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Utilisations Des Actéries Lactiques Pour La Fabrication D'un Yaourt À Partir D'un Lait de Brebis
Utilisations Des Actéries Lactiques Pour La Fabrication D'un Yaourt À Partir D'un Lait de Brebis
EN
Microbiologie Alimentaire et Industrielle
Thème
2010 - 2011
12 isolats de bactéries lactiques ont été isolées et identifiées en se basant sur leur
caractéristiques physiologiques et biochimique à partir de 05 échontillons de lait cru de vache
collectés de différente région à savoir.
Parmi les isolats, 07 appartenaient au genre Streptococcus soit un taux de 58,33% et 05 au
genre Lactobacillus soit un taux de 41,67% .Etant donnée que notre étude porte sur les
espèces impliquées dans la fabrication de yaourt,les résultats d’isolement et les tests
d’identification ont ciblé les deux souches constituant le levain mixte à savoir Lactobacillus
bulgaricus et Streptococcus thermophilus .
Les souches bactériennes ont été identifiées en se basant sur leur profil macroscopique
et microscopique ainsi que par le système Api50.
Ces souches présentent des propriétés technologiques variables, à savoir un bon
pouvoir acidifiant, par la production d’acide lactique, une activité protéolytique et une
résistance aux inhibiteurs comme les antibiotiques.
L’acidité exprimée en degré dornic °D après24/h de fermentation était de l’ordre de
(79°D et 90°D) chez les espèces Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus
respectivement.
L’activité protéolytique chez les souches lactiques est importante, évaluée entre
8à11mm chez les Streptococcus thermophilus et 15à22 mm pour les Lactobacillus
bulgaricus.
Le test de l’antibioresistance des souches permet de signaler généralement leurs
sensibilités apparentes aux différents antibiotiques utilisés.
L’activité antagoniste des souches lactiques spécifiques du yaourt a révélé que ces
souches ont un pouvoir d’inhibition vis-à-vis de St. Aureus et Salmonella sp.
Les propriétés technologiques de B. animalis sont déterminées par son aptitude à
fermenter le lait de brebis et le lait écrémé en culture pure et en culture mixte en association
avec Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus.
L’évolution des valeurs de pH dans le lait de brebis et le lait écrémé enrichi après 24
heures est caractérisée par une baisse de pH atteignant les valeurs 4.7 et 4.9 dans le lait
écrémé enrichi et le lait de brebis respectivement. Inversement, les teneurs en acidité Dornic
augmentent et atteignent 72 °D après 24 heures de fermentation dans le lait écrémé enrichi,
alors que dans le lait de brebis, la teneur atteinte en fin de fermentation est de 69 °D.
La survie de Bifidobacterium animalis dans les produits fermentés en culture mixte,
associée avec Lb. delbrueckii subsp bulgaricus et S.thermophilus(Strp) dans le lait
reconstitué écrémé et le lait de brebis stocké à 6°C pendant 21jours (0-4h) durée de
fermentation et 7-21jours durée de post-acidification) s’est révélée beaucoup mieux en culture
mixte qu’en culture pure dans le lait fermenté de brebis.
Mots clé : Lait (vache, brebis), yaourt, bactéries lactiques, Bifidobacterium, culture mixte,
fermentation, viabilité.
12 strains of lactic bacteria were isolated and indetified on the basis of their
physiological and biochemical caracteristics from 5 samples of raw cow’s milk of different
regions.
07 isolates belong to Streptococcus (58.33%) and 05 were Lactobacillus (41.67%).
Since this study focuses on the species involved in the manufacture of yogurt, results of
isolation and identification tests were therefore, targeted both Lactobacillus bulgaricus and
Streptococcus thermophilus.
Acidity after 24h of fermentation, expressed in dornic degre (°D), was 79°D and 90°D
with Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus respectively. However, their
bioresistance tests enable to have an idea about the sensibility to the studied antibiotics.
It was noticed that this two strain have an inhibitory activity towards St. Aureus and
Salmonella sp.
Technological properties of B. animalis were measured by their ability to ferment sheep milk
in both pure and mixed culture combination with Lactobacillus bulgaricus and
Streptococcus thermophilus.
Changes in pH values in both sheep milk and skimmed milk enriched after 24 hours were
characterized by a decrease to 4.5 and 4.8 respectively. While Dornic acidity levels
were increased to 57 ° D after 24 hours of fermentation in skimmed milk enriched, whereas in
the sheep milk,t reached at the end of fermentation 69 ° D.
Strptococcus 07 12
.)%41,67 Lactobacillus 05 % 58,33
Lactobacillus Streptococcus
Streptococcus L’API Système
bulgaricus Lactobacillus thermophilus
24
bulgaricus Lactobacillus thermophilus Streptococcus (D°90 – D°79
11 8 PH
B. animalis
21 °6
Bifidobacterium
Remerciements
Initialement, ce projet n’aurait pas été réaliser sans la bénédiction du bon dieux qui m’a
permis de m’instruire et qui à récompensé mes prière.
Je dédie ce travail:
A celui qui m’a indiqué la Bonne voie en me rappelant que la volante fait toujours les
grands hommes.
A mon père
A ma mère
A mes chère grands parant pour leur prières que dieux leur présente une bonne sante et une
longue vie.
A mon époux et mes deux filles NOUR et ZOULIKHA POUR leur engagement, les divers
sacrifices et leur soutien.
A mes frère et sœurs pour leur disponibilité, vous avez toujours su être présents dans les
meilleurs moments comme dans les pires.
A mes amis qui m’ont soutenus et m’encouragée dans les pires moments surtout :
C° : Dégré Celsius
D° : Dégré dornic
Mg : milligramme
T : temps
Mn: minute
h: heure
p: poids
Lab: lactic acid bacteria
FIL: fédération international du lait
UFC : unité formant colonies
Strp: Streptococcus theromphilus
Lb: Lactobacilus delbrueckii ssp bulgaricus
PH: potentiel d’hydrogène
ml : millilitre
Introduction Générale
En Algérie, une quantité considérable du lait de transformation est récoltée, sert à la
fabrication de produits laitiers, comme les fromages, les yaourts et laits fermentés, mais une
meilleure connaissance des bactéries lactiques permettrait de créer ces produits.
C’est bien connu, les Algérien en général, comme tout d’ailleurs aux quatre coins du
monde, sont des grands consommateurs ; mais peu d’entre eux ont conscience de la richesse
qui peut apporter ces produits laitiers fermentés et dérives ; ce sont des aliments très riches en
principaux composants (glucides, protéines et lipides) essentiels en alimentation humaine.
Les bactéries lactiques qui sont au cœur de se résultat, sont largement impliquées dans
la fabrication de produits laitiers fermentés, tel que le yaourt, qui est obtenu par l’action des
deux bactéries spécifiques à savoir : Streptococcus termophilus et Lactobacillus bulgaricus
qui doivent être ensemencées simultanément et se trouver vivantes dans le produit fini, à
raison d'au moins 10 millions de bactéries par gramme, à la date limite de consommation
(Codex Stan 243-2003),et interviennent à bien des niveaux , par leur métabolisme et leur
activité enzymatique variée, elles déterminent dans une large mesure l’arôme, la saveur et la
texture des produits.
De plus, les bactéries lactiques jouent également un rôle essentiel dans la conservation
et l’innocuité de ces aliments, par la production des acides organiques et d’autres composés
antimicrobiens, comme les bactériocines qui inhibent la croissance des germes pathogènes ou
de contamination.
On sait aussi que la transformation du lactose par les ferments lactiques et l’activité de
leurs enzymes hydrolytiques améliore la digestibilité des principaux composants constitutifs
des produits.
Par tout, la fermentation du lait sous l’action des ferments lactiques explique
l’excellente réputation des laits fermentés qui en apportant les ingrédients du lait naturel, du
calcium et des protéines, des lipides, glucides, ainsi des vitamines de groupe A, B2 et B12 et
une bonne conservation,
On trouve d’autres types de laits fermentés, entre autres les bio-yoghourts qui sont des
laits fermentés à base du lait de vache ou de chèvre ou de brebis ou d’autres laits selon les
régions, fermentes par des bifidobactéries ou /et par les lactobacilles (Lb. acidophilus,
Lb.casei), souvent en association avec les ferments du yaourt qu’ils lui donnent une saveur
assez douce. Ce type de lait fermenté est dans la catégorie des produits probiotiques (Guler-
Akin et Akin ,2007).
Les probiotiques sont des microorganismes vivants, qui lorsqu’ils sont consommés en
quantités adéquates, ont un effet bénéfique sur la santé de l’hôte (Guarner et Schaafsma,
1998). En alimentation humaine, les genres microbiens les plus utilisés comme probiotiques
sont Lactobacillus, Bifidobacterium et Streptococcus (Holzapfel et al, 1998 ; Mercenier et al,
2003)
Les bifidobactéries sont des habitants naturels de la flore intestinale humaine. Ces
microorganismes sont les bactéries intestinales majeures chez les bébés nourris au lait
maternel (Rasic et Kurmann ,1983).
Les bifidobactéries sont des bactéries probiotiques exerçant différents effets bénéfiques
sur la santé de l’hôte. En effet, parmi ces effets, on note le contrôle de la flore intestinale et
l’inhibition de la croissance de nombreux pathogènes et bactéries purifiantes (Shah, 1999
;Gopal et al., 2001), la régulation du transit intestinal, l’amélioration de l’intolérance au
lactose (DeVrese et al. , 2001) et des allergies alimentaires (Isolauri et al., 2000), certaines
propriétés anti-cancérigènes (Yoon et al., 2000) et anti-diarrhéiques (Shah, 2006), ainsi
qu’une stimulation du système immunitaire (Heyman et Heuvelin, 2006).
I- Le lait :
I-1-Définition :
Le lait est le produit élaboré par les glandes mammaires des femelles de mammifères
après la naissance du jeune (FAO, 1998).
C’est le produit intégral de la traite totale et interrompue d’une femelle laitière bien
portante, bien nourrie et non surmené. Il doit être recueilli proprement et ne doit contenir de
colostrum (Hoden et coulon, 1991).
Aussi selon la définition adoptée par le 1er congrès international pour la répression des
fraudes alimentaires en 1908 (Roger Veisseyre-Grignon, 1975).Il ne doit être en outre
collecté dans de bonnes conditions hygiéniques et présenter toutes les garanties sanitaires.
(Romain et al ; 2008).
Le décret du 25 mars 1924, dans son article premier précise : la dénomination « LAIT »
sans indication de l’espèce animale de provenance était réservée au lait de vache. Tout lait
provenant d’une femelle laitière autre que la vache doit être désigné par la dénomination
« LAIT » suivie de l’indication de l’espèce animale dont il provient : « lait de chèvre »,…etc.
Aujourd’hui la réglementation européenne a aussi défini la dénomination « LAIT ». Le
règlement (C.E.E) n° 1989/87 du conseil du 2 juillet 1987 précise que ce terme « est réservé
exclusivement au produit de la sécrétion mammaire normale obtenu par une ou plusieurs
traites sans aucune addition ou soustraction ».
Le lait est un liquide opaque blanc mat, légèrement bleuté ou plus ou moins jaunâtre,
deux fois plus visqueux que l’eau, de saveur légèrement sucrée et d’odeur peu accentuée,
sécrété après parturition par glande mammaire des animaux mammifères (Marcel et al ;
2002)
L’Algérie est le premier consommateur de lait au Maghreb, avec un marché annuel
estimé à 107 milliards de litres ; dont 60% provient de l’élevage bovin, 26% de lait de brebis
et 13% de lait de chèvre. La production laitière cameline n’est pas prise en compte.
Un taux de croissance de 8% et une consommation moyenne de l’ordre de 100 à
110/habitant/an. Cette consommation augmente encore régulièrement et devrait atteindre au
moins 115 litres par habitant et par an en 2010. Le volume de la collecte a néanmoins régressé
de manières significatives (18%) pour atteindre le niveau de 107 millions de litres, soit un
taux de collecte de 10%, selon des statistiques du ministère de l’agriculture et du
développement rural.
1
Chapitre I Lait de Brebis
En effet, ce qu’il faut savoir c’est que l’industrie laitière algérienne se distingue par un
marché en croissance constante, due à une forte demande qui s’explique aussi par la
croissance démographique estimée à 1.6% par an, l’urbanisation et l’amélioration du pouvoir
d’achat du citoyen qui recourt de plus en plus à la consommation du lait. Par ailleurs, la
consommation des produits dérivés (leben, yaourt et fromage, glaces), croit aussi fortement
grâce ç la qualité des produits et à la stabilité des prix sur le marché, mais aussi la diversité de
la production. En outre, et dans le même sens, la distribution et la couverture des besoins sont
assurées par trois sources : primo le lait cru local essentiellement autoconsommé ou distribué
par le secteur informel et artisanal, secundo, le lait pasteurisé recombiné en sachet
polypropylène, base de la consommation des ménages urbains, tertio, le lait transformé et
conditionné sous emballage divers (bouteille, UHT), de longue conservation.(Le
Maghreb,18-08-2008).
Le lait peut être commercialisé en l’état frais mais le plus souvent après avoir subi des
traitements de standardisation lipidique et d’épuration microbienne pour limiter les risques
hygiéniques et assurer une plus longue conservation.
L’évolution des processus technologiques, des techniques de conservation et de
distribution a permis l’élaboration d’une large gamme de lait de consommation qui se
distingue par leur composition, leur qualité nutritionnelle et organoleptique et leur durée de
conservation.
Les laits destinés à la consommation humaine peuvent être classés actuellement en deux
catégories :
1-Lait non traité thermiquement : lait cru ou micro filtré.
2- Lait thermiquement pasteurisé ou stérilisé.
Ces laits ne subissent que des traitements physiques tels que la standardisation en matière
grasse et/ou protéines, minéraux et vitamines, l’homogénéisation pour éviter le problème de
crémage, le chauffage pour détruire tout ou partie de la flore ou la microfiltration pour réduire
la charge microbienne.
Le lait et les produits laitières pouvant contenir des micro-organismes pathogènes pour
l’homme peuvent être des agents de transmission de maladies contagieuses.
Les germes contenus dans le lait peuvent être à l’origine de toxi-infections alimentaires
en infectant l’organisme des consommateurs, le lait peut ainsi être le vecteur de
Mycobactrium tuberculosis, Brucelle abortus, Corynebacterium diphteriae, Salmonella,
Streptocoques du groupe A, ou encore des virus de la poliomyélite.
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Chapitre I Lait de Brebis
Le lait n’est cependant un aliment complet, car carencé en fer et acides aminés soufrés
(méthionines, cystéine) (Roman et al ; 2008)
La composition moyenne du lait est différenciée selon les espèces et les races des
animaux mammifères, et son état physiologiques (stade de lactation, gestation, à son état
sanitaire et à la conduite du troupeau. (Thomas et al ; 2008) (Tableau N°2)
Tableau N°2 : Composition du lait chez divers mammifères (en g/l). (FAO, 1998)
Composition moyenne du lait en g/l
Protéines Glucides Matières
Eau Extra Matière Lactose minérales
Totales caséines albumines
it sec grasse
(MS)
Lait 905 117 35 12-14 10-12 4-6 65-70 3
maternel
I-2-2-1 Le lactose :
Le lactose est le constituant majeur de la matière sèche du lait, sa concentration est
relativement constante et peu sujette aux variations saisonnières.
Le lactose a un pouvoir sucrant faible ; six fois moins élevé que celui du saccharose il
a un rôle dans l’élaboration du système nerveux, et est hydrolysé en glucose et galactose par
la lactase. (Romain et al ; 2008)
I-2-2-2 La matière grasse laitière :
La matière grasse se trouve dans le lait sous la forme d’une émulsion de petits
globules sphériques ou légèrement ovoïdes, dont le diamètre varie de 2 à 10 µm selon
l’espèce et la race (Roger Veisseyre-Grignon, 1975 ; Thomas et al ; 2008)
I-2-2-3 La matière azotée :
Les protéines 95% de l’azote du lait offrent une extrême complexité (Adrian, 1973).
La matière azoté se compose en protéine vraies 94 - 95% et azote non protéique 5 - 6 %.
Les protéines vraies, insolubles dans uns solution de l’acide trichloracétique à 12%,
elles sont composées de caséines pour 77 à 78 % et de protéines du lactosérum pour 17 à 18
% ces dernières sont des protéines solubles.
L’azote non protéique soluble dans l’acide trichloracétique peut atteindre 9/10% en
fonction du type d’alimentation de la vache, cette fraction non négligeable, au plan
technologique est composée d’urée pour environ la moitié, le reste étant petites molécules
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Chapitre I Lait de Brebis
azotées dont des acides aminés libres, des peptides, des bases organiques (François et al ;
2005)
I-2-2-4 Les minéraux :
La fraction mineur est de 7% de matière sèche, les minéraux du lait ont un rôle
important tant au plan physicochimique que technologique et nutritionnelle, ils participent à
l’organisation micellaire des caséines, ils conditionnent un certain nombre de propriétés du
lait et tout particulièrement son aptitude à l’élaboration d’une très grande diversité de textures
fromagères (Thomas et al ; 2008) (Tableau N°3).
Tableau N°3 : Composition minérale moyenne (Thomas et al ; 2008)
Lait de vache Lait de chèvre Lait de brebis Lait humain
Calcium 1200 1260 1950 320
Phosphore 920 970 1500 150
Potassium 1500 1900 1400 550
Sodium 450 380 460 200
Chlore 1100 1600 1100 450
Magnésium 110 130 180 40
Rapport Ca/p 1.3 1.3 1.3 2.1
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Chapitre I Lait de Brebis
Les bactéries présentes dans le lait caillé : le l’ben, le yaourt, les fromages
augmentent la qualité d’acide lactique du lait en lui donnant un gout aigrelet (parfois
recherché).
Cette acidification du lait frais, provoque une coagulation spontanée caillage ; le lait
ainsi caillé est souvent consommé tel quel. L’augmentation d’acidité empêche un certain
temps la prolifération d’autres bactéries nocives (Encyclopédie de L’agora, 1994)
I-3 Les produits laitiers :
Les produits dérivés exclusivement du lait concernent des produits dont la date limite de
consommation est inférieure ou égale à 30 jours (avis de 1988 du centre national de la
consommation sur l’utilisation du terme frais).
Ils sont fabriqués principalement à base de lait de vache (Malek et al ; 2001) au quel
peuvent être ajoutés d’autres ingrédients laitiers ou non (François et al ; 2005) ; ils
regroupent :
Laits de boissons : lait cru, laits traités thermiquement (lait pasteurisé conditionné et
lait de longue conservation), laits concentrés (lait concentré non sucré et lait concentré sucré)
et lait spéciaux (infantiles, supplémentés, modifiés, biologie et boissons lactées).
Laits fermentés : yaourt, crème dessert frais et les fromages frais.
Beurre.
Glaces et crèmes glacées. (Michel et al ; 2000)
II-Lait de brebis :
1- Définition :
Le lait de brebis a été toujours considéré comme un lait ayant des caractéristiques
spécifiques et, dans certains cas, comme étant un produit plus noble que les autres laits.
(Luquet, 1986)
Comme pour les autres ruminants laitiers, la production et la composition du lait des
brebis laitières sont principalement conditionnées par les facteurs génériques, le stade de
lactation, le système de traite et l’aliment. (Luquet, 1986)
Ce type de lait a des caractéristiques différentes que les autres laits, grâce à sa forte
viscosité impliquant sa richesse. Comme il présente une opacité blanche plus marquée que
celle des laits de vache et de chèvre et il est particulièrement riche en composants fromagers.
On prépare en moyenne deux fois plus de fromage avec du lait de brebis qu’avec du lait de
vache (Luquet, 1986).
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Chapitre I Lait de Brebis
La production de lait de brebis est concentrée dans les pays où la production de lait de
vache est limitée, mais elle concerne également des pays de grande tradition fromagère
comme la France (Tableau N°4). Par ses caractéristiques, le lait de brebis présente de grandes
similitudes avec le lait de chèvre ; il est donc très différent du lait humain. (Koroleva ; 1988)
Tableau N°4 : Principaux pays producteurs de lait de brebis (FAO, 1990).
Pays producteurs de lait de brebis Production laitière (milliers de tonnes)
France 1080
Turquie 893
Iran 735
Grèce 650
Italie 628
Chine 575
Monde 8470
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Chapitre I Lait de Brebis
2-2 Protéines :
Le lait de brebis est plus riche en protéines que les autres laits ; en particulier, il
contient beaucoup d’α-caséine. On trouve d’avantage de phosphore et de calcium dans la
phase colloïdale, autant dans la phase soluble que dans le lait de vache. Ces différences
impriment à ces laits des caractéristiques différentes de coagulation : le lait de brebis coagule
plus vite et donne un coagulum plus ferme que le lait de vache. C’est pourquoi il est très
utilisé en fromagerie (Chillirad et bocquier, 1993).
La richesse du lait de brebis en protéines sériques est surtout marquée par une teneur
élevée de la béta-lactoglobuline et des immunoglobulines (Tableau06). L’azote non protéique
(de 6 à 8 pour cent de l’azote total) est distribué un peu différemment de celui du lait de
vache : plus d’urée et d’acide urique et moins d’acides aminés libres.
L’apport en énergie d’un litre est lié à la teneur en lipides du lait. L’apport énergétique
du lait de brebis de 1100 Kcal/litre (FAO, 1998).
Tableau N°06 : Composition moyenne en g/litre et distribution des protéines dans le lait
de diverses espèces animales (FAO, 1998).
Protéine Vache Chèvre Brebis
α-lactabumine 1.5 (45%) 2.0 (25%) 1.3 (10%)
β-lactoglobuline 2.7 (25%) 4.4 (55%) 8.4 (67%)
Albumine sérique 0.3 (5%) 0.6 (7%) 0.6 (5%)
Immunoglobulines 0.7 (12%) 0.5 (6%) 2.3 (18%)
Protéose-peptone 0.8 (13%) 0.6 (7%)
Total des protéines solubles 6.0 (100%) 8.10 (100%) 12.6 (100%)
(100%)
Caséine α-S 12.0 (46%) / 21.0 (47%)
Caséine β 9.0 (36%) / 16.1 (36%)
Caséine Ќ 3.5 (13%) / 4.5 (10%)
Caséine γ 1.5 (6%) / 3.0 (6%)
Total des caséines (100%) 26.0 (100%) 26.0 (100%) 44.6 (100%)
8
Chapitre I Lait de Brebis
On remarque que : les taux moyens observés en lait de brebis sont un peu plus élevés
que pour les autres laits.
2-7 Le cholestérol :
Sa teneur évaluant avec la richesse en matière grasse des laits. Il est limité dans le lait
de brebis.
Les valeurs extrêmes relevées à Roquefort vont de 15 à 30 mg pour ml de lait (Leveau ;
Bouix et Deroissart, 1991).
2-8 Minéraux et oligo-éléments :
Dans le lait de brebis. On trouve d’avantage de calcium d’une grande teneur.
Le tableau 08 regroupe les données concernant ces éléments, la teneur élevée du chlore
dans le lait de chèvre (elle est à l’origine d’acides hyper-chlorémiques observées chez les
nourrissons exclusivement alimentés au lait de chèvre), ainsi que la teneur élevée en calcium
du lait de brebis.
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Chapitre I Lait de Brebis
Notes : Les valeurs exprimées sont des valeurs moyennes ou dans quelques cas des
valeurs extrêmes. Le signe / indique que les données font défaut ou sont sujettes à caution.
2-9 Vitamines :
Il convient de remarquer la richesse du lait de brebis dans presque toutes les vitamines,
par rapport au lait de vache (FAO, 1998).
Tableau N°9 : Teneurs en vitamines des laits de diverses espèces animales (mg/litre).
Vitamines Vache Chèvre Brebis
B1 0.42 0.41 0.85
B2 1.72 1.38 3.30
B6 0.48 0.60 0.75
B12 0.0045 0.0008 0.006
Acide nicotinique 0.92 3.28 4.28
Acide folique 0.053 0.006 0.006
C 18 4.20 47.0
A 0.37 0.24 0.83
β-carotènes 0.21 <0.10 0.02
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Chapitre I Lait de Brebis
3-Autres caractéristiques :
Le lait de brebis se distingue du lait de vache et de chèvre par des traits caractéristiques,
les uns sont directement observables, les autres liés à ses particularités physicochimiques. A
l’observation visuelle, il est d’une couleur blanche nacré ou porcelaine et représente une
opacité blanche plus marquée que celle des autres laits (Luquet et al ; 1985).
Propriétés organoleptiques :
Le lait de brebis est un liquide jaunâtre (très riche en crème) ; dans l’état normal ; son
gout est agréable, aromatique et douceâtre, avec une saveur caractéristique, il peut aussi
prendre un gout légèrement salé au fur et à mesure de l’avancement de la lactation du fait de
l’augmentation du taux de chlorure.
L’odeur est agréable quant il est frais et piquant après coagulation. Le lait normal
présente donc des propriétés organoleptiques propres pouvant se modifier sous l’influence
d’un certains nombre de facteurs. Les modifications de ces propriétés se font généralement
dans le sens d’une dépréciation de la qualité du lait (Boudhaim, 2002).
1- Facteurs intervenants dans la qualité du lait de brebis :
4-1 L’influence des facteurs alimentaires :
Les teneurs en nutriments des différents laits sont susceptibles de variations, liées par
exemple à la durée de la lactation ou à l’alimentation (type de fourrage utilisé) (BOCQUIR
et al ; 1995).
Variabilité des facteurs interindividuelle : L’influence propre de chacun des
paramètres de variabilité est difficile à identifier. Ce sont les facteurs raciaux, liés aux effets
de la sélection, et les facteurs alimentaires qui ont les conséquences les plus importantes sur le
lait au plan nutritionnel, technologique et économique (FAO, 1998).
4-2 L’influence des facteurs non alimentaires :
Des fluctuations notables subsistent qui sont sous la dépendance de facteurs d’ordre
génétique (race) physiologique (nombre de vêlages, époque de lactation, moment de la traite),
et zootechnique (mode de traite, fourrage) et, enfin, climatique. Le type d’aliments fournis à
la brebis, influence fortement la composition de son lait (Blanc, 1981).
D’une façon générales, il est toujours économiquement préférable de réduire le plus
possible les variations de composition qualitatives, ce qui justifie un ensemble de pratiques
(régularisation des vêlages et de l’alimentation, sélection des races, mélange des laits et
incitations économiques) (Murata et Zabik, 1977 ; Luquet et al ; 1979).
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Chapitre I Lait de Brebis
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Chapitre II Bactéries Lactiques
1. Introduction :
Depuis l’aube de l’humanité, les bactéries lactiques sont employées pour la fabrication
et la conservation des aliments.
L’essor de ces germes a commencé il y’a 65 millions d’années, il s’est accentué lorsque
l’homme est passé du statut de chasseur cueilleur à celui d’éleveur ou il a tenté de contrôler le
phénomène d caillage du lait par le biais des micro-organismes qui dégrade le lactose pour
donner l’acide lactique
Ces bactéries ubiquistes sont aptes à se développer sur différents substrats autres que le
lait, étaient donc probablement présents bien avant la naissance de l’homme et les
mammifères.
Aujourd’hui, les bactéries lactiques sont utilisées dans un grand choix de laitages
fermentés à commencer par le kéfir jusqu’au yaourt, elles ne se réduisent pas uniquement à
leur importance économique mais aussi au rôle important qu’elles jouent dans l’entretien et
l’amélioration de la santé humaine.
2. Définition :
Les bactéries lactiques sont des micro-organismes hétérogènes, selon leur morphologie,
leur structure, leur physiologie et leur nutrition. Ce sont des cellules vivantes, procaryotes et
chimio-organotrophes. (De Roissart, 1986)
Ce sont des bactéries de fermentation alimentaire, gram (+), anaérobies caractérisées par
leur faculté de synthétiser de l’ATP grâce à la fermentation lactique des glucides. (Luquet,
1986)
Les bactéries lactiques sont dépourvues de cytochromes et par conséquent inaptes à
toute respiration aérobie ou anaérobie. Ce sont des bactéries anaérobies facultatives, capables
de fermentation en aérobiose comme en anaérobiose (Leveau et Bouix, 1996)
Micro aérophiles et relativement aérotolérantes. Elles sont également mésophiles ou
thermophiles, selon que leur température optimale de croissance soit respectivement voisine
de 30°C ou 40°C. (Desmazeaud et De Roissart ; 1994)
3. Origine et Habitat :
La découverte de leur action sur le lait fut probablement accidentelle mais leur
utilisation fut perpétuée sous forme de levains. Les bactéries et autres micro-organismes
responsables de la transformation étaient évidemment inconnus des utilisateurs et la réussite
de ces opérations soumise à fluctuations et erreurs. (Stiles et Holzapfel, 1997)
13
Chapitre II Bactéries Lactiques
Grâce à leur souplesse d’adaptation physiologique, elles sont présentes dans plusieurs
milieux riches en principaux nutriments à savoir (produits laitiers, carnés de pèches et
végétaux). (Desmazeaud, 1992)
Très souvent les bactéries lactiques n’interviennent pas seules, mais associes à d’autres
fermentations lors des hydrolyses enzymatiques, voire des réactions purement chimiques
(Tableau N°10)
Mais certaines espèces semblent être adaptées à un environnement spécifique et ne
semblent guère se retrouver ailleurs que dans leur habitat naturel (Deroissart ,1986 ; Luquet,
1994 et Bourgoies, 1996).
Les espèces du genre Lactococcus, Streptocuccus, Leuconostoc se rencontrent surtout
chez les hommes, animaux, oiseaux ou dans la peau des animaux et des matières fécales.
(Hermier et al, 1992 ; Deroissart et Luquet, 1994)
Par contre les espèces du genre Pediococcus ne se rencontrent que sur les plantes.
(Lenoir et Hermier ,1992)
Par ailleurs, les espèces du genre Lactobacillus sont plus répandues dans la nature, elles
se trouvent associées aux plantes, au niveau de l’intestin des animaux et de l’homme, ou à
partir des cavités naturelles de l’homme.
(Larpent et Gourgand, 1990 ; Desmazeaud, 1992 et Deroissart, 1996).
Pour les espèces du genre Bifidobacterium, elles sont découvertes exclusivement chez
l’homme et les animaux. TABLEAU N°10.Mistouka, 1989 et Novel, 1993.
14
Chapitre II Bactéries Lactiques
Streptococcus
Sc. Thermophilus Lait chauffé 45-50°C, lait pasteurisé, yaourt et levains
artisanaux.
Leuconostoc
L.oenos Lait, produits laitiers, fruits, betteraves, choucroute.
Pediococcus vin
Lactobacillus
Lb. Delbrueckii subsp.Bulgariecus Yaourt
Lb.Casei subsp .Casei Lait
Lb. Plant arum Plante
Lb. Curvatus Lait, fromage
Lb. Brevis Ensilage
Lb. Kefir Lait fermenté, kéfir
Lb.Bravaricus Végétaux fermentés
Lb. Sanfransisco Produits de panification
15
Chapitre II Bactéries Lactiques
Ces bactéries furent et sont encore utilisées sous la forme de levains artisanaux, mais le
développement de l’industrie de transformation, en particulier de l’industrie laitière ; a
conduit à la production de ferments industriels capables d’assurer a la fois la qualité et la
constance du produit. (Stiles et Holzapfel, 1997)
Malgré leur importance économique, les bactéries lactiques n’ont pas toujours reçu
l’attention nécessaire ni de la part des microbiologistes ni de celles des industriels. Depuis
quelques années, elles deviennent un sujet d’étude privilégié de par le monde. (Stiles et
Holzapfel, 1997)
4. Propriétés générales:
Les bactéries lactiques apparaissent au microscope sous forme cocci, ou bacille à
gram(+) ; généralement immobiles, asporulés, oxydase(-), réductase (-) ou pseudo catalase(-).
Il existe chez les bactéries lactiques deux types morphologiques bien distincts, les
coques et les bacilles. Les premières de 0.50 à 1.5 m diamètre les seconds de 0.50 à 2 m
et de 1.5 à environ10 m de long.
Chez les genres Streptococcus et Lactococcus, la division cellulaire donne des sphères
ovoïdes groupées en paires ou en chainettes, dans un seul plan.
Le genre Leuconostoc présente des cellules de forme lenticulaire groupées en paires
ou en chainettes courtes.
Le genre Pediococcus donne des sphères groupées en paires ou en tétrades dans deux
plans.
Le genre Lactobacillus recouvre des espèces de morphologie plus variée, les cellules sont
des bâtonnets plus ou moins allongés, groupés en paires ou en chainettes (Desmazeaud ;
1992).
Ce sont des bactéries en général aérotolérantes, sauf que certaines espèces habitant par
exemple le tube digestif des animaux sont anaérobies strictes même en présence d’O2 ; elles
sont incapables de réaliser des phosphorylations oxydatives.
Ceci est d’ailleurs, corrélé à leur incapacité à synthétiser les cytochromes et les enzymes
à noyau hème. Ce pendant grâce à des flavoproteines oxydases ou peroxydases, elles peuvent
réaliser des oxydations limitées non phosphorililantes.
Leur capacité de biosynthèse est faible, ce qui explique leur poly auxotrophes pour
divers acides aminés, de bases nucléiques, les vitamines et des acides gras
(Eddebi, 1998).
16
Chapitre II Bactéries Lactiques
L’absence de catalase est caractéristique chez ces bactéries, mais centaines espèces
présentent une pseudo-catalase, sans hème avec manganèse dont la faible activité pourrait en
aérobiose prolonger la vie des cultures stationnaires en les protégeant de la toxicité à
l’oxygène (Bourgeois et al, 1996).
17
Chapitre II Bactéries Lactiques
(Figure 1)
COOH COOH
HO C H H C OH
CH 3 CH 3
Lévogyre L( ) Dextrogyre D()
18
Chapitre II Bactéries Lactiques
19
Chapitre II Bactéries Lactiques
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Chapitre II Bactéries Lactiques
Bactéries Lactiques
Aérobie ou anaérobie
Anaérobie Aérobie ou anaérobie
Facultatif
Facultatif
Sarcina
Figure N°2
21
Chapitre II Bactéries Lactiques
2) Entérocoques :
Les entérocoques, comme les streptocoques D, possèdent l’antigène D. la principale
différence phénotypique entre les deux genres est que, contrairement aux streptocoques, les
entérocoques se développent dans un milieu hypersalé (6.5% de NaCI). Ils constituent 10% de
la flore aérobie de l’intestin. Ils sont recherchés comme témoins d’une contamination fécale
éventuelle de l’eau et / ou des aliments (Garvie, 1986).
Ils ne sont désormais plus considérés comme des streptocoques, mais comme un
groupe à part entière.
3) Streptocoque lactiques :
Les espèces de ce genre appartiennent à la famille des streptococcaceae et se
présentent comme des cellules ovoïdes, sphériques ou quelques fois allongées. Ce sont des
bactéries homofermentaires (voie des hexoses mono phosphates). Organisée en paires ou en
chainettes, productrices d’acide lactique L (+), catalase (-) et renferment notamment les
espèces suivants : streptococcus Lactis et Streptococcus thermophilus.
Ces espèces diffèrent entre elles par la présence d’un antigène de groupe dit «
antigène de Lance Field » et leur capacité de croître à des températures extrêmes 45 !) C pour
les thermophiles, et 10°C pour les mésophiles (Jones, 1990).
Les streptococcus lactiques se composent en fait de deux groupes distinct :
Streptocoques mésophiles possédant l’antigène N d’où leur nom streptocoque du groupe N et
l’espèce Streptococuus thermophilus ne possédant pas d’antigène de Lance Field.
3-1 Streptocoques lactiques mésophile du groupe N :
3-1-1 Genre Lactococcus :
Traditionnellement, les streptocoques regroupent deux espèces (streptococcus lactis, et
streptococcus cremoris)
(Garvie et Farrow, 1982) ont proposé de rassembler sous le nom collectif Sc, lactis
trois sous espèces, Sc.lactis subsp lactis, Sc.lactis subp diacetylactis et Sc.lactis subsp
cremoris.
(Mundt, 1986) complète ce groupe en ajoutant l’espèce Sc.Raffinolactis définie par
(Garvie, 1978).
Ce sont des bactéries de forme cocoide disposées en chainettes, homo fermentaires (acide
lactique L(+)) ; commune par leur caractère non pathogène et la présence de l’antigène N de
Lance Field, absence de l’hémolyse mais parfois présentent de hémolyse, de
température de croissance optimale moyenne 20-30°C et minimale 10°C, présentent une
faible thermorésistante et de viabilité perdue après 30min à 63°C.
22
Chapitre II Bactéries Lactiques
(Scheifer et al ; 1985) se fondât sur des critères moléculaires, ont proposé de séparer
les streptocoques lactiques mésophiles du genre Streptococcus et créer le genre Lactococcus
(Tableau N°11)
Tableau n°11 : Caractéristiques distinctives des espèces de Lactococcus.
(Schleifer et al, 1985, Schleifer ,1987)
Lc.LActus Lc.LActus Lc.LActus Lc. Lc. Lc.Raffinqla
subsp. subsp subsp cariaie Planta ctis
LACTIS Cremoris Hordniale .UM
Type de Lys-D-Asp Lys-D-Asp Lys-D-Asp Lys-Ala- Lys-ser- Lys-Thr-Ala
peptidoglycane Gly-Ala Ala
Ménaquinones MK9, MK9, MK8, - -
majeures MKB MKB MKB9
Croissance à 40° +(v) - - + V -
Présence de NaCl + - - + + -
4%
Fermentation
Amygdaline V - - + (+) v
Galactose + + - + - +
Lactose + + - + - +
Maltose + + - +(v) + +
Mélibiose - - - V - +
Mélézirtose - - - - - +
Raffinose - - - - - -(v)
Ribose + - - + + +
Selicine +(v) -(v) + + + -
Sorbitol - - - - + -
Saccharose V - + V + -
Théhalose + -(v) (+) + + -
Hydrolyse de + - + + - - (v)
l’arginine
+ : croissance positive ;
- croissance négatif ;
v : croissance selon les souches;
(+) croissance faiblement positive;
+ (v) croissance positive pour la plupart des souches mais occasionnellement négative ;
- (v) : croissance négative pour la plupart des souches mais occasionnellement positive.
23
Chapitre II Bactéries Lactiques
TRE + + + V + V V V + V + V - V V - -
Streptococcus lactis + + + V + V V V + + V V - V V - -
subsp.Diocetylactis
Streptococcus lactis + + + - - - - - - - - V - V - - -
subsp cremorls
Streptococcus + + + - + V V V V + + + V + + + +
raffinolactis
Streptociccus + + - + - - - - - - - - - - - - -
thermophilus
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Chapitre II Bactéries Lactiques
L’isolement se fait soit sur gélose M17 (Terzaghi et Sandine, 1975), soit sur gélose
MSE (Mayeux et al, 1962). Ce milieu sélectif permet la recherche et le dénombrement des
Leuconostocs dans le lait, les produits laitiers et les aliments sucrés.
25
Chapitre II Bactéries Lactiques
Arginine dihydrolase - - - - -
5- Genre Lactobacillus :
Ce genre appartient à la famille des Lactobacillaceae, de forme bâtonnet ou
coccobacilles, souvent groupées en chaines, présentent une forte exigence en facteurs de
croissance, immobiles ou mobiles, asprogènes, anaérobies facultatifs, microaéophiles, ne
réduisent pas les citrates, n’hydrolisent pas la gélatine, et acidophiles (Garvie, 1984).
Les espèces de ce genre soit caractérisées par l’hétérogénéité de la composition de
l’ADN le taux de GC varie de 32 à 53%.(Kandler et Weiss, 1986)
Originellement elles ont été classées en 3 groupes par (ORLA- JENSEN, 1919)
Thermobacterium : homofermentaire et thermophile.
Streptobacterium : homofermentaire et mésophile.
Bétabactrium : hétérofermentaire, soit mésophile soit thermophile.
Les résultats de la taxonomie moléculaire, la détermination du type du péptidoglycane
(PTG), les propriétés de certains enzymes, la détermination de l’isomère de l’acide lactique
(Botazzi,1988) , la taille du génome et l’hybridation ADN-ADN, (Sriran Ganathan et al,
1985) ont permis a (Kandler et Weiss,1986) de diviser les lactobacilles en 3 groupes qui se
retrouvent sous de nouvelles définitions, les groups d’ORLA-JENSEN.
Groupe1 : (Lactobacilles homofermentaires obligatoires) :
C’est des cellules longues droites souvent en palissades, incapables de fermenter les
pentoses et le gluconate (Bottazzi, 1988), fermentent les hexoses par la voie D’EMBDER
MEYERHOF en produisant du lactate jusqu'à 85% à partir du glucose (Novel, 1993).
Les espèces les plus connues sont : Lb.lactis, Lb.bulgaricus, Lb.leichmani et peuvent
produire jusqu’à 18g/l d’acide lactique D(-)
26
Chapitre II Bactéries Lactiques
27
Chapitre II Bactéries Lactiques
6-Genre Pediococcus :
Les germes appartenant à ce genre se trouvent dans les habitats naturel se présentent
comme étant des cellules de forme sphérique en paire ou en tétrades jamais en chaines,
homofermentaires, et l’acide lactique du type DL ou L(+) est le seul produit résultant de leur
dégradation des sucres. (Novel, 1993)
C’est des bactéries exigeantes, de faible activité protéolytique et chez la plupart des
espèces leur incapacité à utiliser le lactose ne leur permettent pas d’acidifier et de coaguler le
lait (Garvie, 1986).
28
Chapitre II Bactéries Lactiques
Leur activité catabolique et leur tolérance à l’O2 sont variables, les températures de
croissance varient entre 25-40 °C, leur contenu en GC varie entre 35-44%, et sont souvent
responsables d’accidents de fabrication, notamment en brasserie (Leveau et Bouix, 1980)
La taxonomie moléculaire permet de distinguer par hybridation ADN-ADN 8espèces :
Pediococcus dextranicum,
Pediococcus halophilus,
Pediococcus acidilactici,
Pediococcus inopinatus,
Pediococcus pentosacens
Pediococcus dammosus
Pediococcus uriinacequi
Pediococcus parvulus (Dellaglio et al, 1989)
7- Bifidobacterium :
7-1 Definition :
Les Bifidobactérries ont été découvertes pour la première fois, par Tissier 1900. Ils ont
été isolés à partir de selles d’enfants nourris au lait maternel. Tissier avait alors décrit ces
organismes comme des bactéries anaérobies, Gram positif en forme de bâtonnet
Ces bactéries avaient alors reçu le nom de bacillus bifidus cormmunis. Au même
moment, en Italie, Moro découvrit des bactéries semblables qu’il a identifiées comme des
lactobacillus (Balllongue et al, 1993)
7-2 Ecologique des bifidobactéries :
Les bifidobactéries font partie de la flore prédominante de l’intestin chez les humains
et les animaux à tous les stades de vie. La composition de la flore dominante chez l’humain
change au cours des différents stades de vie. Chez un jeune enfant nourri au lait maternel, la
flore intestinale est composée de 85-99% de bifidobactéries et les principales espèces
retrouvées sont bifidobacterium infants et B.bifidum. Les entérocoques, les coliformes et les
lactobacilles représentent environ 1-15% de la flore fécale alors que les bactéroides et les
clostridies sont absents (Rasie et Kurmann, 1983).
7-3 Taxonomies :
Pendant plusieurs années, les bifidobactéries ont été classées parmi les bactéries du
genre Lactobacillus. C’est d’ailleurs sous ce nom que sont retrouvées les bifidobactènes dans
les quatre premières éditions du manuel Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.
Apres 1965, suite à l’apparition de nouvelles technologies génétiques, deux équipes
de recherche (Sebald et al, 1965, Werner et al, 1966) ont démontré, grâce au % G+C que les
29
Chapitre II Bactéries Lactiques
bifidobactéries étaient différentes des lactobacilles, des crynébactéries ainsi que des
propionibactéries.
Ces équipes ont démontré que le %G+C était de60.1% pour les bifidobactéries alors
qu’il était de67.6% pour les propionibactéries, de 54.7% pour les corynébactéris et se situait
entre 33 et 49% pour les lactobacilleses (Sebald et al, 1965 ; Werner et al, 1966)
Scardovi et Trovatelli (1965) et De Vries et Stouthamer (1967) ont découvert une
nouvelle voie de fermentation des hexoses chez les bifidobacteies, qui ne se trouve dans
aucune des espèces du genre Lactobacillus, L’enzyme principale de cette voie est une
fructose-6-phosphate phosphoketolase qui clive le fructose-6-phosphate en érythrose-4-
phosphate et en Acétyle-phosphate.
En 1970, Scardovi et al, ont commencé à appliquer intensivement le procédé
d’hybridation ADN-ADN afin d’évaluer la validité des espèces de bifidobactéries décrite et
pour identifier de nouveaux groupes de séquences ADN homologique parmi les souches
qu’ils isolaient dans des diverses niches écologiques.
A partir de 1974, le genre Bifidobacterium a été reconnu par les éditeurs 8ème édition
du Bergey’sManual et à ce moment là, le genre Bifidobacterium était composée de 11
espèces.Une autre correction à la classification a été apportée après l’introduction de
l’électrophorèse des protéines cellulaires solubles sur le gel de polycrylammide (Biavati et al
,1992).
Selon Crociani et al, (1996) les bifidobactéries sont répertoriées de 32 espèces ,12
seraient d’origine humaine ,3 proviendraient de l’abeille, 14 seraient d’origine animale à sang
chaud et 2 proviendraient des eaux usés.
En outre les espèces de Bifidobacterium ne cessent d’augmenter, l’équipe de
Crociani et al (1996) ont pu isoler une nouvelle espèce B.lactis à partir des produits laitiers.
Stackebrant et al (1997), par l’analyse de RNAr16S, ont proposé, une structure
hiérarchique rassemblant le genre Bifidobacterium avec le genre Gardnerella dans une seule
famille Bifidobacteriaceae dans l’ordre de Bifidobacteriales. De nos jours cette famille
comporte 6 genres : Aeriscardovia, Alloscardovia, bifidobacterium, Gardnerella,
Parascardovia et Scardovia (Euzéby, 2007).
Selon Euzéby (2007), le nombre d’espèces citées est de 35 provenant de diverses
origines.
30
Chapitre II Bactéries Lactiques
31
Chapitre II Bactéries Lactiques
7-5-3 le pH :
Considérées comme acidophiles, mais ne supporte pas les ph plus bas que 4 et les ph
plus élevé que 9 (Biaviti et al, 1992). A l’exception de B.animals subsp.lactis et B.animals
subsp.animals résiste à un pH =3.7 (Meile et al ,1997) .
La production maximale d’acide lactique et acétique chez les bifidobactéries exige un
ph optimal initial proche de la neutralité qui varie entre 6-7. (Collins et Hall, 1984, Scardovi,
1986).
32
Chapitre II Bactéries Lactiques
Symboles : comme dans le tableau 2 : en plus, Amy : amidon, Cel : celloboise ; glcn :
gluconate ; Stl : sorbitol
Types de PTG : A :orn(lys)-Ser au début ; B :Orn (Lys)-Ala2-3 ; C :lys (Orn)-D-Asp ;
D/Lys(Orn)-Ala2 Ser0.2-1.0 ; E : Lys-Gly ; F :Lys-Ser ; G :Lys-D-Ser-D-Glu ; H :Orn(Lys)-D-
Glu.
33
Chapitre II Bactéries Lactiques
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Chapitre II Bactéries Lactiques
(1)
Glucose Galactose 6-P Glucose
ATP ATP
Lactose(2)
6-P
ADP
Glucose6-P Tagatose 6-P ADP 6-P
Glucose
ATP NADH
Fructose 1- 6-P
Glycéraldeyde Acétyl-P
NAD+ COASH Pi
(9)
NADH
1,3 Diphosphoglycérate Acétyl-COA
NADH
ADP
COASH
+
NAD
Acé taldéhyde
3- Phosphoglycérate
ATP
NADH
2- Phosphoglycérate
Posphoénol pyruvate
(5) NAD+ Ethanol
Pyruvate
NADH
(6)
N AD+
Lactate
Figure3 : voie homofermentaire et hétérofermentaire des bactéries lactiques (LOONES, 1989 ;
NOVEL,1993).
35 Tagatose-6-phosphate kinase ; (4) Tagatose-1,6diphosphate
(1)Phospho-B-galactosidase ;(2) Tagatose-6-phosphate isomérase ;(3)
aldolase ; (5) Pyruvate kinase ; (6) Lactate déshydrogénase ;(7) Fructase1, 6diphosphate aldolase ;(8) Pentose-5-Phosphte cétolase ; (9)
Ethanol déshydrogénase
Chapitre II Bactéries Lactiques
36
Chapitre II Bactéries Lactiques
Galactose Galactose
Perméase PEP_PTS
Glycéraldényde-3-P Dihydroxyacétone- P
+
NAD NADH
Pyruvate Lactate
6
TPP
11
12
Formiate
NAD+
Acétyl-CoA
NADH
Acétyl-P
ATP Acétaldéhyde
13 NADH
9
Acétate
ADP Éthanol
NAD+
Figure4: la fermentation du galactose chez lactococcus lactis : les deux voies de
pénétration et les deux types de métabolisme. (Thomas et Crow, 1987)
Même légende que pour la figure 2 ; en addition :
(10) Galactokinase ; (11) : pyruvate formlate lyase
(12) : pyruvate déshydrogénase ; (13) acétate kinase.
37
Chapitre II Bactéries Lactiques
8-3 Lactose :
Les Streptocoques thermophiles, les Lacrtobacilles et les Leucomostoc transportent le
lactose sous forme libre par l’intermédiaire d’un système perméase, puisque la présence
systématique d’une B galactosidase a été démontrée (Desmaezaud, 1996).
Le lactose est fermenté selon deux voies à savoir (homofermentaire et hétéro
fermentaire). Par ailleurs, les espèces galactose (-) n’utilisent que la moitié glucose.
(Figure 5).
38
Chapitre II Bactéries Lactiques
LACTOSE
Polysacchride
Membrane
Cytoplasmique
Lactose Lactose-P
ADP NAD
Cytoplasme
ATP NADH
Format Format
Pyruvate
CO2 CO2
NAD
Acétyl-CoA
Acetaldehyde NADH
Diacétyl NADH
Acétoine Lactate
Acétone
2-3
Butanédiol
Membrane
Cytoplasmique
Acetaldehyde
Diacétyl Lactate
Acétoine
Acétone
2-3
Butanédiol
Figure 5 : voie d’utilisation du lactose par les ferments du yaourt (Danone, 1994)
39
Chapitre II Bactéries Lactiques
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Chapitre II Bactéries Lactiques
L’activité protéolytique globale des bactéries lactiques est considérée comme faible
comparée à celle de Bacilles ou Pseudomonas
De plus, grâce à son équipement enzymatique complexe, ils participent efficacement à la
maturation de certains produits alimentaires.
8-6- Métabolisme des lipides et des éstères / Lipolyse et estérolyse :
L’activité lipolytique des Lactocoques dans le lait serait fidèle mais pourrait contribuer
à la faveur des fromages affinés.
Cependant, les bactéries hydrolysent plus facilement les mono et diglycérides que les
triglycérides du lait. (Desmazeaud, 1992)
Les triglycérides contenant des acides gras à chaines courtes sont les plus facilement
hydrolysés, le système enzymatique intervenant dans ce processus est optimale à pH neutre et
à une température de 40-50°C selon les espèces.
Par ailleurs, lorsque l’agitation du lait est forte, l’activité lipolytique peut se produire,
mais la présence d’acide gras à forte concentration constitue un facteur d’inhibition pour les
activités acidifiantes ou protéolytique des bactéries.
(Desmazeaud, 1996)
8-7- Métabolisme de l’O2 et l’Aérobiose :
La relation des bactéries lactiques avec l’O2 est complexe et leur sensibilité à l’O2 peut
être très variable selon les souches : d’anacrobies strictes à aérotolérantes voir insensibles.
(Condon, 1987)
Dans les conditions d’aérobiose, chez la plupart des bactéries lactiques les molécules
NAD réagissent avec l’O2 pour former du peroxyde d’hydrogène H2O2 ou une molécule d’eau
grâce à des NADH : H2O2 ou NADH : H2O oxydases.
En aérobiose, les enzymes de l’O2 sont aussi candidates pour l’oxydation, cette
compétition avec l’état d’anaérobiose peut modifier le spectre ferment aire de ces bactéries.
(Condon, 1987)
9- Principales utilisations des bactéries lactiques en alimentation :
9-1 Introduction :
C’est à partir des années 1900, que le développement des industries de transformation a
conduit à la production industrielle des bactéries lactiques adaptées aux différents produits.
Ces bactéries sont des espèces déterminées et leur activité globale caractérise le ferment,
l’acidification, la protéolyse, la formation d’arome, l’obtention d’une texture…etc. (Tableau
16).Par ailleurs, ces souches recombinées naturellement sont déjà utilisées (Sanders et al,
1986) et celles modifiées par génie génétique sont actuellement en plein essor.
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Chapitre II Bactéries Lactiques
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11- Rôles probiotiques bénéfiques des bactéries lactique sur la santé humaine :
C’est vraisemblablement Eli Merchnikoff qui le premier vers 1908 a suggéré d’utiliser
les laits fermentés contenant une souche de Lactobacilles capable de vivre dans le tractus
intestinal, comme composant d’une alimentation utile à la santé humaine et pour qu’elle
puisse avoir un rôle bénéfique, il faut qu’elle garde une certaine activité, voire une viabilité
lors du transit intestinal.
11-1- Effet sur le transit et sur la flore intestinale :
La consommation du lait riche en Lactobacillus acidophilus vivant facilite le transit
intestinal, combat la constipation et stimule la muqueuse intestinale qui à son tour excite la
couche musculaire sous- jacente.
Ainsi, les laits acidifiés sont utilisés pour lutter contre les diarrhées notamment chez
les jeunes enfants, en particulier ceux qui seraient, de plus mal nourris.
L’ingestion de ferments lactiques peut rencontrer des effets d’une prolifération de
certaines espèces de souches pathogènes comme E.Coli et ceci par divers mécanismes :
production de substance (H2O2, acide lactique et acétique) directement inhibitrice d’E.Coli.
Abaissement du pH par les acides produits
Détoxication par dégradation des entérotoxines
Prévention de la synthèse d’amines toxiques
Fixation sur le tube digestif empêchant la colonisation, de germes pathogènes ou effet
barrière par compétition métabolique. Ainsi s’il n’y a pas d’attachement le Lactobacillus
bulgaricus ne s’implante pas dans le tube digestif et y suivit difficilement à cause de sa faible
tolérance aux sels biliaires (Desmazeaud, 1996).
11-2- Amélioration de l’intolérance au lactose :
Chez les adultes, les symptômes digestifs d’intolérance au lactose sont principalement
des douleurs abdominales, crampes et flatulences.
Chez les jeunes enfants, l’importance clinique est une plus grande avec des diarrhées
acides et celles contenant des sucres réducteurs.
Il a été clairement démontré que le yaourt permet l’absorption du lactose chez les sujets
déficients de lactase, il faut noter que ces effets bénéfiques disparaissent lorsque le yaourt
subit un traitement thermique.
Ceci signifie que l’action favorable n’existe que si les bactéries sont vivantes et leur
Bgalactosidase est active (Desmazeaud, 1996)
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Chapitre II Bactéries Lactiques
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Chapitre II Bactéries Lactiques
Les problèmes d’interprétation chez l’homme viennent du fait que l’alimentation couvre en
général tous les besoins calciques et qu’il devient alors difficile d’évaluer l’absorption du
calcium excédentaire.
L’incorporation du yaourt au régime alimentaire habituel (céréales) améliore
sensiblement l’efficacité alimentaire certains paramètres osseux (contenu total en cendres,
plusieurs caractères morpho métriques), mais surtout la résistance à la rupture des tibias,
indiquent un effet favorable du yaourt, sur la minéralisation osseuse. (Desmazeaud, 1996)
11-6 Influences sur la cholestérolémie :
Les probiotiques possèdent une activité anticholesterolémiante. Selon (Novel, 1993) les
acides organiques sont vraiment des agents hypocholestérolémiants et les acides
hydroxyméthyl et oratique abaissent le cholestérol sérique ; par contre l’acide urique inhibe la
synthèse du cholestérol. (Desmazeaud, 1996)
Par ailleurs, l’ingestion de Lactobacillus acidophilus diminue le taux de cholestérol dans
le sérum sanguin. (Desmazeaud, 1996)
Le rôle de ces bactéries dans l’espèce humaine n’est pas encore bien établi.
La littérature sur le rôle bénéfique de bactéries lactiques est en abondante mais parfois
contradictoires car certains rapports manquent de précision scientifique.
D’autres études préliminaires montrent que ces bactéries pourraient être utilisées dans la
prévention du colon et dans le traitement des infections urogénitales, mais ces effets sont
hypothétiques et nécessitent des recherches plus rigoureuses. (Brassart, 1997)
48
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
Introduction :
49
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
intolérants au lactose. De plus, ils présentent une bonne valeur nutritionnelle, des qualités
organoleptiques généralement très bien acceptées ainsi qu'une relative facilitée de préparation
et de distribution.
I. Différents laits fermentés
Il existe un grand nombre de laits fermentés qui diffèrent par leur matière première, leur
flore microbienne, leur technologie, leur texture, leur goût et leur durée de conservation.
Certains sont voisins, mais présentés sous des noms variés. Beaucoup d'entre eux contiennent
l'une ou les deux bactéries spécifiques du yaourt associées d'autres micro-organismes. Depuis
plusieurs années, des fabricants cherchant de nouveaux débouchés ont repris, avec l'aide de
scientifiques, l'idée émise par Metchnikoff au début du XXème siècle que la consommation des
laits fermentés peut avoir un effet favorable sur la santé et constituer une «bactériothérapie
lactique». C'est ainsi que sont apparus des produits contenant des bactéries intestinales
comme des bifidobactéries en association avec des bactéries lactiques.
On trouvera ci-après un bref résumé des technologies des principaux laits fermentés,
fabriqués depuis une époque très ancienne ou récente.
a- Lait à l'acidophile
Le lait entier ou écrémé est soumis à un traitement thermique. Selon les fabricants il est:
Soit pasteurisé à 95 °C pendant 30 secondes.
Soit chauffé pendant 1 heure à une température proche de l'ébullition.
Soit chauffé deux fois de suite pendant 1 heure à 90 °C.
Soit stérilisé sous pression à 115 °C.
Soit traité par UHT (quelques secondes à 141-145 °C).
Après refroidissement à 37 °C, il est ensemencé avec 1 à 5 % d'une culture pure de
Lactobacillus acidophilus. Ce germe est isolé de selles de nourrissons au sein ou d'excréments
de jeunes veaux. Le lait est ensuite généralement mis en bouteille et maintenu à 36-37 °C
jusqu'à ce qu'il coagule, ce qui demande de 20 à 24 heures. Il est alors mis au froid (vers 5 °C)
jusqu'à sa consommation, qui doit être rapide afin d'éviter une acidification excessive
(supérieure à 1,8 pour cent d'acide lactique) et une baisse de la teneur en bactéries vivantes.
Le produit se présente comme une crème d'odeur légère et de saveur acidulée
particulière. Dans certains pays, il est apprécié comme aliment hygiénique. Il existe un lait
fermenté préparé à l'aide de levain yaourt associé au Lactobacillus acidophilus.
50
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
51
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
52
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
53
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
Ces produits laitiers fermentés ajoutent leurs propriétés propres aux qualités
nutritionnelles du lait utilisé. En particulier, l'acidification constitue du point de vue
hygiénique un atout majeur. En effet, elle prévient la croissance de la plupart des germes
pathogènes et assure, par des moyens qui peuvent être très simples, la conservation du lait.
De très nombreuses souches et espèces de bactéries lactiques sont utilisées pour la
fabrication des laits fermentés (streptocoques et lactobacilles). Depuis peu, on utilise aussi des
bactéries d'origine intestinale telles que les bifidobactéries. Certaines levures sont aussi
utilisées, en association avec des bactéries, par exemple pour le kéfir. Par contre, les
moisissures sont rarement utilisées dans la fabrication des laits fermentés traditionnels.
Traditionnellement, et plus particulièrement depuis les travaux de Metchnikoff sur le
yaourt au début de ce siècle, les produits laitiers fermentés jouissent d'une image positive
quant à leurs relations avec la santé. Cependant, il aura fallu attendre les années 80 pour que
des faits scientifiques établissent certaines de ces propriétés. La plupart de ces travaux ont
porté sur le yaourt, produit répandu, de flore simple et bien connue, pour laquelle il a été
rapidement montré qu'elle était capable de survivre pendant son passage dans l'intestin, sans
toutefois s'y implanter. (FAO, 2002).
L'homme métabolise les deux formes, la forme D (-) plus lentement que la forme L (+).
Selon le comité ad hoc FAO/OMS de 1973, la situation est différente chez le nouveau-né:
l'immaturité du foie ne lui permettrait pas de métaboliser complètement la forme D (-),
entraînant ainsi un risque d'acidose. Pour cette raison, le comité recommande de ne pas
donner d'aliments contenant de l'acide lactique D (-) avant l'âge de trois mois.
Les autres sources énergétiques, les lipides et les protéines du lait, sont peu modifiées
par la fermentation, hormis la formation d'un coagulum. Il existe une protéolyse modérée et
les acides aminés libérés sont importants pour assurer la croissance symbiotique des bactéries
54
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
du yaourt. Il faut noter par ailleurs que, pour la fabrication du yaourt, il peut être d'usage
d'enrichir le lait en poudre de lait. C'est ainsi qu'en France, le yaourt est le plus souvent plus
riche que le lait en divers nutriments (protéines, calcium, etc., et parfois même en lactose).
D'autre part, ces produits peuvent être plus ou moins sucrés. Leur teneur en saccharose varie
alors de 7 à 15 pour cent.
La teneur vitaminique du lait de départ est modifiée par la fermentation; certaines
vitamines sont consommées par les bactéries, d'autres sont produites. Les travaux publiés à ce
jour sont souvent contradictoires. Il ressort, cependant, une augmentation importante de la
teneur en acide folique du yaourt.
Des travaux récents et précis peu nombreux tendent à montrer d'importantes différences
dans la digestion des protéines selon la technologie subie par le lait. Ainsi, selon Scanff et al.
(1990), avec le lait, il se forme rapidement un caillot de caséine dans l'estomac, celle-ci étant
évacuée lentement sous forme de peptides. Avec le yaourt, il ne se forme pas de coagulum et,
très rapidement, la caséine est évacuée sous forme dégradée et même sous forme non
dégradée. Il a été aussi montré que le temps de transit du yaourt dans l'intestin est plus long
que celui du lait. (FAO, 2002).
3. Effets sur la tolérance au lactose :
Parmi les causes d'intolérance au lait, la mieux connue est certainement celle liée au
lactose. Par défaut de lactose (ou ß-galactosidase) dans la bordure en brosse de la muqueuse
intestinale, le lactose n'est plus hydrolysé; il n'est donc plus absorbé dans l'intestin grêle et va
atteindre le colon, où il sera fermenté par la flore intestinale en donnant naissance à des gaz et
tout particulièrement à de l'hydrogène. Les symptômes de l'intolérance au lactose sont
brièvement présentés au chapitre
Le plus souvent, chez l'enfant, l'intolérance au lactose est due à un déficit en lactase
intestinale secondaire à une entéropathie. Chez l'adolescent et l'adulte, la malabsorption du
lactose est le plus souvent primaire. Une réponse à l'intolérance au lactose pourrait consister
en l'utilisation de laits délactosés. Cependant, on verra au chapitre 9 que les laits fermentés et,
en particulier, le yaourt sont susceptibles d'apporter une solution simple et peu onéreuse.
(FAO, 2002).
Un certain nombre de travaux chez l'animal montrent que l'ingestion de laits fermentés
est susceptible de modifier la flore intestinale de l'hôte, en particulier de diminuer la quantité
de germes indésirables. On dispose, par contre, de très peu d'informations sur son effet chez
55
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
l'homme. Plusieurs études depuis les années 50 indiquent que l'ingestion de lait fermenté par
Lactobacillus acidophilus est susceptible de réduire le nombre d'Escherichia coli dans les
selles qui contiennent alors considérablement plus de L.acidophilus qui, par ailleurs, fait
partie de la flore intestinale humaine. Cette propriété semble avoir été utilisée avec succès
dans le cas d'enfants souffrant de diarrhées à E. coli.
56
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
57
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
Elle est caractérisée par une activité homofermentaire, le plus souvent réduite à
quelques sucres (glucose, lactose, saccharose) et une forte sensibilité au Nacl. (Hardie, 1986)
Elle se présente sous forme sphérique en chaîne, la GC% de son ADN varie de 37 -40
%, et le pont peptidique du PTG est de type L -Tys -L- ala (Farrow et Collins, 1990)
(Tableau N°18)
6-2-Lactobacillus bulgaricus :
C'est des bactéries lactiques homofermentaires à Gram(+), thermophiles, de forme
bâtonnets avec une croissance optimum à 45°C et un optimum de température de production
d'acide variant de 43-46°C.
Elles sont thermotolérantes, avec une relative activité protéolytique, et supportent un
milieu acide (pH = 4-4,5). (Anonyme ,1998)
Leur activité acidifiante se limite sur la fermentation de galactose et glucose seulement.
(Accola, 1982)
Elles ont un rôle essentiel dans le développement des qualités organoleptiques,
hygiéniques et peut-être pro biotique des aliments et le taux de GC de son ADN est de 50%.
(Tableau N°19)
7-Habitat :
On peut les isoler du lait chauffé à 45 -50°C ou du lait pasteurisé, (Hardie ,1986), des
produits laitiers (du yaourt et du matériel de laiterie) et des levains artisanaux (Jones ,1978).
58
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
Croissance à
Croissance à
Thermorésist
ance à 63) c/
Genre Croissance Croissance Recher Productio
Production
Production
Réductase
d’extrane
Arginine
catalase
PH 9.6
streptococcu au lait de à bouillon che de n
30min
ADH
10 °c
45° c
CO2
code
PH
s sherman hypersalé citrate d’acétoine
thermophilu 3% 1% 4 6.5 % VP RM
s %
streptococcus St1 - + - + - - - - - + + - - + - Homo +
thermophilus
streptococcus St2 + + - + - - - - - - - - - + - Homo +c
thermophilus
streptococcus St3 + + - + - - - - - - - - + + - Homo -
thermophilus
streptococcus St4 + + - + - - - - - + + - - + - Homo +
thermophilus
streptococcus St5 + + - + - - + + - - + - - + - Homo +c
thermophilus
streptococcus St6 + + - + - - + + - - + - - + - Homo -
thermophilus
streptococcus St7 + + - + - - + + - - + - - + - Homo +c
thermophilus
streptococcus St8 + + - + - - - - - + + - - + - Homo +
thermophilus
streptococcus St9 + + - + - - + + - - - - - + - Homo +c
thermophilus
streptococcus St10 + - - + - + - - - - + - - + - Homo +c
thermophilus
streptococcus St11 + + - + + + - - - + + - - + - Homo +
thermophilus
streptococcus St12 + + - + - - - - - - - - - + - Homo +
thermophilus
59
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
60
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
Product
d’acétoi
Thermorési
stan ce à 63
Production
Croissance Croissance à Production Réd
Croissance
Croissance
° c /30 min
Recherche
d’extrane
de citrate
Arginine
Catalasa
à PH 9.6
à PH 5.5
ion
ne
au lait de bouillon CO2 ucta
Code
ADH
10° c
45 °c
Genre lactobacillus sherman hypersalé se
et bifidobacterium 3% 1% 4% 6.5 % VP RM
Lactobacillus Lb1 - + - + + + - - - - + + - - + Homo +
delbrueckii ssp
belbrueckii
Lactobacillus Lb2 + + - + - - + + + + + + - + - Homo +
delbrueckii ssp
belbrueckii
Lactobacillus Lb3 - + - - - - - - + + + + + +++ - Homo +-
plantarum
Lactobacillus Lb4 + - - + - - - - - - + - - + - Homo +-
delbrueckii ssp
belbrueckii
Lactobacillus Lb5 - - - + - - + + - + - - - + - Homo +-
delbrueckii ssp
lactis
Lactobacillus Lb6 + - - + + + + + - - + + + + - Homo +
helveticus
Lactobacillus Lb7 - - - + - - - - - + + + - - + Homo +
acetoleranc Groupe
II
Lactobacillus Lb8 + + - - - - + - - + + + - - - Homo -
intestinalis
+ : réaction positive c : coagulation positive ++ : production moyen de l’acétoine
- : réaction négative homo : homofermentaire +++ : production très importante de l’acétoine
61
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
1ère phase:
Caractérisée par la croissance rapide des Streptococcuus thermophilus ; la tolérance à
l’O2 et le pH du lait voisin à 6,6 favorisent le développement des Streptococcus thermophilus
utilisant des faibles quantités d'acides aminés et peptides présents dans le lait permettant
d'assurer le démarrage de leur croissance, en produisant l'acide lactique jusqu'à atteindre un
pH = 4,2 à 4,3.
2ème phase:
Le pH acide 4,2 et 4,3 et le CO2 libéré par les Streptococcus thermophilus lors de
décarboxylation de l'urée présente naturellement dans le lait stimulent la croissance des
62
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
63
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
Genre Code ARA LAC XYL DUL GAL GLYC SACC GLY RAF RHA MANI
streptococcus
thermophilus
streptococcus St1 + + + - + - -+ + + - -
thermophilus
streptococcus St2 + + + - + - + + + - +
thermophilus
streptococcus St3 - + + V + - -+ +- - - +
thermophilus
streptococcus St4 - + - - + - +- + - - +
thermophilus
streptococcus St5 - + - V + - - + - - -
thermophilus
streptococcus St6 - - + - + - +- +- - - -
thermophilus
streptococcus St7 - + - V + - + - - - +-
thermophilus
streptococcus St8 - + - - + - + - - - -
thermophilus
streptococcus St9 - + - + + - - + - - +-
thermophilus
streptococcus St10 - - + V + - +- + - - +
thermophilus
streptococcus St11 - + - - + - + + + - +-
thermophilus
streptococcus St12 + + + + + - + + - - +-
thermophilus
streptococcus St13 - + - - + - + + - - +-
thermophilus
streptococcus St14 - + - - + - + + + - +
thermophilus
streptococcus St15 - + - - + - + + - - +
thermophilus
streptococcus St16 ** + - - + - + + - - +-
thermophilus
streptococcus St17 - + - - + - + + - - +-
thermophilus
streptococcus St18 + + + - + - + + + - +
thermophilus
streptococcus St19 + + + - + - + + - - +
thermophilus
streptococcus St20 - + + - + - + + + - -
thermophilus
streptococcus St21 - + - - + - + + - - -
thermophilus
64
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
Acide lactique
S. thermophilus L. bulgaricus
Lactose
Production
Inhibitation
Stimulation
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Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
Acide aminés
+
Peptides protéine du lait
CO2
Acide
Formique
Urée du lait
Lait
66
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
9- Production de Polysaccharides :
Après croissance dans le lait, les deux souches, Streptococcus thermophilus et
Lactobacillus bulgariccus sont considérées comme responsables de la viscosité du yaourt.
Cette viscosité est attribuée - à la production d'EPS par les souches utilisées.
Le caractère visqueux développé par ces deux souches est instable et la démonstration
de leur contribution à la viscosité du produit qui n'a pas été démontrée...
Les Lactobacillus bulgaricus produisent en phase exponentielle précoce des EPS
solubles en présence de divers substrats carbonés et sont formés de fructose et de glucose
(2/1); avec des liaisons a (1/4) et à (1/6).
Par contre celui des Streptococcus thermophilus est formé de galactose, de glucose ainsi
que de mannose. (Desmazeaud ,1992)
Thréonine
CH3CHOH - CHNH2-COOH NH2CH2COOH + CH3CHO
Aldolase Glycine Acétaldéhyde
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Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
Acide aspartique
Homosérine phosphate
Thréonine
Glvcine +
Acétaldéhyde
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Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
69
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
multiplication de bactéries lactiques dans une préparation du lait, l'acide lactique coagule ou
épaissit le lait et lui confère une saveur acide plus au moins prononcée.
Les caractéristiques propres des différents laits fermentés sont dues à la variation
particulière de certains facteurs comme la composition du lait, la température d’incubation, la
flore lactique ou la flore microbienne autre que lactique.
2- Historique :
La croyance dans les vertus du lait fermenté est partagée depuis des temps
immémoriaux, des temps préhistorique.
Le yaourt est un produit de la fermentation du lait, procédé très ancien, probablement à
l'époque où l'homme a commencé à domestiquer les espèces laitières et à utiliser leurs laits.
Les bactéries lactiques du sol ou des plantes avaient dû contaminer le lait et s'y étaient
développées. De même elles avaient dû se répandre et s'installer dans les récipients à recueillir
et à conserver le lait qu'ils furent en bois puis en peau. Cette contamination accidentelle ne
permettait sûrement pas d'avoir des produits ayant des saveurs définies et stables mais elle
avait indéniablement l'avantage de prévenir le développement de la flore pathogène.
Ce produit est d'origine bulgare; mais a pris un développement considérable dans les
steppes d'Asie, dans les pays méditerranéens, en moyen orient et dans la plus part des régions
d'élevage.
De tout temps, il est reconnu pour ses pouvoirs bien faisant.
3-Définition :
Le yaourt ou yoghourt: ces deux appellations désignent un même aliment à base de
lait qui a subi des transformations grâce à l'emploi de micro organismes particuliers origine de
bactéries lactiques associées: Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus.
Selon la F.A.O et O.M.S (1977), le yaourt est un lait coagulé obtenu par la fermentation
lactique acide due à ces deux bactéries du lait pasteurisé ou concentré avec ou sans addition
de lait en poudre.
Les micros organismes du produit final doivent être viables et abondants. Les ferments
doivent être au minimum de 10 millions de germes par gramme de yaourt (Syndifrais ,1994).
Certains pays admettent qu'à la suite d'un traitement thermique destiné à améliorer la
durée de conservation, le produit ne contient plus de bactéries vivantes
Cette pratique n'est pas recommandable car elle modifie les propriétés du yaourt. (FAO
et INPH, 1998), à l'exclusion de tout autre traitement thermique, il est alors prêt à être
consommé.
70
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
71
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
72
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
Pour Kurman, la température ne doit pas être trop élevée lors de l'homogénéisation
(55-60°C) et la pression doit se situer à environ 200 atmosphères, mais maintenant on
travaille à des températures plus élevées (8590°C) avec des pressions d'homogénéisation
proche de 250 atmosphères.
L’homogénéisation peut s'effectuer pendant la montée en température avant la section
de pasteurisation mais elle peut aussi se faire après la pasteurisation; elle permettrait alors une
meilleure consistance du yaourt mais avec des risques de recontamination. (Lemoinier et al
,1989)
5-3- Pasteurisation:
Le lait enrichi va subir ensuite un traitement thermique, ce dernier a pour but:
La destruction des germes pathogènes et une grande partie de la flore banale
originelle ou simplement indésirable" pour la conservation du produit.
Il permet aussi la destruction éventuelle de certaines substances inhibitrices
naturelles en favorisant aussi la croissance de la flore lactique spécifique.
Le troisième effet est de favoriser la précipitation d'une fraction des albumines, il
dénature environ 80 % des protéines solubles du lait, ce qui entraînera une meilleure rétention
d'eau et une amélioration de la consistance.
Grâce à cette dénaturation, la capacité à fixer de l'eau est multipliée par un facteur de
trois, en comparaison de celle du lait non chauffé .En outre, les protéines dénaturés se fixent à
.la surface des micelles de caséine. Ces deux phénomènes "ont une répercussion directe sur
les propriétés rhéologiques du gel formé après l’acidification. L’effet de dénaturation
recherché est obtenu par un chambrage du lait avant son refroidissement. La plus couramment
utilisé est une pasteurisation à 90-95°C (avec chambrage de 3 à 5 minutes). Une
pasteurisation trop poussée (plus de 5 minutes à 92°C) aura un effet néfaste sur le produit.
(Luquet, 1990)
Cependant, la pasteurisation peut être remplacée par une stérilisation soit par injection
directe de vapeur soit par un chauffage indirect (quelques secondes à 135 - 140°C) .Dans ce
cas, on constate une viscosité plus faible dans le produit.
5-4- Refroidissement :
Généralement, l'abaissement de la température à un degré qui avoisine les 45°C donnent
un corps doux et uniforme.
5-5- Ensemencement:
L'ensemencement c'est l'inoculation des deux germes spécifiques du yaourt:
73
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
74
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
Pour cela la température des produits est abaissée considérablement; c'est la phase dite
de. Refroidissement ou Arrêt de fermentation.
Elle est conduite différemment selon le type de produits : les yaourts traditionnels à la
sortie de l'étuve sont mis à refroidir dans des chambres froides fortement ventilées ou comme
c'est le cas de plus en plus fréquemment, passent dans des tunnels de refroidissement avant
d'être stockés en chambre froide à + 2 à +4°C.
Pour les yaourts brassés, le refroidissement est effectué par passage dans des
échangeurs-refroidisseurs à plaques tubulaires ou même à surface raclée car en tank le
refroidissement serait très lent et conduirait à une sur acidification du milieu.
5-9- Conservation:
Au cours de sa commercialisation, le yaourt est conservé au froid à une température. Ne
devant pas dépasser 8 Cependant 24 jours au plus. Dans ces conditions, les bactéries du
yaourt ne se multiplient pas mais conservent néanmoins une activité métabolique.
C'est ainsi que l'acide lactique est encore produit à partir du lactose, ce qui abaisse
légèrement le pH augmente la saveur acide du yaourt.
Les enzymes Protéolytiques continuent à hydrolyser les protéines et peuvent ainsi
entraîner une diminution de la viscosité ou de la rigidité du gel et surtout faire apparaître des
peptides à saveur amère. (Hermier et Accolas, 1990)
(Figure N°9)
75
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
Multiplication 1 er stade
Traitement thermique
Homogénéisation
Multiplication
2ème stade
Refroidissement
Levains Ensemencement
Refroidissement
Refroidissement
Conditionnement
Stockage réfrigéré
Stockage réfrigéré
76
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
Goût plat, absence d'arôme Mauvaise activité des levains (déséquilibre de la flore, trop de
streptocoques, incubation trop courte ou à trop basse température)
Matières sèches trop faibles
77
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
Nature Causes
Décantation, synérèse Sur acidification ou post acidification (mauvaise conduite de la
Fermentation : température trop élevée pendant le stockage,
Conservation trop longue)
Refroidissement trop faible. Agitation trop poussée et admis-
sion exagérée d'air (pour les yaourts brassés).
Décantation, synérèse Mauvaise adjonction des fruits
Agitation des yaourts (yaourts fermes)
Teneur en matière sèche trop faible
78
Chapitre III Laits Fermentés et Yaourts
79
. Matériels et méthodes
Matériels et méthodes
1. Lieu de l’étude
Cette étude a été menée au niveau du service d’hygiène alimentaire du laboratoire
régional vétérinaire de la wilaya de Mostaganem et le laboratoire de microbiologie
alimentaire et industrielle de l’université d’Oran.
2. Origine des souches
Le lait cru constitue un habitat naturel pour les bactéries lactiques, il représente une
source de nouvelles souches de bactéries lactiques (De Roissart, 2000)
Les souches de bactéries lactiques utilisées dans cette étude ont été isolées à partir du
lait cru de vache de race locale collecté dans une ferme privée de la région de la wilaya de
Mostaganem.
Les souches lactiques de référence d’un levain commercial isolées d’un yaourt de
marque Danone ont été utilisées.
Les souches pathogènes utilisées Staphylococcus aureus et Salmonella sp ont été
procurés au niveau du laboratoire de microbiologie de l’hôpital de Mostaganem.
3. Echantillonnage
Les prélèvements ont été réalisés dans des conditions d’asepsie rigoureuses en tenant
compte des recommandations suivantes :
Désinfecter les mains et les pis de la mamelle de l’animal avec l’eau javellisée puis
sécher avec une lingette stérile.
Jet des premières gouttes du lait.
Mettre le lait prélevé dans des flacons en verre stérile de 100 ml.
Mettre les échantillons dans une glacière (+4°C), puis transportés immédiatement au
laboratoire pour analyse microbiologique.
4. Milieux de culture
Selon les exigences nutritionnelles des bactéries lactiques qui varient d’une souche à
une autre, deux milieux sélectifs sous forme liquides ou solides ont été utilisés pour
l’isolement des Lactobacilles et des Streptocoques (annexe). Il s’agit de :
MRS (De Man, Rogosa et Sharpe, 1960), pour la culture des Lactobacilles
M17 (Terzaghi et sandine, 1975), pour la culture des Streptocoques.
Les milieux sont stérilisés par autoclavage à 120°C pendant 15-20min.
80
. Matériels et méthodes
5. Méthodes d’isolement
Les échantillons de lait de vache cru sont incubés à 45°C jusqu'à coagulation. Cet
enrichissement sert à favoriser le développement de la flore lactique endogène thermophile.
Une fois le lait est coagulé, on homogénéise le coagulum par l’utilisation d’un agitateur
« vortex » ou par simple agitation puis on réalise les dilutions.
5-1 Les dilutions
Des dilutions décimales de 10-1 jusqu’à 10-6 sont réalisées séparément à partir de 1 ml
pour chaque échantillon dans une solution Ringer stérile (à raison de 9ml/tube)
5-2 Ensemencement et mise en culture
A partir des dilutions de 10-4 à 10-6 nous avons procédé à l’isolement des différentes
bactéries lactiques comme suit :
Après homogénéisation, l’ensemencement consiste à déposer ou à porter
aseptiquement 0.1ml de chaque dilution en profondeur dans les milieux spécifiques de
dénombrement (MRS, M17). Les boites de pétri sont ensuite incubées dans une jarre
d’anaérobiose à 45°C pendant 24h à 48h voir jusqu’à 72 h pour l’isolement des Lactobacilles.
Le choix de la température d’incubation est dicté par le fait que les deux espèces recherchées
Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus sont thermophiles ce qui constitue un
des premiers critères de sélection.
Tableau N°21 : Milieux utilisés et conditions d’incubation pour l’isolement des
bactéries lactiques
Micro- Milieux T° optimale C° Durée Condition
organismes d’incubation (h) d’incubation
Lactobacillus MRS 45°C 24 - 72h aéro-anaerobie
facultatif
Streptococcus M17 45°C 24 - 48h aéro-anaerobie
facultatif
81
. Matériels et méthodes
10-1
10-7 10-8
10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
1ml
1ml 1ml 1ml 1ml
1ml 1m 1ml 1ml
l
Echantillon
solution
9 ml d’eau physiologique dans chaque tube
mère
82
. Matériels et méthodes
5.3. Purification
Les isolats de souches lactiques sélectionnées selon leur Gram (+) et catalase (-) ont fait
l’objet de repiquages successifs et alternés sur milieux liquides (bouillon : MRS, M17) et
solides (gélose MRS et M17) jusqu'à l’obtention de cultures homogènes, ce qui permettra
d’assurer leur pureté (Sharpe, 1979).
6. Conservation des souches
a) De courte durée : elle est réalisée sur milieu MRS solide incliné, préalablement
ensemencé et incubé à 37°C pendant 48h. Les souches sont ainsi conservées à 4°C pour une
durée de quelques semaines (max 4sem).
D’une façon générale les bactéries en phase de croissance sont conservées quelques
semaines à 4°C sur gélose inclinée (Accolas et al. 1977).
b) Conservation de longue durée : A partir de cultures jeunes de 24 à 48 h sur milieux
liquides (MRS et M17), on ajoute du lait écrémé stérile à un taux de 70% et 15 % de glycérol.
Les cultures sont ensuite conservées à -20°C pour une période de quelques mois (Mathot et
al., 1994).
7. Pré-identification des isolats de bactéries lactiques
L’identification des bactéries lactiques au stade genre est réalisée en deux étapes :
- La première partie consiste à tester tous les isolats par la coloration de Gram et la
production de catalase
- La deuxième est basée sur l’étude morphologique (macroscopique et microscopique)
et le type de fermentation.
7-1 Etude morphologique
a) Examen macroscopique
Il s’agit d’une observation à l’œil nu ou par la loupe binoculaire les colonies
présumées de Streptocoques et de Lactobacilles afin de déterminer l’aspect, la taille, la
forme, le contour et la couleur des colonies des cultures bactériennes obtenues sur
milieu solide.
b) Examen microscopique
c) Coloration de Gram
Il permet de décrire la forme des cellules, leur mode d’association tout en vérifiant
la pureté des isolats après préparation d’un frottis coloré selon les étapes décrites
de la coloration de Gram (annexe).
83
. Matériels et méthodes
Les cellules qui retiennent le violet de gentiane après traitement par le lugol et
l’alcool sont dites Gram (+) et celles qui prennent la coloration rose de la fuchsine sont dites
à Gram (-).
Toutes les bactéries lactiques sont à Gram positif.
d) Recherche de la catalase
La catalase est une enzyme respiratoire produite par les bactéries aérobies strictes ou
facultatives. Cette enzyme dégrade le peroxyde d’hydrogène (H2O2) en eau (H2O) et en
oxygène (O2) selon la réaction :
2 H 2 O2 O2 2 H 2 O
Pour mettre en évidence la production de cette enzyme, on prélève une colonie bien
isolée, qu’on étale avec l’anse sur une lame et on ajoute une goutte d’eau oxygénée à 10%. La
présence de catalase se manifeste par une effervescence qui indique une formation de bulles
d’air, dues à la dégradation de l’eau oxygénée (Guiraud, 1998 ; Prescott, 2003).
Les bactéries lactiques sont catalase négatives.
7.2 Tests d’identification, études physiologiques et biochimiques
Nous nous sommes intéressés dans le cadre de cette étude à l’identification
particulière des bactéries lactiques impliquées dans la fabrication du yaourt à savoir
Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus selon les tests suivants :
a) Test de croissance à différentes températures
Ce test est important car il permet de confirmer l’appartenance des souches isolées aux
bactéries lactiques thermophiles.
Après inoculation en milieux liquides (M17, MRS) une culture pure des isolats à tester,
les tubes sont incubés à 15°C pendant 07 jours et à 45°C et 50°C pendant 24 à 48h. La
croissance se traduit par l’apparition de troubles dans les milieux (Leveau et Bouix, 1980 ;
Guiraud, 1998).
b) Croissance en bouillon hyper salé (Na Cl)
Tester la croissance en présence de différentes concentrations de chlorure de sodium
donne des renseignements précieux pour l’identification.
En général, les bactéries lactiques ne poussent pas dans des bouillons hypersalés, pour le
confirmer, la croissance des souches ensemencées dans les milieux MRS ou M17 additionnés
de NaCl à différentes concentrations a été observé après 2 à 3 jours d’incubation à 37°C.
84
. Matériels et méthodes
Les isolats ont été testé aux concentrations de 4% et 6.5% de Na Cl (Shlufer et al.,
1985 ; Samelis et al., 1994 ; Carr et al., 2002).
c) Croissance à différentes valeurs de pH
L’habilité à croitre sur les milieux MRS et M17 en bouillon à différentes valeurs de pH
à été observée pendant 2 à 3 jours d’incubation à 37°C. Les isolats ont été testés à pH 5.5 et
9.6. Le pH fortement basique permet de différentier S.thermophilus des entérocoques qui
poussent en milieu alcalin (Carr et al., 2002).
d) Croissance dans le lait de Sherman
On teste l’aptitude des bactéries à pousser en présence d’un inhibiteur tel que
le bleu de méthylène à 0.1% et 0.3% ; pour obtenir un lait à 0.1% de bleu de
méthylène, on ajoute 1ml de bleu de méthylène à 1% stérilisé pendant 20min à 120°C
à 9ml de lait écrémé stérilisé en tube. Le lait à 0.3% de bleu de méthylène est obtenu
en ajoutant 1ml de bleu de méthylène à 3% stérilisé à 9ml de lait écrémé stérilisé. Ce
test est surtout intéressant pour différencier les Streptocoques des Lactocoques. Les
Streptocoques fécaux se développent en présence de 0.1% de BM quant à
Streptococcus thermophilus, elle est très sensible à ce colorant (Guiraud, 1998).
e) Détermination du type fermentaire
Ce test permet de classer les bactéries en espèces homo ou héterofermentaires, il
consiste à mettre en évidence la formation de gaz (CO2), il est réalisé en inoculant le germe
étudié dans 10ml de milieu MRS ou M17 bouillon contenant une cloche de Durham. La
présence ou l’absence de gaz dans les cloches après 48h à 37°C d’incubation nous indique le
type fermentaire (Bourgeois et Leveau, 1980 ; Larpent, 1990).
f) Hydrolyse de l’arginine (ADH) :
La mise en évidence de cette enzyme est intéressante pour la caractérisation des bactéries
lactiques. Cette enzyme libère l’ammoniac et la citruline à partir de l’arginine ; ce test
nécessite le milieu Moèller (Harrigan and Mc cance, 1976).
Le milieu d’arginine est obtenu en ajoutant 10g d’arginine. La répartition est faite en tube
profonds stérilisé 15min à 120°C pour chaque souche isolée ensemencé :
- 1 tube témoin : Moèller sans arginine
- 1 tube de bouillon Moèller + arginine.
Les tubes sont incubés à 37°C pendant 48heures, la lecture des résultats se traduit par la
croissance des bactéries à tester sur milieu Moeller sans arginine qui se manifeste par un
85
. Matériels et méthodes
virage au jaune du milieu du au métabolisme de glucose, tandis que les bactéries à tester sur
milieu Moèller avec arginine, leur développement se traduit par la dégradation de l’arginine et
la libération d’ammoniac qui empêche le virage au jaune, la couleur Leuconostoc devient
violette.
g) La recherche de citratase
La citratase est mise en évidence en ensemençant le milieu Kempler et McKey avec une
culture jeune, les boites de Pétri sont incubées à 37°C pendant 72 h. Les souches dites
citratase (+) sont caractérisées par la formation des colonies de couleur bleue. Cette enzyme
est prépondérante chez Lactococcus lactis subsp lactis et certaines espèces du genre.
h) Production d’acétoine (Acétyl-Méthyl-Carbinol)
Il s’agit d’éliminer par des tests simples, les souches responsables de gros défauts
organoleptiques.
La production d’acétoine est testée sur le milieu « Clark et Lubs » après ensemencement
des souches à tester, puis incubation à 37°C pendant 24h à 48h.
La production de l’acétoine est testée par la réaction de Vogues-Proskauer (VP) et
s’applique de la manière suivante :
Dans un tube à essai, on introduit 1 ml de la culture à tester, on ajoute 0.5 ml de réactif
α-naphtol à 6% dans l’alcool absolu et 0.5 ml d’une solution de soude (NaOH) à 16% dans
l’eau distillée. On agite soigneusement les tubes et on laisse reposer 5 à 10 min à température
ambiante. La production d’acétoine se traduit par l’apparition d’un complexe rose (Zourari et
al., 1992).
i) Profil fermentaire : métabolisme des substrats carbonés
Il s’agit d’apprécier l’aptitude des souches à métaboliser divers composés carbonés en
particulier les sucres. On réalise une galerie d’identification à l’aide d’un milieu de culture
liquide de MRS et M17 sans sucre, le glucose est remplacé par le composé à tester, filtré sur
une membrane et introduit en solution à la concentration finale de 1% en présence du pourpre
de Bromocrésol (BCP) comme indicateur de pH. Avant l’ajout de la culture bactérienne,
celle-ci est centrifugée à 3000 tours / min pendant 10 à 15 min. Le culot est récupéré, puis
recentrifugé une 2ème fois dans l’eau physiologique stérile, puis introduit aseptiquement dans
le tube contenant le milieu MRS et M17 avec un sucre bien déterminé, l’incubation est
effectuée à 37°C pendant 48h.
86
. Matériels et méthodes
La fermentation d’un sucre donné par la souche bactérienne testée se traduit par la
formation d’acide qui se manifeste par le virage de la coloration violette au jaune.
8. Identification des bactéries lactiques en utilisant le système API
L’identification rapide est possible grâce à l’emploi des galeries biochimiques
d’identification d’API 50 CHL (Ref 50410, BioMérieux, France). Ce dispositif se présente
sous la forme d’une plaque en plastique que l’on utilise selon le mode d’emploi sur le
catalogue (voir annexe).
Ce test permet l’identification des bactéries lactiques jusqu’au stade d’espèce en se
basant sur le profil fermentaire et enzymatique. L’API 50 CHL est un système standardisé
associant 50 tests biochimiques formé de 50 microtubes permettant l’étude de la fermentation
des substrats correspondant à leurs la famille des glucides et leurs dérivés (hétérosides,
polyalcools, acides uroniques). Le premier tube sans principe actif sert de témoin négatif. La
fermentation des 49 sucres se traduit par un virage de la couleur du milieu au jaune.
L’utilisation de la galerie consiste à préparer l’inoculum, l’inoculation des galeries puis
incubation à 37 °C selon les étapes suivantes :
8.1. Préparation de l’inoculum
La souche est cultivée sur le milieu à une température adaptée à sa croissance, après 24h
d’incubation, une culture très dense apparaissant sur le milieu est récupérée et centrifugée à
4000 tours/mn pendant 10 mn.
Le culot est homogénéisé dans 2 ml d’eau distillée, puis centrifugé une seconde fois à
4000 tours/mn pendant 10 mn.
Le culot est suspendu à nouveau dans 2 ml d’eau distillée, un nombre (n) de gouttes de
cette suspension est introduit dans 5 ml d’eau distillée stérile de façon à obtenir une opacité de
2 sur l’échelle de Mc Ferland.
On prélève alors à l’aide d’une pipette pasteur 2n gouttes de la suspension est initiale (2
ml) que l’on introduit dans 10 ml de milieu API 50 CHL.
8.2. Préparation des galeries
Environ 10 ml d’eau distillée sont réparties dans les alvéoles du fond de la boite de la
galerie formé de 5 bandes comprenant chacune 10tubes numérotés (0-9,10-19,30-329,40-49)
la galerie est inoculée en répartissant la suspension bactérienne supplémentée par 2n gouttes à
l’aide d’une pipette pasteur.
87
. Matériels et méthodes
Les cupules sont remplies avec de l’huile de paraffine, enfin, la galerie est incubée à la
température optimum de croissance du microorganisme étudié.
8.3. Lecture et interprétation
La lecture des galeries est réalisée après 24 et 48h et comparées aux profils standards en
utilisant le logiciel
9. Caractérisation technologique
Trois critères sont à prendre en compte pour les souches lactiques en industrie laitière :
- La quantité d’acide lactique produite liée au métabolisme fermentaire
- La vitesse de production de l’acide lactique
- Production d’enzymes protéolytiques
9-1-Activité protéolytique
Elle a été déterminée selon la méthode de Huggin and Sandine ,1984 et Veullemard et
al. 1986, ce test est basé sur l'hydrolyse de la caséine sur milieu YMA Yeast Milk agar). On
prépare le milieu YMA solide, coulé dans des boites de pétri, après solidification du milieu,
nous avons ensemencé en touches les souches à tester.
L’activité protéolytique se traduit par un halo clair autour de la souche ensemencée en
touche du à la dégradation de la caséine. La mesure de la dimension du halo permet de
quantifier d’une manière relative l’activité protéolytique des souches les unes par rapport aux
autres. Les résultats sont lus et quantifiés après incubation à 37°C pendant 24h.
9-2 Détermination du pH au cours de la fermentation
Les niveaux de pH ont été mesurés pendant la fermentation à 0h, 2h, 4h, 6h, 8h, 24h à
l’aide d’un pH-mètre en utilisant les tampons de pH 4.00 et de pH 7.00 normes décrites par
l’AOAC, (2000).
9-3 Détermination de l’acidité titrable
Principe : Il correspond à la neutralisation de l’acidité totale par une solution de soude
de titre N/9 en présence d’un indicateur coloré phénolphtaléine à 1%
Les mesures de pH et d’acidité titrable devront s’effectuer stérilement, chaque souche à
tester est ensemencée dans un flacon de 100ml de lait écrémé stérile et incubée à 37°C.
Le dosage de l’acidité se fait en versant les 100ml dans un bécher puis on effectue la
mesure de pH. Ensuite on ajoute dans le bécher 3 à 5 gouttes de phénolphtaléine à 1% et on
titre avec de la soude dornic (N/9) jusqu'à ce que la couleur blanche de lait sous agitation vire
88
. Matériels et méthodes
au rose pale et reste constante, on note alors le volume de la soude (LUCA et REYROLLE,
1989).
Les résultats sont exprimés en degré Dornic (D°), qui traduit l’acidité développée dans
le lait après transformation du lactose en acide lactique selon la formule suivante : acidité
(D°) = le volume de NaOH 10
1D°= 0.1g d’acide lactique dans 1 litre de lait (Guiraud, 1998).
10. Etude de l’antibiorésistance
Elle permet de déterminer la sensibilité ou la résistance des souches à étudier à certains
antibiotiques en utilisant la méthode de diffusion en milieu solide.
A l’aide d’une pipette pasteur stérile, on prélève un nombre suffisant de colonies qu’on
met dans un tube contenant 10ml d’eau physiologique ; on agite pour obtenir une suspension
bactérienne.
On ensemence par écouvillonnage (à l’aide des écouvillons) sur le milieu MH (Muller
Hinton) ou sur le milieu solide M17ou MRS
Déposer les disques d’antibiotiques à raison de 6 à 7 disques par boite, après incubation
à 37°C pendant 24 à 48H.
La lecture des résultats est basée sur l’existence ou pas de zones d’inhibition, par
convention, nous avons considéré que pour un diamètre inférieur à 15mm la souche est
résistance et pour un diamètre supérieur ou égal à 15 mm la souche est sensible.
11. Etude des interactions entre bactéries lactiques isolées et les bactéries
pathogènes
Les souches pathogènes utilisées ont été procurées au laboratoire de microbiologie de
l’hôpital de la wilaya de Mostaganem et identifiées comme suit :
- Staphylococcus aureus
- Salmonella sp
La détection de l’activité antibactérienne des souches lactiques contre les souches
pathogènes est réalisée selon la méthode des puits de Barefoot et Klaenhammer, 1983)
Les bactéries lactiques sont repiquées dans le milieu MRS ou M17 liquide et incubées
pendant une période de 18h à 30°C. Après incubation, une centrifugation réfrigérée (4°c) est
réalisée à 4000 tours/mn pendant 15 mn.
Des puits de 5 mm de diamètre sont creusés stérilement à l’aide d’un emporte-pièce
(cloche de durham) sur la gélose nutritive inoculée au préalable par 0.5 ml de la souche
89
. Matériels et méthodes
90
. Matériels et méthodes
91
. Matériels et méthodes
92
. Matériels et méthodes
93
Résultats et discussions
Résultats
A partir des 05 échantillons de lait cru de vache, 12 isolats de bactéries lactiques ont été
retenus dont 07 appartenant au genre Streptococcus soit un taux de 58.33% et 05 au genre
Lactobacillus soit 41.67%. Etant donné que notre étude porte sur les espèces impliquées dans
la fabrication de yaourt, les résultats d’isolement et les tests d’identification ont donc ciblé les
deux souches constituant le levain mixte à savoir Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus
thermophilus.
Caractéristiques et identification des bactéries lactiques
1- Pré-identification des souches
1-1 Caractérisation morphologique
a) Aspect macroscopique
L’observation macroscopique des colonies développées sur le milieu M17 montre que
celles-ci sont de couleur blanche laiteuse, bien rondes à bords lisses et réguliers de petite taille
avec un diamètre entre 0.5 à 1.5mm (figure 12). Par ailleurs, l’examen macroscopique des
cultures obtenues sur milieu MRS nous a permis de retrouver les critères relatifs aux
Lactobacilles, soient des colonies de taille d’environ 1 à 2 mm de diamètre de couleur
blanchâtre à crémeuse, circulaires et régulières avec une surface lisse (figure 14) (Tableau
23).
Tableau N°23 : Résultats des observations morphologiques des bactéries lactiques
spécifiques
Les souches Aspect morphologique Aspect Diamètre
microscopique
Streptocoques Colonies bien rondes Sphériques, petite 0.5-1 mm
lisses, couleur blanche taille disposées en
laiteuse paires, en courtes
chainettes
Lactobacilles Colonies à bord Bâtonnets plus ou 1-2 mm
régulier, lisses moins longs,
blanchâtres à crémeuses isolés, en paires et
en chaînettes
b) Aspect microscopique
L’aspect microscopique après coloration de Gram a révélé la présence de bactéries à
Gram positif avec deux formes de cellules, des coques et des bâtonnets. Les coques
correspondant aux Streptocoques sont disposées en paires ou en courtes chainettes, alors que
les bâtonnets sont plus ou moins longs, isolées, en paires ou en chainettes soit l’aspect typique
des Lactobacilles (Franz et Holzapfel, 2004) (figures 13,15).
94
Résultats et discussions
95
Résultats et discussions
96
Résultats et discussions
Témoin Témoin
0.1%BM 0.3%BM
97
Résultats et discussions
98
Résultats et discussions
99
Résultats et discussions
100
Résultats et discussions
34 MeLeZitose - -
35 RAFfinose - +
36 Starch + v
37 GLYcoGen + -
38 XyLiTol - -
39 GENtiobiose + +
40 D TURanose - -
41 D LYXose - -
42 D TAGatose + -
43 D FUCose - -
44 L FUCose - -
45 D ARabitoL - -
46 L ARabitoL - -
47 GlucoNaTe - v
48 2-Keto-Gluconate - -
49 5-Keto-Gluconate - -
101
Résultats et discussions
102
Résultats et discussions
7
pH
6
4
Streptococcsus
3 thermophilus
2 Lactobacillus bulgaricus
0
0H 2H 4H 6H 8H 24H Temps
L’évolution du pH durant 24h de fermentation par les souches est représentée par la
figure N° 25.
Les valeurs de pH atteinte après 4h de fermentation chez les souches de Streptococus
thermophilus et Lactobacillus bulgaricus sont de l’ordre de 5.7 et 5.6 respectivement,
cependant après 24h de fermentation les valeurs sont nettement différentes elles sont de
l’ordre de 5.5 et 4.5 respectivement.
103
Résultats et discussions
2H 52 50
4H 74 80
6H 78 85
8H 79 90
24H 79 90
100
°D
90
80
70
60
50 Streptococcsus
40 thermophilus
30 Lactobacillus
20 bulgaricus
10
0
0H 2H 4H 6H 8H 24H
Temps
104
Résultats et discussions
Lactobacillus bulgaricus soit une différence de 2°D, cependant, la production d’acide lactique
a tendance à devenir plus importante chez. L.bulgaricus que S.thermophilus à partir de 04 h
de fermentation. La différence des concentrations en acide lactique chez les deux espèces se
poursuit durant toute la période d’essai mais à une vitesse réduite car cela coïncide
vraisemblablement avec les phases de ralentissement de la croissance et la phase de déclin.
C’est ainsi qu’après 24 h de fermentation les teneurs en acide lactique exprimées en degré
Dornic sont de l’ordre de 79 et 90 °D chez S.thermophilus et L.bulgaricus respectivement
c)Activité protéolytique
Les résultats d’hydrolyse des protéines par les souches lactiques isolées et cultivées sur
le milieu YMA sont représentés dans le tableau N°28. La lecture des résultats consiste à
mesurer les diamètres des halos clairs autour des colonies bactériennes qui traduisent une
activité protéolytique. On constate que l’ensemble des isolats des bactéries lactiques ont été
capables de se développer sur le milieu YMK, se traduisant par l’apparition de zones claires
autour des colonies comme le montre la figure 27, néanmoins une faible activité protéolytique
a été notée chez les Streptocoques par rapport aux Lactobacilles. Les valeurs du diamètre des
zones d’hydrolyse varient 8 à 11 mm et de 15 à 22 mm chez S. thermophilus et L. bulgaricus
respectivement.
Tableau N°28: Activité protéolytique des espèces lactiques sur milieu YMK
Code Souches Diamètre (mm) Evaluation de la
protéolyse
Strp Streptococcus thermophilus 8 à 11 ++
Lb Lactobacillus bulgaricus 15 à 22 +++
105
Résultats et discussions
d) Antibiorésistance
L’évaluation de la sensibilité ou de la résistance des souches lactiques isolées vis a vis
des antibiotiques testés sont regroupés dans le tableau N°29. Il ressort à travers ces résultats
que les deux espèces lactiques sont sensibles au Nitroxolamine et à la Pénicilline mais
résistantes vis-à-vis de la Tétracycline et d’Oxacyline. Cependant leur comportement diffère
par rapport à l’Erytromycine et à la Colistine, S.thermophilus étant résistant au premier et
sensible au second, alors que L. bulgaricus est sensible au premier et résistante au second
(Figures 28 et 29).
TableauN°29 :Evaluation de la sensibilité des souches vis-à-vis des antibiotiques
utilisés.
Les souches Streptococcus thermophilus Lactobacillus
bulgaricus
Antibiotiques Strp
Lb
Erythromycine R S
Colistine S R
Nitroxolamine S S
Tetracycline R R
Oxacyline R R
Penicilline S S
106
Résultats et discussions
e) Interaction bactérienne
La détection de l’activité antibactérienne des souches lactiques spécifiques du yaourt
contre les souches pathogènes Staphylococcus aureus et Salmonella sp réalisée par la
méthode des puits se traduit par l’apparition d’une zone d’inhibition sous forme d’un halo
clair autour des puits (Figures N°30 et 31). Les diamètres des zones d’inhibition varient de 7 à
12 mm en moyenne pour S.aureus contre 6 à 8 mm en moyenne pour Salmonella sp, alors
que ceux obtenus avec l’espèce L.bulgaricus, les valeurs de diamètre sont de l’ordre de 8 à 12
mm et 6 à 9 mm en moyenne pour respectivement S.aureus et Salmonelle sp.
107
Résultats et discussions
(A) (B)
Figure N° 30 : Inhibitions obtenues par la méthode de Barefoot (1983) par les souches de
S. thermophilus contre S.aureus (A) et Salmonella sp (B).
Figure N° 31 : Inhibitions obtenues par la méthode de Barefoot (1983) par les souches de
L.bulgaricus contre S.aureus (A) et Salmonella sp (B).
108
Résultats et discussions
Lait de brebis
pasteurisé 6,70 23,5°D 52,4g/l 173,50 g/l
Normes
(Pellegrini et al., 1987 6,5 - 6,85 22 – 25°D 7.1% 18,3%
et FAO, 1995)
109
Résultats et discussions
0H 40 6.5 40 6.5
2H 40 6.5 40 6.5
4H 45 6.4 52 6.4
6H 45 6.3 52 6.4
8H 52 6 54 6
24H 72 4.7 69 4.9
80
70
60
50
°D
lait écrémé enrichi°D
40
Lait écrémé enrichi pH
30
Lait de Brebis°D
20
Lait de Brebis Ph
10
pH 0
0H 2H 4H 6H 8H 24H
Temps
110
Résultats et discussions
111
Résultats et discussions
120
°D
100 Témoin Lait fermenté
de brebis D°
80
Témoin Lait fermenté
60 reconstitué écrémé D°
40
Souche mixte Lait
fermenté de brebis °D
20
Figure N°34 : Evolution d’acide lactique (D°) chez les Bifidobactérium en culture mixte
112
Résultats et discussions
7
pH
6 Témoin Lait
fermenté de
5 brebis pH
4 Témoin Lait fermenté
reconstitué écrémé
3 pH
2 Souche mixte Lait
fermenté de
1 brebis pH
Le nombre des Streptocoques et des lactobacilles enregistré dans le lait de brebis après
02 heures de fermentation est de 58.104UFC/ml et 42.104UFC/ml respectivement contre
49.104UFC/ml et 35.104 UFC/ml dans le lait reconstitué écrémé.
Le nombre des deux espèces lactiques continue à augmenter dans les deux types de lait à
des vitesses variables, mais globalement les différences en faveur du lait de brebis sont
maintenues pratiquement durant toute la période de fermentation et de post-acidification.
113
Résultats et discussions
Par ailleurs, il faut noter que dans les deux lots au-delà du 7 em jour de conservation, les
nombre moyen des différentes espèces diminuent particulièrement les Streptocoques à cause
de l’acidité excessive développée dans les laits fermentés.
Tableau N° 33: Evolution de la flore lactique et des Bifidobacterium
(N.104)
Témoin Souche mixte
Lait fermenté de Lait fermenté Lait fermenté de Lait fermenté
brebis reconstitué brebis reconstitué
écrémé écrémé
114
Résultats et discussions
UFC/ml 600
Témoin Lait fermenté de
500 brebis Strp
400
Témoin Lait fermenté de
brebis Lb
300
UFC/ml
300 Souche mixte lail
fermenté de brebis Strp
115
Résultats et discussions
UFC/ml
Témoin Lait fermenté de brebis
600 Strp
200
Souche mixte lait fermenté
reconstitué écrémé Strp
Temps
116
Résultats et discussions
Discussion
117
Résultats et discussions
fermentent pas l’arabinose, le xylose, le mannitol et l’inuline. Ces résultats sont analogues
à ceux rapportés par Leveau et Bouix., 1991.
2. Activité protéolytique
L’activité protéolytique à été estimée par la culture des souches dans le milieu Y.M.K
(Yeast Milk Agar) solide et mesure la croissance, les souches sont ensemencées en touche.
La protéolyse se traduit par l’apparition d’un halo clair autour des souches ensemencées
après24h d’incubation due à la dégradation de la caséine.
La mesure de la dimension du halo permet de quantifier d’une manière relative l’activité
protéolytique des souches. D’après les résultats obtenus de l’activité protéolytique, on
remarque que les Lactobacilles ont un pouvoir protéolytique élevé, contrairement aux
Streptocoques. Ces résultats sont compatibles à ceux de Cheriguene et al., 2007 et de
Chougrani et al., 2008. Cependant, l’activité protéolytique des souches lactiques isolées
est assez faible
L’action protéolytique des bactéries lactiques dans les produits laitiers améliore
considérablement leur qualité organoleptique. Selon Desmazeaud, (1992), les enzymes
protéolytiques des bactéries lactiques succèdent à l’action de la présure sur le caillé en
catalysant les réactions conduisant à des précurseurs pour de nombreux produits de flaveur
et d’arôme durant l’affinage de certains fromages. La part des enzymes protéolytiques des
bactéries lactiques durant l’affinage est beaucoup plus importante dans certains types de
fromage comme le Comté, contrairement au fromage de type Saint-Paulin où c’est l’action
de la présure qui est dominante (Lenoir et al., 1983). Par ailleurs, le choix des souches
microbiennes est un facteur important, c’est le cas des Streptocoques organismes
dominants des levains lactiques dont l’aptitude à la protéolyse est très variable car celle-ci
influe non seulement sur les proportions de peptides et d’acides aminés libres du fromage
affiné, mais aussi sur les risques du développement d’amertume (Lenoir et al., 1983 ;
Johnson et al., 1995).
L’activité protéolytique a été observée chez l’ensemble des souches lactiques isolées
S.thermophilus et L.bulgaricus. Les bactéries lactiques du yaourt possèdent des enzymes
protéolytiques de nature différente (protéases, péptidases)(Desmazeaud, 1996). Cependant
cette activité protéolytique reste relativement faible par comparaison aux espèces lactiques
impliquées dans la fabrication de certains fromages, le cas de Lactococcus lactis subsp
lactis (Griponet et al., 1975 ; Salvadori, 1988 ; Novel, 1993).
118
Résultats et discussions
3. Activité antibactérienne
Les bactéries lactiques jouent un rôle fondamental dans l’inhibition des flores non
lactiques, dont certaines sont pathogènes ou nuisibles à la qualité des aliments
(Desmazeaud, 1998). Les deux souches lactiques Streptococcus thermophilus et
Lactobacillus bulgaricus sont connues également par leur pouvoir dans l’acidification, les
processus d’interaction entre elles de façon symbiotique leur permettent d’inhiber la
croissance des autres micro-organismes par la production des composés antimicrobiens tels
que les bactériocines jouant un rôle dans la conservation des produits laitiers tels que le
yaourt.
Le test d’inhibition réalisé par la méthode des puits a montré que les souches lactiques
du yaourt S.thermophilus et L. bulgaricus reconnues par leur pouvoir acidifiant important,
possèdent un effet bactériostatique voir bactéricide vis-à-vis des germes pathogènes testés.
Vaughan et al., (1994) démontrent que les bactéries lactiques isolées du lait cru de vache
inhibent la croissance de nombreux germes pathogènes parmi les quels Staphylococcus
aureus. En effet contrairement à Salmonella sp, un meilleur effet inhibiteur a été obtenu
contre S.aureus par les deux souches lactiques. Selon Onda et al., (2003), les bactéries
pathogènes à Gram (+) sont généralement plus sensibles à l’effet inhibiteur exercé par les
bactéries lactiques en produisant des bactériocines pouvant perturber les fonctions
cellulaires au niveau de la membrane cytoplasmique. Des résultats similaires ont été
rapportés par Aymerich et al., (2000).Cependant, Song et Richard, (1997) ont montré que
Listeria sp bactérie à Gram (+)présente une résistance contre certaines bactériocines à
cause de la différence dans la composition de la membrane cytoplasmique par rapports aux
bactéries sensibles. Par ailleurs, selon Thuault, (1990), l’inhibition exercée vis-à-vis des
germes pathogènes serait plus prononcée en présence de deux acides organiques dans le
milieu, l’acide lactique et l’acide acétique. Dans les travaux rapportés par Medouakh et al.,
(2010), il a été montré que l’effet inhibiteur des souches de Lactobacilles sélectionnées vis-
à-vis de l’espèce pathogène Hélicobacter pylori était du dans la majorité des cas à l’acide
lactique produit. Cette faculté de produire l’acide lactique par les lactobacilles en agissant
comme inhibiteur de la croissance d’autres bactéries pathogènes a été mis en évidence par
de nombreux auteurs ( Lorca et al., 2001 ; Budde et al., 2003). Enfin, la production de
peroxyde d’hydrogène dans certaines conditions pourrait inhiber certaines souches (Premi
et Bottazi, 1972).
119
Résultats et discussions
4. Test d’antibiorésistance
La pénicilline s’avère être l’antibiotique le plus actif sur les bactéries lactiques. Sa
présence à la concentration de 0.01 UI/ml dans un milieu de culture provoque le
ralentissement de l’acidification, alors qu’à la concentration de 0.1 à 0.2 UI/ml,
l’acidification est complètement arrêtée (De Roissart, 1986). ). Selon Chopard et al., 2001,
les souches de Streptococcus thermophilus présentent une grande sensibilité vis-à-vis la
famille des bétalactamines en général et la pénicilline en particulier. Globalement, des
résultats similaires ont été rapportés par la bibliographie particulièrement dans les travaux
de Tamime et al., 1983 et Chougrani et al., 2008.
Quelque paramètres physicochimiques du lait de brebis ont été mesurés à savoir le pH,
l’acidité titrable, la matière grasse et l’extrait sec selon les normes de l’AOAC (2000).
Les résultats obtenus sont indiqués dans le tablau30.
Il apparait que l’acidité titrable mesurée est légèrement faible et n’excèdent pas 23.5°D.
Quant a la valeur de pH, elle a était estimé a 6.70.
On observe aussi que le lait de brebis renferme 17.35% d’extrait sec, ainsi qu’un taux de
matiere grasse de 5.24%.
Les valeurs de pH, l’acidité titrable, la matière grasse et l’extrait sec ; que nous avons
trouvez, concordent avec celles déjà rapportées pour le lait de brebis étudié par Chougrani
et al.,(2008).
120
Résultats et discussions
L’importance variabilité observée et obtenue dans notre échantillon de lait de brebis et les
normes dictés par (Revemal, 1982 ; Pellegrini et al., 1987 et FAO,1985) révèle qu’ils
existent certains facteurs influant sur sa composition et ceci peut être expliqué par : la
nature de l’aliment ingéré, conditions climatiques, la races, l’état physiologique de
l’animal, de même que la méthode de dosage utilisée.
Les propriétés les plus importantes pour l'utilisation commerciale des ferments lactiques
composée de souches probiotiques incluent la croissance et l'acidification rapide du lait, et
la bonne tolérance à l’acidité et à l'oxygène (Rasic et kurmann, 1983).
De même, il est important de considérer les caractéristiques des produits crus, la sécurité
du produit, la capacité d'exercer un effet bénéfique et les caractéristiques désirées du
produit final (Gomes et Malcata, 1998).
121
Résultats et discussions
Les sélections des souches afin de disposer d’un ferment lactique qui permette d’obtenir
un lait fermenté à caractéristiques organoleptiques bien définies sont orientés vers des
souches de Streptococcus et Lactobacillus (pour leur pouvoir acidifiant, pouvoir
protéolytique, activité aromatique et la production des exopolysaccharides) (Pernoud et al.,
2005).
Les souches de Bifidobacterium animalis ( subsp. animalis ou subsp. lactis) sont les
plus utilisées dans la production des laits fermentées au caractères probiotiques (Masco et
al., 2005), parce que ces deux sous-espèce sont connus pour être relativement oxygène
tolérantes (Meile et al., 1997 ; Masco et al., 2004).
De nombreux paramètres influencent la croissance des bifidobacteries dans le lait.Parmi
ces paramètres on a : la température de croissance, le lait utilisé, l’état physiologique
des souches utilisé et leur concentration et les ingrédients ajouté (par ex. les facteurs
bifidogènes).
122
Résultats et discussions
Ces auteur ont constaté que la concentration des bifidobactéries est plus fort dans les
bioyogourt complétés avec de la cystéine que dans bio-yogourt sans la cystéine.
Le pH atteint la valeur de 4.9 au bout de 24H pour le lait de brebis alors qu’il est de 4.7
pour le lait écrémé enrichie, soit respectivement une concentration d’acidité de 69°D et de
72°D.
La production d’acide par la souche Bifidobacterium dans le lait écremé à37°C
atteint45°D après 6h, 52°D après 8H et72°D après24H
La production d’acide par la souche Bifidobacterium dans le lait de brebis à37°C
atteint52°D après 6h,54°D après 8H et 69°D après24H
Ceci s’explique par le taux élevée en protéines dans lait de brebis (61,5g/L),Car les
bifidobactéries ont une activité protéolytique très faible pour dégrader les protéines du lait
comparé de celle des bactéries lactiques (Shihata et Shah, 2000). En effet, Bifidobacterium
diminue lentement le pH du lait et sa croissance est lente et ceci peut etre due aux
substances azotés difficilement assimilable (Hadadji, Bensoltane, 2006 ;Mahi et al.,2006).
Plus récemment, différentes hypothèses ont été proposées pour expliquer le
comportement des bifidobactéries dans le lait de brebis. Certaines d’entre elle elles
s’appuyant sur la concentration plus élevée de β-lactoglobuline, α-lactalbumine et des
complexes de vitamines B (acide pantothénique, biotine et la riboflavine) (Gomes et
Malcata, 1998 ; Kehagias et al., 2008). Ces composés sont considérés comme des bons
facteurs de croissances pour les bifidobactéries (Petschow et Talbott, 1990 ; 1991 ; Ibrahim
et Bezkorovainy, 1994 ; Poch et Bezkorovainy, 1988). Malgré ça, le suivi de l’évolution de
l’acidité titrable a montré un une vitesse d’acidification très lent dans les deux laits
fermentés. Cette faible acidification par lesBifidobacterium en culture pure à été signalé
par plusieurs auteurs (Bennama, 1999; Samona et al., 1996 ; Mahi et al., 2006; Chekroune
et al., 2006 ; Hadadji et Bensoltane , 2006).
Ceci peut être attribué au fait que les bifidobactéries produisent deux molécules d’acides
lactiques et trois molécules d’acides acétiques à partir de deux molécules de glucose
(DeVries et Stouthamer, 1968). Il arrive même que le pyruvate soit clivé en acide formique
et en acétyle-1-phosphate plutôt qu'en acide lactique (Ruas-Madiedo et al., 2005).
123
Résultats et discussions
124
Résultats et discussions
Klaver et al. (1993) ont aussi démontrés que le taux de croissance des bifidobactéries
dans le lait pouvait être augmenté par la présence de souches protéolytiques telles que
Lactobacillus acidophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus ou L. casei..
Par ailleurs, dans une autre étude (Rodrigues et al., 2009) sur les laits fermentés
conventionnel et biologique (teneurs en protéines et en fer plus élevées) ensemencés par
une souche de Bifidobacterium animalis subsp. Lactis en association avec Lactobacillus
bulgaricus LB340 et Streptococcus thermophilus TA040, il a été remarqué que la vitesse
d’acidification était significativement plus importante dans le lait biologique par rapport au
lait conventionnel. Il en est de même concernant la croissance des souches utilisées
largement supérieure dans le lait biologique. Globalement nos résultats sont en accord avec
ceux obtenus par Ait abdesalam et al., 2008.
L’utilisation de l’assocition B. animalis en association avec Streptococcus thermophilus
et Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus dans la fermentation est benifique pour les
trois souches. Cela s’explique par les exigences differentes en facteurs de croissance des
trois espèces. Les souches de Streptococcus thermophilus et de bifidobactérie sont souvent
moins proteolytique (Shihata et Shah, 2000 ; Chekroune, 2005). De ce fait, leur croissance
est limitée, les acides aminés et les péptides présent initialement dans le lait étant
insuffisants pour couvrir leurs besoins.
En revanche, Lb. delbrueckii subsp.bulgaricus possède une protéase membranaire qui va
permettre la libération d’acides aminés est de petits peptides à partir des caséines du lait
ceux-ci étant ensuite utilisables par Streptococcus thermophilus et de bifidobactérie dotés
de peptidase intracellulaires (Shihata et Shah, 2000 ; Marshall, 1987).
Quant à Streptococcus thermophilus, cette espèce a la capacité à utiliser l’oxygène
dissous dans le lait de la sorte à réduire ça concentration un taux très faible, mais non nulle,
permettant ainsi d'augmenter la viabilité des bifidobactéries. Streptococcus thermophilus
aussi produire de l’acide formique et du dioxyde de carbone stimulant la croissance de Lb.
delbrueckii subsp. bulgaricus (Veringa et al., 1968 ; Radke-Mitchell et Sandine, 1984).
125
Résultats et discussions
Selon les résultats mentionnés dans le tableau N°33, on remarque d’une manière
générale que le nombre des bactéries lactiques (Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus
thermophilus) constituant le témoin est beaucoup plus important lorsqu’elles sont cultivées
dans le lait de brebis contrairement au lait reconstitué écrémé.Le nombre des
Streptocoques et des lactobacilles enregistré dans le lait de brebis après 02 heures de
fermentation est de 58.104UFC/ml et 42.104UFC/ml respectivement contre 49.104UFC/ml
et 35.104 UFC/ml dans le lait reconstitué écrémé.Le nombre des deux espèces lactiques
continue à augmenter dans les deux types de lait à des vitesses variables, mais
globalement les différences en faveur du lait de brebis sont maintenues pratiquement
durant toute la période de fermentation et de post-acidification.
En associant la souche probiotique de Bifidobacterium aux bactéries lactiques (souches
mixtes), les mêmes constatations ont été observées à savoir une prédominance des
Lactobacilles, des Streptocoques et des bifidobactérium dans le lait de brebis par
comparaison au lait reconstitué écrémé. Les valeurs notées après 02 heures de fermentation
sont de l’ordre de 160.104UFC/ml, 50.104UFC/ml et 13.104UFC/ml dans le lait de brebis
pour respectivement les Streptocoques, les Lactobacilles et les bifidobactérium contre les
valeurs de 49.104UFC/ml, 40.104UFC/ml et 11.104UFC/ml notées dans le lait reconstitué
écrémé. On s’aperçoit également que durant toute la période de fermentation le nombre des
espèces de Lactobacilles et de Streptocoques étant plus important lorsqu’elles sont
cultivées en association avec la souche de bifidobactérium que lorsqu’elles sont seules
em
dans le témoin. Par ailleurs, il faut noter que dans les deux lots au-delà du 7 jour de
conservation, les nombre moyen des différentes espèces diminuent particulièrement les
Streptocoques à cause de l’acidité excessive développée dans les laits fermentés.
Cette perte de viabilité des bifidobactéries probiotiques ont été précédemment rapporté
par plusieurs auteurs (Dave et Shah, 1997; Gueimonde et al., 2004 ;Gilliland et al., 2002;
Medina et Jordano, 1994; Micanel et al., 1997; Rosenthal et Bernstein,1998; Shin et al.,
2000).
La viabilité des bifidobactéries en culture mixte est particulièrement affectée suite à la
post-acidification des laits fermentés par les bactéries lactiques. Ce phénomène est connu
surtout chez Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus qui développe une acidité
supplémentaire pendant l'entreposage au froid, ce qui abaisse légèrement le pH et
augmente la saveur acide du lait fermenté (Accolas et al., 1977 ; Bouillanne et
Desmazeaud, 1980 ; 1981 ;Donkor et al., 2006). D'autres facteurs stressant comprenant
126
Résultats et discussions
l'oxygène, l'épuisement nutritif et les métabolites autres que les acides organiques produits
pendant la fermentation peuvent aussi influencées la survie des bifidobactéries en lait
fermenté pendant l'entreposage
Le taux de survie est beaucoup mieux dans le lait fermenté de brebis que dans le lait
reconstitué écrémé fermenté .Ceci peut s’expliqué par la teneur importante en protéines du
lait de brebis (61,5g/L) qui ont un pouvoir tampon élevé selon Mietton et al., (2004) et
Salaun et al., (2005). D’un autre coté les bifidobactéries sont bien protégés par les
protéines du lait de brebis qui ont un effet protecteur contre l’acidité du lait fermenté
(Lönnerdal, 2003).
127
Conclusion
Durant notre étude, nous avons isolé des Lactobacilles et des Streptocoques à partir
d’un lait de vache cru acidifier.
L’utilisation des milieux et des conditions de cultures qui répondent aux exigences de
ces bactéries, nous ont permis de les bien isoler et purifier.
Nous avons même constaté leur forme typique .Les études macroscopique et
microscopique ont montré que les Streptocoques forment des petites colonies blanchâtres,
sphériques ou ovoïdes, associées en chainettes et parfois en amas alors que les Lactobacilles
sont des colonies punctiformes, blanchâtres sous forme de bâtonnets courts, disposées par
paires et en chaines.
L’étude physiologique a été réalisée afin de connaitre les conditions optimales de la
croissance des Lactobacilles et des Streptocoques et a montré que les deux souches sont
thermophiles et capables de pousser à une température supérieure ou égale à45°C.
L’identification en utilisant le système API 50 CHL nous a permis de confirmer les
genres et les espèces pré identifiés par les tests physiologiques et biochimiques.
La souche Lactobacille appartient à l’espèce Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus et la souche Streptocoque appartient à l’espèce Sreptococcus thermophilus (les
ferments classiques dans la production des laits fermentés et les yaourts).
Sur le plan biotechnologique, les deux souches ont révélé de bonnes performances
technologiques telles que l’activité protéolytique, le pouvoir acidifiant et l’activité
antagoniste.
Au cours de la deuxième partie expérimentale nous avons étudié l’association de
Lactobacilles et Streptocoques à la souche probiotique Bifidobacterium.
Les propriétés technologiques de B. animalis sont déterminées par sa croissance et son
aptitude de fermenté le lait de brebis et le lait reconstitué écrémé en culture pure et culture
mixte en association avec St. thermophilus et Lb. delbrueckii subsp. Bulgaricus.
Le suivie de la cinétique de croissance et l’évolution de l’acidité et de pH au cours de la
fermentation a révélé que B. animalis se développe mieux en culture mixte (en association
avec St. thermophilus et Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus dans le lait le brebis que en
culture pure.
Le taux de létalité B. animalis pendant le stockage au froid à 6°C pendant 21jours dans
le lait fermenté de brebis (en culture pure et en culture mixte) est moins important que celui
observé dans le lait reconstitué écrémé (dans les deux cultures).
Perspectives
Les résultats présentés dans cette étude nous ont permis de conclure que les bactéries
lactiques en général sont non pathogènes, ce qui permet d’améliorer les conditions de
conservation dans l’industrie alimentaire, bien comprendre quelques mécanismes pour le
développement d’un lait de brebis fermenté probiotique, ces avantages ouvre les volets d’une
éventuelle continuité de ce travail afin de mieux le compléter, par d’autres aptitudes
biotechnologiques.
A.O.A.C., 2000.Assosiation of Official Analytical Chemists. Official methoders of Analysis
Arlington,VA , USA
Abdelmalek, A.2008. Etude de performance des bifidobactéries isolées d’un yaourt fabriqué en
Algérie. Thèse de magister, département de biologie, Faculté de sciences, Université d’Oran, Algérie.
Abdelmalek, A., Bey, F., Gheziel, Y.; Krantar, K. Ait Abdessalam, A.; Meribai, A.; Medouakh,
L. and Bensoltane, A. (2009) Viability and resistance to acidity of Bifidobacteria sp in Algerianés
bio-yogurts. Egyptian Journal of Applied Science (In press)
Accolas., GP et Auclair., (1967).conservation a l’état 1.Congelée de suspension bactéries lactiques
concentriques sous faible, vol1, bactéries
Accolas J.P., Bloquel R. Diddienne R. et Regnier J. (1977). Propriétés acidifiantes des bactéries
lactiques thermophiles en relation avec la fabrication de yoghourt. Lait, 57 (561/562) : 1-23.
Accola J.P, Hemme D, Des Mazeaud M.J, Vassal L , Bouilliane C et Veau M.1982. Des levains
lactiques thermophiles : propriétés et comportement en technologie laitière. Le lait. 487 - 524.
Adrian ,1973.Valeur alimentaire du lait. Ed. La maison. Paris
AFNOR ,. 1982. Recueil de normes françaises des produits dérivés des fruits et légumes, jus de fruits.
Ed. AFNOR, 325 p.
Ait abdeslam R., 2008. Etude de la croissance de bifidobacterium sp dans la lait de brebis. Thèse de
Magister. Université d’Oran.
Alvarez F, Arguelles et Cebero M. 1998. Fermentation of concentrated ski-milk. Effect of different
proteïn, lactose rations obtained by ultra-filtration- diafiltration Journal of dairy science.
Amazou K.S, Prevost H et Divies C .1985. Le lait. 65-21
Arnold D.L , Moodie C.A , Grice HC,Charbonneau S.M, Stavric B,Archibald F.S, Fridovitch
1. 1981. Manganese, superoxide and oxygen tolerance in some lactic acid bacteria .J. bacterial .146 :
928-936
Archibald F.S. 1983-1986. Microbiologie industrielle (les microorganismes intérêts industriels)
collection sciences et techniques agroalimentaires coordonnateurs. J-Y Leveau /M-Bonix 1996.
Article mai, 1997. Etude des interactions entre Lactobacillus etStreptococcus fournie à l'industrie
laitière marocaine.
Assche P et Rahe. 1996. la fabrication des yaourts. Tec et Doc. LAVOISIER. p (18-34).
Axelsson L., 2004. Lactic acid bacteria: Classification and physiology in: lactic acid bacteria:
microbiological and functional aspects.3rd Rev and exp. Marcel Dekker Inc. New York.1-66pp
Barefoot S.F.et Klaenhammer T.R.(1983).Direction and activity of lacticin B, a Bacteriocin
produced by Lactobacillus acidophilus.appl.Environ.Microbiol.45 (6), 1808-1015.
Beauchamp G.K et Cowart B.J. 1987. Development of sweet taste in: DOBBING J (ed), sweetness,
127-138, Springer verlag, Berlin.
Bennama R. (1999). Contribution à l’étude des bifidobactéries : Caractérisation biochimique,
physiologique et technologique de souches isolées en Algérie. Thèse de Magister, département de
biologie, faculté des sciences, Université d’ Oran, Algérie.
Bensoltane A., Yagoubi A.; Mahi M. and Cheriguene A. (2004). Characterization of lactic acid
bacteria isolated from traditional Algerian butter. Egypt. J. Appl. Sci., 19(11B):
604-614.
Bergey's Manual .1986-1989. Manual of determinative bacteriology VILLLIAMS and WILKINS,
Baltimore.
Biavati. B., Soni, T., Mattarelli, P et Trovaletti, L.D. (1992).Survival of bifidobacteria from human
habitat in acidified milk.Microbiological. 15(2) :197-200.
Blanc, B. (1981).Biochimical aspects of human milk-comparison with bovine milk.world Rev
nutrition Diet 36 :1-89
Bocquier F., Guillouet P., Barillet F., (1995).Alimentation hivernale des brebis laitières : intérêt de
la mise en lots. INRA Prod. Animal., 8,19-28.
Boudhamimi., H(2002).Stratégies des entreprises de transformation de lait sur le maché de la
collecte : cas de haouiz et du Doukhala. Mémoire de troisième cycle pour l’obtention du diplôme
d’ingénieur d’état en agroalimentaire. Industrie Agronomique et VétérinaireHassanII. pp 42-76.
Bouillanne C. et Desmazeaud M. (1980). Etude de quelques caractères de souches de Streptococcus
thermophilus utilisés en fabrication de yoghourt et proposition d’une méthode de classement. Lait,
60(598) : 458-473.
Bourgeois, C.M., Leveau, J.Y., (1980). Techniques d’analyse et de contrôle dans les industries
agroalimentaires : le contrôle microbiologique.Tech.et doc. Lavoisier apria.vol.3 : 3-331
Bourgeois et a1.1989, Lenoir et a1.1992. Microbiologie alimentaire .Tome 2. La
fermentation alimentaire .Tec.Doc Apria .p (03-15).
Bourgeois CM et Larpent J.P 1989. Microbiologie alimentaire volume II. Tec et Doc LAVOISIER.
Bourgeois C.M., Larpent J.P ,1996 : Microbiologie alimentaire. Tome 2.Aliments fermentés et
fermentations alimentaires.2eme Edition .Tech et Doc. Lavoisier. Paris.
Bouttazzi V ,1988: An introduction to rod sharpe lactic acid bacteria.Biochimie.70 :303-315
Boyaval P. 1989. Le lait, 2éme édition. p (69-87).
Braquat P.1989.Up take of glutamic acid by Streptococcus salivarius subsp termophilus. CNR 3-302
.J. Dairy Res.56:107-116
Brassart. 1997. Les bactéries lactiques et la santé. A.C.A. p (03-07).
Chekroun A. (2005). Valorisation diététique des protéines du lait de vache par la fermentation
lactique : rôle des bactéries lactiques et des bifidobactéries. Thèse de doctorat d’état Es-Sciences,
département de biologie, faculté des sciences, Université d’Oran, Algérie
Chekroun A., Bensoltane A., Kheroua O. and Saidi D. (2006). Biotechnological characteristics of
fermented milk by bacterial associations of the strains Streptococcus , Lactobacillus and
Bifidobacterium . Egypt. J. App. Sci. 21: (2b), 583-598.
Cerning J.1990. Exocellular polysaccharides produced by lactic acid bacteria F. E. M. S. Microbiol.
Rev.87:113-130
Cherigeune A., Chougrani F. and Bensoltane A. (2006). Identification and characterization
of lactic acid bacteria isolated from Algerian goat’s milk. Pakistan J. Biol. Sci., 9(7):
1242-1249.
Cherigeune, A., F. Chougrani, A. M. A. Bekada, M. El soda and A. Bensoltane (2007).
Enumeration and identification of lactic microflora in Algerian goat’s milk. African J. Biotech., 6(15):
1
Chilliard Y.,Bocquier F.,(1993).Effects of fat supplementation on Milk yield and composition in
dairy goats and ewes. Proceed.5th Int.symp.-FAO.1990.Annuaire FAO de la production, vol 44.Rome,
FAO.
Chopard, R. et Gandhi, D. N. 1990. Effect of stabilizers on the control of whey separation in
fermented beverages prepared from sweet cream buttermilk. Journal of Food Science and Technology,
27(3), 182-183.854-1861.
Chougrani F., Cherigeune A. and Bensoltane A. (2006). Identification and some
technological properties of lactic acid bacteria isolated from Algerian ewe’s milk.
Egypt. J. App. Sci., 21(8): 148-157.
Chougrani F., Cherigeune A. and Bensoltane A. (2008). Use of lactic strains from Algerian
ewe’s milk in the manufacture of a natural yogurt.African. J. of Biotechnology .7 (8): 1181-1186.
Chougrani F., Utilisation des souches lactiques isolées A partir du lait de brebis algérien dans la
fabrication d’un yaourt nature. Thèse de Doctorat. Université d’Oran.
Carr, F.J.,Chill,D.andMaida,N.,(2002). The lactic acid bacteria: a literature survey. Crit Rev
Microbiol 28: 281-370
Crociani, F., Biavati, B., Alessandrini, A., Chiarini, C, et Scardovi, V. (1996). Bifidobacterium
inopatum sp. Nov. And Bifidobacterium denticolens sp nov. two new species isolated from human
dental caries. Int .J .Syst .Bacteriol 46:564-571.
Collins, E.B., Hall, B.J. (1984).Growth of Bifidobacteria milk and preparation of Bifidobacterium
infantis for a dietary adgunct. Journal of Dairy sciences 67 (7):1376-80
Collins MD, Farrow T.A.E, Phillips B.A et Jones .1990. A classification of Lactobacillus
divergens, Lactobacillus isolated forme pouthy in a new, serums camobacterium J.yaourts bacteriol
.37, p(310-316)
Condons .1987. Responses of lactic acid bacteria to oxygen .F.E.M.S. Microbio1. Rev.46 : 269-280
Dave R. I. and Shah N. P. (1997). Viability of yoghurt and probiotic bacteria in yoghurts made from
commercial starter cultures. Int. Dairy J., 7: 31–41.
Dellaglio L.V .1989. Caracteristic of thermophilic lactic acid bacteria in: des laits fermentés. Actualité
de la recherche Johlibbey- Eurotest . Paris. P (11-18).
Dellaglio, F.; H. DeRoissart ; S. Torriani ; M.C.Curk and D. Janssens (1994).
Bactéries lactiques, Volume I. Uriage : Lorica. P25, 30 et 48
De Roissart H et Luquet F.M .1994. Bactéries lactiques aspects fondamentaux et technologiques.
Lorica, got 604. Volume I et II
Desjardins M. L., Roy D. and Goulet J. (1990). Growth of bifidobacteria and their enzyme
profiles. J. Dairy Sci., 73: 299-307.
Des Mazeaud M.J .1983. L'état des connaissances en matière de nutrition des bactéries lactiques. Le
lait .63 p (267-316).
Des Mazeaud M.J. 1992. Activité protéolytique intercellulaire de Streptococcus lactiques mésophiles
au cours de l'affinage des fromages .Revue «lait».
Des Mazeaud Michel J. 1992. Les bactéries lactiques .CIPILP.P(200-200-201-210-300).
Des Mazeaud Michel J .1996. Les bactéries lactiques dans l'alimentation humaine utilisation et
innocuité agriculture .INRA, unité de recherches laitiers, 78352 Jouy, en Jasas cedex. France. 5 :33-
343
Coloration de Gram :
Technique
� Préparer un frottis d’une culture bactérienne pure ;
� Recouvrir le frottis avec de cristal violet ; laisser agir une minute ; rincer à
l’eau
distillée ;
� Verser du Lugol et le laisser agir pendant une minute ; rincer à l’eau distillée ;
� Décolorer à l’alcool à 950 entre 15 et 30 secondes ; rincer à l’eau distillée ;
� Recolorer avec de la fuchsine phénique ; pendant 10 seconde si elle est
concentrée
ou 1 minute si elle est diluée. Rincer à l’eau distillée ;
� Sécher au dessus de la flamme d’un bec Bunsen ;
� Observer à l’objectif à immersion (objectif x 100) et à pleine lumière.
Les bactéries « Gram-positif » apparaissent en violet foncé, les bactéries« Gram
négatif » en rose ou rouge.
Recherche d’une catalase :
Exposer une culture sur boite à l’air pendant 30 min. Prélever alors quelques
colonies,
les émulsionner dans une goute d’eau oxygénée à 10 vol. La formation de bulles
est due à la
catalase du germe.
Résumé
12 isolats de bactéries lactiques ont été isolées et identifiées en se basant sur leur
caractéristiques physiologiques et biochimique à partir de 05 échontillons de lait cru de
vache collectés de différente région à savoir. Parmi les isolats, 07 appartenaient au
genre Streptococcus soit un taux de 58,33% et 05 au genre Lactobacillus soit un taux
de 41,67% .Etant donnée que notre étude porte sur les espèces impliquées dans la
fabrication de yaourt,les résultats d’isolement et les tests d’identification ont ciblé les
deux souches constituant le levain mixte à savoir Lactobacillus bulgaricus et
Streptococcus thermophilus . Les souches bactériennes ont été identifiées en se basant
sur leur profil macroscopique et microscopique ainsi que par le système Api50. Ces
souches présentent des propriétés technologiques variables, à savoir un bon pouvoir
acidifiant, par la production d’acide lactique, une activité protéolytique et une
résistance aux inhibiteurs comme les antibiotiques. L’acidité exprimée en degré dornic
°D après24/h de fermentation était de l’ordre de (79°D et 90°D) chez les espèces
Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus respectivement. L’activité
protéolytique chez les souches lactiques est importante, évaluée entre 8à11mm chez les
Streptococcus thermophilus et 15à22 mm pour les Lactobacillus bulgaricus. Le test de
l’antibioresistance des souches permet de signaler généralement leurs sensibilités
apparentes aux différents antibiotiques utilisés. L’activité antagoniste des souches
lactiques spécifiques du yaourt a révélé que ces souches ont un pouvoir d’inhibition
vis-à-vis de St. Aureus et Salmonella sp. Les propriétés technologiques de B. animalis
sont déterminées par son aptitude à fermenter le lait de brebis et le lait écrémé en
culture pure et en culture mixte en association avec Lactobacillus bulgaricus et
Streptococcus thermophilus. L’évolution des valeurs de pH dans le lait de brebis et le
lait écrémé enrichi après 24 heures est caractérisée par une baisse de pH atteignant les
valeurs 4.7 et 4.9 dans le lait écrémé enrichi et le lait de brebis respectivement.
Inversement, les teneurs en acidité Dornic augmentent et atteignent 72 °D après 24
heures de fermentation dans le lait écrémé enrichi, alors que dans le lait de brebis, la
teneur atteinte en fin de fermentation est de 69 °D. La survie de Bifidobacterium
animalis dans les produits fermentés en culture mixte, associée avec Lb. delbrueckii
subsp bulgaricus et S.thermophilus(Strp) dans le lait reconstitué écrémé et le lait de
brebis stocké à 6°C pendant 21jours (0-4h) durée de fermentation et 7-21jours durée de
post-acidification) s’est révélée beaucoup mieux en culture mixte qu’en culture pure
dans le lait fermenté de brebis.
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