Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
Manuel Des TP Eaux
Manuel Des TP Eaux
UNITE :
MICROBIOLOGIE DES EAUX, DES BOISSONS ET
DES PRODUITS DE LA MER
MANUEL
DES TRAVAUX PRATIQUES
du 18 au 29 MAI 2002
Responsable des Travaux pratiques : Dr E. LEBRES
Assistants : Mr Azizi Djamal
Mr Hamza Abdenour
Mme Taleb Farida
Mr Taouchichet Belkacem
LE PRELEVEMENT
AU ROBINET
ASEPTIE MAXIMUM
FLAMBAGE - DESINFECTION
EVACUATION DES PREMIERS LITRES
DEBIT DE REMPLISSAGE
VOLUME A PRELEVER
PUITS ET FORAGES
CONNAITRE LA NAPPE
CONNAITRE L'USAGE DE CES EAUX
LE TRANSPORT
TEMPERATURE
DELAI
MULTIPLICATION
MORTALITE
TEMPERATURE DE 4C
LES PLUS COURTS POSSIBLES
EAUX EMBOUTEILLES
LE DENOMBREMENT DOIT AVOIR LIEU DANS
LES HEURES QUI SUIVENT L'EMBOUTEILLAGE
LES FLACONS
NATURE
VERRE
FLACONS A USAGE UNIQUE
STERILISATION
PAR LA CHALEUR
PAR L'OXYDE D'ETHYLENE
PAR LES RAYONS GAMMA
CONTROLE DE STERILITE
STERILISATION EXTERIEURE
NEUTRALISANTS
TP : 1
Recherche et dnombrement des germes revivifiables
Eau
Analyser
1 ml
1ml
22C
37C
pendant 72 heures
Schma n1
TP : 2 . COLIMETRIE.
Recherche et dnombrement des Coliformes en milieux liquides .
Les coliformes se prsentent sous forme de Bacilles Gram ngatifs
(BGN), non sporognes, oxydase ngative, aro-anarobies facultatifs, capables
de crotre en prsence de sels biliaires et capables de fermenter le lactose avec
production dacides et de gaz, en 24 48 heures 37C.
Les coliformes sont considrs comme indices de contamination fcale.
La recherche et le dnombrement des coliformes peut se faire selon deux
mthodes de choix :
- Soit en milieu liquide sur BCPL par la technique du NPP (Nombre le Plus
Probable).
- Soit par filtration sur membrane 0,45 en milieu solide en supposant la
disponibilit dune rampe de filtration.
Technique en milieu liquide sur BCPL.
La technique en milieu liquide fait appel deux tests conscutifs savoir :
le test de prsomption : rserv la recherche des Coliformes totaux .
le test de confirmation : encore appel test de Mac Kenzie et rserv la
recherche des Coliformes fcaux partir des tubes positifs du test de
prsomption .
Test de prsomption .
A partir de leau analyser, porter asptiquement :
50 ml dans un flacon contenant 50 ml de milieu BCPL D/C muni dune
cloche de Durham
5 fois 10 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL D/C muni dune
cloche de Durham
5 fois 1 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL S/C muni dune
cloche de Durham, comme lindique le schma n 2.
Chassez le gaz prsent ventuellement dans les cloches de Durham et bien
mlanger le milieu et linoculum.
Incubation :
Lincubation se fait 37C pendant 24 48 heures .
5
Lecture :
Sont considrs comme positifs les tubes prsentant la fois :
un dgagement gazeux ( suprieur au 1/10 de la hauteur de la cloche ) ,
un trouble microbien accompagn dun virage du milieu au jaune ( ce qui
constitue le tmoin de la fermentation du lactose prsent dans le milieu ) .
Ces deux caractres tant tmoins de la fermentation du lactose dans les
conditions opratoires dcrites .
La lecture finale se fait selon les prescriptions de la table du NPP qui figure en
annexe.
Illustration :
Inoculum
1 X 50 ml
5 X 10 ml
5 X 1 ml
Test de prsomption
+
+
+
+
+
+
-
Nbre Caractristique
1
3
Test de
pr
s
o
m
pti
on
1 X 50 ml
Nbre
Caractristique
Test de confirmation
Gaz
Indole
Nbre
Caractristique
5 X 10 ml
5 X 1 ml
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
Tableau Rcapitulatif
Le nombre caractristique relatif au dnombrement des Coliformes fcaux est
donc 111 , ce qui correspond sur la table du NPP au chiffre 5.
Le rsultat final sera donc de :
14 Coliformes totaux dans 100 ml deau analyser
5 Coliformes fcaux dans 100 ml deau analyser
Remarque :
Etant donn que les Coliformes fcaux font partie des Coliformes totaux , il est
pratiquement impossible de trouver plus de Coliformes fcaux que de
Coliformes totaux .
TP : 2
Colimtrie en milieu liquide : Test de prsomption
Eau
Analyser
1 X 50 ml
BCPL D/C
5 X 10 ml
BCPL D/C
5 X 1 ml
BCPL S/C
37C, 24 48 heures
+ +
+ +
2
Schma n2
TP : 2
Colimtrie en milieu liquide : Test de confirmation
44C , 24 heures
Ajouter 2 3 gouttes de Kowacs
10
1
Schma n3
TP : 3
Colimtrie par filtration
La colimtrie par filtration est une mthode rapide, simple, normalise mais
ncessitant la disponibilit dune rampe de filtration.
Tout dabord, il faudrait striliser un entonnoir laide dun bec bunsen.
Le refroidir soit avec leau analyser ou bien avec de leau distille strile.
Mettre en place de faon aseptique une membrane de 0,45 entre la
membrane poreuse et lentonnoir laide dune pince strile.
Fixer ce dernier avec la pince correspondante.
Recherche de coliformes totaux
Remplir de faon aseptique lentonnoir avec 100 ml deau analyser.
Actionner la pompe vide pour permettre le passage de leau travers la
membrane.
Retirer ensuite la membrane laide dune pince strile et la placer dans une
boite de Ptri de 45 mm de diamtre contenant de la glose TTC.
Cette membrane sera incube 37C, pendant 24 heures et servira la
recherche des coliformes totaux.
Recherche de coliformes fcaux
Remplir par la suite lentonnoir avec 100 ml deau analyser.
Actionner de la mme faon la pompe vide pour permettre le passage de
leau travers la membrane.
Retirer ensuite la membrane laide dune pince strile et la placer dans une
boite de Ptri de 45 mm de diamtre contenant de la glose TTC.
Cette deuxime membrane sera incube 44C, pendant 24 heures et servira
la recherche des coliformes fcaux.
11
Lecture et interprtation
Aprs 24 heures dincubation, les coliformes totaux et fcaux apparaissent
sous forme de petites colonies jaunes ou oranges, lisses, lgrement
bombes.
Etant donn le caractre slectif de la glose TTC ; ne pousseront
thoriquement que les coliformes.
Ne dnombrer que les boites refermant entre 15 et 300 colonies.
Le nombre de colonies trouves sera exprim dans 100 ml deau analyser.
TP : 3
Colimtrie par filtration
Filtration de 100 ml deau
Eau
Analyser
Entonnoir
Membrane 0,45
Rampe de
Filtration
3 postes
Pompe
37C
44C
24 heures
Coliformes totaux
Coliformes fcaux
12
Schma n4
TP : 4 . STREPTOMETRIE
Recherche et dnombrement des Streptocoques fcaux en milieux liquides
5 X 1 ml
Test de prsomption
+
+
+
+
+
-
Test de confirmation .
Le test de confirmation est bas sur la confirmation des Streptocoques fcaux
ventuellement prsents dans le test de prsomption.
14
Les tubes de ROTHE trouvs positifs feront donc lobjet dun repiquage
laide dune se boucle dans tube contenant le milieu LITSKY EVA, comme
lindique le schma n6.
Bien mlanger le milieu et linoculum .
Incubation :
Lincubation se fait cette fois-ci 37C, pendant 24 heures .
Lecture :
Sont considrs comme positifs , les tubes prsentant la fois :
un trouble microbien, et
une pastille violette (blanchtre) au fond des tubes.
La lecture finale seffectue galement selon les prescriptions de la table du
NPP qui figure en annexe.
Illustration
En reprenant lexemple prcdent relatif au test de prsomption, cela suppose
que nous avons 5 tubes repiquer savoir :
2 tubes sur 5 de ROTHE D/C, et
3 tubes sur 5 de ROTHE S/C.
Inoculum
Test de
pr
s
o
m
pti
on
1 X 50 ml
5 X 10 ml
5 X 1 ml
+
+
+
+
+
-
Test de confirmation
Trouble
Pastille violette
Nbre Caractristique
0
+
+
+
+
2
+
+
+
+
-
Tableau Rcapitulatif
15
TP : 4 . STREPTOMETRIE
Recherche et dnombrement des Streptocoques fcaux en milieu liquide :
Test de Prsomption
Eau
Analyser
1 X 50 ml
ROTHE D/C
5 X 10 ml
ROTHE D/C
5 X 1 ml
ROTHE S/C
16
37C, 24 48 heures
Schma n5.
TP : 4 . STREPTOMETRIE
Recherche et dnombrement des Streptocoques fcaux en milieu liquide :
Test de Confirmation
Repiquage
sur milieu Eva
Repiquage
sur milieu Eva
17
37C , 24 heures
1
Schma n6
TP : 5
Streptomtrie par filtration
La streptomtrie par filtration est tout comme la colimtrie par filtration une
mthode rapide, simple, normalise mais ncessitant la disponibilit dune
rampe de filtration.
Tout dabord, il faudrait striliser un entonnoir laide dun bec bunsen.
Le refroidir soit avec leau analyser ou bien avec de leau distille strile.
Mettre en place de faon aseptique une membrane de 0,45 entre la
membrane poreuse et lentonnoir laide dune pince strile.
Fixer ce dernier avec la pince correspondante.
Remplir de faon aseptique lentonnoir avec 100 ml deau analyser.
Actionner la pompe vide pour permettre le passage de leau travers la
membrane.
18
Retirer ensuite la membrane laide dune pince strile et la placer dans une
boite de Ptri de 45 mm de diamtre contenant de la glose SLANETZ et
BARTLEY.
Cette membrane sera incube 37C, pendant 24 heures.
Lecture et interprtation
Aprs 24 heures dincubation, les streptocoques fcaux apparaissent sous
forme de petites colonies rouges, marron ou roses, lisses, lgrement
bombes.
Etant donn le caractre slectif de la glose SLANETZ ; ne pousseront
thoriquement que les streptocoques fcaux.
Ne dnombrer que les boites refermant entre 15 et 300 colonies.
Le nombre de colonies trouves sera exprim dans 100 ml deau analyser.
TP : 5
Streptomtrie par filtration
Entonnoir
Membrane 0,45
Rampe de
Filtration
3 postes
Pompe
37C, 24 heures
19
Streptocoques fcaux
Aprs 24 heures dincubation, 37C, procder au dnombrement de toutes
les colonies caractristiques et rapporter ce nombre 100 ml deau
analyser.
Schma n7
TP : 6
Recherche et dnombrement des
Spores dAnarobies Sulfito-Rducteurs
Les anarobies sulfito-rducteurs (ASR) se prsentent sous forme de
bactries Gram +, se dveloppant en 24 48 heures sur une glose Viande Foie
en donnant des colonies typiques rduisant le sulfite de sodium (Na 2SO3) qui se
trouve dans le milieu, en sulfure qui en prsence de Fe 2+ donne FeS (sulfure de
fer ) de couleur noire.
Les spores des ASR constituent gnralement des indices de
contamination ancienne.
A partir de leau analyser :
prendre environ 25 ml dans un tube strile, qui sera par la suite soumis
un chauffage de lordre de 80C pendant 8 10 minutes, dans le but
de dtruire toutes les formes vgtatives des ASR ventuellement
prsentes.
Aprs chauffage, refroidir immdiatement le tube en question, sous
leau de robinet.
20
21
TP : 6
Recherche et dnombrement des
Spores dAnarobies Sulfito-Rducteurs
Eau
Analyser
25 ml deau analyser
22
Schma n8
TP : 7
Recherche de Salmonella
Les Salmonella sont des entrobactries qui se prsentent sous forme de
Bacilles Gram Ngatifs (BGN), ne fermentant pas le lactose, mais fermentant le
glucose avec production de gaz et de H 2S ; elles se divisent en deux grands
groupes : les mineures et les majeures (hautement pathognes ).
Jour 1 . Premier Enrichissement.
Le premier enrichissement seffectue sur le milieu de Slnite - Cysten D/C
rparti raison de 100 ml par flacon.
Ce dernier sera donc ensemenc laide de 100 ml deau analyser, puis incub
37C pendant 18 24 heures, comme lindique le schma n9.
Jour 2 . Deuxime enrichissement et Isolement.
Ce flacon fera lobjet :
dune part, dun deuxime enrichissement sur milieu Slnite en tubes
raison de 0,1 ml
23
24
TP : 7
Recherche de Salmonella
Eau
Analyser
100 ml
Bouillon Slnite
25
37C , 18 24 heures
Deuxime enrichissement
37C , 24 h
Gram
Etat frais
TSI
Ure Indole TDA
ONPG
Oxydase
LDC , ODC , ADH
GN incline
API 20 E
37C , 24 h
Idem
TP : 8
Recherche de Salmonella par filtration
26
TP : 8
Recherche de Salmonella par filtration
Filtration de 250 ml 5 litres deau
Eau
Analyser
Entonnoir
Membrane 0,45
Rampe de
Filtration
Pompe
3 postes
27
Bouillon Slnite
D/C
37C, 24 heures
Gram
Etat frais
TSI
Ure Indole TDA
ONPG
Oxydase
LDC , ODC , ADH
GN incline
API 20 E
Agglutination (OMA , OMB )
Schma n10
TP : 9
Recherche de Vibrion cholrique
Les Vibrionacae se prsentent sous forme de Bacilles Gram Ngatifs
droits ou incurvs (BGN), trs mobiles, possdant une oxydase, aro-anarobies
facultatifs, fermentant le glucose sans production de gaz ni d'H2S. (hautement
pathognes ).
Jour 1 . Premier Enrichissement.
Le premier enrichissement seffectue sur le milieu Eau Peptone Alcaline 10
fois concentr rparti raison de 50 ml par flacon auquel on ajoute
asptiquement 450 ml deau analyser au moment du prlvement.
Ce dernier sera par la suite incub 37C pendant 18 24 heures, comme
lindique le schma n11.
28
LDC
+
+
ODC
+
+
ADH
+
+
29
TP : 9
Recherche de Vibrion cholrique
Eau
Analyser
450 ml
30
37C, 18 24 heures
1 ml
Isolement sur GNAB 1
Deuxime enrichissement
37C, 24 h
Oxydase
Gram
Etat frais
KIA
LDC, ODC, ADH
GN incline
37C, 24 h
Agglutination
Idem
Schma n11
TP 10
Recherche de Staphylococcus aureus par la mthode de GC
Staphylococcus aureus se prsente sous forme de cocci, en grappe de
raisin, Gram +, possdant une catalase et une coagulase.
Selon la disponibilit des milieux de culture, trois techniques diffrentes sont
recommandes pour la recherche de Staphylococcus aureus savoir :
mthode de Baird Parker
mthode denrichissement sur milieu de Giolliti Cantonii
mthode denrichissement sur milieu de Chapman .
Dans le cas des poissons, la recherche de Staphylococcus aureus par la
mthode d'enrichissement sur milieu de Giolliti Cantonii est recommande.
Mthode denrichissement au milieu de Giolliti Cantonii .
31
32
Aurus
+
+
+
Intermdius
+
+
-
Saprophyticus
+
-
Epidermitis
+
-
TP 10
Recherche de Staphylococcus aureus par la mthode de GC
A partir des dilutions dcimales :
10-1
10-2
1ml
15ml
10-3
1ml
15ml
1ml
15ml
33
GC
GC
GC
37C, 24 48 h
Raction Positive
Raction Ngative
37C , 24 48 h
Catalase , coagulase
Schma n12
Table NPP
1 X 50 ml
5 X 10 ml
5 X 1 ml
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
4
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
0
Nombre
Limites de confiance
caractristique Infrieure Suprieure
<1
1
2
1
2
3
2
3
4
3
5
5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
4
6
4
6
8
6
8
11
8
13
13
34
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
5
5
5
5
5
5
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
5
0
1
2
3
4
5
1
3
4
6
3
5
7
9
5
7
10
12
8
11
14
18
21
13
17
22
28
35
43
24
35
54
92
160
>240
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
1
2
<0,5
1
3
3
2
3
4
5
6
4
5
7
9
12
15
8
12
18
27
39
4
8
11
15
8
13
17
21
13
17
23
28
19
26
34
53
66
31
47
59
85
100
120
75
100
140
220
450
35