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Fondation Nationale de la Sant

MANUEL
PRATIQUE
DANALYSE DE LEAU
4me dition

Fondation
Nationale
de la Sant

Ministre
Sant

Fondation Nationale de la Sant

Manuel Pratique
dAnalyse de lEau
4me dition

Brasilia, 2013

Copyright 2004 Fondation nationale de la sant


Tous droits rservs. La reproduction ou la partie de ce travail, tant que la source et ce
n'est pas la vente ou des fins commerciales.
La responsabilit de copyright textes et images de ce travail est la zone technique.
Le ministre de la Sant institutionnelle peut tre consult dans son intgralit la
bibliothque
Ministre de la Sant virtuelle de la Sant: http://www.saude.gov.br/bvs
Le contenu de cette uvre et d'autres de l'Editeur du ministre de la Sant peut tre
consult sur la page: http://www.saude.gov.br/editora
Dessin: 4me dition 2013 2.000 copies de prparation, de distribution et
d'information:
MINISTRE DE LA SANT
Fondation Nationale de la Sant
Dpartement de sant environnementale
Contrle et Coordination de la qualit de l'eau
Secteur des municipalits du Sud, bloc 4, bloc N, 9e tage, aile sud
CEP: 70070-040, Braslia DF Tl: (61) 3314-6670/6396
Page d'accueil: http://www.funasa.gov.br
Editeur:
Coordination de la Communication Sociale
Division de l'dition et des mdias Rseau
Secteur des municipalits du Sud, bloc 4, bloc N, 2e tage, aile nord
CEP: 70070-040, Braslia DF
Page d'accueil: http://www.funasa.gov.br
Imprim au Brsil
Fiche Catalographique
Brsil. Fondation Nationale de la sant
Manuel pratique d'analyse de l'eau/National Health Foundation 4. ed. Brasilia
: FUNASA, 2013.
150 p.
ISBN
1. Analyse de l'eau. 2. Contrle de la qualit de l'eau. 3. Consommation d'eau (sant
environnementale). I. Titre. II. Srie.
CDU 628
Titres par indexation:
En anglais: Practical manual on water analysis
En espagnol: Manual prctico de anlisis de agua

Sommaire

Prsentation....................................................................5
Examen bactriologique de leau ....................................7
Introduction..............................................................9
Les bactries coliformes..........................................11
Matriel utilis en bactriologie..............................13
Prparation du matriel en verre.............................14
Prparation des milieux de culture..........................15
Comment faire pour utiliser l'eau de dilution
pour la dtermination du NPP de coliformes...........17
Prlvement d'chantillons d'eau pour les
examens bactriologiques.......................................18
Procdures d'examen..............................................21
-- Les coliformes totaux...........................................21
-- Coliformes thermotolrants..................................26
-- Comptage des bactries htrotrophes.................28
-- Coliformes totaux.................................................29
-- Coliformes thermotolrants..................................32
-- Coliformes totaux et Escherichia coli....................36
Strilisation.............................................................38
Analyses physico-chimiques de leau ...........................41
Analyses Titrimtriques...........................................43
-- Gaz carbonique libre...........................................46
-- Chlorures.............................................................48
-- La duret totale....................................................51
-- pH.......................................................................54
Analyses colorimtriques........................................56
-- Le chlore rsiduel libre.........................................56
-- Couleur................................................................57
-- Aluminium...........................................................59

-- Turbidit...............................................................63
-- Temprature.........................................................67
-- Les Fluorures........................................................68
-- Prlvement et conservation des chantillons pour
les analyses physico-chimiques............................74
-- Essai de coagulation (Jar-Test)...............................75
-- Correction du pH de leau traite.........................79
-- Dtermination de la teneur de chlore actif dans
une solution de chlore (hypochlorite de sodium
et hypochlorite de calcium)..................................81
Prparation des Ractifs Utiliss dans les Analyses
Constantes dans ce Manuel...........................................83
Ractifs pour lalcalinit..........................................85
Ractifs pour CO2...................................................87
Ractifs pour lanalyse de chlorures........................89
Ractifs pour lanalyse de la duret.........................91
Ractifs pour lanalyse de laluminium....................94
Ractifs pour lanalyse de fluorures.........................96
Rgles gnrales pour corriger les solutions
titres......................................................................99
Relation de matriels de laboratoire danalyse de
leau......................................................................102
La bioscurit en laboratoire.................................107
Annexe A Collecte et conservation dchantillons
pour Comptage des cellules de cyanobactries et
cyanotoxines .............................................................. 111
Annexe B Dtermination du Giardia sp et du
Cryptosporidium sp dans leau par la technique de
filtration, de sparation immunomagntique et de
microscopie de limmunofluorescence........................119
Bibliographie...............................................................143
Elaboration..................................................................147

Prsentation
Ce manuel, rdig de faon et en en langage simple, vise
aider les personnes qui travaillent les laboratoires de
contrle de qualit des installations de traitement d'eau
pour les petites et moyennes entreprises, dvelopper leurs
activits quotidiennes.
L'ide est venue de la ncessit de disposer d'un instrument
dans le laboratoire de recherche qui pourrait accompagner
les pas des techniciens chaque instant et dans nimporte
o.
Dans ce manuel sont dcrites les procdures les plus courantes qui sont ralises en routine dans le laboratoire d'une
station de traitement de l'eau (ETA). Toutes les techniques
utilises dans ce manuel rpondent l'article 22 du Dcret
n 2.914/2011 du Ministre de la Sant, qui est en accord
avec les standards nationaux et internationaux les plus
rcents, telles que I) Standard Methods for the Examination
of Water and Wastewater, dautorit parmi les institutions
American Public Health Association (APHA), American
Water Works Association (AWWA) et Water Environment
Federation (WEF); II) United States Environmental Protection Agency (EPA), III), standards publies par l'International Standartization Organization (ISO); ainsi que des
mthodologies proposes par l'Organisation mondiale de
la sant (OMS). Chaque procdure aborde ici ncessitant
une connaissance plus approfondie, doit faire lobjet dune
consultation des principaux manuels traitant du sujet.
La premire partie de l'ouvrage aborde les examens bactriologiques comprenant la recherche de coliformes totaux et
thermo-tolrants, dont lEscherichia coli ainsi que le comptage standard des bactries htrotrophes, jusqu la prparation du matriel utilis, passant par la ralisation dessais

jusqu lobtention de rsultats. Dans la deuxime partie sont


dcrites les techniques danalyses physico-chimique ainsi
que les tests de routine d'un ETA et enfin la prparation de
tous les ractifs utiliss. Ont galement t inclues quelques
procdures de bioscurit en laboratoire, ainsi que la liste
des quipements et matriels de laboratoire.
L'annexe I prsente les techniques de collecte et de conservation des chantillons pour le comptage des cellules de cyanobactries et cyanotoxines. Dans l'Annexe II est dcrite la
technique de dtermination du Giardia et du Cryptosporidium
sp dans l'eau par la technique de filtration, de sparation immuno-magntique et de microscopie immuno-fluorescence.
Nous pensons que les paramtres dcrits ici sont suffisants
pour surveiller le contrle de la qualit de l'eau distribue
pour la consommation humaine.
L'examen de leau destine la consommation humaine est
d'une importance capitale, car elle mesure labsence ou non
de micro-organismes ou de produits chimiques prsents dans
l'eau, ce qui peut tre nocif pour la sant des gens.

Examen bactriologique de leau


Coliformes totaux
Coliformes thermo-tolrants
Bactries htrotrophiques

Introduction

La dtection et la quantification de tous les micro-organismes


prsents dans l'eau et potentiellement pathognes prend du
temps, les cots sont levs et les rsultats obtenus ne sont
pas toujours positifs ou ne permettent pas de confirmer la
prsence de micro-organismes.
L'objectif de lexamen microbiologique de leau est de fournir des informations quant la potabilit, c'est dire sans
risque d'ingestion de micro-organismes qui causent des
maladies, provenant gnralement dune contamination par
des matires fcales humaines ou dautres animaux sang
chaud. Soulignons que les micro-organismes prsents dans
les eaux naturelles sont pour la plupart inoffensifs pour la
sant humaine. Mais dans la contamination par les eaux uses
certains micro-organismes qui sont prsents et peuvent tre
nocifs pour la sant humaine.
Ces micro-organismes pathognes incluent notamment les
virus, les bactries, les protozoaires et les helminthes.
Dans ce tableau sont listes quelques maladies vhicules
par leau et ses agents
Maladies
DOrigine bactrienne
la Typhode et la paratyphode
La dysenterie bacillaire
le cholra
la Gastro-entrite aigu et la diarrhe

DOrigine virale
L'hpatite A et E
La polio
La Gastro-entrite aigu et chronique

DOrigine parasitaire
dysenterie amibienne
parasite gastro-entrite

Agents pathognes
Salmonelle typhique
Salmonelle parathyphique A et B
Shigella sp
Vibrio cholerae
Escherichia coli Entrotoxique Campylobacter
Yersinia enterocolitica
Salmonelle
Shigella sp
Virus de lhpatite A et E
Virus de la poliomilite
Virus Norwalk
Rotavirus
Enterovirus
Adenovirus

Entamoeba histolytica
Girdia lmblia
Cryptosporidium

Source: Opas, 1999


Manuel Pratique dAnalyse de lEau

L'eau potable ne doit pas contenir de micro-organismes


pathognes et doit tre libre de bactries indicatrices de
contamination fcale. Comme les indicateurs de contamination fcale, les bactries du groupe coliformes sont choisies
comme bactries de rfrence. Le principal reprsentant de
ce groupe de bactries est appel Escherichia coli.
La raison du choix de ce groupe de bactries comme indicateur de contamination de l'eau est due aux facteurs suivants:
a. On les trouve dans les excrments des animaux
sang chaud, y compris les humains;
b. elles sont facilement dtectables et quantifiables
par des techniques simples et conomiquement
viables, sur n'importe quel type d'eau;
c. Sa concentration dans l'eau contamine a une
relation directe avec le degr de contamination
fcale de cette dernire;
d. elle a la dure de survie la plus importante chez
les bactries pathognes intestinales, car elles
sont moins exigeantes sur le plan nutritionnel et
sont incapables de se multiplier dans le milieu
aquatique ou se multiplient moins que les bactries entriques;
e. EIles sont plus rsistantes aux dsinfectants et aux
agents tensioactifs que les bactries pathognes.
Le dcret n 2.914/2011 du Ministre de la Sant (dcret
de potabilit) tablit la ncessite d'tre vrifi dans l'eau
potable, pour assurer sa potabilit, l'absence de coliformes
totaux et d'Escherichia coli daprs le comptage des bactries
htrotrophes.

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Le mme dcret prvoit que le comptage des bactries htrotrophes devra tre effectu comme l'un des paramtres
permettant d'valuer l'intgrit du systme de distribution
(rservoir et rseau) devant tre effectu dans 20% des
chantillons mensuels de coliformes totaux dans les rseaux
de distribution, recommandant qu'il ne devra pas dpasser
500 units formatrices de colonies pour 1 ml d'chantillon
(500 ufc/ml).
Afin de respecter le standard de qualit microbiologique de
la potabilit, l'absence de coliformes totaux dans 100 ml
dchantillon la sortie du traitement est obligatoire. Toutefois, conformment l'annexe I du dcret n 2.914/2011 MS,
on admet la prsence de coliformes totaux dans seulement
1 chantillon mensuel pour des systmes ou des solutions
collectives qui approvisionnent moins de 20.000 habitants
et dans 5% des chantillons mensuels des solutions collectives ou des systmes qui approvisionnent plus de 20.000
habitants. Il est noter que dans les deux cas la prsence
d'Escherichia coli dans l'eau potable n'est pas permise.

Les bactries coliformes


Concepts:
les Coliformes totaux (bactries coliformes) bacilles
gram-ngatifs, arobies ou anarobies facultatifs, non sporuls, oxydase-ngatifs, capables de dvelopper en prsence
de sels biliaires ou dagents tenso-actifs qui fermentent le
lactose en produisant de l'acide, du gaz et de l'aldhyde
35,0 0,5oC pendant 24-48 heures, et qui peuvent prsenter
une activit enzyme galactosit. La majorit des bactries
coliformes appartiennent au genre Escherichia, Citrobacter,
Klebsiella et Enterobacter, bien que plusieurs autres genres
et espces appartiennent galement au groupe;
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

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coliformes fcaux (thermo-tolrants) sous-groupe de


bactries coliformes qui fermentent le lactose 44,5 0,2oC
sous 24 heures, dont le principal reprsentant est la bactrie
Escherichia, d'origine exclusivement fcale;
Escherichia coli bactrie du groupe coliforme qui fermente la lactose et le mannitol, produisant de l'acide et du
gaz 44,5 0,2oC pendant 24 heures, produit de lindole
partir de tryptophane, oxydase ngative, nhydrolyse pas
l'ure et prsente les enzymes -galactosidase et la glucuronidase, et est considr comme l'indicateur le plus prcis
de la contamination fcale rcente et de prsence ventuelle
de micro-organismes pathognes.
L'origine fcale de E. coli est incontestable et sa nature
omniprsente peu probable, ce qui valide son rle prcis
dorganisme indicateur de contamination tant dans les eaux
naturelles que traites.
Le comptage standard des bactries est trs important pendant
le processus de traitement de l'eau, car il permet d'valuer
l'efficacit des diffrentes tapes de traitement.
Il est galement important de connatre la densit des bactries car une augmentation considrable de la population bactrienne peut nuire la dtection des organismes coliformes.
Bien que la plupart de ces bactries ne soit pas pathognes,
elles peuvent prsenter des risques pour la sant, ainsi pour
que la qualit de l'eau, provoquant des odeurs et saveurs
dsagrables.

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Matriel utilis en bactriologie


a) autoclave;
b) incubateur biologique;
c) incubateur de strilisation et de de schage;
d) balance;
e) distillateur;
f) bain-marie;
g) compteur de colonies;
h) anse de platine avec cble;
i) tube Durhan;
j) tube essai;
k) milieux de culture;
l) coton;
m) flacons de collecte;
n) pipettes gradues;
o) pipeteur;
p) papier aluminium;
q) lampe alcool ou bec Bunsen;
r) botes de Ptri;
s) pincettes en acier inoxydable;
t) filtres membrane;
u) porte-filtres en verre ou en acier inoxydable;
v) lampe ultra-violet.

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Prparation du matriel en verre


Tubes essai
a) placer le tube de Durham en position inverse l'intrieur
du tube essai;
b) boucher le tube essai avec un tampon d'ouate.

Flacons de collecte
a) mettre deux gouttes (0,1 ml) de thiosulfate de sodium
10% dans le flacon;
b) placer une bande de papier aluminium entre le goulot et
le bouchon de la bouteille;
c) envelopper le goulot et le bouchon dans du papier aluminium.

Pipettes
a) mettre une petite boule de coton dans la buse de la pipette;
b) l'envelopper dans du papier aluminium ou du papier kraft.

Botes de Ptri en verre


a) les envelopper dans du papier d'aluminium ou du papaier
kraft.
Remarque: les flacons de collecte, les pipettes et les botes de
Petri doivent tre striliss et avant d'tre prpars ils
doivent tre propres et secs (voir la strilisation p 38.).

Milieux de culture
a) Bouillon lactos;
b) Bouillon lactos bili au vert brillant 2%;
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c) Bouillon EC;
d) Plate Count Agar.

Prparation des milieux de culture


Bouillon lactos concentration double
a) peser 26 grammes de milieu de culture et les dissoudre
dans 1.000 ml deau distille;
b) rpartir dans des tubes essai (10 ml dans chaque tube),
fermer les tubes;
c) striliser 121oC (1 Kg/cm2 de pression) en autoclave
durant 15 minutes;
d) laisser refroidir;
e) garder au rfrigrateur (valable pendant une semaine).

Bouillon lactos concentration simple


a) peser 13 grammes de milieu de culture dshydrat et les
dissoudre dans 1.000 ml deau distille;
b) distribuer dans des tubes essai (10 ml dans chaque tube),
fermer les tubes;
c) striliser 121oC (1 Kg/cm2 de pression) en autoclave
durant 15 minutes;
d) laisser refroidir;
e) conserver au rfrigrateur (valable pendant une semaine).

Bouillon lactos bili vert brillant 2%


a) peser 40 grammes de milieu de culture dshydrat et les
dissoudre dans 1.000 ml deau distille;
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

15

b) repartir dans des tubes essai (10 ml dans chaque tube),


fermer les tubes;
c) striliser 121oC (1 Kg/cm2 de pression) en autoclave
pendant 15 minutes;
d) laisser refroidir;
e) conserver au rfrigrateur (valable pendant une semaine).

Milieu EC
a) peser 37,0 grammes de milieu dshydrat et les dissoudre
dans 1000 ml deau distille;
b) rpartir dans des tubes essai dont le tube Durhan inverti,
10 ml dans chaque tube, fermer les tubes;
c) striliser 121oC (1Kg/cm2 de pression) en autoclave
pendant 15 minutes;
d) conserver au rfrigrateur (valable pendant 96 heures).

Plate Count Agar


a) peser 20,5 grammes de milieu de culture dshydrat et
les dissoudre dans 1000 ml deau distille froide;
b) laisser reposer pendant 5 minutes;
c) chauffer en remuant frquemment avec un bton de verre
jusqu la dissolution complte du milieu (ne pas porter
bullition);
d) si ncessaire, ajuster le pH 7,0 avec de lhydroxyde de
sodium en solution normale (NaOH 1N);
e) rpartir dans des tubes essai bouchon vis (12 ml dans
chaque tube);
f) striliser 121oC (1 Kg/cm2 de pression) en autoclave
pendant 15 minutes.
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Remarques:

1. Ce milieu se solidifie aprs refroidissement. Fondre dans
un bain-marie avant usage.

2. D la varit des milieux de culture existant sur le march, toujours suivre les instructions du fabricant qui sont
imprimes sur ltiquette du flacon.

Eau de dilution
Solution 1
- peser 34 grammes de phosphate de potassium monobasique (KH2PO4) et dissoudre dans 500 ml deau distille,
ajuster le pH 7,2 avec une solution dhydroxyde de
sodium de solution 1N et diluer 1 litre avec de leau
distille. On a besoin normalement de 175 ml de NaOH
1N pour augmenter le pH.
Solution 2
- peser 81,1 grammes de chlorure de magnsium hxahydrat (MgCl2.6H2O) et dissoudre dans 1 litre deau distille
Solution 3
- mlanger 1,25 ml de la solution 1 et 5 ml de la solution 2
avec 1 litre deau distille. Rpartir dans des tubes essai
dans des quantits, qui, aprs lautoclavage assurent un
volume de 9 0,2 ml.
- striliser en autoclave 121oC (1Kg/cm2 de pression)
pendant 15 minutes.

Comment faire pour utiliser l'eau de dilution


pour la dtermination du NPP de coliformes
a) prendre 1 tube essai contenant 9 0,2 ml deau de
dilution strilise;
b) ajouter 1 ml dchantillon deau tre examine;
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

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c) bien mlanger. Quand la dilution est de 1:10;


d) prlever de la dilution en haut, avec une pipette strilise, 1 ml et linoculer dans le tube contenant le bouillon
lactos concentration simple (dilution 1:100).

Prlvement d'chantillons d'eau pour les


examens bactriologiques
Le prlvement des chantillons est l'une des tapes les
plus importantes pour l'valuation de la qualit de l'eau. Il
est donc essentiel que l'chantillonnage soit effectu avec
prudence et de la technique afin dviter toutes les sources
possibles de contamination.
Les chantillons doivent tre prlevs dans des flacons en
verre blanc, haut vas, avec un bouchon en verre rod,
dune capacit de 125 ml, striliss au pralable ou dans
des sacs plastiques striles, jetables; contenant une pastille
de thiosulfate de sodium.
Les flacons pour la collecte deaux chlores doivent recevoir,
avant d'tre striliss, 0,1 mL (2 gouttes) de thiosulfate de
sodium 10%.

Procdure pour les prlvements dans les maisons


a) se laver les mains avec de leau et du savon;
b) nettoyer le robinet avec un morceau de coton imbib
dalcool 70% et/ou avec de l'hypochlorite de sodium
100mg/L;
c) ouvrir le robinet et laisser couler leau pendant 1 ou 2
minutes;
d) collecter lchantillon deau;
18

Fondation Nationale de la Sant

e) remplir environ au du volume;


f) fermer le flacon et lidentifier en marquant ladresse,
lheure, le nom du collecteur, etc.;
g) marquer le flacon avec le numro dchantillon correspondant au point de collecte;
h) remplir la fiche didentification de lchantillon deau;
i) mettre le flacon contenant lchantillon dans une caisse
d isopor avec de la glace;
j) sceller, identifier et envoyer la caisse au laboratoire.
Le temps entre la collecte et lexamen de lchantillon ne
doit pas excder 24 heures.
Note: En plus des maisons, les chantillons peuvent tre collects dans les hpitaux, les coles, les robinets publics, ainsi
que tous les points considrs comme vulnrables. En cas
dutilisation dhypochlorite de sodium pour la dsinfection
du robinet, il doit tre retir compltement avant la collecte
deau.

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

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Les diffrentes phases

Source: OMS, 1998 (adapt)

Autres endroits de collecte


Dans les stations de traitement, les chantillons peuvent tre
collects dans la captation, larrive de leau brute avant
le canal de Parshall, dans les carafes, la sortie des filtres et
des rservoirs deau traite.

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Procdures d'examen
Les coliformes totaux
Mthode des tubes multiples (TM)
Matriel ncessaire:
a) tube essai
b) tagre pour tube essai
c) Tube Durhan
d) pipette gradue de 10 ml
e) pipette gradue de 1 ml
f) bec Bunsen ou une lampe alcool
g) bouillon lactos double concentration
h) bouillon lactos simple concentration.
i) bouillon lactos bili vert brillant 2%.
j) eau de dilution
k) anse de platine avec cble Kolle
l) incubateur biologique

Excution du test
Test prsomptif
a) prendre une batterie contenant 15 tubes essai rpartis
de 5 en 5;
b) inoculer avec une pipette strilise dans les 5 premiers tubes (ceux qui contiennent le bouillon lactos
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

21

concentration double) 10 ml dchantillon d'eau


tre examine dans chaque tube. (Dilution 1:1);
c) dans les 10 tubes restant (ceux qui contiennent le bouillon lactos concentration simple), inoculer dans les
5 premiers 1 ml dchantillon (dilution 1:10) et dans
les 5 derniers tubes, inoculer 0,1 ml d'chantillon dans
chaque tube. (Dilution 1:100). Voir page 15;
d) mlanger;
e) incuber 35 0,5oC pendant 24/48 heures;
f) si, aprs 24/48 heures, il y a formation de gaz dans le
tube de Durhan, cela signifie que le test prsomptif a
t positif. Dans ce cas, effectuer un test de confirmation. Si aucune formation de gaz na eu lieu au cours
de l'incubation, l'examen se termine ce stade et le
rsultat du test est ngatif.
Observation: la place du bouillon lactos on peut utiliser du
bouillon tryptose lauryl.

Test de confirmation
a) prendre les tubes du test prsomptif qui ont t positifs
(qui ont form du gaz) dans trois 3 dilutions 1:1, 1:10
et 1:100;
b) prendre un nombre gal de tubes contenant le milieu
de culture bili vert brillant 2%;
c) avec une anse de platine, prcdemment flambe puis
refroidie, retirer de chaque tube positif une partie de
l'chantillon positif et inoculer dans le tube correspondant contenant le milieu vert brillant. Cette procdure
est appele repiquage;
d) identifier les tubes;
e) incuber pendant 24/48 heures 35 0,5oC;
22

Fondation Nationale de la Sant

f) si la fin de la priode dincubation de l'heure 24/48


on observe la formation de gaz dans le tube essai
Durham, le test est considr comme positif. Sil ny a
pas de formation de gaz, le test est considr comme
ngatif.

Phases du test
Inoculer dans CL ou CLT
et inoculer pendant 24 2
heures 35 0,5oC
(A) Formation de gaz ou forte
augmentation.
Confirmer avec VB 35
0,5oC pendant 24/48 heures

1) Ne produit pas de
gaz. Absence de groupe coliforme

2) Produit du gaz.
Groupe coliforme
confirm.

(B) Absence de gaz ou production douteuse. Incuber pendant


+ 24 heures

1) Production de gaz ou
production douteuse et forte augmentation. Confirmer
comme dans (A)

2) Absence de gaz. Test


ngatif pour le groupe
coliforme

Note: CL = bouillon lactos


CLT = bouillon tryptose lauryl
VB = bouillon bili vert brillant 2%

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Expression des rsultats


a) Les rsultats sont exprims en NMP (nombre plus Probable)/100 ml d'chantillon.
b) pour dterminer la NMP, on vrifie la combinaison forme
par le nombre de tubes positifs qui prsentent les dilutions
1:1, 1:10 et 1:100 dans le test de confirmation.

Exemple:
a) Dans 5 tubes de dilution 1:01, on a obtenu 3 tubes positifs;
b) dans 5 tubes de dilution 1:10, on a obtenu deux tubes
positifs;
c) dans les 5 tubes de dilution 1:100, on a obtenu un tube
positif;
d) la combinaison suivante sest forme: 3-2-1;
e) on dtermine les N.M.P en consultant le tableau 1.
Si vous ne voulez pas travailler avec 15 tubes pour dterminer
la NMP, faire seulement cinq tubes pour la dilution 1:1 (10
ml de milieu de culture + 10 ml d'chantillon) et calculer le
NMP en consultant le tableau 2.

24

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Tableau 1 N.M.P. avec un taux de confiance de 95% pour les


diffrentes combinaisons de rsultats positifs lorsque 5 tubes
sont utiliss pour chaque dilution (10 ml, 1,0 ml et 0,1 ml)
Combinaison
de positifs

N.M.P./100 mL

0-0-0
0-0-1
0-1-0
0-2-0
1-0-0
1-0-1
1-1-0
1-1-1
1-2-0
2-0-0
2-0-1
2-1-0
2-1-1
2-2-0
2-3-0
3-0-0
3-0-1
3-1-0
3-1-1
3-2-0
3-2-1
4-0-0
4-0-1
4-1-0
4-1-1
4-1-2
4-2-0
4-2-1
4-3-0
4-3-1
4-4-0
5-0-0
5-0-1
5-0-2
5-1-0
5-1-1
5-1-2
5-2-0
5-2-1
5-2-2
5-3-0
5-3-1
5-3-2
5-3-3
5-4-0
5-4-1
5-4-2
5-4-3
5-4-4

<2
2
2
4
2
4
4
6
6
4
7
7
9
9
12
8
11
11
14
14
17
13
17
17
21
22
26
26
27
33
34
23
30
40
30
50
60
50
70
90
80
110
140
170
130
170
220
280
350

Limites
Infrieur

Suprieur

1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
2.0
2.0
1.0
2.0
2.0
3.0
3.0
5.0
3.0
4.0
4.0
6.0
6.0
7.0
5.0
7.0
7.0
9.0
12
9.0
12
12
15
16
9
10
20
10
20
30
20
30
40
30
40
60
80
50
70
100
120
160

10
10
13
11
15
15
18
18
17
20
21
24
25
29
24
29
29
35
35
40
38
45
46
55
63
56
65
67
77
80
86
110
140
120
150
180
170
210
250
250
300
360
410
390
480
560
690
820

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

25

Suite du tableau 1
Combinaison
de positifs

N.M.P./100 mL

5-5-0
5-5-1
5-5-2
5-5-3
5-5-4
5-5-5

240
300
500
900
1600
1600

Limites
Infrieur

Suprieur

100
100
200
300
600
-

940
1300
2000
2900
5300
-

Source: APHA, 1985

Tableau 2 N.M.P. dans une confiance limite 95% pour


des rsultats positifs lorsque 5 tubes de 10 ml sont examins
Combinaison
de positifs

N.M.P./100 mL

0
1
2
3
4
5

< 2,2
2,2
5,1
9,2
16,0
>16,0

Limites
Infrieur

Suprieur

0
0,1
0,5
1,6
3,3
8,0

6,0
12,6
19,2
29,4
52,9
Infinito

Source: APHA, 1985

Coliformes thermotolrants
Mthode des tubes multiples (TM)
Matriel ncessaire:
a) tubes essai avec le milieu CE;
b) un bec Bunsen ou une lampe alcool;
c) une anse de platine;
d) un bain-marie.

26

Fondation Nationale de la Sant

Excution du test
a) prendre tous les tubes du test prsomptif qui ont t
positifs (formation de gaz) et tous les tubes ngatifs
dans lesquels il y a eu augmentation aprs 48 heures
sur trois dilutions (1:1, 1:10 et 1:100);
b) transfrer, avec une anse en platine flambe puis refroidie, une partie des tubes essai contenant le milieu
EC;
c) mlanger et laisser tous les tubes dans un bain deau
pendant 30 minutes;
d) incuber dans un bain-marie 44,5 0,2oC pendant 24
2 heures;
e) si aprs 24 heures ou moins, il y a une formation de gaz,
cela indique la prsence de coliformes thermotolrants;
f) calculer le N.M.P en consultant le tableau 1.
Remarque: Remarque: Ce test doit tre ralis en mme temps que
le test de confirmation pour les coliformes totaux.
Observation: Toujours effectuer ce test chaque fois que des tests
de confirmation pour les coliformes totaux sont effectus.

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

27

Comptage des bactries htrotrophes


Matriel ncessaire:
a) une bote de Ptri;
b) une pipette gradue;
c) un bec Bunsen ou une lampe alcool;
d) plate Count Agar (PCA);
e) un incubateur biologique;
f) un compteur de colonies.
Excution du test
a) transfrer laide dune pipette strile, 1 ml de l'chantillon pralablement strilis dans une bote de Ptri;
b) entrouvrir la plaque et ajouter le milieu de culture,
pralablement fondu et stabilis dans un bain-marie
44-46oC, contenu dans un tube essai;
c) homogniser le contenu de la plaque en faisant des
mouvements circulaires de faon modre (), environ
10 fois de suite;
d) lorsque le milieu de culture se solidifie, incuber la
plaque en position inverse 35 0,5oC pendant 48
3 heures;
e) la fin de la priode d'incubation, compter les colonies
l'aide d'un compteur de colonies.

28

Fondation Nationale de la Sant

Expression des rsultats


Les rsultats sont exprims en nombre de colonies de
bactries/ml ou units formatrices de colonies (UFC)/ml.

Remarques:
a) avant de commencer les essais, dsinfecter la paillasse du
laboratoire en utilisant une solution d'alcool thylique
70% ou un autre dsinfectant qui ne laisse pas de rsidus;
b) Tous les chantillons doivent tre examins doivent tre
homogniss au moins 25 fois;
c) ne pas oublier de flamber le goulot des tubes essai
contenant des milieux de culture avant de les utiliser;
d) le thiosulfate de sodium 10% plac dans les flacons de
collecte sert neutraliser l'action du chlore;
e) les botes de Petri doivent tre places en position inverse
pour viter la condensation sur la surface de la glose
(agar);
f) effectuer un comptage standard des bactries htrotrophes toujours en double.

Coliformes totaux
Mthode de la membrane filtrante (MF)
Matriel ncessaire:
a) quipement de filtration avec un porte-filtre;
b) bote de Petri strilise de 47 mm;
c) filtres de membrane de 47 mm dune porosit de
0,45m, avec un carton absorbant;
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

29

d) milieu de culture (m Endo Broth MF);


e) Eau de dilution strile;
f) pinces en acier inoxydable;
g) verre en acier inoxydable;
h) bec Bunsen ou une lampe alcool;
i) pompe vide (seringue);
j) incubateur biologique.
Excution du test
a) en utilisant une pince, mettre soigneusement un carton
absorbant dans une bote de Ptri;
b) avec une pipette strilise mettre 1,8 ml de milieu de
culture sur le carton absorbant et recouvrir la plaque;
c) placer le filtre membrane dans le porte-filtre avec la
pince prcdemment flambe et refroidie;
d) agiter le flacon contenant l'chantillon au moins 25 fois;
e) dboucher et flamber le goulot de la bouteille;
f) verser soigneusement 100 ml dchantillon dans le
porte-filtre, en vitant que leau nclabousse les bords
suprieurs;
g) allumer la pompe vide (seringue) et aspirer;
h) aprs avoir filtr l'chantillon, laver trois fois les parois
de l'entonnoir avec de leau de dilution strile hauteur
de 20 ml chaque fois en appliquant le vide;
i) aprs le lavage et le filtration, enlever le vide et retirer
lentonnoir du support;

30

Fondation Nationale de la Sant

j) retirer le porte-filtre du support et le mettre dans une


bote de Ptri, prpare au pralable, avec le ct
quadrill vers le haut laide dune pince flambe et
refroidie;
k) fermer la bote de Ptri et lincuber inverse 35oC
pendant 24 2 heures;
l) aprs la priode d'incubation, examiner le filtre et
effectuer le comptage des colonies.
Lecture des rsultats
Les colonies de coliformes totales typiques ont une couleur
rose au rouge fonc avec un clat mtallique.
Le brillant peut apparatre au centre ou la priphrie de
la colonie. Les non coliformes apparaissent en rouge-clair
ou fonc sans le brillant mtallique caractristique.
Observation: Parfois, lorsque le disque est trop humide et la
source de lumire trs intense, les colonies de coliformes peuvent apparatre avec un brillant fauss,
causant des erreurs. Cela peut tre contourn en
utilisant une source de lumire plus diffuse ou en
schant le filtre avant examen.

Prparation d'un milieu de culture


Matriel ncessaire:
a) du milieu de culture dshydrat (m Endo Broth MF);
b) de leau distille;
c) de lalcool thylique 95%;
d) flacon Erlenmeyer de125 ml;
e) un verre de montre;
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

31

f) un bec Bunsen ou une lampe alcool.


Technique
a) peser 4,8 grammes de milieu dshydrat;
b) transfrer dans le flacon Erlenmeyer;
c) ajouter lentement 100 ml deau distille contenant 2
ml d'alcool thylique 95%;
d) chauffer au bain-marie ou au bec de bunsen jusqu'au
dbut de l'bullition (ne pas faire bouillir);
e) laisser refroidir;
f) rpartir 1,8 ml sur chaque plaque.
Observation: 1. Ne prparer que la quantit ncessaire pour une
utilisation. Ce milieu peut tre achet dans des ampoules de 2 ml, mais le cot est trs lev. Il est plus
conomique de le prparer au laboratoire.

2. Pour remplacer le milieu m Endo Broth MF, op
peut utiliser un milieu solide (glose Endo LES).

Coliformes thermotolrants
Mthode de la membrane filtrante (MF)
Matriel ncessaire:
a) quipement de filtration avec porte-filtre;
b) plaque strile de 47 mm ;
c) filtres membrane de 47 mm dune porosit de 0,45
m avec un carton absorbant;
d) milieu de culture (m FC broth base);
e) eau de dilution strile;
32

Fondation Nationale de la Sant

f) pinces en acier inoxydable;


g) verre en acier inoxydable;
h) bec bunsen ou petite lampe alcool;
i) pompe vide (seringue);
j) incubateur bactriologique ou bain-marie.
Prparation du milieu de culture
Matriel ncessaire:
a) milieu de culture dshydrat (m FC Broth Base);
b) eau distille;
c) acide rosolique 1% en NaOH 0,2 N;
d) flacon Erlenmeyer de 125 ml;
e) verre de montre;
f) bec bunsen ou une petite lampe alcool.
Technique
a) peser 3,7 grammes du milieu dshydrat;
b) transfrer dans un flacon Erlenmeyer;
c) dissoudre le milieu pes dans 100 ml deau distille;
d) ajouter 1 ml de la solution dacide rosolique 1%;
e) chauffer jusqu bullition;
f) laisser refroidir;
g) rpartir 2,0 ml sur chaque plaque.
Remarque:

1. Ne prparer que la quantit ncessaire pour l'utilisation;


Manuel Pratique dAnalyse de lEau

33

2. Ce milieu peut tre achet dans des ampoules de


2 ml, mais le cot est trs lev. Il est plus conomique de le prparer dans le laboratoire;
3. Pour prparer l'acide rosolique 1%, dissoudre 1
gramme de l'acide dans 100 ml de NaOH 0,2 N;
4. Pour prparer le NaOH 0,2 N diluer 20 ml de la
solution 1N dans 100 ml eau distille;
5. Lacide rosolique est valable 2 semaines au
moins, lorsqu'il est conserv au rfrigrateur (2
10oC). Jeter lorsque la couleur passe du rouge au
brun fonc;
6. Ce milieu peut tre rendu solide par addition de
1,2 1,5% de glose avant l'bullition.

Excution de l'essai
a) placer soigneusement un carton absorbant dans la bote
de Petri en utilisant une pince;
b) avec une pipette strile placer 2,0 ml de milieu de
culture sur le carton absorbant et refermer la plaque;
c) placer la membrane filtrante sur le porte-filtre laide
de la pince prcdemment flambe puis refroidie;
d) agiter le flacon contenant l'chantillon, au moins 25
fois;
e) ouvrir et flamber le goulot de la bouteille;
f) verser soigneusement dans 100 ml d'chantillon dans
le porte-filtre, en vitant que l'eau nclabousse les
bords suprieurs;
g) allumer la pompe vide (seringue) et aspirer;
h) aprs avoir filtr l'chantillon, laver trois fois les parois
de l'entonnoir avec de leau de dilution strile par 20
ml par le vide;
i) aprs le lavage et la filtration, vacuer le vide et retirer
lentonnoir du support;
34

Fondation Nationale de la Sant

j) avec une pince flambe puis refroidie, retirer le filtre et


le mettre dans la bote de Ptri, le ct quadrill vers
le haut;
k) fermer la bote de Ptri et lincuber inverse 44,5
0,2oC pendant 24 2 heures;
l) Une fois la priode d'incubation termine, examiner
le filtre en effectuant le comptage des colonies;
m) les colonies indicatives de coliformes fcaux (thermotolrants) apparaissent en bleu. Les non coliformes
apparaissent avec une coloration claire ou rose.

Strilisation de lensemble de filtration dans le champ


a) humidifier soigneusement l'anneau damiante situ la
base du support avec un demi-bouchon dalcool mthylique (bouchon du flacon dalcool);
b) allumer le feu;
c) placer la cuve en acier au-dessus de l'entonnoir presque
en le bouchant;
d) aprs avoir chauff la cuve jusquau supportable pour la
main, fermer le support;
e) attendre environ 15 minutes, puis retirer la cuve et rincer
l'entonnoir avec de leau de dilution strile afin d'liminer
tout rsidu toxique.
Observations: 1. La combustion incomplte du mthanol provoque la formation de formaldhyde qui est l'agent
strilisant;

2. Le porte-filtre doit tre strile au dbut de chaque
srie de filtration et cette srie ne doit pas dpasser
30 chantillons. A chaque srie de filtration examiner 100 ml d'eau de dilution pour contrler la strilit du porte-filtre;
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

35

3. Les milieux de culture prpars pour une utilisation avec une membrane filtrante sont valables
pendant 96 heures sils sont gards au rfrigrateur
une temprature entre 2 et 10oC;
4. Lensemble de filtration peut tre galement strilis en autoclave.

Coliformes totaux et Escherichia coli


Tests de prsence/absence
Substrat mthode chromognique
Le choix d'une mthodologie pour procder des examens
bactriologiques est fait selon celle qui est la mieux adapte aux conditions du laboratoire, mais elle doit adopter
comme standard les mthodologies, les frquences et
linterprtation des rsultats tablis et recommands par
la lgislation en vigueur.
Les mthodes de tubes multiples (TM) et de la membrane
filtrante (MF), sont encore largement utilises, mais entre
temps loption de la mthode de substrat chromognique-fluorognique dfini est communment adopte
pour sa facilit la manipulation, ainsi que pour avoir un
rapport cot/bnfice dj prouv.
La mthode est base sur les activits enzymatiques
spcifiques des coliformes (bta-galactosidase) et E. coli
(bta-glucuronidase). Les milieux de culture contiennent
des nutriments indicateurs (substrat chromogne) qui,
hydrolyss par des enzymes spcifiques de coliformes et/
ou E. coli, provoquent un changement de couleur dans le
milieu. Aprs la priode d'incubation, si la couleur jaune
est observe, des coliformes totaux sont prsents. Si une
fluorescence bleue est observe la lumire ultraviolette
(UV) 365 nm, le E coli est prsent.
36

Fondation Nationale de la Sant

Au-del dune plus grande prcision, cette mthode a


comme avantage le temps de rponse, tant donn que la
dtermination simultane de coliformes totaux et E-coli est
effectue aprs incubation des chantillons 35oC pendant
24 heures, sans ncessit deffectuer dessais confirmatifs.
Matriel ncessaire:
a) un rcipient de collecte en verre ou en plastique;
b) du substrat chromo gnique (ONPG)/fluorogne (MUG);
c) un incubateur biologique;
d) une lampe ultra-violet de 365 nm.
Excution de lessai
a) collecter l'chantillon (100 ml) dans un flacon strile
ou dans un sac de collection contenant du thiosulfate
de sodium 10% pour leau traite;
b) dans le flacon-mme ou dans le sac ajouter le contenu
d'un flacon contenant le substrat chromogne;
c) fermer le flacon ou le sac et secouer lgrement, pas
besoin de tout dissoudre, cette dissolution se produit
naturellement;
d) incuber 35,0 0,5oC pendant 24 heures.

Interprtation et expression des rsultats


Aprs 24 heures dincubation, retirer la matire de lincubateur et observer visuellement le flacon ou le sac. Sil
prsente une coloration jauntre, le rsultat confirme la
prsence de coliformes totaux dans lchantillon.

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

37

A laide dune lampe ultraviolette de 365 nm, observer sil


existe une fluorescence bleue dans les chantillons qui dveloppent une coloration jauntre en approchant la lampe
du flacon. Si lchantillon prsente une coloration jauntre
et fluorescente la lumire UV-365 nm cela signifie quil y a
une prsence dEscherichia coli dans lchantillon examin.
Si lchantillon reste transparent, le rsultat est ngatif, tant
pour les coliformes totaux que pour lE. coli.
Exprimer le rsultat comme: Prsence ou absence de Coliformes Totaux ou dEscherichia coli.
Note: La fluorescence bleue apparat seulement en prsence de
la lumire ultraviolette, en enlevant le flacon de devant la
lumire il redevient jaune.

Strilisation
Les matriels suivants doivent tre striliss: flacons de collecte dchantillons, pipettes, botes de Ptri en verre, flacons
et tubes eau de dilution ainsi que les milieux de culture.

Procdure de strilisation
a) prparer tout le matriel;
b) vrifier si le niveau de leau dans lautoclave est au-dessus
des rsistances. Complter si ncessaire;
c) dposer tout le matriel dans une bote mtallique et
fermer lautoclave;
d) ouvrir les deux loquets du couvercle pour ne pas permettre
la vapeur de sortir des bords de l'appareil. Brancher
lappareil dans la prise;
e) tourner le slecteur de temprature en position "maximum";
38

Fondation Nationale de la Sant

f) ouvrir immdiatement la valve d'chappement de vapeur;


g) lorsque la vapeur commence sortir de cette valve, attendre trois minutes et la fermer;
h) cet instant, l'aiguille de la jauge commencera s'lever;
i) Lorsque l'aiguille atteint la marque 1kg/cm de pression, la
temprature doit tre 121oC. Laisser dans cette position
pendant 20 minutes;
j) si la pression continue augmenter, tournez la touche
de slection choisir la position "milieu" de l'autoclave et
continuer regarder;
k) Le matriel sera strilis en 20 mn;
Remarque: Normalement, les autoclaves ont un slecteur
de temprature qui a trois positions "minimum,
moyenne et maximum" justement pour maintenir la
pression et la temprature dans la bande utilise. Il
sert galement allumer et teindre lappareil. De
nos jours il existe des autoclaves munis dun microprocesseur qui excute les tapes automatiquement, soit le cycle de strilisation et de dcontamination aprs avoir t programm par l'utilisateur.

l) teindre lappareil et attendre que le pointeur du manomtre atteigne la position "0". Cette procdure pourra tre
acclre en ouvrant lentement la valve de soupape de
vapeur;
Attention: Ne pas ouvrir cette valve en une seule fois!
m) quand le pointeur du manomtre atteint la position 0
et quil ny a plus de vapeur qui sort de la valve, ouvrir le
couvercle de lappareil et retirer le matriel.
Remarque: Il existe plusieurs modles dautoclaves sur le march
et il est important de toujours suivre les instructions du
fabricant.
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

39

Analyses physico-chimiques de leau


Titrimtriques et Colorimtriques

Analyses Titrimtriques
L'alcalinit totale
L'alcalinit totale de l'eau est donne par la somme des diffrentes formes d'alcalinit existantes, soit, par la concentration
des hydroxydes, des carbonates et des bicarbonates, exprime
en termes de carbonate de calcium. On peut dire que l'alcalinit mesure la capacit de l'eau neutraliser les acides.
La mesure de l'alcalinit est d'une importance fondamentale
dans le processus de traitement de l'eau, car cest en fonction
de sa teneur que stablit le dosage des produits chimiques
utiliss.
Normalement les eaux superficielles possdent une alcalinit
naturelle en concentration suffisante pour ragir au sulfate
d'aluminium dans les processus de traitement. Lorsque
l'alcalinit est trop faible ou inexistante, il est ncessaire
de provoquer une alcalinit artificielle en appliquant des
substances alcalines, comme la chaux hydrate ou la soude
(carbonate de sodium) afin datteindre cet objectif.
Lorsque l'alcalinit est trop leve, on procde l'inverse,
l'acidification de l'eau jusqu' obtention d'une teneur en
alcalinit suffisante pour ragir au sulfate d'aluminium ou
d'autres produits utiliss dans le traitement des eaux.

Mthode de dtermination
Le titrage avec l'acide sulfurique
Matriel ncessaire:
a) une pipette volumtrique de 50 ml;
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

43

b) un flacon Erlenmeyer de 250 ml;


c) une burette de 50 ml;
d) de la phnolphtaline;
e) un indicateur mthylorange;
f) un Indicateur mlange vert de bromocrsol/rouge de
mthyle;
g) une solution d'acide sulfurique 0,02 N;
h) une solution de thiosulfate de sodium 0,1 N.
Technique
a) prendre 50 ml d'chantillon et les mettre dans un flacon
Erlenmeyer;
b) ajouter 3 gouttes de solution d'indicateur vert de bromocrsol/rouge de mthyle;
c) Titrer la solution avec 0,02 N d'acide sulfurique jusqu'
ce que la couleur vire au bleu-vert rose;
d) noter le volume total de H2SO4 utilis (V) ml.
Calcul:
Alcalinit totale en mg/L de CaCO3 = V x 20
Notes:

1. utiliser 0,05 ml (1 goutte) solution de thiosulfate de
sodium N 0,1 si l'chantillon prsente du chlore rsiduel
libre;

2. Utiliser cette technique en cas dabsence dalcalinit la
phnolphtaline;

3. S'il y a de lalcalinit phnolphtaline, ajouter, avant
de mlanger l'indicateur vert de bromocrsol de mthyle/
rouge 3 gouttes de phnolphtaline et titrer avec H2SO4
44

Fondation Nationale de la Sant

0,02 N jusqu' ce que la couleur rose forme disparaisse.


Continuer ensuite avec ltape b) de la technique;
4. L'alcalinit la phnolphtaline ne peut se produire que
si le pH l'chantillon est suprieur 8,2;
5. A dfaut d'obtenir un mlange indicateur vert de bromocrsol/rouge de mthyle, utiliser un indicateur de mthylorange. Dans ce cas, le point tournant dans l'tape 3 de la
technique sera de jaune orange;
6. Le tournant lors de l'utilisation du vert de bromocrsol/
rouge de mthyle comme indicateur est plus clair que lors
de l'utilisation mthylorange;
7. La formule ci-dessus est utiliser lors de l'utilisation
d'un chantillon de 50 ml. En cas dutilisation de 100 ml
dchantillon, le volume (V) sera multipli par 10;
8. Fc facteur de correction de la solution du ractif de
titrage.

Fluxogramme de lanalyse
Echantillon de 50 ml

Indicateur
3 gouttes
si coloration

Titrer avec

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

45

Gaz carbonique libre


Le gaz carbonique libre existant dans des eaux superficielles
est normalement moins concentr que 10 mg/l, alors que dans
les eaux souterraines il peut tre plus concentr.
Le gaz carbonique contenu dans leau peut contribuer significativement la corrosion des structures mtalliques et
des matriaux base de ciment (tubes de fibrociment) dun
systme dapprovisionnement en leau et cest pour cela que
sa teneur doit tre connue et contrle.

Mthode de dtermination
Titrage avec de l'hydroxyde de sodium
Matriel ncessaire:
a) une burette de 50 ml;
b) un flacon Erlenmeyer de 250 ml;
c) une pipette volumtrique de 100 ml;
d) un bouchon en caoutchouc;
e) de lhydroxyde de sodium 0,02N;
f) phnolphtaline.
Technique
a) placer 100 ml dchantillon (sans agiter) dans un flacon
Erlenmeyer;
b) ajouter 10 gouttes de phnolphtaline, si la solution
se colore, elle ne contient pas de CO2, et si elle ne se
colore pas, continuer;
46

Fondation Nationale de la Sant

c) titrer avec une solution d'hydroxyde de sodium (NaOH)


0,02 N goutte goutte jusqu' l'apparition dune lgre
coloration rose pendant au moins 30 secondes;
d) noter le volume (ml) de NaOH utilis (V).
Calcul
V x 10 x Fc = mg/L de CO2 libre
o:
Fc = facteur de correction.
Pour calculer les missions totales de CO2, appliquer la
formule suivante:
mg/l CO2 0,44 Total = A + (2B + C)
o:
A = mg/L sans CO2
B = alcalinit due la cuisson
C =alcalinit due au carbonate.

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

47

Fluxogramme de lanalyse de CO2


Titrer avec

100 ml
dchantillon

indicateur de
phnolphtaline

Chlorures
En gnral, les chlorures sont prsents dans eaux ltat brut
et transforms des concentrations allant de petites traces
jusqu' plusieurs centaines de mg/l. Ils sont prsents sous la
forme de chlorures de sodium, de calcium et de magnsium.
La mer a une forte concentration de chlorure qui est d'environ de 26.000 mg/l. De fortes concentrations de chlorures
peuvent restreindre l'utilisation de leau en raison de la saveur
qu'ils donnent et l'effet laxatif qu'ils peuvent causer. Le dcret
n 2.914/2011 du Ministre de la Sant brsilien tablit le
niveau de 250 mg/l comme maximum autoris pour leau
potable. Les mthodes conventionnelles de traitement des
eaux nliminent les pas chlorures. Leur limination peut se
faire par dsalinisation (osmose inverse) ou par lectrodialyse,
(change d'ions).
48

Fondation Nationale de la Sant

Mthode de dtermination
Titrage avec du Nitrate dargent
Matriel ncessaire:
a) une burette de 50 ml;
b) un bcher de 250 ml;
c) un flacon Erlenmeyer de 250 ml;
d) un mesureur de pH;
e) un bcher de 100 ml;
f) de la solution titre de nitrate d'argent 0,0141N;
g) de la solution de chromate de potassium indicateur
K2CrO4;
h) hydroxyde de sodium 1N;
i) acide sulfurique 1N;
j) Chlorure de sodium 0,0141 N.
Technique
a) placer 100 ml dchantillon dans le flacon Erlenmeyer;
b) ajuster le pH entre 7 et 10, en cas de besoin avec NaOH
ou H2SO4;
c) ajouter 1 ml de la solution indicatrice de K2CrO4;
d) titrer la solution avec du nitrate d'argent 0,0141N
jusqu ce que la solution vire au jaune rougetre qui
est le point de fin de titrage;
e) effectuer un essai en blanc de la mme faon que pour
lchantillon.
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

49

Calcul:

mg/L Cl =

(A B) x N x 35.45
mL dchantillon

o:
A = ml de solution titre utilise dans lchantillon;
B = ml de solution titre en blanc;
N = normalit de la solution titre;

Fluxogramme de lanalyse de chlorures

100 ml
dchantillon

50

pH entre 7 et 10

Fondation Nationale de la Sant

1ml
dindicateur

titrer avec AgNO3

La duret totale
Duret totale est calcule comme la somme des concentrations des ions calcium et magnsium dans l'eau, exprims
en carbonate de calcium.
La duret dune eau peut tre temporaire ou permanente.
La duret temporaire, appele aussi la duret carbonate est
cause par la prsence de calcium et de bicarbonates de
magnsium. Ce type de duret rsiste l'action des savons
et provoque des incrustations. Elle est appele temporaire
car les bicarbonates, par l'action de la chaleur, se dcomposent en gaz carbonique, eau et carbonates insolubles qui
se prcipitent.
La duret permanente, galement appele de duret de
non-carbonates est due la prsence de sulfates, chlorures et
nitrates de calcium et de magnsium, elle rsiste galement
l'action des savons, mais ne produit pas de dincrustations
car ses sels sont trs solubles dans l'eau. Ne se dcompose
pas sous l'action de la chaleur.
Le dcret MS n 2.914/2011 tablit la teneur en duret totale
de 500 mg/L de CaCO3 comme valeur maximale autorise
pour l'eau potable.

Mthode de dtermination
Titrage avec EDTA
Matriel ncessaire:
a) burette de 50 ml;
b) pipette volumtrique de 25 ml;
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

51

c) ballon volumtrique de 50 ml;


d) bcher de 100 ml;
e) flacon Erlenmeyer de 250 ml;
f) de la solution standard de EDTA 0,01 M;
g) solution tampon;
h) indicateur noir riochrome T;
i) inhibiteur cyanure de sodium P.A en poudre;
j) inhibiteur II sulfure de sodium.
Technique
a) prendre 25 ml dchantillon et le diluer avec 50 ml
deau distille dans un ballon volumtrique;
b) placer dans un bcher de 100 ml et ajouter 1 2 ml de
la solution tampon pour augmenter le pH 10 0,1;
c) placer dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml et ajouter
environ 0,05 grammes de lIndicateur noir riochrome
T;
d) titriser avec lEDTA 0,01M en remuant continuellement
jusqu disparition de la couleur pourpre jauntre et
lapparition de la couleur bleue (fin du titrage);
e) noter le volume dEDTA utilis (ml);
f) faire un essai blanc avec de leau distille;
g) soustraire le volume dEDTA utilis dans le titrage
du blanc du volume dEDTA utilis dans le titrage de
lchantillon. La diffrence est le volume qui sera appliqu au calcul.

52

Fondation Nationale de la Sant

Calcul
Duret Totale en mg/L CaCO3 =

ml de EDTA x 1000 x Fc
ml dchantillon

Remarques:

1. Labsence dun point de virage dfini, indique gnralement le besoin dajouter un inhibiteur ou que lindicateur
est dtrior;

2. Il ny a pas besoin de plus de 5 minutes pour un titrage
mesur aprs lajout de la solution tampon;

3. Au cas o la duret de leau serait trs basse, utiliser un
chantillon plus grand, de 50 250 ml en ajoutant proportionnellement une quantit plus importante de solution
tampon de linhibiteur et de lindicateur.

4. Sil est ncessaire dutiliser un inhibiteur, ajouter 20
gouttes de linhibiteur II;

5. Fc = Facteur de correction de lEDTA si diffrent de 1.

Fluxogramme de l analyse

Mesurer 25ml
dchantillon
et diluer p/50

1 2 ml
de solution
tampon

transfrer dans
1 Erlenmeyer
de 250 ml

ajouter
lindicateur

Titrer avec
EDTA 0,01M

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

53

pH
Le terme pH est la concentration d'ions hydrogne dans une
solution. Dans leau, ce facteur est d'une importance exceptionnelle, en particulier dans les procds de traitement. Dans
les laboratoires de routine des usines de traitement, il est
mesur et ajust si ncessaire pour amliorer la coagulation/
floculation ainsi que pour contrler la dsinfection de leau,
la valeur du pH allant de 0 14. En dessous de 7 leau est
considre comme acide et au-dessus de 7 comme alcaline.
Leau au pH de 7 est neutre.
Le dcret n 2.914/2011 du Ministre de la Sant recommande que le pH de l'Eau soit maintenu dans la gamme de
6,0 9,5 dans le systme de distribution.
Il existe plusieurs dispositifs sur le march de la dtermination du pH. Ils sont appels potentiomtres ou colorimtres.
Dans ce manuel est dcrit le fonctionnement de base d'un
potentiomtre, bien que les instructions du fabricant peuvent
varier et quelles doivent donc tre respectes.
Matriel ncessaire:
a) potentiomtre
b) cuves;
c) flacon laveur;
d) papier absorbant;
e) solutions tampons de pH connues;
Technique
a) allumer lappareil et attendre quil se stabilise;

54

Fondation Nationale de la Sant

b) laver les lectrodes avec de leau distille et les scher


avec du papier absorbant;
c) calibrer lappareil avec des solutions standard (pH 4 7
ou 10);
d) laver de nouveau les lectrodes avec de leau distille
et les scher;
e) introduire les lectrodes dans lchantillon tre examin et en faire la lecture;
f) laver de nouveau et les laisser immergs dans leau
distille;
g) teindre lappareil.

Fluxogramme du test

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

55

Analyses colorimtriques
Le chlore rsiduel libre
Le chlore est un produit chimique utilis pour la dsinfection de leau. Il est important de le mesurer, car cela sert
contrler le dosage qui est appliqu ainsi que son volution
durant le traitement.
Le dcret n 2.914/2011 du Ministre de la Sant rend obligatoire le maintien dun minimum de 0,2 mg/l de chlore
rsiduel libre ou de 2 mg/l de chlore rsiduel combin tout
au long de l'extension du systme de distribution (rservoir
et rseau). Il recommande galement que la rutilisation
maximale duelle chlore libre n'importe quel point dans le
systme d'alimentation soit de 2 mg/l. Les principaux produits
utiliss sont: lhypochlorite de calcium, le chlorure de chaux,
lhypochlorite de sodium et le chlore gazeux.

Mthode de dtermination
Comparaison visuelle
Matriel ncessaire:
a) comparateur colorimtrique;
b) cuves de verre ou dacrylique;
c) DPD pour chlore libre en capsules.

56

Fondation Nationale de la Sant

Technique
a) remplir la cuve avec de leau dchantillon jusquau
niveau de 5,0 ml;
b) la placer du ct gauche de louverture de lappareil;
c) remplir une autre cuve jusquau niveau de 5,0 ml avec
lchantillon qui va tre test;
d) ajouter une capsule du ractif DPD dans le second
chantillon et mlanger;
e) placer une cuve avec lchantillon dans le compartiment droit de lappareil;
f) faire une lecture de la teneur en chlore avant 1 minute.
Note: Au moment deffectuer la lecture, positionner le comparateur (quipement) contre une source de lumire comme
par exemple une fentre, le ciel, ou une lampe. Tourner
le disque jusqu obtenir la mme tonalit dans les deux
tubes.

Rsultat
Le rsultat est exprim en mg/l de Chlore Rsiduel Libre.
Observation: Il existe sur le march diffrents types de comparateurs colorimtriques pour mesurer le chlore rsiduel, autant que pour lutilisation de orthotolidine
et leDPD. En cas de doute, consulter, comme toujours, les instructions du fabricant. Lutilisation de
lorthotolidine est viter tant donn quil sagit
dune substance cancrigne et quelle nest plus
recommande par les Standard Methods.

Couleur
La couleur de leau provient de matires organiques, comme
par exemple les substances humiques, les tanins mais galement les mtaux comme le fer et le manganse ainsi que les
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

57

rsidus industriels fortement colors. La couleur, dans les systmes publics dapprovisionnement deau, est esthtiquement
indsirable. Il est important de la mesurer, tant donn quune
couleur leve provoque son rejet par le consommateur et
lamne chercher dautres sources de suppression parfois
beaucoup moins sres.
Le dcret MS n 2.914/2011 tablit pour la couleur apparente
une valeur maximale permise de 15 (quinze) uH comme
standard organoleptique pour la consommation humaine.

Mthode de dtermination
Mthode de Comparaison visuelle
Matriel ncessaire:
a) tubes de Nessler longs de 50 ml;
b) support en bois;
c) solution-standard de chloroplatinate de potassium (500
units de couleur).
Technique
a) prparer les standards de couleur dans la bande de
5 50 units de couleur, mesurant 0,5; 1,0; 1,5; 2,0;
2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5;5,0; 6,0 et 7,0 ml de la solution
standard (500 units de couleur) et les placer dans des
tubes de Nessler de 50 ml;
b) diluer avec de leau distille jusqu la marque de 50
ml;
c) mesurer 50 ml de lchantillon dans un autre tube de
Nessler et comparer avec les standards.
58

Fondation Nationale de la Sant

Rsultat
Le rsultat est lexprim en units de couleur ou unit
Hazen (uH).
Remarques:

1. la comparaison devra tre faite en regardant les tubes
verticalement contre un fond blanc;

2. Protger les standards de lvaporation et de la poussire;

3. lorsque la couleur de lchantillon est plus leve que 70
units, diluer jusqu obtenir un rsultat lintrieur de la
bande couverte par les standards. Dans ce cas, le rsultat
doit tre multipli par le facteur de dilution;

4. uH est lunit de lchelle de Hazen (platine-cobalte,
mgPt- Co/l).

Aluminium
Le test de laluminium est indiqu pour les stations de traitement o le sulfate daluminium est utilis comme coagulant.
Un dosage incorrect de ce coagulant se note la quantit
significative daluminium qui persiste dans leau traite.
Lhydroxyde daluminium Al(OH)3 form dans la raction
est amphotre. Sa ionisation seffectue par le pH acide ou
basique, selon les quations:
En pH acide:
Al(OH)3

[ H+]

Al3 + nH2O
+

En pH basique:
Al(OH)3

[OH-]

AlO33 + nH2O

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

59

Dans les deux formes il peut se solubiliser et traverser les


dcanteurs et les filtres. La solubilisation arrive avec la correction du pH.
Lorsque le pH optimal de floculation nest pas correct, la
teneur en aluminium de leau traite augmente.
Le dcret n 2.914/2011 du Ministre de la Sant tablit que
la norme organoleptique pour la consommation humaines
est de 0,2 mg/l.

Mthode de dtermination
La dtermination de laluminium peut tre faite grce aux
mthodes dabsorption atomique, de leriochrome cyanine R
en utilisant un photomtre de filtre ou un spectrophotomtre,
ainsi que par la mthode de comparaison visuelle, en utilisant
des tubes de Nessler.
Dans ce manuel, on dcrira la mthode de comparaison visuelle, considrant que la plupart des laboratoires des services
dapprovisionnement en eau ne possdent pas toujours des
quipements comme un spectrophotomtre ou dabsorption
atomique.

Mthode de Comparaison Visuelle


Matriel ncessaire
a) un tube de Nessler de forme haute de 50 ml;
b) une pipette gradue de 1 ml;
c) une pipette gradue de 5 ml;
d) une pipette gradue de 10 ml;
e) un support pour les tubes de Nessler.
60

Fondation Nationale de la Sant

Ractifs
a) acide sulfurique 0,02N;
b) ractif tampon dactate de sodium;
c) riochrome Cyanine -R- (colorant);
d) solution de travail du colorant.
Technique
a) mesurer 25 ml dchantillon ou une portion dilue pour
25 ml dans un flacon Erlenmeyer de 125 ml;
b) ajouter 3 gouttes de mthylorange et titrer avec de lacide
sulfurique (H2SO4) 0,02N jusqu obtenir une lgre
coloration rose ple;
c) noter le volume utilis dacide et jeter lchantillon;
d) mesurer nouveau 25 ml dchantillon ou un aliquote
dilu dans 25 ml et les placer dans un tube de Nessler
de 50 ml;
e) ajouter lchantillon le mme volume dacide sulfurique utilis dans ltape N 2, en ajoutant 1 ml en trop;
f) ajouter 1,0 ml dacide ascorbique et mlanger;
g) ajouter 10,0 ml du ractif tampon et mlanger;
h) ajouter 5,0 ml de la solution de travail du colorant et
mlanger;
i) diluer immdiatement jusqu la marque de 50 ml avec
de leau distille;
j) mlanger et laisser reposer 5 10 minutes, ensuite comparer la couleur dveloppe par lchantillon avec les
standards prpars de la mme manire et la mme
heure.

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

61

Rsultat
Le rsultat est exprim en mg/m daluminium.
Observation: Dans cette mthode il nest pas ncessaire de prparer un chantillon blanc et ce nest pas recommand non plus pour les chantillons qui contiennent
de la couleur et de la turbidit car cela peut amener
des erreurs.

Prparation des standards


Matriel ncessaire
a) un tube de Nessler de forme haute de 50 ml;
b) une pipette gradue de 1 ml;
c) une pipette gradue de 5 ml;
d) une pipette gradue de 10 ml;
e) un support pour les tubes de Nessler.
Ractifs:
a) acide sulfurique 0,02N;
b) tampon ractif dactate de sodium;
c) riochrome Cyanine -R- (courant);
d) solution de travail colorante;
e) solution-standard daluminium (1 ml = 5 g Al).
Technique
Prparer les standards dans la bande de 0 0,5 mg/l, en
pipetant 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 et 2,5 ml de la solution
standard (1 ml = 5 g) et en diluant 25 ml avec de leau
distille dans des tubes de Nessler (voir tableau plus bas).
62

Fondation Nationale de la Sant

Traiter ces standards de faon suivante:


a)
b)
c)
d)

ajouter 1,0 ml dacide sulfurique 0,02N et mlanger;


ajouter 1,0 ml dacide ascorbique et mlanger;
ajouter 10 ml du ractif tampon et mlanger;
ajouter 5 ml de la solution de travail courante et mlanger;
e) augmenter le volume 50 ml avec de leau distille et
mlanger;
f) laisser reposer 5 10 minutes.
ml de solutionstandard
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5

g Al/mL
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5

Volume
dchantillon
25
25
25
25
25
25

mg/L Al
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5

Remarques:

1. Pour le standard 0,0 mg/l, prendre 25 ml deau distille et
procder de la mme faon que pour les autres;

2. Prparer les standards chaque examen dchantillon;

3. Si le laboratoire possde un spectrophotomtre, faire une
lecture des standards 535 nm et tracer une courbe de calibration en papier semi logarithme (% de transmission par
concentration). Dans ce cas, il est ncessaire de prparer tous
les standards en cas dexamen dun chantillon. Effectuer
peine un ou deux tests pour vrifier la courbe de calibration
de lappareil.

Turbidit
La turbidit de leau est due la prsence de matriaux solides
en suspension qui rduisent sa transparence. Elle peut tre
galement provoque par la prsence dalgues, de plancton,
de matire organique et plein dautres substances comme le
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

63

zinc, le fer, le manganse et le sable, rsultant du processus


naturel drosion ou de rejets domestiques et industriels.
La turbidit a son importance dans le processus de traitement
de leau. De leau avec une turbidit leve, et selon sa nature, forme des flocons lourds qui dcantent plus rapidement
que ceux de leau faible turbidit. Cela a galement des
inconvnients comme en cas de dsinfection qui peut tre
plus difficile cause de la protection qui peut tre donne
aux microorganismes au contact direct avec les dsinfectants.
Cest un indicateur sanitaire et une norme organoleptique de
leau de consommation humaine.
Au Brsil, la norme de potabilit a t rcemment rvise
et le dcret MS n 2914/2011 inclut les proccupations
internationales concernant la transmission de protozoaires
via lapprovisionnement en eau. Le standard de turbidit de
leau rsultant dune filtration rapide (traitement complet ou
filtration directe) a t rduit 0,5 uT et pour leau rsultant
dune filtration lente 1,0 uT. Entre temps, le traitement de la
valeur maximale permise de 0,5 et 1,0 uT devra tre ralis
par objectifs progressifs pendant quatre ans: dans 25% des
chantillons analyss mensuellement durant la premire
anne, et jusqu 95% la quatrime anne (toujours avec
une VMP de 1 uT dans le reste des chantillons mensuels).
Le dcret n 2.914/2011 du Ministre de la Sant tablit en
outre la valeur maximale permise de 1,0 uT pour leau souterraine post filtration ou pr-dsinfection. Et dans nimporte
quel point de distribution 5,0 uT comme norme organoleptique de potabilit.
Il existe des quipements spcifiques pour la dtermination
de la turbidit dans leau. Dans ce manuel, on prsentera
la technique de dtermination de la turbidit en utilisant la
mthodologie nphlomtrique.
64

Fondation Nationale de la Sant

Mthode Nphlomtrique
Matriel ncessaire:
a) turbidimtre avec un nphlomtre;
b) cellules dchantillons de verre incolore (quartz),
c) ballon volumtrique de 100 ml;
d) pipette volumtrique de 5 ml;
e) ensemble de filtration;
f) filtres de membrane de 0,2 m.
Ractifs:
Eau libre de turbidit:
a) passer leau distille travers un filtre de membrane
de 0,02 m de porosit. Rincer le flacon de collecte au
moins deux fois avec de leau filtre et ne pas prendre
en compte les premiers 200 ml;
Suspension stock de turbidit standard primaire.
Solution I
- Dissoudre 1,0 g de sulfate dhydrazine (NH2). H2SO4
dans de leau distille et diluer 100 ml dans un ballon
volumtrique;
Avertissement: le sulfate dhydrazine est cancrigne. Eviter linhalation, lingestion et le contact avec la peau.

Solution II
- dissoudre 10,0g dhexamthylnettramine (CH2)6N4
dans de leau distille et diluer 100 ml dans un ballon
volumtrique;
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

65

mlanger 5,0 ml de la solution I et 5,0 ml de la solution


II. Laisser reposer pendant 24 heures 25 3oC. La
turbidit de cette suspension est de 4000 UT.

- Mettre la solution stock dans un flacon de couleur


ambre ou dans un autre flacon protg de la lumire
ultraviolette pour le stockage. Diluer cette suspension
stock. La suspension stock reste stable pendant un an
lorsquelle est stocke correctement;
Suspension standard de turbidit:
a) diluer 1,0 ml de la solution stock pour 100 ml avec de
leau libre de turbidit. La turbidit de cette suspension
est de 40 UT. Prparer quotidiennement.
Standards de turbidit dilus:
a) diluer des morceaux de la suspension standard de turbidit avec de leau sans turbidit selon la bande qui
intresse. Prparer quotidiennement.
Processus:
a) calibrer le turbidimtre selon les instructions du fabricant;
b) mesure de la turbidit infrieure 40 uT: agiter doucement un chantillon et attendre la disparition des
bulles; le placer dans la cellule de lchantillon du
turbidimtre; effectuer une lecture de la turbidit directement sur lchelle de linstrument ou sur la courbe
de calibration approprie.
c) mesure de la turbidit suprieure 40 uT: diluer un
chantillon avec un ou plusieurs volumes deau libre
de turbidit jusqu ce que la turbidit de lchantillon
dilue reste entre 30 et 40 UT. Effectuer une lecture et
multiplier le rsultat par le facteur de dilution.
66

Fondation Nationale de la Sant

Calcul:
uT =

A x (B + C)
C

o:
UT = UTN = Unit de Turbidit nphlomtrique;
A = Turbidit de lchantillon dilu;
B = Volume de la dilution (ml);
C = Volume de lchantillon pris pour la dilution.
Exemple: Une portion de 10 ml de lchantillon a t dilue pour
50 ml avec de leau libre de turbidit. Lorsquon effectue la lecture de cet chantillon dilu, on obtient 20

UT =

20 x (40 + 10)
10

UT = 100

Temprature
La temprature dpend de laugmentation de la consommation deau, de la fluoration, de la solubilit et de lionisation
des substances coagulantes, du changement du pH, de la
dsinfection, etc.

Processus de la dtermination dans leau


Matriel ncessaire:
a) un thermomtre;
b) un bcher de 250 ml.
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

67

Technique
a)
b)
c)
d)

mettre un peu deau dans un bcher de de 250 ml;


plonger le thermomtre dans leau;
attendre jusqu ce que le mercure se stabilise;
effectuer une lecture avec le bulbe du thermomtre
encore dans leau.

Les Fluorures
Ladjonction de fluor dans leau pour la consommation
humaine a pour finalit de prvenir les caries dentaires.
Aujourdhui, cette procdure est considre comme un processus normal de traitement de leau et la teneur optimale de
fluor est une partie essentielle de sa qualit. Pour cette raison
et pour dautres, son contrle seffectue obligatoirement dans
la station de traitement de leau (ETA).
Il existe plusieurs mthodes pour dterminer le fluor dans
leau. Les trois les plus connues sont: la mthode Spadns,
la Scott-Sanchis et la mthode de llectrode spcifique par
ions fluorures.
Dans ce manuel, nous ne dcrirons que la mthode Scott-Sanchis, qui mme si elle ne donne pas le degr dexactitude le
plus important, rpond aux attentes et cest la moins onreuse.
Cest une mthode de comparaison visuelle de couleur fate
en tubes de Nessler.

Processus danalyse de fluorures


Mthode Scott-Sanchis
Matriel ncessaire
a) un tube de Nessler de 100 ml;
68

Fondation Nationale de la Sant

b)
c)
d)
e)

un support pour tube de Nessler;


un thermomtre;
une pipette volumtrique de 5 ml;
une pipette gradue de 10 ml.

Ractifs:
a) solution norme de fluorures (1ml = 10 gF);
b) ractif Scott-Sanchis;
c) arsnite de sodium (0,5%).
Prparation des standards et de lchantillon:
a) prendre 7 tubes de Nessler de 100 ml;
b) remplir le 1er tube avec de leau distille (blanc);
c) pipeter dans le 2me tube 2 ml de la solution norme;
d) pipeter dans le 3me tube 4 ml de la solution norme;
e) pipeter dans le 4me tube 6 ml de la solution norme;
f) pipeter dans le 5me tube 8 ml de la solution norme;
g) pipeter dans le 6me tube 10 ml de la solution norme;
h) remplir le 7me tube avec 100 ml dchantillon ou
un aliquote dilu 100 ml. Sil y a du chlore dans
lchantillon, lenlever en ajoutant 0,1ml (2 gouttes)
de solution darsnite de sodium pour chaque mg/l de
chlore;
i) diluer les standards de 2 6 100 ml avec de leau
distille;
j) ajuster la temprature des standards et de lchantillon;
k) ajouter dans chaque tube, mme le blanc, (1er tube) 5
ml du ractif Scott-Sanchis;
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

69

l) mlanger et laisser reposer pendant une heure;


m) une heure aprs avoir ajout le ractif Scott-Sanchis,
comparer lchantillon avec les standards et exprimer
le rsultat en mg F/L.
Exemple: Si la coloration dveloppe par lchantillon ressemble
au standard du tube n 5, cet chantillon aura 0,8 mg/l
dion fluorure. Si lchantillon dveloppe une coloration qui se situe entre deux standards on pourra faire
une interprtation des rsultats. Ex.: une lecture entre
0,6 et 0,8 et exprime par 0,7 mg/l.

Fluxogramme du test

Solution
standard

Ractif
Scott-Sanchis
5ml dans chaque tube
chantillon

70

Fondation Nationale de la Sant

Remarques:

1. La concentration des standards prpars (tubes de 2
6 correspond respectivement 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
mg/l dion fluorure;

2. de nombreux chantillons pourront tre analyss simultanment avec les standards;

3. Sil y a des intervenants dans les chantillons en concentrations qui peuvent altrer les rsultats, ces chantillons
devront tre distills.

Tableau des intervenants


Substances intervenantes

Mthode Scott-anchis

Type derreur

Alcalinit (CaCO3)

400 mg/L

Aluminium (AL3+)

0,25 mg/L

--

Chlorure (Cl-)

2000 mg/L

Fer (Fe3+)

2,0 mg/L

Hexamtaphosphate
(NaPO3)6

1,0 mg/L

Phosphate (PO4-3)

5,0 mg/L

Sulfate (SO4-2)

300 mg/L

Source: Adapt de Mayer, 1971

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

71

Equipements pour la distillation:

thermomtre

Ballon de
distillation

condensation

Ballon
volumtrique
Bec
de bunsen

Effectuer premirement une distillation prliminaire pour


enlever toute contamination de fluorure et ajuster la raction acide/eau pour les distillations ultrieures de la faon
suivante:
a) placer 400 ml deau distille dans le ballon de distillation;
b) ajouter lentement en agitant 200 ml dacide sulfurique
concentr (H2SO4);
c) ajouter quelques perles de verre;
d) connecter le ballon au condensateur et commencer la
distillation;
e) Lorsque la temprature atteint 180oC, arrter la distillation
et liminer ce qui a t distill. Lensemble est prt pour
la distillation de lchantillon.

72

Fondation Nationale de la Sant

Distillation de lchantillon
Ajouter soigneusement 300 ml dchantillon au mlange
dacide qui est rest de la distillation prliminaire et distiller
comme avant jusqu ce que la temprature atteigne 180oC.
A ce moment le liquide distill sera gal 300 ml.
Remarques:

1. Ne pas laisser la temprature dpasser 180oC, afin dviter des traces de sulfate dans le liquide distill.

2. Lorsque les chantillons haut contenu en fluorures sont
analyss, ajouter au ballon de distillation 5 mg de sulfate
dargent pour chaque mg de fluorure prsent dans lchantillon.

3. utiliser la solution dacide sulfurique plusieurs fois
jusqu ce que les contaminants des chantillons deau
accumuls dans le flacon de distillation commencent intervenir dans le liquide distill. Lorsque cela arrive, ne pas
tenir compte de lacide et recommencer nouveau.
Important: le dosage de fluor dans leau pour la consommation
humaine est tablit en fonction de la moyenne des tempratures
maximales journalires de la localit observes pendant une priode
dtermine.

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

73

Prlvement et conservation des chantillons pour


les analyses physico-chimiques
Rcipients

Volume
minimum (mL)

Verre ou
polythylne

200

Rfrigrer

24h/14d

CO2

100

Analyse
immdiate

Dureza

100

HNO3 pH < 2

6 mois

Chlorures

100

pas besoin

7 jours

Aluminium

HNO3 pH < 2

6 mois

Polythylne

300

pas besoin

28 jours

Analyse
immdiate

Turbidit

Verre ou
Polythylne

200

Protger
de la lumire

Chlore
Rsiduel

Verre ou
polythylne

500

Analyse
immdiate

30min/2h

pH

200

Analyse
immdiate

Cor

500

Rfrigrer

24h

Paramtres
Alcalinit

Fluorures
Te m p r a ture

Conservation

Temps
maximum

24h

Source: Adapt de lAPHA, 1985

Remarques:

1. Les volumes dcrits ici sont estims. Dans la pratique, on
doit prlever le volume ncessaire pour la ralisation des
analyses, car il existe des rptitions danalyses qui sont
souvent ncessaires.

2. Lorsquon conserve avec de lacide nitrique, utiliser 2 ml
dacide pour chaque litre dchantillon.

3. Normalement, dans les stations de traitement des eaux
ETAs, les analyses doivent tre effectues immdiatement
aprs le prlvement. Il nest pas dusage de laisser les
chantillon beaucoup de temps avant de les analyser.
74

Fondation Nationale de la Sant

Essai de coagulation (Jar-Test)


Lessai de coagulation est une procdure de routine dans les
stations de traitement des eaux afin de dterminer le dosage
des produits chimiques utiliss dans le traitement.
On peut dire que cest une simulation de ce qui se passe
dans lETA.
Afin de raliser lessai il est ncessaire de connatre au pralable les caractristiques suivantes de leau brute: la couleur,
la turbidit, lalcalinit, le pH et la temprature; au-del des
paramtres hydrauliques de la station de traitement tels que
la sortie, le temps de dtention dans le floculateur, la vitesse
de sdimentation dans le dcanteur, etc.
Lessai de coagulation nest pas une opration trs simple,
car certaines variables du processus doivent tre prises en
compte, comme la couleur de la turbit de leau brute, si
lalcalinit naturelle de leau est suffisante, si le pH se situe
dans la bande optimale de floculation, le type de coagulant
utilis, etc.
Dans cet exemple pratique, on ne considrera que les paramtres suivantes: la couleur, la turbidit, le pH et lalcalinit totale, tant donn que lobjectif principal du test est
denlever la couleur et la turbit de leau, en appliquant une
quantit moindre de coagulant.
Le produit chimique utilis est le sulfate daluminium, qui
est le plus commun.

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

75

Etapes du test de coagulation qui doivent tre


observes
a) effectuer lanalyse de lchantillon brut couleur, pH,
turbidit et alcalinit totale, temprature;
b) dcouvrir le pH optimal de floculation;
c) vrifier le faible dosage du coagulant dans le pH optimal;
d) observer la vitesse de sdimentation des flocons;
e) analyser les particules surnageant en vrifiant principalement la couleur et la turbidit.
Matriel ncessaire:
a) appareil de Jar-Test conforme celui du dessin;
b) un bcher de forme basse de 1000 ml;
c) de la solution de sulfate daluminium 1%;
d) solution de cal 0,5%;
e) des pipettes gradues de 5 et 10 ml.

Source: Adapt de Cetesb, 1973

76

Fondation Nationale de la Sant

Procdure 1 (Considrant que leau brut ait une alcalinit naturelle suffisante et galement un pH optimal
de floculation).
a) placer 6 bchers d1 litre dans la plateforme de lappareil
de Jar-Test;
b) les remplir avec de leau brute jusquau niveau de 1000
ml;
c) allumer lappareil vitesse maximale de 100 r.p.m;
d) ajouter simultanment dans les bchers la quantit de
coagulant (sulfate daluminium) qui a t calcule pour
chaque bcher;
e) laisser agiter cette vitesse pendant 2 3 minutes (temps
de dtention dans la chambre de mlange rapide);
f) rduire la vitesse dagitation 50 r.p.m pendant 10 30
minutes (temps de dtention dans les floculateurs);
g) laisser les chantillons dcanter pendant un certain temps
(ce temps correspond la vitesse de sdimentation dans
le dcanteur 10 30 minutes);
h) recueillir les particules surnageant de tous les bchers et
analyser les paramtres ncessaires afin de vrifier lesquels
ont prsent le meilleur rsultat;
i) normalement le meilleur rsultat est celui qui a prsent
la plus grande rduction de couleur et de turbit et cest
ce dosage qui devra tre choisi.

Procdure 2 (Quand leau na pas dalcalinit suffisante


ou lorsquon ne connat pas le pH optimal de floculation).

a) placer 6 bechers d1 litre dans la plateforme de lappareil


de test de Jar-Test;
b) les remplir avec de leau brute jusquau niveau de 1000 ml;
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

77

c) allumer lappareil la vitesse maximale de 100 r.p.m;


d) tablir diffrents pH dans les bechers en utilisant de lalcali
(chaux hydrate);
e) appliquer une quantit fixe de sulfate daluminium dans
tous les bchers et procder selon les tapes de e) i) de
la procdure 1;
f) mesurer le pH du flacon qui a prsent le meilleur rsultat;
g) effectuer un nouvel essai, en fixant le pH optimal trouv
dans ltape antrieure dans tous les bchers;
h) ajouter du sulfate daluminium dans chaque bcher, en
variant la concentration dans les valeurs proches (infrieures et suprieures) du dosage utilis dans e);
i) procder selon les tapes de e) i) de la procdure 1.
Remarques:

1. Selon les altrations dont peut souffrir leau brute, consquence des inondations, des scheresses des changements
climatiques, etc, il est recommand de toujours effectuer
de nouveaux tests pour ajuster les dosage des coagulants.

2. Si leau brute na pas dalcalinit naturelle suffisante pour
ragir au sulfate daluminium, utiliser de la chaux hydrate
ou un autre alcali pour crer une alcalinit artificielle.

3. Si leau na pas un pH optimal de floculation, crer cette
condition en utilisant des acides ou des bases (alcalis).

4. Lalcali le plus utilis est la chaux hydrate.

5. Normalement on utilise du sulfate daluminium 1% et
de la chaux 0,5% pour effectuer les essais, car cela facilite la mesure des volumes utiliss dans le processus.

6. Pour des dosages de sulfate daluminium de 10 15 20
25 30 et 35 mg/l dune solution 1% les volumes suivants sont ncessaires: respectivement 1,0 ml, 1,5 ml, 2,0
ml, 2,5 ml, 3,0 ml et 3,5 ml. Pour un dosage de chaux, on
utilise la moiti de ces volumes en ml.

78

Fondation Nationale de la Sant

7. Les vitesses dagitation, les temps dagitation et le temps


de la dcantation dpendent des dimensions des units de
traitement et de la sortie de lopration.
8. Consulter le tableau ci-dessous afin dtablir la quantit
de chaux ncessaire en fonction de la consommation de
sulfate daluminium.
Consommation de Sulfate
daluminium
mg/L
Al2(SO4)3

Alcalinit
thoriquement
ncessaire
mg/L (CaCO3)

Alcalinit
naturale
dsire
(CaCO3)

Quantit
thorique de
cal mg/L *

Quantit de cal
souhaitable
mg/L *

10
15
20
25
30
40
50

5
7
9
12
14
18
25

7
10
14
17
20
27
34

3
4
5
7
8
10
13

4
6
8
10
12
15
19

Source: Techniques dapprovisionnement et de traitement de leau vol.II/Cetesb SP


* sil ny a pas dalcalinit naturelle.

Thoriquement, chaque mg/l de sulfate daluminium requiert:


0,45 mg/l dalcalinit naturelle;
0,25 mg/l de chaux (CaO);
0,33 mg/l de chaux comme Ca(OH)2;
0,48 mg/l de carbonate de sodium Na2CO3 (varech).

Correction du pH de leau traite


La correction du pH de leau traite est un procd utilis
dans les ETAs afin de prvenir le processus de corrosion des
structures mtalliques du systme de distribution qui est
provoqu par lacidit de leau, consquence de la prsence
de gaz carbonique dissous.
Les eaux superficielles possdent du gaz carbonique dissous. Ce gaz carbonique peut provenir de latmosphre, de
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

79

la respiration des tres aquatiques et mme de la raction


du sulfate daluminium quand celui-ci ragit lalcalinit
naturelle de leau.
La correction du pH signifie augmenter le pH de leau traite
jusquau pH de saturation qui est le point o le processus
de corrosion napparat plus. Ce pH nest pas le mme pour
toutes les eaux et sa dtermination peut tre effectue en
laboratoire.

Mthode de dtermination
Essai du marbre
Matriel ncessaire:
a) ballon volumtrique de 1000 ml;
b) mesureur de pH;
c) une balance;
Ractif:
Carbonate de calcium
Technique
a) mettre 750 ml deau filtre dans un ballon volumtrique
de 1000 ml;
b) dterminer le pH et lalcalinit (I) de cette eau;
c) ajouter 10 grammes de carbonate de calcium au ballon;
d) agiter pendant 1/2 heure; laisser dcanter et filtrer;
e) dterminer le pH;
80

Fondation Nationale de la Sant

f) agiter nouveau le ballon pendant plus d1/2 heure;


g) laisser dcanter et filtrer;
h) dterminer nouveau le pH.
Rpter les procdures "e","f" et "g" jusqu lobtention dun
pH constant. Le pH de saturation sera le pH constant trouv.
Dterminer dans la dernire opration lalcalinit (II).
Conclusion
Si lalcalinit II > alcalinit I => leau est corrosive.
Si lalcalinit II = alcalinit I => leau nest pas corrosive.
Si lalcalinit II < alcalinit I => leau est incrustante.

Dtermination de la teneur de chlore actif dans


une solution de chlore (hypochlorite de sodium
et hypochlorite de calcium)
Matriel ncessaire:
a) un flacon Erlenmeyer de 250 ou 500 ml;
b) une burette de 50 ml;
c) 1 pipette volumtrique de 1; 5 et 10 ml;
d) une balance de prcision.
Ractifs:
a) du thiosulfate de sodium 0,1N (Na2S2O3. 5H2O);
b) iodure de potassium (KI);
c) acide actique P.A;
d) indicateur damide.
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

81

Technique
a) mesurer 1,0 ml de la solution;
b) dissoudre dans 50 ml deau distille;
c) ajouter 5,0 ml dacide actique concentr (glacial);
d) ajouter 1,0 g de iodure de potassium;
e) titrer avec une solution de thiosulfate de sodium 0,1
N;
f) noter les ml de thiosulfate utiliss.
Calcul
% de chlore =
o:

(A-B) x N x 35,45
P x 10

A = ml de thiosulfate utilis dans le titrage de lchantillon;


B = ml de thiosulfate utilis en blanc;
N = Normalit du thiosulfate;
P = Poids ou volume du produit.

Observation: Selon la concentration de la solution tre analyse;


utiliser un poids ou un volume qui nait pas besoin
de plus que la capacit de la burette utilise concernant le thiosulfate de sodium 0,1 N. Effectuer un test
en blanc avec de leau distille.

82

Fondation Nationale de la Sant

Prparation des Ractifs


Utiliss dans les Analyses
Constantes dans ce Manuel

Ractifs pour lalcalinit


Solution dacide sulfurique 0,02 N
Pour prparer cette solution, on prpare premirement une
solution 0,1N de la faon suivante:
a) transfrer lentement, avec une pipette, 2,8 ml dacide
sulfurique concentr (96% d=1,84) dans un ballon volumtrique de 1000 ml contenant prs de 500 ml deau
distille;
b) complter le volume jusqu la marque, avec de leau
distille et agiter;
b) de cette solution, mesurer 200 ml avec une pipette volumtrique et les transfrer vers un ballon volumtrique de
1000 ml, en compltant le volume avec de leau distille.
Cette solution est approximativement de 0,02 N.

Solution de carbonate de sodium 0,02 N


Pour prparer la solution de carbonate de sodium 0,02 N
scher 1,5 2,0 grammes de Na2CO3 gris norme primaire
250oC pendant quatre heures. Refroidir dans un dessiccateur.
Ensuite, peser 1.060 grammes, les dissoudre dans 250 ml
deau distille et complter le volume pour obtenir 1000 ml
avec de leau distille dans le ballon volumtrique.

Standardisation de la solution
Placer 50 ml dune solution de carbonate de sodium 0,02
N dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml et ajouter 4 gouttes
dindicateur mthylorange. Titrer avec H2SO4 0,02N jusqu
ce que lindicateur ait une lgre coloration jauntre. Noter
le volume dacide utilis.
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

85

Pour calculer la normalit correcte, utiliser la formule suivante:


N=

N X V
V

o:
N = normalit du H2SO4 dsire;
V = volume dacide utilis dans le titrage;
N = normalit du carbonate de sodium;
V = volume du carbonate de sodium utilis.
1 ml de H2SO4 0,02 N = 1,0 mg de CaCO3

Solution de thiosulfate de sodium 0,1 N


Peser exactement 25,0 grammes de Na2S2O3.5H2O, les dissoudre dans un peu deau distille et complter le volume
pour 1000 ml en ballon volumtrique.

Indicateur mthylorange
Peser 0,100 grammes de mthylorange et les dissoudre
dans200 ml deau distille.

Phnolphtaline
a) dissoudre 1 gramme de phnolphtaline dans un peu
deau distille et diluer 200 ml.
b) ajouter des gouttes de NaOH 0,02 N jusqu lapparition
dune lgre coloration rose.

86

Fondation Nationale de la Sant

Mlange indicateur de vert de bromocrsol/rouge de


mthyle
Peser 20 mg de rouge de mthyle, 100 mg de vert de bromocrsol et les dissoudre dans 100 ml deau distille ou dalcool
thylique 95%.

Ractifs pour CO2


Hydroxyde de sodium 0,02 N
a) pour prparer cette solution, on prpare premirement
une solution 0,1N de la faon suivante;
b) peser rapidement 4,2 grammes dhydroxyde de sodium
sur des lentilles, les mettre ensuite dans un bcher de
500 ml et les dissoudre dans de leau distille libre de
gaz carbonique;
c) transfrer cette solution vers un ballon volumtrique d1
litre et complter le volume jusqu la marque. Cette
solution est approximativement 0,1 Normal.
Standardiser avec une solution dacide sulfurique 0,1 normal
de la faon suivante:
a) verser 100 ml deau distille dans un flacon Erlenmeyer
de 250 ml;
b) mesurer avec une pipette volumtrique ou une burette 10
ml de la solution de NaOH 0,1 Normal et la verser dans
le flacon Erlenmeyer prcit;
c) ajouter 3 4 gouttes de lindicateur de mthylorange;
d) titrer avec une solution dacide sulfurique 0,1 Normal;
e) noter les ml de H2SO4 utiliss qui doivent tre gaux ou
proches de 10.
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

87

Si le volume de H2SO4 0,1 N utilis dans le titrage est suprieur ou infrieur 10 ml, calculer le Facteur de correction
(Fc) de la solution de NaOH en utilisant la formule suivante:
Fc (NaOH) =

mL H2SO4 x Fc (H2SO4)
mL de NaOH

Noter le Fc sur le bouchon du flacon.


Prparation de la solution dhydroxyde de sodium N/50:
a) verser 200 ml de la solution stock de NaOH 0,1 N dans
un ballon volumtrique d1 litre et complter avec de leau
distille. Cette nouvelle solution est approximativement
N/50 (0,02 N).
Standardisation de la solution de NaOH 0,02 N:
a) verser 100 ml deau distille dans un flacon Erlenmeyer
de 250 ml;
b) mesurer avec une pipette volumtrique ou une burette
10 ml de la solution de NaOH 0,02 N et la verser dans
le flacon Erlenmeyer prcit;
c) ajouter 3 4 gouttes de lIndicateur de mthylorange;
d) titrer avec la solution dacide sulfurique 0,02 N jusqu
ce que lindicateur vire;
e) noter le volume de H2SO4 utilis qui doit tre aux alentours
de 10 ml.
Calcul du facteur de correction du NaOH
Fc (NaOH) 0,02N =

88

mL de H2SO4 de 0,02 N x Fc (H2SO4)


mL de NaOH

Fondation Nationale de la Sant

Remarques:

1. Il nest pas facile de visualiser lorsque lindicateur vire.
Effectuer un test blanc avec 100 ml deau distille pour
comparer la couleur au moment o lindicateur vire;

2. En ajoutant lindicateur, la solution devient jauntre et
la fin du titrage la solution reste lgrement jauntre;

3. Leau libre de CO2 peut tre obtenue en bouillant de
leau distille pendant 15 minutes et en la refroidissant rapidement temprature ambiante.

Phnolphtaline
a) dissoudre 1 gramme de phnolphtaline dans un peu
deau distille et diluer 200 ml;
b) ajouter quelques gouttes de NaOH 0,02N jusqu lapparition dune lgre coloration rose.

Ractifs pour lanalyse de chlorures


Solution-standard de Nitrate dargent 0,0141 N
a) peser 2,395 grammes de AgNO3 et les dissoudre dans
un peu deau distille. Complter pour obtenir un litre
en ballon volumtrique;
b) standardiser contre une solution de chlorure de sodium
0,0141N; 1,00 ml = 500 g Cl-;
c) conserver la solution dans un flacon sombre.
Chlorure de sodium 0,0141 N
a) dissoudre 824,1 mg de chlorure de sodium sec 140oC
dans une eau libre de chlorures et diluer pour obtenir 1000
ml. 1,00 ml = 500 g Cl-.

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

89

Standardisation de la solution de nitrate dargent 0,0141 N


a) utiliser 100 ml dchantillon (NaCl 0,0141 N) ou une
portion dilue 100 ml;
b) ajuster le pH entre 7 et 10 avec NaOH ou H2SO4 1 N;
c) ajouter 1 ml de K2CrO4 (chromate de potassium);
d) titrer avec une solution de nitrate dargent 0,0141 N
jusqu lapparition dun jaune rougetre;
e) noter le volume de nitrate dargent utilis dans le titrage;
f) calculer le facteur de correction du AgNO3 0,0141 N
en utilisant la formule suivante:
Fc =

100
Vp

o:
Fc = Facteur de correction.
Vp = Volume de AgNO3 utilis dans le titrage.
Solution indicatrice de chromate de potassium (K2CrO4)
a) peser 50 grammes de K2CrO4 et les dissoudre dans un
peu deau distille;
b) ajouter de la solution dAgNO3 0,0141 N jusqu la
formation dun prcipit rouge;
c) laisser reposer pendant 12 heures;
d) filtrer et complter le volume pour obtenir 1000 ml
avec de leau distille.

90

Fondation Nationale de la Sant

Hydroxyde de sodium (NaOH) 1N


a) peser 40 grammes dhydroxyde de sodium, les dissoudre dans un peu deau distille et diluer dans 1 litre;
b) conserver dans un flacon en polythylne ou verre pirex.
Acide sulfurique (H2SO4) 1N
a) verser environ 500 ml deau distille dans un bcher
de 1000 ml;
b) verser ensuite lentement 28 ml dacide sulfurique
concentr dans le bcher prcit en remuant en permanence;
c) laisser refroidir;
d) verser dans un ballon volumtrique de 1000 ml et
complter le volume avec de leau distille, en homognisant;
e) stocker en flacons de polythylne ou en verre pirex.
Remarques:

1. remuer avec un bton en verre;

2. ne jamais ajouter deau dans lacide, mais de lacide
dans leau.

Ractifs pour lanalyse de la duret


Solution standard dEDTA 0,01 M
a) peser 3,723 grammes de EDTA (sel disodique de l'acide
thylne diamine ttra actique), le dissoudre dans de
leau distille et le diluer dans 1000 ml;
b) standardiser contre une solution standard de carbonate
de calcium;
c) conserver cette solution dans un flacon de polythylne.
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

91

Solution standard de calcium


a) peser 1,0 gramme de carbonate de calcium anhydre
(CaCO3) standard primaire et le verser dans un flacon
Erlenmeyer de 250 ml;
b) ajouter peu peu, laide dun entonnoir du HCl 1:1
jusqu dissolution complte du CaCO3;
c) ajouter 200 ml deau distille et bouillir pendant
quelques minutes pour liminer le CO2;
d) refroidir et ajouter quelques gouttes de rouge de mthyle, ajuster pour obtenir une couleur orange intermdiaire en ajoutant du NH4OH 3N ou du HCl 1:1;
e) verser ce mlange dans un ballon volumtrique de 1000
ml et complter le volume avec de leau distille (1 ml
de cette solution = 1,0 mg de CaCO3).
Standardisation de la solution dEDTA 0,01 M
a) mesurer 25 ml de la solution-standard de calcium et
diluer pour 50 ml avec de leau distille en flacon
Erlenmeyer de 125 ml;
b) ajouter 1 2 ml de la solution tampon para obtenir un
pH denviron 10 0,1;
c) ajouter 0,05 grammes dindicateur riochrome noir T;
d) titrer avec de lEDTA 0,01 M goutte goutte jusqu la
disparition de la dernire coloration violace et lapparition de la couleur bleue indiquant le point final du
titrage.
Calcul:
Fc =
92

25
Vp

Fondation Nationale de la Sant

o:
Fc = Facteur de Correction;
Vp = Volume dEDTA utilis dans le titrage.
Solution tampon pour la duret
a) peser 16,9 grammes de chlorure dammoniac (NH4Cl)
et les dissoudre dans 143 ml dhydroxyde dammoniac
concentr (NH4OH);
b) ajouter 1,25 grammes de sel de magnsium dEDTA t
diluer 250 ml avec de leau distille.
Observation: Si vous ne disposez pas de sel de magnsium
dEDTA, dissoudre 1,179 grammes de sal sodique
dEDTA et 780 mg de MgSO4.7H2O ou 644 mg de
MgCl2.6H2O dans 50 ml deau distille et ajouter
le tout la solution de ltape a) en compltant le
volume pour 250 ml avec de leau distille.

Indicateur noir riochrome T


a) peser 0,5 grammes de noir riochrome T sur un verre
de montre;
b) peser 100 grammes de chlorure de sodium P. A. dans
un bcher;
c) verser les deux ractifs dans un mortier et moudre le
mlange jusqu ce quil se transforme en poudre;
d) stocker dans des flacons ouverture large, bien ferms.
Inhibiteur I cyanure de sodium P.A.
Utiliser 250 mg dans la solution titrer.

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

93

Inhibiteur II sulfure de sodium


a) peser 5 grammes de sulfure de sodium (Na2S.9H2O) ou
3,7 grammes de Na2S.5H2O;
b) dissoudre dans 100 ml deau distille;
c) conserver dans un flacon de verre bien ferm afin
dviter sa dtrioration par le contact avec lair.
Solution standard de couleur
a) peser 1,246 grammes de chloroplatinate de potassium
(K2PtCl6) et 1,0 gramme de chlorure cobalteux cristallis
(CoCl2.6H2O);
b) dissoudre dans de leau distille;
c) ajouter 100 ml dacide chlorhydrique concentr et diluer pour 1000 ml avec de leau distille. (cette solution
quivaut 500 units de couleur).

Ractifs pour lanalyse de laluminium


Acide sulfurique (H2SO4) 0,02N
a) prparer de la mme faon que pour lalcalinit totale.
Acide ascorbique
a) peser 0,1g dacide ascorbique, le dissoudre dans un
peu deau distille et complter le volume pour 100 ml.
Cette solution devra tre prpare quotidiennement.
Ractif tampon
a) peser 136 g dactate de sodium (NaC2H3O2.3H2O) et
les dissoudre dans de leau distille. Ajouter 40 ml de
solution dacide actique 1N et diluer pour 1000 ml
avec de leau distille.
94

Fondation Nationale de la Sant

Solution dacide actique 1N


a) mesurer 58 ml dacide actique concentr et diluer
pour 1000 ml avec de leau distille.
Solution de riochrome Cyanine R (stock)
a) peser et dissoudre 150 mg du colorant dans environ 50
ml deau distille. Ajuster le pH 2,9 avec de lacide
actique 1:1 (2 ml dacide sont ncessaires). Diluer
pour 100 ml avec de leau distille.
Solution de travail (riochrome Cyanine R)
a) mesurer 10 ml de la solution-stock et diluer pour 100
ml avec de leau distille. Cette solution reste stable
pendant 6 mois.
Solution indicatrice de mthylorange
a) peser et dissoudre 100 mg de mthylorange dans 200
ml deau distille.
Solution stock dAluminium (1ml = 500 g Al)
a) peser 8,791 g de sulfate double d'aluminium et de
potassium (AlK (SO4)2.12H2O) et les dissoudre dans un
peu deau distille. Complter le volume pour 1000
ml dans un ballon volumtrique.
Solution-standard dAluminium (1ml = 5 g)
a) diluer 10 ml de la solution stock daluminium pour
1000 ml avec de leau distille dans un ballon volumtrique. Prparer quotidiennement.
Observation: 1) tous les ractifs doivent tre prpars avec de
leau distille libre daluminium.

2) effectuer toutes les procdures qui dterminent
la dilution ou le complment pour x ml en ballon
volumtrique.

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

95

Solution dEDTA 0,01M


a) peser et dissoudre 3,7 grammes dEDTA dans 1000 ml
deau distille.

Ractifs pour lanalyse de fluorures


Solution-standard de fluorures
a) prparer une solution-stock en dissolvant 221,0 mg de
fluorure de sodium anhydre (NaF) dans de leau distille
et diluer 1000 ml (1 ml de cette solution quivaut
100 gF);
b) diluer 100 ml de la solution stock prcite pour 1000
ml avec de leau distille (1 ml = 10 gF).
Ractif zirconium-alizarine
a) peser et dissoudre 300 mg doxychlorure de zirconium
(ZrOCl2.8H2O), dans 50 ml deau distille et verser dans
un flacon volumtrique de 1000 ml avec un couvercle;
b) peser et dissoudre 70 mg de mono sulfate dalizarine
dans 50 ml deau distille;
c) verser la solution 2 dans la solution 1, lentement en
remuant;
d) la solution rsultante devra reposer quelques minutes.
Mlange acide
a) mesurer 101 ml dacide chlorhydrique concentr (HCl)
et diluer pour approximativement 400 ml avec de leau
distille;
b) ajouter prcautionneusement 33,3 ml dacide sulfurique concentr (H2SO4) dans environ 400 ml deau
distille;
c) mlanger les deux solutions aprs refroidissement.
96

Fondation Nationale de la Sant

Ractifs Scott-Sanchis
a) ajouter le mlange acide la solution ractive Zirconil-alizarine;
b) complter le volume pour 1000 ml avec de leau distille et mlanger;
c) conserver dans un flacon ambre et dans un endroit
protg de la lumire directe. Ce ractif reste stable
pendant 6 mois.
Arsnite de sodium
a) peser 5 g darsnite de sodium (NaAsO3) et dissoudre
dans un peu deau, diluer pour 1 litre avec de leau
distille (utiliser 1 goutte pour chaque 0,1mg de chlore
existant dans lchantillon).
Observation: cette solution est toxique viter lingestion et le
contact avec la peau.

Ractifs pour lanalyse de la teneur du chlore actif:


Thiosulfate de sodium 0,1 N Dissoudre 25 grammes de
thiosulfate de sodium Na2S2O3.5H2O dans 1 litre deau distille rcemment bouillie. Stocker pendant deux semaines et
standardiser avec du dichromate de potassium K2Cr2O7 0,1 N.
Remarques:

1. Utiliser de leau distille bouillie dans la prparation du
thiosulfate.

3. Ajouter quelques millilitres de chloroformions ( 5 ml)
pour minimiser la dcomposition bactrienne de la solution de thiosulfate.

Dichromate de potassium 0,1 N Peser 4,904 grammes de


dichromate de potassium (K2Cr2O7), dissoudre dans un peu
deau distille et diluer de suite pour un litre. Stocker dans
un flacon en verre avec un couvercle en verre.
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

97

Solution indicatrice damide Peser 5,0 grammes damide.


Ajouter un peu deau distille jusqu former une pte. Dissoudre de suite cette pte dans un litre deau distille bouillante. Laisser reposer pendant une nuit. Utiliser le liquide
surnageant en le prservant afin dajouter 1,25 grammes
dacide salicylique.

Standardisation de la solution de thiosulfate de


sodium 0,1N
Matriel ncessaire:
a) burette de 50 ml;
b) flacon Erlenmeyer de 250 ml;
c) pipette gradue de 1 ml;
d) pipette volumtrique de 10 ml.
Procdure:
a) verser 80 ml deau distille dans le flacon Erlenmeyer;
b) ajouter, sans cesser de remuer,1 ml de H2SO4concentr
et 10 ml de dichromate de potassium 0,1 N;
c) ajouter 1,0 gramme de iodure de potassium;
d) laisser ragir le mlange pendant 6 minutes dans lobscurit;
e) titrer avec la solution de thiosulfate de sodium jusqu
lapparition dune coloration jaune clair;
f) ajouter 1,0 ml de la solution damide et continuer le
titrage jusqu la disparition de la couleur bleue forme.

98

Fondation Nationale de la Sant

Calcul

Normalit =

1
mL de thiosulfate consomm

Rgles gnrales pour corriger les solutions


titres
La correction des solutions titres est une procdure trs utilise en laboratoire. Elle sert mesurer le degr dexactitude
des solutions standardises. Priodiquement, le technicien
doit vrifier lexactitude de ces solutions pour que les rsultats
des analyses soient les plus corrects possibles.

Rgle 1
Lorsque le volume consomm de la solution titrer est gal
au volume de la solution-standard pris pour le titrage, cela
signifie quelle est exacte. Ex.: 10 ml de HCl 0,1N ont t
consomms pour titrer 10 ml de Na2CO3 0,1N.

Rgle 2
Lorsque le volume consomm de la solution titrer est infrieur que le volume du standard pris, cela signifie que la
solution titrer est plus concentre. Dans ce cas, corriger de la
faon suivante: Ex.: 8,3 ml de HCl 0,1 N ont t utiliss dans
le titrage de10 ml de Na2CO3 0,1N; en appliquant lquation
suivante, nous avons: 8,3: 10:: x: 1000.
Les calculs effectus donnent:
10x = 8,3 x 1000
x = 8300/10 x = 830 ml
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

99

Ensuite, on mesure 830 ml de la solution titrer et on complte 1000 ml avec de leau distille. Faire un nouveau
titrage pour vrifier la rigueur du dosage qui ne doit pas rester
au-dessous de 9,9 et au-dessus de 10,1 ml.

Rgle 3
Si le volume de la solution titrer est suprieur celui de
la solution standard, cela signifie que la solution titrer est
plus dilue. Dans ce cas, on calcule le facteur de correction
de la faon suivante:
Exemple: 10,5 ml dune solution de HCl 0,1N ont t consomms pour titrer 10 ml dune solution standard de Carbonate de Sodium.

En appliquant lquation suivante, nous avons:

10,5: 10:: 1: x

Les calculs effectus donnent:

10 = 10,5x x = 10/10,5 x = 0,9524

Le facteur de correction de la solution est donc de
0,9524.

Nettoyage du matriel en verre au laboratoire


La prcision et lexactitude des analyses sont lies, entre
autres facteurs, lusage du matriel de verre au laboratoire.
Il est donc ncessaire que toute la verrerie soit parfaitement
propre, libre dimpurets, telles que les savons, dtergents et
autres produits qui peuvent adhrer aux parois des rcipients.
La verrerie peut en gnral simplement tre lave avec de
leau, de leau et du savon neutre ou par le biais de solutions
spciales, comme la solution sulfochromique, par exemple.

100

Fondation Nationale de la Sant

Procdure de lavage
Pour de la verrerie neuve:
a) la majorit des matriels en verre neuf est lgrement
alcaline, de ce fait ces matriels doivent tremper
pendant quelques heures dans une solution dacide
chlorhydrique ou nitrique 1% avant dtre lavs.
Pour de la verrerie dj utilise:
a) Les matriels en verre dj utiliss avec un milieu de
culture (botes de Ptri, tubes de culture), doivent tre
striliss avant dtre lavs. Ensuite ils doivent tre
placs dans un grand rcipient contenant de leau et 1
2% de savon ou de dtergent, en les laissant bouillir
pendant 30 minutes. Ils doivent ensuite tre rincs
leau courante, nettoys avec des dtergents neutres et
rincs nouveau;
b) Dans certaines situations o les matriaux de verre
ne pourraient pas tre propres avec des dtergents
communs ou dautres produits de nettoyage, il serait
ncessaire dutiliser un mlange constitu dacide sulfurique et de solution sature de dichromate de sodium,
prpare de la faon suivante: mlanger 1 litre dacide
sulfurique concentr avec 35 ml de la solution sature
de dichromate de sodium. Cette solution ne doit pas
tre utilise pour le lavage de verreries utilises pour
lanalyse du chrome.
Remarques:

1. La solution prcite est acide et attaque la peau;

2. ne pas permettre le contact entre la main et la solution;

3. la solution attaque les tissus. Eviter le contact avec les
affaires;

4. ne pas laver avec cette solution les verres colls comme
les cuves utilises dans les spectrophotomtres, les cuves
de turbidit, etc.;
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

101

5. aprs avoir pass cette solution sur la verrerie, la rincer


grande eau et tout de suite aprs avec de leau distille.

Relation de matriels de laboratoire danalyse


de leau
Equipements
a) autoclave verticale, dune capacit de 18, 24, 48 ou 72
litres et 110/220 volts;
b) incubateur pour la culture bactriologique, avec un thermostat rglable allant de 30 65oC, ayant une taille de
45x45x40 cm respectivement de largeur, profondeur et
hauteur, et quipe dun plateau rglable 3 positions;
c) balance analytique; lectrique avec une capacit de 160
g, une sensibilit de 1/100 mg, cinq dcimales et 110/220
volts;
d) balance de prcision avec une chelle doubl et un pesage
maximum de 200 grammes et une sensibilit de 0,1 g;
e) distillateur deau, capacit de 2 litres/heure et 110/220
volts;
f) bain-marie dune capacit de 50 tubes essai, avec un
thermostat rglable de 35 65oC et 110/220 volts;
g) bain de vapeur, pour 6 essais simultans; construit en
plaque mtallique, avec un thermostat rglable jusqu
6 positions et 110/220 volts;
h) chapelle pour lchappement forc de gaz, avec un moteur
lectrique de 1/3 de HP et 110/220 volts;
i) plaque chauffante avec un thermostat rglable, de taille
x et 110/220 volts;

102

Fondation Nationale de la Sant

j) incubateur pour la strilisation et le schage, taille respectivement de 50x40x50 cm de largeur, profondeur et


hauteur, avec un thermostat rglable jusqu 300oC ainsi
quun plateau rglable 3 positions et 110/220 volts;
k) appareil de Jar-Test pour 6 tests simultans, avec un rgulateur de vitesse de 0 100 rpm, sur une base de verre
ou acrylique illumin et 110/220 volts;
l) mesureur de chlore rsiduel, portatif, avec un disque de
couleur, une chelle de 0 3,5 mg/l, pour une utilisation
au ractif DPD;
m) thermomtre bactriologique, avec une chelle de 0
60oC et des divisions de 1oC;
n) thermomtre chimique ayant une chelle de 0 300oC
et des divisions de 1oC;
o) turbidimtre complet;
p) mesureur digital de pH, sur pied avec une bande de mesure de 0 14, un lectrode, ainsi que 110/220 volts;
q) mesureur digital de pH, portatif ayant une bande de
mesure de 0 14, un lectrode et fonctionnant avec une
batterie de 9 volts;
r) lanterne pour lidentification du E. coli, avec une lampe
fluorescente ultraviolette, 6 watts, 365 nm, rechargeable,
portative et de 110 volts;
s) bec de Bunsen;
t) dionisateur dune capacit de 50 litres/heure et de
110/220 volts.

Verrerie
a) tube pour culture, sans bord, taille 150 x 16 mm;
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

103

b) tube pour culture, sans bord, taille 180 x 18 mm;


c) tube pour culture, sans bord, taille 125 x 15 mm;
d) tube de Nessler, de forma haute, capacit de 50 et 100
ml;
e) tube de Durhan, taille 40 x 5 mm;
f) ballon volumtrique, fond plat, avec un couvercle en
tflon ou en verre abras, classe "A" ayant une capacit
de de 50, 100,250, 500 et 1000 ml;
g) bcher de forme basse, gradu, dune capacit de 50,
100, 250, 500 et 1000 ml;
h) burette avec un robinet en verre ou en tflon, enregistrement permanent, casse "A" et une capacit de 10, 25,
et 50 ml;
i) pipette sorologique, codifie par couleurs, avec un bocal
pour le coton, enregistrement permanent et une capacit
de 1, 2, 5 et 10 ml;
j) pipette de MOHR, codifie par couleurs, un bocal et
un bec temprs, un enregistrement permanent et une
capacit de 1, 2, 5 et 10 ml;
k) pipette volumtrique, codifie par couleurs, un bocal et
des becs temprs, un enregistrement permanent, classe
A et une capacit de 10, 25, 50 et 100 ml;
l) flacon de verre pour les ractifs, vas, de couleur blanche
avec bouchon de verre dpoli interchangeable et une
capacit de 125 ml;
m) bcher gradu conter, avec une base hexagonale en
verre, un enregistrement permanent, classe "A" et une
capacit de 10, 25,50, 100, 250, 500 et 1000 ml;
n) flacon Erlenmeyer, ouverture large renforce, gradu et
dune capacit de 125, 250 et 500 ml;
104

Fondation Nationale de la Sant

o) entonnoir analytique avec un angle de 60o, lisse, avec


une tige courte et un diamtre de 50, 75 et 100 mm;
p) entonnoir analytique avec un angle de 60o, ray, avec
une tige longue et un diamtre de 50, 75 et 100 mm;
q) entonnoir analytique avec un angle de 60o, ray, avec
une tige courte et un diamtre de 50, 75 et 100 mm;
r) Bote de Ptri en verre, transparent, de taille 100 x 15 mm;
s) ensemble de distillation pour les fluorures, constitu dun
ballon de fond plat de 1000 ml ayant une sortie latrale
pour le condensateur Grahan, avec des joints abrass;
t) bton de verre de 30 cm de longueur x 5 mm de diamtre;

Matriels divers
a) anse de platine calibre 3 mm de diamtre;
b) cble Kolle pour manipuler le platine;
c) coton en feuille pour la bactriologie;
d) crayon dermographique;
e) bouillon lactos, dshydrat, en emballage de 100 ou 500
grammes;
f) bouillon lactos, bili vert brillant 2%, dshydrat, en
emballage de 100 ou 500 grammes;
g) milieu ENDO MF, pour coli total, en emballage de 100
ou 500 grammes;
h) milieu EC MF, pour coli fcal, en emballage de 100 ou
500 grammes;
i) pourpre de bromocrsol en emballage de 5 grammes;
j) tagre pour tubes essai, avec une capacit de 15 tubes
de 180 x 18 mm, en bois ou en plastique rsistant.
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

105

k) tagre pour tubes essai avec une capacit de 40 tubes


de 180 x 18 mm, en fil mtallique rsistant lautoclavage;
l) bouillon tryptose lauryl sulfate, dshydrat, en emballage
de 100 ou 500 grammes;
m) milieu EC, dshydrat, en emballage de 100 ou 500
grammes.
n) Plate count agar, dshydrat, en emballage de 100 ou
500 grammes;
o) substrat chromogne pour la dtermination enzymatique
qualitative de coliformes totaux e E. coli en chantillons
de100 ml deau, conditionn en botes de 20 ampoules;
p) panier mtallique avec une capacit de 50 tubes essai
de 180 x 18 mm, rsistant autoclavage;
q) support pour tube de Nessler de 50 et 100 ml, en bois ou
en aluminium avec une capacit de 8 tubes;
r) papier daluminium, mesurant 7,5 m de longueur x 30
cm de largeur;
s) coton hydrophile, paquet de 500 grammes;
t) Bote de Petri en plastique, strilise, de 47 mm de diamtre;
u) filtres strils de 47 mm de diamtre, 0,45m de porosit
avec un carton absorbant, en emballage de 100 units;
v) ensemble porte-filtre de membrane, en acier inoxydable,
avec un dispositif pour la strilisation sur le champ;
w) pince en acier inoxydable de 10 cm de longueur.

106

Fondation Nationale de la Sant

La bioscurit en laboratoire
Dans ce manuel ne sont contenues que les principales procdures en matire de bioscurit en laboratoire, procdures
qui devront tre respectes par les techniciens qui travaillent
dans ce domaine.

Procdures dordre personnel:


a) ne pipeter aucune sorte de liquide avec la bouche;
b) utiliser des lunettes de protection dans les endroits du
laboratoire o lutilisation est obligatoire;
c) ne pas mettre les mains la bouche ou se toucher les
yeux lors de manipulation de produits chimiques;
d) ne pas conserver les aliments dans le rfrigrateur du
laboratoire;
e) ne pas manger lintrieur du laboratoire;
f) ne pas fumer lintrieur du laboratoire;
g) toujours utiliser un tablier ou une blouse manches longues avec un lastique aux poignets et lenlever en sortant
du laboratoire;
h) Se laver les mains contentieusement avec assez deau et
de savon avant de manger;
i) ne pas manipuler de produits toxiques sans sassurer avant
de leur toxicit.

Procdures relatives au laboratoire


a) maintenir les comptoirs du laboratoire toujours propres
et libres de matriels trangers au travail;

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

107

b) retirer du comptoir les matriels, chantillons et ractifs


employs au travail aprs les avoir utiliss;
c) nettoyer immdiatement nimporte quel panchement de
produits et de ractifs avec les prcautions ncessaires;
d) en vidant un flacon de ractif, le nettoyer pralablement
avec de leau avant de le mettre au lavage;
e) tiqueter immdiatement nimporte quel ractif ou solution prpars, ainsi que les chantillons collects;
f) ne pas jeter des produits corrosifs concentrs dans lvier;
il faut dabord les diluer;
g) dans la prparation de solutions acides ne jamais ajouter
deau dans lacide mais de lacide dans leau;
h) ne pas jeter dans lvier des liquides inflammables et ou
volatils; les stocker dans des rcipients adquats;
i) disposer les cylindres avec des gaz dans un endroit externe
au laboratoire, correctement conditionns;
j) utiliser une chambre de flux laminaire (cabine de scurit
biologique) pour la manipulation de milieux de culture et
pour la recherche microbiologique;
k) utiliser une chambre dextinction (cabine de scurit
chimique) avec un purificateur de gaz lors de lutilisation
de liquides inflammables et/ou volatils.

Procdures relatives lutilisation de la verrerie:


a) ne pas utiliser de matriels en verre fissurs;
b) utiliser des gants en amiante pour manipuler les objets en
verre qui sont chauds;
c) ne pas laisser les flacons chauds sans protection sur les tagres du laboratoire, les placer sur des plaques damiante;
108

Fondation Nationale de la Sant

d) ne pas chauffer de rcipient en verre directement avec


une flamme, utiliser un cran damiante;
e) ne pas pressuriser les rcipients en verre;
f) ne pas oublier le verre lorsquil est en train de chauffer,
toujours utiliser un minuteur ou un rveil;
g) ne pas utiliser de flacons pour chantillons qui ne soient
pas parfaitement propres et sans sassurer de leur adquation lutilisation qui va en tre faite;
h) utiliser des gants de cuir et des lunettes de scurit,
chaque manipulation de bouchon en lige ou en caoutchouc, de tubes en verre ou de thermomtres;
i) jeter les couvercles en verre bloqus;
j) jeter les morceaux de verre utiliser une pelle et un balai;
k) utiliser une protection faciale et des gants de pelica pour
remuer des solvants volatils dans des flacons ferms.

Procdure pour lutilisation dquipements en gnral


a) avant dutiliser nimporte quel quipement, lire les instructions dutilisation fournies par le fabricant;
b) ne jamais allumer les appareils sans vrifier le voltage
avant;
c) ne pas installer ni mettre en marche dquipements lectriques sur des superficies humides;
d) ne pas laisser dappareils lectriques allums dans le
laboratoire aprs utilisation, except ceux qui ont un
besoin constant dnergie comme les rfrigrateurs, les
incubateurs, etc.;
e) teindre le feu sur des appareils lectriques seulement
avec un extincteur de CO2;
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

109

f) Garder les quipements de scurit dans un local facilement accessible et porte de tous les employs du
laboratoire, tels que:
extincteur dincendie;
douche durgence;
lave-yeux;
couverture de scurit;
masque gaz;
masque et lunettes de scurit, etc.

110

Fondation Nationale de la Sant

Annexe A

Collecte et conservation dchantillons pour


Comptage des cellules de cyanobactries et
cyanotoxines

Indroduction
A la fin de llaboration de ce manuel, dj rvis et adapt
la lgislation actuelle concernant la qualit de leau pour la
consommation humaine, les procdures de base de collecte
dchantillons de leau afin de didentifier et de compter les
cyanobactries dans les sources dapprovisionnement ont
t incluses.
Une telle initiative est due une eutrophisation en hausse
des milieux aquatiques qui a t produite principalement par
lactivit humaine, causant un enrichissement artificiel de ses
cosystmes. Les sources principales de cet enrichissement
ont t identifies comme les dversements dgouts domestiques et industriels des centres urbains ainsi que la pollution
diffuse venant des rgions agricoles. Cette eutrophisation
artificielle produit des changements dans la qualit de leau,
dont: la rduction de loxygne dissout, la perte des qualits
scniques, cest--dire, des caractristiques esthtiques du
milieu et de son potentiel de loisir, la mort de nombreux
poissons et laugmentation de lincidence de floraison de
micro-algues et de cyanobactries, avec des consquences
ngatives sur lefficience et le cot du traitement de leau,
lorsquil sagit de la source dapprovisionnement public. Ces
floraisons ou blooms se caractrisent par une croissance
intense de ces micro-organismes sur la superficie de leau, formant une couche dense de cellules de plusieurs centimtres
de profondeur, ayant des consquences sur la sant publique.

Collecte et conservation dchantillons pour le


comptage de cellules de cyanobactries
Matriel ncessaire
a) Flacon en polythylne ou en verre ambr dune capacit de 1000 ml;
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

113

b) une bouteille de Van Dorn ou similaire;


c) Solution de lugol;
d) Solution de formaldhyde 40%;
e) Equipements de protection individuelle (gants, bottes
et masque).

Dfinition du point de collecte de lchantillon


a) sil y a floraison de cyanobactries, lchantillon devra
tre collect dans le point de concentration le plus lev
de cette dernire;
b) sil ny a pas de floraison de cyanobactries, lchantillon devra tre collect dans le point de captation de
lETA, dans la source.

Identification des chantillons


a) tous les chantillons devront tre identifis par une
numration sur le flacon de collecte, faisant rfrence
la fiche de collecte ou fiche de prlvement;
b) les fiches de prlvement accompagneront les chantillons et devront comporter les donnes suivantes:
nom et adresse de lintress, nom de la source, type
de source, date et heure de la collecte, description du
local de collecte, GPS, nom du collecteur, apparition
de phnomnes.

Procdure de collecte chantillon de superficie


a) nettoyer le flacon de collecte au moins trois fois;
b) remplir le conteneur avec un chantillon collect, en
laissant un volume dair dans la partie suprieure du
flacon;
114

Fondation Nationale de la Sant

c) collecter au minimum 1000 ml dchantillon pour eau


brute;
d) collecter 4.000 ml dchantillon pour eau traite.
Observation: collecter seulement dans des flacons ambre

Conservation, conditionnement et transport de


lchantillon
a) milieux oligotrophes: conserver les chantillons dans
de la solution Lugol (ajouter 1ml/l);
b) milieux eutrophiss: conserver les chantillons dans
une solution formaldhyde 40%(ajouter 2ml/L)
c) conserver lchantillon 4C;
d) conditionner dans des caisses thermiques et;
e) envoyer au laboratoire dans un dlai maximum de 8
heures.

Collecte et conservation des chantillons pour la


dtermination de cyanotoxines
Matriel utilis
a) flacon en polythylne ou en verre ambr, dune capacit de 1000 ml;
b) quipements de protection individuelle (gants, bottes
et masque;

Dfinition du point de collecte de lchantillon


a) sil y a une floraison de cyanobactries, lchantillon
devra tre collect dans le point de concentration le
plus lev de cette dernire;
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

115

b) sil y a une floraison de cyanobactries et que le comptage de ces dernires dpasse 20.000 cellules/ml, des
chantillons devront tre collects la source et la
sortie de lETA, selon le dcret MS n 2914/2011;
c) sil ny a pas de de floraison de cyanobactries, un
chantillon devra tre collect au point de captation
de lETA, la source.
Identification des chantillons
a) tous les chantillons devront tre identifis par une
numrotation sur le flacon de collecte mme, mentionnant galement les fiches de collecte ou fiches de
prlvement;
b) les fiches de prlvement accompagneront les chantillons et devront comporter les donnes suivantes: nom
et adresse de lintress, nom et type de la source, date
et heure de collecte, description du local de collecte
GPS, nom du collecteur et apparition de phnomnes.

Procdures de collecte de fraction particulaire


Matriel ncessaire
a) nettoyer le flacon de collecte au moins trois fois;
b) remplir le contenant avec lchantillon collect, en
laissant un volume dair dans la partie suprieure du
flacon;
c) collecter au minimum 1000 ml dchantillon de eau
brute;
d) collecter 4000 ml dchantillon de eau traite;

116

Fondation Nationale de la Sant

Conservation, conditionnement et transport de


lchantillon
a) conserver lchantillon 4C;
b) conditionner dans des caisses thermiques et envoyer
au laboratoire dans un dlai maximum de 8 heures.
Observation: si lchantillon ne peut pas tre envoy au laboratoire le jour de la collecte, cette dernire devra tre
congele et envoye au laboratoire dans un dlai
de 15 jours.

Lavage des flacons


Pour laver les flacons de collecte et de conservation dchantillons pour lanalyse de cyanotoxines, il est suggr de
procder de la faon suivante: laisser les flacons immergs
dans du savon neutre pendant 12 heures, les laver ensuite
exhaustivement avec de leau et les immerger dans une solution de HCl 5% pendant 12 heures, les laver de nouveau
exhaustivement avec de leau distille et les scher. Si le
flacon avait dj t utilis pour une collecte dchantillons
contenant des cyanobactries, limmerger dans une solution
deau sanitaire pendant 30 minutes antes de passer ltape
du savon neutre.

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

117

Bouteille de van Dorn


La bouteille de van Dorn (fig.) consiste
en un tube de PVC dun volume de
2; 5 et 7 litres ou plus. Le fonctionnement consiste plonger la bouteille ouverte par les deux extrmits
jusqu atteindre le point dsir,
laisser tomber le loquet qui ferme
hermtiquement les deux extrmits.
Lchantillon est retir par le robinet
qui est sur la partie latrale de la
bouteille en dconnectant la partie
suprieure.

118

Fondation Nationale de la Sant

Annexe B

Dtermination du Giardia sp et du
Cryptosporidium sp dans leau par la technique
de filtration, de sparation immunomagntique
et de microscopie de limmunofluorescence

Introduction
La transmission de protozooses via lapprovisionnement
deau, en particulier le Giardia et le cryptospordium, est un
sujet de proccupation grandissant pour la sant publique.
Les protozoaires sont des micro-organismes eucariotiques,
unicellulaires, sans parois cellulaires qui se nourrissent de
bactries et dautres organismes. La plupart des protozoaires
sont ltat libre et on les rencontre frquemment dans les
eaux superficielles, dont (o ?) beaucoup despces sont
parasites. Les effets sur la sant dcoulant de lexposition
aux protozoaires prsents dans leau de consommation sont
multiples. Leffet le plus commun se manifeste par des drangements gastro-intestinaux, normalement de courte dure.
Cependant, chez les individus sensibles, tels que les enfants,
les personnes ges et les immunodprims, les effets peuvent
tre plus graves, chroniques et mme fatals.
La transmission de protozooses via lapprovisionnement
deau, en particulier le Giardia et le cryptospordium, est un
sujet de proccupation grandissant pour la sant publique.
Les protozoaires sont des micro-organismes eucariotiques,
unicellulaires, sans parois cellulaires qui se nourrissent de
bactries et dautres organismes. La plupart des protozoaires
sont ltat libre et on les rencontre frquemment dans les
eaux superficielles, o beaucoup despces sont parasites. Les
effets sur la sant dcoulant de lexposition aux protozoaires
prsents dans leau de consommation sont multiples. Leffet
le plus commun se manifeste par des drangements gastro-intestinaux, normalement de courte dure. Cependant, chez les
individus sensibles, tels que les enfants, les personnes ges
et les immunodprims, les effets peuvent tre plus graves,
chroniques et mme fatals.

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

121

Le Giardia et le cryptospordium sont des microorganismes trs


rpandus et relevant de la pathognicit, qui se multiplient
seulement dans lappareil gastro intestinal des tres humains
et dautres animaux. Bien quils ne puissent pas se reproduire
dans lenvironnement, ils peuvent survivre longtemps dans
le milieu aquatique. Les cystes de Giardia et principalement,
les oocystes de cryptospordium, sont connus pour rsister
aux agents dsinfectants utiliss sans le traitement de leau
pour la consommation humaine, en particulier lorsque cest
le chlore qui est utilis.
Face ce scnario, le dcret MS n 2.914/2011 impose le
contrle du Giardia et du cryptospordium au niveau du point
de captation de leau lorsque la moyenne gomtrique annuelle de lE. coli ce point est suprieure ou gale 1.000
org/100ml. En outre, lorsque la moyenne arithmtique de
la concentration de oocystes de cryptospordium spp. est
suprieure ou gale 3,0 oocystes/L aux points de captation
de leau, le dcret recommande que la turbidit de leffluent
filtr (filtration rapide) soit infrieure ou gale 0,3 uT, ou
qualternativement on emploie le processus de dsinfection
qui atteint la mme efficacit dans llimination des oocystes
de cryptosporidium spp de faon prouve.
Les mthodologies utilises pour la dtection d(oo)cystes
se basent sur la concentration des chantillons et sur la
dtection. Dans toutes les mthodes utilises concernant
le contrle des oocystes, les tapes de concentration, de
purification (qui est incorpore pour sparer les (oo)cystes
des rsidus restants) et de dtection sont considres comme
trs importantes. Soulignons que ces mthodologies ont t
dcrites et standardises (normalises) dans des pays comme
les USA, lAustralie et le Canada, dont les programmes et
les lgislations en matire de contrle de la pollution et de
dgradation des sources sont une priorit.
122

Fondation Nationale de la Sant

Les diffrentes mthodologies employes pour la recherche


de protozoaires pathognes dans leau sont sujettes de
nombreuses limitations, parmi lesquelles on trouve les cots
levs, la ncessit dimporter des intrants et le besoin de
personnel spcialis. Il y a galement la grande varit des
rsultats et le taux de rcupration bas des mthodes analytiques, mme lorsquon emploie la mthode de rfrence la
Mthode 1623/USEPA. On peut encore considrer que ces
mthodologies ne permettent pas lidentification de lespce
de protozoaire (qui peut tre un indicateur utile de la source
de contamination), elles ne fournissent pas non plus dinformations concernant linfectiosit des organismes.
Suit une mthodologie de dtermination de giardose sp et de
Cryptosporidium sp dans des chantillons deau.
Dtermination du Giardia sp et du Cryptosporidium sp dans
leau par la technique de filtration, de sparation immunomagntique et de microscopie de limmunofluorescence
La mthode 1623 de lUSEPA est la suivante: la dtermination
du Giardia sp. et du Cryptosporidium sp. dans leau par la
technique de filtration, de sparation immunomagntique et
par la microscopie de limmunofluorescence (USEPA, 2005).

1. Principe de la mthode
La technique de dtection du Cryptosporidium et du Giardia dcrite dans cette procdure est base sur les tapes
suivantes: concentration de lchantillon par filtration et
centrifugation, purification par sparation immunomangntique (IMS), coloration et lecture de lames (microscopie
de limmuno-fluorescence FA). Le cryptosporidium et le
Giardia sont identifis grce des colorants DAPI (de langlais 4-6-Diamidino-2-phenylindole) et une microscopie
de contraste par interfrence diffrentielle. Cette mthode
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

123

identifie les genres, cryptosporidium ou Giardia, mais pas


le niveau des espces. Son application exige lemploi de
personnel trs qualifi avec de lentrainement et de lexprience concernant la dtermination du Cryptosporidium et
du Giardia par filtration, IMS, et FA.

2. Interfrents

Turbidit

Organismes ou dtritus
auto-fluorescence ou
Immuno-fluorescence

Contamination

124

Fondation Nationale de la Sant

Influence dans les tapes de


concentration et sparation,
en vertu de la concentration
de la matire particulaire et de
lanalyse de lchantillon en
microscopie, rendant difficile
lidentification des oocystes de
cryptosporidium et des cystes de
Giardia.
Interfrence dans lidentification
des (oo)cystes, lorigine de faux
test positifs.
Solvants, ractifs, matriel de
laboratoire et de traitement des
chantillons qui peuvent tre
responsables de lintroduction
des interfrents et lorigine
derreurs dinterprtation des
examens
microscopiques
doocystes et de cystes. Dans tous
les matriels utiliss on doit avoir
constat labsence dinterfrents
grce une analyse fate en
blanc (contrle ngatif). On doit
utiliser du matriel jetable autant
que possible.

Inexprience du laborantin

Lidentification d(oo)cystes au
microscope exige une capacit
du
laborantin
didentifier
autant les genres grce un
chantillon
environnemental
(compos de components divers)
qu lentranement dans les
tapes diverses des mthodes
dutilisation des quipements.

3. Scurit
Les dangers de contamination biologique associe et le risque
dinfection par des cystes et des oocystes sont levs dans cette
mthode, tant donn quelle inclut la manipulation dchantillons concentrs dorganismes pathognes vivants (actifs), cest
pourquoi ils doivent tre manipuls avec des gants;
Le laboratoire doit tablir des mesures de scurit et des
pratiques de sant appropries, observant les procdures
de scurit typiques des laboratoires de microbiologie qui
traitent des organismes pathognes durant la prparation,
lutilisation et llimination dchantillons concentrs, de
ractifs et de matriels dans la manipulation et la strilisation
dquipements;
Les connaissances de la toxicit ou de la carcinognicit des
composants ou ractifs utiliss ne sont pas bien consolides,
ainsi chaque composant doit tre trait comme potentiellement dangereux pour la sant, ce qui implique une exposition
la plus rduite possible ces produits;
Le transport dchantillons contenant des agents infectieux
doit tre ralis de faon rigoureuse, en procdant de prfrence linactivation des agents. En outre, on doit respecter
les standards et les lgislations en vigueur concernant le
transport dagents biologiques inactifs ou non.
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

125

4. Equipements et matriels
Remarque: les marques ou les fournisseurs cits le sont titre de
rfrence. Des rsultats quivalents peuvent tre atteints en utilisant dautres marques, il faut nanmoins
respecter ladquation des intrants utiliss.

4.1 les gallons ou rcipients en plastique (polythylne) pour


le prlvement dchantillons dun volume entre 10 et
50 litres. Le matriel de prlvement doit tre recyclable
de prfrence;
Remarque: on peut opter pour la strilisation des galons de prlvement en les lavant avec 200 ml de solution dhypochlorite de calcium 12,5% (bien remuer afin de
rpandre la solution), conserver de 8 12h (pendant
la nuit), jeter la solution dhypochlorite de calcium et
laver dabord avec 200 ml de solution de thiosulfate de
sodium (52%) et rincer de suite avec de leau distille
(eau ractive). Opcionalmente, pode-se optar pela esterilizao dos gales de coleta pela lavagem com 200
mL de soluo de hipoclorito de clcio 12,5% (agitar
bastante para espalhar a soluo), aguardar de 8 a 12h
(overnight), descartar a soluo de hipoclorito de clcio e lavar, primeiramente, com 200 mL de soluo de
tiossufalto de sdio (52%) e em seguida enxaguar com
gua destilada (gua reagente).

4.2 Agitateur de tubes (du type Vortex);


4.3 Agitateur magntique;
4.4 Barres magntiques;
4.5 Agitateur rotatif dune capacit de 18 rpm/min;
4.6 Pompe vide/pression ou ligne de pression dune capacit minimale de 5 bar;

126

Fondation Nationale de la Sant

4.7 Centrifugeuse pouvant proportionner une force de 1500g


quipe de rotateurs swinging-bucket qui accommodent les tubes coniques de 250 ml et 50 ml;
4.8 Concentrateur de particules magntiques pour tubes de
10 ml (MPC1 ou MPC6);
4.9 Concentrateur de particules magntiques pour tubes de
micro-centrifugeuse (MPC-M ou MPC-S);
4.10 Mlangeur rotatif (homognisateur) du type Stomacher dune capacit de 300/350 coups/minute;
4.11 Sacs plastiques compatibles avec lhomognisateur;
4.12 Micro-pipeteurs dun volume variable de 100-1000 L
et 10-100 ou 20-200 L;
4.13 Microscope optique quip dun contraste interfrentiel
diffrentiel (DIC) et dune pi fluorescence ayant la
capacit daugmenter de 200x, 400x et 1000x;
4.14 Porte filtre en mousse;
4.15 Bchers de 1000 ou 2000 ml;
4.16 Filtres en mousse (Filta-Max);
4.17 Station de lavage et de concentration (Filta-Max);
4.18 Membrane de polycarbonate de 25 mm de diamtre et
dune rtention de 1m;
4.19 Lames pour la microscopie de fluorescence;
4.20 Lamelles couvre-objet (minimum 24x32 mm);
4.21 Pipettes Pasteur;
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

127

4.22 Pipettes srologiques de 5 et 10 ml;


4.23 Aiguilles en polypropylne dune capacit de 200-300
L et 1000 L;
4.24 prouvette de 500 ml;
4.25 Tubes de polypropylne de 1,5 ml (du type eppendorf);
4.26 Tubes coniques de centrifugeuse dune capacit de 250
ml et de 50 ml;
4.27 Tubes de Leighton (ct plat).

5. Ractifs
5.1 Hydroxyde de sodium;
5.2 Acide chloridrique;
5.3 A
 ctone;
5.4 G
 lycrole;
5.5 E thanol;
5.6 M
 thanol;
5.7 Eau ractive (eau ultra pure);
5.8 Tween 20 (Sigma Chemical);
5.8.1 Tampon phosphate salin PBS pH 7.4 (Sigma Chemical): 8 g NaCl; 0.2 g KCl; 1.15 g Na2HPO4 anhydre;
0.2 g KH2PO4; 1,0 L deau ractive;
5.8.2 DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole (Sigma Chemi- cal);
128

Fondation Nationale de la Sant

5.9 Solutions pour llution des filtres;


5.9.1 Tampon phosphate salin/Tween 20 (PBST): Ajouter
0,10ml (100L) de Tween 20 1,0 L de solution
tampon phosphate salin (PBS);
5.9.2 Solution de stock:dissoudre 2 mg DAPI dans 1,0 ml de
mthanol absolu;
Remarque: Prparer des volumes minimums pour lutilisation et
verser dans un flacon ou un tube strile protg de la
lumire avec un couvercle filet. Conserver entre 1oC
et 10oC. Ne pas congeler. Jeter la solution aprs 2 semaines ou lorsque le contrle positif devient ngatif.

5.9.3 DAPI (solution dutilisation suivre les instructions du


fabricant du kit danticorps): ajouter 0,01 ml de DAPI
(solution stock) 50 ml de PBS;
Remarque: Prparer des volumes minimums pour lutilisation et
conserver dans un flacon ou un tube strile protg de
la lumire avec un couvercle filet. Conserver entre
1oC et 10oC. Prparer la solution quotidiennement.

5.10 Solutions pour le montage de lames;


5.10.1 Glycrole/PBS: Mlanger 60 ml de glycrole et 40
ml de PBS.
Remarque: Prparer au moment de lutilisation.

5.10.2 milieu de montage DABCO/Glycrole: peser 2,0g de


DABCO (Sigma Chemical) et les mettre dans un ballon
volumtrique. Ajouter 95 ml de solution de glycrole/
PBS tide (chauffe) et mlanger jusqu la dissolution
complte du ractif. Complter le volume pour 100
ml et verser dans un flacon strile ayant un couvercle
filet dune capacit de 100 ml. Conserver entre 2 et
8C (validit: 3 mois).

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

129

6. Prlvement dchantillon
6.1 Remplir entirement le contenant assurant ainsi une
collecte de 10 L (la version de la mthode utilisant un
filtre dponge Filta Max a t valide pour un volume
de 50 L, toutefois des volumes dchantillon alternatifs
peuvent tre utiliss);
6.2 Les chantillons devront tre prlevs dans un volume
unique et conservs au rfrigrateur entre 1oC et 10oC,
sans les congeler, jusqu leur traitement;

7. Identification de lchantillon
7.1 Identifier correctement l chantillon;
7.1.1 Enregistrer les informations concernant la provenance
de lchantillon ainsi que la date et lheure de prlvement;
7.1.2 Enregistrer les donnes de lanalyse: date du dbut de
lanalyse, volume analys et volume du centrifugat;
7.1.3 Enregistrer les lots des ractifs et des solutions utiliss.

8. Filtration
8.1 Mettre le filtre en mousse sur le porte-filtre;
8.2 Connecter laide de tuyaux de silicone ou du porte-filtre
au rcipient contenant lchantillon et la pompe ou la
ligne de pression;
8.3 Leffluent pendant le processus de filtration doit tre
conserv dans un rcipient gradu afin de mesurer son
volume;
130

Fondation Nationale de la Sant

8.4 A la fin de la filtration de lchantillon, arrter la pression.


Dconnecter le porte-filtre du tuyau et fermer le couvercle du porte-filtre avec un bouchon en caoutchouc aux
points dentre et de sortie;
8.5 Si llution nest pas fate immdiatement, conserver le
porte-filtre et la mousse entre1 et 10oC.
Llution peut tre commence 96h aprs le prlvement de
lchantillon ou sa filtration dans le champ.

9. E lution
Remarque: le processus dlution dcrit utilise la station de lavage
Filta-Max, il est fortement recommand de lire les
instructions du fabricant afin de connatre le fonctionnement du montage et du mode dopration de lappareil. On peut galement utiliser un Stomacher en
option.

9.1 Procdure dlution dans la station Filta-Max;


9.1.1 Premier lavage;
9.1.1.1 Poser la membrane filtrante plane sur la base du
concentrateur avec la partie rugueuse vers le haut;
9.1.1.2 Utiliser les verrous de la station de lavage pour incubateur le tube concentrateur (en crant une tanchit
dans la membrane);
9.1.1.3 Retirer le tube concentrateur de la station de lavage;
9.1.1.4 Jeter le filtre en mousse du porte-filtre;
9.1.1.5 Connecter le filtre en mousse la station de lavage;

Manuel Pratique dAnalyse de lEau

131

9.1.1.6 Verser lexcdent de liquide rcupr partir du


module de filtration dans le tube concentrateur, puis
le laver de suite avec du PBST et verser le liquide
nouveau dans le tube concentrateur;
9.1.1.7 Ajouter 600 ml de PBST dans le tube concentrateur et
le connecter la base en dessous du tube dlution;
Remarque: Si plus de 50 ml de liquide a t rcupr partir du
module de filtration, rduire le volume de PBST en
consquence.

9.1.1.8 Laver le filtre en mousse en bougeant le piston vers


le haut et vers le bas 20 fois. Il est recommand
deffectuer des mouvements doux afin dviter de
produire trop de mousse;
9.1.1.9 Sparer le concentrateur et purger le liquide restant
dans le tube dlution, en bougeant le piston vers le
haut et vers le bas 5 fois, puis mettre le tampon fourni
extrmit du tube dacier de suite, afin dviter que
cela ne goutte;
9.1.1.10 Concentrer la solution lue du premier lavage en
utilisant lappareil Filta-Max . Mettre le tube concentrateur sur un agitateur magntique et mettre le
couvercle avec sa barre magntique;
9.1.1.11 Connecter lappareil de vidange la valve sur la
base du concentrateur. Allumer lagitateur et ouvrir
la valve;
9.1.1.12 Allumer la pompe vide;
9.1.1.13 Laisser le liquide scouler jusqu une hauteur
approximativement gale au milieu de barre magntique et fermer la valve de suite;
132

Fondation Nationale de la Sant

9.1.1.14 Enlever lagitateur magntique et le laver avec du


PBST ou de leau ractive afin de rcuprer tous
les oocystes;
9.1.1.15 Transfrer le concentr dans un tube de 50 ml, laver
ensuite les parois du tube de concentration et transfrer le produit du rinage dans le tube de 50 ml.
9.1.2 Second lavage.
9.1.2.1 Ajouter un volume additionnel de 600 ml de PBST
au module concentrateur;
9.1.2.2 Rpter le lavage des filtres en mousse, bougeant le
piston vers le haut et le bas 10 fois. Il est recommand
deffectuer des mouvements doux afin dviter de
produire trop de mousse;
9.1.2.3 Ajouter le concentr du premier lavage conserv dans
le tube de 50 ml pour lluat (mlange dluant et de
solut) du second lavage et rpter le processus de
concentration de lchantillon avec lappareil Filta-Max .
Remarque: En cas dobstruction des pores de la membrane et dinterruption de lcoulement avant la fin de la concentration, il est possible de remplacer la membrane filtrante.
Dmonter le tube concentrateur et conserver lluat
restant dans un rcipient. Retirer la membrane laide
dune pince et la mettre dans le sac fourni. Mettre une
nouvelle membrane et remonter le tube concentrateur. Remettre lluat conserv dans le tube concentrateur, laver le rcipient leau ractive, additionner
le liquide lluat et continuer la concentration. La
membrane peut tre remplace plusieurs fois si ncessaire. La concentration peut galement tre ralise
par centrifugation 1500G pendant 15 minutes.

9.1.2.4 Enlever lagitateur magntique.


Manuel Pratique dAnalyse de lEau

133

9.1.2.5 Lchantillon final peut tre vers dans le mme tube


de 50 ml. Laver les parois du tube concentrateur avec
du PBST et verser la solution dans le tube de 50 ml.
9.1.2.6 Insrer le tube concentrateur vide dans la station de
lavage.
9.1.2.7 Retirer la membrane et la transfrer dans le sac fourni
laide dune pince;
9.1.2.8 Laver la membrane:
9.1.2.8.1 Manuellement Ajouter 5 ml de PBST dans le sac
contenant la membrane. Frotter la superficie de
la membrane travers le sac jusqu ce quelle
paraisse propre. Transfrer le produit de llution
dans un tube de 50 ml en utilisant une pipette.
Rpter le lavage de la membrane avec plus de 5
ml de PBST et transfrer le produit de llution dans
le tube de 50 ml.
9.1.2.8.2 Lavage avec un Stomacher Ajouter 5 ml de
PBST dans le sac contenant la membrane. Le mettre
dans un Stomacher et remuer pendant 3 minutes.
Transfrer lluat dans un tube de 50 ml en utilisant
une pipette. Rpter le lavage deux fois en utilisant
le Stomacher et 5 ml daliquotes de PBST.

10. Centrifugation
10.1 Centrifuger le tube de 50 ml 1500g pendant 15 minutes.
10.2 Aspirer avec soin ce qui surnage jusqu 5 ml au dessus
du sdiment laide dune pipette de Pasteur.
10.3 Enregistrer le volume du sdiment.
134

Fondation Nationale de la Sant

Remarque: Le volume du sdiment ne doit pas tre suprieur 0,5


ml, quantit maximale recommande de matire particulire pour la purification par la mthode.

11. Sparation immunomagntique


11.1 Remuer vigoureusement le tube en vortex pour suspendre le sdiment:
11.1.1 Si volume de sdiment est infrieur 0,5 ml, agiter le
tube en vortex vigoureusement jusqu a suspension
complte du sdiment. Tourner le tube centrifuger
doucement afin de rduire la mousse forme aprs
lhomognisation.
11.1.2 Si le volume de sdiment est suprieur 0,5 ml, le concentr doit tre spar en plusieurs sous-chantillons
(un sous-chantillon ne doit pas avoir un volume de
sdiment suprieur 0,5 ml).
11.1.2.1 Estimer le volume total requis en utilisant le volume
du sdiment pour la formule
Volume total requis (mL) =

Volume de sediment (mL)


0,5 mL

x 5,0 mL

Par exemple, si le volume du prcipit est de 1,2 ml, le volume total ncessaire est de 12 ml. Ajouter de leau purifie
au tube centrifuger pour complter le volume 12 ml.
11.1.3 Si tout le volume obtenu est soumis lIMS, le diviser
par 5 ml et calculer le nombre de sous-chantillons
qui devront tre analyss (en arrondissant au chiffre
rond suprieur le plus proche). Dans lexemple sit
ci-dessus, 12/5 ml = 2,4, en arrondissant cela donne
3 sous-chantillons.
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

135

11.1.4 Si le volume tre analys est partiel, remuer vigoureusement le volume total en vortex afin de suspendre
compltement le prcipit.
11.2 Prparer pour chaque concentr 1,5ml dune dilution
1X du tampon SL-A 10X. Pour chaque 1,0 ml requis de
la solution dilue, mlanger 100L (0,1ml) et 900L
(0,9ml) deau ractive.
11.3 Transfrer 5ml de lchantillon concentr (ou sous-chantillon) dans le tube de Leighton (ct plat) contenant 1,0 ml de chaque tampon SL-A 10X et SL-B 10X
(Dynabeads GC-Combo) laide dune pipette de 10ml.
11.4 Rincer deux fois avec de leau ractive le tube contenant le concentr (ou sous-chantillon), de sorte que
le volume final dans le tube de Leighton soit de 12 ml.
11.5 Ajouter chaque tube de Leighton (contenant lchantillon
et les tampons), 100 ml de DynabeadsCrypto-Combo
et 100ml de DynabeadsGiardia-Combo, homogniss lavance dans le vortex pendant 10 secondes.
Mettre les tubes dans lagitateur rotatoire pendant au
moins 1 heure, 18rpm.
11.6 Transfrer le tube de Leighton dans le concentrateur
magntique de particules (MPC1 ou MPC6), homogniser, manuellement et avec soin, dans un angle de
90o approximativement pendant 2 minutes.
11.7 Eliminer ce qui surnage sans retirer le tube du concentrateur magntique de particules et sans remuer la matire.
11.8 Si lchantillon est flou, liminer ce qui surnage, suspendre le sdiment dans 10 ml de PBS et rpter la procdure dans le concentrateur magntique de particules.
136

Fondation Nationale de la Sant

11.9 Enlever le concentrateur magntique de particules et


suspendre lchantillon dans 500L (0,50ml) de tampon
SL-A 1X en utilisant une pipette Pasteur et transfrer
dans un tube eppendorf. Ajouter nouveau 500L
de tampon SL-A 1X au tube de Leighton, bien laver et
transfrer dans le tube eppendorf. Mettre ce dernier dans
le concentrateur magntique MPC-M ou MPC-S, et
homogniser manuellement dans un angle de 180oC
pendant 1 minute.
11.10 Pour transfrer, quantitativement, tout le volume, attendre environ une minute aprs le second transfert et
recueillir tout le volume rsiduel qui se serait coul
vers la partie infrieure du tube.
11.11 Eliminer ce qui surnage sans retirer le concentrateur
magntique.
11.12 Dissociation du complexe beads/(oo)cyste.
11.13 Enlever le concentrateur magntique.
11.14 Ajouter 50L de solution de HCl 0,1N puis agiter dans
le vortex grande vitesse pendant environ 50 secondes.
11.15 Mettre le tube dans le concentrateur magntique
(MPC-M ou MPC-S) sans la bande magntique
cet endroit et laisser reposer dans une position verticale
pendant tau moins 10 minutes temprature ambiante.
11.16 Agiter dans le Vortex pendant environ 30 secondes.
11.17 Sassurer que tout lchantillon soit la base du tube.
Placer le tube de la micro-centrifugeuse (eppendorf)
dans le concentrateur magntique (MPC-M ou
MPC-S).
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

137

11.18 Placer la bande magntique dans le concentrateur


magntique (MPC-M ou MPC-S) et laisser reposer
pendant minimum 10 secondes.
11.19 Prparer une lame, lidentifier et ajouter 5 L de NaOH
1,0 N dans le puits de contrle de la lame.
11.20 La procdure comprend deux dissociations acides,
toutefois on peut opter pour le montage de deux lames,
chacune delle avec le volume de chaque dissociation,
ou pour une lame unique. Si on opte pour le montage
dune lame unique, additionner 10 L de NaOH 1,0
N au puits de contrle de la lame. Le volume du concentr ajout la lame doit tre mesur.
11.21 Le volume obtenu de la dissociation peut tre conserv
dans un autre eppendorf contenant 10 L de NaOH
1,0 N. Ainsi, on peut raliser une lecture dun aliquote
plus petit du concentr, cependant on doit enregistrer
le volume concentr et le volume de laliquote.
11.22 Sans enlever leppendorf du concentrateur magntique
(MPC-M ou MPC-S), transfrer tout lchantillon
dans le puits de contrle de la lame avec le NaOH.
Eviter de toucher les particules coinces sur les parois
du tube. Sassurer que tout le fluide soit transfr.
11.23 Enlever leppendorf du concentrateur magntique et
rpter la procdure de lavage avec lacide.
11.24 Le volume de la seconde dissociation acide peut tre
ajoute la lame contenant le volume de la premire
dissociation ou peut tre mis sur une deuxime lame.
Remarque: les puits de contrles de la lame peuvent tre petits
pour accueillir les volumes des deux dissociations.
138

Fondation Nationale de la Sant

Remarque 2: les tapes de llution, de concentration et de purification (sparation immunomagntique) doivent


tre conclues le mme jour.

12. Coloration
12.1 Laisser les lames scher temprature ambiante pendant la nuit (ou jusqu ce que la lame soit compltement sche). Suivre les instructions du fabricant afin
deffectuer la coloration immuno-fluorescente.
Remarque: la coloration doit tre commence dans les 72h suivant la prparation de la lame.

12.2 P lacer la lame dans une chambre humide, dans


lobscurit et temprature ambiante pendant environ
30 minutes. (la chambre humide consiste en un rcipient
de plastique contenant des serviettes en papier humides
sur lesquelles les lames sont poses).
12.3 Laver les puits de contrle en ajoutant du PBS en quantit suffisante (environ 100L). Aspirer le liquide avec
soin sans toucher lendroit contenant la matire.
12.4 Ajouter 50L de DAPI et laisser reposer pendant 5
minutes dans la chambre humide (la chambre humide
consiste en un rcipient de plastique contenant des
serviettes en papier humides sur lesquelles les lames
sont poses).
12.5 Laver les puits de contrle en ajoutant du PBS en quantit suffisante (environ 100L). Aspirer le liquide avec
soin, sans toucher lendroit contenant la matire.
12.6 Mettre une goutte du milieu de montage DABCO/
glycrole et couvrir avec une lamelle couvre-objet, en
vitant la formation de bulles entre la lame et la lamelle
couvre-objet.
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

139

12.7 Seller les bords de la lamelle couvre-objet prcautionneusement avec du vernis transparente.
12.8 Prparer des lames de contrle positif ou ngatif, en
suivant les spcifications du fabricant.
Remarque: 
lexamen microscopique doit tre commenc tout
de suite aprs la fin de la coloration, mais si les colorants ne perdent pas leur fluorescence, il peut tre
ralis dans un dlai de 168h (7 jours) si les lames sont
conserves labri de la lumire.

13. Lecture microscopique


13.1 Examiner chaque puits de contrle de faon systmatique, en tablissent un standard de lecture, du haut vers
le bas ou dun ct vers lautre, garantissant que toute
la surface soit value.
13.2 Examiner en utilisant limmuno-fluorescence (FA),
DAPI et la microscopie de Contraste par Interfrence
Diffrentielle (DIC).

14. Contrle positif et ngatif


14.1 Commencer lexamen par le contrle positif et ngatif, identifiant dans le contrle positif au moins trois
oocystes de Cryptosporidium et trois cystes de Giardia.
Examiner le contrle ngatif, confirmant labsence de
cystes et doocystes.
14.2 Enregistrer les rsultats e commencer la lecture des
chantillons seulement si les contrles positif et ngatif
prsentent des rsultats satisfaisants.
14.3 Oocystes de cryptosporidium

140

Fondation Nationale de la Sant

14.3.1 Examiner en FITC avec un agrandissement de 200X.


Ce sont des oocystes caractristiques si ce sont des
formes fluorescentes ovodes ou sphriques de 4 6
m de diamtre;
14.3.2 En visualisant les oocystes, agrandir 400X et changer
le microscope pour un filtre bloquant les UV pour
DAPI. Les oocystes caractristiques prsentent une
coloration interne bleue brillante ou ont jusqu 4
noyaux de coloration bleu ciel;
14.3.3 Ensuite, examiner en contraste interfrentiel diffrentiel et observer la prsence de caractristiques morphologiques internes et externes typique doocystes
de cryptosporidium, en agrandissant de 1000x.
14.3.4 Un rsultat positif doocyste cryptosporidium prsente
une fluorescence, une taille et des formes typiques et
positives pour une Fluorescence-FITC, DAPI et DIC.
14.4 C
 ystes de Giardia
14.4.1 Examiner en FITC avec un agrandissement de 200X.
Ce sont des cystes caractristiques sils ont des formes
fluorescentes ovodes ou sphriques de 8 18 m de
diamtre et 5 15 m de largeur;
14.4.2 En regardant les cystes, agrandir 400X et changer le
microscope pour un filtre bloquant les UV pour DAPI.
Les cystes caractristiques prsentent une coloration
interne bleu brillante ou ont de deux quatre noyaux
de coloration bleu ciel;
14.4.3 Ensuite, examiner en contraste interfrentiel diffrentiel et observer les caractristiques morphologiques
internes et externes typiques des cystes de Giardia.
Manuel Pratique dAnalyse de lEau

141

14.4.4 Un rsultat positif pour le cyste de Giardia donne une


fluorescence typique, une taille et une forme typique
et ne prsente pas de caractristiques atypiques dans
les FA, DAPI ou DIC.
14.5 Calcul des rsultats
Si tout le volume concentr (rsultat de la dissociation acide)
tait examin au microscope
Nombre d(oo)cystes. L-1=

Nombre d(oo)cystes identifis


Volume dchantillon prlev

Si on effectue une lecture au microscope dun aliquote du


volume concentr obtenu la fin de la dissociation acide.
N de (oo) cystos identifis x
-1
N de (oo) cystes. L =

142

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Volume do concentr (uL)


Aliquote de concentr analys (uL)

volume dchantillon collect

Bibliographie

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Elaboration

Elaboration
Elaboration
Marinaldo da Silva Valente/Suest/AM/Funasa
Collaborateurs de Funasa
Osman de Oliveira Lira/Suest/PE/Funasa
Nilce Bazzoli/Suest/MG/Funasa
Jlio Csar Reis da Silva/Suest/MA/Funasa
Raimundo Rodrigues dos Santos Filho/Suest/MA/Funasa
Miguel Crisstomo Leite Brito/Densp/Funasa
Coordination
Maria Fernanda Bittencourt/Densp/Funasa
Rvision Technique
Felizana M.M. da S. Palhano
Girlene Rodrigues Leite
Vilma Ramos Feitosa/Densp/Funasa
Marinaldo da Silva Valente/Suest-Am/Funasa
Rvision de la 3me dition
Ana Maria Moreira Dias Cocag/Desam/Funasa
Aristeu de Oliveira Junior Cocag/Desam/Funasa
Antonio Carlo B. Brando Cocag/Desam/Funasa
Demtrius Brito Viana Consultant OPS/Funasa
Osman de Oliveira Lira URCQA/Sesam/Suest-PE/Funasa
Rvision orthographique et grammaticale de la 3me dition
Leila Santos Coesc/Gab/Prsi/Funasa/MS
Examen 4me dition et mise jour
Ana Maria Moreira Dias Cocag/Desam/Funasa
Aristeu de Oliveira Junior Cocag/Desam/Funasa

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Antonio Carlo B. Brando Cocag/Desam/Funasa


Demtrius Brito Viana Consultant OPS/Funasa
Osman de Oliveira Lira URCQA/Sesam/Suest-PE/Funasa
Illustration
Leonardo Ribeiro da Silva Terra/Coesc/Gab/Prsi/Funasa
Conception graphique et couverture
Glacia Elizabeth de Oliveira Diedi/Coesc/Gab/Funasa
Diagramming
Eduardo dos Santos Diedi/Coesc/Gab/Funasa
Rvision orthographique et grammaticale de la 1re et 2me
dition
Olinda Myrtes Bayma S. Melo Coesc/Gab/Prsi/Funasa/
MS
Rvision bibliographique
Raquel Machado Santos /Coesc/Gab/Prsi/Funasa
Solange de Oliveira Jacinto /Coesc/Gab/Prsi/Funasa

La publication de ce manuel a t finance par les termes de la


coopration N 38 signe entre la FUNASA et la OPAS/OMS.

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