Analyse Des Macromolécules Biologiques - Introduction: Réf.: P3300 V3

Réf.
: P3300 V3
Analyse des
Date de publication :
10 juin 2018 macromolécules biologiques
- Introduction
Cet article est issu de : Procédés chimie - bio - agro | Bioprocédés
par Gwenola BURGOT
Mots-clés Résumé Les macromolécules biologiques synthétiques connaissent un développement

Biotechnologies | Chimie considérable grâce à l’essor des biotechnologies. Leur mode d’obtention par
analytique
biotechnologie impose d’avoir recours à des techniques particulières d’analyse aussi bien
pendant les études de développement qu’en analyse de routine. Deux types d’exemples
sont présentés dans cet article pour montrer les apports de la chimie analytique et la
place qu’elle tient tout en demeurant dans le cadre strict de sa discipline : biotechnologies
faisant appel à des processus de fermentation et de génie enzymatique et
biotechnologique reposant sur la recombinaison génétique (génie génétique).
Keywords Abstract Synthetic biological macromolecules experience a considerable development

biotechnology | analytical thanks to the growth of biotechnology. Their method of production needs to use special
chemistry
analytical techniques both during development studies and routine analysis. Two different
types of examples are described to shown the contribution of the analytical chemistry and
the place it holds while remaining in the regulatory framework of discipline:
biotechnologies using fermentation processes and enzyme engineering and biotechnology
based on genetic recombination or genetic engineering.
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Analyse des macromolécules

biologiques
Introduction
par Gwenola BURGOT
Professeur des Universités
Laboratoire de Chimie Analytique, Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques,
Université de Rennes1, Rennes, France
Note de l’éditeur
Cet article est la version actualisée de l’article P3300 intitulé « Analyse des macromolécules
biologiques. Introduction », rédigé par Fernand PELLERIN paru en 1999
1. Enjeux et contexte ............................................................................................ P 3 300v3 - 3

2. Applications........................................................................................................ — 4
2.1 Produits issus des fermentations et des réactions enzymatiques .......... — 4
2.1.1 Préparation d’enzymes ...................................................................... — 4
2.1.2 Spécificité des enzymes .................................................................... — 4
2.2 Produits issus des protéines ...................................................................... — 5
2.2.1 Production et contrôle de la matière première................................ — 5
Parution : juin 2018 - Ce document a ete delivre pour le compte de 7200045224 - universite de strasbourg // 130.79.168.107
2.2.2 Contrôle du produit fini ou préparation pharmaceutique .............. — 6

3. Conclusion et perspectives ............................................................................. — 6
4. Glossaire.............................................................................................................. — 6
Pour en savoir plus .............................................................................................. Doc. P 3 300v3
L es macromolécules biologiques artificielles connaissent un essor considé-

rable depuis que les procédés de biotechnologie ont permis de les
synthétiser. Ces procédés regroupent des techniques d’utilisation de matériaux
vivants pour synthétiser ou modifier des molécules. Par l’application intégrée
des sciences biochimiques et microbiologiques, de la génétique et du génie
chimique, les biotechnologies permettent le développement industriel des
capacités et des propriétés des micro-organismes des cultures cellulaires et
des produits qui en dérivent. On les retrouve dans les grands domaines
d’applications : agroalimentaire, santé, biodiversité marine, environnement.
De nouveaux produits sont ainsi apparus. Dans le domaine agricole, la sélec-
tion de nouvelles variétés fait appel aux progrès de la génétique moléculaire et
se matérialise par une amélioration de la résistance des végétaux aux intempé-
ries ou aux prédateurs, comme par celle du rendement. Dans le domaine
agroalimentaire, on assiste à l’élaboration de nouvelles protéines, comme à
l’accélération de la croissance des animaux d’élevage. Dans le domaine de la
santé, des progrès spectaculaires ont été enregistrés : production en pleine
extension de vaccins à partir de protéines purifiées, de peptides synthétiques,
d’anticorps monoclonaux à visée thérapeutique.
Les propos de la rubrique « Analyse des macromolécules biologiques » ne
sont pas d’entrer dans le cadre de multiples contrôles auxquels doivent donner
lieu les produits biotechnologiques : microbiologiques, biologiques, immuno-
logiques, etc., ni d’entrer dans celui des règlements qui, sur le plan
international ou européen, permettent de mieux appréhender les problèmes.
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ANALYSE DES MACROMOLÉCULES BIOLOGIQUES _________________________________________________________________________________________
Seule, la participation de la chimie analytique y est développée et permet de

fournir des méthodes d’analyse pour contribuer à la connaissance structurale
des macromolécules tout en constituant un outil qualité pour l’analyse de
production.
Cet article constitue une introduction aux articles de la rubrique « Analyse
des macromolécules biologiques ».
Sigles
Abréviations Définitions
CEE Communauté Économique Européenne
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbant Assay
ESI Electrospray ionisation
HMSO Her Majesty’s Stationnery Office
HPLC High performance liquid chromatography
ICH International Conference of Harmonization
IUPAC International Union for Pure and Applied Chemistry
MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time of Flight
MS Mass Spectrometry
RMN Résonance Magnétique Nucléaire
SDS-PAGE Sodium Dodécyl Sulfate Polyacrylamide Gel

Electrophoresis
USP United States Pharmacopeia (Pharmacopée américaine)
La notion de macromolécules est introduite en 1922 par un chimiste alle-

mand, Hermann Staudinger qui les définit comme des enchaînements d’uni-
tés équivalentes ou monomères liés entre eux par des liaisons covalentes.
Elles sont caractérisées par un poids moléculaire élevé. Il existe des macro-
molécules d’origine organique, les protéines, les glucides mais également
d’origine minérale comme les silicones à base de silice et d’oxygène.
Les macromolécules biologiques ou biomolécules recouvrent quatre
groupes de substances (polysaccharides, protéines, acides nucléiques et
lipides) parmi lesquelles seuls les lipides ne sont pas de nature polymé-
rique. Les macromolécules biologiques relèvent des domaines de la santé
ou de la microbiologie avec des composés d’origine naturelle, notamment
les composés cellulaires, ou d’origine synthétique, comme les médicaments
ou les enzymes.
Les macromolécules biologiques artificielles ont longtemps été obtenues
par modification de la macromolécule naturelle de référence ou par syn-
thèse d’un monomère. Mais, les possibilités restaient limitées. Ce n’est que
grâce à l’arrivée des procédés de biotechnologie que la production des
macromolécules biologiques artificielles a pu connaître un essor important.

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_________________________________________________________________________________________ ANALYSE DES MACROMOLÉCULES BIOLOGIQUES
1. Enjeux et contexte Une définition précise a été donnée par la Fédération euro-
péenne et par l’Union Internationale de Chimie Pure et Appli-
Les macromolécules biologiques synthétiques doivent leur quée (IUPAC) : « Par l’application intégrée des sciences
essor aux procédés de biotechnologies. Ceux-ci regroupent des biochimiques et microbiologiques, de la génétique et du génie
techniques d’utilisation de matériaux vivants pour synthétiser ou chimique, les biotechnologies permettent le développement
industriel des capacités et des propriétés des micro-organismes
modifier des molécules. On les retrouve dans les grands
des cultures cellulaires et des produits qui en dérivent ».
domaines d’applications : agroalimentaire, santé, biodiversité
marine, environnement.
Les biotechnologies traditionnelles étaient utilisées de manière Cette définition rejoint celle donnée en 1980 aux États-Unis par
empirique depuis l’antiquité dans les processus de fermentation A. Spinks dans Biotechnology reproduisant le rapport du « Joint
aérobie (fermentation acétique de production de vinaigres) ou Working Party » [1].
anaérobie (fermentation alcoolique, fermentation lactique,…) mais La participation de la chimie analytique, développée dans cet
sans compréhension ni contrôle des procédés. article, se retrouve comme une partie importante dans les déve-
loppements des biotechnologies comme dans tous les domaines
Les nouvelles biotechnologies à l’échelle industrielle
de l’activité chimique. Elle permet de fournir des méthodes d’ana-
connaissent, depuis les années soixante-dix, un développement
lyse pour contribuer à la connaissance structurale des macromolé-
constant dans tous les domaines de l’activité chimique. Tous les
cules mais peut également être un outil qualité pour l’analyse de
secteurs ont investi des sommes considérables dans la production :
recherche de nouveaux produits biotechnologiques, leur déve-
loppement et leur réalisation industrielle à une très grande ■ Tout isolement d’une substance suppose, dans un premier
échelle ; ces investissements ont porté leurs fruits avec l’arrivée temps, une approche analytique qui définit les opérations d’extrac-
sur le marché de produits qui concurrencent ou se substituent à tion, purification, séparation et isolement (cf. article Identification,
ceux des industries chimiques traditionnelles. L’industrie des fer- pureté et dosage d’une protéine [P3310]). Les techniques mises au
mentations et la production industrielle fondée sur les propriétés point au niveau de la recherche à l’échelle analytique sont transpo-
des enzymes, grâce au perfectionnement de la connaissance de sées dans un deuxième temps à l’échelle préparative puis indus-
leurs fonctions et l’élucidation de leur structure, ont été rapide- trielle. La première étape tient une place primordiale dans le
ment suivies par le développement des anticorps monoclonaux, domaine des biotechnologies ; il ne faut pas oublier que les pre-
la protéomique, les cultures cellulaires, le séquençage et les miers essais biologiques ou microbiologiques sont effectués sur
recombinaisons génétiques (cf. article Analyse des protéines ou des quantités très réduites qui relèvent des techniques microanaly-
protéomique [P3312]). tiques ; les rendements très faibles au départ, sans oublier le prix
de revient le plus souvent très élevé des matières premières, les
De nouvelles matières premières sont ainsi apparues. Dans le techniques mises en œuvre et la haute spécialisation des chimistes
domaine agricole, la sélection de nouvelles variétés fait appel analystes prennent une place chaque jour plus importante avec un
aux progrès de la génétique moléculaire et se matérialise par accroissement de l’efficacité. Au niveau de la recherche, l’analyste
une amélioration de la résistance des végétaux aux intempéries intervient pour élucider les structures.
ou aux prédateurs, comme par celle du rendement. Dans le Il met en jeu les méthodes d’analyse les plus performantes. La
domaine agroalimentaire, on assiste à l’élaboration de nou- spectrométrie de masse, utilisée pour l’identification des « petites
velles protéines, permettant l’accélération de la croissance des molécules » formées par la dégradation des protéines, a concouru
animaux d’élevage. Dans le domaine de la santé, des progrès à identifier des polypeptides de masse moléculaire allant jusqu’à
spectaculaires ont été enregistrés : production en pleine exten- 15 000 et au-delà et intervient ainsi dans l’analyse séquentielle.
sion de vaccins à partir de protéines purifiées, de peptides syn- Elle constitue maintenant l’outil indispensable à l’étude des bio-
thétiques. De nouveaux médicaments sont obtenus par ces molécules. La spectrométrie de masse permet de déterminer le
procédés (insulines et hormones antéhypophysaires, version poids moléculaire de la protéine grâce aux applications de l’ioni-
synthétique de composés biologiques naturels). De nouvelles sation douce par électronébuliseur (cf. article Electrospray.
molécules sont élaborées grâce au progrès simultané de la com- [P3350]). On obtient des fragments multichargés ; le rapport m/z
préhension des mécanismes physiopathologiques. Les interfé- devient alors plus faible permettant de réduire la gamme de
rons, les anticorps monoclonaux (infliximab, rituximab) pour la masse. Une autre technique de production d’ions consiste à
prise en charge des pathologies inflammatoires chroniques, les désorber à l’aide d’un faisceau laser les ions d’une matrice avec
érythropoétines stimulant l’érythropoèise, les facteurs de crois- laquelle on a précipité l’échantillon. Les ions produits, peu char-
sance de la lignée sanguine blanche (filgrastim) en sont gés, sont accélérés par un champ électrique et analysés de façon
quelques exemples. classique en mesurant leur temps de vol : spectrométrie de masse
MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time of
Le développement des biotechnologies implique la participa- Flight). (cf. article Analyse des protéines ou protéomique [P3312]).
tion de toutes les branches de la chimie, notamment dans le L’étude de la structure primaire des protéines ou le séquençage
cadre de l’analyse chimique. Tout développement implique en des peptides ou oligosaccharides par MS-MS peut faire appel à
effet un contrôle et une réglementation, d’abord scientifique puis une autre méthode d’ionisation : la FAB-MS (couplage Fast Atom
légale ; les biotechnologies n’y échappent pas. Le propos de la Bombardment – spectrométrie de masse). Ici, un faisceau
rubrique « Analyse des macromolécules biologiques » n’est pas d’atomes neutres, l’argon, de grande énergie cinétique va ioniser
d’entrer dans le cadre de multiples contrôles que doivent sup- les substances non volatiles à température ambiante (cf. article
porter les produits biotechnologiques : microbiologiques, bio- Analyse des glucides et glycoprotéines [P3320]).
logiques, immunologiques, etc., ni d’entrer dans celui des D’autres techniques reçoivent des applications multiples pour
règlements qui, sur le plan international ou européen, per- élucider la structure de fragments polypeptidiques de masse
mettent de mieux appréhender les problèmes et de concilier moléculaire plus élevée et la structure tridimensionnelle : les tech-
ceux qui relèvent de l’éthique tels que ceux émanant de la CEE niques électrophorétiques (cf. article Electrophorèse capillaire.
sous forme de directives ou de notes explicatives pour les médi- [P3365] [P3366] [P3367]), les méthodes immunotechnologiques
caments d’origine biotechnologique. Sur le plan scientifique, les (cf. article Méthodes analytiques immunologiques [P3335]) et la
unions internationales se préoccupent des problèmes biotechno- résonance magnétique nucléaire RMN (cf. article Application de la
logiques. RMN à la détermination des structures [P1092]). Le signal de RMN
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est porteur d’informations sur l’environnement chimique du À ces essais vient évidemment se joindre le titrage de l’activité
noyau étudié ce qui constitue un des avantages de cette technique enzymatique qui fait l’objet d’un développement particulier dans
car il devient possible de travailler dans un environnement simi- l’article [P3310] Identification, pureté et dosage d’une protéine, de
laire à celui de la cellule vivante. cette rubrique.
■ Au stade du développement puis au stade industriel, l’analyse
intervient dans le contrôle des fabrications, dans la garantie de 2.1.2 Spécificité des enzymes
constance du produit, dans la recherche de dérivés éventuels ; elle
apporte une contribution efficace à la fabrication du produit bio- L’exemple des produits d’hydrolyse de l’amidon (polysaccha-
technologique. La recherche et l’identification des dérivés glycosy- ride constitué par la répétition d’unités monomères glucose) est
lés résultant de modification post-traductionnelle permettent, par particulièrement démonstratif.
exemple, de caractériser les médicaments biosimilaires du médica- L’hydrolyse acide de l’amidon provoque une coupure au hasard
ment original ou princeps. des liaisons α-1,4 et α-1,6 avec formation d’oligosides, de produits
secondaires et de glucose. Les enzymes agissent spécifiquement.
Telle est l’idée directrice à l’origine de cette rubrique sur l’ana- – L’α-amylase, ou α-D-1,4-glucane-glucanohydrolase, conduit à
lyse des macromolécules biologiques qui implique la participation des holosides moyens, de degré de polymérisation (DP) 3 et 6 : le
de spécialistes de disciplines très éloignées les unes des autres. produit de la réaction est un mélange d’une faible quantité de
Deux types d’exemples sont présentés dans cet article pour glucose et maltose et d’oligoholosides. Elle est le plus souvent uti-
montrer les apports de la chimie analytique et la place qu’elle lisée pour la préparation des maltodextrines.
tient tout en demeurant dans le cadre strict de sa discipline : – La β-amylase ou α-D-1,4-glucane-maltohydrolase est une
exoamylase hautement spécifique des liaisons α-1,4 ; elle agit de
– biotechnologies faisant appel à des processus de fermentation façon méthodique en libérant des molécules de maltose à partir
et de génie enzymatique des extrémités non réductrices des chaînes d’anhydroglucose. Des
– biotechnologique reposant sur la recombinaison génétique, ou attaques successives similaires se poursuivent jusqu’à une conver-
génie génétique. sion totale en maltose. Après hydrogénation, le produit obtenu
(Lycasin® 80/55 de chez Roquette) utilisé comme édulcorant et
sucrant renferme principalement 50 à 55 % de maltitol, 37 à 44 %
de dérivés hydrogénés et 6 à 8 % de sorbitol (D-glucitol).
2. Applications – L’amyloglucosidase ou α-1,4-glucanohydrolase est utilisée
pour la transformation quantitative du glucose ; elle catalyse la
rupture des liaisons α-1,4, α-1,6 et α-1,3. L’α-1,6-amyloglucosidase
2.1 Produits issus des fermentations conduit au glucose et à des disaccharides à base d’isomaltose ; par
hydrogénation, l’isomaltitol (gluco-1,6-sorbitol) prédomine.
et des réactions enzymatiques

Les modalités d’attaque enzymatique ont été largement mises à
Les processus fermentaires et enzymatiques sont la partie la profit ; l’expérience industrielle montre que la voie enzymatique
plus ancienne de la production des produits biologiques. On ne est la méthode la plus utilisée, en réalisant divers couplages, aussi
peut que rappeler les boissons fermentées (vin, bière). Les tech- bien pour la préparation d’hydrolysats intermédiaires que pour la
niques de fabrication sont depuis longtemps maîtrisées et bénéfi- conversion totale en glucose. Elle a permis de produire des
cient jour après jour des acquisitions conduisant à l’obtention hydrolysats aux qualités précises et contrôlables, en évitant les
d’enzymes purifiées et, avec leur concours, à des produits de qua- inconvénients rencontrés lors de l’hydrolyse acide. On obtient
lité constante. ainsi des mélanges d’oligosides et d’oses ou de leurs produits
d’hydrogénation dont la qualité est définie par les techniques ana-
lytiques.
2.1.1 Préparation d’enzymes En plus des spécifications générales et des critères technolo-
Les enzymes sont obtenues à partir d’organismes animaux, giques qui gouvernent leur emploi, la composition en « sucres »
végétaux, microbiens dans des conditions très variées. La prépa- (oses) et en produits d’hydrogénation doit être vérifiée ; les
ration d’enzymes par culture microbienne doit garantir une fer- méthodes chromatographiques apportent une contribution parti-
mentation contrôlée et empêcher la formation de produits culièrement efficace.
toxiques ou indésirables. La participation de l’analyste implique La chromatographie gaz-liquide des oses et osides après silyla-
une adaptation des méthodes classiques. tion ou la chromatographie en phase liquide rend aisément
compte des teneurs des divers dérivés organiques et permet
Exemple d’obtenir la carte d’identité du produit. De nombreuses techniques
Les enzymes sont très souvent immobilisées sur un support par ont été préconisées et sont décrites dans tous les ouvrages clas-
adsorption et échange de ligands. siques.
Des préparations sont obtenues en recourant à des mutants hyper- Les applications industrielles des réactions enzymatiques sont
producteurs d’enzymes purifiées par chromatographie d’affinité. multiples :
– synthèse d’antibiotiques et de stéroïdes ;
Cette diversité impose à l’analyste trois types de critères : – fractionnement de la caséine du lait en polypeptides palliant
les difficultés d’assimilation ;
– la limitation de contaminants chimiques (As, Pb, métaux – hydrolyse partielle ou totale des protéines en peptides ou
lourds, protéines étrangères) et microbiens (salmonella, coli- acides aminés.
formes…) ;
– la mise en évidence des additifs et ingrédients utilisés dans la Autant de moyens entrent dans la pratique industrielle et
production ; ces substances doivent être insolubles et retirées de impliquent des techniques d’analyse très élaborées.
l’aliment lorsqu’elles ont rempli leur rôle (processing aids) ; Les techniques chromatographiques, notamment d’exclusion,
– la recherche et la limitation de produits tels que le glutaraldé- renseignent sur la composition des mélanges obtenus et sur la
hyde, etc. dispersion molaire des composants.

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2.2 Produits issus des protéines sion, la structure du vecteur d’expression, la combinaison hôte-
vecteur ainsi que la stabilité génétique et le contrôle du phéno-
Les macromolécules protéiques obtenues par un procédé bio- type et celui du génotype de la cellule hôte (cf. article Analyse des
technologique ont connu, depuis les années quatre-vingt, un protéines ou protéomique [P3312]).
développement considérable : ce procédé est venu s’ajouter à la En ce qui concerne les conditions de fabrication du produit, la
production par extraction à partir de produits naturels, à leur surveillance des paramètres, liés au pilotage de la culture cellu-
modification par voie enzymatique ou à la synthèse totale d’oli- laire (pH, température, concentration en oxygène dissous et en
gopeptides et de polypeptides. Les procédés biotechnologiques dioxyde de carbone et agitation) est réalisée in situ. Une perturba-
font appel à la culture des cellules ou des tissus in vitro comme in tion même faible des paramètres expérimentaux peut avoir des
vivo, à leur synthèse par voie microbiologique, aux anticorps conséquences délétères sur la productivité et la qualité du pro-
monoclonaux produits par des hybridomes. duit. Certains contrôles sont réalisés en dehors du réacteur de
fabrication, notamment la mesure de la teneur en glucose et en
glutamine ainsi que celle des métabolites produits pendant le pro-
Les méthodes de recombinaison génétique ou génie géné- cessus de fabrication. Il est largement fait appel aux dosages
tique, dites de l’ADN recombinant, sont le « résultat d’une chromatographiques et immunologiques (cf article Méthodes ana-
manipulation génétique dans laquelle l’ADN codant pour le lytiques immunologiques [P3335]).
produit souhaité est introduit au moyen d’un vecteur tel qu’un
plasmide dans un micro-organisme approprié ou une lignée 2.2.1.2 Contrôle de l’identité de la protéine recombinante
cellulaire (constituant l’hôte) et où cet ADN est exprimé et tra-
duit en protéine. » Le contrôle de routine doit mettre en évidence des différences
chimiques liées à la variabilité du procédé de fabrication mais
aussi des différences de la structure spatiale avec modification de
Cette définition proposée par la Pharmacopée européenne met la conformation ou la formation d’agrégats ainsi que des dissocia-
en évidence les contraintes biologiques auxquelles les produits tions. De plus, des modifications post-traductionnelles comme les
doivent satisfaire pour caractériser le système hôte vecteur dans glycosylations, les méthylations ou les acétylations contribuant à
le cas des médicaments produits par des processus biotechnolo- la variabilité de l’activité clinique de la substance biologique
giques des thérapies génique et cellulaire ; on les retrouve dans la doivent pouvoir être mises en évidence. Le profil de glycosylation
Pharmacopée des États-Unis (USP). Elles sont transposables à influence le profil immunogène d’une protéine.
tous les groupes de produits formés par recombinaison géné- L’analyse séquentielle, ou détermination de la séquence pepti-
tique. dique, correspond à la connaissance de la structure primaire de la
D’une manière générale, la qualité de tels produits ne peut être protéine. Cela signifie qu’il faut identifier les fragments pepti-
acquise par un seul test mais par la mise en œuvre d’une batterie diques par spectrométrie de masse avec des méthodes d’ionisa-
de tests effectués au cours du développement et de la fabrication tion de type électrospray ESI ou MALDI ou par des méthodes de
de la protéine et du produit fini. Comme pour les matières pre- fragmentation enzymatique/chimique de la protéine suivie d’une
mières pharmaceutiques et les médicaments traditionnels, les analyse par chromatographie liquide ou HPLC. La cartographie
médicaments biologiques doivent satisfaire aux tests d’identité, peptidique établie par spectrométrie de masse MALDI-TOF MS
de pureté et de teneur. permet également de connaître le poids moléculaire de la proté-
En phase de développement de la forme pharmaceutique, les ine.
propriétés et l’intérêt de la protéine recombinante font appel aux Mais, connaître l’organisation spatiale est tout aussi important
techniques de modélisation moléculaire sous la forme d’études pour l’activité biologique. Aussi, les structures d’ordre secondaire,
conformationnelles et d’optimisation des structures tridimension- tertiaire et quaternaire peuvent être analysées par diffraction aux
nelles des molécules. La modélisation moléculaire permet la rayons X (cf. article Détermination des structures 3D des macro-
visualisation des macromolécules, la prédiction ou l’affinement molécules biologiques par diffraction X [P1111]) ou par RMN (cf.
des structures, la simulation des mécanismes d’action. Les article Application de la RMN à la détermination des structures
méthodes spectrales d’analyse par infrarouge, le dichroïsme circu- [P1092]).
laire, la diffraction des rayons X contribuent à l’élucidation des L’étude de la conformation tridimensionnelle et des modifica-
structures ; la thermogravimétrie, l’analyse calorimétrique diffé- tions post traductionnelles les plus fréquentes comme les glycosy-
rentielle apportent aussi leurs résultats. lations font appel aux méthodes séparatives chromatographiques
Les contrôles de routine, s’ils mettent en œuvre des techniques et électrophorétiques avec des détecteurs de fluorescence ou de
adaptées à la structure des macromolécules biologiques, suivent spectrométrie de masse.
les référentiels proposés par les Pharmacopées et l’International Les méthodes chimiques traditionnelles sont également large-
Conférence of Harmonization ICH. On distingue les contrôles de ment utilisées :
qualité de la matière première et celle du produit fini.
– détermination des groupements fonctionnels thiols libres, des
oses liés aux protéines tels que les glycoprotéines ;
2.2.1 Production et contrôle de la matière – identification et dosage des additifs chimiques ajoutés comme
première conservateurs, antioxydants ;
– recherche et mise en évidence des produits de dégradation.
2.2.1.1 Contrôle du procédé de fabrication Tous ces impératifs mettent le plus souvent en œuvre des
La qualité des protéines recombinantes implique la maîtrise du méthodes chimiques faisant notamment appel à la spectrophoto-
clonage, des conditions de culture cellulaire, des conditions de métrie dans le visible.
fabrication, de l’isolement de la macromolécule protéique, de la
détection de déviations anormales ou de la différenciation d’un 2.2.1.3 Contrôle de la pureté de la protéine recombinante
ADN normal et anormal (cf. article [P3305] Analyse des macromo- Les protéines sont des substances complexes, qui subissent des
lécules biologiques et applications. Généralité). Elle impose des variabilités suivant le mode de production qui apporte des diffé-
contrôles à chaque niveau. rences en termes de profil de pureté. La recherche de contami-
Pour la cellule hôte et le plasmide du vecteur d’expression nants biologiques tels que les virus, les rétrovirus, de composants
(comportant le fragment d’ADN spécifique de la protéine), l’ana- cellulaires et le test ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbant Assay
lyse porte sur l’identité du gène codé dans le vecteur d’expres- ) relèvent des spécialistes des techniques biochimiques, immuno-

P 3 300v3 – 5
logiques, radioimmunologiques, etc. Ces techniques sont décrites L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) concourt
dans l’article Identification, pureté et dosage d’une protéine également à élucider les structures : le dodécylsulfate de sodium
[P3310] afin de fournir aux chimistes analystes les données néces- (SDS) linéarise les chaînes par rupture de liaisons hydrogène ; la
saires à la connaissance des phénomènes, à leur interprétation et présence d’un réducteur (thiol) (mercapto-2-éthanol) dans le
pour leur permettre d’apporter le cas échéant le concours de leur milieu supprime les ponts disulfure. Les données fournies par
discipline. l’électrophorèse en font le complément des techniques chromato-
graphiques pour la séparation des polypeptides et l’établissement
Pour les impuretés provenant des substrats ou des agents
de leur structure. De nombreuses phases sont maintenant utili-
chimiques de sélection comme les antibiotiques, le choix de la
sées. L’électrophorèse capillaire est basée sur les mêmes prin-
méthode est adapté à la structure moléculaire. Les méthodes
cipes que l’électrophorèse sur gel ; elle permet des séparations
chromatographiques sont privilégiées.
plus rapides et une meilleure résolution avec détection directe des
Un contrôle de la masse, de la charge et du profil glycosidique composés et leur quantification. L’isoélectrofocalisation sépare
permet la mise en évidence des agrégats solubles. La chromato- les isoformes ou les glycoformes (variation des oses ; les proté-
graphie d’exclusion avec détection par absorbance moléculaire ines sont séparées en fonction de leurs solubilités).
UV visible ou les techniques électrophorétiques comme SDS page
ou l’électrophorèse capillaire apportent une contribution intéres-
sante. Les variants de charge sont contrôlés par électrophorèse
2.2.2 Contrôle du produit fini ou préparation
capillaire ou chromatographie d’échange ionique (cf. article Elec- pharmaceutique
trophorèse capillaire. Appareillage [P3367]). Les variants des pro- Des contrôles généraux communs à tout médicament sont réali-
fils glycosidiques peuvent être contrôlés par des techniques sés : pH, osmolalité, solubilité, teneur en protéines totales, charge
chromatographiques, HPLC ou électrophorétiques, couplées à une microbienne, endotoxines bactériennes et stérilité.
détection par fluorescence ou diffusion de lumière. Pour les
variants conformationnels, les méthodes de dichroisme circulaire, Le contrôle de la teneur en protéine fait largement appel aux
de spectroscopie IR et de spectromètre de masse sont largement méthodes chromatographiques et/ou électrophorétiques (cf.
utilisées. articles Electrophorèse capillaire. [P3365] [P3366] [P3367]).
Que l’on se place au niveau de la recherche, du développement
2.2.1.4 Dosage des protéines recombinantes ou du contrôle industriel, l’analyse des macromolécules obtenues
par des procédés biotechnologiques impose des contraintes très
Il est évident que le dosage de l’azote total, exprimé en azote lourdes. Dans le cadre des méthodes physiques, physico-
protéique, n’apporte pas une garantie suffisante pour s’assurer de chimiques ou chimiques d’analyse, leur mise au point comporte la
la composition d’une protéine. Il est nécessaire d’effectuer divers validation de tous les procédés mis en œuvre : spécificité, préci-
types de contrôles (cf. article Analyse des acides nucléiques sion, reproductibilité doivent être vérifiées à chaque niveau et lors
Méthodes d’analyse séquentielle des macromolécules biologiques de chaque essai. La nécessité de disposer d’étalons de référence
[P3315]). exige des études faites en collaboration et une harmonisation des

Le dosage de la teneur en protéines fait appel aux méthodes de procédés.
chromatographie en phase liquide et aux immunodosages. Ces
méthodes peuvent être mises en œuvre directement in situ pour
un contrôle régulier en cours de fabrication. La chromatographie
sous toutes ses formes d’application apparaît comme la méthode 3. Conclusion et perspectives
indispensable à l’établissement des structures comme au contrôle
de la constance des fabrications. Malgré toutes les contraintes rencontrées, les produits biotech-
La chromatographie d’exclusion est appliquée à la séparation nologiques constituent une voie d’avenir en pleine extension. Sur
des constituants d’un mélange de protéines, à la détermination le plan de l’analyse, l’évolution conduira à améliorer la fiabilité et
moléculaire de chaque fraction et à la détermination de la masse les performances des méthodes actuelles et à en développer de
moléculaire moyenne. La comparaison des profils chromatogra- nouvelles. L’analyse de tels produits est l’affaire de toutes les dis-
phiques montre la constance de la distribution. ciplines concernées ; pour sa part, le chimiste analyste apporte
son expérience personnelle et la parfaite connaissance de son
Les acides aminés sont séparés après hydrolyse par chromato-
domaine. Son efficacité est d’autant plus grande qu’il possède une
graphie en phase liquide ou d’échange d’ions ; les procédés aisé-
connaissance plus claire des autres domaines concernés.
ment automatisés sont à la base de l’identification, des études de
stabilité ou de dégradation. La rubrique Analyse des macromolécules biologiques répond à
ces objectifs. Les données biologiques étant souvent peu fami-
L’analyse séquentielle des acides aminés peut être effectuée à lières aux chimistes analystes, on trouvera dans l’article Analyse
partir de l’extrémité N-terminale selon la méthode d’Edman. L’iso- des macromolécules biologiques et applications Généralités
thiocyanate de phényle se fixe sur le NH2 terminal libre de la [P3305] la définition des termes utilisés.
chaîne peptidique et, après hydrolyse, le dérivé phénylthiohydan-
toïne de cet acide aminé peut être identifié. La répétition du cycle
de réactions permet d’identifier les uns après les autres, d’une
façon séquentielle, les acides aminés. Après attaque enzymatique
par la carboxypeptidase, les fonctions α-carboxyliques des acides
4. Glossaire
aminés sont également séparées et identifiées. L’analyse séquen-
tielle est complétée par la détermination de la carte peptidique Biosimilaires ; biosimilar medicinal product
qui est un procédé d’identification, de prise d’« empreinte digi- Copie d’un médicament original obtenu par génie génétique.
tale » contrôlant les aminoacides dans les fragments de peptides On n’utilise pas le terme de médicament générique car le mode
formés par coupure de la molécule par action enzymatique de dif- de production est susceptible d’entraîner des différences de struc-
férentes endopeptidases (trypsine, chymotrypsine…) ou de réac- ture (taux de dérivés glycosylés) qui ne sont pas sans influence
tifs chimiques (bromure de cyanogène). L’ensemble permet de sur l’activité thérapeutique du produit.
déceler les multiples séquences qui doivent être conformes à celle
du produit originel et contribue à vérifier la constance du produit Biotechnologie ; biotechnology
en même temps qu’à établir la structure de la macromolécule pro- Les procédés de biotechnologie regroupent des techniques
téique. d’utilisation de matériaux vivants pour synthétiser ou modifier

P 3 300v3 – 6
des molécules. On les retrouve dans les grands domaines d’appli- Protéomique ; proteomics
cations : agroalimentaire, santé, biodiversité marine, environne-
Concerne la caractérisation des systèmes vivants
ment.
Résonance magnétique nucléaire RMN ; nuclear magnetic reso-
Génie génétique ; genetic engineering
nance
Les méthodes de recombinaison génétique ou génie génétique
dites de l’ADN recombinant sont le « résultat d’une manipulation Technique spectroscopique de caractérisation et d’analyse qui
génétique dans laquelle l’ADN codant pour le produit souhaité est s’appuie sur les propriétés magnétiques de certains noyaux ato-
introduit au moyen d’un vecteur tel qu’un plasmide dans un miques. Celles-ci varient en fonction de l’environnement interne et
micro-organisme approprié ou une lignée cellulaire (constituant externe des molécules, ce qui permet d’étudier le comportement
l’hôte) et où cet ADN est exprimé et traduit en protéine. des protéines dans leur environnement cellulaire.
Macromolécule biologique ; biological macromolecule Spectrométrie de masse ; mass spectrometry
Les macromolécules biologiques ou biomolécules recouvrent Technique de caractérisation et d’analyse basée sur les diffé-
quatre groupes de substances (polysaccharides, protéines, acides rences de rapports masse/charge m/z de fragments chargés issus
nucléiques et lipides) parmi lesquelles seuls les lipides ne sont de la molécule mère et produits par fragmentation ou ionisation.
pas de nature polymérique. Les macromolécules biologiques Les méthodes d’ionisation sont choisies en fonction de la nature
relèvent des domaines de la santé ou de la microbiologie avec des du composé à analyser. Pour les macromolécules biologiques, les
composés d’origine naturelle, notamment les composés cellu- méthodes d’ionisation les plus utilisées sont l’electronébulisation
laires, ou d’origine synthétique, comme les médicaments ou les (électrospray) (ESI) et la désorption-ionisation laser assistée par
enzymes. matrice (MALDI).

P 3 300v3 – 7
P
O
U
Analyse des macromolécules R
biologiques
E
Introduction N
par Gwenola BURGOT
Professeur des Universités
Laboratoire de Chimie Analytique, Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, S
Université de Rennes1, Rennes, France
A
V
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O
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lyses [P595] (2017). [P3310] (1992). BOURREL (F.) et COURRIERE (P.). – Radioanalyse.
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Analyses [P3361] (2003).
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chimie-bio-agro [P3320] (1997). lyses [P3365] (2003).
nique. Principe, méthodes d’introduction et
d’ionisation. Mesures-Analyses [P2645] (2017). HADÈGE (A.) et HUYNH (T.N.). – Electrophorèse ca-
OLLIVIER (V.), OLLIVIER (D.) et ARTAUD (J.). – Ana-
pillaire. Appareillage. Mesures-Analyses
BOUCHOUX (G.) et SABLIER (M.). – Spectrométrie lyse des lipides. Extraction. Paramètres physico-
[P3366] (2013).
de masse. Applications. Mesures-Analyses chimiques. Constituants majeurs. Mesures-Ana-
lyses [P3325] (2015). TAVERNA (M.), LE POTIER (I.) et MORIN (P.). – Elec-
[P2646] (2005).
trophorèse capillaire. Applications. Mesures-
CHERON (J.M.), MARCHAND (J.), TREICH (I.) et EFSTATHIOU (T.) et NIO (C.). – Analyse des poly- Analyses [P3367] (2003).
TROUVIN (J.H.). – Analyse des macromolécules saccharides. Mesures-Analyses [P3326] (2008).
biologiques et applications. Généralités. Ar- COHEN (J.). – Méthodes analytiques immunolo-
chives [P3305] (1991). giques. Archives [P3335] (1997).

Doc. P 3 300v3 – 1
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Analyse Des Macromolécules Biologiques - Introduction: Réf.: P3300 V3

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par Gwenola BURGOT

Mots-clés Résumé Les macromolécules biologiques synthétiques connaissent un développement

Keywords Abstract Synthetic biological macromolecules experience a considerable development

Pour toute question :

Analyse des macromolécules

1. Enjeux et contexte ............................................................................................ P 3 300v3 - 3

2.2.2 Contrôle du produit fini ou préparation pharmaceutique .............. — 6

L es macromolécules biologiques artificielles connaissent un essor considé-

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ANALYSE DES MACROMOLÉCULES BIOLOGIQUES _________________________________________________________________________________________

Seule, la participation de la chimie analytique y est développée et permet de

CEE Communauté Économique Européenne

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HMSO Her Majesty’s Stationnery Office

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USP United States Pharmacopeia (Pharmacopée américaine)

La notion de macromolécules est introduite en 1922 par un chimiste alle-

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_________________________________________________________________________________________ ANALYSE DES MACROMOLÉCULES BIOLOGIQUES

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et des réactions enzymatiques

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[P3315]). exige des études faites en collaboration et une harmonisation des

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