Pathologie Biologie 54 (2006) 506–509

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Apport de l’utilisation de la gélose MRSASelect BioRad

pour la détection de routine de la résistance
à la méticilline des staphylocoques isolés de flacons d’hémoculture
Use of BioRad plating agar MRSASelect for the daily detection of methicillin
resistant staphylococci isolated from samples taken from blood culture bottles
P. Harriau*, F. Ruffel, J.-B. Lardy
Laboratoire Harriau–Lardy–Ruffel, 53, rue Henri-Barbusse, 18200 Saint-Amand-Montrond, France

Disponible sur internet le 05 octobre 2006

Résumé
Dans le cadre de l’activité d’un laboratoire de biologie polyvalente de taille moyenne, il n’est pas toujours aisé de mettre en œuvre les
méthodes de détection rapide de la résistance à la méticilline des staphylocoques (détection du gène mecA ou de la PLP2a). Utilisant déjà les
géloses sélectives chromogènes MRSASelect BioRad pour le dépistage des porteurs de Staphylococcus aureus résistant à la méticilline, nous
avons voulu tester leur utilisation dans le cas des prélèvements réalisés sur flacons d’hémoculture. De décembre 2004 à octobre 2005, tous les
flacons d’hémocultures détectés positifs et montrant des cocci à coloration de Gram positif évocateurs de staphylocoques à l’examen direct, soit
45 paires d’hémocultures et trois liquides articulaires, ont été ensemencés en cadrans sur une gélose MRSASelect en plus des géloses standards
non sélectives. Après culture, un antibiogramme a été réalisé par la méthode des disques. Aucune discordance n’a été observée tant au niveau des
possibilités de cultures, qu’au niveau de la mise en évidence de la résistance à la méticilline aussi bien pour Staphylococcus aureus que pour les
staphylocoques à coagulase négative quelle que soit leur espèce. De plus, la coloration rouge des Staphylococcus aureus sur le milieu permet la
visualisation des colonies après une dizaine d’heures d’incubation seulement, permettant ainsi de prévenir rapidement le clinicien de la suspicion
d’isolement d’un Staphylococcus aureus résistant à la méticilline. De même, en cas de culture polymicrobienne, la différence de coloration des
colonies de Staphylococcus aureus (rouges) et de staphylocoques à coagulase négative (blanches) est d’une grande utilité.
© 2006 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
Abstract
Within a medium size general biology laboratory, it is not always easy to set up rapid methods for detection of methicillin-resistant staphy-
lococci (detection of the mecA gene or PLP2a). Since we already use BioRad chromogenic plating agar MRSASelect for the detection of carriers
of methicillin resistant Staphylococcus aureus, we wanted to test its use on samples taken from blood culture bottles. Between December 2004
and October 2005, all the blood bottle cultures that detected positive by direct examination for Gram positive cocci and suspected to be staphy-
lococci, that is 45 pairs of blood cultures and 3 joint aspirations, were inoculated on quarter plates of both MRSASelect and standard non-
selective agar. After culture, they were screened by the disc method. No mismatch was observed between the cultures themselves or the high-
lighting of methicillin resistance in either Staphylococcus aureus isolates or for coagulase-negative staphylococci, regardless of species. Further-
more, the red colour of Staphylococcus aureus on the medium allowed visualisation of the colonies after only about ten hours incubation, thus
giving the clinician rapid warning of suspected methicillin resistant Staphylococcus aureus. In addition, in polymicrobial cultures the different
colour of the colonies of Staphylococcus aureus (red) and coagulase-negative staphylococci (white) is extremely useful.
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* Auteurcorrespondant.
Adresse e-mail : harriau@labosam.com (P. Harriau).

0369-8114/$ - see front matter © 2006 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
doi:10.1016/j.patbio.2006.07.036
 P. Harriau et al. / Pathologie Biologie 54 (2006) 506–509
Mots clés : Staphylococcus aureus ; Résistance ; Méticilline ; Milieu sélectif ; Hémoculture
Keywords: Staphylococcus aureus; Drug Resistance; Methicillin; Selective medium; Blood culture
1. Introduction
Bien que l’isolement d’un Staphylococcus aureus résistant à
la méticilline (SARM) à partir d’une hémoculture soit un évé-
nement rare dans notre laboratoire, il est primordial de pouvoir
donner cette information le plus rapidement possible au clini-
cien. N’ayant pas à notre disposition les moyens génétiques de
recherche du gène mecA et ayant trouvé les méthodes de mise
en évidence de la PLP2a trop onéreuse et de réalisation déli-
cate, nous avons voulu tester la possibilité d’utiliser les géloses
sélectives chromogènes MRSASelect BioRad que nous utili-
sons déjà pour le dépistage des porteurs de SARM, afin de
détecter dès la primoculture la méticillinorésistance des staphy-
locoques isolés de flacons d’hémocultures. Dans ce but, nous
avons ensemencé systématiquement une gélose MRSASelect
en plus des géloses standards pour tout flacon d’hémoculture
détecté positif et présentant des cocci à coloration de Gram
positif évocateurs de staphylocoques à l’examen direct. Nous
avons évalué l’intensité de la pousse obtenue, la corrélation
avec les résultats de l’antibiogramme ainsi que le délai permet-
tant d’observer une pousse fiable sans risque d’erreur.
2. Matériels et méthodes
La gélose MRSASelect est un milieu sélectif inhibant la
croissance de la majorité des germes, à l’exception des staphy-
locoques résistants à la méticilline. Un substrat chromogène
permet de différencier Staphylococcus aureus apparaissant
sous forme de colonies rose foncé à rouges des staphylocoques
à coagulase négative (SCN) apparaissant sous forme de colo-
nies blanches éventuellement à reflets rosés. Ainsi, toute
culture de colonies rouges est évocatrice de SARM et toute
culture de colonies blanches de SCN résistant à la méticilline.
Les prélèvements ont été réalisés suivant le protocole habituel-
lement utilisé dans les unités de soins directement au lit du
malade, sur des flacons de culture BacT/ALERT FN (bioMé-
rieux) aérobies et anaérobies contenant du charbon actif, une
paire constituée d’un flacon de chaque type étant prélevé
pour chaque patient. En cas d’impossibilité de prélever deux
flacons, le flacon anaérobie a été privilégié. L’incubation a
été réalisée sur automate BacT/ALERT 120 (bioMérieux) pen-
dant sept jours. Comme nous le faisons en pratique quoti-
dienne, dès la détection de la positivité d’un flacon par l’auto-
mate, une coloration de Gram a été réalisée, suivie de
l’ensemencement d’une gélose chocolat + Polyvitex incubée
sous CO2, une gélose Columbia +5 % de sang de mouton incu-
bée en anaérobiose et une gélose CLED incubée en aérobiose
pendant 18 heures à 37 °C. Pour cette étude, une gélose
MRSASelect (BioRad) a été ensemencée en plus des géloses
« standards » habituelles lorsque la coloration de Gram mon-
trait des cocci évocateurs de staphylocoques (cocci à coloration
de Gram positif assez gros, groupés en tétrades ou en amas).
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Cette gélose a été incubée 18 heures à 37 °C en aérobiose.
L’ensemble des géloses a été ensemencé selon les recomman-
dations du fabricant, directement à partir des flacons d’hémo-
cultures par dépôt d’une à deux gouttes de bouillon à l’aide
d’une aiguille de subculture (bioMérieux) traversant le bou-
chon du flacon, l’isolement étant réalisé par la technique clas-
sique des cadrans. Selon le moment de positivation des flacons,
les géloses MRSASelect ont été observées régulièrement tout
au long de la journée afin de déterminer en combien de temps
une coloration et/ou une pousse pouvait être détectée sur ce
milieu. Après 18 à 24 heures d’incubation, l’ensemble des
géloses a été observé et les cultures obtenues sur les différents
milieux comparés. En cas d’absence de culture ou de culture
faible sur gélose MRSASelect, l’incubation a été prolongée de
24 heures. Lorsqu’un staphylocoque (cocci à coloration de
Gram positif, catalase positive) a cultivé sur les géloses stan-
dards, une coagulase a été recherchée à partir de la gélose
Columbia +5 % de sang de mouton. Si celle-ci était positive,
la souche a été identifiée comme Staphylococcus aureus. Si
elle était négative, une identification de l’espèce a été réalisée
à l’aide de galeries miniaturisées API ID32 STAPH (bioMé-
rieux) dont le résultat a été interprété à l’aide d’un automate
ATB Expression (bioMérieux). En cas de cultures présentant
plusieurs aspects de colonies sur une ou plusieurs géloses,
des repiquages ont été réalisés afin d’identifier tous les types
obtenus. Un antibiogramme a été réalisé sur chaque souche de
staphylocoque isolée par la méthode utilisée en routine dans
notre laboratoire, c’est-à-dire la méthode des disques décrite
par le Comité de l’antibiogramme de la Société française de
microbiologie (CA-SFM). La détection de la méticillinorésis-
tance a été réalisée et interprétée selon les recommandations
2004 du CA-SFM [1] à l’aide d’un disque de céfoxitine
30 μg déposé sur une gélose Muller-Hinton et un disque
d’oxacilline 5 μg déposé sur une gélose Muller-Hinton hyper-
salée, ces deux géloses étant incubée à 37 °C durant 18 heures.
En cas de difficulté de lecture de la zone d’inhibition autour du
disque d’oxacilline, l’incubation de la gélose Muller-Hinton
hypersalée a été prolongée jusqu’à 48 heures. La lecture inter-
prétative des antibiogrammes obtenus a été réalisée sur un
automate SIRSCAN 2000 (I2A). La période de l’étude s’est
étendue du 1er décembre 2004 au 31 octobre 2005.
3. Résultats
Durant la période d’étude, 1355 paires d’hémocultures ont
été prélevées, dont trois correspondant à des liquides articulai-
res ensemencés en flacons directement au bloc opératoire. Sur
l’ensemble des flacons prélevés, 158 paires ont été détectées
positives sur au moins un des flacons dont 47 ont présenté
des cocci évocateurs de staphylocoques à la coloration de
Gram. Sur l’ensemble des géloses ensemencées, 20 souches de
S. aureus et 33 souches de SCN (16 S. epidermidis, 7
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S. hominis, 3 S. haemolyticus, 3 S. capitis, 1 S. warneri, 1
S. simulans, 2 SCN non identifiés) ont été isolées. Sur les gélo-
ses MRSASelect, 23 cultures positives ont été obtenues dont
neuf ont présenté des colonies rouges caractéristiques de
SARM et 14 des colonies blanches évocatrices de SCN résis-
tants à la méticilline. Toutes ces souches ont été correctement
identifiées, c’est-à-dire S. aureus pour les colonies rouges et
SCN pour les colonies blanches, et ont été retrouvées comme
résistantes à la méticilline sur l’antibiogramme. La résistance à
la méticilline a été confirmée secondairement pour l’ensemble
des souches de SARM par recherche de la PLP2a à l’aide d’un
latex sensibilisé. Les trois prélèvements de liquide articulaire
ensemencés sur flacons d’hémocultures ont été détectés posi-
tifs. Pour deux d’entre eux provenant d’un même patient, un
SARM a été isolé pour lequel une culture a été obtenue sur
gélose MRSASelect. Le troisième prélèvement a permis la
culture d’un mélange de S. simulans et S. hominis, ces deux
souches ne cultivant pas sur géloses MRSASelect et étant
retrouvées sensibles à la méticilline sur l’antibiogramme.
Dans un cas, une paire d’hémocultures prélevées sur un cathé-
ter central a permis l’isolement d’un mélange comprenant un
SARM, un S. haemolyticus résistant à la méticilline et un
S. capitis sensible à la méticilline. Les deux staphylocoques
résistants à la méticilline ont cultivé sur gélose MRSASelect,
le SARM donnant des colonies rouges intenses et
S. haemolyticus des colonies blanches. Dans ce cas, la colora-
tion différentielle des SARM et des SCN a été très utile.
Après 18 heures d’incubation, il n’a pas été observé de dif-
férence notable d’abondance de cultures entre les géloses
MRSASelect et les géloses standards. En cas de réincubation
jusqu’à 48 heures des géloses MRSASelect, aucune pousse tar-
dive d’autres types de germes n’a pu être observée confirmant
le caractère sélectif de ces géloses. Parmi les flacons détectés
positifs et ensemencés le matin, lorsqu’une coloration rouge a
pu être observée sur gélose MRSASelect après huit à dix heu-
res d’incubation, nous n’avons pas observé de discordance
avec les résultats des cultures après 18 heures d’incubation.
En effet, dans ce cas, un SARM a été systématiquement isolé
et la méticillinorésistance confirmée par l’antibiogramme.
4. Discussion
Notre laboratoire privé est situé dans une ville de 12 000
habitants, en zone rurale. Notre activité de biologie polyvalente
a représenté neuf millions de B en 2004. Une part de notre
activité est liée à un hôpital général de 317 lits (86 lits de
MCO, 227 lits de SSR/SLD, quatre lits d’HTCD, urgences
avec SMUR), une clinique chirurgicale privée participant au
service public de 68 lits et quatre maisons de retraites. En
2004, 1449 paires d’hémocultures prélevées en institutions
ont été traitées au laboratoire. Dans des laboratoires de petite
et moyenne taille tels que le nôtre pour lesquels l’isolement
d’un SARM à partir de flacons d’hémocultures est un événe-
ment rare, voire exceptionnel, il n’est pas facile de mettre en
œuvre les méthodes préconisées pour une recherche de la résis-
tance à la méticilline que sont la recherche du gène mecA ou de
l’expression de la PLP2a. En effet, celles-ci sont coûteuses ou
demandent du matériel généralement non disponible dans notre
type de laboratoire. Même dans le cas où celui-ci est dispo-
nible, il l’est généralement dans le cadre de contrats de colla-
boration et ne l’est que rarement pour des recherches rapides
(le plus souvent réalisation de séries, appareillage parfois sur
un autre site). C’est pour cela qu’il nous a paru intéressant
d’évaluer dans quelle mesure l’utilisation de géloses sélectives
chromogènes lors du repiquage des flacons d’hémoculture
détectés positifs pouvait nous aider à palier ce manque. Le
but de notre étude a été de vérifier la fiabilité de l’information
que nous pouvons fournir aux cliniciens lorsque nous obser-
vons une pousse sur ce type de milieu ensemencé directement
à partir de flacons d’hémocultures détectés positifs en pratique
courante. Durant les 11 mois de l’étude, aucune discordance
n’a pu être mise en évidence entre la croissance sur gélose
MRSASelect et la résistance à la méticilline retrouvée sur
l’antibiogramme réalisé secondairement, aussi bien pour les
20 souches de S. aureus que pour les 33 souches de SCN iso-
lées. Les géloses MRSASelect ont permis l’isolement de neuf
souches de SARM correctement identifiées et dont la résistance
à la méticilline a été secondairement confirmée par la mise en
évidence de PLP2a à l’aide d’un test au latex sensibilisé. Les
cultures obtenues après 18 heures d’incubation n’ont pas pré-
senté de différence d’abondance notable par rapport aux
milieux non sélectifs utilisés en routine. L’abondance de la
culture associée à l’intensité de la coloration rouge obtenue
pour S. aureus a permis une interprétation non ambiguë des
cultures. De plus, dans un cas, le caractère chromogène de la
gélose MRSASelect a mis en évidence dès la primoculture la
présence d’un mélange contenant un SARM. Cette détection
des SARM s’est révélée efficace aussi dans deux cas pour
des flacons d’hémoculture ensemencés directement au bloc
opératoire avec du liquide articulaire provenant d’une infection
sur prothèse articulaire.
Un autre aspect important que nous avons évalué à été le
délai nécessaire pour obtenir une pousse sur la gélose MRSA-
Select suffisante nous permettant de fournir une information
fiable aux cliniciens. Dans notre expérience, une coloration
rouge a été observable de façon non ambiguë dès huit à dix
heures d’incubation pour les prélèvements présentant une
charge en bactéries suffisante, c’est-à-dire lorsqu’un début de
culture était visible sur les autres milieux. Ainsi, il a été pos-
sible de réaliser une détection très précoce de la présence d’un
SARM, sans discordance avec les résultats des cultures obte-
nues après 18 heures d’incubation ni des antibiogrammes réa-
lisés secondairement, permettant ainsi de prévenir les cliniciens
au plus tôt de la suspicion d’isolement de SARM et de mettre
en œuvre une antibiothérapie adaptée chez le patient.
Au niveau économique, l’utilisation des géloses MRSASe-
lect est plus avantageuse pour une structure comme la nôtre
que l’utilisation des autres méthodes préconisées pour la détec-
tion de la méticillinorésistance des staphylocoques. Le prix de
revient des géloses MRSASelect (1,15 € HT prix catalogue) est
bien moindre que celui des trousses permettant la détection de
la PLP2a (3,50 à près de 5,00 € HT par test suivant le fournis-
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seur) et sans commune mesure avec le coût que pourrait repré-
senter la mise en place de techniques moléculaires de détection
du gène mecA. De plus, ces géloses étant déjà utilisées dans
notre laboratoire pour le dépistage des porteurs de SARM
dans les services de moyens et longs séjours, leur utilisation a
pu être optimisée, limitant ainsi les pertes par péremption. Les
performances de la gélose MRSASelect se sont avérées excel-
lentes puisque nous avons obtenus une sensibilité et une spéci-
ficité de 100 % pour la détection des SARM et des SCN résis-
tants à la méticilline, aussi bien pour la différenciation
S. aureus/SCN que pour la mise en évidence de la résistance
à la méticilline.
5. Conclusion
L’utilisation des géloses MRSASelect pour l’ensemencement
des flacons d’hémoculture positifs permet une détection de la
méticillinorésistance des staphylocoques facile, sans discor-
dance avec l’antibiogramme et rapide puisque la coloration des
SARM est observable après huit à dix heures d’incubation.
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Cette détection est réalisée sans matériel particulier et à faible
coût par rapport aux méthodes recommandées par le CA-SFM.
Pour notre part, les géloses MRSASelect sont maintenant utili-
sées systématiquement en routine pour l’ensemencement des
flacons d’hémoculture détectés positifs et montrant des cocci à
coloration de Gram positif évocateurs de staphylocoques à
l’examen direct. Si l’ensemencement a eu lieu le matin et en
cas de présence de SARM, il est généralement possible d’obser-
ver une coloration rouge sur la gélose dès la fin d’après midi,
nous permettant de prévenir le clinicien de la suspicion d’isole-
ment d’un SARM. Dans tous les cas, cette information est dis-
ponible 24 heures avant le résultat de l’antibiogramme permet-
tant ainsi d’adapter au plus tôt l’antibiothérapie du patient.
Référence
[1] Comité de l’antibiogramme de la Société française de microbiologie.
Communiqué 2004 (Édition de Janvier 2004). Available from : URL :
http://www.sfm.asso.fr/nouv/general.php?pa=5.