Cours Microbiologieindutrielle

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Cours de Microbiologie industrielle
Presentation · June 2022
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Messaoudi Omar
Université Amar Telidji Laghouat
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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
‫وزارة التعــلـيــــم العـــالــــي و البــحث الـعلــــمـي‬
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE
‫جــامعـــة عــمـــار ثــلــيــجــي باألغواط‬
UNIVERSITE AMAR TELIDJI LAGHOUAT
‫كلـــيــــــة العـــلـــــــوم‬
FACULTE DES SCIENCES
‫قسم البيولوجيا‬
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
Polycopie de cours
Microbiologie industrielle
Destiné aux étudiants de 3eme année licence

Microbiologie.
Préparé par :
Dr Omar MESSAOUDI
Maître de conférences B
o.messaoudi@lagh-univ.dz
Année universitaire 2020/2021

Préface
La présente polycopie de microbiologie industrielle s’adresse aux étudiants de

3eme année licence Microbiologie, il est divisé en deux parties. La première partie
permet à l’étudiant d’acquérir des connaissances fondamentales sur la matière, et cela
par l’étude des trois principaux acteurs de la microbiologie industrielle, qui sont : les
microorganismes industriels, les fermenteurs industriels, et les milieux de cultures
industrielles. Après l’acquisition des notions de base, la deuxième partie de la matière
discutera les différents produits de la fermentation industrielle, qui sont (i) : la
biomasse microbienne : utiliser généralement comme source de protéines d’origine
unicellulaire, (ii) : la production industrielle de certains métabolites primaires
représentés par les acides aminés, les acides organiques et les biogaz, ainsi que (iii) la
production industrielle de certains métabolites secondaires représentés par les
antibiotiques, les polysaccharides et les vitamines. La pédagogie empruntée lors de
l'élaboration de ce présent cours est basée sur l'utilisation d'un langage simple et
basique, soutenu par des exemples. De plus, et afin de rendre le contenu plus
accessible aux étudiants, beaucoup d'illustrations en forme de schémas simplifiés, de
photos et de tableaux récapitulatifs ont été utilisés. De ce fait, il est toujours
encourageant et motivant de recevoir des corrections, conseils et recommandations de
la part de nos collègues enseignants et chercheurs.
Liste des figures
Figure 1 : Les étapes de l’amélioration génétiques des souches industrielles…… 7

Figure 2 : Les étapes du mutagène aléatoire…………………………………….. 8
Figure 3 : La méthode de brassage génétique…………………………………... 9
Figure 4 : Schéma d’un fermenteur……………………………………………... 14
Figure 5 : Fermenteur de type Batch (discontinu)……… …………………........ 15
Figure 6 : Évolution de taux de croissance des cellules (X), par rapport aux 16
taux de conversion de substrat (S), la production de métabolites (P), au cours
d’une fermentation industrielle …………………………………………………...
Figure 7 : Fermenteur de type Fed Batch……………………………………….. 17
Figure 8 : Fermenteur de type Fed Batch……………………………………….. 17
Figure 9 : Un bioréacteur continu de type turbidostat……………………..…... 18
Figure 10 : Processus de scale up………………………………………………… 18
Figure 11 : Réaction de conversion de α-cétoglutarate au succinyl-CoA………... 23
Figure 12 : Réaction de la formation de l’acide L-glutamique…………………... 23
Figure 13 : Biosynthèse de l'acide l-glutamique chez les souches mutantes…….. 23
Figure 14 : Réaction de la formation de l’acide citrique. 27
Figure 15 : Cycle du Krebs………………………………………………………. 27
Figure 16 : Schéma du procédé de la fabrication de l'acide citrique par la 29
méthode de la fermentation en surface…………………………………………….
Figure 17 : Photos d’une usine de la fabrication de l’acide citrique par la 30
fermentation en surface……………………………………………………………
Figure 18 : Les étapes de la fabrication de l’acide citrique………………………. 31
Figure 19 : Les 4 étapes de la méthanisation…………………………………….. 33
Figure 20 : Structure du noyau de B-lactamines…………………………………. 39
Figure 21 : Structure de base de la pénicilline…………………………………… 39
Figure 22 : Substitution de groupement acyle de l'acide 6-aminopénicillanique 40
(6-APA) par un nouveau radical…………………………………………………..
Figure 23 : Les étapes de la fabrication industrielle de la pénicilline……………. 41
Figure 24 : Structure chimique d’Alginate……………………………………….. 43
Figure 25 : Structure chimique de curdlan……………………………………….. 43
Figure 26 : Structure chimique de dextrane……………………………………… 43
Figure 27 : Structure chimique de la gomme gellane…………………………….. 44
Figure 28 : Structure chimique de pullulane……………………………………... 44
Figure 29: Structure chimique de la gomme xanthane…………………………… 45
Figure 30 : structure de la vitamine B12…………………………………………. 48
Liste des tableaux
Tableau 1 : Quelques exemples de l’application des microorganismes en 4

industrie……………………………………………………………………………
Tableau 2 : Les bactéries hydrolytiques de la digestion anaérobie………………. 34
Tableau 3 : Les différentes réactions d’acidogènes……………………………… 35
Tableau 4 : Les réactions des bactéries acétogènes syntrophes………………….. 36
Table des matières
Préface.
Liste des figures
Liste des tableaux
Introduction. 1
I. Les domaines d’activité de la microbiologie industrielle et intérêt de 2
l’utilisation des microorganismes en industrie.
1. Introduction……………………………………………………………. 2
2. Intérêt de l’utilisation des microorganismes en industrie. …………….….. 2
3. L'objectif recherché dans la fermentation industrielle. …………………… 3
4. Les domaines d’activité de la microbiologie industrielle. ………………...
II. Les microorganismes industriels : isolement, sélection et amélioration 5
des souches. …………….…………….…………….……………………..
1. Introduction. …………….…………….…………….………………… 5
2. La stratégie suivie pour la recherche de nouvelles souches industrielle.. 5
2.1 Isolement des souches. ….…………….…………….……………………… 5
2.2 Sélection des microorganismes industriels. …………….……………. 6
2.3 Identification moléculaire des souches sélectionnées. ….……………. 6
3. Amélioration des souches sélectionnées. ….…………….…………….. 6
3.1 Mutagénèse aléatoire. ….…………….…………….………………… 8
3.2 Le brassage génétique. ….…………….…………….………………… 9
4. Faisabilité industrielle. ….…………….…………….………………….. 9
III. Les milieux de culture industriels. ….…………….…………….……… 11
1. Introduction. ….…………….…………….…………………………… 11
2. Les facteurs déterminant le choix de milieu de culture industrielle………. 11
3. La composition de milieu de culture industrielle. ….…………….…… 11
3.1. Sources de carbone. ….…………….…………….………………… 11
3.2. Sources d’azote. ….…………….…………….…………………….. 12
3.3. Les sels minéraux. ….…………….…………….………………….. 13
3.4. Les vitamines et les facteurs de croissances………………………….. 13
3.5. L’apport en O2. ….…………….…………….………………………. 13
3.6. L’ajout des antimousses. ….…………….…………….…………… 13
IV. Les fermenteurs industriels. ….…………….………………………….. 14
1. Introduction. ….…………….…………….………………………….... 14
2. Les types de fermenteurs. ….…………….…………….………………… 15
2.1. Le mode discontinu (ou batch). ….…………….…………….……… 15
2.2. Fed Batch (fermenteur discontinue et alimenté)……………………... 16
2.3. Fermentation continue. ….…………….…………….…………… 17
3. Processus de mise à l’échelle (ou extrapolation) : scale up……………… 18
V. Les produits de fermentations industrielles. 19
V.1. Les protéines d’organismes unicellulaires (P.O.U)…………………….. 19
1. Définition. ….…………….…………….……………………………... 19
2. La raison du besoin mondial des protéines d’origine unicellulaire……. 19
3. Les microorganismes utilisés pour la production des P.O.U…………….. 19
4. Critère de choix de microorganisme pour la production de P.O.U…….. 20
5. Production industrielle des P.O.U. ….…………….…………….……… 20
6. Avantages et inconvénient des POU. ….…………….…………….…… 20
V.2. Les métabolites primaires obtenus par fermentation microbienne. 22
V.2.1. Les acides aminés. ….…………….…………….…………………….. 22
1. Introduction. ….…………….…………….………………………….... 22
2. Exemple de la fabrication industrielle de l’acide glutamique……………. 22
3.1. Les principales souches microbiennes utilisées………………………. 22
3.2. Les principaux traitements utilisés pour favoriser la sécrétion de 24
l’acide glutamique. ….…………….…………….…………………
3.3. Les conditions de culture……………………………………………. 24
V.2.2. Les acides organiques. ….…………….…………….………………… 26
1. Introduction. ….…………….…………….…………………………… 26
2. Définition et utilisation de l’acide citrique………………………………... 26
3. Structure chimique de l’acide citrique. ….…………….……………….. 26
4. Les microorganismes industriels producteurs de l’acide citrique……….. 26
5. Biosynthèse naturelle de l’acide citrique……………………………….. 27
6. Aspect biochimique de la biosynthèse industrielle de l’acide citrique……. 27
7. Le milieu de culture industriel utilisé pour la production de l’acide 28
citrique. ….…………….…………….…………………………………….
8. Les étapes de la production industrielle de l’acide citrique……………. 29
8.1. Fermentation. ….…………….…………….……………………….. 29
8.2. Précipitation, extraction et purification de l’acide citrique………….. 30
V.2.3. Production du biogaz par le processus de méthanisation………………... 32
1. Introduction. ….…………….…………….…………………………… 32
2. L’intérêt de la méthanisation. ….…………….…………………………. 32
3. Aspect biochimique et microbiologique de la méthanisation……………... 32
3.1. L’hydrolyse. ….…………….…………….………………………… 33
3.2. L’acidogènes. ….…………….…………….…………………………. 33
3.3. L'acétogénèse. ….…………….…………….………………………… 35
3.3.1. Les bactéries homo-acétogènèse non syntrophes………….. 35
3.3.2. Les bactéries acétogènes syntrophes………………………… 35
3.4. La méthanogènese. ….…………….…………….………………… 36
4. Purification du biogaz (méthane). ….…………….…………….………. 36
V.3. Les métabolites secondaires obtenus par fermentation microbienne. 38
V.3.1. Les antibiotiques. ….…………….…………….……………………… 38
1. Introduction. ….…………….…………….…………………………… 38
2. La classe des B-lactamines. ….…………….…………….……………… 38
3. Production industrielle de pénicilline. ….…………….…………….….. 40
V.3.2. Les polysaccharides….…………….…………….…………………….. 42
1. Introduction. ….…………….…………….…………………………… 42
2. Les exopolysaccharide d’origine microbienne et leur application 42
technologique. ….…………….…………….……………………………
2.1. L’Alginate. ….…………….…………….………………………….. 42
2.2. Le curdlane. ….…………….…………….…………………………. 43
2.3. Le dextrane. ….…………….…………….…………………………. 43
2.4. La gomme gellane (E418). ….…………….…………….…………. 44
2.5. Le pullulane. ….…………….…………….………………………… 44
2.6. La gomme xanthane. ….…………….…………….………………… 45
3. Exemple de la fabrication industrielle du polysaccharide : la gomme 45
xanthane. ….…………….…………….…………………………………
V.3.3. Les vitamines. ….…………….…………….…………………………. 47
1. Introduction. ….…………….…………….…………………………… 47
2. Structure et microorganismes producteurs de la vitamine B12……….. 47
3. Production industrielle de la vitamine B12…………………………….. 48
Références bibliographique. 50
Cours Microbiologie industrielle Omar MESSAOUDI
Introduction.
L’utilisation des microorganismes pour le bien-être de l’homme est une pratique très
ancienne qui revient à 7000 ans avant JC, avec les Sumériens ainsi que les Égyptien. Les
microorganismes ont été utilisés pendant cette période d’une manière empirique, pour la
conservation des denrées alimentaires, pour la préparation du pain, pour la fabrication de vinaigre et
les boissons alcoolisées, ainsi que pour la fabrication du fromage (Baltz et al, 2010).
Suite à la découverte des microorganismes, ainsi qu’aux connaissances et des

expériences accumulées au fil du temps, un nouveau domaine est apparu, appelé la microbiologie
industrielle, qui est une branche de la microbiologie appliquée, dans laquelle les microorganismes
d’intérêt sont exploités, pour un intérêt commercial, pour réaliser un procédé de biosynthèse, de
biotransformation ou de dégradation à grand échelle. En effet, les microorganismes industriels
peuvent être utilisés pour produire une biomasse riche en protéines, ou pour la production de
molécules utiles à l’homme, issues soit de métabolisme primaire, comme les acides aminés, les
acides organiques et les biogaz, ou secondaires, tel que les antibiotiques, les vitamines ou les
polysaccharides, ainsi que pour réaliser certaines réactions de biotransformations de molécules
organiques toxiques, pour les rends inoffensives (Okafor et al, 2020 ; Harwood et al, 2018).
Une grande partie du succès de l’utilisation des microorganismes en industrie est en relation
avec leur culture facile ainsi que de sa vitesse de croissance élevée, ce qui permet de réduire le cout
et le temps de production. Cela permet de surmonter beaucoup de problèmes rencontrés lors de
l’utilisation des plants par exemple. En effet, les plants utilisés comme source de molécules
commerciales d’intérêt, exigent un champ de culture très vaste, un temps plus important, ainsi que
des conditions climatologiques adéquates (la pluviométrie, la température, le taux d’humidité….),
ce qui permet d’augmenter le cout de production (Wilson et al 2019).
De nombreux microorganismes sont utilisés en microbiologie industrielle ; ceux-ci incluent

des bactéries, des archées, des levures, des moisissures et des microalgues. Ces microorganismes
peuvent être utilisés soit dans leur état naturel, ou bien sont des mutants sélectionnés au laboratoire
ou même des microorganismes génétiquement modifiés (MOGM) (Zhang et al, 2014).
1
I. Les domaines d’activité de la microbiologie industrielle et intérêt de l’utilisation des

microorganismes.
1. Introduction
L’industrie de la fermentation est un terme générique appliqué aux processus commerciaux qui
reposent sur la capacité des microorganismes à produire des molécules utiles, à grand échelle, en
présence ou en absence d’air. Ainsi, contrairement au sens biochimique, le terme de fermentation
industrielle ne se réfère pas au métabolisme du micro-organisme (Humphrey et al, 1992).
La fermentation se déroule dans des fermenteurs ou des cuves, sous des conditions
physicochimiques (température, pH, aération, source de carbone, source d’azote…) rigoureusement
contrôlées (Walker et al, 2014).
2. Intérêt de l’utilisation des microorganismes en industrie:

L’utilisation des micro-organismes en industrie apporte une vaste gamme de produits et de
services. Ils se sont avéré particulièrement utile en raison de (Demain et al, 2008):
 Leur culture facile ;

 Leur temps de génération très courte ;
 Leur vitesse de croissance élevée.
 Leur capacité d’être cultivé sur des substrats bon marché, qui sont dans de nombreux cas des
déchets issus de l’industrie agroalimentaire. ;
 Sont faciles à manipuler génétiquement, ce qui permet d’améliorer les souches.
3. L'objectif recherché dans la fermentation industrielle.
- Recueillir les microorganismes eux-mêmes (levure de boulangerie par exemple) (Ritala et
al, 2017).
- Recueillir un sous-produit de la réaction (alcool, antibiotiques...) (Keller et al, 2019).
- La bioconversion des molécules, Transformer des produits complexes en éléments simples
(traitement des eaux usées, valorisation des déchets industriels) (Huang et al, 2017).
Dans l’industrie alimentaire l’intérêt apporté par la fermentation d’un produit alimentaire est
d’améliorer sa stabilité, et ce pour deux raisons :
- la consommation de substrat fermentescible évite une dégradation bactérienne post-
fermentaire de l’aliment ;
- la production d’alcool ou d’acide limite la contamination bactérienne.
Ce rôle capital de conservation généré par la fermentation s’accompagne d'effets positifs
recherchés au niveau de la texture et de l’aromatisation des produits fabriqués.
2
4. Les domaines d’activité de la microbiologie industrielle.

La microbiologie industrielle peut avoir différentes applications, à savoir :
 Domaine agroalimentaire : plusieurs produits alimentaires sont issus de la fermentation

industrielle, c’est le cas par exemple de la fabrication du yaourt réalisé par l’action de deux
bactéries, Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus. La bactérie lactique,
Lactococcus lactis, est utilisée pour la fabrication des différents types de fromages à pâtes
fraiches, en raison de son aptitude à acidifier le milieu suite à la fermentation de lactose en
acide lactique, ce qui facilite ainsi la formation du caillé.
Plusieurs acides organiques sont produits industriellement par voie microbienne, comme par
exemple, l'acide acétique et l’acide citrique, produits par les espèces du genre Acetobacter et
le champignon Aspergillus niger, respectivement.
 Domaine pharmaceutique : parmi les sources majeures de médicaments qui existent sur le
marché c’est les microorganismes, en particulier les bactéries membres dans le phylum des
Actinobacteria, qui sont la source de 80% des antibiotiques qui existe sur le marché.
 Domaine de bioremédiation et dépollution de l’environnement : Grace à son aptitude de
biotransformation des polluants toxiques, les microorganismes peuvent être utilisés dans la
décontamination de milieux pollués, ce procédé est appelé bioremédiation.
 Domaine d’énergie renouvelable : les microorganismes jouent un rôle primordial dans le
domaine d’énergie renouvelable, en effet, par l’intervention de plusieurs microorganismes,
les déchets organiques peuvent être convertis en biogaz (méthane) ou bioéthanol, qui sont
ensuite utilisés comme carburants pour remplacer l’énergie fossile.
D’autres applications sont décrites dans le Tableau 1.
3
Le Tableau 1 : quelques exemples de l’application des microorganismes en industrie
Microorganismes Le produit de la fermentation L’application

Saccharomyces cerevisiae Ethanol Chimie fine
Pseudomonas Acide 2 ceto-gluconique Un intermédiaire dans la production
de l’acide ascorbique (vitamine C) ;
précurseur de la synthèse d’acide
isoascorbique.
Aspergillus niger Pectinase, protease Clarification des jus de fruits
Bacillus subtilis Amylase Préparation de l'amidon modifié ;
Utiliser pendant l’encollage de
papier.
Bacillus subtilis Protease Hydrolyse des protéines
Micrococcus glutamicus Lysine Additif alimentaire
Leuconostoc mesenteroides Dextran Stabilisant alimentaire
Gluconobacter suboxydans Sorbose Production acide ascorbique

Streptomyces olivaceus Cobalamine (Vitamine B12) Complément alimentaire
Recombinant d’E. coli Insuline Médecine humaine

Streptococcus thermophilus, Yaourt Starter dans l’industrie laitière
Lactobacillus bulgaricus
Candida utilis Les protéines d'origine Alimentation humaine et animale
Fusarium graminearum unicellulaires (P.O.U)
Cephalosporium acremonium Cephalosporin Antibiotiques pour le traitement des
Saccharopolyspora erythrea Erythromycin infections
4
II. Les microorganismes industriels : isolement, sélection et amélioration des souches.

1. Introduction.
Les micro-organismes sont largement utilisés en industrie pour réaliser des fins utiles à l’homme.
Ils se sont avérés particulièrement utiles en raison de la facilité de leur culture, de la rapidité de leur
croissance, de leur pouvoir à utiliser des substrats bon marché (qui dans de nombreux cas sont des
déchets de l’industrie agro-alimentaire), et de leur capacité à subir facilement des manipulations
génétiques (Becker et al, 2017). Les microorganismes utilisés en industrie sont généralement :
- Des bactéries : qui sont des cellules procaryotes, dépourvues de noyau. Plusieurs bactéries
peuvent être utilisées dans le domaine industriel, telles que les actinomycètes dont le genre
Streptomyces, qui fournit à lui tout seul 70% des antibiotiques utilisés (Al Farraj,et al,
2020). Les bactéries lactiques, telles que Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus
thermophilus, sont utilisées pour la fabrication du yaourt (Yamauchi et al, 2019), alors que
les espèces, Corynebacterium glutamicum et Propionibacterium shermanii, sont
caractérisées par son pouvoir de sécréter l’acide glutamique et la vitamine B12 (Zhang et
al, 2020).
- Des champignons : qui sont des eucaryotes, pourvues de noyau, unicellulaire (des levures)
ou pluricellulaire (moisissures). Ce sont soit des moisissures, soit des levures. L’espèce,
Saccharomyces cerevisiaea, et la levure la plus utilisée dans le domaine industriel,
principalement dans la production de protéines, protéines recombinantes et plusieurs
produits biopharmaceutiques (Gervasi et al, 2018). Apergillus niger, est une moisissure
utilisée pour la production industrielle de l’acide citrique (Steiger et al 2019).
- Les microalgues : sont des microorganismes photosynthétiques eucaryotes ou procaryotes
unicellulaires ou pluricellulaires. Les cyanobactéries du genre Arthrospira sont utilisées
comme compléments alimentaires pour lutter contre la malnutrition sous forme de spiruline
alimentaire (spirulina) (De La Jara et al, 2018).
2. La stratégie suivie pour la recherche de nouvelles souches industrielle.
2.1 Isolement des souches.
Cette étape est aléatoire, puisqu'il s’agit de prélever des microorganismes, en rapport avec
l'organisme recherché, sur un aliment, le sol…etc. Le prélèvement est ensuite ensemencé sur un
milieu approprier afin d’isoler le germe recherché. L’étape suivante consiste à isoler et purifier les
différents clones obtenus. La purification est réalisée par strie d’épuisement. Cette technique permet
l’isolement de colonies, et l’obtention des cultures pures (Becker et al, 2017).
5
2.2 Sélection des microorganismes industriels.

Après l’isolement, les microorganismes obtenus subissent ensuite une sélection selon leur
aptitude biologique et technologique (Zhou et al, 2017 ; Min et al, 2017 ; Mattanovich et al,
2017; Paul et al, 2019):
- Rendement élevé : pouvoir de produire la molécule d’intérêt ou la biomasse dans une courte
période.
- Des critères biologiques spécifiques aux microorganismes et leur application. Par exemple,
les ferments lactiques sont sélectionnés selon leur pouvoir acidifiant et aromatisant ainsi
qu’à la production des bactériocines.
- Non pathogènes et ne produisent pas de métabolites indésirables comme les toxines.
- Facile à manipuler génétiquement.
- Croitre sur des substrats bon marché (les déchets d’industrie agroalimentaire).
- Ne possèdent pas d’exigence spécifique vis-à-vis des facteurs de croissances.
- Stable génétiquement, surtout après leur conservation par congélation ou lyophilisation.
- Pourvoir de résister aux différents procéder technologique.
- La résistance aux bactériophages : ce critère met en jeu des enzymes de restriction, et qui est
lié au nombre et la forme des protéines de surface qui sont autant de points d’attaches aux
bactériophages.
2.3. Identification moléculaire des souches sélectionnées.
Lorsqu’une souche est retenue et répond aux critères de sélection, elle fait l’objet d’une
identification moléculaire sur la base de séquençage d’ADNr 16s (Salam et al, 2020).
3. Amélioration des souches sélectionnées.
Les stratégies d’améliorations visent à (Min et al, 2017):
a) accroître le rendement de la concentration en produit désiré, ou de la biomasse.
b) Réduire la production des métabolites indésirables.
Deux méthodes sont utilisées, afin d’améliorer les souches sélectionnées : la mutagenèse aléatoire
et la recombinaison (Johansen et al, 2017).
La plupart des procédés de mutagenèse ou de recombinaison in vitro suivent un schéma de base

similaire : le gène d’intérêt subit d’abord une mutagenèse ou une recombinaison in vitro, puis les
copies du gène obtenus, sont introduites dans des plasmides portant un gène de résistance d’un
antibiotique, après, ces plasmides sont introduits dans des organismes hôtes (typiquement des
bactéries), par transformation, de sorte qu’un organisme ne reçoit en moyenne qu’une copie mutée. Les
6
bactéries transformées sont sélectionnées par l’ajout, dans le milieu de culture, d’antibiotique qui va
éliminer toutes les bactéries non transformées (Figure 1) (Chang et al, 2017 ; Asif et al, 2017).
Figure 1 : Les étapes de l’amélioration génétiques des souches industrielles (Chang et al, 2017).
Une mutagenèse aléatoire ou la recombinaison génétique, aboutit à une population hétérogène

portant différents types de gènes mutés. On doit tester chaque clone pour chercher la ou les mutations
d’intérêt. Pour cela, deux cas sont possibles :
● Si l’activité désirée de l’enzyme d’intérêt est rendue essentielle à la survie de la cellule

transformée, il est généralement simple d’identifier les mutations bénéfiques en entreprenant
une sélection par survie cellulaire. un bon exemple est le criblage basé sur une résistance à un
inhibiteur (Jang et al, 2013).
● Lorsque la sélection par survie cellulaire ne peut être appliquée pour tester tous les mutants
d’une banque donnée, l’expérimentateur doit se tourner vers une technique alternative, le
criblage. Selon cette approche, tous les mutants enzymatiques de la banque seront testés
individuellement pour la caractéristique désirée. De manière classique, pour entreprendre un
criblage, on crée une banque de 102 à 105 mutants en cellules, on les dispose individuellement
dans des plaques à multi-puits et on les teste un par un pour une activité ou une propriété
désirée. Concrètement, il est possible de suivre l’évolution d’un réactif par la coloration ou par
l’apparition de fluorescence, d’évaluer les changements de pH selon un indicateur ajouté au
7
milieu de réaction, de suivre la turbidité de la solution ou encore de calculer les changements

de température accompagnant la réaction qui intéresse l’expérimentateur (Bergmans et al,
1981).
3.1 La mutagenèse aléatoire.
La mutagenèse aléatoire peut être réalisée par différentes méthodes. Il est possible de modifier
la séquence de sites de restriction, d'utiliser au hasard un oligonucléotide dans le plasmide, de traiter
l'ADN du plasmide par des agents chimiques in vitro ou bien encore d'inoculer des nucléotides
incorrects lors de la synthèse in vitro de l'ADN (PCR) (Yang et al, 2018).
Pour cette dernière méthode, on peut introduire plusieurs mutations en faisant plusieurs rondes
de PCR sur un même gène à l’aide d’une polymérase dont le taux d’introduction d’erreurs est très
élevé et qui n’a pas d’activité exonucléique de correction des erreurs : c’est la méthode PCR pro-
erreurs (Error-prone PCR6) (Figure 2). Le nombre de mutations ainsi obtenues demeure faible
(environ 1 à 2 mutations par 1000 paires de bases d’ADN, au maximum) (Shao et al, 2017).
Ce taux mutationnel peut néanmoins être amélioré et modulé par la modification des conditions de
réaction de la PCR par rapport à celles de la PCR normale (Ye et al, 2020):
- Mn2+ est utilisé à la place du Mg2+ comme cofacteur

- Des concentrations faibles de dNTPs sont utilisées
- des analogues de dNTPs sont utilisés
- Des co-solvants organiques (e.g. isopropanol) diminuent aussi la fiabilité de la polymérase.
Figure 2 : Les étapes du mutagène aléatoire.
8
3.2 Le brassage génétique.
Le brassage génétique, DNA shuffling en anglais, correspond aux recombinaisons génétiques qui
se produisent par l’utilisation d’une série de gènes homologues d’une même famille ou bien du
même gène ayant différentes mutations. Le point de départ est de mélanger les séquences
homologues. Les gènes sont ensuite découpés de façon non spécifique et aléatoire par un DNase I
(Yang et al, 2017). Les fragments obtenus, de 50 à 100 pb de longueur, vont alors s'hybrider les uns
aux autres selon leur homologie de séquence, ensuite plusieurs cycles de PCR sans amorces sont
entreprise (Figure 3). Le résultat est une banque de gènes hybrides, qui seront transformés dans des
cellules hôtes afin de rechercher les propriétés uniques désirées de la souche améliorer (Brindha et
al, 2020).
Figure 3 : La méthode de brassage génétique.

4. Faisabilité industrielle.
Les souches présélectionnées, identifiées puis amélioré doivent être propagées en vue d’une
commercialisation. Elles doivent être produites à une échelle industrielle et pour cela il faut que les
rendements de production soient satisfaisants. Les souches sont étudiées à un stade pilote et font
l’objet d’analyses à chaque étape du processus de fabrication (dénombrement viabilité…) dans le
but d’évaluer leur résistance au processus ; ceci pour déterminer des paramètres de fermentation ou
traitements de la biomasse les plus adaptés à la survie, l’étape de congélation étant la plus
destructrice (Diethard et al, 2017 ; Kriger et al, 2018).
9
Lorsque la faisabilité industrielle est satisfaisante, il y a création d’un souchier. Les cellules
sont cultivées en fermenteurs de 2 litres puis réparties en cryo-tubes, d’un millilitre, additionnées
d’un cryoprotecteur, puis conservées à basse température (azote liquide ou congélateur à -80°c)
(Kriger et al, 2018).
10
III. Les milieux de cultures industriels.

1. Introduction.
Les milieux de cultures industriels doivent satisfaire les exigences nutritionnelles du
microorganisme pour permettre une croissance optimale de la biomasse cellulaire, et en même
temps, doivent fournir les nutriments nécessaires pour la biosynthèse des métabolites cibles
(Okafor et al, 2020).
La fermentation industrielle est réalisée, le plus souvent, sur un milieu de culture liquide,
bien que certaines fermentations sont opérées sur des milieux de culture solides (Demain et 1981).
2. Les facteurs déterminant le choix de milieu de culture industrielle.
Les principaux facteurs qui affectent le choix de milieux de culture industrielle sont les
suivants (El-Mansi et al, 2018):
 Substrat de bon marché (peu coûteux).

 Qualité physico-chimique constante même après stérilisation.
 Disponibilité durant toute l'année.
 Coûts de transport et de stockage faible, surtout vis-à-vis de température.
 Facilité à manipuler sous forme solide ou liquide.
 Facile a stérilisé.
 Une viscosité qui ne gêne ni l'agitation ni l'aération de milieu de culture industriel durant le
procédé de la fermentation.
3. La composition de milieu de culture industriel.
La composition de milieu de culture doit inclure une source de carbone qui est le plus
souvent la source d’énergie, en plus d’une source d'azote, de phosphore et de soufre. Des oligo-
éléments doivent également être présents dans le milieu de culture industrielle. Certains micro-
organismes exigeants nécessitent la présence de certains facteurs de croissance, telle que certaines
vitamines ou des acides aminés (Waites et al, 2009).
3.1. Sources de carbone.
La quantité ainsi que la qualité de la source de carbone utilisée comme ingrédient dans le milieu
de culture industrielle, peut être déterminée à partir du coefficient de rendement de la biomasse
(Ycarbon), qui est le rapport entre la quantité de biomasse produite et la quantité de substrat carboné
consommée (g de biomasse / g de substrat) (Waites et al, 2009).
11
Pour des raisons de cout, les sources de carbone pur, comme les glucides, tels le glucose ou le
saccharose, sont rarement utilisés pendant les fermentations à l'échelle industrielle, par contre,
d’autres sources de carbone moins chères peuvent être utilisées :
 Mélasse : c’est un sous-produit résultant du raffinage du sucre extrait de la betterave
sucrière ou de la canne à sucre. Il s'agit d'un sirop visqueux de couleur foncée contenant 50 à
60% (p/v) de glucides, principalement le saccharose, ainsi que 2% (p/v) de substrats azotés,
en plus de quelques vitamines et des sels minéraux (Koval et al, 2019).
 L’extrait de malt : les extraits aqueux d'orge maltée peuvent être concentrés pour former
un sirop très riche en sucre simple et de disshaccaride, en plus de certaines vitamines,
peptide et d’acide aminé. Ces substrats peuvent être utilisés pour la culture des champignons
filamenteux, des levures et d'actinomycètes (Cvetković et al, 2002).
 Amidon et la dextrine : l'amidon est obtenu, le plus souvent, à partir de maïs, mais il peut
également être obtenu à partir d'autres céréales. Pour être utilisé comme source de carbone
et d’énergie, l'amidon subit d’abord une hydrolyse en sirop de sucre, contenant
principalement du glucose et la dextrine, par des acides dilués ou des enzymes
amylolytiques (Laluce et al, 1988).
 Lactosérum : appelé aussi le petit-lait, c’est le résultat de la coagulation du lait. La
composition de lactosérum varié en fonction de la méthode dont il a été obtenu, en effet, le
lactosérum obtenu par la présure est très riche en protéines sériques ainsi que le lactose,
alors que le lactosérum obtenu par fermentation lactique du lait, est riche en protéines
sériques et du calcium (Pescuma et al, 2015).
3.2. Source d’azote.
La plupart des microorganismes industriels, peuvent utiliser les sources d'azote sous formes
organiques et inorganiques. L'azote inorganique peut être fourni sous forme de sels d'ammonium,
tel que, sulfate d'ammonium (SO4-NH4+) et le phosphate de diammonium ((NH4)2HPO4), alors que
les sources d'azote organique comprennent les acides aminés, les protéines et l'urée (Kampen et al,
2014).
La source d’azote est souvent fournie sous une forme brute, qui est essentiellement des sous-
produits issue de l’industrie agro-alimentaire, comme la liqueur de maïs, les extraits de levure, les
peptones et la farine de soja. Les acides aminés purs ne sont utilisés que dans certains cas
particuliers (Waites et al, 2009).
12
3.3. Les sels minéraux.

Des sels minéraux comme, le cobalt, le cuivre, le fer, le manganèse, le molybdène et le zinc
sont présents en quantité suffisante dans l’eau ainsi que les autres ingrédients du milieu de la
culture industrielle. Par exemple, le corn steep liquor, contient une quantité satisfaisante en sels
minéraux, pour répondre aux exigences de la fermentation (Zhou et al, 2006).
3.4. Les vitamines et les facteurs de croissances.
De nombreuses bactéries peuvent synthétiser toutes les vitamines nécessaires à partir
d'éléments de base. Tandis que d’autres microorganismes, nécessite l’ajout des vitamines dans le
milieu de culture industrielle. D'autres facteurs de croissance sont nécessaires, comme les acides
aminés, les acides gras et les stérols (Chang 1999).
3.5. L’apport en O2.
Selon les besoins de microorganisme en O2, ainsi que son type respiratoire,, l’oxygène est
injecté dans le fermenteur sous forme d’air contenant environ 21% (v / v) d'oxygène, ou il peut être
fourni sous forme d'oxygène pur lorsque les besoins de microorganisme sont particulièrement
élevés. L’air ou l’oxygène injecté dans le fermenteur, doit être stérilisé par filtration (Waites et al,
2009).
3.6. L’ajout des antimousses.
Les antimousses sont nécessaires pour réduire la formation de mousse pendant la
fermentation, qui est due principalement aux protéines du milieu de culture. Si la formation de la
mousse n'est pas contrôlée, elle peut bloquer les filtres à air, entraînant la perte asepsie. Il existe
trois approches pour contrôler la formation de la mousse : (i) modification de la composition du
milieu culture ; (ii) utilisation de brise-mousse mécanique ; (iii) l’ajout des produits antimousses
chimiques, qui sont des molécules tensioactifs, comme par exemple les huiles végétales (huile de
soja, huile de tournesol et le huile de colza), l'huile de poisson (Pelton et al, 2002).
13
IV. Les fermenteurs ou les bioréacteurs industriels.

1. Introduction.
Un bioréacteur, appelé également fermenteur ou propagateur, est un appareil dans lequel on
multiplie des micro-organismes (levures, bactéries, champignons microscopiques, algues, cellules
animales et végétales) pour la production de biomasse, ou pour la production d'un métabolite ou
encore pour la bioconversion d'une molécule cible (Erickson, 2019).
Un bioréacteur comporte (Figure 4):
 Une enceinte de culture, en verre ou en acier inoxydable, avec un volume variable
allant de quelques litres jusqu'à plusieurs mètres cubes dans le cas d'unités
industrielles. La cuve est hermétiquement fermée et ne laisse pas passer l'air du
milieu intérieur et celui du milieu extérieur.
 Un système d'agitation est utilisé pour assurer l’agitation et l’aération de la culture, il
est formé par un moteur externe, et un ou plusieurs turbines intérieures (selon la
taille de fermenteur).
 Une seringue pour injecter le milieu de culture ou des éléments nutritifs.
 Des sondes pour la vérification de la température (thermomètre), du pH (pH-mètre),
de la concentration en oxygène dissous (sonde oxymétrique),
 Une unité de contrôle gérée par un ordinateur permet d'enregistrer et piloter tous les
paramètres de fonctionnement.
Figure 4: Schéma d’un fermenteur.
14
Les bioréacteurs sont classés en fonction de leur volume maximal:

- les bioréacteurs de laboratoire stérilisables à l’autoclave jusqu’à 18 L ;
- les bioréacteurs de laboratoire stérilisables in situ jusqu’à 30 L ;
- les bioréacteurs pilotes jusqu’à 300 L ;
- les bioréacteurs industriels jusqu’à 500 000 L (500 m3).
2. Les types de fermenteurs.
On distingue trois types de fermenteurs :
2.1. Le mode discontinu (ou batch).
Dans ce type de fermenteur, le système est fermé et garde un volume constant. La cuve est
remplie par le milieu de culture stérile, puis il sera inoculé par la souche industrielle. La
fermentation se déroule sous agitée, et durant tout le temps de la fermentation, le volume de la
culture reste constant sans introduction supplémentaire de milieu de culture. Cependant, les réactifs
de neutralisation, ou encore un produit antimousse, peuvent être ajoutés (Carmaux, 2008) (Figure
5).
Figure 5 : Fermenteur de type Batch (discontinu) (Carmaux, 2008).
La concentration en biomasse augmente selon la courbe de croissance microbienne. Au même

temps, le substrat est consommé par le microorganisme et la concentration de produits (P)
recherchés augmente. À la fin de culture on vide le fermenteur et on extrait le produit désiré
(Oosterhuis et al, 2011).
15
Figure 6 : Évolution de taux de croissance des cellules (X), par rapport aux taux de conversion
de substrat (S), la production de métabolites (P), au cours d’une fermentation industrielle
(Oosterhuis et al, 2011).
Les avantages de la fermentation en mode discontinu (Batch).
- Le produit désiré peut-être recueilli à tout moment.
- Le risque de contamination est faible.
Les inconvénients de la fermentation en mode discontinu (Batch).
- Le temps de latence est très long.
- La durée de la phase exponentielle est très courte, donc la biomasse et le produit finale sont
produits en quantités faibles : rendement limité.
2.2. Fed Batch (fermenteur discontinue et alimenté).
Dans ce type de fermentation, afin de diminuer le temps de la phase de latence et en même
temps assuré une durée plus allongée de la phase exponentielle de croissance, la culture commence
par l’utilisation d’un petit volume de milieu de culture appelé pied de cuve, qui sera ensemencé par
un inoculum microbien. Quand le microorganisme atteint la phase exponentielle de croissance, on
introduit le milieu de culture stérile dans la cuve. Le débit d'alimentation est réglé de façon à ce que
la concentration en substrat soit constante dans la cuve, et en même temps sans exercer un effet
inhibiteur sur la production de la biomasse (Figure 7). La fermentation est coupée dès que la cuve
est remplie par le milieu de culture. Il faut noter que le risque de contamination dans ce type de
fermenteur est plus élevé (Evgenios et al, 2020).
16
Figure 7 : Fermenteur de type Fed Batch (Evgenios et al, 2020).

2.3. Fermentation continue.
Dans ce type de fermentation, la phase exponentielle de croissance microbienne est maintenue
en permanence, grâce à une addition régulière de milieu de culture neuf par un débit constant, ce
qui permet un réapprovisionner en nutriments et le maintien de pH; et en même temps une quantité
équivalente de milieu de culture additionné doit être soutirée, ce qui permet d’éviter l’accumulation
des déchets (Figure 8) (Sarkar et al, 2003).
Figure 8: Fermenteur de type Fed Batch (Evgenios et al, 2020).

Parmi les dispositifs utilisés, le turbidostat qui est un fermenteur de culture en mode continu
(Figure 9). Grace à un contrôle turbidimétrique, la concentration du milieu de culture est maintenue
constante:
- Si la charge microbienne tend à trop augmenter, un apport de milieu neuf est réalisé afin de
diluer et ramener le trouble microbien à sa valeur initiale.
- Si la charge microbienne diminue, il y a diminution d’apport de milieu neuf jusqu’à ce que
la croissance revienne à sa valeur initiale.
17
Figure 9 : Un bioréacteur continu du type turbidostat (Lee et al, 2011).

1: réservoir de milieu stérile; 2: valve de contrôle du flux de milieu neuf, 3: sortie de milieu de culture, 4:
cellule phoéléctrique ; 5 : source lumineuse.
3. Processus de mise à l’échelle (ou extrapolation) : scale up.

Quel que soit le domaine des applications de la microbiologie industrielle, le passage depuis les
Erlenmeyer de laboratoire au bioréacteur industrielle reste un défi. D'où l'idée de processus de
mise à l'échelle, ou scale up en anglais, qui consiste à transférer la culture microbienne, préparée
dans des Erlenmeyers du laboratoire, à des bioréacteurs de laboratoire de petit volume, puis à des
bioréacteurs pilotes, ensuite la culture sera introduite dans un fermenteur industriel (Figure 10).
Afin d’assurer la réussite de l’extrapolation, les divers paramètres physicochimiques sont analysés
puis modifiés durant chaque étape de la mise à l’échelle, car les réactions physicochimiques et
enzymatiques des cellules microbiennes, qui se produisent à l’intérieur du bioréacteur varient en
fonction du volume du réacteur utilisé. Donc on cherche à obtenir le même rendement, malgré
l’augmentation du volume de la culture (Levin, 2001 ; Schmidt et al, 2005 ; Xing et al, 2009).
Figure 10 : Processus de scale up (Levin, 2001).
18
V. Les produits de la fermentation industrielle.
V.1. Les Protéines d'Origine Unicellulaire (P.O.U).
1. Définition.
On appelle "Protéines d'Origine Unicellulaire" (P.O.U), ou en anglais Single Cell

Proteins (SCP), toute biomasse microbienne riche en protéines destinée à l'alimentation humaine ou
animale. Les P.O.U ne sont pas des protéines pures, mais contiennent également des glucides, des
lipides, des acides nucléiques, des sels minéraux et des vitamines (Nasseri et al, 2011).
2. La raison du besoin mondial des protéines d’origine unicellulaire.
Les sources de protéines sont essentiellement couverts par les protéines animales, représenté
principalement par la viande de différents types, cependant, à cause de son prix élevé, le régime
alimentaire de beaucoup de pays accuse un grave déficit en protéines animales, et la recherche de
nouvelles ressources protéiques est l’une des préoccupations de ces pays. Donc la motivation de
l’utilisation de P.O.U dans l’alimentation humaine, à principalement comme objective de surmonter
la sous-alimentation dans ces pays, et permet donc de satisfaire leurs besoins en protéines. Dans les
pays où il n’y a pas de graves problèmes de sous-alimentation, l‘utilisation des P.O.U en
alimentation humaine est très limitée, et elle est plutôt destinée à l’alimentation animale (Ravindra
et al, 2000).
3. Les microorganismes utilisés pour la production des P.O.U.
Généralement, quatre types de micro-organismes sont utilisés. II s'agit des micro-algues, des
bactéries, des levures et des champignons filamenteux. Ci-après, quelques exemples (Gervasi et al,
2018):
 Les levures généralement utilisées comme P.O.U, sont principalement :
- Saccharomyces cerevisiae: utilisé surtout comme additif alimentaire.
- Candida utilis : après inactivation par chauffage, elle est utilisée en tant qu'aliment
nutritif, puisqu’elle est riche en protéines et en acides aminés libres, et possède une
saveur légère de viande.
 La moisissure, Fusarium venenatum, est utilisée pour la production de Quorn, qui est
une marque de substitut de viande à base de mycoprotéine, possédant un gout qui
ressemble à la viande de poulet (Reihani et al, 2019).
Les cyanobactéries peuvent être utilisées comme des compléments alimentaires, c’est le cas par
exemple de la spiruline, produit principalement à partir des espèces, Arthrospira platensis ou
19
Arthrospira maxima. La spiruline est riche en protéines (60% de protéines) et de vitamines, ainsi que
des sels minéraux et des oligoéléments (Avila‐Leon, et al, 2012).
4. Critère de choix de microorganisme pour la production de P.O.U.

Avant d’être utilisé comme source de P.O.U, le microorganisme doit remplir certains critères,
en fait, il doit être (Nangul et al, 2021):
 Non pathogène
 Possédant un taux de protéines élevé.
 Taux de croissance élevé ;
 Facilité pour la récolte ;
 Bonne résistance aux variations dans les conditions de production.
5. Production industrielle des P.O.U.
 Les conditions de culture.
Le rapport idéal pour les différentes sources de carbone, d’azote et de phosphore, entrant dans la
composition de milieu de culture pour la production des P.O.U, doit être égal à 100 / 5 / 1. La
température d’incubation est généralement comprise entre 30 et 35 °C, selon le microorganisme,
alors que le pH doit être maintenu entre 4.0 et 5,5. Un paramètre critique est la concentration en
oxygène dissout. Pour des fermentations aérobies, le milieu devrait être saturé à 40 % en oxygène "
(Waites et al, 2009).
 Fermentation et purification des P.O.U.
Après avoir stérilisé le milieu de culture, la production de biomasse est réalisée dans un
fermenteur. Les POU sont récupérés, ensuite, par centrifugations multiples, puis sont emmagasiné
dans des barils, ou bien sont séchés afin d'obtenir une poudre exempte de toute cellule vivante
(Ghanem, 1992).
6. Avantages et inconvénient des POU.
L’utilisation de microorganisme comme source de protéines d'origine unicellulaire possède
certains avantages par rapport aux sources de protéines d’origine animale ou végétale (Nasseri et al,
2011) :
 Taux de croissance rapide, par rapport aux animaux d’élevage.
 Teneur élevée en protéines (30–80% du poids sec);
 La possibilité d'utiliser une large gamme de substrats bon marché (peu coûteux), y compris
les déchets organiques, pour leur croissance.
 Demande peu d’espace et peu d’eau, par rapport à l’élevage.
 Permets de résoudre un problème environnemental.
20
 La production des P.O.U est indépendante des variations climatiques.

Quelques inconvénients pouvant accompagner l’utilisation des P.O.U, comme source de
protéines (Fabregas et Herrero, 1985) :
 Ils peuvent produire des toxines ou autres métabolites nuisibles.

 Le contenu en acides nucléiques des POU limite leur utilisation en alimentation humaine.
En effet, une grande consommation d'acides nucléiques, élève la concentration en acide
urique dans le plasma du sang. Il y a alors un risque de précipitation d'urée dans les tissus et
les articulations, ce qui aboutit à des symptômes analogues à la maladie de la goutte.
21
V.2. Les métabolites primaires obtenus par fermentation microbienne.
V.2.1. Les acides aminées.
1. Introduction.
De nombreux micro-organismes peuvent synthétiser des acides aminés à partir de composés

azotés inorganiques, via des procédés de la fermentation industrielle. Ces acides aminés sont
principalement utilisés comme compléments alimentaires pour l’alimentation humaine ou animale.
Cependant, plusieurs acides aminés sont utilisés comme ingrédients dans les produits
pharmaceutiques et cosmétiques, et dans l'industrie chimique pour la fabrication de polymères, le
cas par exemple de l’acide glutamique, lysine, et tryptophane (Demain et al, 2008).
Dans la suite du cours, on discutera l’exemple de la production industrielle de l’acide

glutamique.
2. Exemple de la fabrication industrielle de l’acide glutamique.
L’acide glutamique est un acide aminé non essentiel, produit industriellement sous forme de
Glutamate monosodique (MSG, E621). Cette molécule est utilisée principalement comme additif
alimentaire pour exhausser le goût de plusieurs produits alimentaires, car il est responsable du goût
umami (Ikeda, 2003).
2.1. Les principales souches microbiennes utilisées.
Les bactéries productrices de l'acide glutamique, regroupent des espèces qui appartiennent tous
au phylum des Actinobacteria, dont, Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium,
Microbacterium et Micrococcus. Ce sont des bactéries à Gram-positifs, immobiles, aérobies stricts,
auxotrophes pour la biotine (Tatsumi, 2012).
Les souches industrielles utilisées pour la production de l’acide glutamique, sont des mutants
des espèces de, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Brevibacterium flavum
et Brevibacterium lactofermentum. Afin de surmonter les contraintes rencontrées lors de la
production industrielle de l’acide glutamique, plusieurs étapes sont suivies (Hermann et al, 2003 ;
Ikeda, 2013) :
 Modification génétique des souches industrielles qui vise surtout à bloquer les voies
métaboliques qui amènent à la biosynthèse des sous-produits indésirables.
 L’inhibition du mécanisme de régulation de la production de l’acide glutamique par rétro-
inhibition, en effet, chez les souches sauvages de Corynebacterium glutamicum, quand le
22
produit final s'accumule et atteint une concentration finale désirable, la production

cytoplasmique de l’acide glutamique est inhibé par le mécanisme de rétro-inhibition,
 Diminuer l’activité du complexe enzymatique, α-cétoglutarate déshydrogénase, également
appelé, complexe oxoglutarate déshydrogénase (OGDC), qui sont des enzymes du cycle de
Krebs, catalysent la réaction de conversion de α-cétoglutarate au succinyl-CoA (Figure 11).
+ CoA-SH + NAD+ → NADH + H+ + CO2 +

α-Cétoglutarate Succinyl-CoA
Figure 11: Réaction de conversion de α-cétoglutarate au succinyl-CoA (Ikeda, 2013).
En effet, la production de l’acide glutamique est catalysée par l’enzyme glutamate

déshydrogénase (Figure 12), qui utilise comme substrat, l’oxoglutarate (α-cétoglutarate), qui est un
intermédiaire de cycle de Krebs (Ertan, 1992).
Figure 12: Réaction de la formation de l’acide L-glutamique (Ertan, 1992).
Afin d’orienter le métabolisme des souches mutantes vers une surproduction de l’acide
glutamique, l’activité de l’enzyme, oxoglutarate déshydrogénase (OGDC) (Figure 13), décroît sous
des conditions limitantes en biotine, ce qui permet une accumulation de α-cétoglutarate et conduit,
par conséquent, à une amélioration du rendement de productions de l’acide glutamique. Il est
important de noter que, la concentration optimale de biotine pour produire du glutamate se situe
entre 2 et 5 µg/L (Schultz et al, 2007).
Figure 13 : Biosynthèse de l'acide l-glutamique chez les souches mutantes (Sonenshein, 2021).
23
2.2. Les principaux traitements utilisés pour favoriser la sécrétion de l’acide

glutamique.
Comme la biosynthèse de l’acide glutamique est cytoplasmique, et les souches mutantes ne

sécrètent pas le glutamate, une gamme de traitements est utilisée pour rendre les cellules plus
perméables et faciliter la libération de l'acide aminé dans le milieu extérieur. Ces traitements
comprennent :
 La limitation de la biotine pendant la fermentation glutamique est à l’origine de la
diminution du taux de phospholipide membranaire, ce qui a pour effet d’augmenter le
rapport d’acides gras saturés/ acides gras insaturés, qui est à l’origine de l’excrétion du
glutamate (Gutmann, 1992).
 L'ajout de la pénicilline semble être utilisé lors de la production industrielle de l’acide
glutamique. En effet, la pénicilline inhibe la biosynthèse de peptidoglycane chez les souches
productrices, ce qui engendre un agrandissement de la taille cellulaire, et en même temps,
provoque une amélioration du rendement de production de glutamate (Kim et al, 2010).
 Traitement par des tensioactifs, surtout pat Tween 40, en effet, il a été observé que des
concentrations finales de 80 g/L en glutamate ont été obtenues par la souche C. glutamicum,
en utilisant le Tween 40 (Kim et al, 2009 ; Hoischen et Kramer, 1990).
2.3. Les conditions de culture.
La fermentation est réalisée dans des fermenteurs en acier inoxydable d'une capacité maximale
de 450 m. Les sources de carbone utilisés sont généralement le glucose ou le saccharose. La
mélasse de la canne à sucre ou la betterave peuvent aussi être utilisée. La source d'azote (sels
d'ammonium, urée ou ammoniaque) est alimentée lentement pour éviter l'inhibition de la production
de L-glutamate (Hirasawa et al, 2016).
La culture est maintenue en agitation dans des conditions aérobies, à la température de 30–37 °
C, selon le microorganisme utilisé. Afin d’éviter la diminution du pH du milieu de culture, au fur et
à mesure que le L-glutamate est excrété dans le milieu, le pH est maintenu entre 7 à 8. La durée de
la fermentation, est normalement entre 35 à 40 h. et atteint des niveaux d'acide lglutamique dans le
bouillon de 80 g / L (Delaunay et al, 1999).
La purification de l’acide glutamique, implique, une centrifugation pour éliminer la biomasse

microbienne. Le pH du surnageant est abaissé doucement, par l’acide chlorhydrique, au point
isoélectrique de l'acide L-glutamique (pH= 3,2). Les cristaux de l’acide L-glutamique, sont ensuite
récupérés par centrifugation, puis lavés plusieurs fois. Le MSG est préparé en ajoutant une solution
24
d'hydroxyde de sodium à l'acide l-glutamique cristallin suivi d'une recristallisation (Schultz et al,
2007).
25
V.2.2. Les acides organiques.
1. Introduction.
Les acides organiques sont des molécules organiques ayant des groupements acides (COOH)
dans leur squelette carboné. La plupart des acides organiques ont une application agroalimentaire, et
servent surtout comme agents de conservation, aromatisant, acidulant et antioxydant. Parmi les
principaux acides organiques utiles à l’homme on trouve : l’acide citrique, l’acide acétique l’acide
lactique et l’acide propionique (Sauer et al, 2008).
Dans la suite du cours, on discutera l’exemple de la production industrielle de l’acide

citrique.
2. Définition et utilisation de l’acide citrique.

L'acide citrique, ou le citrate, est un acide organique, présent en abondance dans le citron, d'où
son nom. Il est largement utilisé dans l'industrie alimentaire, sous forme d’un additif alimentaire
(numéro E330), en tant qu'agent acidulant et aromatisant dans les boissons, les confiseries, les
bonbons acidulés et autres aliments. L’acide citrique peut avoir d’autres applications non
alimentaires, surtout médicales et pharmaceutiques (Max et al, 2010).
3. Structure chimique de l’acide citrique.

C’est un acide tricarboxylique (possédant trois groupes fonctionnels carboxyles : trois COOH),
plus un groupe hydroxyle (OH) (Menzel et al, 2013):
4. Les microorganismes industriels producteurs de l’acide citrique.
De nombreux microorganismes, peuvent être utilisés pour produire l’acide citrique, notamment:
 Des bactéries : Bacillus licheniformis et Bacillus subtilis (Xu et al, 2005).

 Des moisissures : Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, et
Penicillium restrictum (Show et al, 2015).
 Des levures : Candida lipolytica, Candida intermedia, et Saccharomyces cerevisiae
(Yalcin et al, 2010).
26
Cependant, la production industrielle mondiale est assurée par la moisissure Aspergillus niger,
en raison de sa facilité de manipulation, et de sa capacité à fermenter une variété des substrats bon
marché, ainsi qu’à leurs rendements élevés de production de l’acide citrique (Papagianni, 2007).
5. Biosynthèse naturelle de l’acide citrique.

L’acide citrique est un intermédiaire métabolique de cycle de Krebs, issue de la condensation
du résidu acétyle (2 carbones) de l’acétylel-CoA sur l’oxaloacétate (quatre carbones) pour former le
citrate (six carbones), avec libération de CoA, la réaction est catalysée par l’enzyme citrate
synthase (Figure 14) (Szczodrak, 1981):
Figure 14 : Réaction de la formation de l’acide citrique (Szczodrak, 1981).
6. Aspect biochimique de la biosynthèse industrielle de l’acide citrique.

L’acide citrique est un intermédiaire métabolite de cycle du Krebs, une fois formé il est
immédiatement converti en cis-aconitate, par l’enzyme aconitase (Figure 15) (Degu et al, 2011) :
Figure 15 : Cycle du Krebs (Degu et al, 2011).
27
En industrie, afin d'accumuler le citrate, la réaction de conversion du citrate en cis-aconitate,

doit être bloqué. Ceci est réalisé en inhibant l'aconitase, l'enzyme qui catalyse cette réaction.
L’inhibition de cette enzyme peut se faire de plusieurs manières, dont (Ramakrishnan et al, 1955 ;
Kubicek et Röhr, 1985):
 L’élimination des ions du fer (Fe+2), en effet, l’enzyme aconitase utilise les ions de
fer comme cofacteur, donc si on élimine le fer à partir du milieu de culture industriel,
l’enzyme sera automatiquement bloquée. On peut éliminer les ions du fer par l’ajout
de certains agents chélateur de fer comme : fluorocitrate.
 La modification génétiquement des souches d’Aspergillus niger, par la provocation
des mutations au niveau du gène responsable de la biosynthèse de l’enzyme
aconitase, afin d’avoir des souches transgéniques dépourvut de cette enzyme.
7. Le milieu de culture industriel utilisé pour la production de l’acide citrique.
Le processus de la fermentation industrielle de l’acide citrique, implique la culture de la
moisissure, A. niger, en condition aérobie, dans un milieu de culture qui doit contenir :
 Une source de carbone.

La source de carbone pourrait être l'amidon, l'hydrolysat d'amidon, le jus de la canne à sucre,
le glucose, le saccharose ou la mélasse. En industrie, la source de carbone la plus utilisée c’est la
mélasse. Afin d’avoir un de bon rendement de production en acide citrique, la concentration de
sucre dans le milieu de culture doit être d'au moins 140 g / L (14%) (Ikram et al, 2004).
 Une source d'azote.

Sont généralement des sels d'ammonium, surtout, le sulfate d'ammonium, le nitrate
d’ammonium…etc, qui sont généralement fournis à des concentrations de 0,1 à 0,4 g / L
(Papagianni et al, 2005).
 Les sels minéraux.

Les sels minéraux, surtout Fe+2, doivent être débarrassés du milieu de culture, car ce dernier
exerce une inhibition de la formation d'acide citrique au-delà d'une concentration critique.
L’élimination des sels minéraux est réalisée par la chromatographie échangeuse d’ions (Choudhary
et al, 1966).
 Le pH.
Afin d’initier la croissance d’Aspergillus niger, le pH initiale de milieu de culture est
généralement compris entre 5 et 7. Ensuite, il doit être maintenu en dessous de 2, ceci à l'avantage
28
de contrôler la contamination et d’inhiber la formation d'acide oxalique et d’acide gluconique (des

produits indésirables) (Papagianni et al, 2005).
8. Les étapes de la production industrielle de l’acide citrique.

8.1. Fermentation.
La fabrication industrielle de l’acide citrique peut se faire soit par une fermentation en surface
soit par une fermentation immergée:
 Le procédé de la fermentation en surface :

Cette méthode consiste à placer le milieu de culture stérile, qui est généralement de la mélasse,
dans des plateaux peu profonds (5 à 20 cm de profondeur) en aluminium ou en acier inoxydable,
(figure 16), placé dans une enceinte stérile (figure 17) (Kılıç et al, 2002).
Les plateaux sont inoculés par pulvérisation de spores d’Aspergillus niger. Le champignon se
développe alors à la surface du milieu. Les conditions aérobies sont maintenues par l’air stérile qui
est soufflé dans la chambre de la fermentation. La température est réglée à 30 °C. Le pH descend
progressivement en dessous de 2, moment auquel la production d'acide citrique commence. La
fermentation dure environ 8 à 12 jours et atteint un rendement d'environ 1,0 kg / m3 par jour
(Darouneh et al, 2009).
Figure 16: Schéma du procédé de la fabrication de l'acide citrique par la méthode de la fermentation en
surface (Darouneh et al, 2009).
29
Figure 17: photos d’une usine de la fabrication de l’acide citrique par la fermentation en surface (Kılıç
et al, 2002).
 Le procédé de la fermentation immergée :

Plus de 80% de la production mondiale en acide citrique est produite par fermentation immergée
dans des fermenteurs de 200 à 900 m³ de volume. Les fermenteurs sont résistants à la corrosion,
généralement en acier inoxydable. (Darouneh et al, 2009). Contrairement à la fermentation en
surface, le milieu de culture stérile est ensemencé par des cellules végétatives, et non plus par des
spores de la moisissure A. niger. La culture est maintenue en agitation à la température de 30 °C et
un pH qui ne dépasse pas pH=3,5. La fermentation dure cinq à quatorze jours et atteint un
rendement d'environ 18,0 kg/ m³ par jour (Khan et al, 1990).
8.2. Précipitation, extraction et purification de l’acide citrique.

Après la fin de la fermentation, la purification de l'acide citrique commence par la séparation du
mycélium fongique, par filtration ou centrifugation, à partir du milieu de culture. La solution
obtenue, est chauffée puis mélangée avec la chaux (CaO) pour former un précipite de citrate de
calcium (Ca3(C6H5O7)2). Ceci est séparé par filtration, puis traité par l'acide sulfurique dilué pour
générer de l'acide citrique plus un précipité de sulfate de calcium (gypse). Ce dernier sera éliminé
par filtration. La solution d'acide citrique obtenue sera décolorée par le charbon actif puis évaporée
pour produire des cristaux d'acide citrique. Ces cristaux sont récupérés par centrifugation, puis
séchés et conditionnés (Vandenberghe et al, 1999).
Les étapes de la fermentation industrielle de l’acide citrique sont résumées dans la figure 18.
30
Figure 18 : Les étapes de la fabrication de l’acide citrique.
31
V.2.3. Production du biogaz par le processus de méthanisation.
1. Introduction.
La méthanisation (ou la digestion anaérobie) est le processus naturel biologique de dégradation

de la matière organique, en absence d'oxygène (condition d’anaérobiose), en biogaz. Ce dernier est
composé principalement de méthane (CH4) et de dioxyde de carbone (CO2) (Lehtomäki et al,
2006). Le processus de la méthanisation se déroule en plusieurs étapes par l’intervention de
plusieurs communautés microbiennes, dans des digesteurs anaérobies ou des méthaniseurs (Sagagi
et al, 2009).
2. L’intérêt de la méthanisation.
La méthanisation à principalement deux intérêts majeurs : économiques et environnementale
(Martin et al, 2013) :
 L’intérêt économique: le méthane (biogaz) produit, peut-être utilisé comme source

d’énergie renouvelable, ce qui peut remplacer les sources d’énergie fossile (gaz naturel
surtout), ce qui va réduire le coût d’achat du pétrole et du gaz naturel. Le méthane est
utilisé, pour la cuisson ou transformé en énergie mécanique ou en électricité.
 L’intérêt environnemental : la matière première utilisée au cours de la méthanisation
correspond généralement aux différents déchets organiques : urbains, agricole ou
industrielle, ce qui contribue à la dépollution de l’environnement.
3. Aspect biochimique et microbiologique de la méthanisation.
La méthanisation est le fruit d'un extraordinaire travail collectif et successif de nombreuses

populations de microorganismes. En effet, c'est une succession de réactions chimiques catalysées
par des enzymes produits par différents organismes vivants. La digestion anaérobie (méthanisation),
peut-être décrite en quatre phases de dégradation (Figure 19) : l’hydrolyse, l’acidogène,
l’acétogénèse et la méthanogenèse. Chaque phase fait intervenir un groupe de microorganisme
particulier (Tian et al, 2017).
32
Figure 19 : Les 4 étapes de la méthanisation (Christy et al, 2014).
3.1 L’hydrolyse.
Au cours de cette étape, les molécules organiques de haut poids moléculaire comme les
polysaccharides, les lipides, les protéines et les acides nucléiques sont hydrolysés en monomères
(monosaccharides comme le glucose, les acides gras, les acides aminés et les bases azotées). Les
bactéries impliquées dans cette étape ont un métabolisme du type anaérobie strict ou facultatif et
forment un ensemble phylogénétique hétérogène regroupant de nombreux groupes bactériens
(Tableau 2), notamment : Clostridium, Bacillus, Bacteroides, Butyrivibrio, Ruminococcus,
Pseudomonas…..etc (Cirne et al, 2007).
3.2 L’acidogènes.
Au cours de cette étape, les monomères issus de l'étape d'hydrolyse sont transformés par
fermentation en acides organique (ex : acide acétique, acide propionique, acide butyrique, acide
lactique), en alcool (ex: éthanol), et en hydrogène et dioxyde de carbone (Tableau 3). Plusieurs
genres bactériens interviennent lors de cette étape : Bacteroides, Bacillus, Pelobacter,
Acetobacterium, Enterobacteriaceae (Elefsiniotis et al, 2004).
33
Tableau 2: Les bactéries hydrolytiques de la digestion anaérobie (Cirne et al, 2007).
34
Tableau 3 : Les différentes réactions d’acidogènes (Elefsiniotis et al, 2004).
3.3 L’acétogénèse.
Dans l’étape d’acétogénèse, les intermédiaires métaboliques sont transformés en acétate,

hydrogène et gaz carbonique. Ces trois derniers vont ensuite servir de substrat aux méthanogènes
(l’étape suivante de la méthanisation). L’étape d'acétogénèse est catalysée principalement par les
bactéries homo-acétogènes, ainsi que les acétogènes productrices obligatoires d’hydrogène (qui sont
des bactéries syntrophiques) (Francioso et al, 2010).
3.3.1 Les bactéries homo-acétogènes non syntrophes.
Ces bactéries produisant exclusivement de l'acétate. Selon l’origine de l’acétate généré, les
bactéries homoacétogénes sont divisées en deux groupes (Kushkevych et al, 2019):
- Groupe 1 : ces bactéries produisent de l'acétate, à partir de la fermentation d’un substrat

carboné. Elles peuvent fermenter des oses simples tels le glucose, ou les produits issus de
l’étape d’acidogènes, en acétate. C’est le cas des: Butyribacterium spp. et Peptococcus
glycinophilus.
- Groupe 2 : ces bactéries utilisent l’hydrogène et le dioxyde de carbone pour produire de
l'acétate :
4 H2 + 2 HCO3- + H+ → CH3COOH+ 4 H2O
C’est le cas des : Acetoanaerobium noterae, Eubacterium limosum Sporomusa spp.
Thermoanaerobacter kivui
3.3.2. Les bactéries acétogènes syntrophes
Les bactéries acétogènes syntrophes, ou les acétogènes productrices obligatoires d’H2, ou en

anglais OHPA (obligate hydrogen producing bacteria), sont des bactéries qui produisent du
dihydrogène lors de la réaction de formation de l'acétate (Tableau 4). Comme : Syntrophobacter,
Syntrophomonas, Syntrophus, Syntrophococcus (Schink, 1997).
35
L’activité de ces bactéries est inhibée par un excès de H2 dans le milieu, donc l’hydrogène
générés lors de cette étape doit être immédiatement consommé. Ces bactéries exigent donc la
présence des espèces consommatrices d’H2 pour assurer le maintien faible de la pression d’ H2,
ainsi, la symbiose de ces bactéries avec les bactéries consommatrices d’ H 2, notamment les sulfato-
réductrices, les bactéries homo-acétogènes non et les méthanogènes, sont indispensables pour
garantir une bonne activité dans le digesteur (Huang et al, 2020).
Tableau 4 : Les réactions des bactéries acétogènes syntrophes (Huang et al, 2020).
3.4 La méthanogènese
Les méthanogènes sont des archées, utilisant principalement comme substrats l'acétate, le
dioxyde de carbone et l'hydrogène, pour générer le méthane. Il existe deux groupes de
méthanogènes (Lyu et al, 2018 ; Enzmann et al, 2018):
 Les méthanogènes acétoclastique : sont des méthanogènes qui utilisent l’acétate
(acétotrophes) pour produire le méthane. Deux genres d’archées utilisent cette
voie : Methanosarcina et Methanosaeta.
CH3COOH → CH4 + CO2
 Les méthanogènes hydrogénotrophes : utilisent l'hydrogène et le dioxyde de carbone pour
former le méthane. Trois organismes peuvent utiliser le monoxyde de carbone pour générer
du méthane : Methanothermobacter thermoautotrophicus, Methanosarcina barkeri et
Methanosarcina acetivorans.
CO2 + 4 H2 → CH4 + 2 H2O.
Le formiate peut aussi être utilisé comme source d'électrons par la plupart des
méthanogènes hydrogénotrophes :
4 HCOOH → CH4 + 3 CO2 + 2 H2O.
4. Purification du biogaz (méthane).
Pour son utilisation comme source d'énergie, le biogaz subit une (Ferreira et al, 2015):
36
 Élimination de particules solides et de la poussière,

 Déshydratation (pour éliminer l’eau).
 Élimination des composés soufrés (H2S),
 Élimination du CO2.
37
V.3. Les métabolites secondaires obtenus par fermentation microbienne.
V.3.1. Les antibiotiques.

1. Introduction.
Les antibiotiques sont des molécules organiques issues du métabolisme secondaires des
champignons filamenteux et des bactéries, en particulier les actinomycètes. Bien que 4000
molécules antimicrobiennes ont été isolées à partir de divers microorganismes, seulement une
cinquantaine sont utilisés comme antibiotiques pour le traitement de différentes infections. En effet,
une molécule bioactive doit remplir plusieurs critères importants pour qu’elle soit considérée
comme antibiotique : (i) : elle doit être sélective, (ii) : ne doit pas être toxique pour l'homme ou les
animaux, (iii) : coûts de production faible, (iv) possède un spectre large d’activité, (v) : un
mécanisme d’action déterminer, (vi) : une solubilité élevée, (x) : doit être stable vis-à-vis les
différents facteurs physicochimiques …ect (Davie, 2006 ; Awad et al, 2012).
Les familles d’antibiotiques les plus utilisés en médecine sont les b-lactamines, comme les
pénicillines obtenu à partir de la moisissure Penicillium glaucum, et les céphalosporines purifiées à
partir de la moisissure Cephalosporium acremonium; ainsi que les aminosides, comme la
streptomycine qui a été isolée à partir de Streptomyces griseus (Zähner et al, 2020 ; Ohnishi et al,
2008).
Depuis l’introduction de la pénicilline dans le marché mondial, les bactéries ont développé une
résistance vis-à-vis de cette molécule organique, et ce phénomène ne cesse pas de s’arrêter.
L'acquisition de cette résistance apparaît en général une dizaine d'années après l'introduction de
l'antibiotique, et elle est due à des mutations génétiques aléatoires, ou suite à des échanges de gènes
de résistance entre les bactéries (transformation génétique, transduction). La résistance aux
antibiotiques a rendu la recherche de nouvelles molécules antibiotiques une urgence mondiale (Fair
et al, 2014).
2. La classe des B-lactamines.

Cette classe de molécules renferme des antibiotiques qui contiennent un noyau β-lactame
formé par trois atomes de carbone et un d'azote dans sa structure moléculaire (Figure 20) (El
Khoury, 2019):
38
Figure 20 : Structure du noyau de B-lactamines (Suarez, C., & Gudiol, 2009).
Plus de 100 B-lactamines, principalement des pénicillines et des céphalosporines, ont été
approuvées pour l'usage humain, et elles représentent plus de la moitié des antibiotiques produits
dans le monde. Ce groupe est particulièrement utile en raison de son large spectre d’activité, contre
les différentes bactéries à Gram positives et négatives (Page, 2012).
Parmi les antibiotiques qui appartiennent à cette famille, on trouve la pénicilline. Sa

structure se caractérise par un cycle à 4 atomes bêta-lactames fusionnés avec un hétérocyclique à
cinq atomes (thiazolidine). Sur ce cycle à 5 sont liés deux groupes méthyles et un groupe carboxyle.
Le noyau B-lactamines porte une fonction amine sur laquelle se lient diverses chaines latérales par
une liaison amide (Figure 21) (Pandey, N., & Cascella, 2020):
Figure 21 : Structure de base de la pénicilline (Pandey, N., & Cascella, 2020).
Les pénicillines agissent par empêchement de la biosynthèse de la paroi bactérienne, suite à

une inhibition de l’enzyme transpeptidase, qui est une enzyme clé dans la biosynthèse de
péptidoglycan de la paroi bactérienne, et provoque ainsi la mort de la bactérie (Bayles, 2000).
La majorité des pénicillines sont désormais semi-synthétiques à l’heure actuelle, suite à la

modification chimique de la pénicilline naturelle obtenue à partir de l’espèce P. chrysogenum. Cette
modification est réalisée par substitution de groupement acyle naturel attaché sur l'acide 6-
aminopénicillanique (6-APA) par d'autres groupes, ce qui confère à la molécule des nouvelles
propriétés (Figure 22) (Parmar et al, 2000).
39
Figure 22 : Substitution de groupement acyle de l'acide 6-aminopénicillanique (6-APA) par un

nouveau radical (Parmar et al, 2000).
Les pénicillines semi-synthétiques, telles que la méthicilline, la carbénicilline et

l'ampicilline, présentent diverses améliorations par rapport à la molécule originale, notamment une
résistance à l’acidité gastrique ce qui permet une administration orale, une résistance vis-à-vis de la
pénicillinase, une activité contre certaines bactéries à Gram-négatives (Shewale et al, 1997).
3. Production industrielle de pénicilline.

L’obtention du pénicille à partir de la culture de la souche P. chrysogenum, est résumée dans la
Figure 23. Le milieu de culture utilisé pour la production industrielle de la pénicilline est formé par
(Veiter et al. 2020; Cepeda-García et al, 2014 ; Rodríguez-Sáize et al, 2005):
 Une source de carbone : qui est généralement le glucose, le lactose, le saccharose, l'éthanol
et les huiles végétales. Ces sources de carbone sont utilisés soit seules ou combinées,
comme le cas de la combinaison glucose/lactose. En effet, en premier lieu, le champignon
utilise le glucose comme source de carbone pour effectuer une bonne croissance, une fois le
glucose est épuisé, l’espèce P. chrysogenum utilise le lactose pour initier la biosynthèse de
la pénicilline.
 Une source d’azote : la source d’azote la plus utilisée c’est le Corn steep liquor.
 D’autres ingrédients peuvent aussi être ajoutés, comme l’ammoniac, des sels minéraux
peuvent également être ajoutés.
Après avoir préparé et stérilisés le milieu de culture, ceci est introduit dans des fermenteurs du
type Fed-Batch d’une capacité de (20-40) 103 litres. Le niveau d'oxygène doit être maintenu entre
25–60 mmol / L / h, et la culture doit être incubée entre 25–27 ° C avec un pH de 6,5–7,7 (Kalai et
al. 2014 ; Abbaszadeh et al. 2014).
Après 6 à 8 jours d’incubation, la culture est centrifugée, pour séparer le surnageant par rapport
à la biomasse qui sera utilisée pour l’alimentation animale après plusieurs lavages pour éliminer les
traces de la pénicilline. L’extraction de la pénicilline est effectué à partir du surnageant en utilisent
40
le solvant, acétate de pentyle, à partir du quelle la molécule de pénicilline est purifier par le charbon
actif. L’antibiotique est ensuite cristallisé par l’addition d’acétate de sodium, suivie par une
filtration, enfin, plusieurs étapes de lavages par l’éthanol sont effectuées. La pénicilline pure est
ensuite séchée, puis des nouvelles radicales peuvent être ajoutées à sa structure de base (Yadav et
al. 2018 ; Dar et al. 2015 ; Devi et al, 2009).
Figure 23 : Les étapes de la fabrication industrielle de la pénicilline (Devi et al, 2009).
41
V.3.2. Les polysaccharides d’origine microbienne

1. Introduction.
Les polysaccharides sont des polymères de sucre simple (monosaccharides), relient entre eux
par des liaisons glycosidiques. Ils sont formés par un seul type de monosaccharide
(homopolysaccharide), ou bien sont formés par plusieurs types de monosaccharides
(hétéropolysaccharide hétérogènes) (Salehizadeh et al, 2018).
Les polysaccharides industriels peuvent avoir différentes origines, comme les plants (cellulose,
pectine, gomme arabique et l’amidon) et les algues (agar-agar, alginate, carraghénine). Les
microorganismes, y compris les bactéries et les champignons, de son tour, peuvent synthétiser des
polysaccharides industriels. Selon leur localisation par rapport à la cellule productrice, on distingue
trois types de polysaccharides d’origines microbiennes (He et al, 2010 ; Nunez et al, 2013):
 Les polysaccharides intracellulaires : ces types de polysaccharides sont difficiles à extraire ;

 Les polysaccharides de la paroi : comme la chitine qui existe au niveau de la paroi des
champignons, ces types de polysaccharides sont aussi difficiles à extraire.
 Les polysaccharides extracellulaires : ces types de polysaccharides extracellulaires, ne forme
pas des liaisons covalents avec la paroi de la cellule microbienne. Ils sont appelés
généralement des exopolysaccharides (EPS), ils sont soit sécrété hors de la cellule
microbienne sous la forme de boue lâche, soit ils enrobent la cellule microbienne sous forme
d'une capsule appelée slime ou ‘‘capsular polysaccharides (CPS)’’.
Les exo-polysaccharides d’origine microbienne remplissent plusieurs fonctions physiologiques
pour le microorganisme (Porter et al, 2017 ; Dumitriu, 2004):
 Ils peuvent protéger le micro-organisme contre la dessiccation,

 Permets au microorganisme de s’échapper du système immunitaire,
 agir comme une barrière contre les virus et les agents chimiques,
 facilite la fixation du microorganisme sur les différentes surfaces,
 Sont des réserves énergétiques.
2. Les exopolysaccharide d’origine microbienne et leur application technologique.
2.1. L’Alginate.
C’est un hétéro polymère linéaire d’acide D-mannuronique, dont certaines unités sont
acétylés, et d'acide L-guluronique. La liaison se fait via β-1-4 (Figure 24). Ce polymère est
biosynthétisé par les bactéries à Gram négatives, Pseudomonas sp et Azotobacter vinlandii
(Franklin et al, 2011).
42
Figure 24: Structure chimique d’alginate (Franklin et al, 2011).
L’alginate est appliqué dans l’industrie agro-alimentaire pour leur propriété émulsifiante,
gélifiante, épaississante, et stabilisante, surtout dans les produits à base de lait (glaces, crèmes
glacées) ainsi que les pâtisseries. Il peut être utilisé aussi pour encapsuler des médicaments, sous
forme de billes d'alginates, et pour la fabrication des produits de beauté (Bregni et al, 2000).
2.2. Le curdlane
C’est un homopolymère linéaire non ramifié de D-glucose, unis par des liaisons β (1→3)
glycosidiques (Figure 25). Produit par l’espèce Alcaligenes faecalis var.myxogenes, ainsi que
certaines espèces du genre Agrobacterium. Il est utilisé comme additif alimentaire (épaississant et
stabilisant) (E424) (Jiang et al, 2013).
Figure 25: Structure chimique de curdlan (Jiang et al, 2013).
2.3. Le dextrane.
Est un homopolymère ramifié de α-D-glucose, liée par des liaisons α (1→6) glycosidiques,
avec des ramifications de types α (1→3) ou α (1→4) (Figure 26). Ce polysaccharide est synthétisé
par plusieurs microorganismes, dont Leuconostoc mesenteroides (Naessens et al, 2005).
Figure 26: Structure chimique de dextrane (Purama et al, 2009).
43
Le dextrane est produit industriellement à partir du saccharose, par l’enzyme dextranase-

sucrase. Le produit obtenu, dit «dextrane natif», possède une masse molaire moyenne élevée, par
conséquent, il ne peut pas être utilisé sous cet état. Pour cela, le « dextrane natif» subit une
hydrolyse acide douce par l’acide chlorhydrique dilué, afin d’obtenir un dextrane de faible masse
molaire moyenne, plus adaptées aux différentes applications visées, surtout les applications in vivo.
En effet, le dextrane peut être utilisée pour substituer le plasma sanguin, puisqu’il possède des effets
anti-thrombiques, et permet d’activer le flux sanguin (Robyt et al, 2008).
2.4. La gomme gellane (E418).
C’est un hétéropolyoside linéaire, constitué par des unités répétitives de tétrasaccharide

(quatre sucres), qui se compose de deux résidus de D-glucose ainsi que les résidus de L-rhamnose et
d'acide D-glucuronique (Figure 27). La gomme gellane est produite par la bactérie Sphingomonas
elodea. Elle est utilisée comme additif alimentaire, en tant que gélifiante et épaississante dans
plusieurs préparations alimentaires (Nampoothiri et al, 2003).
Figure 27: structure chimique de la gomme gellane (Nampoothiri et al, 2003).
2.5. Le pullulane.
C’est un hétéropolyoside linéaire constitué par l’union des unités le maltotriose, qui est un
triholoside de trois molécules de glucoses reliés entre eux par des liaisons osidiques de type α
(1→4). Les maltotrioses sont connectés entre eux par des liaisons osidiques du type α (1→6)
(Figure 28) (Singh et al, 2015).
Figure 28: structure chimique de pullulane (Singh et al, 2015).
44
Le pullulane est produit à partir de l'amidon par la levure Aureobasidium pullulans, la

principale utilisation commerciale du pullulane est la fabrication de films comestibles (Hamidi et
al, 2019).
2.6. La gomme xanthane.
La gomme xanthane est une hétéropolysaccharide obtenue par la fermentation aérobie des
sucres par des bactéries du genre Xanthomonas, dont Xanthomonas campestris, Xanthomonas
carotae, Xanthomonas malvacearum et Xanthomonas phaseoli. Beaucoup d’entre eux sont des
phytopathogènes (Rosalam et al, 2006).
Ces bactéries sont des petits bacilles mobiles à Gram-négatifs, aérobies stricts. L’espece X.
campestris, est utilisée pour la production commerciale de xanthane (Leela et al, 2000).
La structure de la gomme xanthane est complexe, et elle est formée par une chaine
principale d’unités de D-glucose liées en β (1→4), sur laquelle, il y a des ramifications latérales
toutes les deux unités de glucose, constitué par un trisaccharide formé par un α-D-mannose, un
acide β-D-glucuronique et un β-D-mannose terminal (Figure 29). 30 % à 40% de β-D-mannoses, de
xanthanes commercialisés, portent un groupement pyruvate chélaté entre les carbones 4 et 6, alors
que 60 à 70% de α-D-mannose est acétylé sur le carbone 6 (Sworn, 2021).
Figure 29: Structure chimique de la gomme xanthane (Sworn, 2021).
3. Exemple de la fabrication industrielle du polysaccharide : la gomme xanthane.
Environ 20 000 tonnes de xanthane sont produites chaque année. La production est
influencée par plusieurs facteurs, tels que le type de fermenteur utilisé et son mode de
fonctionnement, la composition du milieu de culture et les conditions physicochimiques de la
fermentation (Palaniraj et al, 2011).
45
La première étape consiste à la mise en culture de la bactérie, X. campestris. La culture

obtenue sera utilisée pour inoculer des fermenteurs à l’échelle pilote de 50 à 200 m3 de volume. Le
milieu de culture industrielle utilisé pour la production de la gomme xanthane, à la composition
suivante (Garcıa-Ochoa et al, 2000 ; Palaniraj et al, 2011):
 Une source de carbone : qui est ajouté à raison de 30–40 g / L, elle est généralement le D-
glucose, le saccharose ou la mélasse.
 Une source d’azote : ajouté avec un rapport, carbone/azote d'environ 10/1, pour obtenir un
rendement élevé du produit. Les principales sources d’azote utilisées sont : la caséine,
hydrolysat de soja, sels d'ammonium, la peptone, Corn steep liquor, et l’extrait de levure.
 Des traces de MgCl2.
 Une solution tampon de phosphate.
La culture est maintenue en agitation à la température entre 28 et 30 ° C, à pH=7,0. La bactérie
commence à produire le xanthane pendant la phase exponentielle de croissance, et la fermentation
est normalement terminée après 3 jours d’incubation. À la fin de la fermentation, la culture est
chauffée à 100-110 °C pendant 10 min pour tuer les bactéries et améliorer les propriétés
rhéologiques du xanthane. Ceci est suivi d'une série d'étapes de purification par filtration, puis une
précipitation dans l’isopropanol, en fin une étape de centrifugation pour obtenir la gomme xanthane.
Après séchage, le résidu est broyé de façon à obtenir une poudre de la gomme xanthane. Le
rendement minimal attendu est d’environ 25g/L à 50 g/L (Silva et al, 2009 ; Gumus et al, 2010).
46
V.3.3. Les vitamines.

1. Introduction.
Les vitamines sont des molécules organiques indispensables, en quantités infimes, au
métabolisme cellulaire d’un organisme vivant, qui est incapable de les synthétiser. Ces molécules
organiques remplissent plusieurs rôles physiologiques pour la cellule, en effet, certaine agit comme
des molécules antioxydantes, d’autres sont des cofacteurs enzymatiques, tandis que certaines
d’autres ont un rôle hormonal comme la vitamine D. On distingue deux types de vitamines, les
vitamines lipophiles, comme les vitamines D, E, K et A, et les vitamines hydrosolubles, dont les
huit vitamines du groupe B (pour béribéri, une maladie causée par une carence en vitamine B1)
(Chawla et Kvarnberg, 2014).
Parmi les vitamines hydrosolubles, la vitamine B12, qui est utilisée comme complément
alimentaire, puisqu’elle est indispensable au fonctionnement normal du cerveau et à la formation
du sang, pour cela, cette molécule est utilisée pour le traitement de l’anémie pernicieuse, ainsi
qu’elle est essentielle à la synthèse, la régulation de l'ADN, et au métabolisme des acides aminés et
des acides gras (Dziegielewska-Gesiak et al, 2019).
À l'heure actuelle, plusieurs vitamines sont produites industriellement par voie microbienne,
dont, la cobalamine (vitamine B12). Dans ce chapitre on discutera la structure, les microorganismes
producteurs ainsi que la production industrielle de la vitamine B12 (Piao et al, 2004).
2. Structure et microorganismes producteurs de la vitamine B12.

Seules les bactéries et les archées peuvent synthétiser la vitamine B12. Les bactéries
capables de synthétisées les cobalamines (vitamine B12), sont généralement isolées à partir du sol,
et appartiennent à différentes espèces, dont, Propionibacterium freudenreichii; Pseudomonas
denitrificans ; Propionibacterium shermanii, Streptomyces olivaceus (Piwowarek et al, 2018).
Point de vue structural, la vitamine B12, est une molécule organique composée d'un anneau
corrinoïde tétrapyrrolique, avec un atome de cobalt au centre, qui se lie avec des ligands axiaux
supérieurs (R) et inférieurs (R’) (Kräutler, 2005).
En fonction de la nature des ligands axiaux (supérieurs et inférieurs), la vitamine B12,

prendra ainsi différente dénomination : "cyanopseudocobalamine", "méthylpseudocobalamine",
"hydroxypseudocobalamin" ou "adénosylpseudocobalamine. En effet, le ligand axial inférieur (R’)
peut-être un groupement diméthylbenzimidazole (DMB) ou bien un groupement adénine, alors que
le ligand axial supérieur (R) peut-être soit un groupe cyano (-CN), un groupe hydroxyle (-OH), ou
un groupe méthyle (-CH3) (Figure 31) (Krishnakumar et al, 2007).
47
Figure 30 : structure de la vitamine B12 (Hazra et al, 2015).
3. Production industrielle de la vitamine B12.

En raison de leur productivité élevée en vitamine B12 et de leur croissance rapide, les
espèces, Propionibacterium shermanii, Propionibacterium freudenreichii et Pseudomonas
denitrificans, sont les plus utilisées en industrie pour la production de la vitamine B12. Cependant,
dues à la différence du mécanisme de biosynthèse de la vitamine B12, les conditions de
fermentation utilisées sont différentes pour les deux genres (Hazra et al, 2015).
Les deux espèces, Propionibacterium shermanii, Propionibacterium freudenreichii, sont des

microaérophiles, et elles sont capables de produire la vitamine B12 uniquement avec de faibles
pressions en oxygènes. Cependant, la biosynthèse du ligand axial inférieur (R’)
diméthylbenzimidazole (DMBI) est effectuée dans des conditions d’aérobiose. Par conséquent,
deux étapes sont requises. Au cours des 3 premiers jours de la fermentation, les bactéries sont
cultivées en conditions d’anaérobiose. Cela conduit à l’accumulation de l’intermédiaire,
cobinamide, qui est le précurseur de la vitamine B12 dépourvu du fragment DMBI. Dans la
deuxième phase, la culture est aérée légèrement, pendant 1 à 3 jours, ce qui permet à la bactérie
d'entreprendre la synthèse oxygénée du DMBI, et de la lier au cobamide, pour former la vitamine
B12 (Yongsmith et al, 1982).
En parallèle de la production intracellulaire de la vitamine B12, les deux espèces du genre

Propionibacterium, excrètent de l'acide propionique et l'acide acétique ce qui provoque une baisse
de pH, donc il est important de neutraliser les acides accumulés afin de maintenir la culture à pH 7
(Piwowarek et al, 2018).
À la fin de la fermentation, la culture est chauffée à 80–120 ° C pendant 10–30 min à pH

6,5–8,5 afin d'extraire la vitamine B12. Ensuite, elle est traitée avec du cyanure ou du thiocyanate,
48
pour obtenir la cyanocobalamine, qui est la forme commercialement la plus courante de la vitamine
B12, car c’est la molécule la plus stable à l'air libre et la plus facile à cristalliser, et donc à purifier
une fois produite par fermentation bactérienne (Hazra et al, 2015).
La vitamine B12 est précipitée par l'ajout de l'acide tannique, puis purifier avec des colonnes
d'adsorption ou échangeuses d'ions (Piwowarek et al, 2018).
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Cours de Microbiologie industrielle

Presentation · June 2022

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Destiné aux étudiants de 3eme année licence

Année universitaire 2020/2021

La présente polycopie de microbiologie industrielle s’adresse aux étudiants de

Figure 1 : Les étapes de l’amélioration génétiques des souches industrielles…… 7

Tableau 1 : Quelques exemples de l’application des microorganismes en 4

Suite à la découverte des microorganismes, ainsi qu’aux connaissances et des

De nombreux microorganismes sont utilisés en microbiologie industrielle ; ceux-ci incluent

I. Les domaines d’activité de la microbiologie industrielle et intérêt de l’utilisation des

2. Intérêt de l’utilisation des microorganismes en industrie:

 Leur culture facile ;

4. Les domaines d’activité de la microbiologie industrielle.

 Domaine agroalimentaire : plusieurs produits alimentaires sont issus de la fermentation

Le Tableau 1 : quelques exemples de l’application des microorganismes en industrie

Microorganismes Le produit de la fermentation L’application

Leuconostoc mesenteroides Dextran Stabilisant alimentaire

Gluconobacter suboxydans Sorbose Production acide ascorbique

Recombinant d’E. coli Insuline Médecine humaine

II. Les microorganismes industriels : isolement, sélection et amélioration des souches.

2.2 Sélection des microorganismes industriels.

La plupart des procédés de mutagenèse ou de recombinaison in vitro suivent un schéma de base

Une mutagenèse aléatoire ou la recombinaison génétique, aboutit à une population hétérogène

● Si l’activité désirée de l’enzyme d’intérêt est rendue essentielle à la survie de la cellule

milieu de réaction, de suivre la turbidité de la solution ou encore de calculer les changements

- Mn2+ est utilisé à la place du Mg2+ comme cofacteur

Figure 2 : Les étapes du mutagène aléatoire.

3.2 Le brassage génétique.

Figure 3 : La méthode de brassage génétique.

III. Les milieux de cultures industriels.

 Substrat de bon marché (peu coûteux).

3.3. Les sels minéraux.

IV. Les fermenteurs ou les bioréacteurs industriels.

Figure 4: Schéma d’un fermenteur.

Les bioréacteurs sont classés en fonction de leur volume maximal:

Figure 5 : Fermenteur de type Batch (discontinu) (Carmaux, 2008).

La concentration en biomasse augmente selon la courbe de croissance microbienne. Au même

Figure 7 : Fermenteur de type Fed Batch (Evgenios et al, 2020).

Figure 8: Fermenteur de type Fed Batch (Evgenios et al, 2020).

Figure 9 : Un bioréacteur continu du type turbidostat (Lee et al, 2011).

3. Processus de mise à l’échelle (ou extrapolation) : scale up.

Figure 10 : Processus de scale up (Levin, 2001).

V. Les produits de la fermentation industrielle.

V.1. Les Protéines d'Origine Unicellulaire (P.O.U).

On appelle "Protéines d'Origine Unicellulaire" (P.O.U), ou en anglais Single Cell

2. La raison du besoin mondial des protéines d’origine unicellulaire.

3. Les microorganismes utilisés pour la production des P.O.U.

4. Critère de choix de microorganisme pour la production de P.O.U.

 La production des P.O.U est indépendante des variations climatiques.

 Ils peuvent produire des toxines ou autres métabolites nuisibles.

V.2. Les métabolites primaires obtenus par fermentation microbienne.

V.2.1. Les acides aminées.

De nombreux micro-organismes peuvent synthétiser des acides aminés à partir de composés

Dans la suite du cours, on discutera l’exemple de la production industrielle de l’acide

2. Exemple de la fabrication industrielle de l’acide glutamique.

2.1. Les principales souches microbiennes utilisées.

produit final s'accumule et atteint une concentration finale désirable, la production

+ CoA-SH + NAD+ → NADH + H+ + CO2 +

Figure 11: Réaction de conversion de α-cétoglutarate au succinyl-CoA (Ikeda, 2013).

En effet, la production de l’acide glutamique est catalysée par l’enzyme glutamate

Figure 12: Réaction de la formation de l’acide L-glutamique (Ertan, 1992).