INSTITUT PASTEUR DALGERIE

COURS NATIONAL DHYGIENE ET DE MICROBIOLOGIE

DES ALIMENTS

UNITE :
MICROBIOLOGIE DES EAUX, DES BOISSONS ET
DES PRODUITS DE LA MER

MANUEL
DES TRAVAUX PRATIQUES

du 18 au 29 MAI 2002
Responsable des Travaux pratiques : Dr E. LEBRES
Assistants : Mr Azizi Djamal
Mr Hamza Abdenour
Mme Taleb Farida
Mr Taouchichet Belkacem

LE PRELEVEMENT
AU ROBINET

ASEPTIE MAXIMUM
FLAMBAGE - DESINFECTION
EVACUATION DES PREMIERS LITRES
DEBIT DE REMPLISSAGE
VOLUME A PRELEVER

PUITS ET FORAGES
CONNAITRE LA NAPPE
CONNAITRE L'USAGE DE CES EAUX
LE TRANSPORT
TEMPERATURE

DELAI

MULTIPLICATION
MORTALITE
TEMPERATURE DE 4C
LES PLUS COURTS POSSIBLES

EAUX EMBOUTEILLES
LE DENOMBREMENT DOIT AVOIR LIEU DANS
LES HEURES QUI SUIVENT L'EMBOUTEILLAGE

LES FLACONS
NATURE

VERRE
FLACONS A USAGE UNIQUE
STERILISATION
PAR LA CHALEUR
PAR L'OXYDE D'ETHYLENE
PAR LES RAYONS GAMMA
CONTROLE DE STERILITE
STERILISATION EXTERIEURE
NEUTRALISANTS

 THIOSULFATE DE SODIUM (Pastilles)

EDTA
TP : 1
Recherche et dnombrement des germes revivifiables
La recherche et le dnombrement des germes revivifiables se ralise
deux tempratures diffrentes afin de cibler la fois les micro-organismes
tendance psychrophiles soit 20 et ceux franchement msophiles soit 37C.
A partir de leau analyser, porter asptiquement 2 fois 1ml dans deux
boites de Ptri vides prpares cet usage et numrotes comme lindique le
schma n1.
Complter ensuite chacune des boites avec environ 20 ml de glose
TGEA fondue puis refroidie 451C.
Faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de
8 pour permettre linoculum de se mlanger la glose.
Laisser solidifier sur paillasse , puis rajouter une deuxime couche
denviron 5 ml de la mme glose ou de glose blanche . Cette double couche a
un rle protecteur contre les contaminations diverses.
Incubation :
La premire boite sera incube, couvercle en bas 20C,
La seconde sera incube couvercle en bas 37C,
pendant 72 heures avec :
- premire lecture 24 heures ,
- deuxime lecture 48 heures , et
- troisime lecture 72 heures .
Lecture :
Les germes revivifiables se prsentent dans les deux cas sous forme de colonies
lenticulaires poussant en masse.
Dnombrement :
Il sagit de dnombrer toutes les colonies, en tenant compte deux remarques
suivantes :
1. Ne dnombrer que les boites contenant entre 15 et 300 colonies,
2. Le rsultat sera exprim par millilitre deau analyser 22 et 37C.

TP : 1
Recherche et dnombrement des germes revivifiables

Eau
Analyser

1 ml

1ml

Ajouter environ 20 ml de glose TGEA

Laisser solidifier sur paillasse
Ajouter une double couche ( 5 ml )
Incuber :

22C

37C
pendant 72 heures

Dnombrer les colonies lenticulaires

en masse

Schma n1

TP : 2 . COLIMETRIE.
Recherche et dnombrement des Coliformes en milieux liquides .
Les coliformes se prsentent sous forme de Bacilles Gram ngatifs
(BGN), non sporognes, oxydase ngative, aro-anarobies facultatifs, capables
de crotre en prsence de sels biliaires et capables de fermenter le lactose avec
production dacides et de gaz, en 24 48 heures 37C.
Les coliformes sont considrs comme indices de contamination fcale.
La recherche et le dnombrement des coliformes peut se faire selon deux
mthodes de choix :
- Soit en milieu liquide sur BCPL par la technique du NPP (Nombre le Plus
Probable).
- Soit par filtration sur membrane 0,45 en milieu solide en supposant la
disponibilit dune rampe de filtration.
Technique en milieu liquide sur BCPL.
La technique en milieu liquide fait appel deux tests conscutifs savoir :
le test de prsomption : rserv la recherche des Coliformes totaux .
le test de confirmation : encore appel test de Mac Kenzie et rserv la
recherche des Coliformes fcaux partir des tubes positifs du test de
prsomption .
Test de prsomption .
A partir de leau analyser, porter asptiquement :
50 ml dans un flacon contenant 50 ml de milieu BCPL D/C muni dune
cloche de Durham
5 fois 10 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL D/C muni dune
cloche de Durham
5 fois 1 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL S/C muni dune
cloche de Durham, comme lindique le schma n 2.
Chassez le gaz prsent ventuellement dans les cloches de Durham et bien
mlanger le milieu et linoculum.
Incubation :
Lincubation se fait 37C pendant 24 48 heures .
5

Lecture :
Sont considrs comme positifs les tubes prsentant la fois :
un dgagement gazeux ( suprieur au 1/10 de la hauteur de la cloche ) ,
un trouble microbien accompagn dun virage du milieu au jaune ( ce qui
constitue le tmoin de la fermentation du lactose prsent dans le milieu ) .
Ces deux caractres tant tmoins de la fermentation du lactose dans les
conditions opratoires dcrites .
La lecture finale se fait selon les prescriptions de la table du NPP qui figure en
annexe.
Illustration :
Inoculum
1 X 50 ml
5 X 10 ml

5 X 1 ml

Test de prsomption
+
+
+
+
+
+
-

Nbre Caractristique
1
3

Le nombre caractristique est donc 132 ; ce qui correspond sur la table de

Mac Grady au nombre 14.
On considre alors quil y a 14 Coliformes par 100 ml deau analyser.
Test de confirmation ou test de Mac Kenzie.
Le test de confirmation ou test de Mac Kenzie est bas sur la recherche de
Coliformes thermotolrants parmi lesquels on redoute surtout la prsence
dEscherichia coli.
Les coliformes thermotolrants ont les mmes proprits de fermentation que
les coliformes mais 44C.
Escherichia coli est un coliforme thermotolrant qui entre autre :
- produit de lindole partir du tryptophane 44C,
- donne un rsultat positif lessai au rouge de mthyl,

- ne produit pas de lacthyl mthyl carbinol,

- nutilise pas le citrate comme source unique de carbone.
Les tubes de BCPL trouvs positifs lors du dnombrement des Coliformes
totaux feront lobjet dun repiquage laide dune se boucle dans tube
contenant le milieu Schubert muni dune cloche de Durham, comme lindique le
schma n3.
Chasser le gaz prsent ventuellement dans les Cloches de Durham et bien
mlanger le milieu et linoculum .
Incubation :
Lincubation se fait cette fois-ci au bain marie 44C pendant 24 heures .
Lecture :
Sont considrs comme positifs , les tubes prsentant la fois :
un dgagement gazeux, et
un anneau rouge en surface , tmoin de la production dindole par
Escherichia Coli aprs adjonction de 2 3 gouttes du ractif de Kowacs.
La lecture finale seffectue galement selon les prescriptions de la table du
NPP en tenant compte du fait que Escherichia Coli est la fois producteur de
gaz et dindole 44C.
Illustration
En reprenant lexemple prcdent relatif au dnombrement des Coliformes
totaux , cela suppose que nous avons 6 tubes repiquer savoir :
le flacon de BCPL D/C,
3 tubes sur 5 de BCPL D/C, et
2 tubes sur 5 de BCPL S/C.
Inoculum

Test de
pr
s
o
m
pti
on

1 X 50 ml

Nbre
Caractristique

Test de confirmation
Gaz

Indole

Nbre
Caractristique

5 X 10 ml

5 X 1 ml

+
+
+
+
+
-

+
+
-

+
+

+
+

Tableau Rcapitulatif
Le nombre caractristique relatif au dnombrement des Coliformes fcaux est
donc 111 , ce qui correspond sur la table du NPP au chiffre 5.
Le rsultat final sera donc de :
14 Coliformes totaux dans 100 ml deau analyser
5 Coliformes fcaux dans 100 ml deau analyser

Remarque :
Etant donn que les Coliformes fcaux font partie des Coliformes totaux , il est
pratiquement impossible de trouver plus de Coliformes fcaux que de
Coliformes totaux .

TP : 2
Colimtrie en milieu liquide : Test de prsomption

Eau
Analyser

1 X 50 ml

BCPL D/C

5 X 10 ml

BCPL D/C

5 X 1 ml

BCPL S/C

37C, 24 48 heures

+ +

+ +

2
Schma n2

TP : 2
Colimtrie en milieu liquide : Test de confirmation

Repiquage sur milieu Schubert + cloche

44C , 24 heures
Ajouter 2 3 gouttes de Kowacs

10

1
Schma n3

TP : 3
Colimtrie par filtration
La colimtrie par filtration est une mthode rapide, simple, normalise mais
ncessitant la disponibilit dune rampe de filtration.
Tout dabord, il faudrait striliser un entonnoir laide dun bec bunsen.
Le refroidir soit avec leau analyser ou bien avec de leau distille strile.
Mettre en place de faon aseptique une membrane de 0,45 entre la
membrane poreuse et lentonnoir laide dune pince strile.
Fixer ce dernier avec la pince correspondante.
Recherche de coliformes totaux
Remplir de faon aseptique lentonnoir avec 100 ml deau analyser.
Actionner la pompe vide pour permettre le passage de leau travers la
membrane.
Retirer ensuite la membrane laide dune pince strile et la placer dans une
boite de Ptri de 45 mm de diamtre contenant de la glose TTC.
Cette membrane sera incube 37C, pendant 24 heures et servira la
recherche des coliformes totaux.
Recherche de coliformes fcaux
Remplir par la suite lentonnoir avec 100 ml deau analyser.
Actionner de la mme faon la pompe vide pour permettre le passage de
leau travers la membrane.
Retirer ensuite la membrane laide dune pince strile et la placer dans une
boite de Ptri de 45 mm de diamtre contenant de la glose TTC.
Cette deuxime membrane sera incube 44C, pendant 24 heures et servira
la recherche des coliformes fcaux.

11

Lecture et interprtation
Aprs 24 heures dincubation, les coliformes totaux et fcaux apparaissent
sous forme de petites colonies jaunes ou oranges, lisses, lgrement
bombes.
Etant donn le caractre slectif de la glose TTC ; ne pousseront
thoriquement que les coliformes.
Ne dnombrer que les boites refermant entre 15 et 300 colonies.
Le nombre de colonies trouves sera exprim dans 100 ml deau analyser.
TP : 3
Colimtrie par filtration
Filtration de 100 ml deau
Eau
Analyser

Entonnoir
Membrane 0,45

Rampe de
Filtration
3 postes

Pompe

37C

44C
24 heures

Coliformes totaux

Coliformes fcaux

12

Aprs 24 heures dincubation :

- 37C , en ce qui concerne la recherche des coliformes totaux,
- 44C , en ce qui concerne la recherche des coliformes totaux,
procder au dnombrement de toutes les colonies caractristiques et rapporter ce
nombre 100 ml deau analyser.

Schma n4
TP : 4 . STREPTOMETRIE
Recherche et dnombrement des Streptocoques fcaux en milieux liquides

Les Streptocoques fcaux ou Streptocoques du groupe D de la

classification de Lancefield , se prsentent sous forme de coccie Gram + ,
shriques ovodes formant des chanettes , ne possdant pas de catalase mais
possdant lantigne du groupe D.
Ils sont capables de se dvelopper en 24 48 heures 37C sur un milieu
slectif lazoture de sodium en donnant des colonies caractristiques rduisant
le TTC et qui de plus hydrolysent lesculine en 48 heures 44C aprs
repiquage dune colonie sur une glose bilie lesculine.
Leur recherche et leur dnombrement peut se faire de la mme manire
que pour les coliformes , cest dire laide de deux mthodes distinctes selon
la disponibilit ou non dune rampe de filtration et seuls les milieux de culture
changent.
Mthode de recherche en milieu liquide
Tout comme la mthode de recherche des coliformes en milieu liquide, celle de
la recherche et le dnombrement des Streptocoques fcaux fait appel deux tests
conscutifs savoir :
le test de prsomption
le test de confirmation : rserv la confirmation relle des Streptocoques
fcaux partir des tubes positifs du test de prsomption .
Test de prsomption .
A partir de leau analyser, porter asptiquement :
13

 50 ml dans un flacon contenant 50 ml de milieu ROTHE D/C,

5 fois 10 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu ROTHE D/C,
5 fois 1 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu ROTHE S/C, comme
lindique le schma n 5.
Bien mlanger le milieu et linoculum .
Incubation :
Lincubation se fait 37C pendant 24 48 heures .
Lecture :
Sont considrs comme positifs les tubes prsentant un trouble microbien,
seulement ces derniers :
- ne doivent en aucun cas faire lobjet de dnombrement
- doivent par contre, absolument faire lobjet dun repiquage sur milieu
LITSKY EVA dans le but dtre confirms.
Illustration :
Inoculum
1 X 50 ml
5 X 10 ml

5 X 1 ml

Test de prsomption
+
+
+
+
+
-

Test de confirmation .
Le test de confirmation est bas sur la confirmation des Streptocoques fcaux
ventuellement prsents dans le test de prsomption.

14

Les tubes de ROTHE trouvs positifs feront donc lobjet dun repiquage
laide dune se boucle dans tube contenant le milieu LITSKY EVA, comme
lindique le schma n6.
Bien mlanger le milieu et linoculum .
Incubation :
Lincubation se fait cette fois-ci 37C, pendant 24 heures .
Lecture :
Sont considrs comme positifs , les tubes prsentant la fois :
un trouble microbien, et
une pastille violette (blanchtre) au fond des tubes.
La lecture finale seffectue galement selon les prescriptions de la table du
NPP qui figure en annexe.
Illustration
En reprenant lexemple prcdent relatif au test de prsomption, cela suppose
que nous avons 5 tubes repiquer savoir :
2 tubes sur 5 de ROTHE D/C, et
3 tubes sur 5 de ROTHE S/C.
Inoculum

Test de
pr
s
o
m
pti
on

1 X 50 ml
5 X 10 ml

5 X 1 ml

+
+
+
+
+
-

Test de confirmation
Trouble
Pastille violette

Nbre Caractristique

0
+
+

+
+
2

+
+

+
+
-

Tableau Rcapitulatif

15

Le nombre caractristique relatif au dnombrement des Streptocoques fcaux

est donc 021 , ce qui correspond sur la table du NPP au chiffre 3.
Le rsultat final sera donc de :
3 Streptocoques fcaux dans 100 ml deau analyser

TP : 4 . STREPTOMETRIE
Recherche et dnombrement des Streptocoques fcaux en milieu liquide :
Test de Prsomption

Eau
Analyser

1 X 50 ml

ROTHE D/C

5 X 10 ml

ROTHE D/C

5 X 1 ml

ROTHE S/C

16

37C, 24 48 heures

Schma n5.

TP : 4 . STREPTOMETRIE
Recherche et dnombrement des Streptocoques fcaux en milieu liquide :
Test de Confirmation

Repiquage
sur milieu Eva

Repiquage
sur milieu Eva

17

37C , 24 heures

1
Schma n6

TP : 5
Streptomtrie par filtration
La streptomtrie par filtration est tout comme la colimtrie par filtration une
mthode rapide, simple, normalise mais ncessitant la disponibilit dune
rampe de filtration.
Tout dabord, il faudrait striliser un entonnoir laide dun bec bunsen.
Le refroidir soit avec leau analyser ou bien avec de leau distille strile.
Mettre en place de faon aseptique une membrane de 0,45 entre la
membrane poreuse et lentonnoir laide dune pince strile.
Fixer ce dernier avec la pince correspondante.
Remplir de faon aseptique lentonnoir avec 100 ml deau analyser.
Actionner la pompe vide pour permettre le passage de leau travers la
membrane.

18

 Retirer ensuite la membrane laide dune pince strile et la placer dans une
boite de Ptri de 45 mm de diamtre contenant de la glose SLANETZ et
BARTLEY.
Cette membrane sera incube 37C, pendant 24 heures.
Lecture et interprtation
Aprs 24 heures dincubation, les streptocoques fcaux apparaissent sous
forme de petites colonies rouges, marron ou roses, lisses, lgrement
bombes.
Etant donn le caractre slectif de la glose SLANETZ ; ne pousseront
thoriquement que les streptocoques fcaux.
Ne dnombrer que les boites refermant entre 15 et 300 colonies.
Le nombre de colonies trouves sera exprim dans 100 ml deau analyser.

TP : 5
Streptomtrie par filtration

Filtration de 100 ml deau

Eau
Analyser

Entonnoir
Membrane 0,45

Rampe de
Filtration
3 postes

Pompe

37C, 24 heures
19

Streptocoques fcaux
Aprs 24 heures dincubation, 37C, procder au dnombrement de toutes
les colonies caractristiques et rapporter ce nombre 100 ml deau
analyser.
Schma n7

TP : 6
Recherche et dnombrement des
Spores dAnarobies Sulfito-Rducteurs
Les anarobies sulfito-rducteurs (ASR) se prsentent sous forme de
bactries Gram +, se dveloppant en 24 48 heures sur une glose Viande Foie
en donnant des colonies typiques rduisant le sulfite de sodium (Na 2SO3) qui se
trouve dans le milieu, en sulfure qui en prsence de Fe 2+ donne FeS (sulfure de
fer ) de couleur noire.
Les spores des ASR constituent gnralement des indices de
contamination ancienne.
A partir de leau analyser :
prendre environ 25 ml dans un tube strile, qui sera par la suite soumis
un chauffage de lordre de 80C pendant 8 10 minutes, dans le but
de dtruire toutes les formes vgtatives des ASR ventuellement
prsentes.
Aprs chauffage, refroidir immdiatement le tube en question, sous
leau de robinet.

20

 Rpartir ensuite le contenu de ce tube, dans 4 tubes diffrents et

striles, raison de 5 ml par tube.
Ajouter environ 18 20 ml de glose Viande Foie, fondue puis
refroidie 45 1C, additionne dune ampoule dAlun de fer et dune
ampoule de Sulfite de sodium.
Mlanger doucement le milieu et linoculum en vitant les bulles dair
et en vitant lintroduction doxygne.
Laisser solidifier sur paillasse pendant 30 minutes environ, puis
incuber 37C, pendant 24 48 heures.
La premire lecture doit absolument tre faite 16 heures car trs
souvent les colonies des ASR sont envahissantes auquel cas on se
trouverait en face dun tube compltement noir rendant ainsi
linterprtation difficile voire impossible et lanalyse sera refaire en
utilisant des dilutions dcimales de 10-1 voire 10-2, la deuxime lecture
se fera 24 heures et la troisime et dernire 48 heures.
Dnombrer toute colonie noire de 0,5 mm de diamtre, poussant en
masse.
Interprtation des rsultats .
Il est donc impratif de reprer et de dnombrer toutes les colonies noires
poussant en masse et de rapporter le total des colonies 20 ml deau analyser.
Identification biochimique .
Certains auteurs prconisent lidentification biochimique de toute colonie
suspecte car trs souvent il y a dveloppement de colonies de Staphylocoques et
de Bacillus ct, quon prendrait tord pour des colonies de Clostridium
Sulfito-rducteur.
Pour cela il sagit de casser le tube laide dune lime mtallique 1 cm au
dessus de la colonie suspecte et de prendre exactement le centre de la dite
colonie.
Le centre de la colonie noire suspecte ( qui est en ralit blanche mais entoure
dune aurole noire ) sera alors dpos soigneusement dans un tube contenant
du bouillon T G Y ou T Y pralablement rgnr 80C pendant 15 minutes.
Placer ensuite ce tube dans un agitateur ( Vortex ) pour bien mlanger la colonie
dans le milieu puis lincuber 37C en anarobiose pendant 24 48 heures.

21

Aprs la priode dincubation, constater le trouble du milieu, puis raliser les

tapes suivantes :
Etat frais pour constater sil y a mobilit ou non ...
Coloration de Gram pour constater les types de colonies et leur coloration
Sil sagit de bacilles Gram positifs , faire un isolement sur deux boites de
glose au sang de mouton frais :
* lune sera incube 37C en arobiose ,
* lautre sera incube 37C en anarobiose .
Aprs 24 48 heures dincubation :
* slectionner les boites ayant pouss strictement en anarobiose ,
* noter le type dhmolyse ,
* faire une coloration de Gram puis une raction catalase ,
* sassurer quil sagit bien dune souche pure , sinon purifier ,
* puis ensemencer une Galerie biochimique Api 20 A incuber
toujours 37C et toujours en anarobiose .

TP : 6
Recherche et dnombrement des
Spores dAnarobies Sulfito-Rducteurs

Eau
Analyser

25 ml deau analyser

22

Chauffage 80C , 10 minutes

Refroidissement brutal sous leau de robinet
Rpartir raison de 5 ml par tube dans 4 tubes

Ajouter environ 15 ml de glose VF fondue puis refroidie 45 1C

Laisser solidifier puis incuber 37C, 16 24 puis 48 heures

Schma n8

TP : 7
Recherche de Salmonella
Les Salmonella sont des entrobactries qui se prsentent sous forme de
Bacilles Gram Ngatifs (BGN), ne fermentant pas le lactose, mais fermentant le
glucose avec production de gaz et de H 2S ; elles se divisent en deux grands
groupes : les mineures et les majeures (hautement pathognes ).
Jour 1 . Premier Enrichissement.
Le premier enrichissement seffectue sur le milieu de Slnite - Cysten D/C
rparti raison de 100 ml par flacon.
Ce dernier sera donc ensemenc laide de 100 ml deau analyser, puis incub
37C pendant 18 24 heures, comme lindique le schma n9.
Jour 2 . Deuxime enrichissement et Isolement.
Ce flacon fera lobjet :
dune part, dun deuxime enrichissement sur milieu Slnite en tubes
raison de 0,1 ml
23

 dautre part, dun isolement sur glose Hektoen.

Lincubation se fait donc 37C pendant 24 h.
Jour 3 . Lecture des boites et Identification.
Dune part, le tube de Slnite fera lobjet dun isolement,
Dautre part, la boite de glose Hektoen subira une lecture en tenant compte
du fait que les Salmonella se prsentent le plus souvent sous forme de
colonies de couleur gris bleu centre noir.
Identification morphologique et biochimique.
Cinq colonies caractristiques et distinctes feront lobjet dune identification
morphologique et biochimique qui se droulent comme suit :
Etat frais ( bacilles , mobilit ) ,
Coloration de Gram ( bacilles Gram ngatifs ) ,
Ensemencement dun tube de Kligler ( TSI ) qui sera incub 37C , 24 h
( Lactose, Saccharose, Glucose, Gaz et H2S ),
Ensemencement dun tube de glose nutritive incline qui sera incub
37C, 24 h qui servira lagglutination sur lame,
Ensemencement :
* soit dune galerie biochimique classique (ONPG, Oxydase, LDC, ODC,
ADH, Tmoin, Ure, Insole, TDA, VP, RM ),
* ou dune galerie biochimique API 20E.
Identification Antignique .
Cette dernire repose sur lagglutination sur lame de verre, partir des mmes
colonies isoles la veille sur GN incline en tubes, laide des srums de
groupes dabord OMA, OMB puis les autres aprs.

24

TP : 7
Recherche de Salmonella

Eau
Analyser

100 ml

Bouillon Slnite

25

37C , 18 24 heures

Isolement sur Hektoen

Deuxime enrichissement

37C , 24 h

Gram
Etat frais

TSI
Ure Indole TDA
ONPG
Oxydase
LDC , ODC , ADH
GN incline
API 20 E

37C , 24 h

Agglutination (OMA, OMB )

Schma n9

Idem

TP : 8
Recherche de Salmonella par filtration

La recherche de Salmonella par filtration est une mthode rapide, simple,

normalise mais ncessitant la disponibilit dune rampe de filtration.
Tout dabord, il faudrait striliser un entonnoir laide dun bec bunsen.
Le refroidir soit avec leau analyser ou bien avec de leau distille strile.
Mettre en place de faon aseptique une membrane de 0,45 entre la
membrane poreuse et lentonnoir laide dune pince strile.
Fixer ce dernier avec la pince correspondante.

26

 Remplir de faon aseptique lentonnoir avec 100 ml deau analyser, comme

le montre le schma n10.
Actionner la pompe vide pour permettre le passage de leau travers la
membrane.
Continuer remplir lentonnoir jusqu 5 litres deau analyser selon les
dernires recommandations de lOMS s'il n'y a pas de colmatage des pores de
la membrane.
Retirer ensuite la membrane laide dune pince strile et la placer dans un
flacon contenant du bouillon Slnite D/C, quon incube 37C pendant 18
24 heures.
Le lendemain , procder un isolement sur glose Hektoen qui sera incube
37C pendant 24 heures.
Le lendemain reprer les colonies caractristiques puis procder une
identification biochimique classique puis une identification antignique.

TP : 8
Recherche de Salmonella par filtration
Filtration de 250 ml 5 litres deau
Eau
Analyser

Entonnoir
Membrane 0,45

Rampe de
Filtration

Pompe

3 postes

27

Bouillon Slnite
D/C
37C, 24 heures

Gram
Etat frais
TSI
Ure Indole TDA
ONPG
Oxydase
LDC , ODC , ADH
GN incline
API 20 E
Agglutination (OMA , OMB )

Schma n10
TP : 9
Recherche de Vibrion cholrique
Les Vibrionacae se prsentent sous forme de Bacilles Gram Ngatifs
droits ou incurvs (BGN), trs mobiles, possdant une oxydase, aro-anarobies
facultatifs, fermentant le glucose sans production de gaz ni d'H2S. (hautement
pathognes ).
Jour 1 . Premier Enrichissement.
Le premier enrichissement seffectue sur le milieu Eau Peptone Alcaline 10
fois concentr rparti raison de 50 ml par flacon auquel on ajoute
asptiquement 450 ml deau analyser au moment du prlvement.
Ce dernier sera par la suite incub 37C pendant 18 24 heures, comme
lindique le schma n11.

28

Jour 2 . Deuxime enrichissement et Isolement.

Ce flacon fera lobjet :
dune part, dun deuxime enrichissement sur milieu EPA en tubes raison
de 1 ml
dautre part, dun isolement sur glose GNAB 1.
Lincubation se fait donc 37C pendant 24 h.
Jour 3 . Lecture des boites et Identification.
Dune part, le tube dEPA fera lobjet dun isolement sur GNAB 2,
Dautre part, la boite de glose GNAB 1 subira une lecture en tenant compte
du fait que les Vibrions se prsentent le plus souvent sous forme de grosses
colonies lisses et transparentes caractristiques.
Identification morphologique et biochimique.
Cinq colonies caractristiques et distinctes feront lobjet dune identification
morphologique et biochimique qui se droulent comme suit :

Etat frais (bacilles, mobilit ),

Coloration de Gram (bacilles Gram ngatifs ),
Oxydase (+),
Ensemencement dun tube de KIA qui sera incub 37C, 24 h
( Saccharose, Glucose, Gaz et H2S ),
Ensemencement dun tube de glose nutritive incline qui sera incub
37C, 24 h qui servira lagglutination sur lame,
Si l'agglutination avec l'eau physiologique et au srum polyvalent O1 est
ngative, faire une minigalerie base sur l'tude des acides amins en vue
de diffrencier entre les Vibrions, les Pleisiomonas et les Aromonas
selon le tableau suivant :
Vibrions
Aromonas
Pleisiomonas

LDC
+
+

ODC
+
+

ADH
+
+

S'il s'agit du genre Vibrion, rpondre : Vibrion NON Agglutinable (NAG).

Si l'agglutination avec l'eau physiologique et au srum polyvalent O1 est
positive, il s'agit d'un vibrion rough (auto-agglutinable).

29

 Si l'agglutination avec l'eau physiologique est ngative et positive au

srum polyvalent O1, rpondre : Vibrion cholrique.

TP : 9
Recherche de Vibrion cholrique

Eau
Analyser

450 ml

30

Bouillon EPA 10X[ ]

37C, 18 24 heures
1 ml
Isolement sur GNAB 1

Deuxime enrichissement

37C, 24 h

Oxydase
Gram
Etat frais

KIA
LDC, ODC, ADH
GN incline

37C, 24 h

Agglutination
Idem
Schma n11

TP 10
Recherche de Staphylococcus aureus par la mthode de GC
Staphylococcus aureus se prsente sous forme de cocci, en grappe de
raisin, Gram +, possdant une catalase et une coagulase.
Selon la disponibilit des milieux de culture, trois techniques diffrentes sont
recommandes pour la recherche de Staphylococcus aureus savoir :
mthode de Baird Parker
mthode denrichissement sur milieu de Giolliti Cantonii
mthode denrichissement sur milieu de Chapman .
Dans le cas des poissons, la recherche de Staphylococcus aureus par la
mthode d'enrichissement sur milieu de Giolliti Cantonii est recommande.
Mthode denrichissement au milieu de Giolliti Cantonii .
31

Prparation du milieu denrichissement.

Au moment de lemploi, ouvrir asptiquement le flacon contenant le
milieu de Giolliti Cantonii pour y ajouter 15 ml dune solution de Tllurite de
Potassium.
Mlanger soigneusement. Le milieu est alors prt lemploi.
Ensemencement.
A partir des dilutions dcimales retenues (10-1 10-3), porter
asptiquement 1 ml par dilution dans un tube vis strile.
Ajouter par la suite environ 15 ml du milieu denrichissement comme
lindique le schma n 12. Bien mlanger le milieu et linoculum.
Incubation.
Lincubation se fait 37C pendant 24 48 heures.
Lecture.
Seront prsums positifs, les tubes ayant virs au noir.
Pour sassurer quil sagit bien dun dveloppement de Staphylococcus aureus,
ces tubes feront lobjet dune confirmation par isolement sur glose Chapman
pralablement fondue, coule en boites de ptri et bien sches.
Les boites de Chapman ainsi ensemences seront incubes leur tour 37C
pendant 24 48 heures.
Aprs ce dlai, reprer les colonies suspectes savoir les colonies de taille
moyenne, lisses, brillantes, pigmentes en jaune et pourvues dune catalase et
dune coagulase.
Expression des rsultats.
- Si la dilution 10-3, le tube a noirci au bout de 24 heures dincubation, et
lisolement sur Chapman, il y a pas de colonies caractristiques ; ce tube
est considr comme positif et le dnombrement correspond l'inverse de
la dilution en question savoir 1000 Staphylococcus aureus par gramme de
produit.
- Si par contre, il y a noircissement uniquement la dilution 10 -1 et
apparition de colonies caractristiques sur milieu de Chapman
correspondant, il faut tenir compte de la dilution en question et le nombre

32

rel de Staphylococcus aureus correspond linverse de la dilution soit 10

par gramme de produit.
Pour sassurer quil sagit bien de colonies de Staphylococcus aureus, effectuer
sur 2 3 colonies de chaque boite des tests biochimiques rapides savoir :
- une preuve la catalase

( laide de leau oxygne ),

- une preuve la coagulase ( laide de plasma de lapin ).

Quelques caractres biochimiques de diffrentes espces de staphylocoques sont
rsums dans le tableau ci - aprs.
Staphylocoque
Catalase
Coagulase
Mannitol en
anarobie
Rsistance la
Novobiocine
(5 Micro-gr )

Aurus
+
+
+

Intermdius
+
+
-

Saprophyticus
+
-

Epidermitis
+
-

TP 10
Recherche de Staphylococcus aureus par la mthode de GC
A partir des dilutions dcimales :

10-1

10-2

1ml
15ml

10-3

1ml
15ml

1ml
15ml

33

GC

GC

GC

37C, 24 48 h

Raction Positive

Raction Ngative

Isolement sur Chapman

37C , 24 48 h
Catalase , coagulase

Schma n12
Table NPP
1 X 50 ml

5 X 10 ml

5 X 1 ml

0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

0
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
4

0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
0

Nombre
Limites de confiance
caractristique Infrieure Suprieure
<1
1
2
1
2
3
2
3
4
3
5
5

<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5

4
6
4
6
8
6
8
11
8
13
13

34

1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
5
5
5
5
5
5

0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
5
0
1
2
3
4
5

1
3
4
6
3
5
7
9
5
7
10
12
8
11
14
18
21
13
17
22
28
35
43
24
35
54
92
160
>240

<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
1
2
<0,5
1
3
3
2
3
4
5
6
4
5
7
9
12
15
8
12
18
27
39

4
8
11
15
8
13
17
21
13
17
23
28
19
26
34
53
66
31
47
59
85
100
120
75
100
140
220
450

35