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UFR CHIMIE‐BIOCHIMIE
Licence Sciences et Technologies
mention Biochimie
Lipides membranaires
Pr Agnès Girard‐Egrot
Equipe Génie Enzymatique, Membranes Biomimétiques et
Assemblages Supramoléculaires
ICBMS – UMR 5246
Bâtiment CPE
Tel: 04 72 44 85 32
Fax: 04 72 44 79 70
Email: agnes.egrot@univ‐lyon1.fr
PLAN
1) INTRODUCTION .................................................................................................................................................. 2
1.1. RÔLE ET COMPOSITION DES MEMBRANES ............................................................................................. 2
1.2. VISUALISATION DES MEMBRANES .......................................................................................................... 4
2) LIPIDES MEMBRANAIRES ................................................................................................................................ 7
2.1. DIFFERENTES CLASSES DE LIPIDES MEMBRANAIRES ......................................................................... 7
2.1.1. Phosphoglycérides ..................................................................................................................................... 8
2.1.2. Glycoglycérides ......................................................................................................................................... 9
2.1.3. Sphingolipides ......................................................................................................................................... 10
2.1.4. Stérols ...................................................................................................................................................... 12
2.1.5. Acides gras .............................................................................................................................................. 13
2.2. CARACTÉRISTIQUES COMMUNES DES LIPIDES MEMBRANAIRES .................................................. 14
2.3. COMPOSITION ET CARACTÉRISATION DES LIPIDES D’UNE MEMBRANE...................................... 14
2.3.1. Analyse de la composition lipidique ........................................................................................................ 14
2.3.2. Caractérisation des chaînes hydrocarbonées .......................................................................................... 16
2.3.3. Composition lipidique des membranes biologiques ................................................................................ 17
2.4. SYSTEMES MODÈLES LIPIDIQUES .......................................................................................................... 18
2.4.1. Liposomes ................................................................................................................................................ 18
2.4.2. Monocouches lipidiques .......................................................................................................................... 21
2.4.3. Bicouches lipidiques planes..................................................................................................................... 22
3) DÉTERGENTS ..................................................................................................................................................... 24
3.1. NATURE ET PROPRIETES DES DETERGENTS ....................................................................................................... 24
3.2. SOLUBILISATION DES LIPOSOMES PAR LES DETERGENTS .................................................................................. 27
3.3. SOLUBILISATION DES MEMBRANES PAR DES DETERGENTS. ............................................................................... 29
4) POLYMORPHISME LIPIDIQUE...................................................................................................................... 30
4.1. EFFET HYDROPHOBE......................................................................................................................................... 30
4.2. ORGANISATIONS STRUCTURALES DES PRINCIPALES PHASES DU POLYMORPHISME LIPIDIQUE ........................... 33
4.3. DIAGRAMME DE PHASE .................................................................................................................................... 34
4.4. CONCEPT DE FORME ......................................................................................................................................... 36
4.5. COMPENSATION DE FORMES ............................................................................................................................. 38
4.6. CARACTERISATION DES PHASES DU POLYMORPHISME LIPIDIQUE ..................................................................... 39
4.6.1. Cryofracture ............................................................................................................................................ 39
4.6.2. Spectroscopie RMN ................................................................................................................................. 40
4.7. IMPORTANCE DES DIFFERENTES PHASES DANS LES MEMBRANES BIOLOGIQUES ................................................ 44
4.8. MECANISME DE FUSION LIPIDIQUE ................................................................................................................... 45
5) FLUIDITE MEMBRANAIRE............................................................................................................................. 46
5.1. INTRODUCTION ................................................................................................................................................. 46
5.2. DETERMINATION EXPERIMENTALE DE LA FLUIDITE .......................................................................................... 47
5.2.1. Dépolarisation de fluorescence .............................................................................................................. 47
5.2.2. Valeur de la fluidité membranaire ........................................................................................................... 50
5.3. FLUIDITE ET CONFORMATION DES CHAINES HYDROCARBONEES ....................................................................... 51
5.3.1. Conformations ordonnées et désordonnées des lipides ........................................................................... 51
5.3.2. Détection expérimentale des transitions ordre désordre .................................................................... 52
5.3.3. Transitions conformationnelles dans les phases lipidiques ..................................................................... 55
5.3.4. Conformation des chaînes et fluidité membanaire .................................................................................. 57
5.4. ROLE DE LA FLUIDITE MEMBRANAIRE .............................................................................................................. 60
5.5. MICRODOMAINES MEMBRANAIRES ................................................................................................................... 61
ANNEXES ................................................................................................................................................................. 63
ANNEXE 1 : TECHNIQUE DE FOLCH ......................................................................................................................... 63
ANNEXE 2 : CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM) ................................................................................ 63
ANNEXE 3 : CHROMATOGRAPHIE GAZ-LIQUIDE (CGL) ........................................................................................... 63
ANNEXE 4 : NOTIONS DE SPECTROSCOPIE RMN ..................................................................................................... 64
1
La majeure partie de ce cours est tiré de « Biochimie et Biophysique des Membranes » de
E. Schechter, seconde édition (Masson, Paris, 1997), noté Réf. 1; « Progress in Protein-lipid
interactions. (A. Watts & J.J. H.H. M. de Pont, eds) de B. De Kruijff et al. (Elsevier 1985), noté
Réf. 2 ; « Biomembranes. Molecular structure and function » R. B. Gennis (Springer-Verlag,
New York, 1989), noté Réf.3. La provenance des figures est indiquée au bas de chaque légende.
1) INTRODUCTION
1.1. RÔLE ET COMPOSITION DES MEMBRANES
Les membranes biologiques sont des structures omniprésentes délimitant les cellules et les
organites intracellulaires (mitochondries, noyaux, chloroplastes, lysosomes, …). Le rôle premier
de ces membranes est de permettre des compartimentations. La membrane cytoplasmique
délimite la cellule et sépare les milieux intracellulaire et extracellulaire. Le rôle de cette
membrane est de maintenir des compositions différentes entre le cytosol et le milieu externe ; de
même, les membranes des organites intracellulaires permettent le maintien de compositions
différentes entre le cytosol et le lumen des organites. `
La membrane cytoplasmique est composée de lipides et de protéines. La fonction de
compartimentation est dévolue aux lipides membranaires.
Les lipides sont des molécules amphiphiles qui possèdent une partie polaire et une partie
apolaire situées dans deux régions distinctes de l’espace (Fig. 1.1).
Figure 1.1. Modèle moléculaire d'un lipide (gauche) et organisation des lipides en bicouche
formant une vésicule close délimitant un intérieur aqueux (droite). D’après la Réf. 1
En milieu aqueux, l’organisation la plus stable des lipides est celle qui permet de
minimiser les interactions entre les parties hydrophobes et les molécules d’eau. Les lipides
s'organisent le plus souvent en bicouche, partie apolaire au centre, où l'eau n'a pas accès. La
partie polaire étant en contact avec le milieu aqueux de part et d’autre de la bicouche. La
structure se referme sur elle-même formant une vésicule close, qui sépare un compartiment
2
interne aqueux du milieu externe, également aqueux, ce qui est le propre de la membrane
biologique.
La présence de cette structure close continue empêche le libre passage des macromolécules
d'un compartiment à un autre ; de plus, l'existence de la partie apolaire au centre de la bicouche
bloque pratiquement toute diffusion d'ions (K+, Na+, Cl-...) et freine considérablement la
diffusion de solutés organiques polaires (sucres, acides aminés, ...). Seuls quelques solutés très
hydrophobes diffusent librement et rapidement à travers la bicouche ; c'est le cas des hormones
stéroïdes.
Bien que la compartimentation est la condition sine qua non de la vie cellulaire, il n’en
demeure pas moins que la cellule ou l’organite a besoin d'échanges continuels de matière,
d'énergie et d'information de part et d’autre de la membrane qui les délimite. Ces échanges sont
possibles grâce à la présence de protéines, second constituant majeur des membranes.
Les protéines membranaires se classent en trois grandes catégories: les protéines
périphériques (protéines extrinsèques), les protéines transmembranaires (ou intégrales) et les
protéines avec un pied d'ancrage (ces deux dernières correspondant aux protéines intrinsèques).
Les protéines périphériques ne sont associées à la membrane que d'une manière
relativement faible par des interactions électrostatiques avec les parties polaires des lipides ou les
parties polaires des protéines membranaires qui émergent hors de la membrane (Fig. 1.2). Leur
localisation leur permet de participer à des réactions qui s’effectuent à l’interface entre la
membrane et les compartiments aqueux.
(a) (d)
(c)
(b)
3
Leur disposition dans la membrane leur permet de participer à des transformations et à des
réactions qui s’effectuent de part et d’autre de la membrane. Elles sont impliquées dans le
transport de matière (canaux ioniques, transporteurs, …) et le transfert d’information
(récepteurs).
Les protéines à pied d'ancrage sont des protéines associées de manière covalente à des
acides gras, qui joue le rôle d'une ancre s'enfonçant dans la partie lipidique. Parmi ces protéines
certaines sont solubles et le demeurent malgré leur liaison avec des acides gras, d'autres sont
normalement membranaires et l'acide gras ne fait que renforcer l'interaction membrane-protéine.
Ces protéines, comme les protéines intégrales, sont impliquées dans l’échange d’information.
Les différents constituants (lipides, protéines) d'une membrane ne sont pas reliés entre eux
par des liaisons de covalence. Les interactions entre lipides et protéines sont de nature
hydrophobe au centre de la membrane, polaire aux interfaces. Elles se font et défont
continuellement. De ce fait la membrane a un caractère dynamique, les lipides et les protéines
étant animés de mouvements divers conférant à la membrane une certaine fluidité.
L'épaisseur d'une bicouche lipidique est au plus égale à 2 fois la plus grande longueur d'un
lipide, soit environ 6 nm. L'épaisseur d'une membrane du fait de la présence de protéines peut
être légèrement supérieure. En tout état de cause, elle est inférieure à 10 nm, et seules les
techniques de microscopie électronique permettent de visualiser les bicouches lipidiques et les
membranes.
Les techniques utilisées sont les suivantes :
4
Figure 1.3. Cliché de microscopie électronique d’une cellule (hépatocyte) en couche mince
faisant apparaître différents compartiments délimités par leur membrane. m.p. : membrane
plasmique ; m.n. : membrane nucléaire ; mito : membranes mitochondriales.
Agrandissement : 10 000 . D’après la Réf. 1.
A plus fort grossissement, il est possible d’estimer l’épaisseur des membranes (de 8 à 10
nm). Les membranes présentent invariablement un aspect tri-lamellaire : deux couches sombres
de 2 à 3 nm d'épaisseur séparées par une couche claire de 2 à 3 nm d'épaisseur (Fig. 1.4). Les
couches sombres correspondent principalement aux parties hydrophiles des membranes (parties
polaires des lipides et des protéines qui émergent) sur lesquels l’agent contrastant s’est déposé ;
la couche claire correspond à la partie centrale hydrophobe de la membrane.
Figure 1.4. Vue agrandie d’une membrane cytoplasmique caractérisée par un aspect
trilamellaire : 2 couches sombres (2 à 3 nm d'épaisseur) séparées par une couche claire (2 à 3
nm d'épaisseur). Agrandissement : 100 000. D’après la Réf. 1.
5
2) La cryofracture est une autre technique qui permet d'éviter les traitements
chimiques inhérents à l'observation des couches minces. Elle comporte 4 étapes principales (Fig.
1.5, A) : (i) est congélation ultra-rapide de l’échantillon afin de figer sa structure initiale ; (ii)
fracture de l’échantillon à très basse température (<170 K) et sous vide poussé (<10-6 Torr) ; (iii)
réplique immédiate de la surface de la fracture par un dépôt de vapeur de métaux lourds de 1 à 2
nm d’épaisseur et renforcement de cette réplique par une couche de carbone de 10 à 20 nm
d'épaisseur ; (iv) digestion de la matière organique, lavage et observation de la réplique
métallique au microscope électronique. Comme la fracture suit préférentiellement les surfaces de
moindre résistance, la cryofracture permet une visualisation des parties intimes des membranes,
le centre de la bicouche lipidique (Fig. 1.5, C & B).
Figure 1.5. Principe de la cryofracture en microscopie électronique (A) et clichés d’un liposome
(B : agrandissement : 80 000) et d’une membrane cytoplasmique d’E. coli (C : agrandissement :
50 000). D’après la Réf. 1.
6
3) La cryomicroscopie électronique est une technique qui permet la visualisation directe
des membranes sans aucun prétraitement. Comme en cryofracture, l’échantillon est vitrifié par
un refroidissement rapide. Toutefois, contrairement à la cryofracture, c’est la membrane elle-
même qui est observée et non une réplique métallique (Fig. 1.6). Ceci est possible du fait que :
(i) l’échantillon est observé à très basse température ce qui évite la déshydratation même sous le
vide poussé qui règne à l’intérieur du microscope ; (ii) l’observation s’effectue à faible dose
électronique, ce qui évite la dégradation du matériel biologique.
Figure 1.6. Cryomicroscopie de vésicules lipidiques. La double couche délimitant les vésicules
est clairement apparente (agrandissement : 100 000). À plus fort grossissement (encart), on
distingue les parties polaires de la bicouche (parties sombres) séparant la partie hydrophobe
centrale (partie claire). D’après la Réf. 1.
2) LIPIDES MEMBRANAIRES
Le rôle des lipides dans la membrane est essentiellement structural. Cependant, certains
lipides possèdent des propriétés fonctionnelles importantes. Ils peuvent jouer le rôle de
récepteurs ou être à l’origine de seconds messagers intracellulaires.
7
2.1.1. Phosphoglycérides
Le groupe phosphoryle des phospholipides est ionisable. Son pK est compris entre 1 et 2 :
il porte une charge négative au pH physiologique. La charge globale du phospholipide dépend
donc de la nature du substituant X. S’il est lui-même neutre, le phospholipide est chargé
négativement (phosphatidylglycérol, phosphatidylsérine, phosphatidylinositol). Si le substituant
X porte une charge positive, le phospholipide est électriquement neutre (zwitterionique). Ces
phospholipides neutres sont amphotères dans la mesure où leur électroneutralité est le résultat de
la compensation d’une charge négative par une charge positive.
8
Figure 2.1. Structure des diacylphosphoglycérides (Phospholipides). D’après la Réf 1.
b) Les plasmalogènes sont des phosphoglycérides dans lesquels une des chaînes
hydrocarbonées est associée au glycérol par une liaison vinyl-éther. Ceux sont des éthers de
glycérides. La liaison éther se situe le plus souvent en position C1 (Fig. 2.2.). Les plasmalogènes
sont abondants dans la gaine de myéline, le réticulum sarcoplasmique cardiaque, le système
nerveux périphérique et le muscle.
H2
H3C n(H2C) C C O C
H H
H3C n(H2C) C O CH O
O C O P O X
H2
O-
Figure 2.2. Structure générale d’un plasmalogène.
2.1.2. Glycoglycérides
9
galactose (Fig. 2.3). Ils sont très abondants dans les membranes photosynthétiques des algues,
des chloroplastes et de certaines bactéries.
2.1.3. Sphingolipides
10
Figure 2.4. Structure des sphingolipides. D’après la Réf. 1.
a) Les Sphingophospholipides possèdent les mêmes types de têtes polaires que les
phospholipides. À titre d’exemple, la sphingomyéline (un des constituants principals des
membranes biologiques) est un sphingophospholipide substitué sur l’alcool primaire de la
céramide par un groupement phosphocholine. On trouve d’autres sphingolipides substitués sur la
céramide par la phosphoryléthanolamine, le phosphorylinositol, le phosphorylglycérol.
b) Les Sphingoglycolipides sont des dérivés de la céramide associés à des sucres par
l’intermédiaire d’une liaison glycosidique sur l’alcool primaire de la céramide. Ces sucres
peuvent varier du simple monosaccharide à des oligosaccharides plus ou moins complexes ; ils
constituent la classe des cérébrosides. Certains possèdent en plus des molécules d’acide sialique
(acide N-acétylneuraminique) branchées sur la chaîne oligosaccharidique ; ces
sphingoglycolipides anioniques constituent la classe des gangliosides (Tableau 2.1). Tous les
sphingoglycolipides sont localisés principalement dans la monocouche externe de la bicouche de
la membrane plasmique. Ils sont insérés dans la bicouche par leur partie hydrocarbonée et
projettent leur partie saccharidique hors de la cellule. Ils sont impliqués, du fait de leur partie
saccharidique, dans de nombreuses fonctions de reconnaissance (par exemple les
glycosphingolipides du globule rouge sont responsables de la spécificité des groupes sanguins).
Par ailleurs, certains virus utilisent la partie saccharidique comme ancrage précédent l’infection.
11
Tableau 2.1. Formules de quelques sphingoglycolipides. D’après la Réf. 1
2.1.4. Stérols
Les stérols sont des molécules beaucoup plus compactes et beaucoup plus apolaires que les
lipides décrits précédemment. Le cholestérol (Fig. 2.5, A) constitue environ 30 % des lipides
totaux des membranes plasmiques. On le trouve également dans les membranes lysosomiales,
endosomiales et Golgiennes des cellules animales. La seule partie polaire de la molécule est le
groupement OH.
Figure 2.5. (A) Structure de quelques stérols. (B) taille relative d’un stérol et d’un
phospholipide, et leur disposition dans une membrane. D’après la Réf. 1.
12
2.1.5. Acides gras
Les acides gras sous forme libre sont des constituants mineurs des membranes. On les
trouve associés aux lipides membranaires sous forme d’esters. Ils correspondent à la chaîne
grasse, hydrophobe (partie apolaire) de ces derniers. Le nombre d’acide gras différents obtenus
par hydrolyse des lipides isolés d’une membrane donnée est élevé. Généralement, on trouve un
mélange d’acides gras saturés et insaturés (de 1 à 4 doubles liaisons, quelquefois 6) de longueur
variant de 12 à 24 atomes de carbone (Tableau 2.2).
13
2.2. CARACTÉRISTIQUES COMMUNES DES LIPIDES
MEMBRANAIRES
14
seconde migration (Fig.2.6, b). (À la fin de la première chromatographie, la plaque est retournée
à 90° et la seconde chromatographie est effectuée dans le second système solvant). En fin de
chromatographie, la position des différents lipides est révélée en utilisant des colorants, soit non
spécifiques (marquant tous les lipides), soit spécifiques d’un ou d’une classe de lipides
particuliers. (La révélation la plus simple est la révélation à l’iode qui réagit sur les doubles
liaisons des chaînes hydrocarbonées).
Figure 2.6. Séparation des lipides totaux de cerveau de rat par chromatographie en couche
mince sur gel de silice. a : Chromatographie à une dimension. Solvant d’élution :
acétate/propanol/chloroforme/méthanol/KCl (0,25%) (25 :25 :25 :10 :9). b : Chromatographie
à 2 dimensions. Le solvant d ‘élution est le même qu’en a. Solvant d’élution dans la deuxième
direction : chloroforme/méthanol/7N NH4OH (65 :35 :5). D’après la Réf. 1.
Abréviations. PC, PS, PA, PG, PE : phosphatidyl choline, sérine, acide, glycérol, éthanolamine ; MGDG, DGDG :
monogalactosyl, digaltactosyl diglycéride ; LN : lipides neutres ; n.d. : lipide non déterminé
15
Figure 2.7.Chromatogramme sur colonne de silice indiquant les temps de rétention (min.)
correspondant aux différents phosphoglycérides: phosphatidylglycérol (PG);
phosphatidylinositol (PI); phosphatidylsérine (PS); phosphatidyléthanolamine (PE) et
phosphatidylcholine (PC). (Le mélange de solvants utilisé était: acétonitrile/méthanol/acide
phosphorique 14,7 M, (100:10:1,8 v: v).
16
2.3.3. Composition lipidique des membranes biologiques
Abréviations. PC, PE, PI, PS, PG: phosphatidyl choline, éthanolamine, inositol, sérine, glycérol ; DPG :
diphosphatidyl glycérol ; MGDG, DGDG : monogalactosyl, digaltactosyl diglycéride ; SQDG : sulfolipide. La
composition est donnée en % de la quantité totale de lipides.
17
2.4. SYSTEMES MODÈLES LIPIDIQUES
Les lipides constituent l'élément structural des membranes. Des renseignements de nature
structurale sont obtenus par la caractérisation de systèmes constitués uniquement de lipides : ce
sont des systèmes modèles lipidiques. De plus, ces systèmes se prêtent à de nombreuses autres
applications. Trois systèmes sont présentés ici : les liposomes, les monocouches et les bicouches
planes (les deux dernières sont très utilisées pour aborder les études d’interaction entre lipides et
protéines).
2.4.1. Liposomes
Les liposomes sont certainement les systèmes modèles lipidiques les plus utilisés. Ils
trouvent des applications dans les domaines de la biochimie-biophysique, de la pharmacologie-
médecine, de la thérapie génique et de la cosmétologie. Ce sont des vésicules dont la surface est
constituée d'une bicouche lipidique et qui renferment un volume de solvant aqueux dans lequel
elles ont été préparées. Les plus petites vésicules ont un diamètre théorique de l’ordre de 25 nm
et les plus grandes peuvent atteindre 2500 nm, et peuvent égaler les dimensions des cellules
vivantes (ex : hématies = 5μm ; bactéries ~ 1 μm).
b) Les liposomes unilamellaires de petite taille (SUV, Small Unilamellar Vesicles) sont
obtenus par traitement physique des liposomes multilamellaires. Il suffit de soumettre ces
derniers à des ultrasons ou à des pressions élevées, pour obtenir des vésicules de taille
homogène, constituées d'une seule bicouche lipidique, contenant à l’intérieur du milieu aqueux
(Fig. 2.9). Ces vésicules ont un diamètre faible (de l’ordre de 25 nm), ce qui peut présenter des
inconvénients : (i) La courbure importante impose des contraintes d'association des lipides. La
surface de la monocouche externe (et donc le nombre de lipides dans cette monocouche) est
significativement supérieure à la surface de la monocouche interne ; (ii) le volume interne de
phase aqueuse est petit. De plus, l’utilisation de sondes à ultrasons peut entraîner la libération de
particules métalliques qui peuvent dégrader certains lipides. L’extrusion d’une suspension
liposomale sur des membranes de polycarbonate de diamètre déterminé est une façon d’obtenir
des SUV de tailles plus ou moins grandes, tout en évitant les inconvénients des ultrasons. En
filtrant successivement une suspension de liposomes de phosphoglycérides (uni ou
multilamellaires) sur des membranes ayant des pores de 30 nm de diamètre, il est possible
d’obtenir des SUV de 47 à 52 nm. Sur des membranes présentant des pores de 100 nm de
diamètre, on peut former des liposomes de 69 à 80 nm diamètre.
18
Figure 2.9. Liposomes multilamellaires et unilamellaires de petites tailles (D’après la Réf. 1)
19
Éther
Milieux
aqueux
(tampon)
Milieux Milieux
aqueux Éther aqueux
(tampon) (tampon)
Figure 2.10. Formation de liposomes unilamellaires de grande taille par inversion de phase.
D’après la Réf. 1.
d) Le champ d’applications des liposomes est varié. Comme ces vésicules délimitent un
compartiment aqueux interne, il est possible d’aborder les études concernant la perméabilité
passive d’une bicouche purement lipidique aux divers ions et solutés (mesure de la quantité de
solutés emprisonnée dans le volume interne après diffusion). La tâche est facilitée si le volume
interne est relativement important (LUV) et si l’ion ou le soluté est radioactif. Les liposomes
sont également utilisés pour caractériser la diffusion des lipides au sein de la bicouche, la fusion
avec d'autres lipides, les interactions entre protéines solubles (extrinsèques) et les membranes,
etc... De plus, il est possible de préparer des protéoliposomes dans lesquels une protéine
membranaire, préalablement purifiée, a été re-insérée. Ces protéoliposomes permettent d’aborder
l’étude fonctionnelle d’une protéine membranaire purifiée dans son contexte lipidique ; ils
constituent un modèle simplifié de membranes biologiques.
Les liposomes trouvent des applications en pharmacologie et médecine en tant que
transporteurs de médicaments qui doivent franchir la région hydrophobe des membranes
biologiques. Un médicament soluble dans l’eau sera encapsulé dans le volume intra-liposomal de
liposomes unilamellaires de grande taille ; un médicament hydrophobe sera dissous dans la
phase lipidique de liposomes multilamellaires. Dans les deux cas, le principe actif peut être
véhiculé dans l’organisme par simple injection. Au cours de la circulation, les liposomes
fusionnent avec les membranes cellulaires ou, ce qui est plus courant, sont endocytés par des
cellules ; le principe actif est alors délivré dans la cellule. Cependant, les liposomes sont
rapidement éliminés de la circulation par les cellules phagocytaires du système réticulum
endothélial et s'accumulent dans le foie ou la rate qui en sont les cibles privilégiées, mais ce qui
limite leur utilisation pour traiter d’autres organes cibles. Les développements actuels tendent à
augmenter le temps de survie des liposomes dans la circulation en modifiant leur composition
lipidique pour échapper à la phagocytose. Les liposomes à temps de vie prolongée ont trouvé des
applications dans certaine chimiothérapie anti-cancéreuse. (L’efficacité thérapeutique de la
doxorubicine, très efficace contre certains cancers du sein, est fortement augmentée par injection
20
sous-forme de liposomes ; sa cardiotoxicité étant limitée. De plus, l’addition de récepteur
reconnus spécifiquement par certaines cellules (notamment cancéreuses) permettrait de cibler
l’organe à traiter. Enfin, dans la mesure où il est possible d’encapsuler un gène ou un plasmide à
l’intérieur du liposome, ces vecteurs sont également utilisés en thérapie génique.
Les liposomes sont également employés dans le domaine de la cosmétologie. De
nombreuses substances utilisées en cosmétologie (crèmes hydratantes, antioxydants, extraits de
thymus, collagène...) sont en général appliquées localement sous forme d'émulsion huileuse ou
de solution alcoolique. Or, le contact à long terme d’huile ou d’alcool avec la peau peut nuire à
son bon état. L’encapsulation du principe actif dans des liposomes permet de contourner cet
inconvénient. Il n'est pas exclu, mais cela reste à prouver, que les liposomes soient capables de
fusionner localement avec les cellules de la peau, libérant leur contenu à l'intérieur des cellules et
augmentant de ce fait leur efficacité.
Si l’on dépose sur la surface d’une solution aqueuse une goutte d’une solution d’un lipide
dissous dans un solvant organique, il se forme au cours de l’évaporation du solvant une
monocouche de lipides à l’interface air/eau. Le film monomoléculaire de lipides occupe toute la
surface disponible. La partie polaire hydrophile des lipides entre en interaction avec l’eau, la
partie apolaire hydrocarbonée reste en contact avec l’air (Fig. 2.11). Un dispositif adéquat
(balance de Wilhelmy) permet de déterminer la pression superficielle qui reflète l’encombrement
des molécules à l’interface.
Mesure de la pression
superficielle (π)
Le système des monocouches se prête bien à l’étude des interactions lipides/protéines. Une
protéine ou un peptide peut être injecté dans la phase aqueuse. Son insertion dans la
monocouche, indication d’une interaction, s’accompagne d’une augmentation de pression
superficielle si la surface est maintenue constante (Fig. 2.12, a) ou, d’une augmentation de
surface si la pression superficielle est maintenue constante (Fig. 2.12, b). L’avantage principal de
la technique des monocouches lipidiques est de pouvoir étudier l’interaction de protéines ou de
peptides solubles extrinsèques avec une couche lipidique monomoléculaire, correspondant à un
demi-feuillet membranaire. Cette topographie permet de simuler, dans des conditions proches de
la réalité des situations biologiques, ce qui se passe quand une molécule hydrosoluble du milieu
21
extra-(intra-) cellulaire (peptides, protéines cytosolubles, hormones) arrive à la surface de la
cellule ou de l’organelle.
a π
b
Aire
Figure 2.12. Étude de l’interaction d’une protéine ou d’un peptide à l’aide des monocouches de
phospholipides. L’insertion d’une protéine ou d’un peptide dans la monocouche s’accompagne,
soit d’une augmentation de la pression superficielle (a: surface constante), soit d’une
augmentation superficielle (b : pression constante).
Les bicouches lipidiques planes peuvent être obtenues à travers un orifice séparant deux
compartiments aqueux. Deux techniques permettent d’y arriver (Fig. 2.13). La première
approche (Fig. 2.13, a) permet d’obtenir une bicouche lipidique (appelée « black lipid films »).
Un pinceau est plongé dans une solution contenant des lipides dissous dans un solvant organique
non miscible à l'eau (par exemple, du décane). Un coup de pinceau est appliqué sur l'orifice
circulaire (diamètre de 1 mm environ) d’une paroi séparant deux compartiments aqueux. Il se
forme un film lipidique dont l'épaisseur diminue spontanément en fonction du temps, l'excès de
lipide formant un manchon aux bords de l'orifice. L'amincissement se poursuit jusqu'à la
formation d'une couche lipidique. Les parties polaires étant en contact avec le milieu aqueux, les
chaînes hydrocarbonées étant situées à l'intérieur de la bicouche. Cependant, la bicouche ainsi
22
formée contient toujours le solvant hydrophobe, donnant lieu à de légers défauts de structure de
la membrane.
La seconde approche consiste à former une bicouche lipidique plane à partir de deux
monocouches formées par évaporation du solvant (Fig. 2.13, b). Les monocouches sont
préformées sur les surfaces de deux solutions séparées par une paroi verticale possédant un
orifice circulaire au dessus du niveau des solutions (1). Le niveau des solutions est ensuite élevé
au delà de l’orifice (2). Cette technique permet d’obtenir des bicouches asymétriques, si la
composition lipidique des deux monocouches initiales est différente.
a)
Manchons
0,5 à 1 mm
b)
1) 2)
Élévation du
niveau d’eau
0,5 à 1 mm
Figure 2.13. Bicouches lipidiques planes. Une paroi sépare deux compartiments aqueux. Un
orifice de 1 mm de diamètre environ permet la formation de la bicouche lipidique plane. (a)
méthode « coup de pinceau » ; (b) méthode « élévation du niveau d’eau » D’après la Réf. 1.
Ce système, avec ces deux compartiments aqueux auxquels on a facilement accès et dans
lesquels on peut plonger des électrodes, se prête admirablement bien à l'étude de la perméabilité
ionique de la bicouche. Il est possible de mesurer facilement des courants et/ou des différences
de potentiel de part et d'autre de la bicouche.
La conductance de la bicouche en présence d'ions inorganiques dans les compartiments est
très faible. Elle reflète la faible perméabilité d'une bicouche lipidique aux ions. Mais par ailleurs,
il est possible d'insérer dans la bicouche lipidique des protéines, en particulier des canaux
ioniques. Ceci peut se faire en fusionnant à la bicouche préformée des vésicules contenant des
protéines. Les caractéristiques de conductance des canaux (sélectivité des ions, agents
inhibiteurs, conductance, …) peuvent alors être déterminées au moyen de ce modèle de bicouche
lipidique plane.
23
3) DÉTERGENTS
Les détergents sont comme les lipides, des molécules amphiphiles qui servent notamment à
l’extraction et à la purification des protéines membranaires intrinsèques. En effet, les interactions
entre les protéines intrinsèques et les autres constituants de la membrane sont de nature
hydrophobe. Ces interactions sont indispensables pour le maintien des structures protéiques
natives. En leur absence, les protéines extraites en milieux aqueux ont tendance à s’agréger, à se
dénaturer et à précipiter de manière irréversible. Les détergents, de part leur nature amphiphile,
permettent d’extraire les protéines membranaires, en re-créant autour d’elles, un environnement
hydrophobe semblable à celui présent dans la membrane.
Comme pour les lipides membranaires, le caractère amphipathique des détergents leur
confèrent un comportement particulier dans l’eau : ils sont capables de former des structures
d’agrégation. C’est dans ce contexte, que nous étudions ici les propriétés des détergents avant
d’aborder le polymorphisme lipidique (§ IV).
Les détergents, au même titre que les lipides, possèdent une partie hydrophobe (aromatique
ou aliphatique sous la forme d’une seule chaîne hydrocarbonée) et une partie polaire,
spatialement distinctes.
La caractéristique principale d'un détergent, qui les distingue des lipides membranaires, est
de former des micelles, alors que dans les mêmes conditions, les lipides membranaires forment
des vésicules. Dans ces micelles, les parties polaires des molécules de détergent tapissent la
surface en contact avec le milieu aqueux; les parties hydrophobes sont situés à l'intérieur,
formant un milieu où l'eau n'a pas accès (Fig. 3.1, a). Le nombre de molécules de détergent par
micelle dépend de la nature du détergent (entre quelques molécules à plus d'une centaine).
(a) (b)
Quelle que soit sa concentration, le détergent est en équilibre entre sa forme monomère et
sa forme micellaire constituée de l’association de n molécules :
n.Monomère (Monomère)n
24
Du fait de la valeur élevée de n, on peut montrer qu’en dessous d’un certaine concentration
en détergent, la concentration de micelles est négligeable et tout le détergent se trouve sous
forme de monomères ; en revanche, au-dessus de cette concentration, la concentration sous
forme de monomères reste pratiquement constante et l'excès de détergent forme des micelles
(Fig. 3.1, b). Cette concentration critique, qui varie d’un détergent à un autre et qui dépend des
conditions expérimentales, est appelée concentration micellaire critique (CMC). Sa valeur est
généralement comprise entre 10-2 et 10-6 M.
Les lipides membranaires possèdent une partie hydrophobe qui est plus importante que
celle des détergents, ce qui leur confère un comportement différent. Tout d’abord, ils ne sont
solubles sous forme de monomères qu'à des concentrations extrêmement faibles (10-10 à 10-12
M) ; d'autre part, au delà de ces concentrations, ils ne forment pas des micelles mais des
vésicules, les lipides s’organisent en bicouche séparant un intérieur d’un extérieur aqueux (Fig.
1.1). Ce sont ces différences entre lipides et détergents qui vont permettre l’extraction par les
détergents des protéines membranaires de leur environnement lipidique. (Une protéine
membranaire solubilisée en présence de détergents, se purifie par la suite comme une protéine
soluble). Nous verrons au paragraphe suivant (IV. Polymorphisme lipidique), qu’il est possible
de prédire, la forme lamellaire ou micellaire que peuvent prendre les molécules amphiphiles.
(SDS) (CTAB)
Les détergents ioniques (SDS, CTAB) ont un caractère très polaire qui leur est conféré par
leur charge nette. Ils ont donc une CMC élevée. Ils solubilisent d'une manière très efficace la
grande majorité des protéines membranaires. Leur inconvénient est de les dénaturer, le plus
souvent d'une manière irréversible. De ce fait, ils ne sont utilisés que lorsque l'on cherche à
déterminer des paramètres indépendants de la structure de la protéine (masse moléculaire,
séquence, etc...). En effet, les détergents ioniques, comme le dodécylsulfate de sodium (SDS), se
fixent initialement, sur les résidus chargés positivement (lysines, arginines, histidines de toutes
les protéines (solubles ou membranaires), par l’intermédiaire de sa charge négative. Cette
première fixation entraîne une modification de la conformation de la protéine avec démasquage
de régions hydrophobes, initialement enfouies à l'intérieur de la protéine. De nouvelles
molécules de détergent viennent s'y fixer, cette fois ci par leur partie hydrophobe. Il y a alors un
effet coopératif, la fixation entraînant l’apparition de nouvelles régions hydrophobes sur
lesquelles viennent se fixer de nouvelles molécules et ainsi de suite jusqu’à dénaturation
complète de la protéine. En fin de compte, la protéine dénaturée est entièrement recouverte de
molécules de SDS, ce qui lui donne une forme allongée. Pour les protéines solubles, la quantité
de SDS fixée par unité de poids de protéine est en général indépendante de la nature de cette
dernière (environ 1 molécule de SDS pour deux résidus d'acides aminés). La quantité de SDS qui
25
se fixe sur les protéines membranaires est en général plus élevée du fait de leur caractère
hydrophobe. Quoiqu’il en soit, toutes les protéines solubilisées par le SDS ont une charge
négative dépendante de leur masse moléculaire, ce qui permet de les séparer sur gel de
polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE).
Les détergents non ioniques sont beaucoup plus doux et permettent souvent de solubiliser
les protéines sans trop perturber leur structure native. La dénaturation ou le maintien de la
structure native, de même que la solubilisation ou la non-solubilisation, dépendent de la nature
de la protéine et du détergent. Les polyoxyéthylènealcools (nom commercial : Brij, Triton,
Tween, …) sont moins solubles sous forme de monomères que les détergents ioniques et
possèdent de ce fait une CMC plus faible. Ceci constitue un inconvénient pour certaines
expériences de reconstitution correspondant à l’opération inverse à la solubilisation (formation
de vésicules protéolipidiques à partir de micelles de lipide/détergent et protéine/détergent par
élimination du détergent sous forme de monomères). La partie saccharidique des alkyl-
glucosides (octyl-glucoside, dodécyl-maltoside) confère à ces détergents non-ioniques une bonne
solubilité. Ils présentent de ce fait une CMC élevée plus favorable aux expériences de
reconstitution.
26
c) Détergents zwitterioniques
d) Sels biliaires
Les sels biliaires, cholate et déoxycholate de sodium, sont des détergents atypiques. Il
n'existe pas, comme pour les autres détergents, une séparation nette dans l'espace des parties
polaire et hydrophobe. Le cycle pentaphénantrène possède une face polaire et une face apolaire.
Les micelles sont constituées de l’association d’un nombre réduit de molécules (une dizaine), les
faces apolaires étant en contact au sein de la structure. Du fait de leur CMC élevée, ces
détergents sont souvent utilisés lorsque l’on envisage, après la solubilisation des expériences de
reconstitution.
27
Aux faibles concentrations de détergent (en dessous de la CMC), les molécules de
détergents s’incorporent dans la bicouche lipidique de la vésicule en perturbant sa structure sans
la détruire. Au delà d’une certaine saturation, l’organisation en bicouche n’est plus stable et il se
forme des micelles mixtes lipides/détergents pouvant contenir jusqu’à 0,3 mole de phospholipide
par mole de détergent. Nous verrons au paragraphe suivant, §IV polymorphisme lipidique, que
cette transformation, qui a lieu le plus souvent à une concentration en détergent proche de sa
CMC, est liée à la forme même des molécules de lipides (concept de forme). À ce stade, coexiste
un mélange de vésicules saturées en détergent et de micelles de détergent saturées en
phospholipide.
Figure 3.2. Solubilisation graduelle des liposomes par addition de détergent. (a) modèle de la
solubilisation ; (b) Variation de la turbidité au cours de la solubilisation. D’après la Réf. 1.
28
L’addition supplémentaire de détergent déplace l’équilibre vésicule micelle vers la
formation de micelles jusqu’à disparition des vésicules. Une vésicule de 1µm de diamètre
contient environ 50.10-6 molécules de lipide (la surface occupée par un lipide est de l’ordre de
0,5 nm2). Lors de la micellisation complète, une vésicule se transforme en environ 106 micelles
saturées. Au delà, l’addition de détergent ne fait qu’augmenter le nombre de micelles en
diminuant la concentration de lipides dans les micelles de détergents.
La transition vésicule vers micelle se détecte facilement par une diminution de la turbidité
de la suspension (Fig. 3.2,b). Cette diminution est due à la différence de taille entre vésicules
(>100 nm) et micelles (~10 nm).
Figure 3.3. Solubilisation des membranes par un détergent non-dénaturant. D’après la Réf. 1.
29
et donc leur dénaturation. Par addition supplémentaire de détergent, on accomplit une
délipidation progressive de ces micelles trinaires pour obtenir finalement un mélange de micelles
lipide/détergent et de micelles protéine/détergent. Ces deux types de micelles peuvent être
séparés grâce à leurs propriétés de charge et de densité différentes. Les micelles
protéine/détergent contenant des protéines de nature différente peuvent être purifiées par les
techniques couramment utilisées pour les protéines solubles (électrophorèse,
chromatographies,…).
4) POLYMORPHISME LIPIDIQUE
De part leur caractère amphiphile, où la tête polaire peut interagir avec l’eau et la queue
hydrophobe va limiter sont contact avec l’eau, les lipides vont former des structures d’agrégation
dont la cohésion va être régie par l’effet hydrophobe. Extraits de leur contexte membranaire, et
remis en suspension dans l’eau à très forte concentration, les lipides peuvent adopter des
organisations structurales très variées : c’est le polymorphisme lipidique. La forme des agrégats
va dépendre de la balance amphiphile, c’est-à-dire de taille relative des parties hydrophile et
hydrophobe de la molécule (balance "hydrophile-hydrophobe"). Bien que certaines de ces
organisations ne soient pas toujours physiologiques, l’étude des différentes phases adoptées in
vitro par les lipides membranaires permettent de tirer quelques conclusions quant à la propension
qu'ont ces derniers à adopter des organisations autres que lamellaires dans les membranes
biologiques. Comme nous le verrons un peu plus loin, la pertinence de ces organisations est
illustrée notamment dans la fusion membranaire.
L’effet hydrophobe peut se définir de la façon suivante : « lorsqu’on met une chaîne
carbonée assez longue dans l'eau, elle tend à réduire sa zone de contact avec l'eau ». En fait nous
allons apprendre que c’est le milieu aqueux, dans lequel sont immergées les chaînes
hydrocarbonées, qui les oblige à se ressembler et à s’agréger.
En effet, lorsque une molécule isolée de lipides amphipathiques est immergée dans l'eau,
sa tête polaire hydrophile va interagir favorablement avec le solvant et devenir hautement
solvatée (tendance à la dissolution) ; la rupture du réseau de liaisons hydrogène entre les
molécules d’eau au voisinage de la tête polaire est compensée par le fait que ces entités polaires
ou chargés peuvent créer de nouvelles interactions avec les molécules d’eau. Le changement net
d’enthalpie (∆H) pour solubiliser la tête polaire est en général faible. À l'inverse, les chaînes
hydrocarbonées qui sont elles totalement hydrophobes, sont incapables de créer des interactions
avec les molécules d’eau :
- les chaînes hydrophobes vont donc non seulement rompre le réseau structurée
des molécules d’eau liées par des ponts hydrogène (ce qui va demander un
apport d’énergie aboutissant à une légère augmentation de l’enthalpie libre de
réaction : H positif),
- mais elles vont également obliger les molécules d'eau aux alentours à
s'organiser et à former une cage autour d’elles (Fig. 4.1). Dans ce réseau figé,
les molécules d’eaux vont alors jouir que d’un faible degré de liberté de
30
translation et à cause de cela, elles se trouvent dans un état hautement ordonné
de basse entropie : la présence des chaînes hydrocarbonées dans l’eau entraîne
donc une diminution de l’entropie du solvant (et S devient négatif).
Au final, la variation d’énergie libre nécessaire pour dissoudre une chaîne hydrocarbonée
dans l’eau n’est donc pas favorable : G = H -TS où H à une valeur positive, S une valeur
négative, donc G est positif.
Lorsque plusieurs molécules de lipides amphiphiles sont présentes dans l'eau, les chaînes
hydrophobes vont avoir tendance à se rassembler pour limiter le nombre de molécules d'eau
immobilisées dans les cages autour des chaînes hydrocarbonées; ainsi beaucoup de molécules
d'eau pourront regagner le solvant, ce qui augmentera leur entropie de translation. C’est en fait
cette élévation de l’entropie des molécules d’eau qui est la force principale de l’agrégation
des chaînes hydrocarbonées, et non pas une quelconque affinité des chaînes entre elles.
L’élévation de l’entropie du solvant accompagnant la formation de l’agrégat est plus élevée
(donc plus favorable) que la diminution d’entropie accompagnant l’assemblage des chaînes
hydrocarbonées dans l’agrégat (ce qui correspond pour les chaînes hydrocarbonées à une
meilleure ordonnance moléculaire, c’est-à-dire une diminution de l'entropie ce qui n'est pas
favorable).
Les chaînes hydrophobes s'associent donc entre elles pour présenter vers le solvant la
surface hydrophobe la plus faible possible et les régions polaires adoptent une disposition qui
leur permet d’accroître au maximum leurs interactions avec le solvant aqueux. C’est la force de
formation de l’agrégat. À l’intérieur de l’agrégat, les chaînes hydrocarbonées vont pouvoir
interagir entre elles par des interactions de van der Waals. L’ensemble des forces qui
maintiennent entre elle les régions non polaires des molécules est appelé interactions
hydrophobes. Il faut noter que la force de ces interactions n’est pas due à une quelconque
attraction des chaînes apolaires entre elles, mais c’est le résultat d’une organisation atteignant sa
stabilité thermodynamique optimale, réduisant au minimum la diminution d’entropie liée à
l’arrangement des molécules d’eau autour des zones hydrophobes des molécules amphiphiles.
Ces interactions hydrophobes sont en fait les forces de cohésion des agrégats lipidiques. Bien
que ces interactions soient en soi de faibles énergies, leur nombre important au sein de l’agrégat
permet de maintenir la cohésion des différentes phases adoptées par les lipides membranaires.
31
Figure 4.1. Effet hydrophobe. (a) chaîne alkyle entourée par une molécule d’eau très organisée ; (b)
agrégation de plusieurs chaînes hydrocarbonées et libération de molécules d’eau. L’énergie récupérée
en libérant les molécules d’eau immobilisées stabilise l’agrégat. D’après Lehninger, Nelson & Cox,
« Principes de Biochimie » seconde édition (Médecine-Sciences 1994, Flammarion).
32
4.2. Organisations structurales des principales phases du polymorphisme
lipidique
A)
Phase Hexagonale type HII
Phase Lamellaire (L)
eau
bicouche
4 à 6
nm
B)
33
Figure 4.3. Organisation hexagonale de type HI adoptée par les lysophospholipides (détergent).
D’après la Réf. 1.
Dans l’organisation lamellaire (notée L), les bicouches lipidiques sont séparées par des
couches d’eau dont l’épaisseur va dépendre des conditions d’hydratation (Fig. 4.2, A). Ce type
de phase est généralement obtenu quand des phospholipides, comme les phosphatidylcholines,
ou des sphingolipides, comme les sphingomyélines, sont remis en suspension à de fortes
concentrations (> à 50% en lipides). Dans ces conditions, les vésicules formées de bicouches
lipidiques (telles que nous les avons présentées Fig. 1.1), s’aplatissent à cause de la diminution
de la quantité d’eau dans le mélange, et les lipides, tout en gardant une organisation en bicouche,
sont localisés au sein de lamelles que l’on peut considérer comme planes et de surface infinie par
rapport à leur épaisseur. Ces lamelles, en grand nombre, sont parallèles et séparées par des
couches d’eau dont l’épaisseur, bien définie, dépend de la quantité d’eau dans le système.
L’organisation de type HI (ou micelle directe) est généralement adoptée par les lipides ne
présentant qu’une seule chaîne hydrocarbonée, tels que les lysophospholipides et les détergents
(Fig. 4.3). Comme dans la phase HII, les lipides tapissent la surface de cylindres ordonnés
suivant une symétrie hexagonale. Toute fois, contrairement à la phase HII, les chaînes
hydrocarbonées sont localisées à l’intérieur des cylindres, les têtes polaires à l’extérieur en
contact avec l’eau.
L’organisation d’un lipide donné au sein du mélange lipide/eau dépend des conditions
expérimentales, en particulier de la température et de la concentration lipidique. La recherche
des domaines d’existence des différentes organisations en fonction de la température et de la
34
concentration conduit à un diagramme de phase. La figure 4.4 présente un diagramme de phase
simplifié d’un mélange phospholipide/eau. Les domaines L/Lß et HII correspondent
respectivement aux domaines d’existence des organisations lamellaires et hexagonale HII. (Nous
verrons au paragraphe suivant (V. Fluidité membranaire) que les phases L et Lß sont des
phases lamellaires dans lesquelles la conformation des chaînes hydrocarbonées est en fonction de
la température ; pour l’analyse du diagramme de phase, nous ne ferons pas pour l’instant, la
différence entre ces deux types de phases et nous parlerons simplement de phases lamellaires). Il
est à noter que d’autres organisations existent dans d’autres domaines de concentration et de
température. Nous ne les détaillerons pas ici.
L’analyse du diagramme simplifié (Fig. 4.4) indique que le passage de la phase lamellaire
L vers la phase hexagonale HII est favorisée par une diminution de la concentration en eau (ou
une augmentation de la concentration lipidique), cette transition nécessitant un contact étroit
entre bicouches. De même, pour une concentration lipidique relativement élevée, lorsque le
contact entre lamelles lipidiques est suffisamment étroit (concentration en eau suffisamment
faible), la transition de la phase lamellaire Lß vers la phase hexagonale HII peut être induite par
une élévation de la température. La transition phase lamellaire vers phase hexagonale implique
de franchir une barrière énergétique ; l’énergie nécessaire pouvant être fournie par l’agitation
thermique.
Figure 4.4. Diagramme de phase simplifié d’un mélange phospholipide/eau. Les parties grisées
représentent les domaines d’existence des différents organisations lipidiques (phases). Lß et Lß
correspondent à des organisations où les chaînes hydrocarbonées sont ordonnées (cf. § 5.3.1.
conformation des chaînes en fonction de la température). Un mélange de phase existe dans les
régions entre ces domaines. D’après Gulik-Krzywicki et al., J. Mol. Biol., 1967, 27, 303-322.
35
4.4. Concept de forme
Comme nous venons de le voir, un lipide donné peut former différentes phases dans des
conditions physico-chimiques différentes, mais dans les conditions physiologiques, les lipides
membranaires adoptent une organisation particulière. Le tableau 4.1 présente l’organisation
préférentielle adoptée par différents lipides membranaires à température physiologique. Nous
pouvons noter en particulier que les monogalactosyldiglycérides, lipides abondants des
membranes photosynthétiques et que les phosphatidyléthanolamines, lipides abondant dans de
nombreuses membranes, adoptent une organisation de type HII.
Un concept de forme a été avancé pour tenter d’expliquer l’origine des différentes
organisations lipidiques : celles-ci dépendraient des volumes respectifs (encombrement spatial)
des parties polaire et hydrophobe du lipide. À volume égal, le lipide s'inscrit dans un cylindre et
l'organisation correspondante est de type lamellaire L (formation de bicouche lipidique) (Fig.
4.5, a) ; si le volume de la partie polaire est inférieur à celui de la partie apolaire, le lipide prend
la forme d'un cône et l'organisation correspondante est la phase hexagonale de type HII (micelle
inversée) (Fig. 4.5, b) ; enfin, si le volume de la partie polaire est supérieur à celui de la partie
apolaire, le lipide présente une forme de cône inversé et l'organisation correspondante est de
type HI (micelle directe).
36
a b
c d
Figure 4.5. Organisation lipidique et concept de forme. Si le lipide s’inscrit dans un cylindre,
l’organisation est lamellaire (a) ; si le lipide s’inscrit dans un cône, l’organisation est celle de la
micelle inversée (b) ; si le lipide s’inscrit dans un cône inversé, l’organisation est micellaire (c).
Par compensation de formes, un mélange de lipides adopte une organisation lamellaire (d).
D’après la Réf. 1.
37
Figure 4.6. Relation entre la forme structurale du lipide et son organisation dans une phase
lipide/eau. D'après la Réf. 2.
4.5. Compensation de formes
Dans un système constitué d'un mélange de lipides différents et d'eau, il peut y avoir
compensation de forme. Ceci se répercute sur l'organisation finale. C’est ainsi que si la
lysophosphatidylcholine (lysoPC) adopte préférentiellement la phase micellaire de type HI
(micelle directe) et la phosphatidyléthanolamine (PE), une organisation micellaire de type HII
(micelle inverse), un mélange de ces 2 lipides adopte, par compensation de forme, une
organisation lamellaire (Fig. 4.5,d & Fig. 4.7).
38
Figure 4.7. Organisation lamellaire obtenue par compensation de forme de différents lipides.
D'après la Réf. 2.
4.6.1. Cryofracture
39
Figure 4.8. Cryofracture de phospholipides dans des organisations lamellaire (A) et hexagonale
(B). Les schémas représentent la propagation de la fracture dans l’échantillon. Dans les deux
cas, la fracture se propage dans la partie hydrophobe de la structure entre les chaînes
hydrocarbonées des lipides (surface de moindre résistance). D’après la Réf. 1.
40
Figure 4.9. Spectre RMN du 31P de phospholipides sous forme de micelles (a), de petites
vésicules (SUV après sonication) (b), de micelles inverses au sein de l’épaisseur de la membrane
(c) ou d'une phase cubique (d). Cette phase correspond entre autre à l’une des organisations
lipidiques qui n’ont pas été détaillées dans l’analyse du diagramme de phase (Fig. 4.4). D'après
K. Larsson et al., Chem. Phys. Lipids, 1980, 27, 321-328.
41
ces conditions, les molécules ne sont plus dans un environnement isotrope, mais anisotrope,
c'est-à-dire que tous les noyaux ne voient pas le même environnement en fonction de leur
orientation.
42
hexagonale ; de plus, la largueur de cet épaulement change selon la phase: il est de 15 à 30
ppm pour les phospholipides en phase hexagonale (HII) et de 30 à 55 ppm les
phospholipides organisés en phase lamellaire (L). Ces deux différences permettent de
distinguer la phase lamellaire et de la phase hexagonale d’un phospholipide au moyen de la
spectroscopie RMN du 31P et d’identifier ces deux types de phase. Les agrégats de petites
dimensions (petites vésicules (SUV), micelles directes, petites micelles inverses de détergents
(« inverted micellar ») qui présentent une rotation extrêmement rapide, donne un spectre de raie
(pic isotropique), comme nous l’avons vu précédemment.
Figure 4.11. Spectres RMN du 31P et clichés de cryofracture correspondant aux différentes
phases du polymorphisme lipidique. La phase lamellaire a été formée avec de la
phosphatidylcholine du jaune d’œuf ; la phase hexagonale a été obtenue à l’aide de
phosphatidyléthanolamine. La phase lamellaire et la phase hexagonale présentent des spectres
et des clichés de microscopie électronique (cf. Fig. 4.8), totalement différents caractéristiques de
chacune de ces deux phases. Le spectre RMN du 31P en forme de raie, caractéristique d’un
milieu isotrope (pic isotropique), est liée à la rotation extrêmement rapide des petits agrégats.
Les clichés 1 et 2 sont des clichés de petites vésicules (SUV) ou de petites micelles inverses. Les
phases cubique et rhombique correspondent à des organisations lipidiques qui n’ont pas été
détaillées lors de l’analyse du diagramme de phase (Fig. 4.4). D'après la Réf. 3.
43
4.7. Importance des différentes phases dans les membranes biologiques
Il est possible d’établir des équivalences entre l’organisation des systèmes reconstitués
lipide/eau et l’organisation au sein des membranes biologiques, même si toutefois les différentes
phases observées in vitro sont obtenues dans les conditions parfois lointaines de celles des
membranes biologiques (concentration élevée en lipides, faible teneur en eau).
L’équivalent de l’organisation lamellaire des mélanges lipides/eau est clairement la
bicouche lipidique de la membrane biologique : les lipides qui tendent à adopter une organisation
lamellaire stabilisent la bicouche. L'équivalent de l’organisation HI est une micelle classique : les
lipides qui adoptent ce type d’organisation sont les détergents (ex : lysophosphatidyl-
éthanolamine). L’équivalent de l’organisation HII est plus difficile à concevoir. Il pourrait s’agir
d'une micelle inversée au sein de l’épaisseur de la membrane dont les lipides par ailleurs
adoptent une organisation de bicouche : les lipides qui tendent à adopter une organisation de type
HII déstabiliseraient la bicouche lipidique (Fig. 4.13).
Figure 4.13. Equivalence entre organisation et structure membranaire. Les lipides de forme
cylindrique conduisent à une vésicule, ceux de forme de cône inversé conduisent à une micelle
tandis que ceux qui ont la forme de cône produisent des "micelles inversées" au sein d'une
bicouche.
Il est difficile de mettre en évidence directement une organisation de type HII dans une
membrane biologique. Il est possible dans certaines conditions de voir apparaître sur le spectre
RMN du 31P, un spectre caractéristique de lipides possédant un mouvement plus isotrope qui
pourrait s’expliquer par l’existence de micelles inversées. En cryofracture, on peut observer,
dans certaines conditions, des surfaces de fracture de particules de nature lipidique qui pourraient
correspondre à des micelles inversées (Fig. 4.14).
44
Figure 4.14. Cliché de cryofracture de vésicules constituées d’un mélange de
phosphatidyléthanolamine et de cardiolipide (rapport molaire : 4/1) en présence de calcium (a).
Modèle hypothétique décrivant la présence de micelles inverses dans la membrane de la vésicule
(b). D’après la Réf. 3.
Une membrane biologique est constituée d’un mélange de nombreuses espèces lipidiques
de formes différentes. Par compensation de forme, l’organisation globale de la membrane est de
type lamellaire. Il est tout à fait concevable qu’il puisse exister localement et de manière
transitoire une organisation différente (micelle inversée) lors de la fusion de deux membranes.
La pertinence d’organisations autres que lamellaires dans les phénomènes de fusion de
liposomes est illustrée figure 4.15.
Figure 4.15. Deux mécanismes possibles de fusion lipidique. Dans les 2 cas, on passe par un
intermédiaire qui s’apparente à une organisation de type HII. D’après la Réf. 1.
45
Pour qu’une fusion puisse avoir lieu, il est nécessaire qu’un contact s’établisse entre les
deux monocouches externes de deux liposomes distincts. On obtient dans la région de contact
l’équivalent de deux lamelles lipidiques séparées par une couche d’eau (Fig. 4.15, a).
L’enroulement des deux monocouches externes conduit à la formation d’une micelle inversée
(Fig. 4. 15, b). La rupture coordonnée des deux monocouches internes en contact avec la micelle
conduit à un pore aqueux reliant les liposomes initiaux, appelé pore de fusion (Fig. 4. 15, c). La
dilatation de ce pore conduit à la fusion complète des deux liposomes (Fig. 4. 15, d).
D’autres mécanismes de fusion ont été proposés. Celui de la figure 4. 15 (b’) fait intervenir
une tige. Dans ce cas, le contact des monocouches externes conduit à l’initiation de deux
micelles inversées, mais la formation de ces micelles n’est pas complète ; ce premier contact
forçant le second contact entre les deux monocouches internes. La rupture ultérieure de ces deux
monocouches internes en contact conduit au pore de fusion puis à la fusion complète.
Dans les deux mécanismes présentés, entre le contact initial et la fusion, il existe une
organisation intermédiaire rappelant la phase HII.
L’efficacité de fusion dépend de la force de contact entre les deux bicouches, de la nature
des lipides dans la région du point de contact et de la barrière énergétique qu’il faut franchir pour
quitter l’organisation lamellaire. Dans le cas des fusions membranaires, le contact initial est
induit par la présence de récepteurs, d’où la spécificité de fusion. La nature des lipides dans la
zone de contact peut ne pas refléter la composition moyenne membranaire (existence de
microdomaines dans la membrane fluide, cf. § VI). En effet, les lipides sont animés d’une
diffusion latérale importante et il arrive que la zone de contact soit enrichie en lipides ayant
tendance à adopter une organisation hexagonale favorisant la fusion. Par ailleurs, des conditions
particulières peuvent exister au niveau des sites de contact comme une concentration élevée en
calcium qui en rapprochant les lipides acides, favorisent la fusion. Enfin, certaines protéines
membranaires peuvent au niveau du site de contact, favoriser la déstabilisation de la bicouche en
abaissant la barrière énergétique qu’il faut franchir pour quitter l’organisation lamellaire et jouer
ainsi un rôle de catalyseur dans la fusion membranaire.
5) Fluidité membranaire
5.1. Introduction
Les différents constituants d’une membrane biologique, s’ils sont confinés dans un espace
défini par la membrane, n’en sont pas moins animés de mouvements divers. Les lipides tournent
autour de leur axe perpendiculairement au plan de la membrane ; les chaînes hydrocarbonées des
lipides sont flexibles et sont animées d’un mouvement de balancier plus ou moins prononcé. Ces
mouvements à courte échelle confèrent à la membrane une certaine fluidité. Du fait de cette
fluidité, les protéines peuvent être animées de rotation sur elles mêmes. Mais surtout, la fluidité
permet des mouvements à plus longue échelle des lipides et des protéines dans le plan de la
membrane : il s'agit de la diffusion latérale. La diffusion transversale des lipides (flip-flop, Fig.
5.1) est en général beaucoup plus lente. Ces différents mouvements sont schématisés selon la
figure 5.2.
46
Figure 5.1. Diffusion transversale des lipides. D’après la Réf.1.
Figure 5.2. Les divers mouvements des constituants membranaires. Rotation des lipides (1),
mouvement de balancier des chaînes hydrocarbonées (2), rotation des protéines (3), diffusion
latérale des lipides (4), diffusion latérale des protéines (5). D'après la Réf. 1
Dans un milieu isotrope, homogène, la fluidité (ou la viscosité qui est son inverse) est une
propriété générale du milieu qui exprime la résistance au déplacement dans toutes les directions.
Une membrane est un milieu anisotrope, hétérogène. La résistance au déplacement n’est pas la
même dans toutes les directions. Qui plus est, dans une direction donnée, elle n’est pas la même
en différents endroits de la membrane. Dans ces conditions, la définition de la fluidité
membranaire n’est pas simple.
47
Les sondes fluorescentes utilisées pour caractériser la fluidité membranaire sont des petites
molécules hydrophobes qui peuvent s’incorporer dans la partie hydrophobe centrale de la
membrane, sans établir d’interactions spécifiques avec les constituants membranaires. Il s’agit le
plus souvent du diphénylhexatriène (DPH) ou de la N-phénylnaphtylamine (NPN) (Fig. 5.3).
Figure 5.3. Sondes fluorescentes et leur libre rotation dans la membrane. D'après la Réf. 1.
48
d’adsorption est directionnelle : une lumière polarisée dans une direction donnée excite
préférentiellement les molécules qui ont leur moment dipolaire d’absorption dans cette même
direction. L’excitation par une lumière polarisée permet donc d’effectuer une photosélection.
Lors du retour à l’état fondamental, la lumière émise sera préférentiellement polarisée dans une
direction parallèle au moment dipolaire de la molécule au moment de l’émission. En
conséquence, si durant le temps de vie de l’état excité la molécule a peu bougé, la direction de
polarisation de la lumière émise sera la même que celle de la lumière d’excitation ; à l’inverse, si
la molécule a tourné sur elle-même de manière aléatoire, une composante de lumière émise
polarisée perpendiculairement à la direction de polarisation initiale sera observée. La
dépolarisation de fluorescence est d’autant plus importante que la molécule tourne sur elle-même
durant le temps de vie de l’état excité, et donc que le milieu est fluide. La détermination de cette
polarisation se fait en plaçant dans le faisceau émis un analyseur, et en mesurant l’intensité de la
lumière polarisée parallèlement (I//) et perpendiculairement (I) à la direction de polarisation du
faisceau d’excitation. À partir de l’intensité de la lumière émise polarisée parallèlement (I//) et
perpendiculairement (I) à la direction de polarisation du faisceau d’excitation, on peut calculer
l’anisotropie de fluorescence r :
I// - I
r=
I// + 2 I
En absence de mouvement (milieu rigide), I// est maximum et I est minimum. On montre
que r a une valeur maximale de 0,4. Si le mouvement est très rapide par rapport au temps de vie
de l’état excité, la lumière émise est entièrement dépolarisée, I// est égale à I et r est égal à 0.
Ces mesures de fluorescence en la lumière polarisée permettent de mesurer les mouvements du
fluorophore. En effet, la rotation d’une molécule sur elle-même est caractérisée par son
coefficient de diffusion de rotation DR. Plus DR est élevé, plus la molécule tourne rapidement sur
elle-même et plus le milieu est fluide.
c = 1/ 6DR ; = 1/2DR
rt = r + (r0 - r).e-t/c
49
où r0 et r correspondent respectivement à l’anisotropie initiale et à l’anisotropie finale. Cette
dernière n’est pas forcément nulle si le degré de mouvement de la molécule est limité dans la
membrane.
50
rencontrées en fonction de la composition lipidique et des transitions « ordre-désordre »
associées à la conformation des chaînes hydrocarbonées des lipides membranaires.
Au sein d’une chaîne hydrocarbonée, il existe une libre rotation autour des liaisons C-C.
La conformation la plus stable est la conformation trans (t). Dans une situation où les
conformations autour de toutes les liaisons sont de type trans, la chaîne est étirée au
maximum (Fig. 5.8, a) ; on a une conformation "tout-trans".
Figure 5.8. Les différentes conformations d'une chaîne hydrocarbonée. D'après la Réf. 1.
Le passage d’une conformation "tout-trans" (t) à une conformation gauche (g) autour
d’une liaison C-C nécessite de l’énergie (quelques kJ). L’agitation thermique peut suffire à y
pouvoir. Une séquence de conformations ...ttgtgtt... entraîne, au-delà de la conformation gauche,
un changement de direction de la chaîne (Fig. 5.8, b). Dans une bicouche lipidique, ceci rend
plus difficile un parallélisme des chaînes. Une double liaison en configuration cis conduit
également à un changement de direction (Fig. 5.8, c). Ce n’est pas le cas d’une double liaison en
configuration trans (Fig. 5.8, d).
À une température suffisamment basse, dans les conditions où l’agitation thermique est
faible, toutes les chaînes des lipides membranaires ont une conformation "tout-trans". Dans une
organisation en bicouche lipidique, les chaînes sont parallèles les unes aux autres, en contact
étroit et étirées au maximum. On dit que les chaînes sont en conformation ordonnée et on
utilise le terme "gel cristalline" pour décrire l’état de cette phase lamellaire (Fig. 5.9,
conformation ß).
51
Figure 5.9. Conformations ß (ordonnée) et (désordonnée) des chaînes hydrocarbonées des
lipides dans une bicouche. D'après la Réf. 1.
Une élévation de la température entraîne une mobilité accrue autour des liaisons C-C (pour
les chaînes saturées ou insaturées). La probabilité d’une isomérisation trans gauche augmente
avec la température, et au-delà d’une température donnée, une transition coopérative est
observée ; les chaînes passent d’une conformation ordonnée (conformation ß) à une
conformation désordonnée (Fig. 5.9, conformation ). On parle alors de la transition de phase
Gel cristalline (ou Lß) Liquide cristalline (ou L.
En conformation , les chaînes oscillent autour d’une orientation moyenne perpendiculaire
au plan de la membrane. Les chaînes ne sont plus étirées au maximum ; en conséquence, par
rapport à une situation où la conformation est de type ß, l’épaisseur de la bicouche diminue. Le
contact entre chaînes est moins étroit et les lipides sont plus séparés les uns des autres. Au cours
de la transition, il y a une expansion latérale des lipides dans la membrane et la surface occupée
à l’interface est plus importante.
La figure 5.11 (A) présente les profils de calorimétrie différentielle de trois phospholipides
présentant une même longueur de chaînes. Alors que l’acide dimyristoylphosphatique (DMPA)
et le dimyristoylphosphatyléthanolamine (DMPE) présentent un seul pic en calorimétrie
différentielle correspondant à la transition principale Lß L (Fig. 5.11, B), un second pic,
précédant la transition principale, apparaît sur le profil obtenu avec la
dimyristoylphosphatylcholine (DMPC).
Cet événement, appelé "pré-transition", est associé à une transition de la phase gel
cristalline où les chaînes hydrocarbonées sont inclinées par rapport au plan de la bicouche (notée
Lß’) vers la phase cristalline nommée « Ripple Phase » et notée Pß’ (Fig. 5.11, B). Dans le cas
des phosphatidylcholines, la dimension de la tête polaire est supérieure à celui de
l’encombrement de deux chaînes hydrocarbonées en contact étroit et étirée au maximum. De ce
fait, la conformation la plus stable des chaînes hydrocarbonées dans la phase gel cristalline est
53
obtenue lorsque les chaînes sont inclinées par rapport au plan de la bicouche (conformation ß’).
Lors de la transition Lß’ L, il y a alors passage par la phase intermédiaire Pß’ dans laquelle
les chaînes hydrocarbonées se redressent, ce qui entraîne une distorsion de la bicouche et
l’apparition de la pré-transition sur le profil de calorimétrie différentielle ; la transition principale
correspond alors à la transition de phase Pß’ L. L’existence d’une pré-transition est une
caractéristique commune à toutes les phosphatidylcholines, quels que soient la longueur et
le degré d’insaturation des chaînes hydrocarbonées. Elle est liée à l’encombrement élevé de
la tête polaire.
Pré-transition
54
sCH2). La figure 5.13 présente les spectres infrarouges de la dipalmitoylphosphatidylcholine
(DPPC) à différentes températures.
56
Le tableau 5.1 présente les températures de transition de quelques phospholipides, en
relation avec le point de fusion des acides gras constituant les chaînes hydrocarbonées, ainsi que
l’effet des différents paramètres mentionnés ci-dessus.
Dans le cas d’un mélange de lipides, la transition de l’état ordonné à l’état désordonné peut
s’effectuer de manière plus complexe et s’étend sur un domaine de température plus important,
compris entre les températures de transition des lipides purs du mélange.
57
contrôlée par la composition des chaînes hydrocarbonées : plus celles-ci sont insaturées et/ou
courtes, plus la membrane est fluide à la température physiologique.
a) Effet du cholestérol.
Selon les membranes, le cholestérol peut constituer jusqu’à 50% des lipides totaux. Nous
avons vu figure 2.5, comment le cholestérol s’insère dans les membranes : son groupement OH
en interaction avec les parties polaires des lipides membranaires, le noyau tétracyclique rigide en
interaction avec leurs chaînes hydrocarbonées et sa courte chaîne hydrocarbonée, très flexible et
toujours désordonnée, située vers le centre de la bicouche.
L’interaction entre le noyau tétracyclique et les chaînes hydrocarbonées des lipides
avoisinants empêche la cristallisation de ces lipides (c’est-à-dire la formation d’une structure
"tout-trans" compatible avec une conformation ordonnée des chaînes). Au cours de la transition
conformationnelle de la phase L vers la phase Lß (ou Lß’) (abaissement de température), le
cholestérol demeure en interaction avec les lipides avoisinants. De ce fait, la présence du
cholestérol diminue la quantité de lipides qui participent aux transitions conformationnelles et le
nombre de lipides ayant des chaînes ordonnées aux températures inférieures à celle de la
transition conformationnelle est plus faible. Cette diminution est d’autant plus importante que la
quantité de cholestérol est grande. Les transitions disparaissent pour des concentrations de
cholestérol comprises entre 30 et 50% des lipides totaux (concentrations physiologiques) (Fig.
5.16).
58
phase Lß’ L) disparaît au fur et à mesure de l’augmentation du pourcentage de cholestérol
dans le mélange. D’après S. Mabrey et J.M. Sturtevant, Proc. Natl. Acad. Sci., 1976, 73, 3862-
3866.
Les protéines intrinsèques interagissent avec les lipides avoisinants et de ce fait, empêchent
leur participation aux transitions conformationnelles. Quelle que soit la température, les chaînes
de ces lipides demeurent désordonnées. La quantité totale de lipides ayant des chaînes ordonnées
aux températures inférieures à celle de la transition conformationnelle, est plus faible pour les
membranes isolées que pour les systèmes lipidiques reconstitués. Un exemple de perturbation
apportée par la présence d’une protéine incorporée dans un système lipidique reconstitué (phase
lamellaire) est donnée figure 5.17.
59
protein interactions », dans Progress in Protein-lipid interactions 2 (Elsevier Science, 1986, Eds
Watts/De Pont, pp 103-145).
L’effet de cette protéine sur la transition de phase du phospholipide illustre d'une manière
générale l’effet des polypeptides et des protéines sur la conformation des chaînes
hydrocarbonées. L’incorporation des polypeptides et des protéines accroît souvent le désordre
des chaînes hydrocarbonées. Notons que ces interactions entre lipides et protéines peuvent
également affecter la conformation de la protéine ou d’une partie de la protéine.
Figure 5.18. Représentation d'Arrhenius d'un transport actif d'un -galactoside. D’après E.
Shechter et al., Eur. J. Biochem., 1974, 49, 61-76.
60
La vitesse de réaction du transport actif d’un -galactoside à travers la membrane
cytoplasmique d’E. Coli est déterminée en fonction de la température. La pente de la
représentation logarithmique de la vitesse de transport en fonction de l’inverse de la température
permet de déterminer l’énergie d’activation du transport. Deux énergies d’activation peuvent être
déterminées de part et d’autre de la transition conformationnelle qui a lieu vers 20°C. Ces
différences d’énergie d’activation reflètent deux régimes de fonctionnement différents du
transport actif de -galactoside en fonction de l’état conformationnelle des chaînes
hydrocarbonées, c’est-à-dire de la fluidité membranaire.
Nous avons déjà signalé que toutes les membranes biologiques ne présentent pas
rigoureusement la même fluidité. De plus, il a été montré depuis une dizaine d’années, que des
complexes lipidiques membranaires, enrichis en cholestérol et sphingolipides (principalement
glycosphingolipide et sphingomyéline) peuvent ne pas être solubilisés par certains détergents
(Triton, par exemple) et que ces fragments membranaires, aussi appelés DRM (pour « Detergent
Resistent Membrane ») flottent en surface d’un gradient de densité après centrifugation. Ces
complexes membranaires, également appelés « radeaux lipidiques » (ou « rafts » en anglais),
correspondent à des microdomaines appauvris en phospholipides insaturés et certaines protéines
transmembranaires, mais enrichis en cholestérol, sphingolipides et certaines protéines à ancre
lipidique. Les interactions fortes qui existeraient entre les parties saccharidiques des glycolipides
permettraient l’agrégation latérale des lipides dans le feuillet exoplasmique de la bicouche des
microdomaines (Fig. 5.19) ; l’espace créé entre les chaînes hydrocarbonées par les interactions
entre les parties polaires volumineuses des glycolipides impliqués serait alors comblé par du
cholestérol.
Ces microdomaines enrichis en sphingolipides et cholestérol présentent une structure
cristalline ordonnée particulière nommée "Liquide ordonnée, Lo" (pour « Liquid ordered »).
Cette phase Liquide ordonnée est une phase intermédiaire entre la phase gel cristalline Lß et la
phase liquide cristalline (L). En effet, la phase Lo est caractérisée par une conformation
ordonnée des chaînes, similaire à celle de la phase Lß (peu de configurations gauche), et par une
rotation axiale et une mobilité latérale des lipides similaires à celles de la phase L (diffusion
latérale des lipides).
61
Figure 5.19. Modèle d’organisation des microdomaines (ou radeaux) membranaires.
Les radeaux en rouge, figure 5.21, ségréguent des autres régions de la membrane en bleu,
enrichies dans le feuillet exoplasmique en phosphatidylcholine insaturés. a) Les radeaux
contiennent des protéines attachées au feuillet exoplasmique de la bicouche par leur ancre
GlycosylPhosphatidylInositol (GPI), des protéines liées au feuillet cytoplasmique par leurs
chaînes acyles (ex : protéine YES de la famille des Src-kinase) ou des protéines
transmembranaires comme les hémaglutinines (HA). b) la bicouche lipidique du radeau est
asymétrique, avec les sphingomyélines et les glycosphingolipides en rouges, enrichis dans le
feuillet exoplasmique et les glycérophospholipides (comme les phosphatidylsérines ou les
phosphatidyléthanolamines en vert) dans le feuillet cytoplasmique. Le cholestérol en gris est
présent des deux côtés et remplit l’espace sous les têtes polaires des sphingolipides. D’après
Simons & Ikonen, Nature, 1997, 387, 569-572.
En espérant que ce cours vous aura intéressé et familiarisé avec ces constituants parfois
mal considérés, que sont les lipides membranaires, je vous souhaite une bonne révision …
62
ANNEXES
Annexe 1 : Technique de Folch
La technique de Folch est l’une des techniques couramment utilisées pour extraire les
lipides à partir des tissus.
Un volume de suspension tissulaire ou membranaire est mélangé à 20 volumes d’un
mélange chloroforme/méthanol (2 :1). Le résidu non solubilisé (protéines dénaturées) est éliminé
par filtration ou centrifugation. L’addition de 0,2 volumes d’eau à l’extrait lipidique conduit à un
système biphasique. La phase supérieure de composition chloroforme/méthanol/eau dans des
rapports 3/48/47 comprend les lipides les plus hydrophiles (glycosphingolipides acides,
glycosphingolipides neutres ayant une longue chaîne polysaccharidique). La phase inférieure,
principalement chloroformique (composition chloroforme/méthanol/eau : 86/14/1), comprend les
lipides les moins hydrophiles (phospholipides, stérols, sphingophospholipides,
glycosphingolipides à courte chaîne polysaccharidique), mais aussi les lipides non membranaires
comme les mono, di, triglycérides et les acides gras.
Une chromatographie sur couche mince est généralement effectuée sur un gel de silice de
faible épaisseur déposé sur une plaque d’aluminium. Le mélange de lipides dissous dans un
solvant organique est déposé à l’extrémité inférieure de la plaque (chromatographie ascendante).
Les lipides s’adsorbent sur le gel par interactions électrostatiques par l’intermédiaire de leur
partie polaire. L’extrémité inférieure de la plaque est plongée dans un solvant d’élution qui
migre le long de la plaque par capillarité, entraînant les différents lipides, et ce d’autant plus que
les interactions polaires avec le gel sont faibles. Les lipides sont donc séparés suivant le caractère
plus ou moins polaire de leur partie hydrophile.
Dans un solvant ou mélange de solvants donnés, la mobilité de chaque lipide peut-être
définie par la valeur de Rf, rapport entre la distance parcourue par le lipide et la distance
parcourue par le front du solvant. Deux lipides ayant des valeurs de Rf différentes seront séparés
au cours de la chromatographie. Cependant, aucun solvant ou mélange de solvants d’élution ne
permet de séparer tous les lipides les uns des autres. Il est le plus souvent nécessaire d’effectuer
plusieurs chromatographies successives en utilisant divers mélanges de solvants. Deux
chromatographies successives peuvent être réalisées sur la même plaque et combinées en une
seule chromatographie bidimensionnelle. À la fin de la première chromatographie, la plaque est
retournée de 90° et la seconde chromatographie est effectuée dans le second système de solvant.
63
d’acide gras sont retenus plus ou moins longtemps en fonction de leur affinité relative entre la
phase gazeuse et la phase liquide. L’affinité dépend de la longueur et du degré d’instauration des
chaînes. Les différents composants séparés par la colonne sont détectés à la sortie par ionisation.
L’intensité du courant détectée est proportionnelle à la quantité d’acide gras.
La spectroscopie RMN est basée sur le phénomène de spin (de l’anglais, « tourner très
rapidement sur soi-même »). Tout comme les électrons, les noyaux de certains atomes peuvent
avoir un spin.
La rotation sur elle-même de particules chargées (comme le proton ou l’électron) engendre
un courant électrique et un moment magnétique (Fig. A4.1) Ce mouvement circulaire (moment
cinétique intrinsèque) est appelé spin. Bien que le neutron ne porte pas de charge, il a également
un spin.
Figure A4.1. Un noyau avec un moment angulaire I différent de zéro se comporte comme un
petit barreau magnétique. La force et le champ magnétique produit par ce mouvement de spin
est exprimé par le moment magnétique µ.
Pour obtenir une Résonance Magnétique Nucléaire, il est nécessaire d’utiliser des noyaux
dont le spin nucléaire total est différent de 0. Il est établi que les noyaux possédant une masse
atomique (N) impaire ont un spin, tandis que ceux possédant une masse atomique paire n’ont :
- soit pas de spin si la charge nucléaire (Z) est paire ;
- soit ont un spin si la charge nucléaire (Z) est impaire.
(Ceci vient du fait que les protons (ou les neutrons), comme les électrons, s’associent en pairs de
spin opposé et le spin résultant est nul. Pour obtenir un spin non nul, il est donc nécessaire
d’avoir dans le noyau un proton ou un neutron non apparié. C’est la même chose pour les
électrons). La spectroscopie de résonance magnétique nucléaire concerne le spin du noyau,
tandis que la spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) concerne le spin de
l’électron).
À titre d’exemple, les noyaux suivants ont un spin nucléaire total qui vaut 1/2 : 1H; 13C,
31P, etc... et peuvent être utilisés en RMN.
Pour obtenir un spectre RMN, il faut placer l’échantillon de spin non nul dans un champ
magnétique externe (B0). Dans ces conditions, les spins des noyaux (c’est-à-dire les moments
64
magnétiques nucléaires induits) vont s’orienter comme « des petits aimants ». Pour les noyaux
de spin nucléaire total égal à 1/2, les moments magnétiques ne peuvent prendre que deux
orientations par rapport au champ magnétique externe, soit parallèle, soit anti-parallèle (Fig.
A4.2). Les deux orientations sont caractérisées par les états de spin +1/2 et -1/2. Ces deux états
de spin n’ont pas la même énergie, en présence du champ magnétique externe. L’écart entre ces
deux états est d’autant plus important que le champ magnétique externe est élevé (Fig. A4.3).
Figure A4.2. a) En absence de champ magnétique externe, les spins nucléaires sont orientés de
manière aléatoire les uns des autres. b) Quand un champ magnétique externe B0 est appliqué au
système nucléaire, les moments magnétiques µ s’orientent selon deux orientations possibles, soit
parallèle, soit anti-parallèle à la direction du champ magnétique externe.
Figure A4.3. Les noyaux qui ont un spin parallèle à la direction du champ magnétique externe
B0 possèdent un état énergétique plus bas que ceux qui ont un spin antiparallèle. La différence
d’énergie entre les deux états de spin est directement proportionnelle à la force du champ
magnétique externe : h = (h/2π) B0.
65
antiparallèle. Du fait de la plus grande stabilité de l’état parallèle, un léger excès de spins se
trouve dans cette configuration (Fig. A4.3).
La transition entre deux états de spin du noyau est caractéristique du noyau et dépend de
son environnement électronique. Comme dans toutes spectroscopies, si l’énergie d’une radiation
électromagnétique coïncide avec la différence d’énergie entre les deux états de spin (en
l’occurrence : S = +1/2 ou S =- 1/2), le noyau peut basculer de l’état de spin parallèle vers l’état
de spin anti-parallèle et absorber la radiation électromagnétique. Dans le cas contraire, il n’y a
pas d’absorption de la radiation électromagnétique. Ainsi, chaque noyau peut absorber une
radiation électromagnétique de fréquence bien caractéristique (appelée fréquence de Larmor
ou fréquence de résonance) qui peut donner lieu à des informations sur l’environnement du
noyau et de là, sur la structure de la molécule étudiée.
Pour qu’il y ait absorption, il faut que :
∆E = h = (h/2π) B0.
Dans un spectromètre RMN, c’est la fréquence 0 que l’on fixe (dans le domaine des
radiofréquences) et c’est l’intensité du champ magnétique que l’on fait varier, en ajoutant une
composante parallèle ∆B0 au champ magnétique B0. La résonance est obtenue quand :
Bvrai = B0 + Binduits
66
Le spectre RMN est exprimé en ppm (partie par million). Ceci est dû au fait que l’intensité
de la radiofréquence peut-être différente d’un appareil à un autre. Donc pour faire basculer un
noyau donné, il faudra des valeurs différentes de B0 en fonction de la fréquence utilisée. Par
exemple, pour un même proton, si la radiofréquence est de 60MHz, on observe un pic à 300Hz.
Par contre, si la radiofréquence est de 120 MHz, le pic sera observé à 600Hz. Pour résoudre ce
problème, on utilise le rapport :
Position du pic en Hz
=
Radiofréquence en MHz
Ainsi, si l’on reprend l’exemple précédent, = 300/60 = 600/120 = 5 ppm (partie par
million de la fréquence utilisée).
Le spectre est donc représenté de droite à gauche sur une échelle de 0 à plusieurs dizaines
de ppm (cf. Fig. 4.9 ; 4.10 ; 4.11). Les signaux apparaissent à des valeurs données en ppm que
l’on appelle déplacement chimique. Le déplacement chimique est le terme qui regroupe les
effets de l’environnement atomique ou moléculaire sur la fréquence de Larmor du noyau
considéré.
67