
200
0 5 10 15 20 25
Concentration du glucose (mM)
R
p
o
n
s
e
r
e
l
a
t
i
v
e
(
%
)
Glucose
Glucose + 400 M AA
Figure I I I .3 : Rponse du biocapteur Pt/PEDT/GOD au glucose en labsence ( ) et en
prsence ( ) de 400 M dacide ascorbique. Mesures effectues 0,65 V/ECS et 25C en
milieu tampon phosphate 0,01 M, pH 7.
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25
Concentration du glucose (mM)
R
p
o
n
s
e
r
e
l
a
t
i
v
e
(
%
)
Glucose
Glucose + 200 M AU
Figure I I I .4 : Rponse du biocapteur Pt/PEDT/GOD au glucose en labsence ( ) et en
prsence ( ) de 200 M dacide urique. Mesures effectues 0,65 V/ECS et 25C en milieu
tampon phosphate 0,01 M, pH 7.
91
Enfin, nous avons pris comme modle lacide ascorbique pour tester la slectivit du biofilm
et nous avons compar la rponse du biocapteur au peroxyde dhydrogne et lacide
ascorbique pour une mme concentration finale (1 mM). Les rsultats obtenus ont t
compars avec ceux dune lectrode de platine nue (tableau III.2). Nous avons observ quen
effet, la slectivit des molcules denzyme nest pas suffisante pour lever linterfrence de
certaines molcules lectro-actives qui sont dtectes directement par le transducteur
ampromtrique. Les courants recueillis sont, en comparaison, plus faibles en prsence de la
couche enzymatique car celle-ci freine laccs de ces molcules vers llectrode. Le
phnomne est plus marqu pour lacide ascorbique qui est de taille plus encombrante que
H
2
O
2
.
Tableau I I I .2 : Comparaison des courants obtenus avec une lectrode de platine nue et une
lectrode de Pt modifie. Mesures effectues 0,65 V/ECS et 25C en milieu tampon
phosphate 0,01 M, pH 7 qui contient 1 mM de peroxyde dhydrogne ou dacide ascorbique.
Electrode I
H2O2
(A)
I
AA
(A)
I
H2O2
/I
AA
Pt 3,1 4,8 0,6
Pt/PEDT/GOD 2,6 1,4 1,8
III.2.5.2 Rponse des lectrodes Pt/PEDT/GOD aux espces interfrentes
Afin dvaluer linfluence des espces interfrentes sur la rponse au glucose de nos
biocapteurs Pt/PEDT/GOD, ltude de la rponse aux trois interfrents modles cits ci-
dessus a t effectue. Les concentrations utilises pour les diffrentes espces sont les
suivantes : 5 mM de glucose, 400 M dascorbate, 200 M de paractamol, 200 M durate.
Ces valeurs respectent les proportions interfrent/glucose que lon peut rencontrer dans des
chantillons de sang. Les rsultats sont prsents sur la figure III.5.
92
Nous observons que la rponse des trois interfrents reprsente un pourcentage important de
la rponse au glucose (80 % pour lacide ascorbique, 50 % pour lacide urique et 39 % pour le
paractamol), ce qui est considrable pour les dosages dans des milieux biologiques.
0
20
40
60
80
100
R
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%
)
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a
m
o
l
Figure I I I .5 : Rponses relatives dans les conditions dutilisation possibles du biocapteur en
milieu biologique du glucose (5 mM), de lascorbate (400 M), du paractamol (200 M) et
de lurate (200 M) pour une lectrode Pt/PEDT/GOD. Mesures effectues 0,65 V/ECS et
25C en milieu tampon phosphate 0,01 M pH 7.
Il est donc primordial de travailler un potentiel conduisant une rponse optimale
des biolectrodes au glucose tout en minimisant les courants interfrents. Pour cette
exprience, nous avons tudi la rponse en courant des biolectrodes Pt/PEDT/GOD au
glucose et aux interfrents 0,4 V/ECS. La figure III.6 montre que la rponse des interfrents
diminue quand le potentiel passe de 0,65 0,4 V/ECS (75 % pour lacide ascorbique, 45 %
pour lacide urique et 21 % pour le paractamol). Cependant 0,4 V/ECS, nous observons
une perte de rponse en courant au glucose de 20 % par rapport la rponse 0,65 V/ECS.
93
Il savre donc que le biocapteur ainsi ralis nest pas bien adapt aux mesures des
chantillons rels contenant les espces interfrentes essayes. Une amlioration du
biocapteur est donc ncessaire afin daugmenter la slectivit du dosage.
Figure I I I .6 : Rponses relatives au glucose 0,65 V (5 mM), de lascorbate (400 M), du
paractamol (200 M) et de lurate (200 M) pour une lectrode Pt/PEDT/GOD. Mesures
effectues 0,65 V/ECS et 0,4 V/ECS ; 25C en milieu tampon phosphate 0,01 M, pH 7.
III.2.5.3 Platinisation des lectrodes
Dans cette optique, nous avons choisi de mettre profit les proprits
lectrocatalytiques de microparticules de mtaux nobles. Dans une premire tape, nous avons
procd llectrodposition du platine sur une lectrode de platine partir dune solution
contenant un sel mtallique prcurseur. Dans une deuxime tape, nous avons immobilis
lenzyme comme nous lavons dj dcrit dans le chapitre 2. Les biolectrodes ainsi labores
ont montr de meilleures caractristiques analytiques.
0
20
40
60
80
100
R
p
o
n
s
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r
e
l
a
t
i
v
e
(
%
)
glucose acide
ascorbique
acide urique paractamol
0,65 V
0,4 V
100
80
75
50
45
39
21
94
Aprs avoir prpar les lectrodes, nous avons valu les caractristiques du
biocapteur afin de les comparer avec les biolectrodes non platines (Pt/PEDT/GOD). La
figure III.7 prsente les courbes dtalonnage des biolectrodes platines Pt(Pt)/PEDT/GOD
0,65 et 0,3 V/ECS. Un rsum des caractristiques analytiques est prsent dans le
tableau III.3.
0
100
200
300
400
500
0 5 10 15 20 25 30
Concentration du glucose (mM)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
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u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
lectrode platine / 0,65 V
lectrode platine / 0,3 V
lectrode non platine / 0,65 V
Figure I I I .7 : Courbe dtalonnage des biolectrodes platines Pt(Pt)/PEDT/GOD ( )
0,65V/ECS et ( ) 0,3 V/ECS et des biolectrodes non platines Pt/PEDT/GOD ( )
0,65V/ECS. Mesures effectues 25C en milieu tampon phosphate 0,01 M, pH 7.
95
Tableau I I I .3 : Caractristiques des biolectrodes Pt/PEDT/GOD et Pt(Pt)/PEDT/GOD.
Mesures effectues 25C en milieu tampon phosphate 0,01 M, pH 7
Biolectrode Potentiel de mesure
(V)
Sensibilit de la partie
linaire
(mA.M
-1
.cm
-2
)
Domaine de linarit
(mM)
Pt/PEDT/GOD 0,65 15,2 0,2-8
Pt(Pt)/PEDT/GOD 0,65 44,2 0-8
Pt(Pt)/PEDT/GOD 0,30 42,3 0-8
Par rapport une lectrode non platine, la sensibilit est plus leve pour les
biocapteurs labors sur une surface platine. Llectrodposition de platine a pour effet
daugmenter la sensibilit des biolectrodes Pt/PEDT/GOD denviron 100 %. Ce phnomne
a dj t observ par Blanger et coll. [118]. Ils ont montr que linclusion de platine dans un
biofilm polypyrrole/GOD permet daugmenter la sensibilit des biocapteurs denviron 40 %.
Le fait de pouvoir dtecter le peroxyde dhydrogne un potentiel beaucoup moins
lev devrait permettre de diminuer les courants parasites dus aux interfrents lectro-
oxydables.
Pour tudier ce phnomne, nous nous sommes attachs valuer la rponse des
interfrents lectro-oxydables (ascorbate, urate et paractamol) sur les biolectrodes
Pt(Pt)/PEDT/GOD. Les rsultats sont exposs dans la figure III.8. Les taux dinterfrence de
chacun des composs lectro-oxydables (ascorbate, urate, paractamol) ont t calculs par
rapport la rponse au glucose. Les courants parasites gnrs par loxydation 0,3 V des
interfrents sont infrieurs ceux observs sur llectrode non platine (54 %, 42 % et 2 %
pour lascorbate, lurate et le paractamol respectivement).
En conclusion, la platinisation de llectrode met en vidence leffet catalytique de
particules mtalliques, ce qui permet dutiliser une surtension doxydation plus faible du
peroxyde dhydrogne sur lectrode de platine. De cette faon, nous avons amlior la
sensibilit relative de la dtection du glucose. La rponse cumule auxs trois interfrents (aux
concentrations indiques) reprsente 98% de la rponse du glucose (contre 169% dans le cas
dune biolectrode Pt/PEDT/GOD). Cependant, la slectivit des biocapteurs ainsi labors
96
reste encore un problme rsoudre pour leur applicabilit la dtection du glucose dans les
fluides biologiques.
Pour tester la rponse du biocapteur Pt(Pt)/PEDT/GOD dans un milieu rel, nous
avons utilis du srum synthtique dj dos par la procdure N 17-UV/18-UV
(enzymatique, hexokinase) par Sigma Diagnostics
. Le produit Accutrol
TM
est une
prparation lyophilise, dose contenant des enzymes dorigine humaine, des analytes dans
une base de srum humain. Pour raliser cette exprience, nous avons utilis une prparation
avec des concentrations de glucose comprises dans la gamme des valeurs normales trouves
dans le srum jeun (Accutrol
TM
normal) et une autre prparation avec des concentrations de
glucose leves par rapport la gamme des valeurs normales dans le srum (Accutrol
TM
anormal). Les rsultats sont prsents dans le tableau III.4.
0
20
40
60
80
100
R
p
o
n
s
e
r
e
l
a
t
i
v
e
(
%
)
glucose acide
ascorbique
acide urique paractamol
Pt/PEDT/GOD-0,65 V
Pt(Pt)/PEDT/GOD-0,3 V
Figure I I I .8 : Rponses relatives au glucose (5 mM), de lascorbate (400 M), du
paractamol (200 M) et de lurate (200 M) pour une lectrode Pt/PEDT/GOD et
Pt(Pt)/PEDT/GOD. Mesures effectues 0,65 V/ECS et 0,3 V/ECS ; 25C en milieu
tampon phosphate 0,01 M, pH 7.
97
Tableau I I I .4 : Comparaison des rsultats du dosage de glucose dans le srum, obtenus avec
le biocapteur Pt/PEDT/GOD, le biocapteur Pt(Pt)/PEDT/GOD et la procdure Sigma.
Accutrol
TM
normal
(mM)
Accutrol
TM
anormal
(mM)
Pt/PEDT/GOD
0,65 V
7,3 0,2 36,4 0,9
Pt(Pt)/PEDT/GOD
0,65 V
5,6 0,6 19,0 1,2
Pt(Pt)/PEDT/GOD
0,3 V
4,4 0,5 14,0 0,4
Sigma
(enzymatique, hexokinase)
5,3 1,1 18,9 2,2
Nous pouvons constater que la stratgie de la platinisation contribue se rapprocher de
la valeur obtenue avec une mthode couramment utilise dans les laboratoires danalyses. Les
rsultats plus levs obtenues avec une lectrode non platine pourraient tre dus aux espces
interfrentes prsentes dans lchantillon (acide urique, paractamol et salicylate).
III.2.5.4 Elaboration dun biocapteur Pt/PEDT/GOD/BQ
Dans la continuit de ltude des interfrents, nous avons utilis la benzoquinone
comme mdiateur rdox afin damliorer la slectivit du biocapteur. Le mcanisme
ractionnel propos est le suivant :
Glucose + GOD(FAD) + H
2
O Acide gluconique + GOD(FADH
2
)
GOD(FADH
2
) + Q GOD(FAD) + H
2
Q
H
2
Q Q + 2 H
+
+ 2 e
-
Q et H
2
Q sont les formes oxyde et rduite de la benzoquinone.
98
De manire mettre en vidence la connexion lectrique de lenzyme llectrode via
les molcules de benzoquinone, nous avons effectu une courbe dtalonnage du glucose en
prsence du mdiateur rdox en solution et en milieu anarobie (Figure III.9). Cette
exprience montre la rgnration effective de lenzyme par le mdiateur rdox en labsence
doxygne.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentration du glucose (mM)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
Figure I I I .9 : Courbe dtalonnage tablie en milieu anarobie dune biolectrode
Pt/PEDT/GOD. Concentration de la benzoquinone en solution = 5 10
-4
M. Mesures effectues
0,2 V/ECS ; 25C en milieu tampon phosphate 0,01 M, pH 7, sous atmosphre dargon.
La rtention du mdiateur dans la matrice de polymre permettrait la r-oxydation
lectrochimique du cofacteur de lenzyme et la dtection ampromtrique du glucose.
Le comportement de la biolectrode est mis en vidence par le trac de courbes de
voltampromtrie cyclique en labsence et en prsence de glucose (figure III.10). En prsence
de glucose, la courbe montre une augmentation du courant du pic doxydation du groupement
rdox associe une diminution de lintensit du pic de rduction. Ce phnomne est
99
caractristique dune oxydation catalytique et peut tre reli la rduction de la benzoquinone
par la glucose oxydase ltat rduit. Pourtant le pic doxydation retrouv environ 0,2 V est
dcal par rapport au potentiel formel doxydation plac 0,280 V [104].
Le potentiel doxydation du systme permet la dtection du glucose un potentiel moins
anodique et ainsi amliorer la slectivit dans des conditions relles danalyse.
Figure I I I .10 : Voltamprogrammes en absence (A) et en prsence (B) de glucose (5 mM)
dune biolectrode Pt/PEDT/GOD/BQ. Mesures effectues 10 mV/s et 25 C en milieu
tampon phosphate 0,01 M pH 7.
La figure III.11 prsente la courbe dtalonnage du biocapteur. La biolectrode montre
une augmentation rapide du signal de 0 5 mM et une sensibilit de 800 A. M
-1
.cm
-2
correspondant ce domaine. Le temps de rponse est de 10 secondes. Nous avons utilis ce
biocapteur pour tester les interfrents lectro-oxydables. Les rsultats sont prsents dans la
figure III.12. Llaboration des biolectrodes en utilisant la benzoquinone comme mdiateur
rdox, prsente une sensibilit faible mais permet de rduire assez considrablement
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
-0,7 -0,5 -0,3 -0,1 0,1 0,3 0,5 0,7
Potentiel (V)
C
o
u
r
a
n
t
(
A
)
A
B
100
linterfrence du paractamol. Cependant, le biocapteur noffre aucun avantage en ce qui
concerne lascorbate et lurate. La faible slectivit des biolectrodes peut sexpliquer par une
faible rtention de la benzoquinone dans la matrice polymre ou par une perte du mdiateur
dans ltape dlectropolymrisation. Il serait donc ncessaire de mettre en uvre un nouveau
mode opratoire permettant de fixer de faon plus efficace le mdiateur rdox la matrice
polymre afin de diminuer les interfrents lectro-oxydables.
0
1
2
3
4
5
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentration du glucose (mM)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
Figure I I I .11 : Courbe dtalonnage dune biolectrode Pt/PEDT/GOD/BQ. Mesures
effectues 0,2 V/ECS ; 25C en milieu tampon phosphate 0,01 M pH 7.
101
Figure I I I .12 : Rponses relatives au glucose (5 mM), de lascorbate (400 M), du
paractamol (200 M) et de lurate (200 M) pour une lectrode Pt/PEDT/GOD et
Pt/PEDT/GOD/BQ. Mesures effectues 0,65 V/ECS et 0,2 V/ECS respectivement; 25C
en milieu tampon phosphate 0,01 M pH 7.
0
20
40
60
80
100
R
p
o
n
s
e
r
e
l
a
t
i
v
e
(
%
)
g
l
u
c
o
s
e
a
c
i
d
e
a
s
c
o
r
b
i
q
u
e
a
c
i
d
e
u
r
i
q
u
e
Pt/PEDT/GOD (0,65 V)
Pt/PEDT/GOD/BQ (0,2 V)
100
80
75
50
40 39
5
102
III.3 ANALYSE PAR INJECTION EN FLUX CONTINU (FIA)
III.3.1 Principe
Lanalyse par injection en flux continu (technique danalyse maintenant largement
dveloppe) est base sur linjection dun chantillon liquide dans un flux porteur continu
constitu dun ractif convenablement choisi. Lchantillon inject forme une zone qui, durant
son transfert vers un dtecteur, se disperse et ragit avec les composants du flux porteur. La
forme et lamplitude des pics dtects expriment la concentration de la substance injecte et
fournissent des informations cintiques sur les ractions chimiques se produisant dans le flux
continu.
Le mode dinjection en flux continu le plus simple et le plus souvent adopt est
prsent sur la Figure III.13.
La FIA a t applique au dosage de nombreux composs en phase liquide.
Cependant, la rapidit de lanalyse peut tre limite par le dtecteur, comme dans notre cas
avec llectrode enzymatique. Les courbes de rponse natteignent pas le plateau
correspondant ltat stationnaire (comme dans le cas de la mesure en batch), mais se
prsentent sous forme de pic de rponse correspondant la concentration du substrat
dtecter.
La Figure III.14 permet de comparer linfluence du temps de rponse de llectrode
enzymatique sur la hauteur et la forme du pic obtenu par le systme FIA avec la rponse en
systme en batch. En travaillant avec un capteur rponse rapide, il est possible de raccourcir
le temps correspondant au cycle de mesure, tout en assurant un pic lev, ce qui amliore le
rapport signal/bruit.
III.3.2 Caractristiques dun systme FIA
Sa caractristique la plus intressante est sa reproductibilit. Elle peut tre attribue
aux proprits suivantes du systme :
- linjection rapide et ponctuelle de lchantillon
- le pilotage exact et reproductible des pompes et des vannes (analyse en temps fixe)
- le contrle de la dispersion de lchantillon entre linjection et la dtection.
103
Ces facteurs contribuent rduire significativement le temps danalyse et supprimer
lattente des tats stationnaires avant deffectuer les mesures. De plus, lautomatisation du
systme FIA prsente les avantages suivants :
- rduction des cots de main-duvre
- amlioration de lexactitude et de la prcision
- possibilit dutilisation dans des analyses risques pour lhomme
- rduction du temps danalyse, donc augmentation du nombre dchantillons doss.
104
temps de passage
Figure I I I .13 : (a) Configuration la plus simple dun systme FIA un seul passage : C : flux
porteur ; P : pompe ; S : vanne dinjection ; R : racteur ; D : dtecteur. (b) Zone de
dispersion de lchantillon dans le flux porteur. (c) Pic caractristique enregistr sous flux
continu : I : point dinjection ; T : temps mort ; h : hauteur du pic ; t
b
: largeur du pic la
base ; A : aire du pic.
105
Figure I I I .14 : Rponses dlectrodes enzymatiques en batch et en systme FIA
III.3.3 Utilisation des enzymes immobilises en FIA
Par leur slectivit et leur faible cot, les enzymes immobilises reprsentent des
complments attrayants aux avantages propres du systme FIA. Elles offrent ainsi des
potentialits suprieures celles des enzymes travaillant en mode batch, utilises auparavant.
Lorsque la technique enzymatique est combine avec une mthode FIA, les dtecteurs
lectrochimiques sont les plus frquemment utiliss. La combinaison des enzymes
immobilises avec une mthode FIA a t dcrite partir de 1982. Grce ses avantages
(slectivit, simplicit, fiabilit et rapidit), la FIA en association avec les techniques
enzymatiques est devenue un excellent systme analytique et le nombre de ses applications a
augment rapidement dans diffrents domaines : mdecine [119, 120], alimentation [121],
environnement [122, 123], analyse de la biomasse, pharmacie, contrle de bioprocds [124,
125].
Dans un systme FIA, les lectrodes solides (platine ou carbone vitreux) sont
frquemment utilises pour la dtection de substances lectroactives (eau oxygne ou
NADH) gnres par une raction enzymatique dans un bioracteur [126].
106
III.3.4 Matriels et mthodes
III.3.4.1 Ractifs
Le 7,7,8,8-ttracyanoquinodimthane (TCNQ) a t fourni par Sigma.
Lhexacyanoferrate (III) de potassium Normapur
TM
a t fourni par Prolabo. Les autres
ractifs utiliss ont dj t dcrits dans la partie exprimentale de la section III.2.
III.3.4.2 Appareillage
Lappareillage et lquipement pour le dosage par systme biocapteur-FIA
comprennent :
- vanne dinjection basse pression Rhodyne
- boucles dinjection Rhodyne
de 50 L
- pompe pristaltique : Ismatec SA
de 0,44 mm de diamtre
- cellule de dtection UniCell - BAS
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
0.05 mM 0.1 mM
0.2 mM
0.5 mM
1 mM
2 mM
5 mM
10 mM
20 mM
Figure I I I .18 : Rponse du biocapteur Pt/PEDT/GOD pour diffrentes concentrations en
glucose de la solution danalyse. Surface active : 0,071 cm
2
. Mesures effectues 0,65 V/ECS
et 25C en milieu tampon phosphate 0,01 M pH 7. Paramtres FIA : volume dinjection :
50 L, dbit : 75 L.min
-1
.
112
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20
Concentration du glucose (mM)
H
a
u
t
e
u
r
d
u
p
i
c
(
A
/
c
m
)
y = 7,7926x + 1,8762
R
2
= 0,9943
0
20
40
60
80
0 2 4 6 8 10
Concentration du glucose (mM)
H
a
u
t
e
u
r
d
u
p
i
c
(
A
/
c
m
)
Figure I I I .19 : Courbe dtalonnage dune biolectrode Pt/PEDT/GOD. Mesures effectues
0,65 V/ECS et 25 C en milieu tampon phosphate 0,01 M pH 7.
Le tableau III.5 rsume les caractristiques de la dtection en batch et en FIA du
biocapteur Pt/PEDT/GOD.
Tableau I I I .5 : Comparaison des caractristiques de dtection du biocapteur Pt/PEDT/GOD.
Biocapteur Pt/PEDT/GOD
Limite de
dtection
(mM)
Domaine de
linarit
(mM)
Sensibilit
(mA.M
-1
.cm
-2
)
Ecart type
relatif
(%)
Temps de
rponse
(minutes)
Batch 0,040 0,2-8 15,2 8,5 0,2
FIA 0,005 0,05-10 7,8 3,7 2*
* Temps de rponse du systme FIA (y compris le temps de transport de lchantillon
depuis la vanne dinjection jusquau biocapteur).
113
III.3.5.3 Etude en milieu rel
Comme pour la mthode en batch, nous avons valid le biocapteur Pt/PEDT/GOD en
systme FIA en faisant des tests en milieux complexes. Pour ce faire, nous avons utilis aussi
comme chantillon les deux srums synthtiques commercialiss par Sigma
et dj dcrits
dans la premire partie du chapitre III. Ces deux chantillons rels contiennent aussi quelques
espces lectro-oxydables susceptibles dinterfrer dans le dosage du glucose dans les fluides
biologiques. Ces interfrences lectrochimiques et leurs concentrations respectives sont
rsumes dans le tableau III.6.
Tableau I I I .6 : Liste des espces interfrentes prsentes dans les chantillons rels.
Interfrent
Electro-oxydable
Mthode Accutrol
TM
normal Accutrol
TM
anormal
Moyenne
(mmol/L)
Gamme de
Concentrations
(mmol/L)
Moyenne
(mmol/L)
Gamme de
Concentrations
(mmol/L)
Acetaminophne Abbott-AxSYM (FPIA) 0,113 0,086-0,139 1,019 0,814-1,225
Salicylate Abbott-AxSYM (FPIA) 0,7 0,5-0,8 1,2 1,0-1,4
Acide urique BioChem/ATAC (505 nm) 0,357 0,321-0,393 0,577 0,518-0,636
Les chantillons de srum sont directement injects dans le flux porteur du systme
biocapteur-FIA. La rptabilit des pics obtenus pour le srum normal, sans dilution, est
prsente dans la Figure III.20. Le tableau III.7 montre la comparaison des rsultats obtenus
par notre biocapteur/FIA avec ceux de diffrentes mthodes de dosages effectus chez Sigma
Diagnostics et dans des laboratoires de rfrence utilisant les mthodes indiques. Les valeurs
obtenues dans la gamme normale sont lgrement infrieures celles dtermines par les
diffrentes mthodes signales. Pour les dosages dans la gamme anormale, nous avons trouv
des valeurs qui ne sont pas en accord avec celles obtenues par les diffrentes mthodes
danalyse courantes. Linfluence du volume dchantillon inject se traduit par une
modification du signal du dtecteur. En effet, la hauteur des pics augmente avec la quantit
114
injecte alors que le coefficient de dilution diminue dans le mme temps ; la hauteur du pic
tend vers une limite, appele tat stationnaire. A ce niveau, la hauteur correspond au signal
que donne lchantillon non dilu et donc un coefficient de dilution gal lunit. Par
consquent, la dilution-dispersion de lchantillon dans le liquide vecteur donne un signal plus
faible si la concentration du constituant de lchantillon au maximum du pic est infrieure la
concentration initiale injecte.
Un autre problme habituel associ lanalyse des chantillons complexes est
lencrassement de llectrode qui empche son bon fonctionnement [73; 74]. Dans notre cas,
le contenu total des protines est denviron 60 g/L pour le srum synthtique normal et 80 g/L
pour le srum synthtique anormal. De substances tensioactives (lipides) sont aussi prsents
dans lchantillon.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
1000 1500 2000
Temps (s)
H
a
u
t
e
u
r
d
u
p
i
c
(
A
/
c
m
)
Figure I I I .20 : Rptabilit des mesures du glucose dans un chantillon de srum Accutrol
TM
normal par systme biocapteur-FIA. Mesures effectues 0,65 V/ECS et 25C en milieu
tampon phosphate 0,01 M pH 7. Paramtres FIA : volume dinjection : 50 L, dbit :
75 L.min
-1
.
115
Tableau I I I .7 : Comparaison des rsultats du dosage du glucose dans le srum Accutrol
TM
,
obtenus avec le biocapteur Pt/PEDT/GOD coupl au systme FIA et ceux obtenus par
diffrentes mthodes.
Accutrol
TM
normal Accutrol
TM
anormal
METHODE
MOYENNE
(mmol/L)
DOMAINE DE
CONCENTRATIONS
(mmol/L)
MOYENNE
(mmol/L)
DOMAINE DE
CONCENTRATIONS
(mmol/L)
Abbott Spectrum/VP
series (hexokinase)
4,9 4,4-5,4 18,7 16,9-20,5
Bayer-Opera/RA
series
(hexokinase/340 nm)
5,0 4,5-5,5 18,6 16,8-20,4
Beckman-
CX/LX/Synchron
series (hexokinase)
4,8 4,3-5,3 18,1 16,3-19,9
BioChem-ATAC
(hexokinase/340 nm)
5,3 4,7-5,9 18,8 16,9-20,7
Ortho-Vitros
(oxydase)
4,8 4,3-5,3 18,5 16,7-20,3
Pointe Scientific
(oxydase)
5,0 4,5-5,5 18,3 16,5-20,1
Roche-Cobas Mira
series
(hexokinase/340 nm)
4,6 4,2-5,0 18,8 16,9-20,7
Sigma (enzymatic,
Trinder)
4,7 3,7-5,7 17,9 15,9-19,8
Pt/PEDT/GOD
Biocapteur/FIA
4,1 3,9-4,3 8,4 7,9-8,9
116
III.4 ELABORATION DUN BIOCAPTEUR CV(PT)/PEDT/GOD AVEC
LINCORPORATION DES DIFFERENTS MEDIATEURS REDOX ET SON
UTILISATION DANS DES SYSTEMES FIA.
Dans cette partie du chapitre, nous avons combin les deux stratgies utilises dans la
premire partie (platinisation des lectrodes et utilisation des mdiateurs rdox) afin dvaluer
la rponse au glucose des biocapteurs fonctionnant sous les conditions de lanalyse en flux
continu.
Pour cela, nous avons platin des lectrodes de carbone vitreux (CV), et ensuite nous
avons immobilis lenzyme et le mdiateur rdox comme nous lavons dj dcrit auparavant.
Les biocapteurs ainsi labors ont t incorpors dans le systme FIA.
Les figures III.21, III.22 et III.23 prsentent respectivement les courbes dtalonnage
du glucose des biolectrodes qui utilisent comme mdiateur rdox, la benzoquinone (BQ),
lhexacyanoferrate (III) de potassium (HcFK) et le 7,7,8,8-ttracyanoquinodimthane
(TCNQ).
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20
Concentration du glucose (mM)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
CV(Pt)/PEDT/GOD/BQ
E travail = 0,2 V
Figure I I I .21 : Courbe dtalonnage dune biolectrode CV(Pt)/PEDT/GOD/BQ. Mesures
effectues 0,2 V/ECS et 25C en milieu tampon phosphate 0,01 M pH 7.
117
0
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20
Concentration du glucose (mM)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
CV(Pt)/PEDT/GOD/HcFK
E travail = 0,3 V
Figure I I I .22 : Courbe dtalonnage dune biolectrode CV(Pt)/PEDT/GOD/HcFK. Mesures
effectues 0,3 V/ECS et 25C en milieu tampon phosphate 0,01 M pH 7.
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15 20
Concentration du glucose (mM)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
CV(Pt)/PEDT/GOD/TCNQ
E travail = 0,3 V
Figure I I I .23 : Courbe dtalonnage dune biolectrode CV(Pt)/PEDT/GOD/TCNQ. Mesures
effectues 0,3 V/ECS et 25C en milieu tampon phosphate 0,01 M pH 7.
118
Les trois biolectrodes prsentent une partie linaire jusqu 5 mM. Le fait dlaborer
des biocapteurs qui dosent le glucose un potentiel moins lev permet denvisager une
amlioration de leur slectivit par rapport aux espces lectro-oxydables prsentes dans les
chantillons rels. Cependant, nous observons une diminution de la sensibilit par rapport au
biocapteur Pt/PEDT/GOD incorpor dans le systme FIA.
Tableau I I I .8 : Comparaison des sensibilits des diffrents biocapteurs coupls au systme
FIA.
Biocapteur Potentiel de mesure
(V/ECS)
Sensibilit
(mA.M
-1
.cm
-2
)
Pt/PEDT/GOD 0,65 7,8
CV(Pt)/PEDT/GOD/BQ 0,2 6,9
CV(Pt)/PEDT/GOD/HcFK 0,3 2,4
CV(Pt)/PEDT/GOD/TCNQ 0,3 2,3
119
III.5 CONCLUSION
Llimination de linterfrence des composs lectro-oxydables, dans lutilisation des
biocapteurs in vivo est un dfi crucial pour le dveloppement futur de ces sondes. Cependant
les rponses technologiques que lon peut apporter ce problme permettent damliorer la
spcificit des biocapteurs sans jamais saffranchir totalement de la variation des courants
parasites cause par ces molcules. En gnral, lefficacit dpend du choix des diffrentes
techniques dont les principes de base ont t voqus prcdemment. Ceci saccompagne
souvent dune diminution de la sensibilit des biolectrodes.
Dans ce chapitre, nous avons prsent lutilisation dune technique danalyse associant
llectrode glucose oxydase au systme dinjection en flux continu (FIA). Afin de raliser le
systme biocapteur enzymatique-FIA, nous avons utilis une cellule de dtection
lectrochimique commercialise. Lun des buts essentiels de notre exprimentation tait de
dterminer les performances de lensemble du systme biocapteur-FIA. Nous pouvons
conclure, quavec la configuration biocapteur incorpor dans la cellule et associ au systme
FIA, nous avons russi amliorer la limite de dtection grce laugmentation du rapport
signal/bruit, ainsi que le domaine de linarit du dosage du glucose.
La reproductibilit de la rponse dune mme lectrode est caractrise par une variation de
3,7% contre 8,5% obtenue pour les mesures en batch. Cependant, nous avons constat une
perte de sensibilit dpendant du mdiateur utilis.
Ce systme peut contribuer lamlioration du dosage automatis du glucose car il
peut parfaitement sintgrer dans une chane automatique de mesures. Outre le secteur
mdical, dautres secteurs dactivit industrielle peuvent aussi bnficier de lutilisation de
ces types de capteurs enzymatiques associs la technique FIA.
CHAPITRE IV : IMMOBILISATION DE LA POLYPHENOL
OXYDASE DANS UN FILM DE PEDT
121
IV.1 INTRODUCTION
Lutilisation intensive, notamment dans le secteur agricole, de pesticides et
dherbicides pour le traitement des sols, conduit la contamination des eaux de surface, des
lacs ou des nappes phratiques. La plupart de ces produits demeurent actifs durant plusieurs
annes causant alors une pollution continue des eaux. Leur dtection est donc trs importante
dans le contrle de lenvironnement.
Eau, air et sol sont des ressources naturelles vitales o nous puisons directement ou
indirectement (via la chane alimentaire) nos nutriments. Cest pourquoi ces trois
compartiments sont aujourdhui trs surveills. A lheure actuelle, des centaines de molcules
chimiques sont contrles dans leau et dans lair. Conformment la rglementation, la
dtection et le dosage de ces molcules sont raliss laide dinstruments danalyse
conventionnels, tels que spectromtres et chromatographes. Ces appareils offrent des
mthodes de mesure fiables, souvent normalises. Cependant, ils sont coteux, volumineux,
exigeants sur le plan technique et ncessitent, en outre, une tape souvent longue de
prparation de lchantillon.
Par ailleurs, la demande en analyse dpasse largement le cadre rglementaire. La
dmarche sur le terrain vise la surveillance permanente sur site afin dalerter le plus tt
possible en cas de danger. Cette prudence est de rigueur pour le risque sanitaire et pour la
protection des installations industrielles ; elle ncessite des mthodes utilisables en continu,
rponse rapide et automatisables. En effet, toutes les sources de pollution ntant pas
rpertories, a fortiori rglementes, il faut donc envisager la possibilit de dcouvrir de
nouveaux dangers. Cest l que les mthodes biotechnologiques trouvent leur place et leur
intrt ct des mthodes conventionnelles. Elles possdent, en effet, les qualits requises
pour rvler rapidement un danger pour le milieu naturel et lhomme.
Une grande varit de macromolcules biologiques ont t utilises comme lment
biologique dans llaboration de biocapteurs pour la dtection de polluants, en raison de leur
affinit leve pour certains polluants [127]. Le tableau IV.1 montre quelques exemples des
diffrentes classes de biorcepteurs utiliss dans llaboration de ces biocapteurs.
122
Tableau I V.1 : Exemples de diffrents biorcepteurs utiliss dans llaboration des
biocapteurs pour le dosage des polluants [127].
BI ORECEPTEURS EXEMPLES POLLUANTS
DOSES
Acide -aminobutyrique
(GABA)
Cyclodines
Pyrthrodes
Bicyclophosphate
RECEPTEURS
Arylhydrocarbons Dioxines
ANTICORPS IgG Biphnylepolychlors
Dioxines
Pentachlorophnol
Benzo(a)pyrne
Benzne, tolune, xylne
cyanobactries Herbicides
Pseudomonas Naphtalne
CELLULES
ENTIERES
Actylcholinestrase Organophosphors
Lucifrase Hg
2+
ENZYMES
Peroxydase Cyanure
Benzotriazole
La miniaturisation est un aspect attrayant pour le contrle de lenvironnement si lon
tient compte du cot trs lev de lanalyse au laboratoire. Le dveloppement de biocapteurs
portables pourrait aussi diminuer le temps de transport des chantillons vers le laboratoire et
les prcautions prendre pendant ce transport.
Dans ce chapitre, nous dcrirons un biocapteur ampromtrique bas sur
limmobilisation dune enzyme, la polyphnol oxydase (PPO), galement appele tyrosinase,
la surface dune lectrode de carbone vitreux (CV). Limmobilisation de la PPO est ralise
par pigeage dans des films de PEDT. Cette mthode permet la mise au point dun capteur
dont les performances en termes de sensibilit et de limite de dtection sont intressantes. Ce
biocapteur assure la dtection directe du phnol et dautres substrats dintrt mdical.
123
Dans cette partie, enfin, nous nous sommes intresss lvaluation des potentialits
de fonctionnement de ce biocapteur et la possibilit dlargir, dans le futur, son champ
dapplication la dtection de polluants, tels que les cyanures, les herbicides et les pesticides,
en utilisant la dtection indirecte selon un processus dinhibition de la biolectrode.
124
IV.2 PRINCIPE DU BIOCAPTEUR A POLYPHENOL OXYDASE
IV.2.1 La polyphnol oxydase
La polyphnol oxydase (PPO) (monophnol mono-oxygnase EC 1.14.18.1),
galement appele tyrosinase, est une mtallo-protine forme de 4 sous-units monomres,
chacune de masse molaire avoisinant 32000 g.mol
-1
. La squence dacides amins de cette
enzyme est connue. Issue de diffrentes souches (vgtale, animale), la PPO assure, entre
autres, la biosynthse des pigments (mlanine) de la peau des vertbrs. En effet, elle permet
lhydroxylation de la tyrosine en 3,4-dihydroxyphnylalanine (DOPA). La PPO participe
aussi la biosynthse des composs polyphnoliques, dots pour certains dune activit
antibiotique chez les plantes et les micro-organismes.
Cette enzyme catalyse en milieu arobie deux types de raction :
lortho-hydroxylation (activit de crsolase) du monophnol en ortho-
diphnol :
Loxydation (activit de catcholase) de lortho-diphnol en ortho-
quinone :
Loxygne molculaire est rduit en eau par un mcanisme dchange de quatre lectrons
[128].
125
Le groupe prosthtique de la PPO est un site compos de deux atomes de cuivre dont
les variations de coordinance laissent apparatre trois formes limites sous lesquelles la PPO
ragit diffremment :
-forme oxy [Cu(II) O
2
2-
Cu(II)]
-forme met [Cu(II) OH Cu(II)]
-forme doxy [Cu(I) Cu(I)]
Ces trois formes interviennent dans tous les mcanismes molculaires relatifs aux
activits de crsolase et de catcholase de la PPO. Toutes les interactions enzyme/substrat ont
lieu sur ces sites actifs. Le mcanisme daction de la PPO est, donc, relativement complexe
analyser [129]. Il est gnralement admis que cette enzyme possde au moins deux sites
distincts de fixation. Lun prsente une affinit pour les composs aromatiques : cest le site
de lenzyme sur lequel viennent se fixer par exemple le catchol ou ses drivs. Lautre site
prsente de laffinit pour les composs complexant les centres mtalliques : cest le site sur
lequel se fixe loxygne molculaire. Cette complexit est nanmoins intressante car
lactivit de la PPO est susceptible dtre affecte par une large varit dinhibiteurs.
Dans le mcanisme correspondant lactivit de crsolase de la PPO, le monophnol
est li en position axiale lun des atomes de cuivre de la forme oxy de lenzyme. Il doit
alors subir un rarrangement strique que loriente en position ortho pour ltape
dhydroxylation. Ce mcanisme gnre un orthodiphnolate coordin qui est ensuite oxyd en
quinone laissant un site doxy disponible pour loxygne molculaire. Rcemment,
Rodrguez-Lpez et col. [130] ont confirm que la forme oxy de lenzyme est la seule
capable de catalyser la transformation de monophnol en diphnol.
Dans le mcanisme correspondant lactivit de catcholase de la PPO, loxydation de
deux molcules de catchol en ortho-quinone est couple la rduction de deux molcules
doxygne molculaire en eau. Le cycle catalytique commence par la liaison dune molcule
de catchol la forme met de lenzyme et la formation de une molcule de quinone. La
deuxime molcule de catchol est lie la forme oxy de lenzyme ce qui donne lieu la
formation de une autre molcule dortho-quinone et la rgnration de la forme met de
lenzyme qui recommence le cycle catalytique [131]. Contrairement au mcanisme antrieur,
un rarrangement strique du substrat ne savre pas ncessaire pour ce simple transfert
lectronique.
126
Le point isolectrique de la PPO est de 4,7. A pH 6-7 elle est anionique. Lactivit
enzymatique dune solution de PPO peut tre mesure par spectrophotomtrie. En effet, en
prsence de lenzyme, le catchol en solution tamponne (pH 6,5) est transform en
orthoquinone qui absorbe la lumire 380 nm. Cette absorbance augmente tout dabord
linairement en fonction du temps, puis tend se stabiliser. La pente de la partie linaire de la
courbe obtenue ltat stable est proportionnelle lactivit enzymatique de cette solution.
IV.2.2 Principe du biocapteur
Les biocapteurs ampromtriques bass sur limmobilisation de la PPO permettent la
dtection des drivs monophnoliques et orthodiphnoliques (figure IV.1). Leur champ
dapplications potentielles concerne essentiellement le domaine biomdical (dosage de
neuromdiateurs, catcholamine) et celui de lenvironnement (dtection de polluants
phnoliques et pesticides). Ces applications ncessitent des capteurs capables de dtecter des
concentrations nanomolaires de la molcule cible, ce qui constitue encore actuellement le
premier objectif atteindre.
127
catchol pinphrine
dopamine L-DOPA
Figure I V.1: Formules chimiques de quelques substrats utiliss par la PPO.
Le principe de dtection du biocapteur est montr la figure IV.2. Lorthoquinone,
produite par la raction enzymatique, est un compos lectroactif qui peut tre rduit
lectrochimiquement en orthodiphnol. Le fonctionnement du biocapteur est bas sur la
mesure du courant de rduction, au potentiel de 0,2V/ECS, de lorthoquinone
enzymatiquement gnre. La rponse ampromtrique de llectrode est directement lie la
concentration en substrat dans la solution.
Il est important de noter que ce mode de dtection ampromtrique aboutit la
rgnration de catchol la surface de llectrode. Substrat de lenzyme, ce compos peut
soit diffuser vers la solution, soit entrer dans un nouveau cycle catalytique avec la PPO. Dans
128
ce dernier cas, le processus se traduit par une amplification de la rponse de la biolectrode
[132]. De mme que la GOD, la PPO ncessite un milieu arobie ; dans la suite de ce chapitre,
les rsultats ont t obtenus en utilisant comme lectrolyte des solutions de tampon phosphate
satures en air.
Figure I V.2 : Reprsentation schmatique du fonctionnement du biocapteur phnol.
Le chapitre prcdent a montr les potentialits de nouvelles biolectrodes
enzymatiques bass sur lutilisation de films de PEDT pour la ralisation de biocapteurs
ampromtriques. Ce chapitre est ax sur limmobilisation de la PPO dans des films de
PEDT. Ltude dcrit la caractrisation et loptimisation du biocapteur pour la dtection
directe du phnol, du catchol, de lpinphrine, de la L-DOPA et de la dopamine.
129
IV.3 MATERIELS ET METHODES
IV.3.1 Ractifs pour la fabrication du biocapteur
La polyphnol oxydase (EC 1.14.18.1), de champignon,possde une activit de 6680
UI.mg
-1
(1 unit induit une augmentation de 0,001 dabsorbance 280 nm de 3 mL de
solution de L-tyrosine par minute pH 6,5 et 25C).
Le catchol, lpinphrine, la dopamine et le L-DOPA utiliss sont des produits SIGMA.
Le phnol utilis est un produit fourni par Carlo Erba.
Le monomre 3,4-thylnedioxythiophne est fourni par Bayer AG.
Le poly(thylne glycol) de MM = 15.000 est fourni par Aldrich.
Toutes les solutions de tampon phosphate sont prpares par mlange dans leau, de
dihydrognophosphate de sodium (NaH
2
PO
4
, 2H
2
O), dhydrognophosphate de sodium
(Na
2
HPO
4
, 2H
2
O) et de chlorure de potassium RECTAPUR fournis par Prolabo.
Pour chaque exprience, toutes les solutions aqueuses ont t ralises partir dune
eau ultrapure, purifie par le systme Milli Q
.
IV.3.2 Appareillage
Lappareillage pour les tudes lectrochimiques consiste en un ensemble VoltaLab
TM
21 dj dcrit dans le chapitre II.
Llectrode de rfrence est llectrode au calomel standard (ECS) de chez Tacussel
.
La contre-lectrode est forme dun fil de platine.
Les lectrodes de travail sont des lectrodes de carbone vitreux de 3 mm de diamtre
fournies par BAS
.
La surface des lectrodes de travail a subi un traitement pralable qui consiste en un
polissage laide de solutions de diamant de diffrents diamtres de particules ( 1, 3 et 15
m) dans un feutre appropri (kit de nettoyage PK-4 fourni par BAS
).
Les tests enzymatiques ont t raliss avec un spectrophotomtre UV/VIS Cary 50
(Varian) en utilisant des cuves usage unique fournies par Polylabo pour liminer toutes
sources de contamination entre chaque mesure.
130
IV.3.3 Mthodes
IV.3.3.1 Elaboration des biolectrodes
Les biolectrodes CV/PEDT/PPO ont t labores selon le procd suivant : 1 mg de
PPO est dissous dans 200 L dune solution aqueuse contenant 10
-2
M de 3,4-
thylnedioxythiophne (EDT), correspondant la limite de la solubilit du monomre.Cinq
microlitres (5 L) de ce mlange sont dposs sur la surface dune lectrode de carbone
vitreux (diamtre 3 mm). Llectrode est sche lair pour obtenir un film de monomre et
denzyme adsorbs (Schma figure IV.3). La polymrisation du EDT est effectue potentiel
constant (+ 1,2 V/ECS) pendant 2 minutes, dans une solution tampon phosphate de potassium
0,02 M, pH 6,2 avec PEG 10
-3
M.
Figure I V.3 : Mthode de prparation du dpt de monomre et de lenzyme.
IV.3.3.2 Dtermination de lactivit de la PPO
Cette technique de mesure dactivit a permis destimer la quantit denzyme
relargue par llectrode dans la solution dlectropolymrisation lors de la polymrisation du
PEDT. Vingt microlitres (20 L) de solution dlectropolymrisation contenant lenzyme sont
EDT + PPO
Schage
+1200mV
2 min
Solution tampon 0,02 M, pH 6,2
+ PEG
Electrode de
travail
Electrode de
rfrence
Electrode
auxiliaire
131
ajouts 1 mL de solution aqueuse de catchol (0,1 M) et 1,980 mL de tampon phosphate 0,1
M, pH 6,5. Tout de suite aprs laddition de la solution de PPO, la raction doxydation du
catchol est suivie par lenregistrement de laugmentation de labsorbance 380 nm en
fonction du temps. La courbe obtenue prsente une partie linaire au dpart de la raction.
Lactivit enzymatique est value partir de la pente mesure.
Lactivit du biofilm est mesure par le mme procd spectrophotomtrique. La biolectrode
est immerge dans la mme solution de catchol et tampon phosphate, et soumise une
vitesse de rotation dtermine. Labsorbance 380 nm est mesure toutes les deux minutes
pendant 30 minutes. La partie linaire de la courbe reprsentant lvolution de labsorbance
au cours du temps permet alors de calculer lactivit du biofilm.
IV.3.3.3 Mesures ampromtriques en fonction des diffrents paramtres
Avant chaque mesure lectrochimique, les lectrodes sont stabilises dans un tampon
phosphate 0,1 M pH 6,5 (10 mL ou 20 mL) un potentiel de - 0,2 V/ECS jusqu lobtention
dun courant rsiduel stationnaire. Des petits volumes de solution des substrats (5 300 L)
sont ensuite injects dans la cellule. Les solutions des substrats sont prpares dans de leau
dsionise, et conserves au rfrigrateur.
La rponse de llectrode en fonction de la temprature est enregistre dans une
solution danalyse contenant du tampon phosphate 0,1 M, pH 6,5 et du catchol 5 M. La
valeur de la rponse en densit du courant du biocapteur est alors releve aprs stabilisation
du courant pour chaque temprature.
La rponse de llectrode en fonction du pH est enregistre dans chaque solution
tamponne diffrents pH (10 mL de tampon phosphate 0,1 M, pH 5 8). La concentration
de substrat est de 5 M.
La rponse de llectrode pour un potentiel donn est enregistre dans une solution
danalyse contenant tampon phosphate 0,1 M pH 6,5 et du catchol 5 M. La valeur de la
rponse en densit du courant du biocapteur est alors releve aprs stabilisation du courant
pour chaque potentiel.
132
IV.4 RESULTATS ET DISCUSSION
IV.4.1 Immobilisation de la PPO dans un film de PEDT
Limmobilisation de la PPO au sein de la matrice de PEDT a t ralise sur une
lectrode de carbone vitreux : une quantit contrle de chacun des lments constitutifs du
biomatriau est dpose la surface de llectrode, puis laisse scher lair afin dobtenir un
film adhrent la surface de llectrode (figure IV.3). Pour obtenir une rponse dtectable,
donc une production leve dorthoquinone, on a dtermin la quantit denzyme ncessaire
dans une tude pralable. En consquence, la solution de dpt est compose de 1 mg de PPO
dissous dans 200 L dune solution de EDT 10
-2
mol L
-1
. Le volume de dpt a t choisi en
fonction des valeurs optimales dtermines lors dune tude prliminaire, soit 5 L. La
rponse du biocapteur nest pas affecte par le pH de la solution dlectropolymrisation,
donc la solution sera identique celle dfinie prcdemment dans le cas de la GOD, soit la
solution tampon phosphate 0,02 M, pH 6,2.
Par ailleurs, nous navons pas trouv de diffrences significatives dans la rponse du
biocapteur quand un deuxime ajout de monomre est fait dans la solution
dlectropolymrisation. Par consquent, la solution dlectropolymrisation est compose de
PEG 10
-3
M en milieu tampon phosphate 0,02 M, pH 6,2. Llectropolymrisation potentiel
constant (+ 1,2 V/ECS) permet la synthse dun film polymre stable de PEDT.
La figure IV.4 illustre linfluence de la quantit denzyme initialement dpose, sur la
sensibilit du biocapteur, la masse de EDT tant constante et gale 75 nmoles.
133
0
5
10
15
5 15 25 35 45 55
Polyphnol oxydase (g)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
Figure I V.4 : Influence de la quantit initiale denzyme mlange 75 nmoles de EDT et
dpose la surface de llectrode de carbone vitreux (diamtre 3 mm) sur la rponse du
biocapteur polyphnol oxydase (substrat : 5 M catchol, pH 6,5, 25C, activit spcifique
de la PPO : 6680 UI.mg
-1
, dose par Sigma).
Llectrode prpare avec 25 g denzyme prsente la meilleure rponse. Pour des
faibles quantits de PPO dposes, la sensibilit du biocapteur dcrot de moiti. La
diminution de la sensibilit de llectrode prpare avec 50 g pourrait tre due une perte de
biomatriau en raison dune concentration trop leve denzyme qui rduit son adhrence la
surface de llectrode. Cependant, le pourcentage denzyme active pige dans la matrice de
PEDT reste trs bas (moins de 1 % des units dposs).
134
IV.4.2 Optimisation du temps dlectropolymrisation
Pour optimiser le temps dlectropolymrisation, nous lavons fait varier dans un
domaine compris entre 5 secondes et 8 minutes afin dtudier son influence sur la rponse du
biocapteur en prsence dune solution de catchol 5 M. Les rsultats sont montrs la
figure IV.5.
0
20
40
60
80
100
0 100 200 300 400 500
Temps d'lectropolymrisation (sec.)
R
p
o
n
s
e
r
e
l
a
t
i
v
e
(
%
)
Figure I V.5 Influence du temps dlectropolymrisation sur la rponse dune biolectrode
CV/PEDT/PPO. Conditions opratoires : concentration du catchol 5 M, tampon phosphate
0,1 M, pH 6,5, potentiel de mesure 0,2 V/ECS, temprature 25C.
Nous voyons que la rponse ampromtrique relative du est lev pour des temps
dlectropolymrisation courts (5 et 10 secondes). Ensuite, nous observons une diminution de
la rponse denviron 15%. Au-del de 60 secondes, elle reste constante. Pour un temps
dlectropolymrisation trs court, nous avons obtenu une meilleure rponse qui peut
135
sexpliquer par la formation dune couche de polymre trs fine favorisant la diffusion du
substrat. Cependant, nous avons observ macroscopiquement des problmes dadhrence du
film la surface de llectrode, ce qui peut entraner une perte denzyme retenue et une
diminution importante de la sensibilit du biocapteur dans le temps. Nous avons donc fix un
temps dlectropolymrisation de 120 secondes pour nous assurer que la stabilit du polymre
est adquate pour retenir lenzyme, et une bonne adhrence du polymre llectrode.
IV.4.3 Choix du potentiel de travail
Lorthoquinone produite par la raction enzymatique est un compos qui peut tre
rduit lectrochimiquement en orthodiphnol correspondant. Cest ce mode de dtection
ampromtrique que nous utiliserons dans la suite de ce travail. La rponse en courant du
biocapteur pour une concentration en catchol de 5 M a t mesure pour des valeurs de
potentiel comprises entre - 0,3 et + 0,3 V/ECS. Comme le montre la Figure IV.6, le courant de
rduction maximal se trouve - 0,2 V/ECS. Pour la suite des expriences, nous nous
placerons - 0,2 V/ECS.
136
0
0,5
1
1,5
2
-300 -200 -100 0 100 200 300
Potentiel (mV)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
Figure I V.6 : Influence du potentiel de mesure sur la rponse en courant dun biocapteur
CV/PEDT/PPO. Conditions opratoires : concentration du catchol 5 M, tampon phosphate
0,1 M pH 6,5, temprature 25C. Systme sous agitation mcanique.
IV.4.4 Performances du biocapteur dans des conditions optimises pour la dtection de
diffrents substrats
Ltude prcdente a permis de dfinir une composition du film enzymatique et
dtablir les conditions dlectropolymrisation. Les tudes ultrieures ont t ralises avec
des films labors par le dpt de 25 g de PPO et 75 nmoles de EDT.
Les figures IV.7, IV.8, IV.9 et IV.10 montrent les courbes de calibration obtenues
pour quatre substrats diffrents de lenzyme : catchol, dopamine, pinphrine et L-DOPA.
Les rponses ampromtriques ont t enregistres en solution tamponne 0,1 M, pH 6,5
25C et en appliquant un potentiel de 0,2 V/ECS.
137
0
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200 250
Catchol (M)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
-5
5
15
25
35
45
0 5 10 15 20 25
Catchol (M)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
Figure I V.7 : Courbe dtalonnage du catchol obtenue avec une lectrode CV/PEDT/PPO.
Conditions opratoires : solution tampon phosphate 0,1 M, pH 6,5, temprature 25C.
Potentiel de mesure : 0,2 V/ECS. Systme sous agitation mcanique.
138
0
5
10
15
20
25
30
35
0 200 400 600 800 1000
Dopamine (M)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
0
4
8
12
0 50 100 150 200
Dopamine (M)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
Figure I V.8 : Courbe dtalonnage de la dopamine obtenue avec une lectrode
CV/PEDT/PPO. Conditions opratoires : solution tampon phosphate 0,1 M, pH 6,5,
temprature 25C. Potentiel de mesure : 0,2 V/ECS. Systme sous agitation mcanique.
139
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 200 400 600 800
Epinphrine (M)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
0
2
4
6
8
0 50 100 150 200
Epinphrine (M)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
Figure I V.9 : Courbe dtalonnage de lpinphrine lectrode CV/PEDT/PPO. Conditions
opratoires : solution tampon phosphate 0,1 M, pH 6,5, temprature 25C. Potentiel de
mesure : 0,2 V/ECS. Systme sous agitation mcanique.
140
0
2
4
6
8
10
12
14
0 200 400 600 800
L-DOPA (M)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
0
0,3
0,6
0,9
1,2
0 2,5 5 7,5 10
L-DOPA (M)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
Figure I V.10 : Courbe dtalonnage de la L-DOPA obtenue avec une lectrode
CV/PEDT/PPO. Conditions opratoires : solution tampon phosphate 0,1 M, pH 6,5,
temprature 25C. Potentiel de mesure : 0,2 V/ECS. Systme sous agitation mcanique.
La sensibilit de la nouvelle lectrode varie dans une gamme assez large en fonction
du substrat utilis et correspond au domaine de linarit de la courbe dtalonnage. Le
catchol prsente laffinit la plus leve pour lenzyme. Tous les composs utiliss sont des
drivs du catchol. Les valeurs de la limite de dtection ont t obtenues pour un rapport
signal/bruit gale 3/1. Le tableau IV.2 prsente les caractristiques de la dtection des quatre
substrats utiliss.
141
Tableau I V.2 : Caractristiques de la dtection du catchol, de la dopamine, de lpinphrine
et de la L-DOPA. Valeurs obtenues avec une lectrode (CV, diamtre 3 mm) CV/PEDT/PPO
de composition : 25 g de PPO et 75 nmoles de EDT. Conditions opratoires : solution
tampon phosphate 0,1 M, pH 6,5, temprature 25C. Potentiel de mesure : 0,2 V/ECS.
Systme sous agitation mcanique.
Substrat Sensibilit
(mA.M
-1
.cm
-2
)
Domaine linaire
(M)
Limite de dtection
(M)
Catchol 1999 1-25 0,05
Dopamine 133 1-200 0,1
Epinphrine 56 1-200 0,5
L-DOPA 104 1-10 0,5
IV.4.5 Etude de la reproductibilit de llectrode CV/PEDT/PPO
Nous avons ralis une tude afin de connatre la reproductibilit de la mthode de
prparation de la biolectrode CV/PEDT/PPO. Pour cela, le substrat de la PPO utilis est le
catchol qui possde une grande affinit pour le site actif de lenzyme et permet dobtenir des
sensibilits importantes du biocapteur. Le tableau IV.3 prsente lintensit de la rponse
ampromtrique de 8 lectrodes CV/PEDT/PPO 5 M de catchol prpares selon un mode
opratoire identique et avec le mme lot denzyme. Ces rsultats sont diffrents de ceux
rapports avant et rsultent de lemploi dun lot denzyme moins active fourni par Sigma.
142
Tableau I V.3 : Etude de la reproductibilit de la prparation de llectrode CV/PEDT/PPO.
Valeurs obtenues avec une lectrode (CV, diamtre 3 mm) CV/PEDT/PPO de composition :
25 g de PPO et 75 nmoles de EDT. Conditions opratoires : solution tampon phosphate
0,1 M, pH 6,5, temprature 25C. Potentiel de mesure : 0,2 V/ECS. Systme sous agitation
mcanique.
N dlectrode
Rponse
ampromtrique
5 M de
catchol (A/cm)
1 6,62
2 4,00
3 6,20
4 6,60
5 5,54
6 8,34
7 4,92
8 4,95
Moyenne 5,90
Intervalle de confiance
95%
0,90
La mthode de prparation du biocapteur prsente une reproductibilit intressante. On
constate que les 8 lectrodes prpares prsentent une variation de 15 % de la valeur moyenne
de leur sensibilit. Les carts entre les valeurs de sensibilit pourraient provenir dune
variation de la concentration en monomre dans la solution de dpt en raison de sa solubilit
limite. La rptabilit de la rponse dune mme lectrode est caractrise par une dviation
standard relative de 8% obtenue sur 5 mesures conscutives pour 5M de catchol.
143
IV.4.6 Influence de la temprature sur la rponse du biocapteur
Il existe une zone de temprature pour laquelle lactivit enzymatique est maximale.
En effet, une augmentation de la temprature contribue accrotre la vitesse dune raction
enzymatique jusqu une valeur limite, au-del de laquelle la vitesse de la raction chute
rapidement en raison de la dnaturation irrversible de lenzyme. La rponse en courant du
biocapteur CV/PEDT/PPO en prsence de 5 M de catchol a t tudie dans une gamme de
temprature allant de 15 40C (figure IV.11).
0
2
4
6
8
10
12
14
10 15 20 25 30 35 40 45
Temprature (C)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
Figure I V.11 : Influence de la temprature sur la rponse en densit du courant dune
lectrode CV/PEDT/PPO. Conditions opratoires : solution tampon phosphate 0,1 M, pH 6,5,
Potentiel de mesure : 0,2 V/ECS.
La figure IV.11 montre que lintensit du courant augmente quand la temprature
passe de 15 25C, puis diminue pour des tempratures suprieures en raison de la
144
dnaturation thermique de la polyphnol oxydase. Nous avons choisi de travailler en milieu
thermostat 25C.
IV.4.7 Influence du pH sur la rponse du biocapteur
Lactivit enzymatique tant dpendante du pH du milieu ractionnel, linfluence de
ce paramtre sur la rponse ampromtrique du biocapteur a t examine. Ltude a t
ralise entre pH 5 8 pour une concentration en catchol de 5 M.
La figure IV.12 montrant les variations de la densit du courant en fonction du pH,
prsente une forme caractristique en cloche. La rponse ampromtrique du biocapteur est
optimale pour un pH de 6,5. Dans toute ltude concernant limmobilisation de la polyphnol
oxydase dans la matrice de PEDT, nous avons choisi une valeur de pH de 6,5 pour le milieu
danalyse.
3
4
5
6
7
8
9
10
4 5 6 7 8 9
pH
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
Figure I V.12 : Influence du pH sur la rponse ampromtrique dune lectrode
CV/PEDT/PPO. Conditions opratoires : solution tampon phosphate 0,1 M. Potentiel de
mesure : 0,2 V/ECS. Temprature 25C. Systme sous agitation mcanique.
145
IV.4.8 Stabilit en fonctionnement de llectrode CV/PEDT/PPO
Pour dterminer les conditions optimales de la conservation de lactivit enzymatique
des biolectrodes, nous avons procd une conservation dans du tampon phosphate (0,1 M,
pH 6,5) 4C afin de maintenir une hydratation optimale du biomatriau.
Les rponses ampromtriques des biocapteurs ont t mesures priodiquement (une
fois par jour) par ajouts dune mme concentration en catchol (5 M) dans la solution
danalyse. Lvolution de la rponse relative de la biolectrode en fonction du temps de
conservation est reprsente dans la figure IV.13. Des pertes dactivit de 60 % sont
enregistres aprs 10 jours lorsque la biolectrode est conserve 4C.
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12
Temps (jours)
R
p
o
n
s
e
r
e
l
a
t
i
v
e
(
%
)
Figure I V.13 : Evolution de la rponse relative dune lectrode CV/PEDT/PPO en fonction
du temps de conservation 4C dans du tampon phosphate 0,1 M, pH 6,5. La rponse du
biocapteur est dtermine par des ajouts de catchol en milieu tampon phosphate 0,1 M,
pH 6,5 thermostat 25C.
146
IV.4.9 Dosage direct du phnol
Le phnol et ses drivs constituent une classe importante de polluants rencontrs dans
leau. Ils proviennent essentiellement des rejets des industries du bois, du charbon ou du
ptrole, mais galement des activits domestiques puisque certains dentre eux sont utiliss
comme dsinfectants. Le phnol est aussi un compos trs toxique et possde une action
destructrice sur les cellules de lpiderme avec laquelle il entre en contact. Il tue la faune
aquatique des concentrations de 1 ppm. Pour ces raisons, la lgislation impose, pour les
eaux destines la consommation humaine, que les phnols ne soient pas dtectables
organoleptiquement aprs lajout de chlore. En cas de dtection, la concentration en phnol,
exprime en indice phnol, doit tre infrieure ou gale 0,5 g.L
-1
, soit 5 nM.
Llectrode CV/PEDT/PPO peut dterminer directement la concentration du phnol.
La figure IV.14 montre la rponse de llectrode pour plusieurs additions de phnol. La
sensibilit du biocapteur est de 608 mA.M
-1
.cm
-2
, le domaine linaire stend de 1 25 M.
La limite de dtection est de 0,05 M et correspond un rapport signal/bruit gale 3/1.
147
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 50 100 150 200 250
Phnol (M)
D
e
n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
/
c
m
)
0
3
6
9
12
15
0 10 20 30
Phnol (M)
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n
s
i
t
d
u
c
o
u
r
a
n
t
(
A
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c
m
)
Figure I V.14 : Courbe dtalonnage du phnol obtenue avec une lectrode CV/PEDT/PPO.
Conditions opratoires : solution tampon phosphate 0,1 M, pH 6,5, temprature 25C.
Potentiel de mesure : 0,2 V/ECS. Systme sous agitation mcanique.
La rponse du biocapteur polyphnol oxydase au phnol est limite par la proportion
de la forme active (oxy) de lenzyme. En consquence, en solution, lactivit de crsolase ou
monophnolase est caractrise par un temps de latence largie. Ainsi, ltape critique dans la
rponse du biocapteur PPO est la rduction efficace de lortho-quinone parce que la
formation de quantits significatives de la forme oxy de lenzyme dpend de la prsence, soit
du catchol soit dun autre donneur dlectrons convenable. Le catchol est capable de
transformer les formes intermdiaires de lenzyme dans la forme active-phnol en prsence
doxygne et donner lieu une amplification de la production dortho-quinone.
Quand le phnol est utilis comme substrat, seulement une petite quantit de la forme
oxy de lenzyme est active d labsence du diphnol activateur ncessaire pour
lactivation en cascade de la PPO. Dans les biolectrodes, o la rduction de lortho-quinone
est lente ou irrversible chimiquement, la cascade narrive pas se complter, les
performances analytiques du biocapteur diminuent. Cela peut tre une explication la faible
148
sensibilit obtenu dans le cas de notre biocapteur. Une possible solution pour amliorer le
systme est lincorporation des mdiateurs rdox. Les plus couramment utiliss sont : le
ferricyanure, le ttracyanoquinodimthane (TCNQ) et le mthylphnazonium [133].
IV.5 CONCLUSION
Le travail expos dans ce chapitre a permis de montrer que le PEDT peut tre utilis
comme support pour llectropolymrisation dautres enzymes que la GOD. Dans ce cas-l, la
polyphnol oxydase (PPO) a t immobilise au sein dune matrice de polymre.
Limmobilisation de la PPO a abouti llaboration dun biocapteur ampromtrique
pour la dtection de diffrents substrats ortho-diphnoliques dintrt mdical.
Le biocapteur permet aussi le dosage des composs monophnoliques (phnol) dans
une gamme de concentrations qui stend de 1 25 M et avec une limite de dtection
de 0,05 M.
La polyphnol oxydase immobilise peut tre utilise comme biocatalyseur dans la
conversion des composs phnoliques en catchol et/ou quinone, tant donne que lenzyme
en solution est dsactiv par les produits de la raction [134]. Cette application potentiel peut
favoriser la biotransformation du phnol et/ou la dpollution des eaux contamines. Par
ailleurs, la tyrosinase a t tudi comme une alternative lutilisation des enzymes
peroxydase pour le traitement des composs phnoliques et ses drivs chlors [135].
CONCLUSION GENERALE
150
Le travail prsent dans ce rapport concerne principalement lutilisation de nouveaux
biomatriaux dlectrode, avec pour principal objectif, la mise en uvre et loptimisation dun
biocapteur ampromtrique enzymatique pour la dtection du glucose dans des milieux
biologiques. En effet, une part importante de ce travail a t consacr une application des
biocapteurs dans le domaine biomdical. Par ailleurs, dans le domaine de lenvironnement,
nous avons optimis un biocapteur pour la dtection du phnol, polluant du milieu aqueux.
Loptimisation de ces deux capteurs a t valu au moyen de la glucose oxydase et de la
polyphnol oxydase.
Nous avons montr que le poly(3,4-thylnedioxythiophne) (PEDT) constitue un bon
support pour llectropolymrisation denzymes. Cependant, malgr leurs excellentes
proprits conductrices dcrites dans la littrature scientifique, ce polymre conducteur nest
pas capable de connecter le site actif de lenzyme llectrode et ainsi rgnrer le cofacteur
enzymatique de faon satisfaisante.
Le pigeage de la glucose oxydase dans une matrice hte de poly(3,4-
thylnedioxythiophne) (PEDT) conduit la mise en uvre dun biocapteur glucose trs
performant, que ce soit en terme de sensibilit et de domaine de linarit quen terme de
temps de rponse.
Dans ce travail, pour amliorer la slectivit du biocapteur glucose vis--vis des
interfrents nous avons test deux stratgies. La premire est base sur la platinisation des
lectrodes dans le but dabaisser la surtension doxydation du proxyde dhydrogne. Les
rsultats obtenus sont prometteurs et nous encouragent continuer des recherches dans cette
voie. La deuxime mthode est fonde sur lutilisation de mdiateurs lectrochimiques afin de
substituer efficacement loxygne, mdiateur naturel de la raction de la GOD.
Cette tude nous a permis aussi de montrer lapplicabilit du systme biocapteur-FIA.
Dans ce cadre, les perspectives les plus intressantes concernent la possible intgration des
systmes automatiss.
Dans le domaine de lenvironnement, limmobilisation de la polyphnol oxydase
permet llaboration dun biocapteur ampromtrique sensible aux composs
orthodiphnoliques et monophnoliques. Les performances analytiques de ce capteur sont
intressantes tant en sensibilit quen seuil de dtection.
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PUBLICATIONS
RESUME
Les biocapteurs ampromtriques dcrits dans ce travail sont bass sur
limmobilisation denzymes oxydo-rductases dans un polymre conducteur dpos la
surface des lectrodes. Les performances des biocapteurs sont conditionnes par la mthode
dimmobilisation mise en uvre ainsi que par les caractristiques de la matrice qui en rsulte.
Une technique de polymrisation lectrochimique a t utilise pour fixer lenzyme dans un
driv du polythiophne, le poly(3,4-thylenedioxythiophne) (PEDT). Les potentialits de
cette technique ont t dmontres pour deux enzymes diffrentes : la glucose oxydase et la
polyphnol oxydase. Loptimisation des paramtres oprationnels a t conduite dabord en
systme batch, puis tendue au systme danalyse en flux continu (FIA). Ce systme
biocapteur-FIA est trs adapt pour des mesures en continu du glucose dans les chantillons
biologiques. La slectivit de ce biocapteur en prsence de composs interfrents a t
amliore par la platinisation de llectrode, qui rehausse la rponse au glucose, ou
lutilisation des mdiateurs rdox. Un biocapteur polyphnol oxydase exploitant
lamplification enzymatique mise en jeu a permis la dtection des polluants phnoliques
jusqu 50 nM.
Mots cls : Biocapteurs ampromtriques, lectrode enzyme, glucose oxydase,
polyphnol oxydase, PEDT, mdiateurs rdox, FIA, glucose, phnol.
ABSTRACT
The amperometric biosensors presented in this work are based on immobilization of oxido-
reductase enzymes in a conducting polymer deposited on electrode surfaces. The biosensor
performance depends on the immobilisation method and the characteristics of the resulting
matrix. An electrochemical polymerisation technique was used to entrap the enzymes in poly
3,4-ethylenedioxythiophene (PEDT) a polythiophene derivative. Potentialities of this
technique were demonstrated with two enzymes: glucose oxidase and polyphenol oxidase.
Optimized conditions were obtained first with a biosensor operating in batch mode and then
in flow injection analysis (FIA). This latter is quite suitable for monitoring of glucose in
biological samples. Selectivity of this biosensor in the presence of interferent species was
improved by enhancing the response to glucose with electrode platinization or the use of
redox mediators. Enzymatic amplification involved in polyphenol oxidase system allowed the
corresponding biosensor to detect phenolic pollutants down to 50 nM.
Key words : Amperometric biosensor, enzyme electrode, glucose oxidase, polyphenol
oxidase, PEDT, redox mediator, FIA, glucose, phenol.