DERRADJI COSTEA Maria

UE 7 Obtention et contrôle des principes actifs

EC 7.1 Chimie analytique
Mme Poirier
11/01/2022 - 11H10-12H10

Chapitre 2: Paramètres chromatographiques

Dans ce cours on verra l’ensemble des paramètres utiles pour savoir lire un chromatogramme et pour l’exploiter dans
un objectif qualitatif, quantitatif et d’optimisation de développement analytique.
Ça ne concerne pas vraiment les officinaux (pas besoin de faire de développement analytique ou de comparaison de
chromatographies) mais il faut savoir lire un chromatogramme car on peut nous en présenter à l'officine (bulletins de
conformité de matières premières).
Pour ceux qui veulent s'orienter vers la recherche, il est nécessaire de connaître ces paramètres chromatographiques,
et les bases en sont données cette année.
Le chapitre est assez important, il y a beaucoup de formules, elles ne sont pas à apprendre par cœur, un formulaire
avec les formules nous sera donné à l'examen et en TP.

A- Chromatogramme

On revient sur ce qu’on a vu hier:

On a vu qu’un système
chromatographique sur lequel on mettait
en sortie de colonne un détecteur permet
d'obtenir un chromatogramme.
Chromatogramme= signal du détecteur
en fonction du temps.

Sur ce chromatogramme on peut identifier

plusieurs paramètres utiles pour
caractériser les pics chromatographiques
et caractériser les molécules:
En ordonnée il y a le signal du détecteur
(ici en volt) et en abscisse le temps (sinon
parfois en abscisse c'est le volume de
phase mobile, mais c'est rare).

On trouve un pic chromatographique à

chaque sortie de molécule. Ici on est dans
le cas de séparation de parabens (des
conservateurs) et on les sépare en fonction des groupements alkyles qu'ils portent.
Le pic est nommé “pic d'élution”. Entre chaque pic on va trouver un signal qui est le signal du détecteur en absence
de composé élué, ça correspond à la ligne de base.

1
B-Description d’un chromatogramme

Chaque pic chromatographique est

assimilé à une courbe de Gauss qui
représente une distribution symétrique
du signal du détecteur en fonction du
nombre de molécules éluées, et qui va
se répartir de manière égale autour
d'une valeur moyenne.
Sur cette courbe de Gauss on va
pouvoir identifier différents
paramètres qui vont nous permettre
de caractériser le pic:

Le premier paramètre est la

distribution autour de la moyenne qui
est représentée par l'écart-type,
nommé ici σ (sigma).
La valeur 2σ représente la largeur du
pic à 60,7% de hauteur.

Pour plus de commodité on a

développé deux autres paramètres de largeur :
- δ (delta) est la largeur à 50% de hauteur.
- ω (oméga) est la largeur à la base.
Il y a des relations entre oméga et sigma, ainsi qu’entre delta et sigma, ils sont proportionnels les uns aux autres.
La différence entre tous ces paramètres est la hauteur à laquelle ils sont déterminés mais ils caractérisent tous la
largeur du pic.
On verra dans le cours qu’on va les utiliser ces paramètres de largeur car plus le pic sera large, plus ça aura des
conséquences sur la séparation, on pourra utiliser soit sigma, soit delta, soit oméga.
Le plus souvent c'est le paramètre delta qui est utilisé, il est aussi nommé "oméga 0.5" dans la pharmacopée.

En plus de la largeur on va caractériser la hauteur :

Le paramètre de hauteur représente la distance entre la ligne de base et l'apex du pic (=maximum du pic). Le
paramètre de hauteur sert à calculer l'aire du pic.

A= 1,062 x h x δ

Pour simplifier, on arrondit souvent 1,062 à 1, on peut donc retenir cette formule de l'aire:

A= h x δ

Avec h : la hauteur ; et δ : la largeur à mi hauteur

Cette surface de pic on l’utilise comme paramètre proportionnel à la quantité de molécules éluées, c’est pour ça
qu’on peut l’utiliser dans un objectif de quantification car il existe une proportionnalité entre l'aire d'un pic et la
quantité (ou la concentration) de l’analyte.

2
(Il existe aussi une proportionnalité entre la hauteur d'un pic et la quantité de composé mais la hauteur est plus
variable aux fluctuations de température et de débit, donc on préfère utiliser l'aire qui permet d’avoir une justesse
plus importante.)

Les paramètres du pic qui sont donc importants à retenir sont la largeur à mi-hauteur, la hauteur et l'aire.
En TP ces paramètres sont déterminés automatiquement par les logiciels développés par les producteurs de
chromatographie.

Avant on parlait du cas d’un pic

idéal, mais pour un pic réel il y a
des paramètres qui s’ajoutent:
Dans le cas des pics réels, ils ont
souvent une autre allure que la
courbe de Gauss, ils sont plutôt
asymétriques.
Cette asymétrie a plusieurs
origines: soit on a saturé la phase
stationnaire car on a injecté trop
de composé, soit c'est à cause
d'interactions entre des composés
basiques et la phase stationnaire,
ces 2 possibilités expliquent la
"traînée" en sortie de colonne
qu’on peut voir.

On caractérise cette asymétrie par deux facteurs :

-Le facteur d'asymétrie (le plus couramment utilisé) : As = b/a

avec “b” la distance entre la moyenne du pic et un point sur la courbe mesuré à 10% de hauteur et “a” la distance
qu’on peut voir sur le schéma à 10% de hauteur.
-Le facteur de symétrie (ce facteur est utilisé dans la Pharmacopée Européenne): As = ω0,05 / 2d
Avec “ω0,05” la largeur à 5% de hauteur et “d” la distance qu’on peut voir sur le schéma à 5% de hauteur.

Les formules ne sont pas à connaître par cœur mais on doit savoir où se mettre dans le pic pour déterminer la largeur
du pic.

3
C- Données de rétention

On se sert des données de rétention

pour qualifier la sortie des
composés.
Les plus importantes sont le temps
de rétention et le volume de
rétention. (Principalement, en
pratique on utilise le temps de
rétention)
Le temps de rétention est le temps
que met un composé à partir de
l'injection pour sortir de la colonne.
(C’est le temps entre l’injection et le
maximum du pic) Ces temps se
déterminent sur le
chromatogramme: on repère le t0
puis on calcule ces temps.
On utilise aussi le temps mort qui
correspond au temps de rétention d'un composé non retenu.
Le temps mort c’est le temps qu'il faut pour traverser la colonne sans interagir avec la phase stationnaire.
Le temps mort est important pour calculer le facteur de rétention et surtout quand on veut comparer des systèmes
de chromatographie.

Il y a plusieurs façons d’estimer le temps mort.

On peut notamment utiliser l’artefact d'injection (il correspond à une petite perturbation de la ligne de base): au
moment de l'injection ça crée des bulles ou des variations qui font un changement de signal au niveau du détecteur, il
met du temps à traverser la colonne et finalement on peut le visualiser sur le chromatogramme. Le temps mort est le
temps entre l’artefact d'injection et le t0.

On peut aussi exprimer cette rétention en volume, c’est la même chose sauf qu’on multiplie le temps de rétention par
le débit de la phase mobile. Si le débit par exemple est de 1 mL/min, on multiplie ça par le temps de rétention en
minutes, on obtient le volume de rétention en millilitres.
De la même manière on retrouve le volume de rétention et le volume mort.
Le volume mort c'est le
volume de phase mobile
nécessaire pour parcourir sans
interactions la phase
stationnaire.

Il y a des petites choses à

connaître qui peuvent influer
sur la qualité de la séparation:
Le volume mort total inclut les
volumes extra-colonne
(volumes contenus dans les
raccords et les tubulures, dans
l'injecteur, dans la cellule du
détecteur...) et le volume
mort de la colonne.

4
Donc le volume mort total comprend aussi un volume qu’on ne peut pas injecter, il sert à combler le vide des volumes
extra-colonnes, et il aura un impact sur la rétention des composés car ce volume est absolument nécessaire avant
toute sortie.

Pour calculer le volume mort il y a plusieurs méthodes :

- Soit ce qu'on a dit avec l'artefact d'injection (mais on a pas toujours cet artefact)
-Soit on injecte un composé qu’on sait être non retenu sur le système. ex: en phase inverse on injecte de la
thio-urée (une molécule polaire), elle n’est pas retenue par la phase inverse donc son temps de rétention = le temps
mort.
-Et sinon grâce au calcul du volume de la colonne et à la connaissance de sa porosité

Comment calculer le volume d'une colonne ? C'est le volume d'un cylindre: π x R² x L = Vs + V’m
Avec:
DI = diamètre interne de la colonne (elle rappelle que R² = (DI/2)² = DI²/4 )
Vs = volume de la phase stationnaire
V'm = volume de la phase mobile de la colonne

Il existe différents types de colonnes en fonction du type de chromatographie utilisé.

En chromatographie liquide haute

performance, on utilise le plus souvent
des colonnes “particulaires”,
c'est-à-dire des colonnes dites
remplies: il va y avoir un cylindre rempli
de petites particules poreuses, dont la
porosité est déterminée. Donc grâce à
la connaissance du volume de la
colonne et de la porosité on peut
calculer le volume mort, puisque
Vm = porosité x Volume colonne.
Ces colonnes particulaires sont celles
qui sont le plus utilisées en
chromatographie phase liquide, elles
sont aussi utilisées en chromatographie
phase gazeuse mais dans une moindre
mesure.

Il y a différentes formes de particules:

on en trouve des irrégulières (comme
on peut voir ici en microscopie
électronique) ou des sphériques.
La forme des particules a un impact sur
la séparation: plus la particule est
régulière et sphérique, meilleure sera
la séparation.

5
 L’autre catégorie de colonnes à connaître
sont les colonnes capillaires: à l'inverse des
colonnes remplies particulaires, elles ont un
petit film de phase stationnaire qui tapisse
la paroi interne de la colonne. Ces colonnes
capillaires sont très utilisées en CPG
(chromatographie phase gazeuse), et pas du
tout utilisées en chromatographie phase
liquide.
La phase stationnaire a une épaisseur très
fine: de 0.1 à 1 micron.

En fonction de ces deux catégories

de colonnes il y a différentes
manières d’estimer le volume mort.
Si on reprend l’exemple de la
colonne particulaire, on a dit qu’on
avait des particules poreuses. Dans
les particules poreuses il y a du
vide caractérisé par la grandeur Vp.
Et entre les particules il y a aussi du
vide, caractérisé par la valeur Vi
(Volume interstitiel).

Pour exprimer V’m (qui représente

le volume mort de la colonne
uniquement) on fait:
V'm = Vi + Vp

Comme la porosité des colonnes particulaires est globalement comprise entre 50% et 70% on peut dire que:
0,5Vc < V’m < 0,7Vc
Avec Vc= Volume total de la colonne

Donc si on veut calculer V’m:

V'm= porosité x Vc = porosité x π x R² x L
La porosité est donnée en %.
En TP on aura besoin de calculer ce V’m. La formule de Vc est dans le formulaire, mais celle de V'm ne l'est pas
forcément donc il faut la retenir.

6
Souvent V'm est assimilé à Vm: c'est une approximation, on estime que c'est le volume mort en oubliant les volumes
extra-colonne.

Dans une colonne capillaire c’est

un peu plus simple dans la mesure
où la totalité de la colonne est non
remplie, on a juste le petit film qui
tapisse la paroi intérieure de la
colonne. Donc finalement on peut
calculer le volume mort d’une
colonne capillaire en utilisant la
formule π x R² x L mais on retire
au diamètre interne 2 fois
l'épaisseur de film car celui-ci
apparaît deux fois (voir schéma).
Cette formule est la formule non
approchée.

Mais comme ef est très petit et

que ef <<< DI, il est alors
négligeable. Donc le plus souvent
on approche la formule par V’m= Vc = π x R² x L (la porosité étant de 100%)

En général, le diamètre interne est compris entre 100 à 500 microns (le plus souvent c’est 500 microns), et l’épaisseur
de film entre 0,5 et 5 microns.

Grâce à ces temps mort, volume mort, temps de

rétention et volume de rétention, on va pouvoir
calculer le facteur de rétention nommé k ou k' (il a
les deux appellations en fonction des références):

k = (Tr - Tm)/Tm = (Vr-Vm)/Vm

k permet de caractériser la rétention d’un composé

sur une colonne et de s’affranchir des paramètres
de dimension de la colonne et du débit de la phase
mobile, parce qu’on prend en compte le temps mort
(on normalise au temps mort).

Grâce au facteur de rétention k on peut comparer différentes chromatographies/systèmes entre eux.

k est compris entre 0 et l’infini:
-si k tend vers 0 --> le composé est non retenu
-si k tend vers l'infini --> le composé est trop retenu

On considère que la chromatographie est correcte et optimisée si les k de tous les composés sont ≥ 1.

7
 Autre expression du facteur de
rétention: k = K x Vs/Vm (juste pour info,
on ne va pas se servir de cette formule)
Avec:
K= coefficient de distribution
Vs= Volume de phase stationnaire
Vm= Volume de phase mobile

Il faut retenir que le facteur de rétention

va déprendre du soluté (de sa structure
chimique), et des interactions entre le
soluté et la phase stationnaire et la
phase mobile.

Donc si on veut modifier le facteur de

rétention pour optimiser une
chromatographie (si on est pas satisfait
de la séparation), on peut jouer sur la phase stationnaire ou la phase mobile. (On ne va pas trop entrer dans le détail
cette année)

Il y a une relation inversement

proportionnelle entre les rapports
frontaux (obtenus en CCM) et les
facteurs de rétention (obtenus sur
colonne).

Donc c’est intéressant quand on veut

estimer les facteurs de rétention sur
colonne et savoir quand va être élué
notre composé: on peut passer par un
développement de méthode qui est basé
sur une CCM. C’est-à-dire que si on
réalise une CCM avec une certaine phase
mobile et une certaine phase
stationnaire identiques que celles qu’on
va utiliser pour la colonne, on pourra
estimer le facteur de rétention car:
k+1 = 1/Rf
(Donc si on a 0,1 de Rf, on aura 9 de facteur de rétention)
Ça peut être intéressant dans les domaines où on utilise beaucoup les chromatographies sur colonne, je pense
notamment à la synthèse organique: on peut avoir une estimation simple du Rf sur colonne avec une CCM.

8
D- Performances des colonnes

On s'intéresse maintenant aux données qui permettent de caractériser les performances des colonnes.
Ces données vont être utilisées pour suivre la vie d' une colonne chromatographique, on va s’y intéresser pour voir si
la colonne ne se bouche pas ou ne se dégrade pas au cours du temps, donc ça peut avoir un intérêt pratique assez
important. Et on s’y intéresse aussi pour faire de l'optimisation de chromatographie, aller vers une colonne plus
performante.

Cette performance est basée sur la

théorie des plateaux, elle a été
développée pour expliquer la forme
gaussienne des pics
chromatographiques.
En 1941 c’est Martin et Synge qui ont
développé cette théorie des plateaux.

La théorie assimile une colonne

chromatographique comme étant
constituée d'un nombre de plateaux
où il y aura des échanges entre la
phase stationnaire et la phase
mobile.
Donc la colonne de chromatographie
est assimilée finalement à une
colonne de distillation constituée de
plateaux théoriques.
Chaque plateau est assimilé à une
ampoule à décanter qui réalise un
partage.
N = nombre de plateaux théoriques.

On découpe la colonne de chromatographie (de longueur L) en N plateaux théoriques. Dans chaque plateau
théorique on a une distribution du soluté entre les 2 phases. Le coefficient de distribution K = Cs/Cm, il correspond à
un équilibre.

9
Dans cet exemple K= 1 et N=5.
A l’instant i-1 il va y avoir une quantité de composé injectée nommée mT, on apporte de l’éluant et ce qui se passe
c’est qu’au premier plateau il y aura une séparation moitié-moitié du composé entre la phase mobile et la phase
stationnaire. A I+1, la quantité qui était dans la phase mobile va se séparer à chaque plateau moitié-moitié, et ainsi
de suite. Au fur et à mesure on aura la distribution qu’on peut voir dans le tableau dans la phase mobile, et qui sera la
même dans la phase stationnaire. Ici on a divisé par 32 la masse de départ et on a bien une distribution gaussienne
des composés.
(Ici le partage se fait moitié-moitié car le coefficient de distribution est de 1, sinon c’est pas forcément 50-50 entre les
deux phases)

Si on augmente le nombre de plateaux, on

augmente les échanges et on diminue le
volume occupé par le gradient de
concentration de notre composé dans la
colonne et finalement on va obtenir un pic
plus symétrique et plus fin (ici on passe de
5 à 25 plateaux).
Donc ce qui faut retenir c’est que plus le
nombre de plateaux est grand, plus on va
avoir une succession d'échanges
importante, plus les pics seront fins (car le
volume occupé par la molécule dans la
colonne sera moins important) et donc
meilleure sera l’efficacité de la colonne.

Donc le nombre de plateaux théoriques

permet de caractériser l'efficacité de la
colonne.

Avec un seul plateau théorique, le composé va occuper la totalité de la colonne, on ne pourra donc pas séparer des
composés les uns par rapport aux autres.

10
 Comment déterminer le
nombre de plateaux
théoriques d’une colonne? Il y
a plusieurs façons de faire. La
façon la plus pratique c’est la
détermination expérimentale
(graphique) à partir d’un
chromatogramme. Elle utilise
des formules qui mettent en
relation les temps de rétention
des composés et la largeur de
pic.
En pratique on utilisera cette
formule: N= 5,54 tr²/δ².
Pour calculer le nombre de
plateaux théoriques d'une
colonne, on utilise le pic du
composé le plus retenu par la
colonne (car c’est celui qui va
passer le plus de temps dans la
colonne qui va être le plus
représentatif de ce qui se passe en terme d’échanges dans la colonne).
Le nombre de plateaux N pour une même colonne est un nombre constant quel que soit le composé élué, c’est un
paramètre qui représente l’efficacité de la colonne.

En plus, si on prend un
chromatogramme donné on voit que
en comparant le pic du composé qui
est retenu 2 min à celui qui est
retenu 8 min, et 12 min, la hauteur
diminue et la largeur augmente, de
manière proportionnelle.
Globalement, on a une hauteur qui
diminue et une largeur qui augmente
tout au long de la chromatographie
de manière constante. Donc si on
veut calculer N on va utiliser le pic le
plus retenu.
La largeur des pics augmente dans le
temps de rétention augmente, et la
hauteur des pics diminue dans le
temps de rétention augmente.
Cette augmentation de la largeur et
cette diminution de la hauteur est
liée au fait que la molécule diffuse dans la colonne et plus une molécule reste dans la colonne plus elle a le temps de
diffuser dans la colonne, donc plus on aura des pics larges sur la fin du chromatogramme.

11
 On a différentes caractéristiques de la
colonne qui peuvent être intéressantes pour
pouvoir augmenter le nombre de plateaux
théoriques.
La première chose c’est la longueur de la
colonne: plus elle est longue, plus on peut
mettre de plateaux théoriques à l’intérieur.
Une colonne longue sera plus efficace si elle
est longue.
Augmenter N:
• N augmente quand la longueur de colonne
augmente
• On peut jouer aussi sur la nature de la
phase stationnaire: dans les colonnes
particulaires plus les particules sont petites
(avec un diamètre dp petit) plus N est élevé,
dans les colonnes capillaires, N augmente
quand l'épaisseur du film diminue et le
diamètre de la colonne diminue (car ça favorise les échanges).

Un dernier paramètre pour caractériser les

performances de colonne:
La hauteur équivalente à un plateau
théorique ( c’est la hauteur d'un plateau)
H= L/N
Plus H diminue, plus les pics sont fins. (H
est inversement proportionnel à N)
H s'affranchit de la dimension de la colonne
(à part pour le calcul de H), grâce à ça on
peut comparer des colonnes de différentes
tailles.
Plus H diminue, plus la qualité de la
colonne augmente.

A retenir:
H permet de juger de la qualité de
la colonne.
N permet de juger de l'efficacité de
la colonne.

Quelques exemples de nombres de

plateaux théoriques, de nombre de
plateaux théoriques par mètre de
colonne et de hauteur équivalente
à un plateau théorique pour des
colonnes capillaires ou remplies de
CPG, CPL et HPLC.

12
(Pour de la CPG colonne capillaire on travaille plutôt avec des colonnes de 60m, 25m c’est petit)
Pour la CPG colonne capillaire on peut voir 100000 plateaux theoriques, ce qui veut dire qu’il faudrait 100000
ampoules à décanter pour obtenir le même résultat séparatif. En terme de hauteur, on est à 0,25 mm.
Pour la CPL classique de 50 cm il y a 100 plateaux, soit 100 échanges.
En HPLC de 10 cm il y a 5000 plateaux.
On voit que le nombre de plateaux par mètre est très différent et la résultante est que la hauteur équivalente en
HPLC est beaucoup plus faible.

13
Ce preneur a aspiré mon âme.

14