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Mémoire de MAGISTER
en Biotechnologie
Présenté par
Bounoua Mohammed Djellel
Intitulé
Devant le Jury :
Président :
Pr. FORTAS Zohra Université d’ORAN
Examinateurs :
Pr. ZADI-KARAM Halima Université d’ORAN
Pr. KARAM Nourredine Université d’ORAN
Dr. BELABID Lakhdar C.U de MASCARA
Rapporteur :
Dr. BELLAHCENE Miloud Université de MOSTAGANEM
Avant - propos
Avant tout, je remercie Dieu tout puissant qui m’a donné la force, la foi, et de m’avoir
permis d’arriver à ce stade.
Ce travail a été effectué au Laboratoire de Biologie des Micro-organismes et de
Biotechnologie (LBMB) de l’Université d’Oran Es-sénia.
J’exprime ma profonde reconnaissance à Pr. Fortas pour m’avoir accueilli dans son
laboratoire et d’avoir accepté de présider le jury de mon mémoire.
Que Mr Bellahcene veuille bien trouver ici l’expression de mes sincères
remerciements pour la bienveillance qu’il n’a cessé de témoigner à mon égard.
Je remercie chaleureusement Mme Karam, Mr. Karam ainsi que Belabid d’avoir
aimablement accepté de siéger dans le jury de ce mémoire.
Mes sincères remerciements vont également à l’ensemble du personnel du laboratoire pour
l’atmosphère amicale et enthousiaste dont ils m’ont entouré et plus particulièrement à Mme
Chahrazed, Dahbia, Mounia, Amel, Merouane, et Mme Dib-Bellahouel.
Dédicace
Djellel
Sommaire
Introduction générale………………………………………………………………………...1
Conclusion et perspectives…………………………………………………………………..61
Liste des figures
Page
Figure 10. Aspect macroscopique de Pseudomonas PM1 sur milieu King B……………….44
Figure 15. Fusarium oxysporum sur milieu de culture après 5 jours d’incubation
(témoin)……………………………………………………………………………………….47
Figure 16. Confrontation directe en boite de Petri entre les souches bactériennes (BA10,
BM1, BT6, PM1) et Fusarium oxysporum après 5 jours d’incubation……………………….47
Figure 17. Diagramme représentant les pourcentages moyens d’inhibition de la croissance
de Verticillium dahliae en confrontation directe avec les antagonistes………………………48
Figure 18. Verticillium dahliae sur milieu de culture PDA après 10 jours d’incubation
(témoin)……………………………………………………………………………………….49
Figure 19. Confrontation directe en boite de Petri entre les souches bactériennes (BA10, BT1,
BT9, PM1) et Verticillium dahliae après 10 jours d’incubation……………………………...49
Figure 24. Test in vivo en boîte de Petri sur des graines de tomate (St. Ruff) au jour 0…….54
Figure 25. Résultat de l’essai in vivo en boîte de Petri sur graines de tomate variété
Heinz (a : Témoin, b : graine+PM1+ F.o.l, c : graine+ F.o.l)………......................................55
Figure 26. Résultat de l’essai in vivo en boîte de Petri sur graines de tomate variété
Luxor F1 (a : Témoin, b : graine+PM1+ V.d, c : graine+ V.d)……………………………….55
Figure 27. Résultat de l’essai in vivo en boîte de Petri sur graines de tomate variété
Marmande (a : Témoin, b : graine+BM1+ F.o.l, c : graine+ F.o.l)…......................................55
Figure 28. Résultat de l’essai in vivo en serre sur plants de tomate variété Marmande
(a : Témoin, b : plante+F.o.l, c : plante+BM1+F.o.l)……………….......................................57
Figure 29. Résultat de l’essai in vivo en serre sur plants de tomate variété St. Ruff
(a : Témoin, b : plante+V.d, c : plante+BM1+V.d)…………………………………………...58
Liste des tableaux
Page
Tableau 9. Résultats des essais in vivo (in planta) entre Fusarium, Verticillium et les 2
antagonistes bactériens BM1 et PM1 sur 2 variétés de tomate……………………………….56
Liste des abréviations
B. : Bacillus
F.o.l : Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici
P.: Pseudomonas
V.d : Verticillium dahliae
[1] : http://www.alger-roi.net/Alger/cahiers_centenaire/productions/textes/p1_chapitre1a.htm
L'olivier est aussi une des plantes les plus citées dans la Bible, où la colombe lâchée
par Noé après le Déluge (Genèse 8/11) revint en tenant un rameau d’olivier dans le bec après
avoir trouvé une terre émergée.
Dans le Coran, l'olivier est un arbre béni, symbole de l'homme universel, et l'huile
d'olive est source de lumière divine pour guider les hommes (moubârakatin zaytounatin dans
le verset 35 de la 24ème sourate intitulée "La Lumière" / An-Nour) [2].
[2] : http://fr.wikipedia.org/wiki/Olivier_(arbre)
[3] : http://data.gbif.org/species/13197107/
1.3. Industrie oléicole mondiale :
La culture de l'olivier occupe en 2005 dans le monde 7,5 millions d'hectares pour une
production d’environ 14,9 millions de tonnes d'olives avec un rendement de 20 quintaux/ha
selon le FAO (2005).
Sur la période 2000/2006, la production mondiale moyenne annuelle s'élève à 2 778
800 tonnes d'huile d'olive et à 1 638 300 tonnes d'olives de table. La production mondiale
d'huile d'olives est passée de 1 453 000 tonnes en 1990 à 2 820 000 tonnes en 2006, alors que
dans le même temps la production d'olives de table passait de
950 000 tonnes à 1 832 500 tonnes (COI, 2006).
La production mondiale d’huile d’olive ne représente cependant qu'environ 3% de la
production d’huile végétale comestible du monde, et est largement dépassée par celle de
l’huile de soja (32 % de la production mondiale avec 32 Mt/an), de l’huile de palme (28 %
avec 27,2 Mt/an), de l’huile de graine de colza (13,5 % avec 13,6 Mt/an), de tournesol (8,9 %
avec 9 Mt/an), d'arachide (4,8% avec 4,8 Mt/an), et de coton (4,2% avec 4,2 Mt/an) (CIRAD,
2004) . De même, dans le commerce international, les huiles d’olive ne représentent pas plus
de 2 % du volume des huiles végétales comestibles vendues (Harwood et Aparicio, 2000) .
L'oléiculture occupe toutefois une part très importante dans l'économie agricole de
certains pays méditerranéens et la tendance de la consommation mondiale est à la hausse. Les
quatre premiers pays producteurs (Espagne, Italie, Grèce et Turquie) représentent 80 % de la
production mondiale d'olives et les dix premiers, tous situés dans la zone méditerranéenne,
95 % (FAO, 2005).
1.4. Industrie oléicole en Algérie :
L’Algérie fait partie des pays du pourtour méditerranéen dont le climat est des plus
propices à la culture de l’olivier. Les données statistiques agricoles des superficies et
productions oléicoles pour les trois années 1991, 1992 et 1993 en Algérie sont représentées
dans le tableau (1) :
Tableau 1. Données statistiques des superficies oléicoles et leurs productions en Algérie
(1991-1992-1993) (Matallah et al., 1996 ; in Matallah-Boutiba, 1998).
1991 184 520 16 222 240 141 960 16.2 735 400 83.8 106 040
1992 164 290 17 540 930 220 290 8.3 2 434 910 91.7 473 800
1993 161 330 17 627 630 206 770 10 1 853 960 90 291 870
La tomate est une plante herbacée annuelle à port rampant, aux tiges ramifiées. Il
existe trois ports : retombant, semi-retombant et horizontal. De nos jours, il est difficile de
déterminer la taille de la tomate puisqu'on utilise exclusivement des hybrides à croissance
indéterminée. Il est nécessaire de les palisser car la tige est très peu ligneuse et a une section
creuse. Pour palisser, on entoure un lien autour de la tige, lien que l'on accroche à un support
ou à une bobine reliée à la charpente de la serre (FAO, 1987 ; in Abderrezak, 2001).
Chez la tomate, le système racinaire est très puissant et ramifié sur les trente premiers
centimètres. On dit que ce système racinaire est pivotant.
La tomate est une plante de climat tempéré chaud. Sa température idéale de croissance
se situe entre 15 °C (la nuit) et 25 °C (le jour). Elle craint le gel et ne supporte pas les
températures inférieures à + 2 °C. C'est une plante héliophile, elle demande une hygrométrie
moyenne, parfois un apport de CO2 (sous serre). Sa période de végétation est assez longue : il
faut compter entre cinq et six mois entre le semis et la première récolte.
[4] : http://fr.wikipedia.org/wiki/Tomate
[5] : http://data.gbif.org/species/13192651/
Tableau 3. Production en tonnes de tomate .Chiffres 2004-2005 (FAO) [5].
[6] : http://www.algerie-dz.com/article1327.html
[7] : http://www.elwatan.com/Tipaza-Les-champs-de-tomates
4. La fusariose vasculaire de la tomate :
4.1. Historique et taxonomie :
Depuis la création du genre Fusarium par Link en 1809, et de sa délimitation actuelle
par Appel et Wollenweber en 1910, de nombreux travaux ont été consacrés à sa taxonomie
(Wollenweber et Reinking, 1935 ; Snyder et Hansen, 1940 ; Raillo, 1950 ; Gordon, 1952 ;
Messiaen et Cassini, 1968 ; Booth, 1971 ; Joffe, 1974 ; Nelson et al., 1983 ; in Belabid,
2003).
Le genre Fusarium tire son nom du latin fusus car ses spores sont en forme de fuseau.
Fusarium oxysporum (Schlecht.) emend. Snyder et Hansen, se distingue des autres espèces de
Fusarium par la production abondante de microconidies, rassemblées en fausse tête à partir de
monophialides courtes. Seule la reproduction asexuée est connue chez cette espèce, ce qui la
place dans le groupe des Deutéromycètes ainsi qu’à la sous-classe des Hyphomycètes et à la
famille des Tuberculariacées ; il fait partie de la section Elegans (Messiaen et Cassini, 1968 ;
Booth, 1971 ; Nelson et al., 1983 ; in Belabid, 2003). Le genre Fusarium est économiquement
très important car il regroupe beaucoup d'espèces phytopathogènes susceptibles d’attaquer un
grand nombre de plantes. Ainsi, plus de 120 formes spécialisées et races ont été décrites chez
F. oxysporum (Armstrong et Armstrong, 1981). De plus beaucoup d’espèces saprophytes sont
capables de se développer en tant que pathogènes secondaires sur des tissus végétaux
sénescents. Sa classification est la suivante [8]:
Règne : Fungi
Division : Ascomycota
Classe : Ascomycetes
Sous-classe : Sordariomycetes
Ordre : Hypocreales
Famille : Nectriaceae
Genre : Fusarium
espèce : oxysporum
[8] : http://data.gbif.org/species/14377524/
4.3. Biologie du champignon :
Les Fusarium sont des ascomycètes ubiquistes abondants dans les sols et souvent
phytopathogènes. Cependant, il peuvent survivre à l’état saprophytique dans les débris
végétaux, et au niveau de la rhizosphère des plantes non hôtes (Booth, 1971 ; Edel et al.,
1995). Le champignon se conserve dans le sol grâce à ses chlamydospores et au mycélium
capable de survivre sur les débris (Erskine et Bayaa, 1996).
5. La lutte génétique :
La sélection de variétés résistantes donne de bons résultats, cependant il faut entretenir
une diversité génétique de manière à ne pas faciliter les mutations adaptatives et les
expansions géographiques du champignon. Depuis quelques années, la recherche se concentre
surtout sur l’identification des gènes impliqués dans la résistance, ceux codant pour des
enzymes entrants dans la biosynthèse de composés toxiques pour le champignon, et ceux
codant pour des toxines protéiques qui inhibent directement sa croissance (Cornelissen et
Melchers 1993; Terras et al., 1998 ; Valpuesta, 2002).
6. La lutte biologique :
Cette méthode consiste à utiliser différents organismes vivants, appelés auxiliaires, ou
de leurs produits, pour prévenir ou réduire les dégâts causés par les bio-agresseurs. Il s’agit
d’utiliser la biodiversité et les ennemis naturels des espèces nuisibles (Fernandes, 2005).
De nombreuses publications ont fait écho à des essais réalisés en serre ou au champ
qui montrent l’intérêt potentiel des Pseudomonas fluorescents non pathogènes en tant
qu’agents de lutte biologique contre les pathogènes responsables de maladies de plantes
(Whipps, 2001 ;Weller et al., 2002).
[9] : http://data.gbif.org/species/13238840/
Le tableau (5) ci-dessous reprend les principaux agents phytopathogènes contre
lesquels l’utilisation des Pseudomonas fluorescents a été proposée :
Les Pseudomonas fluorescents sont largement testés grâce à leur croissance rapide et
leur capacité à coloniser la rhizosphère (Lemanceau, 1992 ; Fukui et al., 1994) .En plus de la
compétition pour les sources de carbone, l’antagonisme peut être attribué en grande partie à la
production de métabolites secondaires (antibiotiques, sidérophores, acide cyanhydrique…)
( O’Sullivan et O’Gara, 1992).
7.1.1. Les mécanismes biochimiques développés par les Pseudomonas fluorescents dans
la lutte biologique :
Différents mécanismes, agissant seuls ou en combinaison, ont été avancés pour
expliquer comment ces Pseudomonas fluorescents sont capables de réduire la gravité de ces
maladies (Fig. 3):
- la simple occupation des sites d’infection potentielle par colonisation de la rhizosphère,
empêchant ainsi la croissance des pathogènes ;
- la production de métabolites inhibiteurs de la croissance des pathogènes ;
- et la stimulation des mécanismes de résistance de l’hôte vis-à-vis des agents pathogènes.
Micro-organisme
phytopathogène
[10] : http://data.gbif.org/species/13238979/
-Bacillus thuringiensis pathogène des insectes, ses vertus entomotoxiques ont été à l'origine
d'un intérêt agricole, sylvicole et commercial dès les années 1930, mais beaucoup plus
marqué à la fin du 20ème siècle, notamment avec le développement du génie génétique et le
brevetage du vivant.
Les premières applications de Bacillus thuringiensis dans l'environnement datent de
1933. Il a été utilisé dès les années 1950 dans les forêts, les champs et les vignobles. Jusqu'au
milieu des années 1970, sa principale application était la lutte contre les lépidoptères
défoliateurs dans les forêts et certains papillons parasites des grandes cultures, de maïs
notamment. En 1976, la découverte des sérotypes israelensis (Bti) et tenebrionis a permis
l'ouverture de nouveaux marchés, grâce à une action larvicide sur les moustiques, les simulies
et les coléoptères.
Plusieurs espèces du genre Bacillus sont efficaces dans le bio contrôle de divers
champignons phytopathogènes (Williams et Asher, 1996 ; Landa et al., 1997 ; Commare et
al., 2002 ; Swain et Ray, 2006).
Les espèces de Bacillus productrices d’antibiotiques sont B. subtilis, B. polymyxa, B.
brevis, B. licheniformis, B. circulans, B. cereus. Les antibiotiques polypeptidiques produits
par Bacillus les plus utilisés dans les traitements médicaux sont la bacitracine, la gramycidine
S, les polymyxines, la tyrotricidine (Morikawa et al., 1992 ; Perez et al., 1993 ; Drablos et al.,
1999). Ils ont un large spectre d’action et sont utilisés comme agents anti-fongiques (Milner et
al., 1995).
La plupart de ces Bacillus ont été capables d’inhiber la croissance de Fusarium
oxysporum efficacement in vitro. D’autres pathogènes parmi le F. oxysporum dont F.o.
ciciris, F.o. phasioli et F.o. melonis sont inhibés par des isolats de Bacillus spp. de la
rhizosphère du pois chiche (Landa et al., 1997).
La souche Bacillus cereus UW85 a la capacité de réduire les maladies des plantes
causées par les Oomycètes (Handelsman et Stabb, 1996), grâce à la production des
antibiotiques Zwittermicine (Milner et al., 1996a) et Kanosamine (Milner et al., 1996b).
8. Modes d’action des bactéries sur les champignons pathogènes :
8.1. Modes directs :
La production de substances antibiotiques voire antifongiques par la bactérie est le
mode d’action le plus répandu et a priori le plus efficace contre les champignons pathogènes.
La molécule produite par la bactérie a un effet soit fongistatique, en ralentissant ou inhibant la
croissance du champignon, soit fongicide, en conduisant à la mort cellulaire fongique. Ces
activités ont souvent été mises en évidence in vitro dans des tests de confrontation
champignons – bactéries sur des milieux nutritifs permettant la production des composés
toxiques. Ces antibiotiques ou fongistatiques dérivent souvent du métabolisme secondaire
bactérien et appartiennent à différentes familles chimiques dont les polykétides (Sarniguet et
al., 2008). Chez les Pseudomonas sp., la pyrrolnitrine a une implication en protection des
plantes pour un spectre restreint aux oomycètes. Elle est exploitée par ailleurs comme
antifongique puissant dans les dermatoses humaines et des molécules homologues sont
utilisées comme fongicides agricoles. Parmi les antibiotiques, le 2,4 – diacétylephloroglucinol
produit par Pseudomonas sp. présente un spectre d’action assez large vis-à-vis de plusieurs
pathogènes fongiques telluriques, comme Fusarium oxysporum sur tomate, Rhizoctonia solani
sur pomme de terre, Pythium sp. sur concombre et betterave (Haas et Défago, 2005). D’autres
antibiotiques connus, comme le cyanure d’hydrogène, sont volatiles. Par ailleurs,
l’implication d’un système de sécrétion bactérien dans l’antagonisme vis-à-vis de Pythium
laisse augurer de la découverte de nouvelles molécules intervenant dans l’antagonisme
(Rezzonico et al., 2005). Mais la production de ces substances antibiotiques varie en fonction
des conditions nutritives et environnementales de la souche bactérienne. Les travaux actuels
sur les systèmes génétiques très complexes de régulations de la production de quelques uns de
ces antibiotiques ont pour but de comprendre la relation avec l’environnement, mais ils sont
cependant souvent restés centrés sur des questions de physiologie bactérienne. Les surfactants
forment une autre famille de composés toxiques. Ces lipopeptides cycliques, comme les
rhamnolipides, sont capables de faire éclater des zoospores d’oomycètes (Raaijmakers et al.,
2006).
Des enzymes comme les glucanases et chitinases produites par certaines bactéries sont
également impliquées car elles dégradent les parois des champignons. La compétition
nutritive, comme mécanisme général est aussi un mécanisme spécifique quand elle porte soit
sur une source de carbone particulière, soit sur un oligo-élément indispensable à la
physiologie du champignon. Un exemple existe autour de l’élément fer.
Les Pseudomonas, comme les champignons, sont capables de produire des
sidérophores, molécules servant à capter le fer.
Le sidérophore bactérien ou pyoverdine a une plus grande affinité pour le fer que
certains sidérophores fongiques et par conséquent sa production abondante prive le
champignon de fer. Ainsi, les chlamydospores de Fusarium oxysporum sur tomate, carencées
en fer ne germent plus et ne donnent plus la forme mycélienne infectieuse (Lemanceau et
Alabouvette, 1993).
2.1. Echantillonnage :
Les échantillons de sol ont été prélevés en 2007 dans les zones rhizosphèriques de
différentes plantes saines (olivier, tomate, fève) des régions de Mohammadia, Tlemcen et Ain
Temouchent selon la méthode de Pochon et Tardieux (1962). La couche superficielle du sol (5
cm) a été éliminée puis un échantillon de 100g est prélevé à proximité du système racinaire, et
mis dans des sacs en plastique propres. Il est directement analysé ou conservé à 4°C pendant
6 heures au maximum.
La recherche de cette enzyme est effectuée simplement par mise en contact d’une
colonie avec quelques gouttes d’ H2O2 à 10 V, un important dégagement gazeux traduit la
présence d’une catalase. Les Bacillus ainsi que les Pseudomonas sont catalase positives.
Milieu de
culture
Milieu de
culture Agent
Phytopathogène
Bactérie
ensemencée
en strie
Figure 5. Méthode de confrontation indirecte sur milieu de culture par action des substances
volatiles entre les souches bactériennes et l’agent phytopathogène.
Matériel végétal : Quatre variétés de tomates ont été utilisées : Luxor F1, Marmande, Heinz
1370 et Saint Ruff.
Les boîtes de Petri contenant les graines sont mises à incuber dans une étuve
(obscurité) à une température de 25 °C, pendant 4 jours. Au cinquième jour, elles sont
transférées à la lumière (16h photopériode) avec ajout de 2 ml d’eau distillée stérile par boîte,
afin de maintenir une humidité suffisante. Au septième jour, l’expérience est achevée
(Hultberg et al., 2000). Nous avons ensuite réalisé des observations visuelles des graines et
des plantules obtenues, puis nous avons procédé à la notation et à la mesure du poids frais des
plantules.
La sévérité des deux types de maladie a été mesurée en utilisant l’indice de maladie,
selon Rafin et Tirilly (1995), répartissant les plantules en 5 classes selon les
symptômes observés:
0 : plantule saine
1 : extrémité de la racine nécrosée
2 : secteur nécrotique au dessus du bout de la racine
3 : racine partiellement nécrotique avec diminution de la croissance des cotylédons
4 : nécrose sévère, racine <2 cm et pas de cotylédons.
0 : pas de symptômes.
1 : < 25% des feuilles avec des symptômes
2 : 26-50% des feuilles avec des symptômes
3 : 51-75% des feuilles avec des symptômes
4 : 76-100% des feuilles avec des symptômes.
Selon Villajuan-Abgona et al. (1996), le pourcentage de suppression est calculé comme suit:
% suppression = [(A-B)/ A x 100]
A : sévérité de la maladie (pathogène seul)
B : sévérité de la maladie (pathogène + antagoniste).
III. Résultats et discussion : 1. Etude des souches fongiques :
1.1. Etude macroscopique et microscopique du Verticillium dahliae :
La colonie de V. dahliae en culture sur milieu PDA a un aspect cotonneux, de couleur
plus ou moins blanchâtre passant après 5 à 6 jours de culture à une couleur noirâtre due à la
production en abondance de microsclérotes (Fig. 6a).
Les observations microscopiques ont montré la présence d’hyphes mycéliens
ramifiées. Des conidiophores portant des phialides verticillées par groupe de trois ou quatre,
les phialides à leur extrémité des conidies plus ou moins arrondies très nombreuses. On a
observé également la présence de microsclérotes (Figs. 6b, et 6c).
c a
b Figure 6. Aspect macroscopique (a) et microscopique (640x) (présence de spores, de
microsclérotes et des phialides en forme de V) (b, c) de Verticillium dahliae.
b c
Figure 7. Aspect macroscopique (a) et microscopique (640x) (Présence
a de macroconidies et
de microconidies) (b, c) de Fusarium oxysporum.
Sur les 36 souches (Tableau 7), 18 sont pré identifiées comme Pseudomonas codées P
X (X : M, A, T selon l’origine de l’échantillon), 17 correspondent au genre Bacillus codées B
X., ainsi qu’une souche inconnue nommée XT.
Total 17 18
70
% d’inhibition
60
50
40
30
20
10
0
BA10 BA21 BA22 BM1 BT1 BT4 BT6 BT9 PM1 PM2 PT3 PT6
Souches bactériennes
80
70
% d’inhibition
60
50
40
30
20
10
0
BA10 BA21 BM1 BM18 BT1 BT4 BT9 PA2 PM1 PT3 PT6 XT
Souches bactériennes
Les résultats obtenus montrent que pour les isolats les plus performants, la zone
d’inhibition est tellement grande qu’il n’y a pas eu de contact physique avec le pathogène
(Fig. 16,18) concluant que la bactérie produit des métabolites antifongiques (Montealegre et
al., 2003). La différence entre les pourcentages d’inhibition de nos souches suggère que le
mode d’action et/ou le type de métabolite produit par les isolats peut varier, mais aussi que les
bactéries sont taxonomiquement différentes (Williams et Asher, 1996).
Les métabolites sécrétés par la bactérie peuvent agir sur le champignon
phytopathogène comme fongistatique, inhibiteur de la germination, fongicide ou en lysant le
mycélium (Gloud, 1990). Selon Vining (1990), la production de ces métabolites secondaires
s’effectue durant la phase stationnaire de la bactérie. Alippi et Monaco (1994) ont démontré
que plusieurs souches de Bacillus pouvaient produire des métabolites antifongiques tels que
subtiline, bacitracine, bacilline et bacillomycine qui appartiennent à la famille des iturines.
Témoin
Figure 18. Verticillium dahliae sur milieu de culture
PDA après 10 jours d’incubation (témoin).
BT1 PM1
Figure 19. Confrontation directe enBT9
boîte de Petri entre les souches bactériennesBA10
(BA10, BT1,
BT9, PM1) et Verticillium dahliae après 10 jours d’incubation.
De plus, comme le milieu PDA (et GN) utilisé dans l’expérience de confrontation
directe est riche en nutriments, la compétition peut être exclue comme le mode d’action de ces
isolats (Landa et al., 1997).
35
% d’inhibition
30
25
20
15
10
5
0
BA10 BM1 BT4 PT6 Souches
bactériennes
Plusieurs travaux ont démontré que les souches bactériennes non antagonistes sur
boîte (in vitro) sont généralement inactives aussi in vivo (Broadbent et al., 1971). Il est donc
préférable de passer par des tests in vitro, et cela malgré les limites de ces derniers, pour le
contrôle in planta (Inam-ul-Haq et al., 2003). Sur la base de cette hypothèse et suite à nos
différents résultats, nous avons choisi de tester pour la suite de notre travail deux souches
bactériennes se caractérisant par un meilleur phénomène d’antagonisme in vitro. A ce sujet,
nous avons sélectionné une souche de Bacillus (BM1), et une souche de Pseudomonas (PM1).
Avant d’aborder le phénomène d’antagonisme in vivo, une étude de caractérisation de
la souche PM1 fut réalisée grâce à l’utilisation de galeries API 20 NE. Cette étude a permis
d’identifier cette souche comme étant Pseudomonas fluorescens (Fig. 23).
Figure 23. Caractérisation de la souche Pseudomonas PM1 à l’aide d’une galerie API 20 NE.
5. Résultats des essais in vivo :
5.1. Résultats de l’essai sur graines en boîtes de Petri :
Les résultats des confrontations in vivo en boîtes de Petri sont regroupés dans le
tableau (8) ci-dessous :
Tableau 8. Confrontation in vivo (sur graines en boîte) entre Fusarium, Verticillium
et 2 antagonistes bactériens BM1 et PM1 sur 4 variétés de tomate.
Var. : Variété de tomate, P.F : poids frais (g), I.M : indice de maladie,
Figure 24. Test in vivo en boîtes de Petri sur des graines de tomate (St. Ruff) au jour 0.
Figure 25. Résultat de l’essai in vivo en boîtes de Petri sur graines de tomate variété
Heinz au 7ème jour (a : Témoin, b : graine+PM1+ F.o.l, c : graine+ F.o.l).
Figure 26. Résultat de l’essai in vivo en boîtes de Petri sur graines de tomate variété
Luxor F1 au 7ème jour (a : Témoin, b : graine+PM1+ V.d, c : graine+ V.d).
Figure 27. Résultat de l’essai in vivo en boîtes de Petri sur graines de tomate variété
Marmande au 7ème jour (a : Témoin, b : graine+BM1+ F.o.l, c : graine+ F.o.l).
a b c
Tous les traitements des graines de tomate avec les antagonistes sélectionnés tendent à
diminuer le pouvoir pathogène des champignons. Les souches de Bacillus BM1 et
Pseudomonas PM1 stimulent légèrement la croissance des graines de tomate variété Heinz
(résistante à la fusariose), et pourrait s’expliquer par la sécrétion de métabolites
phytohormonales (Killian et al., 2000). Selon Tang (1994), un certain nombre de Bacillus ont
la capacité de produire des phytohormones : zéatine, acide gibbérellique et acide abscisique.
Woritka et al. (2004) ont démontré aussi que B. subtilis est capable de promouvoir la
croissance de la plante ainsi que d’augmenter la viabilité des graines de tomate.
L’ajout d’une suspension bactérienne à des graines de tomate a réduit de façon
significative la colonisation fongique de ces dernières, on peut supposer que cette action
résulte de la compétition pour les nutriments. Ce résultat montre l’intérêt et l’importance de la
présence de ces rhizobactéries dans la lutte biologique.
Cette infection est hautement artificielle, et comparée à une infection naturelle
l’inoculum fongique est présent à une haute concentration. Cependant, il est impossible d’en
conclure la quantité de bactéries nécessaires pour la suppression d’une infection sous des
conditions naturelles.
Les résultats du degré de protection des souches antagonistes effectués en serre sont
représentés dans le tableau (9) :
Tableau 9. Résultats des essais in vivo (in planta) entre Fusarium, Verticillium
et les 2 antagonistes bactériens BM1 et PM1 sur 2 variétés de tomate.
Var. : Variété de tomate, C.S : Clé de sévérité, % A: pourcentage moyen d’atteinte des
feuilles/plante, % S : pourcentage moyen de suppression de la maladie chez la plante.
-Essai sur la variété Marmande :
Les résultats présentés dans le tableau (9) montrent que le pourcentage moyen
d’atteinte des feuilles par plantes de tomate inoculées seulement avec le parasite est de 43.5%
pour le Fusarium oxysporum, et de 51.51% avec le Verticillium dahliae, avec une clé de
sévérité de 2.12 et 2.5 respectivement. Les plantules ayant reçu un inoculum bactérien dans le
terreau en plus de la suspension sporale du Fusarium oxysporum ont montré une suppression
de la maladie d’environ 19.77% avec la souche BM1 (Fig. 28), et 20% en présence de la
souche PM1. Cependant, les pourcentages de suppression de la maladie causée par
Vertcillium sur les plantules de tomate avoisinent les 28.17% et 37.87% pour BM1 et PM1
respectivement.
Figure 28. Résultat de l’essai in vivo en serre sur plants de tomate variété Marmande
(a : Témoin, b : plante+F.o.l, c : plante+BM1+F.o.l).
Figure 29. Résultat de l’essai in vivo en serre sur plants de tomate variété St. Ruff
(a : Témoin, b : plante+V.d, c : plante+BM1+V.d).
D’après ces résultats, on remarque que les mêmes souches bactériennes BM1 et PM1,
actives sur le Fusarium oxysporum testées sur la variété Marmande, sont moins performantes
sur la variété St. Ruff.
a b c
Les résultats sont encourageant vis-à-vis du Verticillium dahliae, où la souche BM1
avec 42.5% de suppression de la maladie chez la variété St. Ruff et 28.17% chez la Marmande
est assez performante. Un des mécanismes par lequel les Bacillus exercent un effet
antifongique est le parasitisme par dégradation des membranes des phytopathogènes,. B.
licheniformis (Trachuk et al., 1996) et B. circulans (Watanabe et al., 1990) produisent
l’enzyme chitinase qui dégrade la chitine. Grâce à cette habilité à dégrader la chitine,
composant majeur dans la structure des membranes cellulaires des phytopathogènes (Someya
et al., 2004), ces enzymes chitinolytiques sont considérées importantes dans le contrôle
biologique des pathogènes du sol (Singh et al., 1999).
On peut supposer que la souche Pseudomonas PM1 avec environ 37.87% et 22.27%
de suppression de la maladie causée par Verticillium dahliae chez Marmande et St. Ruff
respectivement peut représenter un bon antagoniste. Vandenbergh et al. (1983) et
Ramamoorthy et al. (2002) ont établi que P. fluorescens stimulait les mécanismes de défense
des plantes en améliorant leur résistance à différents phytopathogènes.
Ces bactéries rhizosphèriques bénéfiques à la croissance de la plante, sont nommées
plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) (Kloepper et Schroth, 1978). La promotion
indirecte de la croissance de la plante se produit lorsque le PGPR atténue ou prévient les
effets néfastes des phytopathogènes par divers mécanismes telle que l’antibiose (Ashgar et al.,
2004). Elizabeth et Handelsman (1999) évoquent l’effet de Bacillus cereus sur les
rhizobactéries comme stimulant la croissance de certaines bactéries, qui augmentent la
croissance des racines, atténuent le pathogène ou induisent une résistance chez l’hôte.
Malgré les bons résultats obtenus par BM1 et PM1, une certaine différence existe entre
les résultats in vitro et in vivo. Ces résultats rejoignent ceux de Burr et al. (1978) qui ont
observé que l’effet antagoniste exprimé in vitro n’est pas toujours retranscrit dans le sol. La
diminution de l’effet antagoniste par rapport aux confrontations directes, pourrait s’expliquer
par la concentration des nutriments dans la rhizosphère qui diffère de celle du milieu de
culture, affectant ainsi la production de métabolites secondaires nécessitant un certain nombre
de carbone (Elad et Baker, 1985). On pourrait expliquer aussi la diminution de l’antagonisme
de Pseudomonas PM1 par le fait que les sidérophores ne sont pas produits en présence de fer
(Meyer et Abdallah, 1978), et donc la perte partielle du potentiel antagoniste peut être due à
l’absence de sidérophores dans un environnement riche en fer (sol).
La fluctuation du niveau des sources de carbone dans la rhizosphère pourrait être une
des raisons de la variation des résultats in vitro et in vivo concernant les mêmes isolats
bactériens, puisque dans la rhizosphère les nutriments deviennent disponibles de façon
aléatoire (Lynch, 1990). Ces bactéries en carence pour des périodes plus ou moins longues
pourraient donc ne pas produire les substances antifongiques qui ont été observées sur les
milieux de culture (riches en nutriments). James et Gutterson (1986) ont remarqué aussi que la
production des antibiotiques n’est pas influencée que par la quantité mais aussi par la qualité
de la source de carbone.
Les essais de lutte biologique à l’aide de ces souches bactériennes ont montré qu’il
était possible de limiter l’incidence du F. oxysporum et du V. dahliae, bien que le niveau de
protection ne soit pas assez important. Néanmoins, l’utilisation de ce traitement biologique
permet de maintenir la maladie à un seuil acceptable, d’autant plus que les mesures
prophylactiques préconisées seront effectivement mises en pratique.
D’autres travaux ont permis de démontrer l’importance de l’action inhibitrice exercée
par des souches de Pseudomonas spp. sur le F. oxysporum ciceri, agent de la fusariose du pois
chiche (Inam-ul-Haq et al., 2003).
Uppal et al. (2008) ont noté une réduction significative de l’incidence de la
verticilliose sur la culture de la pomme de terre par des souches de Pseudomonas spp.
D’autre part, Ahmed Idriss et al., (2007) et Zhang et al., (2008) ont signalés que des enzymes
du genre Bacillus spp. auraient un rôle dans la lyse hyphale de certains champignons
phytopathogènes tels que Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Pythium ultimum et
Alternaria solani.
Dans la majorité des travaux relatifs à l’utilisation des Pseudomonas spp. et Bacillus
spp., la présélection des souches repose, en grande partie sur l’activité de l’antagonisme in
vitro. Cependant, la corrélation entre les potentialités exhibées in vitro et les niveaux des
actions de biocontrôle ou de biostimulation de la croissance végétale, n’est pas toujours
évidente (Toua, 1996 ; Benchaabane et al., 2000). Cette différence de comportement
antagoniste des souches bactériennes in vitro et invivo a été également signalée par Mercado-
Blanco et al. (2004), qui ont montré l’absence de corrélation entre le traitement des plantes
d’oliviers infectés par V. dahliae et les essais in vitro en présence de Pseudomonas spp.
L’antibiose in vitro pour la présélection, impose des restrictions devant la découverte
et la mise en évidence d’autres mécanismes d’actions. Il est très utile d’utiliser des méthodes
relatives aux aptitudes des souches, qui sont plus stables et qui se rapprochent le mieux
possible des conditions d’utilisation in situ (Défago et al., 1990 ; Delorme, 2001 ; Latour et
al., 2003).
Conclusion et perspectives
Nous avons débuté ce travail en isolant des bactéries à partir de 3 échantillons de sol
rhizosphérique provenant du nord-ouest de l’Algérie. Ceci nous a permis d’isoler et de pré-
identifier 36 souches, dont 18 souches correspondent au genre Pseudomonas, 17 à celui des
Bacillus et une souche de genre inconnu.
Les 36 souches ont été testées par les méthodes de confrontation sur boîtes de Petri (in
vitro), il en est ressorti que la méthode la plus efficace sur la croissance mycélienne des
parasites était la méthode directe sur boîte comparée à celle par action des substances volatiles
et à celle par action des filtrats de culture. Nous avions choisi à la lumière de ces résultats 2
meilleurs antagonistes : Bacillus BM1 et Pseudomonas PM1, pour les essais sur plants de
tomate (in vivo).
L’ajout d’une suspension bactérienne à des graines de tomate (4 variétés) a réduit de
façon significative la colonisation fongique de ces dernières avec même un certain effet
bénéfique sur la croissance de la graine Heinz pré-inoculée par les souches BM1 et PM1.
Les résultats des essais en serre sur plants de tomate ont montré des résultats
encourageants de suppression des maladies variant de 19 à 42 %, mais aussi que certaines
souches bactériennes étaient efficaces sur les champignons chez une variété de tomate mais
pas dans l’autre supposant une différence possible dans les exsudats racinaires chez ces 2
variétés.
Les essais de lutte biologique à l’aide de ces souches bactériennes ont montré qu’il
était possible de limiter l’incidence du F. oxysporum et du V. dahliae, bien que le niveau de
protection ne soit pas assez important. Néanmoins, l’utilisation de ce traitement biologique
permet de maintenir la maladie à un seuil acceptable, d’autant plus que les mesures
prophylactiques préconisées seront effectivement mises en pratique.
Les mécanismes qui régissent les interactions plante-bactérie-champignon sont
complexes. Il est primordial de ne pas considérer la maladie seulement comme une relation
entre la plante hôte et le parasite, mais de tenir compte aussi des organismes non pathogènes,
du phylloplan et /ou de la rhizosphère. L’équilibre entre ces trois éléments est fragile, il
dépend grandement des conditions extérieures, tels que le climat et la nature du sol (Bora et
Ozaktan, 1998).
Les essais effectués in vitro et in vivo nous ont permis de mettre en évidence des effets
antagonistes de quelques souches bactériennes. Ces effets antagonistes non négligeables
pourraient s’ajouter aux autres méthodes de lutte, chimique ou génétique. Selon Henni (1987)
et Omar et al. (2006), il serait intéressant de combiner la lutte biologique avec la lutte
chimique à moindres doses. Les tests que nous avons développés peuvent servir de base à la
mise en évidence de propriétés antibiotiques des Bacillus et des Pseudomonas. La mise au
point d’autres tests permettra de révéler d’autres aspects de l’activité antagoniste des souches
bactériennes et de rechercher des espèces plus efficaces afin de les utiliser dans la lutte contre
les maladies d’origine tellurique.
Enfin, bien qu’il s’agisse d’un domaine de recherche assez récent par rapport à la lutte
chimique, nous pensons que des possibilités de lutte biologique s’étendront aux différents
types de cultures et espèces végétales. D’ailleurs, plusieurs auteurs (Akkopru et Demir, 2005 ;
He et al., 2006), estiment qu’elle sera appelée dans un temps proche à jouer le rôle d’un
fongicide, puisque dans plusieurs cas, le contrôle de leur application devient souvent difficile,
parfois impraticable (Sedra et Maslouhy, 1995 ; Snissi et al., 2006).
S’il est bien vrai que la sélection des agents antagonistes est une des principales voies
à nous fournir des agents biologistes efficaces, il est certain aussi qu’elle sera la seule à nous
fournir des agents antagonistes et hautement compétiteurs. Les résultats des essais que nous
avons réalisés confirment la nécessité de continuer à effectuer des tests de pouvoir
antagonistes et de sélection d’agents de bio-contrôle au laboratoire, puis à petite échelle les
compléter par d’autres méthodes plus perfectionnées. Ainsi, une collection d’agents plus ou
moins antagonistes serait sélectionnée tout en étant d’origines différentes, adaptées au milieu,
pour obtenir à la fin une banque d’agents performants, susceptibles d’être incorporés dans les
travaux de lutte biologique.
Pour lutter contre les bio-agresseurs, il faut introduire le bon auxiliaire, au bon
moment et à la bonne dose. Cependant, un bon antagoniste défini dans des conditions
expérimentales doit posséder certaines propriétés pour être utiliser dans la lutte biologique à
grande échelle :
- aptitude à la colonisation de la rhizosphère et à la conservation.
- propriétés technologiques, telle que la multiplication facile de l’antagoniste.
- propriété toxicologique : indemne de pathogénéité pour l’homme, les animaux et les
végétaux traités et ne présentant pas de risque lors de sa préparation.
- et une propriété agronomique, l’utilisation de l’antagoniste doit pouvoir s’inscrire
dans un itinéraire technique aboutissant à la meilleure stratégie visant à associer la lutte
biologique à une lutte chimique ou à une amélioration des plantes (Fernandes, 2005).
En ce qui concerne notre travail, il reste à identifier certaines de nos souches
bactériennes, ainsi que la nature chimique des substances antibiotiques mises en jeu dans le
phénomène d’antibiose vis-à-vis du parasite. La mise en évidence et l’identification de tels
composés in vitro sont relativement simples, mais sont par contre compliquées in situ en
raison de leur faible concentration (Dommergues et Mangenot, 1970 ; Mangenot et Diem,
1979).
Il est à noter qu’une étude sur une caractérisation préliminaire des substances actives
secrétées par les 2 antagonistes (BM1 et PM1) a été entamée, mais malheureusement, cette
étude n’a pas été poursuivie faute de temps et de non disponibilité de matériel spécifique à ce
genre d’étude.
Nous suggérons que ce travail soit repris sur un nombre de souches plus important,
tout en diversifiant les origines géographiques. Il serait également très intéressant de
poursuivre ce travail de screening de souches bactériennes, afin de réduire l’incidence de la
fusariose et de la verticilliose.
Ce travail a fait l’objet d’une présentation scientifique lors du séminaire national sur
Agriculture, Environnement et Santé en avril 2008 à Khemis Miliana.
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Annexe 1
- la dissolution des ingrédients s’effectue dans de l’eau distillée (volume déterminé) dans un
bécher.
- le milieu est stérilisé à l’autoclave pendant 20 minutes, à une température d’environ 120 °C
et correspondant à une pression de 1 bar.
- il est ensuite placé à température ambiante afin de le refroidir pour le manipuler plus
facilement et surtout afin d’éviter la condensation sur les couvercles des boîtes de Petri.
La cellule de Malassez
Le terreau
Abstract:
The fungi cause many diseases of plants, whose seriousness can be attenuated by the
non-pathogenic associated bacteria. A total of 36 strains (18 Pseudomonas, 17 Bacillus and 1
of unknown genus) were isolated and pre-identified from different rhizosperhic soils of the
Algerian western north (Mohammadia, Tlemcen and Ain Temouchent).
Various methods of confrontation with plant pathogenic fungi (Fusarium oxysporum
f.sp. lycopersici and Verticillium dahliae) were used, among in vitro methods the method by
direct confrontation on Petri dishes gave the best results and especially with the strains BM1,
BA10 and PM1.
The tomato seeds bacterisation as well as the pre-inoculation of tomato seedlings by
bacterial strains BM1 and PM1 before adding the fungi, have mostly shown a decrease in the
severity of these diseases.
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18 )Pseudomonas 17 ، Bacillus فn واﻝsnt ﻝp ،(وفl yl 1 و
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