Pathologie Biologie 54 (2006) 285–292

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Article original

Détection de la colonisation nasale de Staphylococcus aureus

résistant à la méthicilline : étude prospective comparant
l’amplification génique temps réel vs les milieux chromogènes sélectifs

Detection of nasal colonization methicillin-resistant

Staphylococcus aureus: a prospective study comparing real-time
genic amplification assay vs selective chromogenic media
J.-C. Nguyen Van a,*, M.-D. Kitzis a, A. Ly a, A. Chalfine b, J. Carlet c, A. Ben Ali a, F. Goldstein a
a
Laboratoire de microbiologie médicale, Fondation hôpital Saint-Joseph, 185, rue Raymond-Losserand 75674 Paris cedex 14, France
b
Unité d’hygiène et de lutte contre les infections nosocomiales (UHLIN),
Fondation hôpital Saint-Joseph, 185, rue Raymond-Losserand 75674 Paris cedex 14, France
c
Service de réanimation polyvalente et CLIN, Fondation hôpital Saint-Joseph, 185, rue Raymond-Losserand 75674 Paris cedex 14, France

Reçu le 3 mai 2005 ; accepté le 12 janvier 2006

Disponible sur internet le 10 mars 2006

Résumé

L’amplification génique temps réel à la différence de l’amplification génique « classique » peut être réalisée dans tous les laboratoires sans
recours à des locaux sophistiqués. Elle permet de plus une détection très précoce (deux heures) comparée à la culture. Le but de l’étude est
d’évaluer la faisabilité de l’amplification génique temps réel en routine lors d’une étude prospective en comparaison avec les milieux chromo-
gènes.
Patients et méthodes. – Cette étude a débuté en juillet 2004 sur une période de quatre mois chez les patients entrant dans quatre services et
682 écouvillons nasaux ont été prélevés chez 508 patients.
Résultats. – Soixante-quatre (9,3 %) étaient positifs par amplification génique et par culture (CHROMagar™ MRSA, MRSASelect et/ou
ORSAB), 19 (2,9 %) étaient positifs par amplification génique seulement (trois patients étaient sous traitement antibiotique), 572 échantillons
étaient négatifs par les deux techniques. La sensibilité et la spécificité de ce test étaient de 95,7 et de 96,8 % respectivement avec une valeur
prédictive positive de 70 % et une valeur prédictive négative de 96,6 %. Initialement, 82 échantillons n’ont pas donné de résultat par amplifica-
tion génique (12 %). Trente-huit d’entre eux ont été résolus à la suite d’un cycle de congélation–décongélation. Au final, 44 échantillons (6,4 %)
sont sans résultat d’amplification génique. La comparaison des résultats des cultures montrent une bonne corrélation pour les milieux chromo-
gènes CHROMagar™ MRSA et MRSASelect (positivité à 24 heures de 5,5 et 5,6 % respectivement). Ces deux milieux permettent une meilleure
détection à 24 heures par rapport au milieu chromogène ORSAB.
Conclusion. – Les résultats obtenus dans cette étude par amplification génique temps réel pour la détection nasale des staphylocoques dorés
résistants à la méthicilline sont prometteurs. Malgré 6,4 % d’échantillons dépourvus de résultats par amplification génique nous considérons que
le kit IDI-MRSA™ constitue une avancée significative pour la rapidité de la détection des patients colonisés.
© 2006 Elsevier SAS. Tous droits réservés.

* Auteurcorrespondant.
Adresse e-mail : jcnguyen@hopital-saint-joseph.org (J.-C. Nguyen Van).

0369-8114/$ - see front matter © 2006 Elsevier SAS. Tous droits réservés.
doi:10.1016/j.patbio.2006.01.001
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Abstract
In contrast to « classical » genic amplification, real-time genic amplification can be performed in every laboratory without the need of
sophisticated isolation procedures. Moreover, real-time genic amplification allows an early detection of meticillin resistant Staphylococcus aureus
colonization, 2 hours compared to 1 or 2 days for culture.
Objective. – In order to assess the feasibility on Smartcycler® of the IDI-MRSA™ real-time genic amplification assay in comparison with
chromogenic media.
Methods. – A prospective study has been initiated in July 2004: nasal swabs were taken from patients entering the ICU, vascular surgery,
diabetology and geriatry wards. During a 4 months period, 682 specimens have been obtained from 508 patients.
Results. – Sixty-four (9.3%) patients were positive by genic amplification and selective agar culture (CHROMagar™ MRSA, MRSASelect
and/or ORSAB), 19 (2.9%) were positive by genic amplification only (3 of these patients were under antibiotic treatment); 572 specimens
remained negative by both methods. The sensitivity and specificity of this assay were 100% and 96% respectively with a positive predictive
value of 70% and negative predictive value of 100%. Initially 82 nasal specimens were unresolved (12%). 38 were resolved following a freeze-
thaw cycle. Thus, 44 (6.4%) were unresolved specimens. Comparison between CHROMagar™ MRSA and MRSASelect showed a good correla-
tion for the detection at 24 hours (5.5% and 5.6% respectively). These two chromogenic media allowed a much better detection of MRSA than
ORSAB medium within 24H.
Conclusion. – The results obtained by the early real-time genic amplification for the detection of meticillin resistant Staphylococcus aureus
are promising. Despite 6.4% amplification failure, we consider that IDI-MRSA™ real-time genic amplification assay represents a significant
breakthrough in the detection of colonization.
© 2006 Elsevier SAS. Tous droits réservés.

Mots clés : PCR temps réel ; Staphylococcus aureus ; Résistance à la méthicilline ; Détection nasale

Keywords: Real time PCR; Staphylococcus aureus; Methicillin resistance; Nasal detection

1. Introduction d’identifier les sujets porteurs de SARM asymptomatiques.

Le staphylocoque doré est classé parmi les pathogènes les
plus fréquemment responsables d’infections nosocomiales [1,
2]. La place des antibiotiques pour traiter ces infections est
exemplaire historiquement, car c’est précisément chez cette es-
pèce bactérienne que les premiers cas de résistance aux anti-
infectieux ont été rapportés [3,4]. Actuellement, les souches
de Staphylococcus aureus résistantes à la méthicilline ou
SARM représentent un problème de santé public majeur et sont
responsables d’une endémoépidémie chronique hospitalière à
l’échelle mondiale. Les SARM ont la capacité de diffuser de
façon épidémique dans les hôpitaux et les établissements de
soins mais il a été aussi montré qu’ils peuvent être de plus en
plus fréquemment d’origine communautaire [5,6]. Le portage
joue un rôle important dans la survenue des infections [7,8] et
constitue en soi un facteur de risque élevé de bactériémie à
SARM [9]. En France, plusieurs études ont permis d’objectiver
des taux de portage variables dans différentes situations :
● 6,3 % parmi les personnels hospitaliers [10] ;
● 6,9 % à l’admission de patients en unité de soins intensifs
[11] ;
● 8,4 % chez des patients présentant une fracture du col du
fémur [12] ;
● et jusqu’à 11,8 % chez des patients cirrhotiques à l’admis-
sion en service d’hépatogastroentérologie [13].
Les taux de morbidité et de mortalité attribuables aux infec-
tions à SARM sont controversés [14] mais il est actuellement
admis que ces infections entraînent un allongement significatif
des durées de séjour et des coûts hospitaliers [15]. Le dépistage
des patients à l’admission et en cours d’hospitalisation permet
Cette stratégie de dépistage constitue une composante majeure
de tout programme de contrôle [16] et la mise en application
des mesures d’isolement géographique et technique permet
d’éviter la transmission croisée. Ainsi, l’importance du dépis-
tage systématique du portage du SARM à l’admission pour les
patients âgés de plus de 75 ans a été récemment attestée par une
étude française [17]. Sans ce dépistage, 84,1 % des porteurs des
SARM n’auraient pas été détectés à l’admission et 76,2 % du-
rant leur séjour. D’un point de vue efficacité, le rapport coût/
bénéfice d’une politique volontaire de prévention des SARM
incluant le dépistage a été démontré à l’admission dans l’hôpital
[18] et dans les unités de soins intensifs [19]. L’efficacité du
dépistage des SARM a été également rapportée dans les servi-
ces de moyens séjours [20]. Il apparaît qu’une stratégie efficace
repose sur l’identification de la totalité du réservoir de SARM.
Cela implique notamment qu’un dépistage systématique soit ef-
fectué dans les établissement de moyens séjours qui sont à ce
jour au centre des épidémies de colonisation par le SARM [21].
En France et aux États-Unis de nombreuses recommandations
ont été publiées [22,23] afin de prévenir la transmission noso-
comiale des SARM. Le prélèvement recommandé pour le dé-
pistage des SARM est le prélèvement nasal [23] car les fosses
nasales antérieures sont un des sites de portage préférentiel de
cette bactérie et la fréquence du portage cutané dépend du por-
tage nasal [24]. Ce dépistage au laboratoire est fondé sur la
mise en évidence de la résistance à la méthicilline du staphylo-
coque doré. La résistance à la méthicilline chez les staphyloco-
ques est principalement due à la présence du gène mecA présent
dans une cassette SCCmec [25], élément génétique mobile in-
tégré dans le chromosome. Ce gène code pour une transpepti-
dase appelée PLP2a, impliquée dans la synthèse du peptidogly-
cane et qui a une faible affinité pour la bêtalactamine [26].
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Différentes techniques permettant de détecter rapidement in
vitro la résistance à la méthicilline des staphylocoques ont été
développées ces dernières années notamment :
● des techniques phénotypiques à l’aide de latex sensibilisé
afin de détecter la PLP2a [27] ;
● des techniques génotypiques à la recherche du gène mecA
par PCR classique [28,29] et par PCR temps réel [30–32].
La PCR temps réel à la différence de la PCR « classique »
peut être réalisée dans tous les laboratoires sans recours à des
locaux sophistiqués. Elle permet de plus une détection très ra-
pide (deux heures) comparée à la culture sur milieux sélectifs
chromogènes de dernière génération (un jour) ou sur milieux
chromogènes classiques de type gélose NaCl–mannitol (deux
jours) contribuant à un isolement précoce des patients colonisés
limitant ainsi la dissémination bactérienne des SARM. Le kit
IDI-MRSA™ est un test de diagnostic in vitro de conception
canadienne (InfectioDiagnostic [IDI] Inc., Québec, Canada) et
commercialisé en France par la société Instrumentation Labora-
tory (Paris). Le test est réalisé sur l’appareil Smart CyclerMD
(Cepheid, Instrumentation Laboratory, Paris) utilisant la PCR
temps réel pour amplifier une séquence d’ADN de SARM et
l’hybridation de sondes fluorogéniques spécifiques pour détec-
ter les produits amplifiés. Le test kit IDI-MRSA™ détecte une
séquence moléculaire unique qui présente une double particula-
rité : une partie de cette séquence provient du chromosome de
S. aureus (gène orfX) et l’autre moitié se trouve dans la cassette
SCCmec.
Nous rapportons ici les résultats d’une étude prospective
dont le but était d’évaluer en routine la PCR temps réel appli-
quée au dépistage nasal du SARM en comparaison avec des
milieux chromogéniques sélectifs de dernière génération.
2. Matériels et méthodes
2.1. Patients et prélèvements
L’étude a été initiée en juillet 2004 à la Fondation hôpital
Saint-Joseph (450 lits dont 60 % de lits de médecine et 40 %
de lits de chirurgie, sans obstétrique ni pédiatrie) et s’est dérou-
lée sur quatre mois en ciblant les patients à haut risque de por-
tage de SARM. Le pourcentage de résistance en 2004 au sein
de l’espèce est de 29,5 % de SARM.
La stratégie du CLIN de notre établissement vis-à-vis des
bactéries multirésistantes est permanente depuis plus de dix
ans et comporte notamment une politique de dépistage ciblée
(SARM, entérobactéries à bêtalactamase à spectre étendu, Pseu-
domonas aeruginosa) initiée en 1994 au niveau des unités de
soins intensifs et particulièrement en réanimation polyvalente
(service du Dr Carlet). Le laboratoire de microbiologie médi-
cale notifie systématiquement de façon journalière tous les pa-
tients porteurs de SARM à l’unité d’hygiène (Dr Chalfine).
L’unité d’hygiène appelle les services pour la mise en isolement
des patients. Depuis 2001, une visite systématique de l’équipe
d’hygiène dans les chambres des patients porteurs de SARM est
effectuée avec évaluation des mesures d’isolement et correction
287
immédiate des mesures si nécessaire. Depuis 2002, la création
d’une base de données avec l’identification des patients connus
porteurs de SARM dans notre hôpital permet aux infirmières de
mettre en isolement un patient à l’arrivée dans leur service.
Cette étude de dépistage s’intègre donc dans cette stratégie
du CLIN afin d’améliorer la précocité de l’isolement et du dé-
pistage par culture sur milieu sélectif chromogène ORSAB.
Parmi les critères permettant de cibler les patients éligibles
figurent :
● les patients déjà connus à SARM (parfois à plusieurs années
d’intervalle) ;
● les patients avec antécédent de transfert dans l’hôpital (sor-
tant d’une unité ou d’un service) ou d’hospitalisation (venant
d’un autre hôpital) ;
● les patients porteurs de plaies c’est-à-dire toutes lésions cu-
tanées avec ulcère, escarre, excoriation, mal perforant, etc…
à l’exclusion des incisions chirurgicales ;
● les patients âgés de 70 ans ou plus.
Le dépistage a nécessité leur consentement éclairé et les pa-
tients ont été informés sous la forme d’un écrit. L’étude a porté
sur ceux entrant dans le service de réanimation polyvalente, de
chirurgie vasculaire, de diabétologie et de gériatrie–lits d’ur-
gence sur une période de quatre mois (de juillet à octobre
2004) ont été prélevés chez 508 patients. Les prélèvements
ont été obtenus à l’aide d’un écouvillon introduit soigneuse-
ment et profondément dans la narine (2,5 cm à partir du bord
de la narine) et tourné délicatement sur lui-même cinq fois par
narine. Deux types d’écouvillons non préhumidifiés ont été uti-
lisés : écouvillons standard (Copan) et écouvillons dédiés (Co-
pan Venturi Transsystem®). Le délai d’acheminement des pré-
lèvements au laboratoire est d’une heure en moyenne puis les
échantillons sont conservés au réfrigérateur à +4 °C. Le délai
moyen avant technique des échantillons est compris entre deux
et quatre heures.
2.2. PCR temps réel
2.2.1. Préparation de l’échantillon clinique
Les échantillons ont été traités conformément aux instruc-
tions du fabricant. La lyse des cellules et la préparation de
l’ADN ont été effectuées à l’aide d’un ensemble de deux tubes
par patient fournis dans le kit. Les écouvillons nasaux ont été
déchargés dans un tube de tampon de 1 ml puis agités à l’aide
d’un vortex et une fraction est transférée dans un tube de lyse.
Après une centrifugation à grande vitesse à 21 000 g pendant
cinq minutes, le surnageant a été éliminé et 50 μl de solution
tampon a été ajoutée au tube de lyse. La lyse bactérienne a été
effectuée par agitation sur vortex pendant cinq minutes. Enfin,
les tubes de lyse ont été centrifugés deux à cinq secondes,
chauffés pendant deux minutes à 95 °C et conservés sur de la
glace pilée. (Ces lysats sont stables jusqu’à quatre heures entre
2 et 8 °C).
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2.2.2. PCR–IDI-MRSA™
La PCR temps réel a été effectuée sur un appareil modulaire
multiparamétrique ouvert nommé Smart CyclerMD (Cepheid,
Instrumentation Laboratory, Paris, France). La trousse utilisée
IDI-MRSA™ (InfectioDiagnostic (IDI) Inc., Québec, Canada)
est fondée sur l’amplification d’une séquence dans le site d’in-
sertion de la cassette chromosomique SCCmec [33] qui porte le
gène mecA et une cible spécifique de S. aureus (gène orfX chro-
mosomique de fonction inconnue, hautement conservé localisé
près du site d’intégration SCCmec). Le détail de la cible a été
décrit par Huletsky [34]. Il s’agit d’une PCR multiplex avec
cinq amorces spécifiques couvrant l’ensemble des différentes
cassettes de staphylocoque SCCmec décrites dans le monde
[34,35].
Une aliquote du lysat a été ajoutée au mélange réactionnel de
PCR contenant notamment les amorces spécifiques de SARM
afin d’amplifier la cible, si elle est présente. Le temps imparti
pour effectuer une série amplification–détection est d’environ
60 à 75 minutes, dépendante du nombre d’échantillons à traiter ;
chaque série comporte au maximum 14 échantillons par patient
par module avec un témoin positif et négatif. L’amplification
d’un contrôle interne constitué d’un fragment d’ADN de 355
paires de bases comportant une séquence de 277 paires de bases
non retrouvée chez S. aureus a permis d’attester le bon dérou-
lement de l’amplification, de garantir l’intégrité des réactifs et
d’écarter l’éventualité de la présence de substances inhibitrices
de PCR. En cas de résultats non résolus, le test a été répété
après un cycle de congélation–décongélation à partir de l’ex-
traction.
Les cibles d’ADN amplifiées ont été détectées à l’aide de
sondes moléculaires de type « beacon ». Pour la détection des
amplicons du SARM, la sonde moléculaire est marquée par le
fluorophore FAM à son extrémité 5′ et par le DABCYL, molé-
cule absorbante non fluorescente à son extrémité 3′. Les ampli-
cons du contrôle interne sont détectés par une molécule mar-
quée par le fluorophore TET à l’extrémité 5′ et le DABCYL à
l’extrémité 3′. Chaque hybride « beacon-cible » émet une fluo-
rescence à une longueur d’onde caractéristique du fluorophore
utilisé pour marquer la sonde « beacon ». La quantité de fluo-
rescence émise à chaque cycle est proportionnelle à la quantité
de produits amplifiés spécifiques présents. Le Smart CyclerMD
mesure simultanément la fluorescence émise par chaque sonde
« beacon » et interprète les données générées afin de fournir un
résultat final à la fin du programme PCR.
2.3. Cultures
Les milieux de culture chromogènes ont été fournis par les
fabricants suivants :
● ORSAB distribué par Oxoid (Dardilly, France). Il s’agit d’un
milieu chromogène sélectif additionné d’oxacilline à la
concentration de 6 mg/l ;
● CHROMagar™MRSA distribué par CHROMagar Microbio-
logy (Paris, France). Il s’agit d’un milieu chromogène sélec-
tif par addition d’une bêtalactamine que le fabricant ne pré-
cise pas volontairement ;
● MRSASelect distribué par Bio-Rad (Marnes la Coquette,
France). Il s’agit d’un milieu chromogène sélectif par addi-
tion de céfoxitine dont la concentration n’est volontairement
pas communiquée par le fabricant ;
● l’évaluation de ce milieu n’a débuté qu’au milieu du mois
d’août 2004. Le nombre de boîtes testées est donc moindre
(n = 443).
L’ensemencement sur boîte a pu être mené en parallèle à
partir de l’écouvillon déchargé dans le tampon d’échantillon
utilisé lors de l’extraction pour la PCR. Afin d’optimiser et
d’augmenter la sensibilité de l’ensemencement, un enrichisse-
ment en bouillon BHI incubé deux heures a été réalisé avant
d’ensemencer chacune des trois boîtes (50 μl/boîte).
Les critères d’identification présomptive de S. aureus étaient
les suivants :
● sur milieu ORSAB, la présence de colonies bleues après 24
ou 48 heures d’incubation à 37 °C associé à un test à la
coagulase pour pallier le défaut de spécificité avec les sta-
phylocoques à coagulase négative ;
● sur milieu CHROMagar™MRSA, la présence de colonies
mauves bien séparées après 24 heures d’incubation à 37 °C ;
● sur milieu MRSASelect, la présence de colonies roses bien
séparées après 24 heures d’incubation à 37 °C.
L’identification des isolats de SARM a été ensuite confirmée
par le test à la coagulase (Marnes la Coquette, France) et par
l’antibiogramme standard en milieu solide. Un échantillon a été
défini comme positif par culture lorsque le SARM pousse sur
un ou plusieurs milieux.
En cas de positivité de la PCR et de culture négative à
24 heures, il y a eu prolongation de l’incubation à 37 °C des
trois milieux chromogènes jusqu’à 48 heures. Si le résultat de la
culture était toujours négatif, les trois milieux chromogènes ont
été ensemencés avec 100 μl de bouillon d’enrichissement de
l’inoculum initial gardé à 37 °C de façon à augmenter la sensi-
bilité de la culture en cas de prélèvement à faible inoculum.
3. Résultats
3.1. PCR temps réel
Six cent quatre-vingt-deux échantillons issus de 508 patients
ont été étudiés dans 90 séries (moyenne d’échantillon par sé-
rie = 7,5). La répartition en fonction des services des échantil-
lons obtenus était la suivante :
● 42,1 % pour les lits d’urgence–gériatrie ;
● 36,6 % pour la réanimation polyvalente ;
● 11,1 % pour la diabétologie ;
● et 10,2 % pour la chirurgie vasculaire.
Soixante-quatre prélèvements étaient positifs par PCR et par
culture soit 9,3 % des échantillons totaux ; 19 (2,9 %) étaient
positifs uniquement par PCR (trois patients étant sous antibio-
tique à visée antistaphylococcique) ; 572 échantillons étaient
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négatifs par PCR et par culture. La sensibilité et la spécificité
du test PCR IDI-MRSA™ sont de 95,7 et 96,8 % respective-
ment avec une valeur prédictive positive de 70 % et une valeur
prédictive négative de 96,6 % (Tableau 1).
Initialement, 82 échantillons n’ont pas donné de résultat par
PCR (12 %). Trente-huit d’entre eux ont été résolus à la suite
d’un cycle de congélation–décongélation. Au final, 44 échantil-
lons (6,4 %) sont sans résultat de PCR.
En fonction du type d’écouvillon utilisé, aucune différence
pour les résultats de PCR positifs n’a été observée entre écou-
villon dédié (Copan Venturi Transsystem® recommandé pour le
kit IDI-MRSA™) et l’écouvillon standard (Copan) mais une dif-
férence significative pour les échantillons sans résultat de PCR
a été observée avec les écouvillons standard. Ainsi, on observe
le même taux de positivité au premier passage (Tableau 2) que
l’écouvillon soit de type standard ou dédié (8,6 et 8,4 % respec-
tivement). En revanche, le nombre d’échantillons sans résultat
de PCR au second passage après un cycle de congélation–dé-
congélation de l’extrait est nettement plus élevé avec l’écouvil-
lon de type standard (8 vs 3,9 %).
3.2. Cultures
Six cent quatre-vingt-deux échantillons ont été testés sur
ORSAB et CHROMagar™MRSA et seulement 443 sur MRSA-
Select. Les milieux CHROMagar™MRSA et MRSASelect per-
mettent une meilleure détection des SARM. Cette détection est
plus précoce après une durée d’incubation de 24 heures compa-
rée à celle du milieu ORSAB. Ainsi, après 24 heures d’incuba-
tion, 6 % de positivité est retrouvée pour les milieux
CHROMagar™MRSA et MRSASelect et seulement 3 % pour
Tableau 1
Résultats obtenus par PCR temps réel avec le kit IDI-MRSA™ comparés à la
culture bactérienne
Culture
Positif Négatif
IDI MRSA™ Positif 45 19
Négatif 2 572
Total 47 591
Tableau 2
Résultats PCR ininterprétable et type d’écouvillon utilisé
Négatif Positif
Écouvillon dédié 182 19
(%) (82) (8,6)
Écouvillon standard 360 39
(%) (78) (8,4)
ORSAB. À 48 heures d’incubation, le milieu ORSAB comble
son retard mais sans toutefois atteindre la performance des mi-
lieux CHROMagar™MRSA et MRSASelect (Tableau 3).
En fonction du type d’écouvillon utilisé les résultats des
cultures positives n’ont montré aucune différence notable.
4. Discussion
4.1. PCR temps réel
La plupart des tests moléculaires développés à ce jour sont
fondés sur la détection de gène spécifique de S. aureus et/ou du
gène mecA. L’application de ces tests ne peut concerner des
échantillons nasaux sans une étape préalable d’isolement d’un
staphylocoque doré en culture pure car ces prélèvements
contiennent souvent à la fois du staphylocoque à coagulase né-
gative et du staphylocoque doré qui peuvent chacun être por-
teurs du gène mec. L’intérêt du test IDI-MRSA qui ne recher-
che pas directement le gène mecA est de permettre de détecter
rapidement le SARM dans un prélèvement comprenant un mé-
lange de staphylocoques sans une étape préalable d’isolement.
Dans cette étude, la valeur prédictive positive de la PCR
temps réel est de 70 %. Ainsi, 19 échantillons présentent un
résultat positif par PCR et une culture négative. Des études
par séquençage à partir des extraits permettraient de déterminer
si ces échantillons « faux positifs » correspondent à de vrais
positifs. L’analyse des courbes sigmoïdes des courbes d’ampli-
fication de PCR constitue pour 18 des 19 échantillons des élé-
ments objectifs permettant de penser qu’il s’agit de vrais posi-
tifs. Des séquençages pourraient confirmer ces données. Si
c’était le cas, cela augmenterait significativement la valeur pré-
dictive positive du test qui passerait alors à 98 %. Plusieurs
hypothèses peuvent expliquer ces résultats PCR positive et
culture négative : l’excision du gène mecA au sein de la cassette
SCCmec, la détection de génome bactérien sans viabilité du fait
Total d’un traitement antibiotique antérieur ou au moment du prélè-
64 vement, la meilleure sensibilité de la PCR comparée à la culture
574
en présence d’un faible inoculum bactérien, Ainsi, un résultat
638
positif n’indique pas forcément la présence de micro-organis-
PCR temps réel IDI-MRSA™
Ininterprétable Ininterprétable Ininterprétable n = 682
puis négatif puis positif deux fois
12 0 8
(5) (0) (3,9) 221
21 5 36 461
(5) (0,01) (8,0)

Tableau 3
Comparaison pour les cultures positives entre les trois milieux chromogènes utilisés (ORSAB, CHROMagar™MRSA, MRSASelect)
Milieu testé ORSAB CHROMagar™MRSA MRSASelect
Nombre n = 682 n = 682 n = 443
Positif en 24 heures 20 (2,9 %) 38 (5,5 %) 25 (5,6 %)
Positif en 48 heures 14 1 0
Positif sur bouillon après 24 heures d’enrichissement 3 3 3
Total 37 (5,4 %) 42(6,1 %) 28(6,3 %)
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mes viables. Il est toutefois présomptif de la présence du
SARM puisque la PCR détecte de façon concomitante la cas-
sette SSCmec et une séquence spécifique du staphylocoque
doré située à l’intérieur du gène orfX.
Deux échantillons ont présenté un résultat PCR négative
–– culture positive. Plusieurs hypothèses peuvent être émises :
un autre mécanisme de résistance à la méthicilline ou la pré-
sence de mutations dans les régions d’hybridation des sondes
ou des amorces correspondant à de nouveaux variants de
SARM. Ainsi, dans une étude similaire de détection nasale
du SARM par PCR temps réel [36], les auteurs émettent l’idée
d’une variabilité dans la cassette SCCmec ou dans la séquence
orfX spécifique du staphylocoque doré.
Le taux de résultats ininterprétables au second passage après
un cycle de congélation–décongélation de l’extrait est signifi-
cativement plus élevé avec l’écouvillon de type standard (8 vs
3,9 %) ce qui impose l’emploi d’écouvillons dédiés (Copan
Venturi Transsystem), ceux-ci permettraient un relargage de
substances inhibitrices de la PCR via la présence d’un petit
manchon à l’extrémité du support de recueil de l’écouvillon.
Parmi les substances potentiellement interférentes figurent de
façon non exhaustive : le sang, l’excès de sécrétions nasales,
les topiques, les décongestionnants etc. Au final, 44 échantil-
lons (6,4 %) sont restés sans résultat de PCR et n’ont pu béné-
ficier que du résultat par culture. Ce taux élevé de PCR inin-
terprétables semble ne pas avoir été retrouvé dans une étude
récente utilisant le même kit dans la détection nasale [37] mais
un certain nombre d’échantillons restés ininterprétables ont été
exclus par l’auteur sans en préciser rigoureusement le nombre.
Il est important de souligner, comme pour tout prélèvement
en biologie que la qualité du prélèvement influe sur le résultat
puisqu’il a été parfois possible de constater des résultats dis-
cordants (positif et négatif) dans une même série avec deux
échantillons d’un même patient. Classiquement, il est admis
qu’un prélèvement de qualité doit faire un peu pleurer le pa-
tient.
Du fait de la bonne valeur prédictive négative (96,6 %) de la
PCR temps réel IDI-MRSA™, nous n’effectuons plus actuelle-
ment en routine les cultures pour les échantillons avec un ré-
sultat de PCR négative. En revanche, pour les résultats positifs
et pour les cas de PCR ininterprétable, une culture systéma-
tique sur milieu chromogène est effectuée. En pratique, il est
donc concevable de substituer la culture par la PCR temps réel
pour une grande partie des échantillons.
Le coût de la technique est de 30 euros hors taxe par test.
Ce coût est à moduler en fonction du volume d’échantillon à
étudier. Le temps technicien peut être évalué au triple de la
technique de la culture habituelle.
4.2. Culture
Du fait de l’expression hétérogène in vitro du gène mecA,
l’utilisation de milieu sélectif est nécessaire pour faciliter la
détection des SARM en culture. Le laps de temps entre l’ense-
mencement sur milieu de culture des écouvillons nasaux et
l’identification du SARM est habituellement de 48 heures par-
fois jusqu’à 96 heures [38]. De nombreuses techniques ont été
développées pour raccourcir ce temps avec des sensibilités qui
oscillent entre 65 et 100 % [38]. Les techniques chromogéni-
ques incorporant un sélecteur de type céphalosporine de
deuxième génération (céfoxitine ou apparentée) à l’image des
recommandations 2004 du CA-SFM [39] pour tester la sensi-
bilité des souches hétérogènes à l’oxacilline constituent un pro-
grès significatif dans la détection des SARM. Au regard des
résultats des cultures obtenus à 24 heures dans notre étude,
nous considérons néanmoins que le milieu chromogène OR-
SAB n’est plus à ce jour recommandé pour le dépistage des
SARM. En effet, l’utilisation de l’oxacilline comme sélecteur
antibiotique n’apparaît pas pertinent vis-à-vis des souches hé-
térogènes. De plus, l’utilisation de l’aniline dans la base gélo-
sée qui permet de caractériser les souches mannitol positives
entraîne un défaut de spécificité notable vis-à-vis des staphylo-
coques à coagulase négative mannitol positifs. Enfin, l’utilisa-
tion d’un test au latex de confirmation de staphylocoque doré
(autre que celui d’Oxoid) n’est pas applicable pour le milieu
ORSAB du fait du caractère non homogène des colonies lors
du test d’agglutination. Ce qui impose un recours systématique
au test à la coagulase.
La durée des temps d’incubation des milieux chromogènes
est importante à respecter pour les milieux
CHROMagar™MRSA et MRSASelect. Selon notre expérience
et suivant les instructions des fabricants, il est indispensable de
faire une lecture scrupuleuse après 24 heures d’incubation pour
éviter des défauts de spécificité. Ces deux milieux chromogè-
nes CHROMagar™MRSA et MRSASelect ont été évalués ré-
cemment et les résultats sont très performants [40,41]. Ainsi, le
milieu CHROMagar™MRSA présente une sensibilité de
95,4 % à 24 heures et une spécificité de 100 % sur des souches
de collection et le milieu MRSASelect une sensibilité de 99 %
et une spécificité de 99 % sur des souches dépistées par écou-
villonnage nasal. La détection aisée et fiable des colonies de
SARM sur milieux CHROMagar™MRSA et MRSASelect ren-
dent ces milieux particulièrement adaptés en routine en l’ab-
sence de tests complémentaires longs et coûteux.
5. Conclusion
Les résultats obtenus dans cette étude par PCR temps réel
pour la détection nasale du SARM sont prometteurs. Malgré
6,4 % de résultats non résolus, nous considérons que le kit IDI-
MRSA™ du fait de son excellente sensibilité constitue une
avancée significative pour la détection des patients colonisés
à SARM.
La détection aisée et fiable des colonies de SARM sur mi-
lieux CHROMagar™MRSA et MRSASelect rendent ces mi-
lieux particulièrement adaptés en routine. Nous ne recomman-
dons pas actuellement le milieu ORSAB pour la détection
nasale des SARM.
Le Programme national de prévention des infections noso-
comiales 2005–2008 [42] précise notamment que « le domaine
de la prévention des infections liées aux soins devraient ainsi
faire l’objet de travaux de recherche prioritaires, soutenus par
 J.-C. Nguyen Van et al. / Pathologie Biologie 54 (2006) 285–292
les programmes institutionnels (PHRC…) ». Parmi ces travaux
figurent « le développement des techniques de diagnostic ra-
pide afin d’améliorer les stratégies de prophylaxie et de prise
en charge précoce ». Les résultats de la technique PCR temps
réel rapportés dans cette étude correspondent aux attentes des
professionnels de santé en termes de qualité de résultats et de
rapidité d’obtention. Il reste à objectiver dans notre hôpital sur
le versant hygiène le bénéfice réel obtenu des mesures d’isole-
ment ainsi initiées.
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