Unversité de Metz

IUT Thionville-Yutz
S1M1 - Mathématiques

Doc S2 : Dénombrements sur gélose – Partie 1

La détermination de la densité microbienne (du titre microbien) d’un échantillon fait appel à
la statistique car il s’agit d’estimer la densité microbienne d’un système à partir d’échantillons
de ce système.
Ainsi, si les N micro-organismes contenus dans le volume V du système étaient accessibles,
on aurait accès à la valeur vraie de la densité microbienne ( ) comme : .
S’agissant d’échantillons, on aura simplement accès à un nombre X de micro-organismes dans
un petit volume v.
On comprend facilement que X est une variable aléatoire (VA) qui, selon ce que renferme
l’échantillon, se traduira par une réalisation (i.e., une valeur) correspondant au nombre N de
micro-organismes de la fraction .

Si un grand nombre de prélèvements indépendants était réalisé sans épuiser la ressource, l’on
observerait que les réalisations de X se distribueraient selon un certain modèle, traduit par la
loi binomiale .
Or, dans le cas où est petit (i.e. ) et N grand (N > 50), alors la loi binomiale
peut être approximée par la loi de Poisson .

Ainsi, sous les hypothèses d’un milieu prélevé présentant une répartition au hasard des micro-
organismes et de leur répartition homogène dans l’échantillon, la probabilité que l’échantillon
renferme r micro-organismes s’écrit :

En considérant le modèle de Poisson, d’espérance et d’écart-type , il

s’agit donc d’estimer, pour chaque détermination, la valeur du paramètre v.

D’après ce modèle, l’incertitude de l’estimation diminue quand augmente la densité

microbienne de l’échantillon. Ex : pour , tandis que
pour .
D’où l’idée d’une mise en œuvre d’un titrage qui génère un maximum d’observations
chiffrées, afin de réduire l’imprécision (exprimée sous forme d’intervalle de confiance) de
l’estimation. Cela passe par la réalisation de :
- séries de dilutions (n-uplet d’observations pour n niveaux de dilution successifs)
- réplicats (k séries de dilution).

Les réplicats dont il est question ici sont des réplicats vrais (à la différence par exemple de
réplicas de lecture pour lesquels seule la dernière étape expérimentale est répliquée et qui sont
issus d’une même série de dilutions) et indépendants.

Frédéric Quignon 1
Unversité de Metz
IUT Thionville-Yutz
S1M1 - Mathématiques
La détermination de la densité d’un échantillon donné va donc de préférence reposer sur k
séries d’ensemencement indépendants (i = 1, 2 …k) sur boîte de Pétri (BdP), à partir de k
séries de dilution de l’échantillon à titrer.

Ainsi, pour chaque série de dilutions, en considérant l’ensemble des résultats ri obtenus pour
les différentes séries de dilutions, la variable aléatoire R, dont la réalisation est la somme de
tous les comptages réalisés sur les BdP, suit une loi de Poisson de type
.

De plus, pour diminuer l’imprécision de l’estimation, l’on procède en général à plusieurs

titrages indépendants, i.e. à des réplicats.

De plus, pour un nombre limité d’évènements (i.e. de colonies, de plages de lyse…), soit pour
, les limites de l’intervalle de confiance autour de l’estimateur central font référence
à une loi du :

Pour :
avec

avec

Pour un nombre suffisant d’évènements (e.g. colonies, plages de lyse…), soit pour ,
les limites de l’intervalle de confiance autour de l’estimateur central font référence à une loi
Normale, pour donner :

Pour :

Remarque : dans ce dernier cas :

- la référence au modèle de Poisson apparaît clairement (valeur centrale de l’estimation
= et incertitude fonction de )
- la référence au modèle de Gauss (loi normale) – vers lequel tend le modèle de Poisson
pour un nombre d’observations suffisant – se retrouve dans l’expression de
l’incertitude. En effet, décrit une variable qui suit une loi normale centrée
réduite ( ). Par exemple, pour = 5%, .

Pour finir, l’estimation de la densité microbienne de l’échantillon, exprimée en unités (e.g.

UFC, UFP…) par unité de volume d’échantillon, est obtenue en divisant les valeurs
précédentes par :

Frédéric Quignon 2
Unversité de Metz
IUT Thionville-Yutz
S1M1 - Mathématiques

Pour la série i et le niveau de dilution j, est le volume équivalent d’échantillon non

dilué ou le volume équivalent de la dilution de référence

Ex : pour le 3ème tube de la série i de dilution décimale, le volume équivalent vaut :

Les dilutions sont généralement opérées selon un pas régulier (= a), souvent égal à 10
(dilutions décimales), mais la procédure de calcul proposée permet de s’adapter à toutes les
situations, même si le pas de dilution n’a pas toujours la même valeur entre les niveaux de
dilution.

Exemple de calcul (1 détermination)

Un échantillon est dilué selon le schéma suivant. Chaque dilution est initialement ensemencée
(à raison de 0.1 mL/BdP) sur 4 BdP, donc certaines sont finalement éliminées car illisibles
(contaminées).

Dilution # BdP lisibles UFC (ri) ri

1/10 3 17 ; 14 ; 13 44
1/50 4 2;3;1;3 9
1/100 2 0;0 0
# BdP : nombre de boîtes de Pétri ; UFC : Unité Formant Colonie

a) Estimation de la densité bactérienne à partir des résultats 1/10 :

= [ 44 / (3 x 0.1) ] x 10 = 1467 UFC/mL = 1.47 x 10^(3) UFC/mL

Comme ri < 50, les limites de l’intervalle de confiance au risque de 5%, sont obtenues en
référence à une loi du :

D’où :
Li = 30.1 / (3 x 0.1) x 10 = 1003 UFC/mL = 1.00 x 10^(3) UFC/mL
Ls = 59.0 / (3 x 0.1) x 10 = 1970 UFC/mL = 1.97 x 10^(3) UFC/mL

b) Estimation de la densité bactérienne à partir de l’ensemble des résultats :

rij = 44 + 9 + 0 = 53 UFC
vij = (3 x 0.10) + (4 x 0.02) + (2 x 0.01) = 0.4 mL d’échantillon non dilué
Facteur de dilution résiduel = x 10 (car 0.1 mL ensemencé / BdP)

Frédéric Quignon 3
Unversité de Metz
IUT Thionville-Yutz
S1M1 - Mathématiques
D’où :
= (53 / 0.4 ) x 10 = 1325 UFC/mL = 1.32 x 10^(3) UFC/mL

Comme ri > 50, les limites de l’intervalle de confiance (IC) sont obtenues en référence à une
loi normale (z(0.975) = 1.96):

D’où :
Li = 38.76 / 0.4 x 10 = 968 UFC/mL = 0.97 x 10^(3) UFC/mL
Ls = 67.27 / 0.4x 10 = 1682 UFC/mL = 1.68 x 10^(3) UFC/mL

Remarque 1 : les cas a) ou b) conduisent à des valeurs d’estimateur central très proches, mais
l’IC est plus réduit dans le cas b) (plus d’évènements pris en compte).

Remarque 2 : dans certaines normes techniques, les procédures de calcul indiquent de ne

considérer que les résultats ( ) de 2 niveaux de dilution successifs ou compris entre, par
exemple, 30 et 300.

Dans l’exemple numérique, la valeur centrale de l’estimation obtenue avec ( rij = 44 + 9)

serait la même que celle considérée en b), mais l’IC serait légèrement plus large avec vij =
0.38 mL.
En fait, la meilleure estimation (la moins imprécise) est obtenue en considérant le plus
grand nombre d’évènements.

La limite supérieure du nombre de colonies à considérer est bien sûr fonction du nombre de
colonies individuelles aisément dénombrables. La Fig. 1 indique que l’effet de la
‘promiscuité’ sur la boîte n’apparaît pas nettement à 300 ni à 350 UFC/BdP. Il faut donc
comprendre qu’il faut mieux se tromper de quelques unités (la justesse du résultat ne s’en
trouvera pas affectée) plutôt que de perdre en précision en omettant une fraction importante
des résultats obtenus.

Fig. 1 : différence entre les UFC/BdP [CFU/Plate] attendues [Expected] et observées [Observed] pour un
facteur de dilution [Dilution] (et un nombre de colonies) croissant. [Sutton 2006]

Frédéric Quignon 4
Unversité de Metz
IUT Thionville-Yutz
S1M1 - Mathématiques
Concernant la limite inférieure, les expériences pratiques rejoignent l’argument théorique
(modèle de Poisson, Fig. 2), et une recommandation autour de 25 UFC/BdP est raisonnable.
Encore une fois, il n’existe pas de limite fixe et les considérations pratiques doivent
l’emporter : si l’on dénombre par exemple 20 colonies d’aspect semblable aux autres sur les
autres BdP et que l’opérateur est généralement capable de maîtriser la stérilité de son
environnement de travail, le risque de fausser l’estimation demeure très faible.

Fig. 2 : Erreur relative des comptages CFU/BdP pour les faibles valeurs (modèle de Poisson). [Sutton
2006]

Référence
Sutton S. (2006). Counting Colonies, PMF Newsletter, 12 (9), 2-5

Frédéric Quignon 5