CATHERINE GARDNER-FORTIER

DEVELOPPEMENT D'UN FROMAGE FONCTIONNEL RENFERMANT UN

COMPOSÉ BIOACTIF, L'ACIDE GAMA-AMINOBUTYRIQUE (GABA)

Mémoire présenté
à la Faculté des émdes supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en Science et Technologie des Aliments
pour l'obtention du grade de maître es sciences (M.Sc.)

DEPARTEMENT DES SCIENCES DES ALIMENTS ET DE NUTRITION

FACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC

2011

Catherine Gardner-Fortier, 2011

Remerciements

Je tiens premièrement à remercier mes directeur et co-directeur, M. Jean-Christophe

Vuillemard et M. Daniel St-Gelais, pour m'avoir donné la chance de réaliser un projet de maîtrise
aussi stimulant. Merci pour votre confiance, votre grande disponibilité et pour vos
encouragements constants tout au long du projet. J'en profite pour souligner également la
précieuse collaboration de M. Claude Champagne tout au long du projet et pour avoir accepté de
donner ses commentaires lors de la lecture de ce présent mémoire.

Pour leur soutien technique, leurs judicieux conseils, leur sens de l'humour et leur
support, je tiens à souligner l'aide précieuse des professionnels de recherche du Centre de
recherche et développement sur les aliments (CRDA) de Saint-Hyacinthe : Annie Caron, Sophie
Turcot, Gaétan Bélanger. Vous avez été de puissantes lanternes qui ont su me guider tout au long
de mon projet. Merci également à Denis Bélanger, à Yves Raymond, à l'équipe de l'analyse
sensorielle, Jacinthe Fortin et Nancy Graveline, et à ma stagiaire, Audrey Mailloux. Vous tous
avez transformé mon passage au CRDA en une période inoubliable! Un merci particulièrement
chaleureux à Annie pour m'avoir accueillie parmi les tiens, où j'ai partagé avec vous de
merveilleux moments pendant ma période de rédaction!

Je voudrais également remercier les partenaires financiers, sans qui le projet le projet
n'aurait pu être réalisé : le Programme de Soutien en Innovation en Agroalimentaire (PSIA) ainsi
que le ministère de l'Agriculture, des Pêcheries et de l'Alimentation du Québec (MAPAQ).
Merci également à la fondation Initia pour sa contribution appréciée.

À Julie Bullard et Kathya Dupont, je dois avouer que les mots me manquent pour dire à
quel point vous avez joué un rôle déterminant dans la réussite de ce projet... Merci pour votre
écoute, nos moments de fous rires, nos pauses caféinées et votre support inconditionnel. Enfin,
merci à ma famille, et à mon conjoint Olivier, pour votre patience et votre compréhension. Je suis
fière d'avoir pris part à cette aventure qui, certes, n'aura pas toujours été évidente, mais qui
m'aura fait grandir et évoluer en tant que personne. Ce projet représentait énormément pour moi,
tant sur le plan professionnel que personnel. Vous tous m'avez permis une fois de plus de
repousser mes limites et d'atteindre mon « inaccessible étoile ». On dit des bateaux qu'ils sont en
sécurité arrimés au port, mais que ce n'est pas pour cette raison qu'ils ont été conçus...

ii
A ma mère.

m
TABLE DES MATIERES

REMERCIEMENTS II
TABLE DES MATIÈRES IV
LISTE DES FIGURES VII
LISTE DES TABLEAUX VIII
RÉSUMÉ 10
INTRODUCTION GÉNÉRALE 11
CHAPITRE 1 : REVUE DE LITTÉRATURE 13
1.1 ASPECTS GÉNÉRAUX 13
1.2 LA FABRICATION FROMAGÈRE 13
1.2.1 La coagulation 14
1.2.1.1 Coagulation par voie enzymatique 14
1.2.1.2 La coagulation par acidification 14
1.2.2 L'égouttage 15
1.2.3 L'affinage 16
1.2.4 Fabrication de fromage Cheddar 16
1.3 LES FERMENTS LACTIQUES 18
1.3.1 Les bactéries lactiques 18
1.3.1.1 Le genre Lactococcus 19
1.3.2 La flore secondaire 21
1.3.2.1 La flore contaminante désirable 22
1.4 ÉTUDE DE L'AFFINAGE À L'INTÉRIEUR DE CAILLÉS MODÈLES 22
1.5 BlOCOMPATIBILITÉ 25
1.5.1 Interactions de coopération 25
1.5.2 Interaction de compétition 26
1.6 LE MÉTABOLISME BACTÉRIEN ET L'AFFINAGE DES FROMAGES 28
1.6.1 Laglycolyse 28
1.6.2 La lipolyse 30
1.6.3 La protéolyse 32
1.6.3.1 Le catabolisme des acides aminés 34
1.6.3.1.1 Le catabolisme du glutamate 35
1.6.3.1.2 Formation du GABA chez les bactéries 36
1.6.3.1.3 Intérêt du GABA pour la santé humaine 39
PROBLÉMATIQUE, HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS 41

iv
CHAPITRE 2 44
BlOCOMPATIBILITÉ DES SOUCHES PRODUCTRICES DE GABA (LC. LACTIS SSP
LACTIS) AVEC UNE SOUCHE DE LC. LACTIS SSP CREMORIS ET OPTIMISATION DE LA
PRODUCTION DE GABA À L'INTÉRIEUR DE CAILLÉS MODÈLES 44
2.1 RÉSUMÉ 44
2.2 INTRODUCTION 45
2.3 MÉTHODOLOGIE 47
2.3.1 Provenance des souches 47
2.3.2 Préparation des inoculums 48
2.3.3 PRÉPARATION D'EXTRAITS ACELLULAIRES POUR LE TEST DE BIOCOMPATIBILITÉ 49

2.3.4 Étude de biocompatibilité par spec trop ho to met rie automatisée (SA) 50
2.3.4.1 Croissance et standardisation des inoculums 50
2.3.4.2 Biocompatibilité des souches 51
2.3.5 Quantification du GABA par les souches productrices 53
2.3.6 Étude de proximité génétique entre les souches productrices de GABA 54
2.3.7 Détermination des conditions optimales pour la production de GABA à l'intérieur d'un
caillé modèle 54
2.3.7.1 Préparation des inoculums 54
2.3.7.2 Production d'un caillé sans ferment 55
2.3.7.3 Préparation des caillés modèles 55
2.3.7.4 Analyses microbiologiques 57
2.3.7.5 Quantification du glutamate et du GABA 57
2.3.8 Analyses statistiques 58
2.4 RÉSULTATS ET DISCUSSION 59
2.4.1 Étude de biocompatibilité par spectrophotométrie automatisée (SA) 59
2.4.1.1 Croissance des 9 souches de Lc. lactis productrices de GABA dans le lactosérum des
souches Lc. cremoris LL074, LL225, LL390 et W62 59
2.4.1.2 Croissance de la souche Lc. cremoris W62 dans les lactosérums des souches productrices
de GABA 65
2.4.3 Étude de proximité génétique des souches productrices de GABA 69
2.4.4 Optimisation de la production de GABA à l'intérieur de caillés modèles 70
2.4.4.1 Évaluation de l'impact du ratio sel/humidité sur la survie des populations bactériennes
productrices de GABA 70
2.4.4.2 Production de GABA dans les caillés modèles 72
2.5 CONCLUSION 77

CHAPITRE 3 78
FABRICATION DE FROMAGES DE TYPE CHEDDAR NATURELLEMENT ENRICHIS EN
ACIDE GAMMA-AMINOBUTYRIQUE (GABA) 78
3.1 RÉSUMÉ 78
3.2 INTRODUCTION 79
 3.3 MÉTHODOLOGIE 81
3.3.1 Préparation des ferments 81
3.3.2 Fabrications fromagères 81
3.3.3 Rendements fromagers 83
3.3.4 Composition des fromages 84
3.3.5 pH des fromages 84
3.3.6 Analyses rhéologiques des fromages 84
3.3.7 Analyses microbiologiques 85
3.3.8 Protéolyse des fromages 85
3.3.9 Détermination du GABA et du glutamate dans les fromages 85
3.3.10 Analyse sensorielle 86
3.3.11 Statistiques 86
3.4 RÉSULTATS ET DISCUSSION 88
3.4.1 Paramètres de fabrication fromagère 88
3.4.2 Composition des fromages 90
3.4.6 Évolution des populations microbiennes pendant la fabrication 91
3.4.7. Évolution des populations microbiennes pendant l'affinage 93
3.4.3 Évolution du pH 95
3.4.4 Évolution de la protéolyse 98
3.4.5 Évolution de la texture 99
3.4.8 Analyse sensorielle des fromages 101
3.4.7 Transformation du glutamate en GABA 105
3.5 CONCLUSION 109
CONCLUSION GÉNÉRALE 110
BIBLIOGRAPHIE 112
ANNEXE 1 122
ANNEXE 2 123
ANNEXE 3 124
ANNEXE 4 125
ANNEXE 5 126
ANNEXE 6 127
ANNEXE 7 128

vi
LISTE DES FIGURES

Figure 1.1 Transport et catabolisme du glucose chez les bactéries lactiques (Desmazeaud et
Roissart, 1994) 29
Figure 1.2 Principales voies de la lipolyse (McSweeney et Sousa, 2000; Gagnon, 2006) 31
Figure 1.3 Principales voies de dégradation des protéines du caillé au cours de l'affinage des
fromages (Mietton et al., 1994) 33
Figure 1.4 Mécanisme de défense contre l'acidité chez la cellule bactérienne L. lactis (Bearson et
al., 1997; Lacroix, 2008) 37
Figure 2.1 Courbe de croissance modélisée présentant l'évolution de la D.O. en fonction du
temps ainsi que les paramètres de croissance Tlag, Taux et DOmax 52
Figure 2.2 Résumé des 24 traitements à l'étude à l'intérieur des caillés modèles 56
Figure 2.3 a) Distribution des valeurs de Tlag (hrs) obtenues par les 9 souches productrices de
GABA en croissance dans les lactosérums des souches LL074, LL225, LL390, W62 et le témoin
GDL 62
Figure 2.3 b) Distribution des valeurs du Taux (DO/hr) obtenues par les 9 souches productrices
de GABA en croissance dans les lactosérums des souches LL074, LL225, LL390, W62 et le
témoin GDL 63
Figure 2.3 c) Distribution des valeurs de DO max (k 600nm) obtenues par les 9 souches
productrices de GABA en croissance dans les lactosérums des souches LL074, LL225, LL390,
W62 et le témoin GDL 64
Figure 2.4 Distribution des valeurs du Tlag (hrs), du Taux (DO/hr) et de la DOmax obtenues par
la souche Lc. cremoris W62 en croissance dans les lactosérums des 9 souches productrices de
GABA 67
Figure 2.5 Quantification de GABA (mg/100ml lait) chez les souches productrices après 5 jours
de fermentation à 30°C à l'intérieur d'un lait supplémenté à lOmM en glutamate 68
Figure 2.6 Mortalité bactérienne (Log UFC/ g caillé) observée chez les souches productrices de
GABA A23 et H13 après 10 jours d'affinage des caillés modèles à 30°C selon les ratios S/H
3,0% et 4,5% 70
Figure 3.2 Populations bactériennes de Lc. lactis A23 et H13 (a) et Lc. cremoris W62 (b)
pendant l'affinage des fromages. Les barres d'erreur représentent les erreurs standard des
moyennes 94
Figure 3.3 Évolution du pH des fromages pendant l'affinage 95
Figure 3.4 Évolution de la protéolyse primaire des fromages pendant l'affinage 98
Figure 3.5 Évolution de la dureté (MPa) des fromages au cours de l'affinage 99
Figure 3.7 Analyse sensorielle des fromages témoin, A23 et H13 104
Figure 3.8 Évolution du glutamate dans les fromages pendant l'affinage 108

vu
LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1.1 Différences métaboliques entre L. lactis ssp lactis etL. lactis ssp cremoris 20
Tableau 2.1 Liste des souches de Lc. lactis ssp lactis productrices de GABA 47
Tableau 2.2 Liste des souches industrielles de Lactococcus lactis ssp. cremoris 48
Tableau 2.3 Paramètres de température et de temps utilisés pour le test de Pearce lors de la
préparation des extraits acellulaires 49
Tableau 2.4 Résumé des essais de biocompatibilité entre les souches 51
Tableau 3.1 Composition moyenne des laits de fabrication 88
Tableau 3.2 Composition des fromages (témoin, A23 et H13) après 16 jours d'affinage 90

vm
 RESUME

Le Cheddar est le principal fromage produit et consommé au Canada. Les ferments utilisés pour
sa fabrication renferment principalement des souches de lactocoques sélectionnées pour leur
pouvoir acidifiant ainsi que pour leurs propriétés aromatiques et technologiques particulières.
Neuf souches de bactéries lactiques, isolées de ferments traditionnels utilisés jusque dans les
années 60 ont démontré la capacité de produire un composé bioactif, l'acide y-aminobutyrique
(GABA), un neurotransmetteur agissant au niveau du système nerveux central. Des émdes
réalisées chez les humains ont démontré que la consommation de lait fermenté contenant du
GABA engendrait une diminution de la pression artérielle.

Le but de ce projet a été d'évaluer la capacité de ces 9 souches de L. lactis ssp lactis à produire
du GABA dans du fromage de type Cheddar. La capacité des souches GABA, proteinases
négatives, à croître en présence de souches commerciales de L. lactis ssp cremoris proteinases
positives, a été évaluée par un test de biocompatibilité et a permis la sélection des souches GABA
A23 et H13. Par la suite, l'effet de différents paramètres d'affinage (3 pH, 2 ratios sel/humidité, 2
concentrations en glutamate) sur la production de GABA a été évalué à l'aide d'un système de
caillé modèle. Les conditions optimales ont été déterminées (pH 4,9 ratio sel/humidité 3,5%, ratio
souches GABA/W62 2 :2) et ont été reproduites en usine pilote pour la production de Cheddar.
Les résultats démontrent que la composition, les propriétés rhéologiques et sensorielles des
fromages renfermant du GABA ne sont pas significativement différentes des fromages témoins et
une quantité de 0,35 mg de GABA/g de fromage a pu être produite après 56 jours d'affinage.

10
 INTRODUCTION GENERALE

La consommation de fromages au Canada connaît une augmentation de 20% depuis les années
80, le Cheddar représentant le type de fromage le plus produit et consommé (Statistiques Canada,
Revue Laitière, 2006). Les ferments lactiques utilisés afin de produire du cheddar sont
principalement composés des souches de Lactococcus lactis ssp latis et de Lactococcus lactis ssp
cremoris, choisies d'abord pour leur pourvoir d'acidification du lait mais aussi pour leur
résistance aux phages. De ce fait, la diversité parmi les souches utilisées au sein de l'industrie est
relativement faible, d'où le grand intérêt manifesté pour la recherche de nouvelles souches aux
propriétés technologiques particulières, comme le développement d'arômes pendant l'affinage,
générant par le fait même de nouveaux fromages Cheddar aux propriétés uniques.

Les divers changements biochimiques se produisant au cours du processus d'affinage des

fromages est principalement régi par les phénomènes de glycolyse, de lipolyse et de protéolyse.
Ces changements, combinés à de nombreuses transformations secondaires, confèrent aux
fromages leur aspect final ainsi que leur typicité. Dans le cas du fromage Cheddar, la protéolyse
représente un phénomène biochimique crucial, où la formation de peptides et d'acides aminés
libres, servant à leur tour de substrats pour une multitude de réactions cataboliques, conduit au
développement de divers composés aromatiques (McSweeney, P.L.H., 2004). Parmi ces
réactions, la decarboxylation d'un acide aminé conduit à la formation d'une amine et de CO2. La
glutamate decarboxylase (GAD) catalyse ainsi la transformation du glutamate en acide gamma-
aminobutyrique (GABA). Le GABA est un neurotransmetteur agissant au niveau du système
nerveux central, reconnu pour diminuer la pression artérielle lorsqu'injecté par voie intraveineuse
(Takahashi et al., 1955; Elliott et Hobbiger, 1959; Stanton, 1963; Lacerda et al., 2003). Plus
récemment, la consommation quotidienne d'un lait fermenté par des souches lactiques
productrices de GABA a démontré également cet effet hypotenseur chez les rats et chez des
humains modérément hypertendus, (Aoki et al., 2003; Inoue et al., 2004; Hayakawa et al., 2004).
Parallèlement, des émdes ont porté sur la caractérisation de la GAD ainsi que sur les facteurs
optimisant la production de GABA, les plus déterminants étant un pH acide du milieu, la
présence de glutamate en concentration suffisante, la présence de NaCl ainsi que des conditions

11
anaerobes (Nomura et al., 1998 & 1999a; Komatsuzaki et al., 2005), généralement retrouvées à
l'intérieur de la matrice fromagère.

Récemment, des souches de L. lactis ssp lactis, provenant de ferments lactiques traditionnels
canadiens collectés dans les années soixante, ont été isolées et caractérisées (Gagnon, 2008;
Lacroix, 2008). Parmi ces souches de lactocoques, neuf ont démontré la capacité de produire du
GABA. Considérant que plus de 14% de la population canadienne souffre d'hypertension
artérielle (Fondation des maladies du cœur, 2005), la recherche concernant les effets du GABA
chez les humains a pris de l'ampleur au fil des années (Tsukatani et al., 2005). Jusqu'à
maintenant, seul un lait fermenté enrichi en GABA a été élaboré à partir de souches de
lactocoques productrices, la matrice fromagère présentant pourtant des conditions favorables à la
production de GABA (faible pH, présence de glutamate et de NaCl, faible présence O2). Le
marché des aliments fonctionnels étant en évolution constante, le but de ce projet était donc
d'évaluer les conditions optimales de production de GABA par les souches de L. lactis ssp lactis
et de vérifier l'effet de la formation du GABA sur les propriétés physico-chimiques et
sensorielles des fromages naturellement enrichis en GABA, dans l'optique de créer un nouveau
fromage fonctionnel réducteur de la pression artérielle.

12
 CHAPITRE 1 : REVUE DE LITTERATURE

1.1 Aspects généraux

Le fromage, aliment ancestral consommé depuis plus de 5000 ans av. J-C, n'a cessé d'évoluer et
est toujours bien présent au sein de notre alimentation actuelle. Ce dernier représente une matrice
très complexe au point de vue physique, biochimique et microbiologique. Avec l'avancement de
diverses technologies spécialisées au fil des années, la fabrication fromagère constitue
aujourd'hui un art où chacun des fromages conçus est unique. Pourtant, la liste des principaux
ingrédients utilisés ne renferme que du lait, des cultures bactériennes souvent d'origine lactique,
de la présure ainsi que du chlorure de sodium (Choisy et al., 1997; St-Gelais et Tirard-Collet,
2002). Les étapes de la fabrication fromagère comprennent, de façon générale, l'acidification du
lait, la coagulation par l'action de la présure, le soutirage, le salage, le pressage puis, finalement,
l'affinage. Le caillé obtenu de la coagulation des caséines du lait contient de la matière grasse,
des protéines, de multiples minéraux de même que des vitamines (Mietton et al., 1994; Mahaut et
al., 2000). De façon générale, un fromage de type Cheddar destiné à la consommation doit
contenir un pourcentage d'humidité inférieur à 39% et un taux minimal de gras de 31%
(Ministère de la justice, 2009). C'est principalement la sélection des ferments utilisés, le mode de
fabrication de même que les particularités de l'affinage des fromages qui confèrent à ces derniers
des saveurs et des caractéristiques propres.

1.2 La fabrication fromagère

Dans la majorité des cas, la transformation du lait en fromage nécessite trois étapes principales :
la coagulation, l'égouttage ainsi que l'affinage. La coagulation du lait conduit à la formation d'un
réseau nommé gel ou coagulum. L'égouttage, ou synérèse, permet au lactosérum contenu dans le
gel d'être évacué en grande partie et donc de former le caillé. L'affinage, pour sa part, englobe
une multitude de réactions de digestion enzymatique des constituants du caillé qui confère à
chaque fromage son unicité au niveau de la texture, l'aspect et la flaveur (Mietton et al., 1994).

13
1.2.1 La coagulation

Le phénomène de coagulation résulte d'une transformation de l'organisation structurale de la

micelle de caséines du lait. Cette dernière est constituée de sous-micelles, formées par les
caséines a, p et K et liées entre elles par le phosphate de calcium (Brûlé et al., 1997). Cette phase,
dite colloïdale, est en équilibre avec la phase soluble du lait. La charge nette négative des
micelles permet à ces dernières de se repousser entre elles. D'autre part, la caséine K, située en
périphérie de la micelle, la présence de minéraux de même que la capacité des micelles à retenir
l'eau permettent de stabiliser cette structure micellaire. Le phénomène de coagulation, par voie
enzymatique ou par acidification, vient en réalité déstabiliser cet équilibre afin de précipiter les
caséines qui se soudent et ainsi forment un gel.

1.2.1.1 Coagulation par voie enzymatique

La coagulation par voie enzymatique requiert l'utilisation de présure, constituée de chymosine et
d'un peu de pepsine, d'origine animale mais aujourd'hui synthétisée par des microorganismes
génétiquement modifiés et par technologie de fermentation. Ces endopeptidases agissent à
l'intérieur des chaînes polypeptidiques et ont une activité très spécifique (St-Gelais et Tirard-
Collet, 2002). La phase primaire de ce type de coagulation réside en l'hydrolyse de la caséine K,
stabilisatrice de la micelle, au niveau du lien PHE105-MET106 de la chaîne peptidique. Cette étape
conduit à la formation de deux segments distincts : la paracaséine K ainsi que le
caséinomacropeptide (CMP). Il se produit alors une diminution de la charge électrique et du
niveau d'hydratation des micelles, ce qui déstabilise ces dernières qui s'agglomèrent entre elles.
Lors de cette deuxième phase de la coagulation, soit l'agglomération, les micelles se rapprochent
et forment un réseau par des liens hydrophobes et ioniques. Cette étape, correspondant au temps
de prise, se traduit par la formation d'un gel et est facilement observable. Le temps de prise,
inversement proportionnel à la quantité d'enzyme ajoutée au lait, peut être influencé par d'autres
facteurs tels la température, le pH, la composition du lait de même que la durée de son
entreposage (Grandison, 1986 ; Daviau et al., 2000 ; Mahaut et al., 2000).

1.2.1.2 La coagulation par acidification

La coagulation par voie d'acidification est provoquée par les bactéries du ferment qui utilisent le
lactose pour le transformer en acide lactique. Ce type de coagulation ne nécessite pas l'utilisation
de présure. Avec la production d'acide lactique, le pH du lait diminue et solubilise le phosphate

14
de calcium colloïdal, ce qui déstabilise les micelles de caséines (Brûlé et al., 1997 ; Mahaut et al.,
2000). La structure de ces dernières étant altérée, les micelles se désagrègent en sous-micelles.
Au point isoélectrique, la répulsion est nulle et les sous-micelles s'associent entre elles par des
liaisons électrostatiques et hydrophobes, emprisonnant ainsi l'eau dans ce réseau pour ainsi
former le gel. La température, le pH, le taux de citrate de même que l'ajout de NaCl et de CaC^
sont tous des facteurs modifiant l'équilibre entre la phase soluble et la phase colloïdale des
micelles de caséines et viennent donc tous affecter le phénomène de coagulation par voie acide
(Brûlé et al, 1997).

Il est à noter que la majorité des productions fromagères ont recourt à ces deux types de
coagulation combinés, à différents niveaux. De ce fait, il est donc possible de rencontrer trois
différents types de caillé : un caillé obtenu par coagulation acide, par voie enzymatique ou bien
encore un caillé obtenu par voie mixte.

1.2.2 L'égouttage

Le phénomène d'égouttage, nommé aussi synérèse, se produit lorsque le caillé se contracte

pendant et après la coagulation et en expulse ainsi le lactosérum en quantité plus ou moins
importante, selon le type de coagulation et le processus de fabrication du fromage. Le caillé
obtenu contient alors en grande partie les caséines de même que les matières grasses, alors que le
lactosérum, pour sa part, renferme du lactose, des minéraux ainsi que les protéines solubles du
lait (Ramet, J.P. 1997). De nombreux facteurs viennent influencer la vitesse de synérèse de même
que la quantité de lactosérum exsudé. Ainsi, la teneur en gras, en protéines, en caséines de même
que la température, le pH, l'ajout de calcium, la teneur en NaCl, la surface des grains, le brassage
effectué ainsi que la pression appliquée au caillé jouent des rôles primordiaux lors de l'égouttage
(Grandison, 1986 ; Patel et Reuter, 1986 ; Mietton et al., 1994 ; Daviau et al., 2000). À la suite de
cette étape de la fabrication, le caillé possède un taux d'humidité de même qu'un niveau de
déminéralisation caractéristique du produit final. Le procédé d'égouttage a donc une influence
considérable sur le caillé formé et, par conséquent, sur le type de fromage produit.

15
1.2.3 L'affinage

À la suite des procédés de coagulation et d'égouttage résulte un substrat renfermant des caséines,
de la matière grasse, de l'eau, des minéraux de même qu'une partie des constituants solubles du
lait (Mahaut et al., 2000 ; St-Gelais et Tirard-Collet, 2002). L'affinage, ultime étape de la
fabrication fromagère, est défini comme étant les transformations biochimiques de ce caillé par
des enzymes. Ces divers enzymes peuvent provenir directement du lait de fabrication (lipases,
plasmine), ajoutés au lait (agent coagulant, ferments et microorganismes d'affinage) ou bien
encore de fermentations par des bactéries, des levures ou des moisissures dégradant de façon
plus ou moins poussée le caillé (Mietton et al., 1994). Les principaux facteurs influençant
l'affinage sont la température, l'humidité, l'activité de l'eau, le pH ainsi que la composition de
l'atmosphère (Mahaut et al., 2000 ; St-Gelais et Tirard-Collet, 2002). Les réactions enzymatiques
du processus d'affinage étant tributaires de ces facteurs, il est primordial de les contrôler puisque
cette dernière étape de la fabrication confère au fromage une texture et une saveur caractéristique.

1.2.4 Fabrication de fromage Cheddar

Le Cheddar, fromage le plus consommé au Canada, fait parti de la catégorie des fromages à pâte
pressée cuite (Statistique Canada, Revue laitière, 2006). Les procédés de fabrication utilisés pour
ce type de fromage confèrent à ce dernier une texture ferme: coagulation à dominance présure,
acidification moyenne, brassage, cuisson et pressage des grains de caillé. D'autre part, l'humidité
relativement faible du cheddar par rapport aux autres types de fromages lui permet d'être affiné
sur une période pouvant aller jusqu'à 10 ans. Ce type de fromage présente un goût légèrement
acide à l'état frais et acquiert une saveur plus prononcée, forte et piquante, après plusieurs mois
d'affinage (St-Gelais et Tirard-Collet, 2002).

La fabrication du cheddar comporte plusieurs étapes caractéristiques et déterminantes. Tout

d'abord, le lait peut être standardisé, enrichi pour être soumis à un traitement de thermisation ou
de pasteurisation. Le lait est ensuite inoculé avec le ferment lactique (1,0-2,0%), composé
traditionnellement d'un mélange de souches L. lactis ssp lactis et de L. lactis ssp cremoris, puis
incubé à 30-32°C pour une période allant de 30 minutes à 1 heure, favorisant la croissance des
ferments et donc un début d'acidification (Cantéri, G., 1997). Le pH du lait est alors abaissé à
environ 6,5 après quoi le lait est emprésuré à l'aide d'un agent coagulant (le plus souvent un
mélange de chymosine et de pepsine). Le lait est laissé au repos pour permettre la formation

16
adéquate du gel puis découpé en cubes de 0,5 à 1,5 cm de côté pour être finalement soumis aux
étapes de brassage et de cuisson. Au cours de ces deux étapes, les grains se contractent et se
raffermissent. Le choix de la taille des cubes est alors déterminant sur l'égouttage et le
rendement, des cubes plus petits s'égouttant plus rapidement. Le choix de la température de
cuisson permet pour sa part un meilleur ajustement au niveau de la vitesse d'acidification et de
l'égouttage. La température des grains est amenée généralement entre 38-40°C pour une période
de 30-60 minutes. En plus de permettre l'exsudation du lactosérum, l'étape de cuisson procure
des conditions favorables au développement du ferment lactique et donc accroît l'acidification. À
l'obtention du degré d'acidité recherché (généralement à pH 6,2 dans le lactosérum), le
lactosérum est soutiré. Les grains de caillé sont ensuite soumis à l'étape de cheddarisation. Cette
étape est propre à la fabrication du fromage cheddar et consiste en l'empilage progressif des blocs
de caillé, forçant une fois de plus l'évacuation du lactosérum. L'action combinée de l'acidité, de
la température de même que la force de gravité des retournements permet aux grains d'établir des
liens entre eux et de se souder les uns aux autres. La texture du caillé, initialement
caoutchouteuse, se transforme et devient fibreuse et lisse (chair de poulet). L'accroissement de
l'acidité du caillé au cours de la cheddarisation provoque la déminéralisation du paracaséinate de
calcium et favorise une fois de plus l'exsudation du sérum. Le caillé cheddarisé passe ensuite au
moulinage, consistant à couper mécaniquement le caillé en petits morceaux, puis au salage à sec.
Le sel se dissout dans l'humidité superficielle des grains pom diffuser ensuite dans la phase
aqueuse du caillé. L'étape préalable de découpage du caillé assure une répartition uniforme du sel
sur les grains, éventuellement pressés en meules de plusieurs kilos. L'étape du salage permet ici
de parfaire l'égouttage puisque les grains se contractent sous l'action du sel et expulsent une fois
de plus une certaine quantité de lactosérum. La teneur en sel ciblée du cheddar se situe entre 1,5
et 1,8%. Les grains sont finalement mis en moules et pressés pour une période allant jusqu'à 24
heures. Le pourcentage d'humidité final d'un fromage cheddar sera ajusté en fonction de la
période d'affinage prévue. Ainsi, l'humidité maximale d'un fromage cheddar frais est
généralement de 39% tandis qu'un cheddar destiné à maturation renferme entre 35 et 37%
d'humidité (St-Gelais et Tirard-Collet, 2004). La température à laquelle le fromage cheddar est
affiné varie également selon le procédé de fabrication mais est généralement comprise entre 5 et
12°C La longueur de la période d'affinage détermine pour sa part la nature et l'intensité de la
saveur du fromage.

17
1.3 Les ferments lactiques

1.3.1 Les bactéries lactiques

L'utilisation de bactéries lactiques est essentielle au cours de la production fromagère. Dans un
premier temps, elles sont responsables de l'acidification du lait et de la minéralisation du caillé.
Elles possèdent également une grande diversité d'enzymes qui, lors de l'affinage, engendrent des
modifications biochimiques ainsi que la libération d'arômes typiques (Choisy et al., 1997; El
Soda et al., 2000; Parente, E. et Cogan, T.M., 2004). Enfin, parce qu'elles acidifient le lait et le
caillé lors de la fabrication fromagère, les bactéries établissent une barrière physiologique et
limitent d'éventuelles contaminations bactériennes du fromage. Selon leur caractéristiques
génotypiques et phénotypiques, les bactéries lactiques sont regroupées en 11 gemes distincts :
Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus, Enterococcus, Pediococcus, Aerococcus,
Tetragenococcus, Leuconostoc, Atopobium, Lactobacillus et Carnobacterium (Dellagio et al.,
1994). Leur classification taxonomique est majoritairement basée sur leurs propriétés
enzymatiques, nutritionnelles, immunitaires, sérologiques ou de composition de paroi. Mis à part
le geme Lactobacillus présentant la forme d'un bâtonnet, les cellules des bactéries lactiques sont
des coques à caractère Gram +. En Amérique du Nord, quatre gemes distincts sont utilisés pour la
production de fromages soient Lactococcus sp., Lactobacillus sp., Leuconostoc sp., ainsi que
Streptococcus sp. (Champagne, 1998). Le geme Bifidobacterium, un bacille Gram +, est
également utilisé pour la fabrication de produits fermentes sans toutefois être considéré comme
faisant partie de la famille des bactéries lactiques.

Les bactéries lactiques sont des microorganismes procaryotes, hétérotrophes et considérés comme
étant chimio-organotrophes (Dellagio et al., 1994). Ce type de cellules, primitives et
indépendantes, a donc besoin de molécules organiques complexes hydrocarbonées telles les
sucres, alcools et acides organiques afin de se développer. De par lem métabolisme de
fermentation des sucres, les bactéries lactiques sont dites homofermentaires si leur produit de
dégradation est de l'acide lactique à plus de 90% et sont classés hétérofermentaires si la
dégradation de lactose mène à la formation d'acide lactique, d'éthanol, d'acide acétique de même
que du CO2 (Desmazeaud et de Roissart, 1994). Mis à part Leuconostoc sp. qui est classé dans le
groupe des bactéries hétérofermentaires, les bactéries lactiques sont dites homofermentaires ou
hétérofermentaires, selon lem principal produit de fermentation (Champagne, 1998). Pom- les

18
bactéries comprises dans le premier groupe, l'acide lactique constitue le principal produit issu de
la fermentation. Lems exigences nutritionnelles en ce qui a trait aux acides aminés, peptides,
vitamines, sels, acides gras et glucides sont également complexes.

La température optimale de croissance des bactéries lactiques permet de classer ces dernières en
deux groupes majoritaires, soit les mésophiles ou les thermophiles. Les bactéries appartenant au
premier groupe possèdent une température optimale comprise entre 25 et 35°C Cette température
se situe entre 37 et 47°C pom le groupe des bactéries dites thermophiles (Champagne, 1998). Ce
concept de température optimale est important dans l'industrie laitière puisqu'il régit les vitesses
de croissance et d'acidification des ferments, du bon fonctionnement de la fabrication fromagère
de même que du contrôle des activités enzymatiques qui ont lieu pendant la maturation
fromagère.

1.3.1.1 Le genre Lactococcus

Les bactéries du geme Lactococcus se présentent sous la forme de cellules ovoïdes de diamètre
variant de 0,5 à 2 pm, disposées en paires ou chaînettes. Elles possèdent un métabolisme
homofermentaire, l'acide lactique (L(+)) étant le seul produit issu de la fermentation. Ces
bactéries mésophiles ont une température optimale de 30°C mais ont la particularité de pouvoir
croître à des températures comprises entre 10°C et 35°C Les lactocoques se distinguent
également par la présence, au niveau de leur enveloppe bactérienne, de la présence de l'antigène
N, de lem faible caractère hémolytique de même que leur incapacité de croître en présence d'un
taux de NaCl de 6,5% ainsi qu'à pH de 9,6 (Dellagio et al., 1994). Leur pH optimal est plutôt
compris entre 6,0 et 6,5 (Champagne, 1998).

Les bactéries du geme Lactococcus sp. trouvent leur importance dans l'industrie laitière, où elles
sont largement utilisées. Les bactéries lactiques, en particulier l'espèce Lactococcus lactis, jouent
un rôle primordial dans les produits laitiers fermentes en y assurant lem acidification, leur
structure, goût, conservation de même que lem salubrité (Dellagio et al., 1994). L'espèce L. lacis
est subdivisée en trois sous-espèces : L. lactis ssp lactis, L. lactis ssp cremoris ainsi que L. lactis
ssp diacetylactis. Cette dernière est particulièrement utilisée pom sa capacité à former du
diacétyle à partir du citrate. Le tableau 1.1 énonce les principales différences métaboliques entre
L. lactis ssp lactis et L. lactis ssp cremoris.

19
Tableau 1.1 Différences métaboliques entre Z. lactis ssp lactis e t l . lactis ssp cremoris
(Cogan, 1980; Dellagio et al., 1994; Beresford et al., 2001)

eu o
eu

NH3 formé à
CO
eu O

l'arginine
O
a

partir de
eu ■*r
IB X/J
eu
c» 1 co
O eu
O
•a
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O
1 _£ (D
o S
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-ii
IM •â £ Cfl
CA

O H -eu 'o
1 H
m u
L. lactis ssp lactis + + + + + +/- + +

L. lactis ssp cremoris - - - - - - - -

Les lactocoques possèdent également plusiems plasmides codant pour une grande variété de
caractéristiques fonctionnelles importantes pom la qualité des levains aromatiques tel que la
fermentation du lactose, la production de proteases, l'utilisation du citrate et la résistance aux
bacteriophages (Teuber et al., 1992).

Dans le cas du fromage cheddar, les microorganismes responsables de l'affinage sont des
bactéries lactiques intervenant à l'intérieur du caillé, soit L. lactis ssp lactis ainsi que L. lactis ssp
cremoris. De façon générale, la population de L. lactis ssp cremoris diminue après deux semaines
de maturation pour finalement disparaître au bout de deux mois en raison de sa plus grande
sensibilité au sel (C hoisy et al., 1997). Les enzymes libérés lors de la lyse des L. cremoris sont
cependant impliqués dans le processus de protéolyse. L'espèce L. lactis ssp lactis atteint quant à
elle une population d'environ IO9 UFC/g en fin de fabrication et peut rester constante durant 6
mois. Ces bactéries, de par leurs enzymes actives, sont responsables de la transformation du caillé
en fromage aux propriétés et saveurs bien définies.

20
1.3.2 La flore secondaire
Les microorganismes utilisés en fromagerie jouent un rôle primordial, tant pour la fabrication que
pour la maturation. Ces derniers peuvent être subdivisés en deux groupes importants et distincts :
la flore primaire et la flore secondaire. La flore primaire renferme essentiellement les bactéries
lactiques et est responsable de l'acidification lors du procédé de fabrication ainsi que de la
maturation des fromages. La flore secondaire comprend une grande variété de bactéries, levures
et moisissures qui, de par leurs enzymes, contribuent au développement de caractéristiques
uniques et propre à une variété de fromage particulier (Beresford et al., 2001). Selon leur nature,
les ferments secondaires peuvent contribuer au développement de gaz (formation des yeux),
assurer le développement d'une saveur recherchée ou réduire le niveau d'acidité à la surface d'un
fromage dans le but d'y implanter d'autres microorganismes ultérieurement.

Les ferments secondaires regroupent les cultures additionnées volontairement à certains types de
fromages au corns de la fabrication ainsi que les microorganismes indirectement ajoutés via une
post-contamination (El Soda et al., 2000). À titre d'exemple, les moisissures Penicilium
roqueforti et Penicilium camenberti sont responsables respectivement des veines bleutées des
fromages persillés et du mycélium blanc à la surface de certains fromages à croûte fleurie tel les
bries et les camemberts et sont ajoutées lors du processus de fabrication (Cogan, 2003). La flore
contaminante, quant à elle, provient de l'air ambiant ou de l'équipement et peut contaminer le lait
de fromagerie depuis sa sortie du pasteurisateur. La flore bactérienne naturelle du lait, sensible au
traitement thermique appliqué, s'en trouve diminuée et le lait est donc plus sujet à la
contamination (Grappin et Beuvier, 1997). Ce phénomène de contamination peut être bénéfique
pom le processus de maturation des fromages si les microorganismes apportés participent de
manière positive à l'affinage des fromages, par exemple par l'apport de bactéries lactiques (Non-
starter lactic acid bacteria, NSLAB). Un mauvais contrôle de ce processus peut conduire
également au développement d'une flore contaminante indésirable, par exemple par l'apport de
coliformes ou de staphylocoques, donnant lieu à l'apparition de certains défauts chez les
fromages contaminés.

21
1.3.2.1 La flore contaminante désirable
Les lactobacilles font partie de la flore secondaire des fromages mais ne sont pas apportés par le
ferment lui-même, d'où leur appellation NSLAB (Non-starter lactic acid bacteria). Le geme
Lactobacillus regroupe une grande variété d'espèces bactériennes aux caractéristiques très
diversifiées. Les membres du geme Lactobacillus peuvent être homofermentaires ou
hétérofermentaires, mésophiles ou thermophiles et possèdent un pH optimal compris entre 5,5 et
6,2, d'où leur caractère acidophile (Dellagio et al., 1994). Dans le cas du cheddar, les bactéries
retrouvées au sein de la flore contaminante sont le plus souvent des lactobacilles
homofermentaires et hétérofermentaires facultatifs tels Lactobacillus plantarum, Lactobacillus
casei et Lactobacillus brevis (Choisy et al., 1997; Beresford, 2001). Initialement, ces bactéries ne
sont présentes qu'en nombre minimal (<100 UFC/g) mais leur population peut atteindre l'ordre
de 10 à 10 dès les premières semaines de l'affinage du fromage, dépendant de plusieurs facteurs
dont la température, de l'espèce contaminante dont il est question, le taux d'humidité du fromage,
le taux de sel, le ratio sel/humidité ainsi que la composition du ferment lactique de départ (Cogan,
2003). Ils contribuent au développement de la flaveur à l'intérieur de la pâte de par leur grande
activité protéolytique, peptidasique et lipasique (Choisy et al., 1997).

1.4 Étude de l'affinage à l'intérieur de caillés modèles

Le temps d'affinage pour un fromage de type pâte pressée tel que le cheddar varie généralement
entre 1 et 12 mois et peut même atteindre jusqu'à 10 années. Le GABA étant produit au cours de
la maturation fromagère, ce processus lent limite énormément les possibilités d'étude des factems
influençant la production de cet acide par les souches lactiques. Ainsi, des systèmes modèles de
fromage ont donc été développés au corns des dernières années permettant d'accélérer les
phénomènes biochimiques se produisant à l'intérieur de la matrice fromagère (Kristoffersen et
al., 1967 ; Noomen, 1978 ; Roberts et Wijesundera, 1995). Un caillé modèle est habituellement
constitué d'une pâte semi-solide ayant la même composition générale qu'un fromage
(Kristoffersen et al., 1967). La température d'incubation à 30°C des caillés modèles de même que
leur contenu en humidité induit une maturation rapide, un avantage considérable pour les émdes
des multiples agents d'affinage.

22
Un caillé modèle peut être préparé selon la méthode usuelle de fabrication fromagère à l'aide
d'un ferment lactique (Kristoffersen et al., 1967). Le même système peut également être obtenu
par acidification directe, donc exempt de culture lactique, tout en possédant les mêmes
caractéristiques physico-chimiques qu'un caillé obtenu par fabrication conventionnelle (Mabbitt
et al., 1955 ; Breene et al. 1964 ; Singh et Kristoffersen, 1971 ; Farke et al, 1995). Afin
d'acidifier le lait, l'acide lactique, chlorydrique ou bien encore la glucono-delta-lactone sont
employés. Outre cette étape d'acidification, les étapes habituelles de coagulation et d'égouttage
sont suivies au corns de la fabrication fromagère. Le caillé obtenu peut par la suite être congelé
ou lyophilisé et réduit en poudre pour sa conservation. Il est à noter que le caillé ainsi obtenu
n'est pas stérile. De plus, l'incubation des caillés modèles à 30°C demeure l'un des principaux
désavantages de cette technologie dû à la possibilité de développement de microorganismes (El
Soda, M., 1997). Enfin, en réhydratant la poudre de caillé, il est possible d'ajuster de nombreux
paramètres avant d'y inoculer le ferment lactique tels le pourcentage de sel, l'humidité, etc.

L'étude réalisée par l'équipe de Harper et Kristoffersen (1970) a démontré que la technique des
caillés modèles permettait de reproduire de façon presque exacte les processus de maturation
d'un fromage commercial. En effet, selon des analyses de comparaison de composés volatils, des
acides gras libres, des peptides ainsi que de la formation de diacétyle entre un caillé modèle de 4
jours et un fromage de type Cheddar ou Suisse âgé de trois mois, les deux types de système
démontraient une très grande similitude. Une seconde étude, cette fois menée par l'équipe de
Farkye et al. (1995), affichait des profils protéolytiques similaires entre un fromage de type
cheddar âgé de 90 jours et un caillé modèle incubé à 30°C pendant 5 jours. La flaveur développée
à l'intérieur des caillés modèles serait optimale après 7 à 9 jours d'incubation à cette même
température (Kristoffersen et al., 1967).

Ainsi, à l'aide de ce système, plusiems paramètres relatifs à l'affinage ont pu être étudiés tels le
développement d'arômes à l'intérieur du fromage de type Cheddar (Kristoffersen et al., 1967),
l'activité protéolytique de différentes souches (Dulley, 1976 ; Noomen, 1978 ; Farke, 1995 ;
Magdoub et El-Samragy, 1991), l'effet des protéines de lactosérum sur la protéolyse à l'intérieur
du Cheddar (Harper et al., 1989), la production de composés volatils (Ponce-Trevino et al., 1987 ;
Dias et Weimer, 1999). Un caillé modèle aseptique a été développé par l'équipe de Roberts et
Wijesundera (1995) en utilisant un équipement à l'échelle du laboratoire permettant des

23
manipulations sous la hotte à partir de lait stérilisé. Cet avancement a permis l'étude du potentiel
aromatique des ferments lactiques au cours de la maturation et, plus précisément, des souches
bactériennes individuelles.

24
1.5 Biocompatibilité
Contrairement aux ferments traditionnels composés de nombreuses souches diversifiées
provenant du lait cru, les ferments mixtes utilisés aujourd'hui pom la production fromagère en
industrie ne renferment généralement que deux ou trois souches (Champagne, 1998).
L'association de deux ou plusiems souches en vue de produire un ferment nécessite une
connaissance approfondie des interactions entre celles-ci. Lors de la production de produits
fermentes, tout comme en fabrication fromagère, ces interactions sont susceptibles de générer des
déséquilibres lors de la croissance des souches, problématique conduisant à des changements
indésirables dans le produit.

Deux types d'interactions bactériennes sont observables à l'intérieur d'un ferment, soit la
compétition et la coopération (ou association). Le principal exemple de coopération entre deux
souches bactériennes est attribué à la symbiose observée entre Streptococcus thermophilus et
Lactobacillus bulgaricus à l'intérieur du yogourt. Ce dernier dégrade les caséines du lait,
entraînant la libération d'acides aminés qui stimulent la croissance de S. thermophilus
(Champagne, 1998). Le neutralisme, quant à lui, est observé lorsque les souches mises en
cultures mixte sont indépendantes l'une de l'autre, n'ayant donc aucune incidence sur la
croissance des autres espèces présentes dans le ferment.

1.5.1 Interactions de coopération

La production de nutriments azotés, de metabolites particuliers ou la modification des conditions
physiologiques du milieu de croissance (par exemple, la baisse du pH ou l'élimination de certains
composés toxiques inhibiteurs) sont considérées comme des interactions de coopération entre les
souches bactériennes.

Les bactéries lactiques sont très exigeantes au niveau des nutriments azotés et il a été constaté
qu'un apport exogène en acides aminés et peptides de faible poids moléculaire favorisait la
croissance de certains lactocoques, donc par le fait même la production d'acide lactique (St-
Gelais et al., 1993). La sélection d'une souche à forte activité protéolytique dans la composition
d'un ferment peut permettre la production de molécules azotées et ainsi favoriser la croissance
d'une seconde souche lactique. En effet, certains mélanges de ferments utilisés en fromagerie
comportent des souches proteinases négatives (PRT), dites « lentes », et d'autre proteinases

25
positives (PRT+), dites « rapides » (Champagne, 1998). De ce fait, les peptides et acides aminés
issus de l'hydrolyse des caséines par les souches PRT+ stimulent fortement la croissance des
souches PRT" (Hugenholtz, 1986; Juillard et Richard, 1993; Desmazeaud et Roissart, 1994). Ce
système d'interaction prévient l'accumulation de peptides responsable de l'apparition
d'amertume chez les fromages.

La production de metabolites particuliers peut également conduire à une interaction de

coopération entre 2 souches bactériennes. Dans l'industrie laitière, l'exemple le plus commun
réside en la production d'acide formique et de CO2 par Streptococcus thermophilus qui stimulent
la croissance et la production d'acide chez Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus (Champagne,
1998). La modification des conditions du milieu peut également conduire à la stimulation de la
croissance bactérienne. Les bactéries lactiques sont pour la plupart des organismes anaérobies
facultatifs et sont donc sensibles à la présence d'oxygène. La combinaison de souches lactiques
avec une souche réduisant la teneur en oxygène dans le milieu (Enterococcus feacalis,
Lactobacillus plantarum) favorise donc la croissance des souches moins tolérantes (Desmazeaud
et Roissart, 1994)

1.5.2 Interaction de compétition

L'acide lactique produit en cours de fermentation est connu comme étant le principal agent
inhibiteur de l'activité et donc de la croissance des bactéries lactiques (Juillard et al., 1987).
D'autres phénomènes antagonismes, comme la libération de bactériocines et de composés
toxiques, peuvent inhiber la croissance des lactocoques (Champagne, 1998). Plus précisément,
les sous-espèces lactis et cremoris génèrent une variété de bactériocines pouvant conduire à
l'inhibition d'une souche de la même espèce (Barefoot et Neetles, 1993). D'autres gemes de
lactocoques catalysent également la formation de peroxyde d'hydrogène (H2O2), toxiques pour
plusiems espèces de bactéries lactiques (Desmazeaud, 1983; Barefoot et Neetles, 1993;
Champagne, 1998). Des factems tels la température, le pH du milieu ainsi que l'utilisation des
mêmes nutriments par les souches sont tous associés à la compétition entre les bactéries lactiques
dans une optique de croissance optimale. Le lait représente un milieu permettant la croissance
adéquate des lactocoques, en raison de sa richesse en glucides. Cependant, les peptides et acides
aminés retrouvés y sont en quantité insuffisante, ce qui résulte en une compétition entre les
souches de bactéries lactiques.

26
Ces phénomènes entourant la compatibilité entre les souches bactériennes peuvent être étudiés
via la mesure de leur croissance, la quantification des metabolites produits ou bien par l'étude
comparée de lem activité acidifiante (Juillard et al., 1987). La mesure de leur croissance peut être
obtenue également par le suivi de la densité optique (DO) dans un milieu de croissance par
spectrophotométrie automatisée (SA) (Champagne et al., 2009). Cette technique a permis lors
d'études antérieures d'étudier les cinétiques de croissance bactérienne (Begot et al., 1996;
Dalgaard et al., 1994), de révéler la présence de composés inhibiteurs (Skyttâ et al, 1993) de
même que la présence de factems de croissance (Danish Standard, 2003) à l'intérieur d'un
milieu.

27
1.6 Le métabolisme bactérien et l'affinage des fromages
Les bactéries lactiques, de par leurs nombreux enzymes, participent activement au processus
d'affinage en hydrolysant les composantes des fromages, modifiant la texture de même que les
propriétés organoleptiques de ces derniers. Les produits issus du métabolisme bactérien peuvent
également être transformés en une multitude de composés aromatiques, responsables de
l'apparition d'arômes typiques de certains fromages (Farkye et al., 1995). Le métabolisme
bactérien représente l'ensemble des réactions de dégradation et de synthèse permettant les
échanges avec le milieu pom assurer la survie, la croissance et la reproduction des bactéries
(Desmazeaud et De Roissard, 1994). Le contrôle et la compréhension de ce dernier sont
primordiaux puisque le métabolisme bactérien régule l'affinage des fromages. Les quelques 600
composés aromatiques impliqués dans l'arôme des fromages résultent en fait de trois voies
métaboliques principales : la glycolyse (catabolisme du lactose), la lipolyse et la protéolyse,
majoritairement responsable de l'étape de maturation des fromages (Curioni et Bosset, 2002). Les
enzymes endogènes du lait, la présure, les enzymes des bactéries lactiques ainsi que celles
provenant de la flore secondaire sont responsables de l'activation de ces trois voies métaboliques
(Molimard et Spinnler, 1996)

1.6.1 La glycolyse
Afin de croître et de produire de l'énergie sous forme d'ATP, les bactéries lactiques ont besoin
d'une somce d'hydrates de carbone fermentescibles. Le lactose, disaccharide composé de glucose
et de galactose, est le sucre fermentescible du lait et y est présent à des concentrations de 4 à 5%
(Desmazeaud, 1983). La figure 1.1 illustre les principales voies de la glycolyse chez les bactéries
lactiques. Selon l'espèce bactérienne et les conditions de croissance, la catabolisme des sucres
peut suivre une voie homofermentaire ou hétérofermentaire.

28
 HÉTÉROLACTIQUE HOMOLACTIQUE
Voie des pentoses-phosphates Voie du f ructose-diphosphate

glucose glucose

c- ; Permease

glucose

ATP - J

N»-trA
glucose-6-P
->-NAO

■ NAOH.
4
6-P-gluconate
» - NA O
glucose-6-P DH

tructose-6-P
6-P-gluconate DH ATP
1
NADH,^ -
ADP
c
° 2 *4""ribulose-5-P fructose-1,6-diP

i
xylutose-5-P
fructose-diP
aldolase

acétyl-P"*- - glycéraldéhyde-3-P
►NAO - U

ACETATE
E -NADH_.*4
f
acétyl-CoA 1,3-diP-glycéra!e
.NADHj-J AOP - J

■NAD-*^ ATP - y \

acétaldéhyde
•NADH.O 3P-glycérale

• NA O -*-4
ETHANOL i
2P-glycérate

phosphoenolpyruvate -

3
AOP
pyruvate-kinase

pyruvate ■*-
-►NAOHj-^

A
lactate DH

LACTATE

Figure 1.1 Transport et ca ta bolisme du glucose chez les ba ctéries la ctiques (Desma zea ud et

Roissart, 1994)

29
Le transport du lactose et du glucose au travers de la membrane des bactéries lactiques s'effectue
via le système de phosphotransférase-phosphoénol pyruvate dépendant (PEP-PTS) (Desmazeaud
et de Roissard, 1994). Le transport membranaire du galactose est effectué à l'aide de ce même
système (PEP-PTS) combiné à un permease à haute affinité. Chez les bactéries lactiques
homofermentaires, ces composés hydrocarbonés, une fois à l'intérieur de la cellule, sont
catabolisés selon deux voies principales : la voie glycolytique principale de Embden-Meyerhof-
Parnas (EMP), la voie du D-tagatose-6-phosphate (Desmazeaud, 1983). Ces différentes voies de
la glycolyse finissent toutes ultimement par la conversion du pyruvate en acide lactique (lactate).
Les bactéries lactiques homofermentaires comme les lactocoques transforment ainsi 1 molécule
de glucose en 2 molécules de lactate tandis que les bactéries dites hétérofermentaires, par
exemple certains lactobacilles, convertissent 1 molécule de glucose en 1 molécule de lactate, 1
molécule de CO2 ainsi qu'une molécule d'éthanol ou d'acétate.

La glycolyse, par la formation d'acide lactique, joue un rôle essentiel en acidifiant le lait. Cette
acidification, en plus d'inhiber les microorganismes nuisibles, permet la coagulation du lait lors
du procédé fromager, l'activation de la synérèse du caillé de même que la solubilisation du
calcium micellaire qui ont une influence déterminante sur la texture des fromages. Les produits
issus de la glycolyse peuvent à leur torn être métabolisés en composés aromatiques, selon la
variété de fromage et les bactéries fermentant les sucres (McSweeney et Sousa, 2000).

1.6.2 La lipolyse
La dégradation lipidique, la réestérification des acides gras libres (AGL) de même que leur
dégradation oxydative représentent les trois voies de transformation de la matière grasse
fromagère au cours du processus d'affinage. La lipolyse, quoique faible chez les bactéries
lactiques, contribue au développement de la saveur et l'arôme des fromages, de par la formation
d'acides gras libres, eux-mêmes précurseurs de divers composés aromatiques.

Les triglycérides, constituants majems de la matière grasse fromagère, sont hydrolyses au cours
de la maturation pom former des acides gras libres (AGL), des mono et diglycérides et
possiblement du glycerol (Singh et al., 2003). L'hydrolyse des triglycérides est effectuée par des
lipases et esterases pouvant provenir principalement du lait de fabrication, des bactéries lactiques

30
constituant le ferment ou bien encore de bactéries exogènes. Les lipases d'origine bactérienne
sont responsables de la formation des acides gras à longues chaines à partir des mono et
diglycérides. Les esterases, pour leur part, produisent des acides gras volatils. La concentration de
ces derniers est influencée par le pH du fromage puisque seuls les acides gras libres sous lem
forme protonnée contribuent à la flaveur et l'arôme des fromages. Les acides gras sont
nécessaires au développement de la flaveur typique des fromages à pâtes pressées cuites tel le
cheddar, et sont également précurseurs de méthylcétones, d'alcools, de lactones et d'esters
(McSweeney et Sousa, 2000; Curioni et Bosset, 2002). Un degré de lipolyse trop élevé ou mal
contrôlé durant l'affinage conduit cependant à l'apparition de défauts de saveur. La figure 1.2
illustre les voies générales de la dégradation des triglycérides et des acides gras.

Triglycérides
I Lipase
Acides gras

P-oxidation p-(î-oxidation
i
Acides gras
insaturés
4- ou 5-
hydroxy acides
P-cétoacides Hydroxyperoxydes

Acides gras
Méthylcétones
libres v-v- ou-6- lactones Aldhéydes
1
Alcools
secondaires Acides Alcools

Figure 1.2 Principales voies de la lipolyse (McSweeney et Sousa, 2000; Gagnon, 2006)

31
1.6.3 La protéolyse
Événement majeur de la maturation fromagère, la protéolyse des caséines en peptides consume
un phénomène complexe. Cette complexité est liée à la nature même des protéines du lait, du
nombre important d'enzymes protéolytiques présentes dans la matrice fromagère de même
qu'aux nombreuses voies possibles de dégradation. La protéolyse doit son importance au fait
qu'elle contribue au processus d'affinage de multiples façons : (i) en modifiant la texture du
fromage de par l'hydrolyse du réseau protéique, (ii) en apportant des changements de saveurs par
la formation de peptides et d'acides aminés libres et (iii) en se servant de ces acides aminés libres
en tant que substrats pom des réactions cataboliques secondaires (désamination, transamination,
decarboxylation, désulfuration) de même que pom le catabolisme des acides aminés. Les acides
aminés libres produits au corns de la protéolyse sont en fait d'importants précurseurs d'une
multitude de réactions cataboliques produisant des composés volatils essentiels pom la flaveur du
fromage (McSweeney et Sousa, 2000). La caractérisation de l'activité enzymatique des souches
bactérienne de même que leur relation avec le développement des flaveurs des fromages a fait
l'objet de plusieurs émdes ces dernières années (Tannous et al., 2002). Aujourd'hui, les souches
composant les ferments en fromagerie sont sélectionnées selon leurs caractéristiques
enzymatiques particulières dans un but d'accélérer la formation de divers composés, d'intensifier
une saveur particulière ou bien encore de diversifier les arômes.

Les enzymes impliquées dans le processus de la protéolyse proviennent de la présure, du lait, des
ferments lactiques utilisés, de même que des NSLAB de la flore secondaire (Singh et al., 2003).
La présure utilisée en fromagerie est responsable de l'hydrolyse primaire des caséines, formant
ainsi des peptides de différentes tailles, solubles ou non dans la phase aqueuse du fromage, qui
seront éventuellement dégradés par les enzymes des bactéries lactiques. Ces peptides sont par la
suite dégradés en petits peptides et acides aminés libres par l'action des peptidases et proteinases
de nature bactérienne. De façon générale, tous les composés azotés d'un fromage en début
d'affinage sont insolubles. Par la suite, la quantité d'azote soluble augmente proportionnellement
avec le temps de maturation des fromages, démontrant ainsi l'évolution du processus d'affinage
(Foster et al., 1961). La figure 1.3 illustre les principales voies de dégradation des protéines du
caillé au cours de l'affinage des fromages.

32
 I PROTEINES DU CAILLE |

I
| PEPTIDES I| (dont certains sont amers)
1 proteinases
ou endopeptidases

Jases
cartwxypeptidase Q aminopeptidase @ dipeptidase© ou exopeptidases

l I I
T
r
J A CIDES AMINES*]-

Désaminations
T
Transaminations ( J ) Decarboxylations Q Dégradations ©
oxydatives ( £ ) ■

NH, T
a-céto-acides

Indole

Alcools Acides Composes soufrés

Figure 1.3 Principales voies de dégradation des protéines du caillé au corns de l'affinage des
fromages (Mietton et al., 1994)

33
Les bactéries lactiques du geme Lactococcus et Streptococcus sont qualifiées de faiblement
protéolytiques mais possèdent néanmoins un système de peptidase/proteinase bien connu et
largement étudié (Christensen et al., 1999 ; Law et al., 1997). Des émdes comparant la protéolyse
d'un fromage Cheddar fait avec ou sans ferment lactique ont démontré l'importance de
l'utilisation de ces microorganismes pour la libération de petits peptides et acides aminés au fil de
l'affinage (Lynch et al., 1996; Lane et Fox, 1996; Farke et al., 1995). Les bactéries lactiques
possèdent dans la grande majorité une proteinase membranaire (PrtP), plusiems
oligoendopeptidases intracellulaires (PepO et PepF), au minimum 3 aminoeptidases générales
(PepN, PepC et PepG) ainsi que plusiems aminopeptidases spécifiques (PepA, PCP, PepL, PepX,
PepI, PepR, PepQ, PepV et PepT) (McSweeney et Sousa, 2000). La proteinase membranaire
contribue à l'hydrolyse des peptides provenant de la dégradation des caséines afin de former de
petits peptides. Les aminopeptidases, dipeptidases ainsi que les tripeptidases (intracellulaires)
sont libérées dans le milieu extracellulaire lors de la lyse bactérienne. Elles sont responsables de
la production d'acides aminés libres (AAL) dans le fromage, produits finaux de la protéolyse.
Dans le cas du fromage Cheddar, les principaux acides aminés libres retrouvés sont l'acide
glutamique (glutamate, Glu), la leucine (Leu), l'arginine (Arg), la lysine (Lys), la phenylalanine
(Phe) ainsi que la serine (Ser). La concentration de ces acides aminés libres augmente au corns de
l'affinage des fromages.

1.6.3.1 Le catabolisme des acides aminés

Le catabolisme des acides aminés est un phénomène capital pour la formation de flaveurs chez
les fromages. Ce processus conduit principalement en la formation d'aldéhydes, d'alcools et de
dérivés provenant du catabolisme d'acides aminés aromatiques, ramifiés et soufrés, tous reconnus
comme étant les principaux contributeurs au développement des flaveurs (Christensen et
Reineccius, 1995; Rijnen et al., 1999; Engels et al., 2000). L'intensité de la flaveur développée
est directement liée à la conversion des acides aminés en composés aromatiques, donc dépend de
l'activité enzymatique des souches lactiques utilisées (Yvon et Rijnen, 2001).

34
Les enzymes principalement retrouvées dans le catabolisme des acides aminés sont des
decarboxylases, des désaminases, des transaminases ainsi que des désulfurases (McSweeney et
Sousa, 2000). Les émdes ayant été réalisées sm le processus du catabolisme des acides aminés
indiquent que celui-ci s'effectue en deux étapes majeures. La première étape est la transamination
et est catalysée par des aminotransferases, dépendantes du cofacteur pyridoxal-5'-phosphate
(PLP) (Yvon et al., 1998; Engels et al., 2000). Les aminotransferases catalysent le transfert du
groupement amine d'un acide aminé vers l'accepteur final : l'a-ketoglutarate. Les recherches des
dernières années sur les aminotransferases ont conduit à la purification et à la caractérisation de
deux importantes aminotransferases chez L lactis ssp lactis et cremoris, soir 1'aminotransferase
aromatique (ATar) ainsi que 1'aminotransferase ramifiée (ATram) (Yvon et al., 1997; Engels et
al., 2000; Yvon et Rijnen, 2001). L'aminotransferase aromatique (ATar) a pom cible les acides
aminés aromatiques (Phe, Tip, Tyr, His) de même que la leucine (Leu) et à la methionine (Met).
L'aminotransferase ramifiée, pour sa part, est spécifique aux acides aminés ramifiés (Leu, Ile,
Val, Met).

La deuxième étape du catabolisme des acides aminés consiste en la conversion des composés
issus des transaminations initiales en aldéhydes (McSweeney et Sousa, 2000). Cette étape est
catalysée par des désaminases. Les aldéhydes formés sont ultimement convertis en alcools ou en
acides, selon une réaction de réduction et d'oxydation, respectivement.

1.6.3.1.1 Le catabolisme du glutamate

D'importantes quantités de glutamate sont produites à l'intérieur de la matrice fromagère suite à
la dégradation des caséines lors de la protéolyse. Ce fait est attribué premièrement à la teneur
élevée en glutamate entrant dans la composition des caséines (Croguennec et al., 2008). D'autre
part, certains acides aminés produits au cours de la protéolyse (Asp, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp et
Val) peuvent être par la suite transformés en glutamate par des réactions de transaminations
(Williams et al., 2002; Poveda et al., 2004).

Le catabolisme du glutamate chez les bactéries lactiques peut être initié à partir de 3 enzymes : la
glutamate-aminotransférase (GAT), la glutamate déshydrogénase (GDH) ainsi que la glutamate

35
decarboxylase (GAD) (Christensen et al., 1999). L'activité de la GAT et de la GDH résulte en la
formation d'a-kétoglutarate. Ce dernier composé est déterminant dans le développement de la
flaveur des fromages puisqu'il est l'acceptem principal des réactions de transaminations
responsables de la conversion des acides aminés en composés aromatiques. L'addition d'a-
kétoglutarate à un fromage à pâte ferme a d'ailleurs démontré une augmentation du
développement d'arômes, résultat du catabolisme des acides aminés ramifiés et aromatiques
(Yvon et al., 1998; Banks et al., 2001). L'intensité de l'activité enzymatique de la GDH chez les
lactocoques n'est cependant pas encore claire, suite aux rapports contradictoires des émdes de
Misono (1985) et de l'équipe de Lapunade et al. (1998). La glutamate decarboxylase (GAD),
pour sa part, catalyse la formation d'acide gamma-aminobutyrique (GABA) et libère une
molécule de gaz carbonique (CO2).

1.6.3.1.2 Formation du GABA chez les bactéries

Le processus de conversion du glutamate en GABA chez les microorganismes est déclenché afin
de réguler le pH intracellulaire et joue donc un rôle physiologique important. En effet, l'enzyme
GAD est activée dans le but de résister à l'acidité accrue du milieu environnant. En présence d'un
milieu acide, la GAD convertit une molécule de glutamate en une molécule de GABA,
impliquant la consommation d'un proton (H+) intracellulaire. L'effet net de cette réaction de
decarboxylation est de réduire la concentration intracellulaire des protons et ainsi limiter
l'acidification du cytoplasme (Gale, E.F., 1946; Bearson et al., 1997; Cotter et al., 2001). La
figure 1.4 illustre ce mécanisme de défense contre l'acidité.

36
 Glutamate

Anaérobiosi

Figure 1.4 Mécanisme de défense contre l'acidité chez la cellule bactérienne L. lactis (Bearson et
al., 1997; Lacroix, 2008)

L'enzyme GAD est normalement retrouvée chez les microorganismes devant transiter à
l'intérieur du système digestif comme E. coli (Smith et al., 1992), Shigella flexneri (Waterman et
Small, 1996) et Clostridium perfringens (Cozzani et al., 1970) mais a été également recensée
chez des bactéries marines (Mountfort et Pybus, 1992) et caractérisée chez des bactéries lactiques
telles Lactobacillus paracasei (Komatsuzaki et al, 2005 & 2008) et Lactococcus lactis ssp lactis
(Nomma et al, 1999a et b & 2000). Plusiems facteurs tendent à influencer l'activité enzymatique
de la GAD et, par le fait même, la production de GABA. L'activité enzymatique de la GAD est
déclenchée à de faibles pH (5,5) et est optimale à un pH compris entre 4,7 et 5,0. Il a été
également démontré que des conditions anaérobiques appliquées pour la croissance
d'Escherichia coli favorisaient la production de l'acide gamma-aminobutyrique (Bearson et al.,
1997; Tsushida et Murai, 1987). La pression osmotique du milieu semblerait aussi affecter
l'activité enzymatique de la GAD. En effet, des travaux effectués par Mountfort et Pybus (1992)

37
ont vérifié l'effet de la salinité sur la production de GABA chez certaines souches bactériennes.
La quantité de GABA formée par Corynebacterium était plus élevée à une concentration de
0,03M de NaCl qu'à 0,33M.

Plus récemment, les travaux de Komatsuzaki et al. (2005) ont porté sur l'effet de la concentration
de glutamate disponible et de l'ajout d'un coenzyme de la GAD, le pyridoxal phosphate. Ce
dernier, lorsqu'additionné au milieu de croissance de Lactobacillus paracasei, augmente
significativement l'activité de la GAD. Il en va de même pour la quantité de substrat ajoutée au
milieu : l'activité de la GAD augmente de façon linéaire avec l'ajout en glutamate jusqu'à une
concentration de 500mM, après quoi la croissance cellulaire de Lb paracasei était inhibée. Ces
résultats sont supportés par les travaux de Lacroix (2008), qui étudia l'effet de la concentration en
glutamate combinée à la concentration en NaCl du milieu sur la production de GABA par des
souches de L. lactis ssp lactis. Les résultats démontrent une production maximale de GABA à des
taux variant entre 0% et 2% en NaCl. D'autre part, cette même étude corrélait l'augmentation de
la production d'acide gamma-aminobutyrique par la GAD avec des taux de plus en plus élevés de
glutamate (jusqu'à 50 mM). Cet effet linéaire était cependant infirmé par une plus forte pression
osmotique (4% NaCl).

Des émdes démontrent que du GABA, produit issu de l'activité de la GAD, a été détecté chez
différents types de fromages (Nomma et al., 1998; Siragusa et al., 2007). Nécessitant la présence
de glutamate, le GABA est produit principalement an cours de l'affinage lors de la protéolyse des
caséines. Combinant de faibles pH, des conditions anaérobiques au sein de la matrice fromagère
de même qu'une libération de glutamate au corns de l'affinage, les fromages présentent donc un
support favorable à la production de GABA. Cependant, bien que les bactéries lactiques soient
abondamment utilisées en industrie fromagère, peu de travaux ont été publiés sm l'optimisation
de la production de GABA par les bactéries lactiques des ferments lors des fabrications
fromagères. Les travaux de Nomma et al. (1998) démontrèrent toutefois qu'une quantité
maximale de 38 mg de GABA/100g de fromage expérimental de type cheddar pouvait être
produite. D'autre part, aucune étude ne relate les effets du GABA sm les propriétés physico-
chimiques des fromages telles la flaveur et la texture. Seule l'équipe de Zoon et Allersma (1996)
détectèrent la formation de fentes et d'ouvertures chez certains fromages renfermant du GABA,

38
pouvant être associé à la réaction de decarboxylation qui libère du CO2 lors de la formation de
l'acide.

Treize ferments naturels recueillis dans des fromageries canadiennes au corns des années
soixante ont été conservés sous forme lyophilisée au Centre de Recherche et Développement des
Aliments (CRDA) ainsi qu'au centre STELA de l'Université Laval. Les émdes de Lacroix (2008)
révélèrent que deux de ces ferments produisaient du GABA et neuf souches de L. lactis ssp lactis
ayant la capacité de le synthétiser ont pu être isolées. Le GABA est soluble dans l'eau et se
retrouve donc dans la fraction azotée soluble des fromages (azote soluble dans l'eau {NSE), WSN
en anglais) et peut être quantifié à l'aide de la chromatographie en phase gazeuse couplée à la
spectrométrie de masse (GC-MS), comme la plupart des composés aromatiques (Manning et
Moore, 1979).

1.6.3.1.3 Intérêt du GABA pour la santé humaine

Le GABA est un neurotransmetteur agissant directement sm le système nerveux central et a la
propriété de diminuer la pression artérielle. Cet effet hypotenseur serait principalement dû à la
capacité du GABA à bloquer les ganglions périphériques ainsi qu'à inhiber la noradrenaline
relâchée par les terminaisons nerveuses sympathiques, se traduisant par une baisse de la
fréquence cardiaque et de la force contractile des muscles du cœur (Stanton, 1963; Hayakawa et
al., 2004).

Cet effet hypotenseur a d'ailleurs fait l'objet de plusieurs émdes chez les animaux (Tkahashi
etal., 1955; Stanton, 1963; Lacerda et al., 2003) de même que chez les humains (Elliott et
Hobbiger, 1959), dans lesquelles le GABA était injecté par voie intraveineuse. Au corns de la
dernière décennie, des travaux ont porté sur l'effet hypotenseur de certains laits fermentes
contenant du GABA chez les rats hypertendus (Aoki et al., 2003; Hayakawa et al., 2004) ainsi
que chez les humains ayant une pression artérielle modérément élevée (Inoue et al., 2003,
Kajimoto et al., 2003). Des doses orales de 100ml de lait fermenté renfermant entre 10 et 12 mg
de GABA abaissaient significativement la pression artérielle chez les humains. L'intérêt
grandissant pom ce composé naturel hypotenseur fait maintenant l'objet de nouveaux

39
développements d'aliments fonctionnels renfermant du GABA en Asie et en Italie (Tsukatani et
al., 2005; Chen et al., 2009; Nakamura et al, 2009; Minervini et al., 2009).

40
 PROBLEMATIQUE, HYPOTHESE ET OBJECTIFS

Problématique

Le fromage Cheddar représente, au Canada et particulièrement au Québec, le principal type de

fromage produit et consommé en 2006 (Statistiques Canada, La revue laitière, 2006). Les
ferments lactiques utilisés pour la fabrication de cette variété de fromage sont constitués
principalement des souches de lactocoques, tel L. lactis ssp lactis et L. lactis ssp cremoris,
sélectionnées d'abord pom lem pouvoir acidifiant de même que lems propriétés aromatiques
particulières ou lems caractéristiques technologiques. Parmi les souches de bactéries lactiques
isolées et caractérisées, certaines ont la capacité de produire l'acide y-aminobutyrique (GABA).
Cet acide est un neurotransmetteur reconnu pom son effet hypotenseur sur le système nerveux
central et a fait l'objet d'études sur les rats et les humains (Takahashi etal., 1955; Stanton, 1963;
Lacerda et al., 2003; Elliott et Hobbiger, 1959). Plus récemment, un lait fermenté contenant du
GABA administré à des patients hypertendus a également engendré une baisse significative de la
pression artérielle (Inoue et al., 2003, Kajimoto et al., 2003). La glutamate decarboxylase (GAD)
catalyse la formation de GABA à partir du glutamate. L'activité enzymatique de la GAD est
optimale à faible pH (4,8-5,0) ainsi qu'en milieu anaérobie.

Les travaux menés par Lacroix (2008) permirent d'isoler et de caractériser des souches de
lactocoques provenant de ferments traditionnels canadiens des années 60. Parmi ces souches,
neuf souches de L. lactis ssp lactis ont démontré la capacité de produire du GABA. Les essais
concernant l'effet hypotenseur du GABA sm les humains ont été réalisés à partir de lait fermenté
(Inoue et al., 2003). Aucune étude n'a tenté de produire un fromage enrichi naturellement en
GABA, aliment fermenté présentant pourtant des conditions favorables à la production de cet
acide hypotenseur, en raison de son faible pH (< 5,0), de sa faible teneur en oxygène de même
que la présence de glutamate au sein de la matrice fromagère.

Le but de ce projet est d'utiliser les souches L. lactis ssp lactis productrices de GABA afin
d'élaborer un fromage de type Cheddar renfermant du GABA. Les souches lactiques PRT"
n'étant pas capables d'acidifier suffisamment le lait dans des conditions de fromagerie, il est
essentiel de les associer avec des souches PRT+. La biocompatibilité des souches de L. lactis ssp

41
lactis productrices de GABA et proteases négatives (PRT) a été évaluée avec des souches
commerciales de L. lactis ssp cremoris proteases positives (PRT+). Par la suite, il a été possible
de déterminer les conditions optimales de production de GABA dans le fromage à l'aide de
caillés modèles pom les reproduire ensuite en usine pilote lors de fabrications de fromages
cheddar. Enfin, les paramètres physico-chimiques et les propriétés sensorielles furent étudiés afin
d'évaluer l'impact de la formation de GABA sur les caractéristiques du fromage au cours de
l'affinage.

42
Hypothèse

77 est possible de fabriquer un fromage enrichi naturellement en GABA en utilisant des souches
de lactocoques productrices de GABA.

Objectifs spécifiques

1. Évaluer la biocompatibilité des souches productrices de GABA {L. lactis ssp. lactis) avec
des souches de lactocoques PRT+ {L. lactis ssp. cremoris)
2. Déterminer l'impact des paramètres de fabrication fromagère sur la production de GABA
par les souches productrices en combinaison avec une souche L. lactis ssp. cremoris à
l'intérieur de caillés modèles
3. Analyser la composition et évaluer les propriétés sensorielles des fromages de type
Cheddar enrichis naturellement en GABA

43
 CHAPITRE 2

Biocompatibilité des souches productrices de GABA (Lc. lactis ssp lactis) avec une souche de
Lc. lactis ssp cremoris et optimisation de la production de GABA à l'intérieur de caillés modèles

2.1 Résumé

La biocompatibilité de neuf souches de Lc. lactis Prt" productrices de GABA en présence d'une
souche de Lc. cremoris Prt+ a été évaluée. La quantification de GABA produit pom chacune des
souches de Lc. lactis a été réalisée à partir d'un lait fermenté par Lc. cremoris, préalablement
enrichi en glutamate, et une étude de proximité génétique entre ces souches a également été
menée. La quantification du GABA produit pour chacune des souches de Lc. lactis de même que
l'étude proximité génétique ont permis de mettre en évidence des différences entre les souches et
de sélectionner deux souches productrices de GABA, A23 et H13, biocompatibles avec la souche
industrielle Lc. cremoris W62. L'effet de certains paramètres de maturation fromagère sur la
production de GABA a ensuite été évalué dans des caillés modèles, affinés à 30°C pendant 10
jours. Le pH s'est avéré le facteur le plus déterminant pour la production de GABA, avec une
production maximale à pH 4,8. Les souches se sont avérées également sensibles à un ratio
sel/humidité de 4,5%, où une quantité inférieure de GABA était observée. Une quantité maximale
de 0,79mg GABA/g caillé a pu être produite dans les conditions optimales (pH 4,8; 3,0mg
glutamate/g caillé; 3,0% sel/humidité).

44
2.2 Introduction
Les ferments lactiques utilisés pour la fabrication du fromage Cheddar referment généralement
des souches de lactocoques, telle Lc. cremoris et Lc. lactis, sélectionnées pom leur pouvoir
d'acidification ainsi que pom leurs propriétés aromatiques particulières. L'association de
différentes souches dans la formulation d'un nouveau ferment nécessite préalablement la
connaissance des interactions entre celles-ci, afin de prévenir des déséquilibres lors de la
croissance des souches et au corns de l'affinage, problématique conduisant à des changements
indésirables dans le produit. Ainsi, les souches présentant une relation de synergie pendant leur
croissance sont préférablement sélectionnées. Parmi les souches de lactocoques, certaines
présentent une croissance limitée après épuisement des acides aminés libres et des peptides du
lait. Ces souches, dites protéinases-négatives (Prf ), ne peuvent hydrolyser les caséines du lait afin
d'obtenir d'autres acides aminés, contrairement à leur variant protéinases-positives (Prf)
(Champagne, C.P., 1998). Les cultures mixtes des souches de lactocoques Prt+/Prf sont pourtant
largement utilisées en industrie fromagère, permettant ainsi de moduler l'acidité du caillé selon
deux vitesses d'acidification, rapide (Prt+), et lente (Prf) (Monnet et al., 2008). La formulation de
nouveaux ferments nécessite la connaissance des interactions existantes parmi les souches entrant
dans lem composition. Des émdes portant sm la biocompatibilité de ferments mésophiles et
thermophiles ont été réalisées antérieurement (Beal et Corrieu, 1991; Juillard et al., 1996b). La
spectrophotométrie automatisée (SA), a été utilisée couramment afin de d'étudier les cinétiques
de croissance bactérienne (Dalgaard et al., 1994; Begot et al., 1996) et permettre de révéler la
présence de factems de croissance ou d'agents inhibiteurs à l'intérieur d'un milieu (Skyttà et al.,
1993; Danish Standard, 2003). Plus récemment, cette même technique a permis d'étudier les
interactions entre des souches de bactéries lactiques à l'intérieur d'un ferment (Champagne et al.,
2009).

Parmi les souches de bactéries lactiques isolées et caractérisées, certaines ont démontré la
capacité de produire l'acide y-aminobutyrique (GABA) (Nomma et al., 1998 & 1999b;
Komatsuzaki et al., 2005; Lacroix et al., 2010). Cet acide est un neurotransmetteur reconnu pour
son effet hypotenseur sm le système nerveux central et a fait l'objet d'études sur les rats et les
humains (Takahashi et al., 1955; Stanton, 1963; Lacerda et al., 2003; Elliott et Hobbiger, 1959).
Il a été démontré qu'un lait fermenté contenant du GABA administré à des patients hypertendus a
engendré une baisse significative de la pression artérielle (Inoue et al., 2003, Kajimoto et al.,

45
2003). La caractérisation de la glutamate decarboxylase (GAD), enzyme responsable de la
conversion du glutamate en GABA, a permis de mettre en évidence l'effet de certains factems
favorisant la production de GABA (pH < 5,0, concentration en glutamate, absence d'oxygène,
présence de NaCl) (Bearson et al., 1997; Nomma et al., 1998 &1999a; Cotter et al., 2001;
Komatsuzaki et al., 2005). Malgré l'utilisation courante en industrie fromagère de Lc. lactis,
aucune souche productrice de GABA n'a cependant été utilisée dans le but de fabriquer des
fromages fonctionnels naturellement emichis en GABA.

Le but de cette étude est de déterminer le niveau de biocompatibilité entre des souches de Lc.
lactis Prt" productrices de GABA et de Lc. cremoris Prf à l'aide de la spectrophotométrie
automatisée (SA), et dans une optique éventuelle de concevoir un fromage aux propriétés
fonctionnelles, l'impact de certains paramètres de fabrication fromagère a ensuite été évalué à
l'aide de caillés modèles, afin de vérifier leur impact sur la production de GABA par les souches
productrices.

46
2.3 Méthodologie

2.3.1 Provenance des souches

Les souches de Lactococcus lactis ssp lactis productrices de GABA utilisées pour cette étude ont
été offertes au Centre de recherche en science et technologie du lait (STELA) de l'Université
Laval et au Centre de recherche et de développement sur les aliments de St-Hyacinthe par le Dr.
D.B. Emmons du Centre for Food and Animal Research (Agriculture et Agroalimentaire Canada,
Ottawa). Les différentes souches de lactocoques proviennent de 2 ferments lactiques collectés en
1968 dans des fromageries. Les souches de Lc. lactis ont pu être isolées et caractérisées, au cours
de travaux réalisés au centre STELA de l'Université Laval, par divers tests biochimiques ainsi
que sur une base de biologie moléculaire (hybridation de sondes à ADN 16S). Ces souches sont
présentées au tableau 1.1 tandis que les souches de Lc. cremoris industrielles sont quant à elles
présentées à l'intérieur du tableau 2.2.

Tableau 2.1 Liste des souches de Lc. lactis ssp lactis productrices de GABA

Genre et espèce Noms attribués

Lactococcus lactis spp. lactis ULAAC A23
Lactococcus lactis spp. lactis ULAAC A13
Lactococcus lactis spp. lactis ULAAC H02
Lactococcus lactis spp. lactis ULAAC H12
Lactococcus lactis spp. lactis ULAAC H13
Lactococcus lactis spp. lactis ULAAC H15
Lactococcus lactis spp. lactis ULAAC H20
Lactococcus lactis spp. lactis ULAAC H24
Lactococcus lactis spp. lactis ULAAC H27

47
Tableau 2.2 Liste des souches industrielles de Lactococcus lactis ssp. cremoris

Genre et espèce Noms attribués Provenance

DSM Food Specialities
Lactococcus lactis ssp cremoris LL074
Inc., NJ, É.-U.
DSM Food Specialities
Lactococcus lactis ssp cremoris LL225
Inc., NJ, É.-U.
DSM Food Specialities
Lactococcus lactis ssp cremoris LL390
Inc., NJ, É.-U.
Wisby, Danlac, Airdrie,
Lactococcus lactis ssp cremoris W62
Alberta, Canada

Toutes les souches étaient conservées à -80°C dans un milieu de lait concentré additionné de
sucrose (5%) et d'acide citrique (0,35%). À partir de ces échantillons, des stocks congelés ont été
préparés selon la méthodologie décrite en annexe 1.

2.3.2 Préparation des inoculums

Pom chacune des souches de Lc. lactis productrices de GABA, 9,0 ml de lait écrémé reconstitué
stérile à 12% (Dairytown products, Sussex, Nouveau-Brunswick, Canada) (p/p) supplémenté à
0,2% d'extrait de levure (DIFCO Yeast Extract, 212750, Maryland, É.-U.) ont été inoculés avec
1,0 ml (10% v/v) de bouillon de culture décongelé puis incubés à 21°C dans un bain
thermorégulé programmable (Bain Polystat ®, Cole Parmer modèle 12111-21 (28,5L), 2007)
pendant 15 heures. L'ajout d'extrait de levure était nécessaire puisque les souches productrices de
GABA étant proteases négatives (Prf) sont incapables d'hydrolyser les caséines du lait pour leur
croissance (Lacroix, 2008). Pom le deuxième repiquage, 9,9 ml de lait écrémé reconstitué à 12%
(p/p) stérile supplémenté avec 0,2% d'extrait de levure a été inoculé avec 100 pi (1% v/v) de la
pré-culture. Les laits ensemencés ont été incubés pendant 15 h à 21°C pour obtenir un pH final
entre 4,5 et 4,9. Pom la croissance des souches de Lc. cremoris Prf, la même procédure a été
utilisée mais les laits n'ont pas été enrichis d'extraits de levure.

Après le second repiquage des souches, un dénombrement a été effectué sm milieu agar M17
(OXOID LTD, CM0817, Basingstoke, Hampshire, England) suite à une série de dilutions à l'aide

48
de bouteilles d'eau peptonée (0,1%) renfermant 3 g de billes de verre afin de détruire les chaînes
de lactocoques par 40 agitations vigomeuses avant l'inoculation en plaques de Pétri par la
technique d'ensemencement dans la masse (St-Gelais et al., 1992). Les boîtes de Petri
ensemencées ont été incubées 48 hemes à 30°C en anaérobiose (5% CO2 : 10% H2 : 85% N2)
puis les bactéries (UFC/g de fromage) ont été dénombrées. Cette étape a été répétée trois fois afin
de générer une moyenne de comptes viables pom toutes les souches de Lc. lactis et de Lc.
cremoris utilisées.

2.3.3 Préparation d'extraits acellulaires pour le test de biocompatibilité

La méthodologie de Pearce utilisée pour la production d'extraits acellulaires est adaptée de
Champagne et al. (2009). Pom chacune des souches de Lc. lactis productrices de GABA et de
Lc. cremoris, 40 ml de lait écrémé (Pm Filtre, Lactancia, Parmalat, Victoriaville, Québec,
Canada) a été inoculé à partir des laits fermentes (section 2.3.2) de façon à obtenir une population
finale de 1,0 x IO7 bactéries par ml. Une solution de présure double force (Chymax Extra, Chr.
Hansen's Laboratory LDT, Mississauga, Ontario, Canada) a par la suite été ajoutée à 0,01%
(v/v). Les tubes étaient agités par inversion puis incubés dans un bain marie à température
programmable selon les paramètres présentés au tableau 2.3.

Tableau 2.3 Paramètres de température et de temps utilisés pour le test de Pearce lors de la
préparation des extraits acellulaires
Température Durée de l'étape Temps cumulé
Étape
(°C) (hh :mm) (hh :mm)
1. T=0, inoculation 32.0 00:00 00:00

2. T=l, Palier à 32.0 32.0 01 :00 01 :00

3. T=2, Montée progressive de la T° jusqu'à 37.5 32.0 ->37.5 00:30 01 :30

4. T=3, Palier à 37.5 (Cuisson) 37.5 00:30 02:00

5. T=4, Descente progressive de la T° jusqu'à 35.0 37.5 ->35.0 00:15 03:15

6. Palier final à 35.0 35.0 02:45 05:00

49
À la fin du test de Pearce, les tubes ont été centrifugés à 4470 x g pendant 30 minutes à 4°C
(Centrifuge Centra GP8R IEC, Thermofisher Scientific, Ontario, Canada). Les lactosérums ainsi
obtenus ont ensuite été ajustés à pH 7.5 à l'aide de KOH 5N. Les extrais acellulaires ont ensuite
été incubés dans des tubes à 50°C pendant 3 heures pom provoquer la précipitation du phosphate
de calcium en solution. Les tubes étaient centrifugés une seconde fois (4470 x g, 30 minutes, 4°C)
puis le pH des extraits a été ajusté à 6.5 avec du HCI IN. Enfin, les extraits acellulaires de
chacune des souches ont été stérilisés par filtration (filtres 0,22 pm, Millex ®, GP, Millipore,
Billerica, MA, É.U.) puis conservés à 4°C jusqu'à leur utilisation.

Tel que décrit par la méthode de Champagne et al. (2009), deux témoins ont été préparés pour
l'étude de biocompatibilité. Le premier témoin consistait en un lait acidifié par du glucono-S-
lactone (Sigma ®, Steinheim, Allemagne), choisi préférablement à l'acide lactique, pour ses
propriétés acidifiantes progressives, représentant plus fidèlement le profil d'acidification d'une
fabrication de fromage Cheddar. Ce témoin rendait possible la comparaison de la croissance des
souches dans les extraits acellulaires versus un milieu ayant connu une acidification chimique
dans lequel la protéolyse associée à l'action de la présure avait quand même eu lieu. Le bouillon
M17, second témoin, permettra d'observer la croissance des souches à l'intérieur d'un milieu
riche et optimal.

2.3.4 Étude de biocompatibilité par spectrophotométrie automatisée (SA)

2.3.4.1 Croissance et standardisation des inoculums

Les souches de Lc. lactis et de Lc. cremoris ont d'abord été inoculées à 10% (v/v) dans du lait
12% selon les mêmes conditions que décrites dans la section 2.3.1. Les laits fermentes ont été
transférés (1% v/v) dans du bouillon Ml7 puis incubés à 21°C pendant 15 heures. Au terme de
l'incubation, les tubes étaient centrifugés (4470 x g, 30 minutes, 4°C) puis le culot bactérien a été
lavé à 2 reprises avec de l'eau physiologique stérile (NaCl 0,9%), dans le but d'éliminer toute
trace du bouillon Ml7 qui pourrait influencer la croissance des souches dans les extraits
acellulaires lors des essais de spectrophotométrie. Les culots bactériens ont finalement été
resuspendus et standardisés dans de l'eau physiologique afin d'obtenir une population de 1 x 108
UFC/ml.

50
2.3.4.2 Biocompatibilité des souches

Le tableau 2.4 présente la planification des essais de biocompatibilité croisée par

spectrophotométrie automatisée pour les souches de Lc. lactis et de Lc. cremoris. Pour chacune
des souches évaluées, 200pl des différents extraits acellulaires de la sous-espèce opposée ont été
répartis en triplicata dans les puits d'une microplaque (Honeycomb™, Labsystems, Helsinki,
Finlande) puis inoculés avec 20pl de culture standardisée (paragraphe précédent) de façon à
obtenir une population finale de 1 x IO7 bactéries dans 220pl de volume total par puit. Les
microplaques ont par la suite été placées à l'intérieur d'une unité de Bioscreen C™ (Labsystems)
et incubées à 30°C pendant 24 heures. L'appareil était programmé afin de mesurer la densité
optique (DO) de chacun des puits à 600 nm toutes les 15 minutes. Avant chaque lecmre de DO la
microplaque était agitée automatiquement pendant 10 secondes à vitesse élevée. La
programmation de l'appareil Bioscreen C™ est détaillée en annexe 2. Trois répétitions ont été
effectuées et les moyennes obtenues ont été analysées.

Tableau 2.4 Résumé des essais de biocompatibilité entre les souches

BLOC BUT VISÉ

Vérifier si les souches de Lc. cremoris

1. Croissance des souches de Lc. lactis dans
l'extrait acellulaire produit par les souches Lc.
cremoris (LL074, LL225, LL390, W62)
2. Croissance de souches Lc. cremoris dans
l'extrait acellulaire produit par les souches de
Lc. lactis (A13, A23, H02, H12, H13, H15,
H20, H24, H27)
produisent des metabolites cellulaires
affectant la croissance des souches de Lc.
lactis. Discrimination potentielle de souches
de Lc. cremoris.
Vérifier si les souches de Lc. lactis produisent
des metabolites cellulaires affectant la
croissance des souches de Lc. cremoris.
Discrimination potentielle de souches de Lc.
lactis.

51
Les combes de croissance obtenues, présentant la variation de la densité optique (DO) en
fonction du temps, ont été modélisées selon l'équation de Corrieu suivante :

DO (t) = a - d x d
b
[ 1 + (t/c) ]

La modélisation des courbes a permis de calculer 3 paramètres : le temps de latence avant le

début de la croissance (Tlag), le taux de croissance maximal de la DO par unité de temps (Taux)
ainsi que la DO max à l'infini (DOmax) comme illustré à la figure 2.1.

DO600nm

DOmax

Temps (hr)
Tlag

Figure 2.1 Courbe de croissance modélisée présentant l'évolution de la D.O. en fonction du

temps ainsi que les paramètres de croissance Tlag, Taux et DOmax

52
2.3.5 Quantification du GABA par les souches productrices
Parallèlement aux tests de spectrophotométrie automatisée (SA), des essais ont été effectués afin
de quantifier la production de GABA pom chacune des souches de Lc. lactis et de Lc. cremoris
en présence de glutamate. Cette partie expérimentale avait pour but de comparer la productivité
en GABA des souches de Lc. lactis et de confirmer que les souches de Lc. cremoris étaient dans
l'incapacité d'en produire, comme l'avait démontré Nomma et al. (1999b). Pom la préparation
des précultures, du lait écrémé reconstitué à 12% (p/p) en solides totaux a été ensemencé avec
chacune des souches (10% v/v), provenant de cultures congelées, puis incubé à 21°C pendant 15
hemes. Par la suite, 10 ml de lait écrémé stérile à 12%(p/p) refermant lOmM de glutamate (L-
glutamic acid, Sigma ®, Steinheim, Allemagne) ont été inoculés (1% v/v) avec chacune des
précultures. L'incubation de chacune des souches a été réalisée à l'intérieur de tubes stériles en
verre de 20 ml avec espace de tête (Agilent Technologies, PaloAlto, Californie, É.-U.) scellés
sous la hotte anaérobique à l'aide de bouchons à rebords en aluminium de 20 mm avec un cloison
PTFE/Si (Agilent Technologies). Ces derniers ont été incubés à 30°C pendant 5 jours afin
d'accélérer la formation de GABA par les souches productrices.

Les laits fermentes ont ensuite été transférés à l'intérieur de tubes de 15 ml afin d'être centrifugés
à 5000 g pendant 20 minutes à 25°C (Sorvall RC-5B Refrigerated Superspeed centrifuge, GMI
Inc., Ramsay, Minnesota, É.-U.). Le surnageant a été collecté puis transféré à l'intérieur de
cryovials et conservé à -20°C jusqu'au moment de l'analyse. Les échantillons de surnageant ont
ensuite été dérivés à l'aide de la trousse EZ :faast™ GC-MS Physiological Amino Acid Analysis
(Phenomenex, Torrance, Californie, É.-U.) et analysés par chromatographie en phase gazeuse
couplée à un spectromètre de masse (GC MS 5973 Network Mass Selective Detector, Agilent
Technologies) connecté à un échantillonneur d'espace de tête (G1888 Network Headspace
Sampler, Agilent Technologies). Les conditions de chromatographie sont détaillées en annexe 3.
Le GABA a été identifié par comparaison de son spectre de masse avec celui du National
Institute of Standards and Technology Mass Spectral Database (NIST, 1998). La conversion des
résultats obtenus par GC-MS en mg de GABA est détaillée à l'annexe 4.

53
2.3.6 Étude de proximité génétique entre les souches productrices de GABA
La caractérisation génétique des neuf souches de Lactococcus lactis productrices de GABA
utilisées dans cette étude a été réalisée par un séquençage de l'ADNr 16S afin de confirmer
l'identification de l'espèce de chacune des souches. Par la suite, le profil plasmidique des souches
a été déterminé à l'aide d'endonucléases de restriction (EcoRV et Hindlll). Enfin, la
différenciation des souches au niveau chromosomique a été mise en évidence par le profil PFGE
suite à une digestion du chromosome à l'aide de l'enzyme Smal.

2.3.7 Détermination des conditions optimales pour la production de GABA à l'intérieur

d'un caillé modèle

2.3.7.1 Préparation des inoculums

Pour cette partie de l'expérimentation, seule la souche Lc. cremoris W62, la plus biocompatible,
a été retenue pour la suite de l'étude. Elle a été combinée avec les souches productrices de GABA
ayant démontré une bonne biocompatibilité combinée à une bonne capacité de produire du
GABA.

Des précultures de chacune des souches ont été préparées dans du lait écrémé stérile à 12% (p/p)
tel que décrit dans la section 2.3.1. Du bouillon M17 a ensuite été inoculé avec chacune des
précultures et incubé à 21°C pendant 15 hemes. Les cellules bactériennes ont par la suite été
concentrées par centrifugation (5000 x g, 30 minutes, 4°C), lavées à l'aide d'un tampon
phosphate1 0,1 M à pH 6.0 et finalement resuspendues dans un volume du même tampon
phosphate de façon à obtenir une concentration finale de 1 x 1010 UFC/ml. Les concentrations en
populations bactériennes ont été vérifiées et confirmés en milieu Ml7 agar après incubation en
anaérobiose pendant 48 heures à 30°C.

1
Les phosphates ainsi que les citrates représentant d'importants composés de la fraction minérale du lait (St-Gelais
et al., 2002), l'utilisation d'un tampon à base de ces minéraux en faible concentration ne devrait pas modifier
significativement la composition des caillés modèles.

54
2.3.7.2 Production d'un caillé sans ferment

Un fromage de type pâte pressée sans ajout de ferment a été produit au Centre de recherche et
développement sur les aliments (Saint-Hyacinthe, Qc, Canada) selon la méthode décrite par
Lacroix et al. (2010) avec quelques modifications. Ainsi, une solution de chlorure de calcium à
33% (p/v) (à raison de 20 ml solution / 100L de lait) a été ajoutée à 400 litres de lait entier
préalablement pasteurisé (72°C/20sec). Le lait a par la suite été chauffé jusqu'à 30°C. Après 1
heure, un mélange composé de 80 mL de présure double force, de 1.354 kg de poudre de
glucono-5-lactone (Aldrich, St-Louis, MO), dilué dans 5.33L d'eau, ont été ajoutés au lait. Le lait
a été agité pendant 1 minute puis laissé au repos pendant 30 minutes pour la coagulation. Le gel
fut par la suite coupé et la température graduellement augmentée pendant 30 minutes de 30°C à
38°C. Après 30 minutes à 38°C, le lactosérum fut soutiré (pH d'environ 5,70). Le caillé ainsi
obtenu fut pressé à l'aide d'une presse hydraulique à 40 PSI (300 kPa) pendant 2 heures à
température de la pièce à l'intérieur de moules munis de cotons à fromages. Le caillé pressé a été
par la suite égrainé puis congelé à -32°C. Enfin, le caillé congelé fut lyophilisé puis finement
réduit en poudre à l'aide d'un broyem à disques (GlenMills Inc., Clifton, NJ, É.-U.). La
composition de la poudre est présentée à l'annexe 5. Afin de limiter les problèmes de
développement de contaminants microbiens à l'intérieur des caillés modèles, la poudre de caillé
lyophilisé a finalement subit un traitement d'irradiation de 5kGray pendant 5 minutes pour être
ensuite emballée à l'intérieur de sacs stériles, puis conservés sous congélation (-32°C) jusqu'à
son utilisation.

2.3.7.3 Préparation des caillés modèles

Les caillés modèles simulant les conditions de composition de Cheddar ont été préparés tel que
décrit par Lacroix et al. (2010) avec quelques modifications. Pom vérifier l'effet des paramètres
de fabrication fromagère sm la production de GABA, deux différents ratios sel/humidité (S/H)
(3,0% et 4,5%) ont été combinés à deux concentrations initiales en glutamate (1,0 mg/g (6,8 mM)
et 3,0 mg/g de caillé modèle (20,3 mM)) et à 3 pH (4.8, 5.1 et 5.4). Ces valeurs de S/H, de
concentrations en glutamate ainsi que de pH ont été sélectionnées suite aux analyses effectuées
sur différents fromages commerciaux (annexe 6). La figure 2.2 présente un résumé des différents
traitements effectués dans les caillés modèles. Douze tampons citrates ont d'abord été préparés
selon les différentes combinaisons de pH, tenem en NaCl et en glutamate mentionnées

55
précédemment. Après dissolution des composés, les tampons ont été filtrés (0,22p) puis
conservés stérilement à 4°C jusqu'à lem utilisation. Chacune des combinaisons a ensuite été
inoculée avec 2 ferments différents (F), composé d'une des deux souches productrices de GABA
Lc. Lactis (A23 et H13) en combinaison avec la souche Lc. cremoris W62 selon un ratio 2 :1 ,
constituant de ce fait 24 traitements à l'étude. En résumé, le modèle présenté à la figure 2.2 à 1,0
mg glu/g de caillé et à pH 4,8 a été réalisé pour toutes les autres combinaisons de %S/H, pH,
teneur en glutamate et ferments.

Ratio 3,0% S/H Ratio 4,5% S/H

/ \ / \
1,0 mg glu/g caillé 3,0 mg glu/g caillé 1,0 mg glu/g caillé 3,0 mg glu/g caillé

pH4,8 pH5,l pH5,4 ...

F A23 :W62 F H13 :W62

Figure 2.2 Résumé des 24 traitements à l'étude à l'intérieur des caillés modèles

Pour chacun des traitements, 100 g de caillé modèle ont été produits comme suit. Afin d'obtenir
un pH fixe à l'intérieur de la pâte, 33.02ml de tampon citrate aux pH 4.8, 5.1 et 5.4 ont été
ajoutés et homogénéisés respectivement avec 3,5 g, 2 g et 1 g de GDL2 puis additionnés de 58,5,

1
Lors d'essais préliminaires, 2 ratios souches Lc. lactis : Lc. cremoris (1 :1 et 2 :1) à l'intérieur de caillés modèles
ont été évalués. La ratio 2 : 1 a permis d'obtenir un meilleur taux de survie de survie des souches de Lc. lactis, donc
probablement une meilleure production de GABA dans le fromage.
2
Selon des essais préliminaires, ces quantités spécifiques de poudre de glucono-5-lactone (GDL) (3,5g, 2g et lg)
combinés au tampon citrate (pH 4.8, 5,1 et 5,4) permettaient l'obtention de pH fixes de 4.8, 5,1 et 5,4 au cours de la
maturation de 10 jours à 30°C

56
60,0 et 61,0 g de poudre de caillé modèle irradiée. Ainsi, après l'ajout de 4 mL de ferment (2,7
mL pour la souche Lc. lactis et 1,3 mL pom la souche Lc. cremoris), il était possible d'obtenir
100 g de caillé modèle avec mie teneur en humidité finale de 38% (p/p). 100 g de caillé modèle
contenait une population bactérienne de 4 x IO8 UFC/g, ce qui se rapproche des concentrations
cellulaires visées (Roberts et Wijesundera, 1995; Farke et al., 1995). La pâte de caillé modèle
était homogénéisée à l'aide d'un stomacher pour une durée de 3 minutes puis transférée à
l'intérieur de pots de verre ambrés vissés, préalablement lavés à l'aide d'une solution de chlore à
12% (v/v). L'oxygène fut éliminé en introduisant de l'azote gazeux dans l'espace de tête. Les
caillés ont été incubés à 30°C pendant 10 jours et les analyses ont été effectuées aux jours 1 et 10.
Un témoin de caillé modèle a été réalisé en remplaçant le volume de ferment par le même volume
d'eau déionisée.

2.3.7.4 Analyses microbiologiques

Afin de réaliser les dénombrements, 11 g de caillé modèle ont été homogénéisés dans 99ml d'eau
peptonée stérile (0,1%) à l'aide d'un Stomacher (Model 400, Seward Medical, London, UK) à
l'intérieur d'un sac conçu à cet effet. Les dilutions subséquentes ont été obtenues par l'utilisation
de bouteilles d'eau peptonée (0,1%) renfermant 3 g de billes de verre afin de détruire les chaînes
de lactocoques suite à 40 agitations vigoureuses avant l'inoculation sur milieu gélose Reddy,
milieu différentiel pom les souches Lc. lactis et Lc. cremoris (Reddy et al., 1972), en utilisant la
technique d'étalement (St-Gelais et al., 1992). Les boîtes de pétri ensemencées ont été incubées
48 hemes à 30°C en anaérobiose dans un incubateur (5% CO2 : 10% H2 : 85% N2) puis les
colonies spécifiques pour chacune des bactéries (colonies blanches-pourpres pom Lc. lactis et
colonies jaunes pour Lc. cremoris, développant de l'acidité sm pétri responsable du changement
de couleur) ont été dénombrées (UFC/g de fromage).

2.3.7.5 Quantification du glutamate et du GABA

La quantification du glutamate et du GABA à l'intérieur des caillés modèles a été réalisée à partir
de l'extrait d'azote soluble dans l'eau (NSE) (Kuchroo et Fox, 1982). Dix g de caillé modèle ont
été homogénéisés avec 40 g d'eau déionisée à l'intérieur d'un tube conique de 50 ml avec l'Ultra-
Turrax afin d'obtenir un facteur de dilution de 5.0 puis ces tubes ont été incubés dans un bain à
40°C pour une dmée de 1 heme. Les tubes ont été par la suite centrifugés (5000 x g, 4°C pendant
30 minutes). La couche de matière grasse à la surface fut enlevée et le surnageant, l'extrait NSE,

57
fut filtré sur un papier Whatman puis transféré à l'intérieur de cryovials. Le dosage du glutamate
et du GABA a été réalisé à l'aide de la trousse EZ:faast™ GC-FID Physiological Amino Acid
Analysis (Phenomenex, Torrance, Californie, É.-U.).

Après dérivation, les échantillons ont été analysés pom déterminer la concentration en glutamate
par la chromatographie en phase gazeuse (GC 6890N, Agilent Technologies, Santa Clara,
Californie, É.-U.) couplée avec un détecteur à flamme ionisante (FID). Les conditions de
chromatographie du GC-FID sont présentées à l'annexe 7. Le GABA a pu être quantifié par GC-
MS, selon les conditions de chromatographie présentées dans la section 2.3.4. Les résultats ont
été exprimés en mg de glutamate ou de GABA par gramme de caillé modèle. La conversion des
résultats est détaillée en annexe 4.

2.3.8 Analyses statistiques

Pour la section portant sur l'étude de biocompatibilité entre les souches, 3 répétitions ont été
effectuées pour chacun des blocs et les moyennes obtenues ont été analysées par une ANOVA
selon un plan expérimental en tiroirs. Le tiroir principal était représenté par les différents extrais
acellulaires et les souches ensemencées à l'intérieur de ces derniers représentant les sous-tiroirs.
Pom la quantification de GABA par les souches de Lc. lactis dans les laits fermentes, 3 essais ont
été effectués et les moyennes obtenues pom chacune des répétitions ont été analysées par une
ANOVA selon un plan factoriel complet. Enfin, pom l'étude reliée à l'optimisation des
conditions de production de GABA à l'intérieur des caillés modèles, 3 répétitions ont été
effectuées et les moyennes obtenues ont été analysées par une ANOVA selon un plan à tiroirs
multiples (split-split-plot design), le tiroir principal étant le ratio S/H, le sous-tiroir étant le pH
des caillés et les différentes souches productrices de GABA à l'étude représentant le sous-sous-
tiroir. Les différences significatives ont été testées à P < 0,05 avec la procédme SAS/STAT®
(SAS User's Guide, 1999).

58
2.4 RESULTATS ET DISCUSSION

2.4.1 Étude de biocompatibilité par spectrophotométrie automatisée (SA)

2.4.1.1 Croissance des 9 souches de Lc. lactis productrices de GABA dans le lactosérum des
souches Lc. cremoris LL074, LL225, LL390 et W62

Les figures 2.3 a, b et c présentent les graphiques des valeurs de Tlag (a), du Taux (b) et de la DO
max (c) obtenues par les 9 souches productrices de GABA en croissance dans les lactosérums
LL074, LL225, LL390, W62 et du témoin GDL. L'utilisation de témoins a permis de valider la
méthode avec un milieu optimal (M 17), où toutes les souches présentaient un taux et une DOmax
supérieurs aux lactosérums (données non présentées), contrairement au témoin GDL dans lequel
les valeurs obtenues était nettement inférieures comparativement au Ml7 en raison de son
contenu très pauvre en nutriments.

Pom le Tlag (Fig. 2.3a), des différences significatives {P < 0,05) entre les lactosérums ainsi
qu'une interaction significative entre les différents lactosérums et les souches GABA
ensemencées ont été observés. Les souches productrices de GABA ont présenté la valeur de Tlag
moyenne la plus faible (0,95 hr) dans le lactosérum LL390 et le Tlag moyen plus élevé (2,07 hrs)
dans le lactosérum W62. Dans le milieu LL390, les souches GABA Al3 et H02 ont obtenu la
même valeur de Tlagde que celles obtenues dans les milieux LL074 et LL225, la composition des
lactosérums LL074, LL225 et LL390 ne semblant pas influencer la valeur du temps de latence
pour ces souches. Les souches GABA H24 et H27 ont présenté des valems de Tlag supérieures
aux autres souches dans les lactosérums LL074 et W62, possiblement attribuable à la deletion de
ces milieux en nutriments essentiels pom ces bactéries. Les mêmes souches H24 et H27 ont
cependant montré un Tlag inférieur aux autres souches dans les milieux LL225 et LL390. Ces
résultats indiquent que les souches H24 et H27 sont plus biocompatibles avec les souches LL225
et LL390 que les souches LL074 et W62 pour le paramètre de Tlag. En général le lactosérum
produit par la souche LL390 permettait un début de croissance plus rapide que le lactosérum W62
pom les souches GABA.

En ce qui concerne le Taux (figure 2.3 b), paramètre de l'augmentation moyenne de la DO/heure,
les statistiques ont démontré un effet significatif du lactosérum, des différentes souches GABA
ensemencées ainsi qu'une interaction significative entre ces deux facteurs {P < 0,05). Les taux

59
moyens enregistrés dans les lactosérums W62, LL074, L1390 et LL225 ont respectivement été de
0,019, 0,016, 0,010 et 0,008 unités de D.O./heure. Les souches GABA A13, A23, H24 et H27 ont
démontré en général les taux moyens les plus élevés avec des valeurs de 0,0154, 0,0152, 0,0146
et 0,0140 unités de D.O./heure sauf dans le cas des milieux LL225 et GDL. Les souches GABA
possédaient un Taux supérieur dans le milieu témoin GDL que dans les milieux LL225 et LL390,
à l'exception des souches H24 et H27, dont les valeurs de Taux étaient similaires pour les 3
milieux. La concentration en nutriments générés par les souches LL225 et LL390 lors de leur
croissance dans le lait est sans doute insuffisante afin de permettre la croissance optimale des
souches GABA. Les souches LL074 et W62 pourraient détenir une activité protéasique élevée et
être à la fois peu exigeants au niveau de lems besoins azotés, laissant ainsi dans leur milieu de
nombreux nutriments disponibles. Le taux, définit comme étant l'augmentation de la D.O.
moyenne par unité de temps, représente la vitesse spécifique de croissance bactérienne. Cette
variable, caractéristique des souches, dépend également des conditions de culture comme le
milieu, le pH, la température, les concentrations en substrats et en produits ainsi que de l'aptitude
des souches à la croissance (souches rapides (Prt+) ou lentes (Prf)) (Béai et al., 1994). Les taux
moyens emegistrés dans les milieux W62 et LL074 ont été supérieurs aux valems obtenues pom
le milieu témoin GDL. Ces résultats démontrent que les souches LL074 et W62 apportent,
contrairement aux souches LL225 et LL390, certains nutriments favorisant la croissance des
souches GABA, soit de par lem poids moléculaire ou lem composition en acides aminés (St-
Gelais et al., 1993). De plus, ces peptides et acides aminés, provenant de la dégradation des
caséines du lait, sont métabolisés différemment d'une souche de à l'autre, selon leurs différences
génétiques comme le montrent les différents Taux des souches de Lc. lactis (Prf) dans un même
milieu (figure 2.3 b). D'autres phénomènes pourraient également expliquer ces observations,
comme la production de substances inhibitrices par les souches LL225 et LL390 lors de lem
croissance dans le lait, telle la diplococcine et la lactococcine A (Klaenhammer , 1993), limitant
la croissance des souches GABA.

Pour les valeurs de DOmax obtenues (figure 2.3 c), l'analyse statistique a révélé un effet
significatif du milieu utilisé ainsi que des souches GABA (P < 0,05). Aucune interaction
significative n'a cependant été observée entre ces deux factems. Le lactosérum W62 a permis
d'obtenir des DOmax significativement plus élevées que les lactosérums LL074, LL225 et
LL390. Les souches GABA H02, A23, A13 et H13 ont montré des DOmax significativement

60
plus élevées, avec des valeurs respectives de 0,121, 0,106, 0,105 et 0,104. Ces résultats diffèrent
des résultats présentés précédemment pom le Taux, où les milieux LL074 et W62 étaient
comparables. Ce même phénomène a été observé par l'équipe de Champagne et al. (2009), où les
paramètres de composition du milieu qui affectait le pmax différaient de ceux qui avaient un effet
sur la DOmax emegistrée. La valem de DOmax est reliée à la capacité du milieu à prolonger la
croissance microbienne. Par conséquent, la forme des nutriments retrouvés dans le milieu a un
impact direct sur les paramètres Taux et DOmax. Les acides aminés et les peptides libres
généreraient un Taux supérieur tandis que la DOmax serait régie par la concentration en facteur
azotés (Champagne et al., 2009). La composition ainsi que la concentration de ces nutriments
serait donc plus favorable dans le milieu W62 pour toutes les souches de Lc. lactis et plus
particulièrement pour la souche H02. Le métabolisme des nutriments peut varier entre les
souches, tel que discuté précédemment. Ainsi, les souches démontrant une DOmax supérieure
diffèrent de celles ayant présenté un taux de croissance plus élevé. Les souches Al3 et A23 ont
montré des valeurs supérieures pour ces deux paramètres.

Les souches de lactocoques peuvent présenter différentes valems de Tlag, Taux et DOmax à
l'intériem d'un même milieu de croissance. Cela dépend de plusiems factems, comme la
composition en nutriments du milieu, les besoins nutritionnels de la souche, son métabolisme et
sa capacité adaptative au milieu, par exemple en présence de substances inhibitrices (Juillard et
Richard, 1989; Champagne et al., 2009). Le choix d'une combinaison de bactéries lactiques pour
créer un ferment dépend de la synergie entre les souches donc d'un bon niveau de
biocompatibilité entre elles. Leur biocompatibilité permet une bonne acidification du lait et limite
le déséquilibre entre les souches lors de la production fromagère et au cours de l'affinage ce qui
augmente les chances de produire un fromage de qualité (Monnet et al., 2008), De ce fait,
considérant les paramètres de Taux et de DOmax, le milieu W62 semble le plus favorable à la
croissance des souches de Lc. lactis productrices de GABA. La souche Lc. cremoris W62 a donc
été conservée pom la suite de l'étude, afin d'évaluer sa croissance les lactosérums produits par
les différentes souches de Lc. lactis productrices de GABA.

61
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2.4.1.2 Croissance de la souche Lc. cremoris W62 dans les lactosérums des souches productrices
de GABA

Les résultats de cette partie sont présentés à la figme 2.4. Les différents lactosérums produits par
les souches GABA (A13, A23, H02, H12, H13, H15, H20, H24 et H27) n'ont pas eu d'effet
significatif sm la croissance de la souche Lc. cremoris W62 pom les paramètres Tlag, Taux et
DOmax. Les moyennes obtenues pour ces trois paramètres ont été respectivement de 1,578 ±
0,193 heures, 0,12 ± 0,001 unités de D.O./hr ainsi que 0,041± 0,006.

Les valeurs moyennes de Tlag ainsi que du taux de croissance sont comparables à celles obtenues
par les souches productrices de GABA. Cependant, la DOmax moyenne emegistrée pour la
souche W62 dans les lactosérums des souches productrices de GABA (0,041) est nettement
inférieme à celle emegistrée par les souches GABA dans le lactosérum W62 (0,14). Tel que
mentionné précédemment, la DOmax d'une souche est principalement influencée par la
concentration en nutriments azotés (Champagne et al., 2009). Les souches productrices de GABA
dans cette étude étant Prf, elles ne possèdent pas d'activité protéasique permettant d'hydrolyser
les caséines (Champagne, C.P., 1998). À l'intérieur du lait, ces souches utilisent les peptides et
les acides aminés libres et se développent donc initialement rapidement mais l'absence de
peptides issus de l'hydrolyse des caséines limitent par la suite leur croissance. Les lactosérums
ainsi produits par les souches GABA Prf sont donc exempts de peptides provenant des caséines
et fortement réduits en acides aminés libres. Dans ces lactosérums, la croissance prolongée de
souche W62 est donc très limitée dû à l'épuisement rapide des nutriments du milieu, d'où une
DO max emegistrée inférieure.

La DOmax moyenne de la souche W62 dans les lactosérums des souches GABA (0,041) est
légèrement inférieure à la DOmax emegistrée dans le milieu témoin GDL (0,058). Ces résultats
suggèrent que les souches productrices de GABA doivent compétitionner pour les mêmes acides
aminés libres que la souche W62 dans un milieu pauvre, puisque la souche W62 a plus de facilité
à croître dans un milieu minimal que dans un milieu préalablement fermenté par les souches
productrices de GABA. Il est fréquent d'observer à la fois les phénomènes de commensalisme et
de compétition lors d'interactions entre les souches Prf et Pif. En début de croissance, les
souches de lactocoques Prt+ contribuent à fournir les nutriments directement assimilables
(peptides et acides aminés) aux variants Prf grâce à leur activité protéolytique (Flambard et al.,

65
1997). Il a été aussi noté que les souches Prf, en association avec leur homologue négatif, se
développaient moins rapidement qu'en culture pme (Juillard et Richard, 1989), dû au phénomène
de compétition pour les nutriments produits par les souches protéolytiques. Néanmoins, les
cultures mixtes formées de souches de Lc. lactis Prf et de son variant Prf sont d'un grand intérêt
dans la formulation de ferments industriels, ces derniers permettant de moduler l'acidité du caillé
selon deux vitesses d'acidification, rapide (Prf) et lente (Prf) (Monnet et al., 2008). Enfin, la
présence d'une souche Lc. lactis productrice de GABA à l'intérieur d'un ferment contenant la
souche Lc. cremoris W62 ne semblerait pas nuire à la croissance de ces 2 souches de lactocoques
pendant la fabrication d'un fromage Cheddar pendant l'acidification du lait. Les résultats obtenus
suite à l'étude de biocompatibilité n'ont pas démontré de difficulté majeure pom la croissance
des souches productrices de GABA dans un milieu préalablement fermenté par la souche Lc.
cremoris W62, observation s'étant reproduite lors de la croissance de la souche W62 dans les
lactosérums produits par les souches de Lc. lactis. Cependant, il est à noter que cette étude de
biocompatibilité a été réalisée de manière séquentielle, c'est-à-dire que les souches de Lc. lactis
et Lc. cremoris n'ont pas été mises en croissance dans un même milieu de culture. L'étude de ce
dernier point permettrait d'appuyer davantage la biocompatibilité entre les souches de Lc. lactis
et Lc. cremoris dans l'optique de formuler un ferment destiné à la fabrication fromagère.

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Figure 2.4 Distribution des valeurs du Tlag (hrs), du Taux (DO/hr) et de la DOmax obtenues par
la souche Lc. cremoris W62 en croissance dans les lactosérums des 9 souches productrices de
GABA. Les barres d'erreur représentent les erreurs standard des moyennes (ESM).

67
2.4.2 Quantification du GABA chez les souches productrices
La figure 2.5 présente les concentrations de GABA après fermentation d'un lait supplémenté en
glutamate par les souches productrices. L'analyse statistique des résultats a révélé une différence
significative entre les souches (P < 0,05). Toutes les souches évaluées ont produit de l'acide y-
aminobutyrique. Les souches A13, H02, H13, H20 et plus spécifiquement la souche A23, ont
démontré une production de GABA après 5 jours d'incubation supérieure à 6,0 mg de
GABA/lOOml de lait fermenté. Une quantité maximale de 7,44 mg GABA/100 ml de lait
fermenté a été produit par la souche A23.

A13 A23 H02 H12 H13 H15 H20 H24 H27

Souches GABA

Figure 2.5 Quantification de GABA (mg/100ml lait) chez les souches productrices après 5 jours
de fermentation à 30°C à l'intérieur d'un lait supplémenté à lOmM en glutamate

Ces résultats sont comparables à ceux présentés par Inoue et al. (2003), Hayakawa et al. (2004),
Minervini et al. (2009) qui ont obtenu des valeurs entre 4,0 à 10,0 mg GABA / 100ml lait.
L'ajout de glutamate (10 mM) pour les essais de la présente étude a pu favoriser les
concentrations de GABA produites dans les laits après 5 jours de fermentation. L'effet de la
présence du glutamate sm la production de GABA serait relié à l'expression du gène gadCB,
responsable de la synthèse de l'enzyme GAD, qui est maximale en présence de NaCl, de
glutamate et à pH acide (Sanders et al., 1998; Small et Waterman, 1998). Le phénomène

68
d'augmentation de la concentration de GABA avec ajout de glutamate, à un taux aussi faible que
10 mM, a également été observé par Lacroix (2008) à l'intérieur de laits fermentes préalablement
enrichis en pyridoxal-5'-phosphate, un cofactem de l'enzyme GAD (Komatsuzaki et al., 2005).

2.4.3 Étude de proximité génétique des souches productrices de GABA

L'étude de la caractérisation génétique des souches de Lc. lactis productrices de GABA, réalisée
par l'équipe du Dr Steve Labrie de l'Université Laval, a démontré que toutes les souches
appartenaient à la sous-espèce lactis. L'analyse du profil plasmidique, suite à une digestion à
l'aide d'endonucléases de restriction, a démontré que les souches productrices de GABA étaient
très similaires entre elles, cette similitude appuyant les résultats obtenus lors de l'étude de
croissance de la souche Lc. cremoris W62 à l'intérieur des lactosérums des souches GABA.
L'étude a cependant révélé des différences entre les souches quant à lem profil chromosomique
obtenu suite à la digestion enzymatique par l'enzyme de restriction Smal. Ainsi, les souches A23,
H02, H12, H24 et H27 ont démontré un profil chromosomique identique à plus de 75%. Les
souches A13,H15,H13et H20 sont quant à elles considérées comme étant distinctes.

Pour la suite du projet, les souches combinant un bon niveau de biocompatibilité avec la souche
W62 ainsi qu'une production de GABA élevée ont été sélectionnées. Ainsi, les souches
productrices de GABA Al3, A23, H02, H13 et H27 présentaient des valeurs supérieures aux
autres souches quant à leur taux de croissance ainsi que leur D.O. maximale. Les souches A13,
A23, H02, H13 et H20 ont démontré, quant à elles, des taux de production de GABA supériems.
Tel que mentionné ci-haut, l'étude de proximité génétique a permis d'identifier les souches A13,
H15, H13 et H20 comme étant uniques du point de vue génétique. Dans un but éventuel
d'optimiser la production de GABA dans un fromage fonctionnel, seules les souches A23 et H13
ont donc été conservées pom la suite de l'étude. Ces deux souches présentent des taux de
production de GABA supériems aux autres souches, sont différentes du point de vue génétique et
proviennent de deux ferments lactiques traditionnels différents.

69
2.4.4 Optimisation de la production de GABA à l'intérieur de caillés modèles

2.4.4.1 Évaluation de l'impact du ratio sel/humidité sur la survie des populations bactériennes
productrices de GABA

La figure 2.6 présente la mortalité bactérienne (Log UFC/g caillé modèle) observée chez les
souches productrices de GABA A23 et H13 après 10 jours d'affinage à l'intérieur des caillées
modèles. Une forte tendance vers une interaction entre le ratio S/H et la souche GABA employée
a été observée (P < 0,09). La population initiale des souches GABA dans les caillés modèles était
de 2,7 x 108 UFC/g. Après 10 joms d'incubation, les populations des souches A23 et H13 ont
subit en moyenne une perte de 8,23 log UFC/g caillé.

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S/H 3,0% S/H 4,5%

Figure 2.6 Mortalité bactérienne (Log UFC/ g caillé) observée chez les souches productrices de
GABA A23 et H13 après 10 joms d'affinage des caillés modèles à 30°C selon les ratios S/H
3,0% et 4,5%

La mortalité moyenne pom les souches productrices de GABA après 10 joms de maturation dans
les caillés modèles est comparable à celle emegistrée pour d'autres caillés modèles pour une
même période d'incubation (Farke et al., 1995; Roberts et Wijesundera, 1995). L'évolution des
populations des souches GABA est également représentative du suivi de l'affinage d'un fromage

70
de type Cheddar en considérant que 10 jours d'affinage à 30°C dans un caillé modèle correspond
à un fromage âgé de plus de 7 mois (McSweeney et Fox, 1993; Farke et al., 1995).

L'effet de la concentration en sel retrouvée à l'intérieur des caillés modèles a eu un impact

majeur sur la survie des populations bactérienne, comme en témoignent les taux de mortalité plus
élevés pom le ratio S/H de 4,5% (1,7% NaCl) comparativement au ratio 3,0% (1,1% NaCl). Une
interaction entre le ratio S/H et la souche GABA employée a été observée {P < 0,09). Cet effet
négatif du sel sm la viabilité des lactocoques lors de l'entreposage des caillés modèles a
également été observé chez les probiotiques (Fortin et al., 2011). La teneur en sel influence en
effet le métabolisme de la plupart des bactéries lactiques jusqu'à une concentration maximale de
5% en NaCl, où leur croissance est complètement inhibée (Desmazeaud et Roissard, 1994). La
réponse des différentes souches de lactocoques à ce stress osmotique dépend de leur capacité à
accroître lem résistance par l'accumulation d'ions K+, de glucides, d'acides aminés ou de
produits analogues (bétaïne).

Il est également intéressant de constater que les souches A23 et H13 présentent des
comportements différents d'adaptation face au stress osmotique. La souche productrice de GABA
H13 semble être plus sensible au sel que la souche A23. Cette observation confirme les résultats
de l'étude de proximité génétique, où les souches A23 et H13 ont été caractérisées comme étant
distinctes l'une de l'autre (section 2.4.3). Des émdes antérieures ont effectivement démontré des
différences entre certaines souches de Lc. lactis au niveau de lem adaptation face à un stress
osmotique (Rallu et al., 1996; Woojin et al., 1999). Ainsi, afin de répondre à un stress osmotique,
ces 2 souches posséderaient des mécanismes d'adaptation qui semblent différer l'un de l'autre; la
souche H13 ayant démontré ici plus de difficulté à s'adapter à ces conditions de stress.

71
2.4.4.2 Production de GABA dans les caillés modèles
La figure 2.7 présente la production de GABA après 10 joms d'affinage dans des caillés modèles
selon le ratio S/H (3,0% et 4,5%), les conditions de pH (4,8, 5,1 et 5,4) ainsi que l'effet de la
teneur initiale en glutamate (1,0% et 3,0%) pom les deux souches productrices de GABA A23 et
H13. Le ratio S/H, le pH, la concentration en glutamate ainsi que la souche GABA utilisée ont eu
un impact sm la production de GABA et une interaction quadruple significative a été observée
pom ces quatre factems {P < 0,05). La quantification du GABA a permis de confirmer l'absence
de formation de GABA pom la souche W62, confirmant ainsi la théorie selon laquelle les
souches de Lc. cremoris étaient dans l'incapacité de produire du GABA (Nomma et al., 1999b).

Le pH est le facteur ayant démontré le plus d'impact sur la formation de GABA à l'intérieur des
caillés modèles comme le démontre la figure 2.7. En moyenne, les concentrations de GABA
après 10 jours de maturation ont été de 0,50 mg/g caillé à pH 4,8, de 0,045 mg / g caillé à pH 5,1
et finalement de 0,009 mg/g caillé pom le pH 5,4. Les concentrations en GABA étaient toutefois
supérieures en présence d'une teneur initiale de 3,0 mg glu/g caillé, maximisant ainsi l'activité de
la GAD. Les souches GABA A23 et H13 ont montré des concentrations de GABA similaires
pom 1,0 mg glu/g caillé - pH 4,8, peut importe le ratio S/H. Ceci pourrait être expliqué par la
faible teneur en glutamate disponible dans le milieu, limitant la capacité du développement de
GABA par les souches. Le pH optimal de l'enzyme GAD étant compris entre 4,7-4,9, ces
résultats confirment ceux obtenus lors des différentes émdes portant sur la caractérisation de
l'enzyme GAD et sur l'influence du pH du milieu sm la production de GABA (Nomma et al,
1998; Komatsuzaki et al., 2005 et 2008). L'enzyme GAD est activée chez les bactéries lactiques
dans le but de résister à l'acidification du milieu. En convertissant une molécule de glutamate en
GABA, la GAD consomme un proton H+ intracellulaire, limitant ainsi l'acidification du
cytoplasme (Gale, E.F., 1946; Bearson et al., 1997; Cotter et al., 2001).

La production de GABA par les souches a également été affectée par le ratio S/H passant en
moyenne de 0,166 mg GABA/g caillé à 4,5% S/H à 0,203 mg GABA/g caillé à 3,0% S/H. De
façon générale, les concentrations de GABA enregistrées par les souches étaient supérieures pour
le ratio S/H 3,0% comparativement au S/H de 4,5%, à l'exception des conditions à 1,0 et 3,0 mg
glu/g caillé à pH 5,1 pom la souche A23. Pom ces conditions, la souche A23 a produit plus de
GABA au ratio 4,5%, ce qui pourrait être expliqué par sa plus grande résistance face au stress
osmotique (section 2.4.4.1). Normalement, la présence de NaCl et de glutamate a un effet positif
72
sm la formation de GABA, ces deux composés agissant au niveau de l'activation du gène gadCB,
responsable de la formation de l'enzyme convertissant le glutamate en GABA (Small et
Waterman, 1998; Sanders et al., 1998). Lacroix (2008) a démontré que des taux de NaCl compris
entre 0 et 2% favorisent la production de GABA par les souches productrices, tandis qu'à une
concentration de 4% la croissance bactérienne semblait inhibée et ainsi réduisait la formation de
GABA. L'effet inhibiteur du NaCl sm l'enzyme GAD purifiée, responsable de la conversion du
glutamate en GABA, a également été vérifié sm une souche de Lactobacillus paracasei à des
taux aussi faibles que 10 mM (0,06%) (Komatsuzaki et al., 2008). Dans le cas de la présente
étude, la présence de sel (S/H de 4,5%) a affecté à la baisse la production de GABA par les
souches productrices. Ceci est probablement dû au plus haut taux de mortalité bactérienne noté
pour ce ratio, limitant ainsi la formation du GABA par les souches productrices (section 2.4.4.1).
Après la lyse cellulaire, l'enzyme GAD peut continuer à générer des molécules de GABA,
comme en témoignent les émdes portant sm l'activité de l'enzyme GAD sous sa forme isolée
(Sanders et al., 1998; Komatsuzaki et al., 2005 et 2008). La capacité de l'enzyme à produire du
GABA dépend de son temps de demi-vie, après quoi l'enzyme cesse son activité. Le temps de
demi-vie de l'enzyme GAD n'a pas été déterminé et cette information demeure non disponible. Il
donc possible d'expliquer les concentrations de GABA infériemes dans les caillés modèles au
ratio S/H de 4,5% par une plus forte mortalité bactérienne.

La teneur en glutamate dans les caillés modèles a eu un impact significatif sur la production de
GABA passant en moyenne de 0,209 mg GABA/g caillé pom une concentration initiale de 3,0
mg glu/g à 0,160 mg GABA/g caillé pour une teneur initiale de 1,0 mg glu/g. L'augmentation de
la teneur en glutamate résulte en une production de GABA supérieure et ce résultat est similaire à
ceux obtenus par Nomma et al. (1998) et Komatsuzaki et al. (2005). Les résultats de Lacroix
(2008), portant sm l'effet de plusiems concentrations en glutamate (0, 10, 25 et 50 mM) sm la
quantité de GABA produit par des souches de Lc. lactis, ont également démontré ce phénomène.
Cette étude a également révélé qu'une concentration maximale de 25 mM de glutamate (2,58
mg/g lait) pouvait être entièrement convertie en GABA, au-delà de quoi le glutamate demeurait
dans le milieu de manière résiduelle.

Les souches A23 et H13 se sont comportées différemment pom les traitements S/H 3,0%-3,0mg
glu/g caillé-pH4,8 et S/H 4,5%-l,0mg glu/g caillé-pH 4,8. Pom ces deux conditions, la
production de GABA par la souche H13 s'est avérée inférieure à la souche A23, reflétant les
73
résultats obtenus pom la quantification de GABA à l'intérieur d'un lait fermenté (section 2.4.2)
où la souche A23 présentait une production de GABA supérieure à la souche H13. La souche
A23 a produit en moyenne une concentration de 0,190 mg GABA/g caillé, ce qui est légèrement
supérieur à la souche H13, emegistrant une moyenne de 0,179 mg GABA/g caillé. Ces résultats
confirment une fois de plus que les deux souches sont différentes sur le plan de leur métabolisme
et de lem capacité d'adaptation au milieu.

Parmi les différentes conditions évaluées à l'intérieur des caillés modèles, une quantité maximale
de 0,796 mg GABA/g caillé modèle a pu être produite par la souche A23 à pH 4,8, 3,0 mg glu/g
de caillé et au ratio SH de 3,0%. Comme les caillés modèles simulent un fromage Cheddar en
cours d'affinage (Farke et al., 1995), il serait possible de s'attendre à un taux de GABA
semblable à l'intérieur d'un fromage mature sous les mêmes conditions optimales (pH 4,8, ratio
S/H 3,0%, 3,0 mg glutamate /g fromage), soit environ 0,8 mg GABA/g de fromage ou 24 mg
GABA par portion de 30g. Ces résultats sont prometteurs, puisque selon les résultats d'Inoue et
al. (2003), la baisse de la pression artérielle était significative suite à l'ingestion de 100 ml de lait
fermenté renfermant 10-12 mg de GABA.

La formation de glutamate à l'intérieur des caillés modèles entre les jours 1 et 10 a également été
analysée. Le pH des caillés a été le seul facteur ayant un effet significatif sur la formation de
glutamate {P < 0,05). Ainsi, les concentrations générées en glutamate pour les pH 5,4, 5,1 et 4,8
ont été respectivement de 0,038, 0,006 et -0,047 mg glu/g caillé modèle. Dans ce dernier cas, la
concentration de glutamate retrouvée après 10 jours de maturation était inférieure à celle
enregistrée au jour 1 pour les caillés modèles à pH 4,8. Ce phénomène s'explique par la
conversion du glutamate en GABA par la GAD pendant la maturation. À pH 4,8, l'activité de cet
enzyme est optimale et donc une plus grande proportion de glutamate du milieu est utilisée afin
de le convertir en GABA, d'où l'épuisement en substrat. Cette relation existant entre les
concentrations en GABA produites ainsi qu'en glutamate résiduel a également été observée à
l'intérieur de caillés modèles par Lacroix et al. (2010).

Considérant ces résultats et dans l'optique de fabriquer un fromage fonctionnel naturellement

enrichi en GABA, il est donc essentiel de privilégier un fromage au pH inférieur à 5,0, puisque ce
factem est déterminant dans la conversion du glutamate en GABA. De plus, il est préférable de
sélectionner une technologie fromagère où la maturation permet de libérer une quantité de

74
glutamate de l'ordre de 2,5mg/g de fromage afin de maximiser la concentration de GABA
formée. Il serait également souhaitable de fixer un ratio S/H compris entre 3,0 et 4,0 % dans le
but de maximiser la survie des souches productrices GABA tout en exerçant un effet inhibiteur
afin de prévenir la croissance de contaminants.

75
 Caillés modèles à 3.0 % S/H

■ Souche A23
■ Souche H13

f t
wz g B

1,0 mg glu 3,0 mg glu 1,0 mg glu 3,0 mg glu 1,0 mg glu 3,0 mg glu
pH4,8 pH4,8 pH5,l pH 5,1 pH 5,4 pH 5,4

Caillés modèles à 4,5 % S/H

Souche A2 3
SoucheH13

1,0mg glu 3,0 mg glu 1,0 mg glu 3,0mg glu 1,0 mg glu 3,0mg glu
pH4,8 pH4,8 pHS.l pH5,l pH S.4 pH 5,4

Figure 2.7 Concentra tions de GABA après 10 jours d'a ffina ge à 30°C dans les caillés à 3,0% et
4,5% S/H selon le pH (4,8; 5,1; 5,4) et le taux initial en glutamate (1,0 et 3,0 mg glu/g caillé). Les
analyses sta tistiques ont été effectuées en prenant en considéra tion tous les tra itements compris
dans l'ensemble des 2 graphiques.
76
2.5 CONCLUSION

Certaines bactéries lactiques, en particulier les souches de Lc. lactis, démontrent la capacité à
produire du GABA à partir de glutamate via la glutamate decarboxylase (GAD). Dans l'optique
de produire un fromage fonctionnel naturellement enrichi en GABA, la biocompatibilité de 9
souches de Lc. lactis Prf avec une souche de Lc. cremoris Prf, lem capacité à produire du GABA
ainsi que lem proximité génétique ont été évaluées. A cette fin, a spectrophotométrie automatisée
a pu être utilisée avec succès et les résultats obtenus ont permis de sélectionner deux souches
productrices de GABA, A23 et H13, biocompatibles avec la souche Lc. cremoris W62. L'effet de
certains paramètres de l'affinage des fromages sur la production de GABA a été évalué dans des
caillés modèles. Les résultats démontrent que le pH est le facteur ayant le plus d'impact sur la
production de GABA, avec un pH optimal de 4,8. En plus du pH acide de la matrice fromagère,
les conditions optimales d'affinage seraient également un ratio S/H entre 3,0 et 4,0% de même
que la possibilité d'affinage sm une longue période, afin de pouvoir y développer une quantité de
glutamate maximale pouvant être convertie en GABA. L'optimisation de la production de GABA
ayant été caractérisée dans des caillés modèles, il serait pertinent de valider ces résultats dans un
contexte de fabrication fromagère réel, dans le but de créer un fromage fonctionnel.

77
 CHAPITRE 3

Fabrication de fromages de type Cheddar naturellement enrichis en acide gamma-aminobutyrique

(GABA)

3.1 Résumé
Deux souches sélectionnées de Lactococcus lactis ssp lactis productrices de GABA ont été
évaluées pour leur capacité à fabriquer un fromage naturellement enrichi en GABA et déterminer
leur éventuel impact sm les propriétés rhéologiques et sensorielles pour des fromages. Les
souches productrices de GABA A23 et H13 ont été combinées avec la souche Lc. lactis ssp
cremoris W62. Les conditions optimales de production de GABA (pH de 4,9 en fin de
fabrication, ratio S/H de 3,5%, ratio souches GABA:W62 de 2 :2) ont été reproduites en usine
pilote lors de la fabrication de fromages de type Cheddar. Les résultats montrent que la présence
de GABA et de souches productrices n'a pas d'impact sur la composition des fromages de même
que leurs propriétés rhéologiques. L'analyse sensorielle a démontré qu'il n'y avait pas de
différence significative au niveau des attributs de flaveur globale, d'amertume et d'acidité entre
les fromages emichis en GABA et les fromages témoins. Les souches Lc. lactis ssp lactis A23 et
H13 ne démontrent pas de différence significative de production de GABA, la quantité moyenne
de GABA dans les fromages après 56 jours d'affinage pouvant atteindre 0,365 mg de GABA/g de
fromage.

78
3.2 Introduction
Au cours du processus d'affinage, plusiems réactions biochimiques surviennent à l'intérieur des
fromages, entraînant des modifications de lem texture ainsi que de lems propriétés
organoleptiques, ce qui lem confère leur typicité. Ces changements biochimiques peuvent être
regroupés en trois voies métaboliques principales, soit la glycolyse, la lipolyse et la protéolyse.
Événement majeur de la maturation fromagère, la protéolyse a un impact direct sm la flaveur des
fromages en libérant des peptides et acides aminés libres issus de l'hydrolyse des caséines et
pourtant servir de précurseurs à de multiples réactions cataboliques secondaires (McSweeney,
2004). Parmi ces réactions, la désamination, la désulfuration, la transamination ainsi que la
decarboxylation sont principalement impliquées dans le développement de composés aromatiques
chez les fromages (Gripon et al., 1991; Yvon et Rijnen, 2001). Ainsi, l'acide glutamique, issu du
processus de protéolyse, est catabolisé par la glutamate decarboxylase (GAD) afin de générer de
l'acide y-aminobutyrique (GABA) (Bearson et al., 1997; Cotter et al., 2001). Le GABA est un
neurotransmetteur agissant au niveau du système nerveux central et reconnu pour diminuer la
pression artérielle (Eliott et Hobbiger, 1959; Aoki et al., 2003; Hayakawa et al., 2004). Au cours
des dernières années, des émdes ont porté sur l'aptitude des bactéries lactiques à produire du
GABA, sur la caractérisation de la GAD ainsi que sm la recherche des conditions optimales de
synthèse du GABA (Nomma et al., 1998 &1999; Komatsuzaki et al., 2005). Un lait fermenté
naturellement enrichi en GABA par des bactéries lactiques sélectionnées a également démontré
une capacité à réduire la pression artérielle de sujets humains naturellement hypertendus (Inoue et
al., 2003).

Une étude récente (Lacroix, 2010) a identifié neuf souches de Lc. lactis ssp lactis ayant la
capacité de produire du GABA. En raison de leur caractère protéinase-négatif (Prf), la
biocompatibilité de ces neuf souches a préalablement été évaluée en présence de souches de Lc.
lactis ssp cremoris Prf. Les principaux résultats présentés au Chapitre 2 ont démontré une plus
grande biocompatibilité entre la souche Lc. cremoris W62 et les souches Lc. Lactis productrices
de GABA A13, A23, H02 et H13. Ces dernières ont également montré un taux de production de
GABA supérieur aux autres souches productrices dans du lait fermenté. Des travaux réalisés dans
des caillés modèles ont également permis de déterminer les conditions de maturation fromagère
optimales pom la production de GABA. Ainsi, le pH s'est avéré le facteur le plus déterminant
dans la production de GABA, avec un taux maximal produit à pH 4,8. Les souches productrices

79
de GABA ont également démontré une sensibilité au NaCl, où une concentration en GABA
inférieure était emegistrée à un ratio S/H de 4,5%.

L'objectif de ce travail est de valider la capacité des souches de Lc. lactis ssp lactis à produire du
GABA dans du fromage de type Cheddar sous les conditions optimales préalablement
déterminées et d'évaluer l'impact de la production de GABA sur les propriétés texturales et
organoleptiques des fromages.

80
3.3 Méthodologie

3.3.1 Préparation des ferments

Deux souches de lactocoques productrices de GABA (Lactococcus. lactis ssp lactis A23 et
Lactococcus lactis ssp lactis H13) provenant de la collection de souches ULAAC (Université
Laval, Québec, Canada) ainsi que la souche Lactococcus lactis ssp cremoris W62 (Wisby,
Danlac, Airdrie, AL, Canada) étaient conservées à -80°C dans du lait écrémé reconstitué à 12%
de solides totaux supplémenté en sucrose (5%) ainsi qu'en acide ascorbique (0,35%) selon la
méthode décrite en annexe 1.

Les souches A23 et H13 ont été remises en culture par inoculation (10%, v/v) dans du lait écrémé
reconstitué à 12% (p/v) de solides totaux (Dairytown products, Sussex, Nouveau-Brunswick,
Canada) préalablement stérilisé (110°C, 10min) et supplémenté par 0,2% (p/v) d'extrait de
levures (Difco Yeast Extract, Sparks, Maryland, É.-U.). La souche Lc. lactis ssp cremoris W62 a
été inoculée à 10% (v/v) selon la même méthode sans supplément d'extrait de levures. Les
cultures ont été incubées à 21°C pendant 15 hemes.

Les ferments de fromagerie ont été préparés en inoculant les souches à 1% (v/v) dans du lait à
12% (p/v) de solides totaux supplémenté par 0,2% (p/v) d'extrait de levures pom les souches A23
et H13. Le lait a préalablement subi un traitement thermique à 95°C pendant 30 minutes à l'aide
d'un bain thermo réglable (Bectrol technologies Inc., Saint-Hyacinthe, Québec, Canada). Après
refroidissement et inoculation, l'incubation a été réalisée à 21°C pendant 15 hemes.

3.3.2 Fabrications fromagères

Les fabrications fromagères ont été réalisées à l'usine pilote du Centre de Recherche et
Développement sur les Aliments (CRDA, Saint-Hyacinthe, Québec, Canada). Quatre répétitions
ont été effectuées et 3 fromages différents ont été fabriqués pom chaque répétition, correspondant
aux 3 ferments utilisés pom l'étude : ferment constitué de la souche Lc. lactis ssp cremoris W62
seule (ferment témoin); ferment constitué de la combinaison des souches Lc. lactis ssp cremoris
W62 et Lc. lactis ssp lactis A23 (ferment A23) ; ferment constitué de la combinaison des souches
Lc. lactis ssp cremoris W62 et Lc. lactis ssp lactis H13 (ferment H13).

81
Pour chaque fabrication fromagère, 750 kg de lait cru (Agropur, Granby, Québec, Canada) a été
pasteurisé à 76°C pendant 16 secondes, refroidi à 31°C et distribué à l'intérieur de 3 cuves (cuve
double « O » Kusel, modèle 4MX, Kusel Equipment CO, Watertown, Wisconsin, É.-U.) de 250
kg de capacité à raison de 210 kg de lait par cuve. L'analyse de la composition des laits
pasteurisés en protéines, caséines, matières grasses, solides totaux et lactose a été réalisée à l'aide
d'un appareil FT-120 (Foss North America, MN, É.-U.)

Les cuves ont été inoculées de façon à obtenir une population initiale de 2,0 x 10 UFC/ml pour
chacune des souches. Ainsi, la première cuve (ferment témoin) contenait une population initiale
de 2,0 x IO7 UFC/ml pour la souche Lc. lactis ssp cremoris W62, la deuxième cuve (ferment
A23) contenait une population de 2,0 x IO7 UFC/ml pour la souche Lc. lactis ssp lactis A23 et 2,0
x IO7 UFC/ml pom la souche Lc. lactis ssp cremoris W62 et la troisième cuve (ferment H13)
renfermait 2,0 x IO7 UFC/ml pour la souche Lc. lactis ssp lactis H13 ainsi que 2,0 x IO7 UFC/ml
pour la souche Lc. lactis ssp cremoris W62. Pour les ferments mixtes, un ratio bactérien de 1:1 a
donc été utilisé2. Pom chacune des répétitions, l'attribution d'un ferment à une cuve était réalisée
de manière aléatoire. Des échantillons de lait ont été prélevés 10 minutes après l'inoculation pour
analyse de composition.

Les paramètres utilisés pour la fabrication fromagère étaient les paramètres de référence d'une
fabrication de fromage de type Cheddar, avec quelques modifications. Le lait a été supplémenté
en chlorure de calcium (CaCl2, Danisco, USA Inc., New Century, KS) à raison de 0,26ml par litre
de lait. Les ferments lactiques ont par la suite été ajoutés à chacune des cuves. Après une
maturation de 30min du lait à 32°C, 10ml de présure double force (Chymax Extra, Chr. Hansen's
Laboratory LTD, Mississauga, Ontario, Canada) ont été ajoutés par 100kg de lait. Après
emprésmage, les laits ont été agités pendant 2 minutes à grande vitesse puis les agitateurs ont été
retirés des bassins. Trente minutes après l'addition de la présme, le caillé fut coupé en cubes
d'environ 1 cm3 puis laissé au repos pom une durée de 10 minutes. Par la suite, la période de
cuisson a débuté couplée à une faible agitation des grains de caillé. La température initiale des
grains de 32°C a été augmentée afin d'obtenir après 30 minutes une température de 38°C. Après

2
Selon des essais préliminaires avec des tests de Pearce présentant les paliers de température de la fabrication d'un
fromage de type Cheddar, un ratio de 1 :1 des souches L. lactis ssp lactis (A23 et H13) et L. lactis ssp cremoris W62
permettait l'obtention d'un pH final de 5,1 après 5 heures.

82
cette étape, une température de 35°C a été maintenue dans chaque cuve. Le soutirage du
lactosérum a été effectué à pH 5,8. Les grains furent entassés puis retournés pendant la
cheddarisation jusqu'à ce que le caillé atteigne un pH final de 4,9. Le caillé fut par la suite haché
et salé (1,4% NaC l, p/p) de façon à obtenir selon le taux d'humidité des grains un ratio
sel/humidité fixe de 3,5%. Les grains de caillé ont été mis en moule et soumis à une pression de
■y

401bs/po pendant 60 minutes (Perfora 443, Copenhague, Danemark). Les meules (de 10-13 kg
en moyenne) des trois différents fromages obtenus (fromages témoin, A23 et H13) ont par la
suite été scellées sous vide à l'intérieur de sacs de plastique puis conservés à 7°C pour une
période de 29 joms. À la suite de cette période, les meules ont été transférées dans une seconde
salle d'affinage à 4°C afin de poursuivre leur maturation jusqu'à 56 jours. Des échantillons de
fromages ont été prélevés après 1, 16, 29 et 56 jours d'affinage.
Il importe de souligner que, bien que les fabrications diffèrent par des inoculations totales (2 x
IO7 C FU/ml au bassin 1 et 4 x IO7 C FU/ml aux bassins 2 et 3), les procédures de fabrication
fromagère ont tenu compte de ces différences. En effet, les actions technologiques (coagulation,
soutirage, etc.) n'ont pas été menées sur la base du temps de fabrication, mais plutôt sm la base
de l'évolution des pH. C eci a permis des ajustements qui tenaient compte des profils
d'acidification pouvant varier dans le temps en fonction des souches utilisées et des différents
taux d'inoculation. Ultimement, cette stratégie visait à obtenir des fromages dont la composition
chimique était la plus normale possible.

3.3.3 Rendements fromagers

Le rendement fromager après pressage a été calculé pour les fromages fabriqués (témoin, A23 et
H13). Le rendement observé correspond à la quantité de fromage (kg) obtenue par 100kg de lait
de fromagerie. Le rendement observé (Robs) est obtenu en effectuant le calcul suivant :

Robs - Fromage x 100

Lait
où,
Fromage = Poids du fromage après pressage (kg)
Lait = Poids du lait de fromagerie (kg)

83
3.3.4 Composition des fromages

Les différents constituants ont été déterminés en duplicata sur des échantillons de fromages après
16 joms de maturation à 7°C. Le pourcentage de solides totaux (ST) des fromages fut évalué
après séchage des échantillons (2g) au fom à vide à 100°C pendant 5 heures (Fisher Isotemp-
Oven série 300, modèle 350G, Pittsburgh, É.-U.) (AOAC, 2002). L'humidité (H) a été calculée
selon l'équation 100 - ST = H. La teneur en matières grasses (MG) des fromages a été évaluée
par la procédure d'extraction des lipides par Mojonnier (Atherton et Newlander, 1977). La teneur
en chlorure de sodium (NaCl) a été évaluée à l'aide d'un analyseur de chlorure de sodium
(Corning chloride analyser 926, Nelson-Jameson Inc, Marchfield, Wl, USA). Les cendres (C) ont
été évaluées par incinération d'échantillons de fromage (2g) dans un fom à mouffle à une
température de 550°C pendant 16 heures (AOAC, 1995). L'azote total (NT) des fromages a été
déterminé par la méthode macro Kjeldahl (AOAC, 1995). Un facteur de correction de 6,38 a été
appliqué afin d'exprimer les résultats en protéines.

3.3.5 pH des fromages

Les valems de pH des fromages témoin, A23 et H13 au cours de l'affinage ont été déterminées à
l'aide d'un pH-mètre titrateur TitraLab80 (Radiometer, Rose-Scientific, Edmonton, Alberta,
Canada) équipé d'une électrode combinée en verre scellée (ASI, Analytical sensors). L'électrode
a été placée dans un échantillon d'environ 10g de fromage râpé et équilibrée pendant 2 minutes
avant la lecmre du pH.

3.3.6 Analyses rhéologiques des fromages

Les caractéristiques rhéologiques des fromages ont été évaluées aux jours 16, 29 et 56 à l'aide
d'un texturomètre TA-XT2 (Mono-Research Laboratories Ltd., Brompton, Ontario, Canada).
Des cylindres de fromage de 1,0 cm3 ont été prélevés et conditionnés à l'intérieur de boîtes de
pétris à 22°C pendant 2 heures. Pour chacun des fromages, 11 échantillons ont subi
individuellement une double-compression à l'aide d'un poinçon cylindrique de 2,5cm attaché à la
tête transversale du texturomètre opéré à une vitesse de 0,4mm/sec et ce jusqu'à 50% de
déformation. L'analyse de la texture a permis d'évaluer la dureté (MPa • sec), l'intensité de
l'adhérence (MPa), l'élasticité ainsi que l'intensité de la cohésion des différents fromages au
corns de l'affinage.

84
3.3.7 Analyses microbiologiques
Les populations de Lc. lactis ssp lactis et de Lc. lactis ssp cremoris retrouvées à l'intérieur des
fromages ont été dénombrées après 1, 16, 29 et 56 jours d'affinage à l'aide du milieu Reddy
(Reddy et al., 1972). Les lactobacilles ont été dénombrés par ensemencement dans la masse dans
le milieu sélectif MRS (Difco Laboratories, Detroit, MI, É.-U.) acidifié à 0,2% (v/v) avec de
l'acide acétique glacial 99,5% (Lab-Grade, Anachemia, Montréal, Canada). Le développement
des lactobacilles dans les fromages a été évalué aux jours 16, 29 et 56 de l'affinage.

Afin de réaliser les dénombrements, 11g de fromage cheddar ont été homogénéisés dans 99ml
d'eau peptonée stérile (0,1%) à l'aide d'un Stomacher (Model 400, Seward Medical, London,
UK) à l'intérieur d'un sac conçu à cet effet. Les dilutions subséquentes ont été obtenues par
l'utilisation de bouteilles d'eau peptonée (0,1%) renfermant 3g de billes de verre afin de détruire
les chaînes de lactocoques suite à 40 agitations vigoureuses. Les boîtes de pétri ont été
ensemencées par la technique d'étalement (St-Gelais et al., 1992) et incubées 48 hemes à 30°C
en anaérobiose dans un incubateur (5% CO2 : 10% H2 : 85% N2) puis les bactéries (UFC/g de
fromage) ont été dénombrées.

3.3.8 Protéolyse des fromages

La protéolyse des fromages a été analysée aux jours 1, 16, 29 et 56. L'azote total (NT) ainsi que
l'indice de protéolyse primaire, mesuré par la teneur en azote soluble dans l'eau (NSE) ont été
analysés à l'aide par la méthode macro-Kjeldahl (AOAC, 1995) en utilisant un appareil Tecator
Kjeltec (Tecator, Hôganâs, Suède). Les résultats ont été exprimés en ratio des fractions azotées
solubles sm l'azote total (NSE/NT) et un factem de correction de 6,38 a été appliqué afin
d'exprimer l'azote en protéines.

3.3.9 Détermination du GABA et du glutamate dans les fromages

Les concentrations en GABA et en glutamate des extraits NSE des fromages ont été quantifiées
par GC-MS et GC-Fid aux joms 1, 16, 29 et 56 de l'affinage selon la méthode détaillée dans la
section 2.3.7.5 du présent mémoire. Les résultats ont été rapportés en mg de GABA/g de fromage
et en mg de glutamate/g de fromage. La conversion des résultats est détaillée à l'annexe 4.

85
3.3.10 Analyse sensorielle
L'analyse sensorielle des 3 fromages fabriqués (témoin, A23 et H13) a été réalisée par l'équipe
d'évaluation sensorielle du Centre de Recherche et Développement sm les Aliments (CRDA,
Saint-Hyacinthe, Québec, Canada). Cette évaluation a été réalisée après 20 jours de maturation
des fromages à 7°C et ce, à deux reprises, soit pour deux répétitions. Pour chacune des analyses
sensorielles, un échantillon d'environ 1,5 kg de fromage était prélevé. Les fromages étaient par la
suite découpés en cubes (1,5cm x 1,5cm) puis disposés à l'intérieur de pots en verre ambrés avec
couvercles de plastique et codés. Les échantillons étaient tempérés à 14°C soixante minutes avant
le début de l'analyse sensorielle.

Un test de classement a été utilisé afin d'évaluer, pour chacun des trois fromages, les attributs
sensoriels de flaveur globale, d'amertume et d'acidité. Pom chacun de ces attributs, chaque
évaluateur devait attribuer un rang pour les échantillons dégustés (1 étant par exemple, le moins
acide et 3 étant le plus acide). Le jury était formé de 30 juges, tous employés au Centre de
Recherche et Développement sm les Aliments (CRDA, Saint-Hyacinthe, Québec, Canada) et
consommateurs de produits laitiers. La nature des valeurs recueillies, en occurrence les rangs, a
suggéré l'utilisation du test de Friedman afin de comparer des mesures répétées sur les mêmes
sujets (blocs) et qui est l'équivalent non-paramétrique de l'analyse de la variance en blocs
aléatoires complets. L'analyse de la variance à l'aide du logiciel Fizz (Sensory Analysis and
Consumer Test Management Software, version 2,0a, Biosystemes, Couternon, France) a été
réalisée sur chacun des attributs et un test de Friedman a été utilisé afin de comparer les
moyennes obtenues (P < 0,05). Enfin, il était possible pour chaque évaluateur de caractériser
chacun des échantillons goûté en lui attribuant une mention parmi les suivantes : caramélisé,
animal, serpillère, rance, vomi, typique du Cheddar, crayeux, ferme, pâteux, étranger ou autre.
Pour chacune des analyses sensorielles, la fréquence de ces attributs a été évaluée.

3.3.11 Statistiques
Un plan expérimental entièrement aléatoire a été utilisé afin de déterminer l'effet du ferment sm
la composition des 3 fromages après 16 joms d'affinage à 7°C, la durée de fabrication ainsi que
les rendements fromagers. Un dispositif en tiroir a été utilisé afin de vérifier l'effet des ferments
sm la production de GABA et de glutamate, sm les populations bactériennes, sm l'évolution du
pH et de la protéolyse primaire de même que sur la rhéologie des fromages aux jours 1, 16, 29 et

86
56 de l'affinage. Les différences significatives ont été testées à P < 0,05 à l'aide de la procédure
SAS/STAT® (SAS User's Guide, 1999)

87
3.4 RESULTATS ET DISCUSSION

3.4.1 Paramètres de fabrication fromagère

Le tableau 3.1 présente la composition moyenne des laits de fabrication 10 minutes après l'ajout
du ferment à la cuve pom chacun des ferments utilisés. Les quantités de protéines totales, de
caséines et de matières grasses du lait avant ajout des ferments étaient respectivement de 3,31 ±
0.003%, 2,54 ± 0,008% et 3,81 ± 0,012%.

Les résultats n'ont montré aucune différence significative {P > 0,05) entre les répétitions pour les
taux de protéines, de caséines, de gras, de solides totaux de même que pom le lactose.

Tableau 3.1 Composition moyenne des laits de fabrication

Laits de fabrication additionnés du ferment
ESM1
Constituants Témoin A23 H13
Protéines (%) 3.370b 3.382a 3.388a 0.002
Caséines (%) 2.606a 2.620a 2.610a 0.007
a a a
Matières grasses (%) 3.757 3.670 3.717 0.03
a 8 a
Solides totaux (%) 12.667 12.640 12.655 0.039
a a a
Lactose (%) 4.502 4.507 4.502 0.009
TTTTT;—r—— ;—;

L'ajout des ferments au lait de fabrication n'a pas non plus affecté significativement {P > 0,05) la
tenem du lait en caséines, en gras, en solides totaux de même qu'en lactose. Seul le pourcentage
de protéines des laits A23 et H13 était significativement différent (P < 0,05) du lait témoin. Afin
d'obtenir mie concentration bactérienne de 2,0 x IO7 UFC/ ml de lait pom chacune des souches
lors de l'ensemencement, des quantités d'inoculum de 6,0 kg pom le ferment témoin, de 8,13 kg
pom le ferment A23 et de 7.87 kg pom le ferment H13 ont été nécessaires. Le milieu de
fermentation étant de la poudre de lait écrémé reconstituée à 12% (p/p), son ajout s'accompagnait
d'une quantité non négligeable de protéines.

88
Les différentes étapes de la fabrication des fromages ont été réalisées à des valeurs de pH
identiques pom les 3 ferments. Bien que selon leur taux d'acidification, la dmée de chacune des
étapes de fabrication pouvait varier d'un ferment à un autre, aucune différence significative {P >
0,05) n'a été observée entre les trois ferments pour le temps de maturation du lait, le temps de
coagulation, le temps de soutirage, le temps de pressage ainsi que pour la durée totale de
fabrication (à la fin du pressage). La durée moyenne totale de fabrication pom les 3 ferments a
été de 345,75 ± 6,32 minutes et est comparable à un processus normal de fabrication du fromage
Cheddar (Daigle et al., 1999, Pandey et al., 2003, Lawrence et al., 2004, St-Gelais et al, 2008).

Enfin, aucune différence significative entre les 3 ferments n'a été observée au niveau des
rendements fromagers. Un rendement moyen de 10,91% ± 0,17 a été atteint et est compris dans
l'intervalle des rendements des fromages à pâte ferme (Mietton et al., 1994, St-Gelais et Tirard-
Collet, 2002).

89
3.4.2 Composition des fromages
Le tableau 3.2 présente la composition des fromages après 16 jours d'affinage. Aucune différence
significative {P > 0,05) n'a été observée entre les trois fromages analysés.

Tableau 3.2 Composition des fromages (témoin, A23 et H13) après 16 joms d'affinage
Constituants Composition (%) ISM 1
Protéines totales (NT) 23,53 0,23
Matières grasses (MG) 30,07 0,46
Extrait sec total (EST) 60,36 0,49
Humidité (H) 39,65 0,49
NaCl (S) 1,33 0,03
S/H 3,36 0,11
Cendres (C) 3^02 0,05
KSM - Krreur standard moyenne

Les laits de départ ayant la même composition et les ferments n'ayant pas eu d'impact significatif
sm le déroulement de la fabrication, il est normal de retrouver la même composition pom les trois
fromages. L'humidité des fromages fabriqués était légèrement supérieure à la norme établie pom
le Cheddar, qui stipule qu'elle doit se situer à un pourcentage inférieur à 39% (Ministère de la
justice, 2009). Le taux d'humidité légèrement élevé influence à la baisse le pourcentage de
matières grasses. Normalement établit à un taux minimal de 31% (Ministère de la Justice, 2009),
le pomcentage de matières grasses des fromages (30,07%) était ainsi diminué par dilution en
raison de l'humidité élevée.

L'humidité a également eu une influence sur le ratio sel/humidité visé pom les fabrications.
Ainsi, un ratio moyen de 3,36% a été mesuré au lieu du ratio ciblé de 3,5%, l'humidité élevée
influençant à la baisse le ratio. Enfin, les paramètres d'azote total (NT) et des cendres mesurés
correspondent à la composition d'un fromage de type Cheddar fabriqué avec du lait entier
(Lawrence et al., 1984, Daigle et al., 1999, Champagne et al., 2009).

90
3.4.6 Évolution des populations microbiennes pendant la fabrication
La figure 3.1 présente le suivi des populations bactériennes {Le. cremoris W62, Lc. lactis A23 et
Lc. lactis H13) au corns des différentes étapes de la fabrication des fromages.

L'analyse statistique a démontré une différence significative entre les deux souches A23 et H13
de même qu'un effet significatif des étapes de fabrication {P < 0.05). L'analyse des résultats a
également mis en évidence une interaction significative entre la souche productrice de GABA
utilisée et les étapes de fabrication {P < 0.05). Les souches A23 et H13 ont démontré une
sensibilité à la chaleur et leur population a diminué suite à l'étape de cuisson, l'effet étant
significativement plus marqué pom la souche A23. Par la suite, les comptes bactériens des
souches A23 et H13 redeviennent identiques avant le salage. Contrairement à la souche H13, la
population de la souche A23 diminuent de façon marquée entre le salage et le jom 1,
probablement en raison d'une plus grande sensibilité à la pression osmotique ou à la toxicité des
ions chlorure. Ainsi, les populations bactériennes des souches A23 et H13 atteignent
respectivement des log de 8,19 et 8,61 au jom 1. Ces résultats diffèrent de ceux obtenus au
chapitre 2 (section 2.4.4.1), où l'étude dans des caillés modèles révélait que les souches A23 et
H13 réagissaient de façon similaire lorsque soumises à un ratio S/H de 3,0% (1,1% NaCl) mais
que la souche H13 était plus sensible que la souche A23 à un ratio S/H de 4,5% (1,7% NaCl). En
plus du ratio S/H différent des valems étudiées dans les caillés modèles (3,36% S/H), les
conditions retrouvées au jour 1 dans les fromages diffèrent de celles des caillés modèles, par
exemple la température de 10°C (vs 30°C pour les caillés modèles) et le pressage subi par les
fromages qui a généré une densité du milieu supérieure à celle retrouvée dans les caillés modèles.
Les différences observées entre les souches A23 et H13 pourraient être attribuées à l'interaction
de ces facteurs sm la croissance microbienne. De plus, les souches A23 et H13 étant différentes
génétiquement (section 2.4.3), le métabolisme bactérien et la réponse engendrée face au stress du
milieu ont pu différer selon la souche.

La souche Lc. cremoris W62 a été affectée significativement par les étapes de fabrication de
même que par la présence des souches Lc. lactis A23 et H13 {P < 0.05). Ainsi, tout comme les
souches A23 et H13, la souche Lc. cremoris W62 a été affectée par l'étape de la cuisson de même
que par le salage, phénomènes normalement observés chez les populations de lactocoques en
corns de fabrication (Daigle et al., 1999).
91
 Fromage Témoin
8.8
8.6
Ë 8.4
P 8.2
8.0
O)
7.8 -♦— Souche W62
7.6
7.4

*.d> _c,cP # ^
\<v° ,*>• t$
o ^ „>

Fromage A23
8.8
8.6
Ë 8.4
g 8.2
^ 8.0
O 7.8 ■ Souche W62
7.6 ■ Souche GABA
7.4

yv
X o^* t*- ,.• >»* *»

Fromage H13
RR -

8.6 - z
g 8.4 - f—^
g 8.2- fr
^ 8.0 - /
5 7.8-
7.6 - —♦— Souche GABA
74 -

^ c#° ■*&* \aÔe ^

xo.° c pi- f«- ^'

Figure 3.1 Populations bactériennes de Lc. cremoris W62, Lc. lactis A23 et Lc. lactis H13
pendant la fabrication et au jom 1 des fromages. Les barres d'erreur représentent les erreurs
standard des moyennes (ESM).

92
3.4.7 Évolution des populations microbiennes pendant l'affinage

La figure 3.2 présente les populations microbiennes de Lc. cremoris W62, Lc. lactis A23 et Lc.
lactis H13 dans les fromages pendant 56 joms d'affinage.

Les populations des souches de Lc. lactis A23 et H13 ont été affectées par la durée de l'affinage
{P < 0.05). Il y a également eu une interaction significative entre la souche productrice de GABA
utilisée dans la composition du ferment et le temps de maturation des fromages {P < 0,05). Tel
que mentionné et discuté précédemment, la souche A23 a démontré des populations bactériennes
inférieures à la souche H13 au jom 1. Après 16 jours d'affinage, ce phénomène s'estompe et les
fromages A23 et H13 présentent des populations bactériennes de Lc. lactis similaires. Aussi, les
populations de Lc. lactis démontrent une croissance marquée pendant les 29 premiers joms de
l'affinage puis un ralentissement par la suite, processus observé lors de l'affinage de fromages de
type Cheddar (Lynch et al., 1996 ; Daigle et al., 1999 ; Beresford et Williams, 2004 ; Champagne
et al., 2009)

La souche Lc. cremoris W62 a été affectée par sa combinaison avec une souche productrice de
GABA à l'intérieur du ferment de même que par la durée de l'affinage (P < 0.05). Une
interaction significative entre la composition du ferment de même que la durée de l'entreposage a
également été observée (P < 0.05). Les comptes viables de Lc. cremoris W62 diminuent de façon
marquée pendant les 29 premiers joms de l'affinage puis se stabilisent ensuite, phénomène aussi
observé par Champagne et al. (2009). Il n'y a donc pas de différence entre les populations de Lc.
cremoris W62 des différents fromages pendant les 15 premiers joms de l'affinage. Par la suite,
les populations observées de Lc. cremoris W62 sont inférieures dans les fromages A23 et H13
par rapport aux fromages témoins exempts de souches productrices de GABA. Ceci peut
s'expliquer par la compétition par les souches Lc. lactis A23 et H13 qui se sont développées
rapidement pour atteindre lem concentration maximale après 29 joms.

93
 a)

9.0

-■— Fromage A 23

TÉ—From age H13

60
T e m p s (jours)

b)

■ Fromage témoin
■ Fromage A 23
■ Fromage H13

Temps (jours)

* Valeurs estimées à un log < 5.0 en raison de l'absence de colonie de Lc, cremoris W62 à une dilution de
10"s dû à l'encombrement de la surface du pétri par les colonies de Lc. lactis A23 et H13

Figure 3.2 Populations bactériennes de Lc. lactis A23 et H13 (a) et Lc. cremoris W62 (b)
pendant l'affinage des fromages. Les barres d'erreur représentent les erreurs standard des
moyennes

94
3.4.3 Évolution du pH
La figure 3.3 présente l'évolution du pH des fromages au corns de l'affinage.

Fromage témoin
Fromage A23
Fromage H13

4.70
4.65
4.60
10 20 30 40 50 60
Temps d'affinage (jours)

Figure 3.3 Évolution du pH des fromages pendant l'affinage

Pom les trois fromages, seul le temps d'affinage affectait significativement les valeurs de pH (P
< 0.05), passant en moyenne d'une valeur de 4,97 au jom 1 à 4,83 au jom 56. Ainsi, la
composition du ferment, qu'il renferme ou non une souche productrice de GABA, n'a pas eu
d'impact sur l'évolution du pH des fromages en fonction du temps d'affinage.

Le pH était initialement compris entre 4,95 et 5,00 pour les trois fromages, le pH enregistré pom
le fromage témoin étant plus faible que pom les fromages A23 et H13. Ce phénomène pourrait
être relié au développement des populations microbiennes au cours de la fabrication. En effet, la
figure 3.2 montre une plus grande quantité de Lc. cremoris W62 dans le fromage témoin au jour
1 par rapport aux fromages A23 et H13. Or, la souche Lc. cremoris W62 est principalement
responsable de l'acidification du lait lors de la fabrication. De ce fait, les populations de Lc.
cremoris W62 plus élevées dans le fromage témoin engendrent une acidification supérieure au

95
jom 1. Par la suite, l'acidification du fromage au corns de l'affinage suivait la même évolution
pour les trois fromages.

Dmant les 15 premiers jours d'affinage, le pH des fromages témoin, A23 et H13 montrait une
baisse constante pom se stabiliser par la suite. Cette diminution du pH pourrait être expliquée par
la survie des lactocoques qui poursuivent la dégradation du lactose résiduel à l'intérieur de la
matrice fromagère, ce qui contribue à la post-acidification observée (Turner et Thomas, 1980 ;
Mietton et al., 1994). En effet, dans le cas du cheddar, les grains sont salés en corns de
fabrication, ce qui ralentit considérablement le métabolisme du lactose à l'intérieur de la pâte.
Une tenem d'environ 10 g de lactose/kg de fromage peut ainsi être retrouvée après pressage puis
transformée en lactate dans les premiers jours de l'affinage (Turner et Thomas, 1980). La teneur
en humidité des fromages plus élevée qu'un Cheddar commercial indique une plus grande
proportion de lactosérum retenue à l'intérieur du caillé, donc une quantité supplémentaire de
lactose. La quantité de lactose dans les fromages n'a cependant pas été déterminée dans cette
étude. Cependant, le principal facteur influençant la conversion du lactose en lactate est la
quantité de sel dissous dans la phase aqueuse du fromage, soit le ratio S/H. Normalement, un
faible ratio S/H (< 4,1%) engendre une métabolisation rapide du lactose résiduel ainsi qu'une
chute du pH du fromage, le lactose étant épuisé après quelques joms (O'Connor, C.B., 1974 ;
Thomas et Pearce, 1981 ; Mietton et al., 1994). Dans le cas de la présente étude, le ratio S/H des
fromages était de 3,36% et la post-acidification a été observée jusqu'à 15 jours de maturation. Ce
phénomène peut être expliqué par l'activité métabolique ralentie des ferments lactiques à faible
pH en fin de fabrication fromagère. Tel que décrit à la section 2.4.4.2, le pH visé en fin de
fabrication était de 4,8 afin d'optimiser les conditions de production de GABA à l'intérieur de la
pâte. Or, dans une fabrication typique de Cheddar destiné à la maturation, le pH est abaissé
jusqu'à 5,2 en fin de fabrication (St-Gelais et Tirard-Collet, 2002). Le pH optimal des bactéries
lactiques étant compris entre 6,0 et 6,5, il se peut que cette baisse accrue du pH pom favoriser la
production de GABA ait affecté de manière significative l'activité des enzymes microbiennes des
ferments, ce qui a pu résulter en une dégradation plus lente du lactose en début de maturation et
ce, malgré la pression osmotique relativement faible (ratio S/H de 3,36).

Le pouvoir tampon des fromages fabriqués a également eu un effet déterminant sm l'évolution de

lem pH au cours de l'affinage. Cette propriété est régie essentiellement par les concentrations en
ions phosphates, citrates, lactates et en caséines (Mietton et al., 2004). Le pH au soutirage en
96
cuve ainsi que l'acidification du caillé à la fin de la cheddarisation sont deux des facteurs
déterminant le niveau de solubilisation du phosphate de calcium colloïdal et par conséquent, sa
contribution au pouvoir tampon du caillé (Lawrence, R.C. et Gilles, J., 1982). Pom un procédé
de fabrication de Cheddar, des valems de pH de 6,0 au soutirage ainsi que 5,2 en fin de
fabrication sont normalement visées (St-Gelais et Tirard-Collet, 2002, Lawrence et al., 2004).
Dans le cas de la présente étude, le soutirage réalisé à pH 5,8 et l'acidification poussée du pH à
4,9 à la fin du processus ont engendré une plus grande solubilisation du phosphate de calcium
colloïdal qui est ensuite évacué avec le lactosérum. Les fromages fabriqués sont donc plus
déminéralisés et possèdent un pouvoir tampon plus faible. Ainsi, le métabolisme du lactose en
lactate pendant les 15 premiers jours d'affinage a généré une acidification qui a fait diminuer le
pH malgré la capacité tampon des fromages.

97
3.4.4 Évolution de la protéolyse

La figure 3.4 présente les résultats des indices de protéolyse pom les fromages témoins, A23 et
H13. Aucune différence significative n'a été observée entre les trois fromages {P > 0,05). Seul le
temps de maturation a affecté significativement la protéolyse des fromages {P < 0,05). Les
indices de protéolyse primaire des fromages ont augmenté de 5,64% au jom 1 à 21,23% après 56
jours d'affinage.

22.00
20.00
18.00
16.00
14.00
LU 12.00 Fromage témoin
(O
Z 10.00 Fromage A23
Fromage H13

- 1 —

20 30 40 50 60
Temps d'affinage (jours)

Figure 3.4 Évolution de la protéolyse primaire des fromages pendant l'affinage

Les indices de protéolyse mesmes sont comparables aux valems moyennes observées dans le cas
du fromage cheddar (O'Keefe et al., 1977, Upadhyay et al., 2004 ; St-Gelais et al., 2009). La
protéolytique primaire résulte de l'activité de l'agent coagulant utilisé, des enzymes indigènes du
lait ainsi que des bactéries du ferment (St-Gelais et Tirard-Collet, 2002 ; McSweeney, 2004). De
part lem composition différente, les trois ferments utilisés pom cette étude auraient ainsi pu
induire des variations dans la protéolyse au cours de l'affinage. L'ajout d'une souche lactique
productrice de GABA à l'intérieur d'un ferment n'a donc pas eu d'influence sur le phénomène de
protéolyse des fromages.

98
3.4.5 Évolution de la texture
La figure 3.5 présente l'évolution de la dureté des fromages aux joms 16, 29 et 56 de l'affinage.
La dmeté des trois fromages a significativement diminué en fonction du temps {P < 0,05),
diminuant en moyenne de 0,075 MPa au jom 16 à 0,065 MPa après 56 joms d'affinage. La
composition du ferment n'a pas eu d'effet significatif sm l'évolution de la dmeté des fromages {P
> 0.05). D'autre part, aucune interaction significative sur ce paramètre de texture n'a été observée
entre le temps et la composition du ferment.

Fromage témoin
Fromage A23
Fromage H13

ra
Q.
bcd
bed

3
O

16 29 56
Temps d'affinage (jours)

Figure 3.5 Évolution de la dureté (MPa) des fromages au corns de l'affinage

La dureté d'un fromage de type Cheddar, initialement comprise entre 0,10 et 0,15 MPa, décroit
de façon marquée dmant les deux premières semaines pendant lesquelles la dégradation de la
caséine asi entraîne une destruction du réseau. La diminution de la fermeté ralentit par la suite
selon le taux de protéolyse (Upadhyay et al., 2004; Lawrence et al., 2004; St-Gelais et al, 2009).
Dans la section 3.4.4, il a été effectivement démontré que le taux de protéolyse primaire pour les
fromages témoin, A23 et H13 observait un ralentissement après 16 joms de maturation,
conduisant à une diminution proportionnelle de la densité des fromages au fil du temps. Outre le

99
phénomène de protéolyse, qui influence majoritairement la texture d'un fromage, la composition,
le ratio S/H ainsi que le pH ont eux aussi un impact sur la texture. Le pH des fromages de cette
étude, plus bas que celui d'un Cheddar commercial, a également pu affecter la dmeté des
produits. En effet, à des valems de pH inférieures à 5.0, les protéines de la microstructure se
compactent et engendrent une texture friable et farineuse (Lawrence et al., 2004). Cela
expliquerait la dureté inférieure mesmée pour les fromages de cette étude par rapport aux valeurs
normalement retrouvées pour un Cheddar standard (0,10-0,15 MPa).

L'absence de différences significatives entre les fromages témoins, A23 et H13 au niveau de la
composition, du ratio S/H, du pH, et de l'indice de protéolyse primaire expliquent le profil de
texture similaire entre les trois fromages, la dureté légèrement supérieure du fromage témoin aux
jours 16 et 29 résultant probablement du fruit du hasard.

100
3.4.8 Analyse sensorielle des fromages
La figure 3.6 illustre la somme des rangs obtenus pom les trois fromages en fonction des attributs
de flaveur globale, d'amertume et d'acidité évalués.

En ce qui concerne la flaveur globale, l'analyse de la somme des rangs attribués par le test de
Friedman a démontré qu'il n'y avait aucune différence significative entre les différents fromages
et ce, pour les deux productions analysées {P > 0,05). Le fromage A23 a toutefois obtenu la
somme des rangs la plus élevée pour la flaveur globale du produit goûté. L'analyse de
l'amertume a également révélé l'absence de différence significative {P > 0,05) bien que le
fromage témoin W62 était considéré comme étant le moins amer. Enfin, il n'existait aucune
différence significative {P > 0,05) au niveau de l'acidité des fromages. Le fromage A23 a
néanmoins été jugé comme étant le moins acide des trois fromages, les fromages témoin et H13
étant très similaires sm ce plan.

101
 Flaveur globale Fromage témoin
Fromage A23
Fromage H13

2> 60

■5 40
«
E 30
I 20
OT

Production 1 Production 2

Amertume Fromage témoin

Fromage A23
Fromage H13

Production 1 Production 2

Acidité
Fromage témoin
Fromage A23
Fromage H13

R-oduction 1 Production 2

Figure 3.6 Évaluation de la flaveur, de l'amertume et de l'acidité des fromages témoin, A23 et
H13 après 20 joms d'affinage

102
Lors de l'analyse sensorielle des fromages, il était également possible pour les évaluatems de
caractériser les produits goûtés en leur attribuant une mention parmi un choix de 11
caractéristiques. La figure 3.7 illustre la fréquence des mentions attribuées afin de caractériser les
échantillons de fromages goûtés. Ainsi, pom les trois fromages analysés, les évaluateurs ont
classé les fromages comme étant similaires et plus particulièrement utilisé les attributs « typique
du Cheddar », ainsi que « pâteux » pom caractériser les produits.

Suite à l'analyse sensorielle, il est donc intéressant de constater que la présence de GABA dans
les fromages n'a pas été perçue par les juges, comme en témoigne l'absence de différence
significative entre les produits pom les attributs de flaveur globale, d'amertume et d'acidité. La
mention « typique du Cheddar », attribuée aux échantillons analysés, englobe des caractéristiques
telles que la flaveur typique du Cheddar, un faible niveau d'amertume, un bon dosage d'acidité,
la présence de notes de diacétyle ainsi que le goût lacté frais. L'aspect « pâteux » des fromages
pourrait être expliqué par l'acidité et la déminéralisation des produits. L'humidité supérieure à la
normale, apporte un aspect plus cireux au niveau de la texture (Kosikowski et Mistry, 1997). À
des valems de pH inférieures à 5.0, les protéines responsables de la microstructure des fromages
prennent une conformation plus compacte, engendrant une texture friable et farineuse (Lawrence
et al., 2004).

Selon les analyses sensorielles, les fromages fabriqués lors de cette étude possèdent donc les
caractéristiques normalement retrouvées dans un fromage de type Cheddar commercial et la
production de GABA ne semble pas avoir affecté les qualités organoleptiques des produits.

103
 Caractérisation des échantillons- Répétition 1
16
c Fromage Témoin
14
o
4jS\Z
12 Fromage A23
C Fromage H13
10
E 8
TJ
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Caractérisation des échantillons- Répétition 2

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c Fromage Témoin
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E Fromage H13
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cf

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Figure 3.7 Analyse sensorielle des fromages témoin, A23 et H13

104
3.4.7 Transformation du glutamate en GABA

Les figures 3.8 et 3.9 présentent la conversion du glutamate en GABA dans les fromages pendant
l'affinage.

Le ferment utilisé de même que la durée de l'affinage ont montré un impact significatif sm la
formation de glutamate dans les fromages {P < 0,05). De plus, une interaction significative a été
observée entre ces deux paramètres {P < 0,05). Le fromage témoin possédait une concentration
moyenne en glutamate pendant l'affinage (0.378 mg/g fromage) nettement supérieure aux
fromages A23 et H13 (0.124 et 0.133 mg/g fromage). Les concentrations en glutamate
emegistrées pom le fromage témoin de même que son augmentation au corns de la maturation
correspondent au phénomène normalement observé lors de l'affinage d'un Cheddar régulier
(Lynch et al., 1996 ; Wallace et Fox, 1997 ; Banks et al., 2001 ; Lacroix et al., 2010).

La quantification du GABA a permis de confirmer l'absence de formation de GABA dans le

fromage témoin au cours de l'affinage. Ces résultats confirment ceux de l'équipe de Nomma
(1999), qui a démontré que les souches de Lc. cremoris étaient dans l'incapacité de produire du
GABA. Aucune différence significative de production de GABA n'a été observée entre les
fromages A23 et H13 {P > 0,05). Le temps a eu un impact significatif sm la production de GABA
(P < 0,05), la concentration moyenne de GABA des fromages A23 et H13 passant de 0,056 mg/g
fromage au jom 1 à 0,365 mg/g fromage après 56 jours d'affinage.

Chez les souches productrices, la glutamate decarboxylase (GAD) catalyse la decarboxylation du

L-glutamate en une molécule de GABA. Cette relation entre la quantité de glutamate générée au
cours de raffinage et sa transformation en GABA est clairement illustrée aux figures 3.7 et 3.8.
Dès le jom 1, les concentrations en glutamate sont significativement plus faibles dans les
fromages A23 et H13 que dans le fromage témoin. Ce même phénomène a pu être constaté par
Lacroix et al. (2010) dans des caillés modèles. Leurs résultats démontraient également une
corrélation négative (r = -0,86) entre la quantité de glutamate et la quantité de GABA. Cette
corrélation négative n'est pas parfaitement linéaire dans la présente étude, puisqu'il faut tenir
compte du fait que les souches de Lc. lactis productrices de GABA, tout comme la souche de Lc.
cremoris W62, ont la capacité de produire du glutamate. Contrairement au fromage témoin, le

105
glutamate n'est pas accumulé dans les fromages A23 et H13 mais cycliquement produit et utilisé
pour être transformé en GABA. D'autre part, la présence de GABA dans les fromages A23 et
H13 au jom 1 témoigne du fait que la transformation du glutamate en GABA ait pu débuter
pendant la fabrication fromagère. Comme le suggère Gale (1946), les souches de Lc. lactis ssp
lactis débutent la conversion du glutamate en GABA en réponse au stress induit par
l'acidification. Ainsi, les souches A23 et H13 ont pu débuter la production de GABA pendant le
processus d'acidification du lait. Cette hypothèse est soutenue par les travaux de Nomura (1998),
qui observait également une production de GABA par des souches de Lc. lactis ssp lactis au
cours de la fermentation du lait.

Dans certains fromages contenant du GABA, Zoon et Allersma (1996) ont observé la formation
de fentes et d'ouvertures pouvant être associé à la réaction de decarboxylation qui libère du CO2
lors de la formation du GABA. Les fromages de type St-Paulin expérimentaux de Nomma et al.
(1998) ont montré le même phénomène. Le taux élevé de production de GABA (1,9 mg de
GABA/g de fromage) ainsi que la rigidité de la pâte en seraient la raison. Dans la présente étude,
les fromages A23 et H13 n'ont pas présenté d'ouvertures ni de fentes. Les concentrations en
GABA inférieures à 0,4 mg de GABA/g de fromage de même que la faible dmeté des fromages
ont pu limiter la formation d'ouvertures.

Les quantités de GABA produites à l'intérieur des fromages A23 et H13 sont également à
mentionner. Tout d'abord, les fromages A23 et H13 renfermaient une concentration moyenne de
0,365 mg de GABA/g de fromage après 56 joms de maturation, ce qui est largement supérieur à
la quantité présente dans des fromages Cheddar commerciaux qui varie de 0,01 à 0,06 mg de
GABA/g de fromage (Nomma et al., 1998; Banks et al., 2001; Lacroix et al., 2010). De plus,
l'optimisation des conditions de fabrication (pH final, ratio S/H et ratio des souches du ferment) a
permis d'obtenir par voie naturelle des concentrations maximales de GABA supérieures aux
quantités retrouvées dans des fromages Cheddar expérimentaux dont le lait a préalablement été
enrichi en a-ketoglutarate afin d'optimiser le catabolisme des acides aminés (Banks et al., 2001).
Les quantités de GABA détectées dans les fromages A23 et H13 sont cependant inférieures aux
quantités produites à l'intérieur des caillés modèles incubés à 30°C (0,796mg GABA/g caillé)
(section 2.4.4.2), phénomène pouvant être expliqué par la température optimale de l'enzyme

106
GAD de 40°C (Komatsuzaki et al., 2005) favorisant ainsi le développement du GABA dans les
caillés modèles comparativement aux fromages affinés à 10°C puis à 7°C.

Les quantités de GABA produites dans les fromages par les souches de Lc. lactis A23 et H13
permettent d'envisager des résultats prometteurs au niveau de la santé humaine. L'ingestion
d'une dose quotidienne de 100ml de lait fermenté renfermant entre 10-12 mg de GABA a
contribué à diminuer significativement la pression artérielle de sujets humains hypertendus
(Inoue et al., 2003). Considérant la présence d'une quantité moyenne de GABA de 0,365 mg/g de
fromage après 56 jours d'affinage, la prise quotidienne d'une portion de fromage de 30g
correspondrait à la consommation de 10,95 mg de GABA et pourrait démontrer un effet positif
sm la pression artérielle.

107
 a ■ Fromage Témoin
■ Fromage A 23
■ Fromage H13

Figure 3.8 Évolution du glutamate dans les fromages pendant l'affinage

0.50
Fromage A 23
0.45
Fromage H13
0.40
"ôT
O) 0.35
ra
g 0.30
W 0.25
O)
£ 0.20
< 0.15
<
C3 0.10
0.05

0.00
16 29
Temps (jours)

Figure 3.9 Formation du GABA dans les fromages pendant l'affinage

108
3.5 CONCLUSION

Cette étude a démontré que la formation de GABA par des souches de Lc. lactis à l'intérieur de
fromages de type Cheddar n'engendrait pas de modifications au niveau de la composition
générale des fromages de même que sur les paramètres de pH, de protéolyse et de texture. De
plus, une analyse sensorielle réalisée sm les fromages n'a révélé aucune différence entre les
fromages enrichis en GABA et les fromages témoins au niveau des attributs de flaveur globale,
d'amertume et d'acidité. Une quantité maximale de 0,367 mg de GABA/g de fromage a été
formée. Considérant qu'une portion de 30g de fromage contiendrait lOmg de GABA, cette
concentration est prometteuse sur le plan de la santé humaine, car des quantités équivalentes dans
des laits fermentes ont montré une baisse de la pression artérielle chez des sujets hypertendus
(Inoue et al., 2004). Il est important de mentionner qu'une concentration maximale de GABA de
0,365 mg/g de fromage a été obtenue de façon naturelle par l'optimisation des conditions de
fabrication fromagère et sans ajout de cofacteurs (pyridoxal-5-phosphate, a-kétoglutarate). Cette
étude a donc démontré la possibilité de produire un fromage de type Cheddar naturellement
enrichi en GABA qui pourrait avoir des propriétés anti-hypertensives. Cet effet reste cependant à
valider par une étude clinique auprès de patients hypertendus.

109
 CONCLUSION GENERALE

L'acide gamma-aminobutyrique (GABA), neurotransmetteur agissant au niveau du système

nerveux central et reconnu pom sa capacité à abaisser la pression artérielle, peut être produit par
certaines souches de bactéries lactiques. Un lait fermenté à partir de souches productrices de
GABA a été administré à des patients hypertendus et a démontré un effet positif. Considérant que
plus de 14% de la population canadienne est au prise avec des problèmes d'hypertension et que le
marché des aliments fonctionnels ne cesse de croître, les objectifs de ce projet étaient donc de
sélectionner des souches démontrant une capacité supérieure de production de GABA
biocompatibles avec des souches industrielles dans le but de formuler de nouveaux ferments aux
propriétés anti hypertensives. Ensuite, l'étude de certains paramètres de fabrication fromagère ont
été évalués afin de connaître leur impact sur la production de GABA par les souches. À partir des
conditions optimales de production de GABA ainsi déterminées, le dernier objectif de ce projet
était de fabriquer un fromage naturellement emichi en GABA par les souches productrices.

À partir de 9 souches de L. lactis ssp lactis productrices de GABA, provenant de ferments

traditionnels canadiens datant des années soixante, la quantification du GABA produit pour
chacune des souches de même qu'une étude de proximité génétique ont permis de sélectionner
deux souches productrices de GABA, L. lactis A23 et H13, démontrant à la fois une forte
capacité de production de GABA, des différences au point vu génétique ainsi qu'une meilleure
biocompatibilité avec la souche L. cremoris W62. Ensuite, l'étude de certains paramètres de
fabrication fromagère (ratio sel/humidité, pH, concentration en glutamate) sur la production de
GABA dans des caillés modèles, a confirmé l'impact déterminant d'un pH acide (4,8), d'une
teneur en NaCl modérée de même que l'affinage sm une longue période pom obtenir une quantité
de GABA maximale.

Des fromages de type cheddar enrichis en GABA par les souches productrices ont été fabriqués
sous les conditions de fabrication optimale de production de GABA. Les diverses analyses
effectuées sm les fromages ont démontré que la formation de GABA n'engendrait pas de
modifications au niveau de la composition générale ni sm le profil de protéolyse et de la texture.
De plus, une analyse sensorielle réalisée sm les fromages n'a révélé aucune différence entre les
110
fromages enrichis en GABA et le témoin sm les attributs de flaveur globale, d'amertume et
d'acidité.

Les concentrations en GABA produites à l'intérieur des fromages permettront d'envisager un

effet au niveau de la santé humaine dans un but de réduire la pression artérielle. Une étude
clinique est actuellement en corns dans le but de valider l'effet hypotenseur de ces fromages.
Suite aux résultats obtenus, il serait pertinent d'évaluer l'effet d'autres paramètres de fabrication
fromagère ou de technologies fromagères différentes, présentant également des conditions
théoriquement favorables au développement de GABA, par exemple le Saint-Paulin, dans le but
de générer une diversité de fromages fonctionnels pour réduire la pression artérielle. Enfin, mie
étude de marché devra également être réalisée dans le but de connaître l'intérêt de tels fromages
dans le secteur des aliments fonctionnels.

111
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121
ANNEXE I
Préparation de culture congelée

1. Réactivation de la souche (à partir d'un vial congelé)

1.1 Préparer du lait écrémé à 12% (p/p) et stériliser à l'autoclave 10 minutes à 110°C
1.2 Après la stérilisation, refroidir le lait sur un bain de glace
1.3 Dégeler un cryovial de la souche à réactiver
1.4 Transférer 1 ml de culture stock à 9 ml de lait autoclave (réveil à 10%)
1.5 Incuber à 21°C, 15 hemes (préculture)
2. Repiquage de la souche
2.1 Inoculer du lait écrémé 12% (p/p) stérile à 1% à partir de la préculture
2.2 Incuber à 21°C, 15 hemes
3. Préparation du milieu à congélation
3.1 Préparer une solution d'acide ascorbique à 17,5% et la filtrer sur 0,22 pm dans un tube
stérile
3.2 Préparer dans une bouteille de verre le milieu à congélation :
20 g de lait écrémé en poudre
5 g de sucrose
Compléter à 100 g avec de l'eau millipore
3.3 Stériliser à l'autoclave 10 minutes à 110°C Après stérilisation, mettre dans un bain de
glace pour refroidir. Ce milieu se conserve à 4°C pendant une semaine.
3.4 Distribuer 15 ml de milieu à congélation dans des tubes stériles de 50 ml (un tube pour
chaque souche à conserver)
3.5 Ajouter 0,4 ml d'acide ascorbique à chaque 15 ml de milieu pom obtenir une
concentration finale de 0,35%

4. Mise en vials pom congélation

4.1 Prélever 5 ml de la culture mère fraiche et l'ajouter à 15 ml de milieu à congélation
supplémenté en acide ascorbique
4.2 Distribuer 1 ml du milieu inoculé dans les cryovials stériles et conçus pom la
congélation
4.3 Congeler les vials à -80°C jusqu'à utilisation

122
ANNEXE 2
Paramètres programmés lors de l'utilisation de l'appareil BIOSCREEN™ pour
l'évaluation de la biocompatibilité des souches

Température d'incubation 30°C

Filtre optique Filtre #7

Longueur d'onde 600 nm

Agitation constante pendant 10 secondes, juste
Fréquence d'agitation
avant la prise de mesure de la densité optique
Vitesse d'agitation Moyenne

Fréquence de mesure de densité optique Mesures aux 15 minutes, période de 24 heures

Type de microplaque 200 puits (2 plaques de 100 puits chacune)

Préchauffage de la chambre d'incubation jusqu'à
Conditionnement de l'appareil
l'atteinte d'une température de 30°C

123
ANNEXE 3
Conditions détaillées de chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectrogramme de
masse (GC-MS) pour la quantification de la production de GABA par les souches
productrices

CP-3800 Gas Chromatograph

Détecteur : Saturn 2000 Gc/MS/MS
Chromatogramme
Injecteur: Splitt/Splittless
Varian Inc, Mississauga, Ontario, Canada
Variant FactorFour Capillary Colomn
Colonne VF-5ms 30mx0,25mm ID DF=0.25
Variant Inc, Mississauga, Ontario, Canada
Gerstel Multipurpose Sampler
Injecteur MPS2/Twister
Gerstel Inc, Baltimore, Maryland, É.-U.
Température du port d'injection maintenue à 225°C
Température du four : maintenue à 35°C pour 1 min puis augmentation à
200°C à un taux de 6°C/min et maintenue à 200°C pour 3 min.
Conditions de chromatographie Température ensuite augmentée à 250°C à un taux de 10°C/min et maintenue à
250dant 4 min
Gaz transporteur: Hélium, ratio 1:10, flux constant de 2.0ml/min

Énergie d'impact des électrons: 70 eV

Température du four : 95°C

Température de la boucle : 160°C

Température transfert : 170°C

Paramètres de l'échantillonneur
à espace de tête Temps de calibration du vial : 30 min

Temps pressurisation : 0.5 min

Temps total pour effectuer une boucle : 0.25 min

Temps d'injection : 1.0 min

124
ANNEXE 4
Conversion des résultats obtenus au CG-FID (quantification du glutamate) et au GC-MS
(quantification du GABA) en mg par gramme de fromage

1) Préparation de l'extrait WSN :

10 g de fromage + 20 g d'H 2 0 + 20 g d'H 2 0 (si 2 extractions) = 50 g total

Facteur dilution (Fd) = 50 g total = 5.0 (facteur varie selon les qté précises pesées)
10 g fromage

2) Extraction d'acides aminés à partir du kit EZ-Faast : volume de WSN fixé aux billes : 100 pi

Dans 100 pi, selon le factem de dilution, la quantité de fromage analysé est :
100 pi = quantité réel de fromage analysé dans 100 pi =20 mg
Fd (ex 5.0)

Rapporter le résultat du GABA ou du taux de Glutamate mesuré par g de fromage :

Ex : 700 nmoles de GABA (ou GLU) = pom 20 mg

700 nmoles x 50 (pom remettre en g) = pour 1 g de fromage
** Attention : Vérifier la calibration de la combe standard et s'assurer que les résultats soient
compris à l'intérieur des différents niveaux de calibration

3) Transformation des nmoles ( 1 x IO"9 moles) en g ou mg de substance dosée :

PM GABA = 103.12 g / mole

PM Glutamate = 147.13 g / mole ANNEXE 6

125
ANNEXE 5
Caractéristiques physico-chimiques et microbiologiques de la poudre de caillé modèle

Paramètres Moyenne de triplicatas

Compte total mésophile (UFC/g) <10

Coliformes (UFC/g) <10
% protéines 37,266 ±0,4715
% humidité 1.58 c± 0,35
% gras 51,32 ±0,97

126
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ANNEXE 7
Tableau 3.1 Conditions de chromatographie pour la quantification du glutamate au GC-
FDD

Injection 2.0 pi, Split 1 :15à250°C

Gaz porteur Hélium l,5ml/min, flux constant
Augmentation de la pression 3kP a/min
Température initiale de 110°C, montée
Programmation du four de 32°C/min jusqu'à 320°C, maintient
pendant 5 minutes
Détecteur 320°C
Zebron ZB-AAA GC (10m x 0.25mm)
Colonne (phenomenex, Torrance, Californie, É.-
U.)

128