5.

Cellules souches et Médecine régénérative

(FIV; transfert nucléaire)

5.1 Cellules souches et régénération du tissu musculaire
ü Les pathologies liées à l’unité motrice
 5.1. Cellules souches et régénération du tissu musculaire

ü Dystrophies musculaires : implication de multiples protéines

Dystrophine : protéine sous-

membranaire essentielle pour
l’intégrité structurelle de la
fibre musculaire

• Nombreuses mutations altérant le fonctionnement de la Dystrophine : vulnérabilité

des fibres au stress mécanique
 5.1 Cellules souches et régénération du tissu musculaire
ü Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) : absence totale de
dystrophine

Révélation par immunofluorescence de la dystrophine dans des

coupes transversales de muscle
A : sujet normal; B : DMD

ü Dystrophie musculaire de Becker (DMB)

Dystrophine est soit de taille anormale
soit produite en quantité insuffisante
 5.1 Cellules souches et régénération du tissu musculaire

ü Modèles animaux pour la pathologie DMD

souris mdx (Muscular dystrophy X-linked)
chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy)

dKO Souris mdx/Utrophine

McGreevy et al., 2015, Disease models and mechanisms

 5.1 Cellules souches et régénération du tissu musculaire
ü De nouveaux modèles animaux pour la pathologie DMD ………

A 12- week-old DMD KO rabbit and its WT littermate showing significant forelimb paralysis in the KO rabbit
5.1 Cellules souches et régénération du tissu musculaire

ü Disruption of dystrophin
expression in the skeletal
muscle of DMD KO rabbits

Immunofluorescence staining of muscle

sections from WT and DMD KO rabbits
with mouse monoclonal antibodies against
dystrophin

ü Impaired physical
activity in DMD KO
rabbits
5.1 Cellules souches et régénération du tissu musculaire

üMuscular dystrophy in
DMD-KO rabbits
(A,B) Analysis of H&E- and
Masson’s trichrome-stained
sections of gastrocnemius from
5-month-old (A) and 12-month-old
(B) WT and DMD KO rabbits
DMD KO rabbits displayed
myopathy with excessive fiber
size variation (red arrows), fiber
fracture (green arrows), fibrosis
(black arrows) and central
nucleated fibers (blue rectangle)
(C,E) Quantification of mean
gastrocnemius muscle fiber area
in WT and DMD KO rabbits at 5
(C) and 12 (E) months of age
(D,F) Quantification of centrally
nucleated fiber (CNF) percentage
in WT and DMD KO rabbits at 5
(D) and 12 (F) months of age
5.1 Cellules souches et régénération du tissu musculaire
ü Thérapies cellulaires possibles pour les dystrophies musculaires

3 2
11 Biopsie musculaire chez un
donneur sain : isolement de
myoblastes par digestion
enzymatique

Prolifération in vitro

Injection intramusculaire de
cellules myogéniques saines

McCullagh and Perlingeiro, 2014 Advanced Drug Delivery Reviews

 5.1 Cellules souches et régénération du tissu musculaire
ü Transplantation de myoblastes normaux : 1ère approche

ü Plusieurs injections sont effectuées

avec une seringue Hamilton de façon
perpendiculaire à l’axe du muscle

ü Une bonne partie des myoblastes

meurent dans les trois jours suivant la
greffe (nécrose cellulaire/alizarine
rouge ou apoptose/caspase3 activée)

ü Prolifération et fusion des myoblastes

ayant survécu avec les fibres
endommagées : fibres hybrides
exprimant les protéines du donneur
(dystrophine)
 5.1 Cellules souches et régénération du tissu musculaire
ü Transplantation de myoblastes normaux et ses limites

1. Faible dispersion des myoblastes hors du site

d’injection : nécessité d’injections multiples
(incapacité à traverser la matrice extracellulaire)

2. Mort rapide des myoblastes suite à leur

injection. Les neutrophiles (2b) vont détruire la
majorité des myoblastes greffés (2a). Une faible
proportion va survivre (20 à 30%) et proliférer
pour former des fibres musculaires (2c) : nécessité
d’injecter un grand nombre de cellules

3. Rejet à long terme des myoblastes et des

fibres exprimant des antigènes du donneur (forte
infiltration de lymphocytes entre les fibres et autour
des vaisseaux sanguins (flèche)) : nécessité d’un
traitement immunosuppresseur
5.1 Cellules souches et régénération du tissu musculaire
ü Sources variées de cellules souches pour les dystrophies musculaires

Muscle derived stem cells

- Capacité d’auto-renouvellement
- Différenciation en cellules
mésodermiques

Hosoyama et al., 2012, Am J Stem Cell

 5.1 Cellules souches et régénération du tissu musculaire

1. Prolifération des MuStem cells

Replated on gelatin-coated matrix,

Under nonadherent conditions, MuStem myospheres gave rise to spindle-shaped cells
cells proliferate by generating myospheres (arrow) and poorly adherent round cells

(arrowhead)
5.1 Cellules souches et régénération du tissu musculaire
2. Caractérisation phénotypique des MuStem cells

Arrow : positive cells

Arrowhead : negative cells

Immunolabelings for myogenic markers :

expression of Pax7, MyoD, and Myf5 by
round cells and spindle-shaped cells

Ø MuStem cells mainly correspond to committed muscle cells at an early

stage of the myogenic lineage
5.1 Cellules souches et régénération du tissu musculaire
3. Différenciation in vitro des MuStem cells

After myogenic differentiation, MuStem

cell–derived cultures displayed numerous
multinucleated myotubes that were
highly positive for the developmental
isoform of MyHCd

Différenciation en myocytes

Différenciation en ostéocytes

Différenciation en adipocytes
 5.1 Cellules souches et régénération du tissu musculaire

4. Greffe des MuStem cells dans un modèle animal de DMD

Five systemic injections of 107 wild-type Mucells/kg on 3 immunosuppressed

GRMS dogs at intervals of 2 to 4 weeks
 5.1 Cellules souches et régénération du tissu musculaire

5. Expression de la dystrophine après injection de MuStem cells :

RT-PCR et Western-blot analysis

 5.1 Cellules souches et régénération du tissu musculaire
5. Expression de la dystrophine après injection de MuStem cells

Ø The systemic delivery of MuStem cells allows an efficient homing of these cells
to the muscle, resulting in long-term dystrophin expression
5.1 Cellules souches et régénération du tissu musculaire
Mai 2015
ü Où en est la recherche?

Ø Pathophysiology of GRMD dog is defined by complex transcriptional remodelling

Ø MuStem cell administration enhances long-term skeletal muscle fibre regeneration

• MUSNT1 is a key regulator of myogenic differentiation and fusion

Ø MuStem cell administration enhances protein degradation in an ubiquitin-dependent

manner : clearance of dysfunctional or denaturated proteins (dystrophyin)
 5.2 Cellules souches et régénération du tissu nerveux

ü Variété de pathologies neurodégénératives associées à une perte neuronale

ü Maladie d’Alzheimer
Perte de neurones corticaux et hippocampiques

ü Maladie de Huntington
Perte de neurones gabaergiques striataux
 5.2 Cellules souches et régénération du tissu nerveux

ü Variété de pathologies neurodégénératives associées à une perte neuronale

Perte de neurones dopaminergiques du

mésencéphale (substance noire)

ü Manifestations cliniques : rigidité, hypokinésie (mobilité anormalement réduite),

tremblements
5.2 Cellules souches et régénération du tissu nerveux

ü Où en est la recherche?
5.2 Cellules souches et régénération du tissu nerveux

ü Où en est la recherche?
5.2 Cellules souches et régénération du tissu nerveux

ü Où en est la recherche?

Nature, 2017

Modèle animal de la maladie de Parkinson :

Primate non humain traité par une neurotoxine
= MPTP administré par voie intraveineuse
5.2 Cellules souches et régénération du tissu nerveux

ü Mécanisme d’action de la neurotoxine MPTP

Immunostaining of tyrosine hydroxylase (TH)–positive neurons in the substantia nigra

pars compacta (SNpc) and terminals in the striatum
Jackson-Lewis V and Przedborski S,
Nature Protocols , (2007)
5.2 Cellules souches et régénération du tissu nerveux

1. Générer des progéniteurs neuronaux

dopaminergiques à partir de cellules souches
pluripotentes induites de patients sains et
atteints de la maladie de parkinson
 5.2 Cellules souches et régénération du tissu nerveux

2. Greffe des progéniteurs neuronaux dopaminergiques

dans le putamen de singes traités au MPTP
5.2 Cellules souches et régénération du tissu nerveux

3. Déterminer si les cellules greffées fonctionnent

comme des neurones dopaminergiques (TEP)

La 18F-dopa se comporte comme la L-dopa:

passage de la BHE puis le composé est capté par
les terminaisons dopaminergiques présynaptiques
au niveau du striatum
11C-PE2I = analyse de l’expression du DAT
Conclusions : essais cliniques

ü Les cellules souches au coeur de la recherche clinique

Conclusions : essais cliniques

ü Médecine régénérative de l’oeil à partir de cellules souches

Conclusions : essais cliniques

The end!