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TECHNIQUES:

Principes de la
chromatographie

Dfinition
La chromatographie est une mthode physique de sparation base sur
les diffrentes affinits dun ou plusieurs composs lgard de deux
phases (stationnaire et mobile).
L'chantillon est entran par la phase mobile au travers de la phase
stationnaire qui a tendance retenir plus ou moins les composs de
l'chantillon l'aide de diffrentes interactions. Lchantillon est adsorb
puis dsorb sur la phase stationnaire, ou est plus ou moins soluble dans
la phase mobile.

Types de chromatographies
Type

Critre de sparation

Adsorption

Polarit

Partage

Solubilit

Exclusion

Taille des molcules

changeuse dions

Charge ionique

Affinit

Structure des protines


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Il est rare de pouvoir associer une mthode chromatographique un seul phnomne.

Types de chromatographies

Chromatographie
changeuse dions

Chromatographie
dexclusion

Chromatographies dadsorption
Phase mobile

Nom

Gaz

Chromatographie en phase
vapeur (CPV) ou en phase
gazeuse (GC)
Chromatographie couche mince
(CCM ou TLC) ou clair
Chromatographie liquide haute
performance (CLHP ou HPLC)

Liquide
Liquide

Utilit de la chromatographie
Selon la quantit de produit appliqu en chromatographie, on sen sert pour:
Analyser < 1 mg de produit par CCM, HPLC ou CPV
Sparer ou purifier les produits dune raction par chromatographie clair
ou HPLC (50 mg 15 g)
Doser des produits. Lanalyse quantitative se fait avec un talon interne ou
aprs prparation dune courbe de calibration.

Chromatographie dadsorption: principe


La chromatographie dadsorption est base sur le partage des soluts
entre ladsorbant solide fixe et la phase mobile. Chacun des soluts
est soumis une force de rtention par adsorption et une force
dentranement par la phase mobile. Lquilibre qui en rsulte aboutit
une migration diffrentielle des soluts de lchantillon analyser, ce
qui permet leur sparation.
Les sparation sont bases sur le principe de polarit, cest--dire
lexistence de diples dans une structure molculaire.
Adsorbants possibles (du moins polaire au plus polaire):
Papier, cellulose, amidon, carbonate de sodium, gel de silice, alumine,
charbon activ.

Adsorbants
Les adsorbants sont sous forme de granules
calibrs. La sparation est meilleure, mais
plus lente si les grains sont fins.
Plus un adsorbant est actif, plus il retient
fortement les composs polaires. La
sparation se fait par ordre croissant de leurs
forces dinteraction avec les composs
polaires.

Polarit des groupements


fonctionnels neutres
R-H

Un compos peu polaire


est peu adsorb.
Un compos polaire est
trs adsorb.

R-X

Polarit croissante

Le gel de silice est polaire, il


a par consquence une plus
grande affinit pour les
composs polaires:

R-NO2
O
R

O
OR

O
R

O
R

NR2

R-NH2

R-OH

Ar-OH

O
R

OH

Les molcules charges ne migreront habituellement pas sur gel de


silice, elles sont trop polaires.

Phase mobile
Hexanes

Il faut que le solut soit soluble dans lluant.


Il est possible de faire des mlanges de
solvants pour changer sa polarit.

CCl4
Polarit croissante

Une phase mobile liquide est appele luant.


Cest elle qui fait migrer les composs, son
choix est donc important.

Benzne, Tolune
Et2O
CH2Cl2
AcOEt
MeOH, EtOH
AcOH

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Choix de lluant
Deux facteurs interviennent lors de linteraction entre lluant et le solut
(mlange de composs sparer):
la solubilit: on doit tre en mesure de dissoudre le solut dans lluant
pour que la migration se fasse.

la polarit de lluant va dterminer quelle vitesse le compos migre.

Moins un compos est polaire, moins il saccroche ladsorbant, plus il


migre avec lluant.
Choix dun luant peu polaire
Plus un compos est polaire, plus il saccroche ladsorbant, moins il
migre avec lluant.
Choix dun luant polaire

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Chromatographie sur couche mince


Ladsorbant (silice, 250 m dpaisseur) est fix sur une plaque (Al, verre)
commercialement disponible.
Le produit/mlange de produits est dpos sur la plaque laide dun
capillaire.
Les produits sont rvls aprs lution.

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Prparation dun capillaire


Au laboratoire, les capillaires sont prpars au dpart de pipettes Pasteur:
Chauffer la partie centrale de la pipette dans la flamme dune torche au
propane en tournant le tube jusqu ce quil soit mou.
Retirer de la flamme et tirer la pipette.
Laisser refroidir et couper la partie fine du milieu.

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Utilit des CCM


1. CCM analytiques (250 m, 2.5 x 7.5 cm)

Vrifier la puret dun produit, quelques microgrammes suffisent


Suivre lavancement dune raction
Vrifier lefficacit dune extraction liquide-liquide
Dterminer lluant pour la chromatographie clair sur gel de silice

2. CCM prparatives (1000 m, 20 x 20 cm)


Purification de petites quantits de produit (jusqu ~100 mg sur une
plaque de 20 x 20 cm). La bande qui contient le produit purifi est
gratte, puis la silice est extraite avec un solvant.

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Prparation de la CCM

1. On trace un trait ~1 cm du bord infrieur de la plaque.


On marque les futur dpts, espacs denviron 0.5 cm.
On identifie chaque produit quon fera luer.
A

B C

2. Le produit/mlange doit toujours tre dilu dans


un solvant (Et2O, CH2Cl2, AcOEt) assez volatil.
Dans un vial, dposer 1 goutte ou 2-3 cristaux de
produit + ~0.5 mL solvant.
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lution de la CCM
3. On utilise un capillaire pour dposer le produit sur la
plaque puis on laisse vaporer le solvant. On peut spotter
2-3 fois si lchantillon est trs dilu.

4. lution: prparer une cuve dlution avec


Bcher de 250 mL avec un papier absorbant lintrieur
Verre de montre
Y verser 10 mL dluant (ex. 8 mL Hex + 2 mL AcOEt)
Placer la CCM dans la cuve en veillant ce que la ligne
soit au-dessus du liquide.
Faire luer jusqu ~5 mm du bord et tracer un trait pour
marquer le front de solvant.
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Rvlation de la CCM
lil nu: si le produit est color
la lampe UV: les molcules qui absorbent les UV 254 nm seront
visibles (noyaux aromatiques par exemple).
Avec un rvlateur chimique: liode est le premier rvlateur tester,
car il est non destructif. Il permet de rvler des doubles liaisons et les
halognures. Liode est vapor chaud ou dans la hotte.
De nombreux autres existent: KMnO4, acide phosphomolybdique,
vanilline, ninhydrine

UV

KMnO4

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Mesure du Rf
Le Rf (rapport frontal ou rtention frontale) est caractristique dun produit
dans un luant donn et pour une phase stationnaire donne.

Produit moins polaire, moins accroch


L

l1
l2

Rf

Produit plus polaire, plus accroch

Hauteur de migration
valeur entre 0 et 1
Hauteur du front de solvant
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Influence de lluant
Lorsque la polarit du solvant augmente, le Rf augmente. Le Rf
augmente, puis diminue.
Pour faire une sparation de deux produits par chromatographie, on
cherche un luant qui donne le plus grand Rf possible, avec un Rf pour
le produit le moins polaire autour de 0,3.

100% Hexane

95% Hexane 90% Hexane 80% Hexane 70% Hexane


5% A cOEt 10% AcOEt 20% AcOEt 30% AcOEt

Polarit de lluant

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CCM bidirectionnelles
Cest une exprience qui permet de prouver si un produit dcompose sur
la silice, ou si un spot de la CCM contient en fait deux produits.

Si lu dans un autre solvant


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