THESE

présentée devant

L'UNIVERSITE DE PROVENCE
AIX-MARSEILLE 1

pour obtenir
le grade de DOCTEUR de L'UNIVERSITE
Spécialité :
Spectrométries et Physico-Chimie Structurales

par
SYLV1E DAUMAS

CORROSION BACTERIENNE
EN GEOTHERMIE BASSE TEMPERATURE
MECANISMES DE CORROSION PAR
LES BACTERIES SULFATO-REDUCTRICES

Soutenue le 28 Mars 1987 devant la commission d'examen

M. J.P. BELAICH Rapporteur

M. H. BOOOT Président
M. J.C. COLSON Rapporteur
MMe J. CROUSIER
M.: J.L. GARCIA,.,
M. J. GUEZENNEC
M. P. SPITERI Rapporteur
 AVANT-PROPOS

Les recherches qui font l'objet de cette thèse ont été effectuées dans le cadre d'une
collaboration entre le Laboratoire Chimie des Matériaux dont l'équipe de corrosion est dirigée p&r
Monsieur le Professeur CROUSIER et le Laboratoire de Microbiologie ORSTOM que dirige Monsieur
GARCIA, Directeur de Recherche à l'ORSTOM. Au-delà des collaborations qu'ils m'ont permis de
développer à l'extérieur de leur laboratoire, je leur suis reconnaissante de m'avoir accueillie et permis
de réaliser au sein de leur équipe ce travail qui est une jonction de leurs disciplines respectives.

Madame CROUSIER, Maître de Conférence à l'Université de Provence, m'a initiée à cette

discipline ardue qu'est j'électrochimie et a fait preuve à mon égard de beaucoup de confiance, je l'en
remercie vivement.

Monsieur CORD-RUWISCH, Chercheur Associé à l'ORSTOM, m'a fait bénificier de ses

compétences en microbiologie des bactéries sulfato-réductrices. Gràce à ses conseils il m'a
beaucoup apporté dans la réalisation de ce travail et je l'en remercie.

Monsieur MASSIANI, Maître de Conférence à j'Université de Provence, a mit au point au

laboratoire plusieurs programmes informatiques d'acquisition automatique de données qui ont
beaucoup facilité mon travail. Nous avons eu en outre de nombreuses discussions. Je l'en remercie
beaucoup.

J'exprime toute ma gratitude à Monsieur SPITERI, Ingénieur de l'Ecole Centrale des Arts
et Manufactures, Ingénieur-Docteur, Chef de groupe d'études au Département Etude des Matériaux
d'E.D. F., auprès de qui j'ai toujours trouvé sympathie et encouragements. L'intérêt qu'il a
constamment porté à ce travail, ses conseils et son amitié m'ont beaucoup aidée.

Je remercie très sincèrement Monsieur GUEZENNEC, Chargé de Recherche à l'IFREMER

(Brest), qui m'a très amicalement accueillie dans son laboratoire de Chimie-Corrosion Marine et qui m'a
fait profiter de son expérience en corrosion bactérienne. Je lui suis très reconnaissante de son
enthousiasme et du grand intérêt qu'il a porté à mon travail.

Je remercie très vivement Monsieur BELAICH, Professeur de Microbiologie à l'Université

de Provence, Directeur de Recherche au Laboratoire de Chimie Bactérienne du C.N.R.S., et
Monsieur COLSON, Professeur à l'Université de Dijon, Directeur du Laboratoire de Recherche sur la
Réactivité du Solide Associé au C.N.R.S., pour avoir bien voulu juger ce travail en acceptant d'être
rapporteurs et membres du jury. Je remercie également Monsieur BODOT, Responsable de la
Formation Doctorale Spectrométries et Physico-Chimie Structurales de l'Université de Provence,
pour avoir accepté de présider ce jury.
 J'aimerais également remercier Monsieur GOYENECHE du département géothermie du
B.R.G.M., Messieurs LOMBART et FOUILLAC et Mademoisselle CRIAUD de l'I.M.R.G. qui m'ont
donné tous les renseignements dont j'ai eu besoin concernant la géothermie.

Je voudrais aussi remercier tous les assistants, techniciens et étudiants des équipes de
microbiologie et de corrosion ainsi que toutes les personnes d'autres services pour leur aide ou tout
simplement pour leur amitié.

Enfin, j'adresse d'affectueux remerciements à mon mari pour la patience dont il a fait
preuve durant la période de réalisation de cette thèse.

Ce travail a pu être réalisé grâce à l'apport financier de l'Agence Française pour la Maîtrise
de l'Energie.
 SOMMAIRE

INTRODUCTION P 1
1. EXPOSE BIBLIOGRAPHIQUE P 4
1. LES BACTERIES SULFATO·REDUCTRICES (BSR)
1.1. Ecologie
1.2. Historique - Evolution de leur classification
1.3. Métabolisme des bactéries sulfato-réductrices
2. LA CORROSION: PHENOMENE ELECTROCHIMIQUE P 8

3. THEORIES DE LA CORROSION BIOLOGIQUE PAR LES BSR P 11

3.1. Utilisation de l'hydrogène: théorie de la dépolarisation cathodique P 11
3.2. Formation de dépôts de corrosion: rôle du FeS P 13
3.3. Production de métabolites corrosifs P 15
3.4. Adhésion des bactéries aux surfaces: différence de potentiel à la surface
ru métal P 16

II. DETECTION ET NUMERATION DES BSR DANS UNE EAU

GEOTHERMALE - ISOLEMENT ET ETUDE DE LEUR
METABOLISME P 18
1. MATERIEL ET METHODES
1.1. PRELEVEMENT
1.1.1. Présentation du site de prélèvement
1.1.2. Méthodes de prélèvement et échantillonnage
1.2. NUMERATION DES BSR P 22
1.2.1. Milieux de culture
1.2.2. Technique de numération
1.3. PURIFICATION DES BSR P 28
1.3.1. Milieu de culture
1.3.2. Ensemencements et dilutions
1.3.3. Isolements
1.4. ETUDE DES BSR ISOLEES EN CULTURE PURE P 29
1.4.1. Etude des caractères morphologiques
1.4.2. Etude de la composition en bases de l'ADN
1.4.3. Etude des caractères physiologiques, nutritionnels et biochimiques
2. RESULTATS P 33
2.1. DETECTlON ET NUMERATION DES BSR DANS LE PUITS
 GEOTHERMIQUE DE CREIL
2.2. ISOLEMENT DES BSR DENOMBREES DANS LE PUITS DE CREIL
2.3. ETUDE DES BSR ISOLEES EN CULTURE PURE
3. DISCUSSION P 38
3.1. POSITION TAXONOMIQUE DES SOUCHES ISOLEES DU FLUIDE
GEOTHERMAL DE CREIL P 38
3.2. PARTICIPATION POSSIBLE DES BSR DANS LES DEGRADATIONS
OBSERVEES SUR L'OUVRAGE GEOTHERMIQUE DE CREIL P 41
3.2.1. Présence de BSR dans le puits de production de Creil p 41
3.2.2. Activité et adaptation des souches au biotope géothermal
de Creil p 43
3.2.3. Origine des BSR présentes dans le puits p 47

III. ETUDE DES POTENTIALITES CORROSIVES DES S5R

ISOLEES DU PUITS GEOTHERMIQUE DE CREIL p 50
1. MATERIEL ET METHODES P 50
1.1. ECHANTILLONS
1.1.1. Origine et composition chimique des échantillons
1.1.2. Montage des échantillons sous forme d'électrode de travail
1.1.3. Préparation de la surface de l'électrode de travail
1.2. CELLULE ELECTROCHIMIQUE P 51
1.3. LES SOLUTIONS P 52
1.4. MONTAGES ELECTROCHIMIQUES P 53
1.5. MESURE DES PARAMETRES BIOLOGIQUES P 55
1.5.1. Technique de prélèvement
1.5.2. Techniques de dosage des composés en solution
1.5.3. Technique de dosage des phospholipides
2. COMPORTEMENT A LA CORROSION DES ACIERS K55 ET
LaO VC13 p 58
2.1. TECHNIQUE UTILISEE P 58
2.2. PROTOCOLE EXPERIMENTAL P 59
2.3. COURBES POTENTIOCINETIQUES DES DEUX ACIERS P 60
2.3.1. Influence de la composition des aciers
2.3.2. Influence de la température
2.4. CONCLUSION P 61
3. SUIVI DU POTENTIEL DE CORROSION DE L'ACIER K55 P 63
3.1. INTRODUCTION P 63
3.2. PROTOCOLE OPERATOIRE P 64
3.3. RESULTATS P 65
3.3.1. Essai en milieu stérile p 65
3.3.2. Essai avec une BSR Hase+ en présence de sulfate p 66
 3.3.3. Essai avec une BSR Hase+ en présence de fumarate p 69
3.3.4. Essai en milieu stérile additionné de 10 mmol / 1 de Na2S p 71

3.3.5. Essai en présence de 10 mmol /1 d'H2S produit par voie

biologique p 71
3.3.6. Essai avec une BSR Hase + sur sulfate, les bactéries
n'étant pas en contact avec la surface métallique p 72
3.3.7. Essai avec une BSR Hase' en présence de sulfate p 74
3.4. ESSAI D'INTERPRETATION DES RESULTATS P 75
3.5. CONCLUSIONS P 79
4. EVOLUTION DU COURANT DE CORROSION DE L'ACIER K55 DURANT
LA CROISSANCE DE BSR P 79
4.1. MESURE DE PERTE DE POIDS - DOSAGE DU FER P 80
4.1.1. Conditions d'expérience
4.2.2. Résultats et discussion
4.2. MESURE DE Icorr PAR EXTRAPOLATION DES DROITES DE TAFEL-
COLONISATION BACTERIENNE DES SURFACES P 81
4.2.1. Conduite de l'expérience
4.2.2. Résultats et discussion
4.3. CONCLUSIONS P 86
5. INFLUENCE DES BSR SUR L'ETABLISSEMENT D'UN COURANT
ENTRE DEUX ELECTRODES P 87
5.1. MONTAGE DE LA PILE ET CONDITIONS EXPERIMENTALES P 87
5.2. RESULTATS EXPERIMENTAUX - DISCUSSIOI\l P 88
5.2.1. Mesure de la f.e.m. de la pile P 88
5.2.2. Mesure du courant de court-circuit de la pile P 90
5.2.2.1. Influences simultanées de l'activité hydrogénase et des
sulfures
5.2.2.2. Influence des sulfures sur l'anode
5.2.2.3. Exclusion de l'effet du FeS
5.2.2.4. Exclusion de l'oxydation de l'hydrogène
5.3. CONCLUSIONS P 93
6. ETUDE DE L'ETAT DE SURFACE DES ECHANTILLONS EXPOSES
AUX BSR P 94
6.1. PROTOCOLE EXPERIMENTAL
6.2. COMPOSITiON CHIMIQUE ELEMENTAIRE DES COUCHES- DISCUSSION
6.3. CONCLUSIONS

CONCLUSIONS GENERALES P 99
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES P 103
INTRODUCTION
 1

INTRODUCTION

Les problèmes posés par la corrosion des métaux ont vu leur importance grandir
considérablement durant les cent dernières années, évolution due à l'utilisation sans cesse accrue
de structures métalliques dans tous les secteurs de la technologie moderne. Par exemple, un quart à
un tiers de la production annuelle de fer est, chaque année, détruite par corrosion. Par les coûts
qu'elle occasionne, la corrosion a pris de nos jours un poids économique considérable. Les
estimations chiffrées sont toujours difficiles à faire mais elles atteignent régulièrement des dizaines
de milliards de francs par dn dans les principaux pays industrialisés où de telles estimations ont été
tentées (TANAKA, 1956: VERNON, 1957). Dans ces études, les dégradations attribuées aux
microorganismes sont souvent très importantes. Aux Etats-Unis, les pertes provoquées par la
corrosion biologique, principalement des canalisations enterrées, ont été évaluées entre 500 et
2000 millions de dollars par an (GREATHOUSE et WESSEL, 1954). En 1964, BOOTH estimait au
moins à 50 %, les dégâts causés par les microorganismes et dans l'industrie du pétrole, aux
Etats-Unis, les bactéries sulfato-réductrices (BSR) ont été trouvées responsables de plus de 77 %
des corrosions observées sur plusieurs puits producteurs (ALLRED et al., 1959).

Si le secteur pétrolier, qui emploie beaucoup de structures métalliques enterrées et

"offshore", est depuis longtemps touché par ces problèmes de corrosion, d'autres industries, plus
récentes, connaissent les mêmes dommages. C'est le cas de l'industrie géothermique basse
température, qui à la suite des différents chocs pétroliers et de la "crise de l'énergie" des années
1970-80, a été beaucoup développée en France. La géothermie, considérée depuis longtemps
comme une des sources alternatives d'énergie, exploite les réserves fossiles en eaux chaudes
emmagasinées dans notre sous-sol, avec comme exemple d'application le chauffage d'habitations
de zones nouvellement urbanisées ou le chauffage de serres. Ces eaux chaudes, souvent enfouies
à plus de 2000 m de profondeur, sont. remontées à la surface par l'intermédiaire de forages,
technologie fortement inspirée des méthodes pétrolières.

Cependant, dans le choix des matériaux pour les équipements constituant le circuit
géothermal, il n'a été que peu pris en compte le caractère fortement agressif du fluide exploité en
région parisienne (Bassin du Dogger). Pour diminuer les investissements, tout en faisant circuler des
débits très supérieurs à ceux des meilleures exploitations pétrolières, il a été retenu de ne
fonctionner qu'avec un simple tubage du puits réalisé en acier au carbone (les pétroliers disposent
d'un double tubage, le tubage interne pouvant être facilement changé). Ces choix ont eu pour
 2

conséquences, après quelques années de service, l'apparition de nombreuses détériorations par

corrosion posant un grave problème pour la rentabilité de cette industrie en région parisienne. Le
coût de fonctionnement, qui devait être négligeable par rapport au coût d'investissement, a été très
largement augmenté par les coûts de remplacement du matériel corrodé (prix du matériel et moyens
techniques sophistiqués mis en oeuvre pour effectuer les diagnostics et lors des remontées
d'équipements endommagés) et par le manque à gagner correspondant aux arrêts d'exploitation
souvent nécessaires aux réparations et durant lesquels une énergie de substitution coûteuse est
utilisée.
Par ailleurs, à côté des problèmes financiers rencontrés par les maîtres d'ouvrage, s'est
alors posée aux exploitants, sociétés de maintenance et maîtres d'oeuvre d'installations nouvelles, la
question du choix des remèdes ainsi que de technologies mieux adaptées à l'exploitation des eaux
fortement chargées en sels du Dogger. Un vaste programme de recherche a été développé sous
l'impulsion de l'Agence Française pour la Maîtrise de l'Energie (A.F.M.E.). Ses objectifs étaient d'une
part de déterminer les causes des détériorations observées et d'autre part de définir des moyens de
lutte appropriés (interventions de maintenance, autres choix de matériaux, additions de produits
inhibiteurs de corrosion).

Dans le cadre de l'étude de la corrosion des aciers par l'eau géothermale, l'attention avait
été attirée sur la présence de bactéries, en particulier de bactéries sulfato-réductrices, au niveau des
installations corrodées (GOYENECHE, 1981; DAUMAS et al., 1985).
L'activité des bactéries dans l'environnement est des plus diverse mais elle n'est pas
toujours perçue du fait de leur petite taille. Cependant leurs activités métaboliques importantes
associées à une- croissance et une reproduction intenses, leur confèrent un rôle primordial dans de
nombreux domaines. D'un point de vue écologique, elles participent, à leur échelle microscopique, à
tous les grands cycles de la matière (carbone, azote, soufre et oxygène). D'un point de vue
économique, leurs capacités métaboliques, tant de synthèse que de dégradation, sont très
largement utilisées dans divers secteurs industriels notamment dans le cadre des biotechnologies.
Elles contribuent également à la dégradation des métaux, aspect plus négatif de leur activité.
Cependant, le concept de CORROSION BIOLOGIQUE a été difficile à admettre bien que dès 1891,
GARRET suggérait, probablement le premier, que les bactéries pouvaient avoir une influence sur la
corrosion des métaux. Encore aujourd'hui, l'agressivité chimique des fluides est, pour certains, la
cause essentielle du processus de corrosion et ils relèguent au second plan les mécanismes
biologiques. Pour d'autres, au contraire, l'action biologique est beaucoup plus qu'un évènement
secondaire ou surajouté, mais est à l'origine même de la corrosion ou du moins, dans certaines
situations, l'un de ses mécanismes fondamentaux.
Depuis GARRET, de nombreux auteurs ont montré que plusieurs groupes bactériens
(thiobacilles, ferrobactéries, sulfato-réducteurs), pouvaient intervenir dans la corrosion des métaux
 3

(GAINES, 1910 ; ELLIS, 1919 ; HARDER, 1919 ; VON WOLZOGEN KUHR, 1922). Cependant, la
corrosion à pH neutre et en l'absence d'oxygène (caractéristiques physiques du fluide géothermal du
Dogger) a généralement été attribuée aux BSR.

GAINES, en 19~ 0, discutait déjà du rôle de ces bactéries dans le phénomène de

corrosion des métaux ferreux. Les études suivantes se sont interessées à leurs mécanismes
d'action. En 1934, VON WOLZOGEN KUHR et VAN DER VLUGT proposent une véritable théorie
pour l'intervention de ces bactéries dans la corrosion du fer et des aciers (ct. chap. 1). Cette théorie
repose sur le fait que les BSR sont capables d'utiliser l'hydrogène comme donneur d'électrons. Ce
métabolisme leur conférerait la possibilité de déstabiliser l'équilibre électrochimique existant à la
suriace d'un métal après son immersion en milieu aqueux.
De plus ces bactéries ont la propriété essentielle de réduire en sulfures, les sulfates
présents dans beaucoup d'eaj.Jx naturelles. Or l'action agressive de ces sulfures est bien connue
(VON WOLZOGEN KHUR, 1922; FARRER et WORMELL, 1953; EWING, 1955; SASAKI et al. , 1977;
SALVAREZZA et VIDELA, 1980 ; TUTTLE et KANE, 1981). Cette seconde particularité du
métabolisme des BSR a donné lieu, dans la littérature, à une polémique sur leur mécanismes d'action
dans la corrosion. Beaucoup d'auteurs sont encore actuellement en désaccord avec la théorie de
VON WOLZOGEN KUHR et VAN DER VLUGT et imputent aux BSR un rôle indirect dans la corrosion
par la production de ces sulfures (MARA et WILLlAMS,1972 : KING et al. , 1973 a,b; SMITH et
MillER, 1975; COSTEllO, 1979).

Dans le cadre des recherches entreprises pour déterminer les causes des lésions
observées au niveau des équipements géothermiques, des études ont donc été conduites pour
préciser l'importance respective, dans ces phénomènes de corrosion, des processus
physico-chimiques et de l'intervention bactérienne, en particulier de l'incidence des BSR, de façon à
justifier, ultérieurement, le développement de moyens de lutte spécifiquement anti-bactériens. le
travail présenté dans ce mémoire s'inscrit dans cet objectif. Une approche écologique du fluide
prélevé sur la centrale géothermique de Creil en constitue la première partie. Elle a pour but de définir
le degré d'adaptation et d'activité des BSR isolées de ce puits par rapport à leurs conditions
environnantes. Nous avons ensuite cherché à mettre en évidence l'effet du développement de ces
bactéries sur la corrosion de l'acier au carbone utilisé en géothermie, en apportant une contribution à
la compréhension des mécanismes liés à j'attaque du fer par les BSR. Pour mener à bien cette étude
qui constitue la deuxième partie de ce travail, nous avons choisi de recourir aux techniques
électrochimiques de mesure de la corrosion en les adaptant aux processus biologiques et à la
spécificité du milieu considéré.
 CHAPITRE 1
EXPOSE BIBLIOGRAPHIQUE
 4

CHAPITRE 1
EXPOSE BIBLIOGRAPHIQUE

Le présent chapitre tente de faire le point de nos connaissances bibliographiques dans le

domaine de la corrosion biologique par les BSR. Une première partie est consacrée à la présentation
du groupe des BSR. Ouelques éléments d'électrochimie sont ensuite exposés. Ces deux
paragraphes sont destinés à familiariser respectivement les électrochimistes et les microbiologistes
qui seront amenés à lire ce travail, avec des notions et des termes qui ne relèvent pas forcément de
leur discipline. Une troisième partie tente de faire le plus clairement possible le lien entre ces deux
disciplines à travers les différents travaux concernant la corrosion par les BSR. Cet exposé non
exhaustif, décrit les différents mécanismes proposés pour leur intervention dans la dégradation des
métaux ferreux.

1. LES BACTERIES SULFATO-REDUCTRICES

1.1. Ecologie

Les bactéries et plus particulièrement les BSR, sont probablement la forme de vie la plus
ancienne rencontrée sur terre (PFENNIG et al., 1981). Les BSR sont des bactéries ubiquistes que
l'on retrouve dans de nombreux environnements aquatiques et terrestres. En effet, les habitats
naturels des représentants de ce groupe, embrassent de larges gammes de salinité, température,
pH et pression ( ZOBELL, 1958). Par contre, étant anaérobies strictes, elles privilégient non
seulement les biotopes exempts d'oxygène mais en plus nécessitent un potentiel rédox très bas, au
moins - 100 mv / E.N.H. ( BAAS BECKING et WOOD, 1955; ALiCO et L1EGEY, 1966; LEGALL et
POSTGATE, 1973; WIDDEL et PFENNIG, 1977).

Comme beaucoup d'êtres vivants, les BSR nécessitent de la matière organique, des
éléments minéraux ainsi que de l'énergie pour leur croissance et leurs synthèses cellulaires. La
particularité commune à toutes les espèces de BSR est qu'el/es effectuent une dissimilation
réductrice du sulfate qu'elles utilisent comme accepteur terminal d'électrons au cours de l'oxydation
anaérobie de substrats organiques. La conséquence de ce métabolisme est la production et
l'accumulation dans leur habitat de quantités importantes de sulfures. Ces bactéries ont un rôle
écologique important dans le cycle du soufre et dans la minéralisation de la matière organique.

1.2. Historique - Evolution de leur classification

En 1893, MURRAY et IRWIN mettent en évidence la réduction biologique des sulfates en

sulfures et deux ans après BEIJERINCK (1895) obtient en culture mixte, les premières BSR
1er GROUPE: BSR qui font une OXYDATION INCOMPLETE
1, BSR Qui n'utilisent pas les AG V, AGLC et acides aromatiques

- Desulfovibrio africanus
baculatus
desulfuricans
gigas
multispirans
salexigens
thermophilus
vulgaris
- Thermodesulfobacterium commune
- Desulfomonas pigra
- Desulfotomaculum antarticum
guttoideum
nigrificans
orientis
ruminis

2. BSR qui utilisent les AGV, AGLC et/ou les acides aromatiques

- Desulfovibrio sapovorans
- Desulfobulbus elongatus
propionicus

2ème GROUPE: BSR qui font une OXYDATION COMPLETE (AGV, AGLC et ac. aromatiques)

- Desulfobacterium autotrophicum
indolicum
phenolicum
vacuolatum
- Desulfovibrio baarsii
- Desulfotomaculum acetoxidans
sapomandens
- Desulfobacter curvatus
hydrogenophilus
la tus
postgatei
- Desulfococcus multivorans
niacini
- Desulfonema limicola
magnum
- Desulfosarcina variabilis

Tableau Classification des bactéries sulfata-réductrices

 5

responsables de ce processus. Il les décrit sous le nom de Spirillum desulfuricans , appelé plus tard
Oesulfovibrio desulfuricans (KLUYVER and VAN NIEL, 1936). La première culture pure de cette
bactérie est obtenue par VAN DELDEN en 1903. En 1930, BAARS fait une étude plus détaillée de
plusieurs cultures de BSR et regroupe ces bactéries dans le genre Vibrio. Cependant il décrit à part
une souche capable de métaboliser l'acétate, le propionate et le butyrate en C02' alors que les

autres en sont incapables. Malheureusement il perd sa souche et POSTGATE (1959), après

plusieurs tentatives, restées sans succés, pour isoler des souches capables d'utiliser ces substrats
(SELWYN et POSTGATE, 1959), en déduit que la souche de BAARS était impure et que les BSR
oxydant les acides gras à courtes chaines n'existent pas. De ce fait les BSR ont été longtemps
considérées comme un petit groupe hautement spécialisé, avec une versatilité métabolique très
réduite. Ce n'est que récemment que l'équipe allemande de PFENNIG et WIDDEL isole les premières
BSR capables d'utiliser les substrats décrits par BAARS (PFENNIG et BIEBL, 1976; WIDDEL et
PFENNIG, 1977; WIDDEL, 1980; WIDDEL et PFENNIG, 1981; WIDDEL et PFENNIG, 1982).

La première BSR sporulée et thermophile est isolée en 1924 par EllON. En 1965,
CAMPBELL et POSTGATE classent toutes les BSR sporulées dans le genre Oesulfotomaculum.
Avec la même démarche, ils regroupent dans le genre Oesulfovibrio , les BSR ne formant pas ces
formes de résistance que sont les spores (POSGATE et CAMPBELL, 1966). Toutes les recherches
sur les BSR se sont focalisées pendant longtemps sur ces souches isolées à partir d'enrichissements
contenant du lactate. Cependant, la classification précédemment établie par POSTGATE et
CAMPBELL (1965,1966) et adoptée par les éditions récentes du BERGEY'S MANUAL de 1984 et
1986 (WIDDEL et PFENNIG, 1984; CAMPBELL et RIVERS, 1986), est largement transformée grâce
aux travaux effectués par PFENNIG, WIDDEL et leur équipe dans le domaine des BSR. L'isolement
de 2 nouvelles espèces de Oesulfovibrio capables d'utiliser les acides gras jusqu'à 18 carbones
(WIDDEL, 1980) et la description (WIDDEL, 1980; WIDDEL et PFENNIG, 1981; WIDDEL et PFENNIG,
1982; BACK et WIDDEL, 1986 a,b) de 6 nouveaux genres (Oesulfcbacter, Oesulfobulbus ,
Oesulfococcus ,Oesulfosarcina et Oesulfonema, Oesulfobacterium)' morphologiquement et
nutritionnellement diversifiés met fin au concept de la versatilité métabolique réduite des BSR.

Pour faciliter l'identification de ce groupe, qui comporte maintenant une collection

importante de souches, PFEI\JNIG, WIDDEL et TRÜPPER (1981) ont proposé de les séparer en deux
groupes, division basée sur leurs capacités métaboliques et sur le stade d'oxydation terminal du
substrat donneur d'électrons (tab.1). Le premier groupe rassemble les espèces qui oxydent
incomplètement leurs substrats en acétate et C02' Il est subdivisé en deux sous-groupes, dans

lesquels se répartissent, d'une part, les espèces dégradant le lactate, l'hydrogène, les alcools et les
sucres et d'autre part, les souches capables de dégrader, souvent en plus des substrats précédents,
les acides gras volatiles (AGV) , les acides gras à longues chaines (AGLC) et les acides aromatiques.
Le second groupe rassemble les souches capables d'oxyder complètement ces mêmes composés
en C02:
 6

- Oxydation incomplète des substrats organiques:

.. Substrats pairs :

CH3 - (CH2)2n - COO- + n/2 S04 2- + n/20H-

----.,~~ (n + 1) CH3 - coo- + nl2 HS" + nl2 H2Ü

.. Substrats impairs:

CH3 - (CH2)2n+1 - COO- + n/2 S04 2- + n/2 OH-

--~> CH3 - CH2 - COO- + n CH3 - COQ- + n/2 HS- + n/2 H20

- Oxydation complète des substrats organiques:

4 H - (CH2) n - COO- + (3n+ 1) S04 2- + H20

--~> (4n+4) H - C03- + (3n+1) HS- + H+ + OH-

1.3. Métabolisme des B5R

Les BSR sont généralement des bactéries hétérotrophes c'est-à-dire qu'elles sont
incapables d'assimiler le C02 comme source de carbone. Elles nécessitent donc une source de

carbone organique. Si le lactate est le composé utilisé, sa dégradation se fait suivant l'équation
suivante:

2 CH3-eHOH-COO- + S04 2- --------------> 2 CH3-COO- + 2HC03- + HS- + H+

Lactate 1 ketate
_ _ _ _ _oxydation 1
l réduction, _

Le lactate sert à la fois de source de carbone et d'énergie. Les bactéries tirant ainsi leur
énergie des réactions d'oxydo-réduction de substrats organiques sont des espèces
chimioorganotrophes. Le lactate est le donneur d'électrons pour la réduction des sulfates en
sulfures. La réduction des sulfates est une respiration (THAU ER et BAOZIONG, 1980) au cours de
laquelle le sulfate, après activation (PECK, 1966), se substitue à l'oxygène (cas d'un métabolisme
aérobie) comme accepteur terminal d'électrons. Comme chez les organimes aérobies, les réactions
oxydatives et réductrices des BSR sont reliées à un système transporteur d'électrons comprenant
des cytochromes. C'est au niveau de ce transport d'électrons (peut-être couplé à un gradient de
protons) qui proviennent de l'oxydation du substrat organique, que les bactéries génèrent, par une
phosphorilation oxydative (PECK, 1960; BAOZIONG et THAUER, 1978), l'énergie nécessaire à leur
croissance, cette dernière étant conservée sous forme des liaisons phosphate riches en énergie de
l'adénosine tri-phosphate (ATP).
 7

Substrat
organiqJe oxydés
rédu~

transporteurs
a'électrons

organique reci.Jtts

oxydé

+C02

Certaines espèces des genres Desulfovibrio ,Desulfotomacu/um et Desulfomonas

oxydent le lactate suivant la réaction ci-dessus: Desulfovibrio desulfuricans ,O. orientis , D. gigas ,
D. sa/exigens, D. africanus , D. bacu/atus , D. vu/garis et D. thermophi/us .. Desulfotomacu/um
nigrificans , D. orientis et D. ruminis : Desulfomonas pigra. Elles sont incapables de métaboliser
l'acétate comme substrat énergétique (donneur d'électrons).

Par contre, certaines autres espèces de BSR nouvellement décrites sont capables
d'utiliser l'acétate comme source d'énergie. C'est le cas de Desulfotomacu/um acetooxidans
(WIDDEL et PFENNIG, 1977), Desulfotomacu/um sapomendens (CORD-RUWISH et GARCIA, 1985),
Desulfococcus mu/tivorans (WI DOEL, 1980), Desulfosarcina variabi/is (WIDDEL, 1980) et
Desulfobacter postgatei (WIDDEL et PFENNIG, 1981).

La réduction biologique du sulfate peut être couplée à l'oxydation de l'hydrogène

moléculaire. Ce type de métabolisme se rencontre chez les espèces chimiolitotrophes (Desulfovibrio
desulfuricans, D. thermophi/us, D. vu/garis, Desulfonema /imico/a, Desulfosarcina variabi/is,
Desulfotomacu/um orientis, nigrificans ), qui ont donc la capacité de tirer leur énergie de l'oxydation
de substrat inorganique:

Une source de carbone est cependant nécessaire pour que la bactérie puisse effectuer
ses synthèses cellulaires. Pendant longtemps, aucune espèce de BSR n'a été reconnue capable de
se développer en l'absence totale de matière organique. Par exemple, MECHALAS et RITIEMBERG
(1960) ont montré que la croissance de Desulfovibrio , sous atmosphère d'H2' n'était possible qu'en

présence d'extrait de levure, lequel sert exclusivement de source de carbone et pas de source
d'énergie. Il a été démontré que chez certaines espèces du genre Desulfovibrio , le carbone assimilé
 anode Fe ~ Fe
2
++ 2e-

anode sortie du courant

cathode en (rée du couran t

Figure 1 = Corrosion: phénomène électrochimique

 8

provient du C02 (30 %) et de l'acétate (70 %) (BRANDIS et THAUER, 1981). Mais, très récemment,

KLEM PS et al. (1985) ont montré que Oesulfotomaculum orientis se développe dans des
conditions d'autotrophie stricte, c'est-à-dire en utilisant le C02 comme unique source de carbone.

L'oxydation de l'hydrogène moléculaire est possible grâce à l'existence d'une enzyme

appelée hydrogénase et dont la présence chez les BSR a été décrite pour la première fois par
STEPHENSON et STICKLAND (1931). Depuis, il a été montré que beaucoup d'espèces possédent
au moins deux hydrogénases, j'une cytoplasmique et l'autre localisée dans l'espace périplasmique
de la paroi cellulaire (LEGALL et al, 1982). Elles catalysent la réaction réversible de combinaison de
deux protons: 2 H+ + 2e- <-----> H2'

2. LA CORROSION PHENOMENE ELECTROCHIMIQUE

La corrosion est la destruction des métaux sous l'effet du milieu ambiant, par une réaction
considérée le plus souvent comme ayant un caractère chimique: Par exemple la corrosion du fer et
de ses alliages exposés à l'humidité se traduit par la formation d'oxydes ou d'oxyhydroxydes de fer
qui constituent ce que l'on appelle communément la rouille.
Cependant, les travaux précurseurs de FARADAY, entre 1834 et 1840, ont conduit
progressivement à une conception plus moderne des processus mis en jeu lors de la corrosion des
métaux en milieu aqueux. Ses recherches l'ont amené à établir l'existence d'une relation entre
l'action chimique et la génération de courants électriques. De nombreuses études effectuées sur
cette base ont permis d'établir que la corrosion des métaux est en fait un processus électrochimique.

La nature électrochimique de la corrosion' en milieu aqueux a été cependant difficile à

admettre car elle était, et elle reste non observable directement. Dans les électrolytes, le processus
électrochimique se traduit par des échanges d'électrons (courants électriques) entre différentes
zones (anodes et cathodes) d'un même métal, entre deux métaux différents ou entre métal et
solution. Ces transferts d'électrons, qui restent cachés à l'observation directe, aboutissent à la
dissolution du métal et à la formation de dépôts de corrosion à sa suriace, conséquence chimique
directement perceptible.

La mise en oeuvre d'un métal et son utilisation ultérieure conduisent souvent à une
hétérogénéité de suriace et de composition se traduisant d'un point de vue électrochimique par des
différences de potentiel entre les imperiections ou impuretés et la matrice du métal. Il est possible
alors qu'II y ait création de microcathodes et de microanodes réparties de manière aléatoire sur la
suriace métallique. On a alors affaire à une pile fonctionnant en court-circuit. On peut considérer
qu'un métal plongé dans une solution est toujours le siège de deux réactions simultanées:
 9

- La réaction anodique

c'est la réaction de corrosion proprement dite au cours de laquelle le métal passe en

solution:

qui dans le cas du fer devient:

Fe < - - > Fe 2+ + 2 e- (i)

Globalement, c'est une réaction d'oxydation qui correspond à la dissolution du métal sous
forme d'ions dans la solution et la libération d'électrons dans le réseau métallique. Or ces charges
électriques ne peuvent pas s'accumuler dans un système conducteur tel qu'un métal. Il faut donc
consommer les électrons produits pour que la réaction (1) puisse se développer. Pour qu'il y ait
corrosion, il est donc nécessaire que se déroule parallèlement à la réaction anodique, une réaction
cathodique du type Ox n+ + ne- --------> Red (Fig. 1).

- La réaction cathodique

Les réactions cathodiques peuvent être les suivantes:

- Réduction de r02 :

1/2°2 + H20 + 2 e- <---> 20H-

- Réduction des protons de l'eau:

2 H20 <--------> 2 OH- + 2 H+ Dissociation électrolytique de l'eau

2 H++2e- < - - > H2 (2)

En l'absence d'oxygène et en milieu neutre, seule la seconde réaction de réduction

cathodique peut avoir lieu.
Il est classique de considérer que le processus de décharge de l'hydrogène s'effectue en
deux étapes:
- La première étape est la réduction des ions H30+ pour donner de l'hydrogène

atomique adsorbé sur le métal:

M + H30+ + e- <------> M Hads + H20 réaction de Volmer

- La deuxième étape est la formation d'hydrogène par l'un des deux mécanismes
suivants:

* La désorption chimique et recombinaison

M Haœ + M Haœ <--> H2 + 2 M Tafel

* La désorption électrochimique

M Hads + H3 o+ + e" <-----> H2 + H20 Heyrovsky

 10

On ne peut pas exclure la possibilité que les deux mécanismes se produisent

simultanément. L'étape déterminante pour la cinétique de la réaction globale n'est pas connue
(BOCKRIS et REDDY, 1973; SUBRAMANYAN,1981), mais l'une d'entre elles (la plus lente)
détermine cette cinétique, l'autre étape étant en équilibre.

Le flux d'électrons va toujours de l'anode (potentiel de surface le plus négatif) vers la

cathode (potentiel de surface le plus positif). Dans le cas général, l'hydrogène formé s'adsorbe à la
surface du métal sous forme d'un film à l'échelon moléculaire et la vitesse de la réaction (2) devient si
lente qu'elle est inefficace à déplacer le système dans le sens de la consommation des électrons (a).
L'ensemble est alors en équilibre. Ce phénomène est connu sous le nom de polarisation •.

En résumé, quand les éléments du sy1ème se polarisent, la corrosion est stoppée. A ce

stade, on observe une légère couche de produits de corrosion sans que le métal soit altéré et cet
état d'équilibre peut durer très longtemps, ceci tant que l'hydrogène cathodique ou les ions ferreux
présents à la surface du métal ne sont pas mobilisés par l'oxygène ou un autre mécanisme.

Si l'hydrogène ou les ions ferreux sont utilisés dans une réaction, il se produit une
déstabilisation de l'équilibre du système qui se traduit par la reprise des deux réactions anodique et
cathodique et, simultanément, par la reprise du processus de corrosion: c'est la dépolarisation H.

Cette dépolarisation est donc sous contrôle cathodique (consommation de l'hydrogène) ou sous
contrôle anodique (utilisation des ions ferreux). Les bactéries peuvent engendrer ces processus de
dépolarisation, ce que nous développons dans le paragraphe suivant.

• Il faut noter cependant que l'usage moderne de ce terme est différent. Il a été défini
comme étant le changement du potentiel en circuit ouvert d'une électrode après le passage d'un
courant (American Society for Testing and MateriaJs, 1979).
** Comme dans le cas de la polarisation, le terme de dépolarisation s'emploie maintenant
différemment et correspond au retour du potentiel de corrosion d'une électrode à sa valeur initiale
après le passage d'un courant.
 11

3. THEORIES DE LA CORROSION BIOLOGIQUE PAR LES

BACTERIES SULFATO-REDUCTRICES

L'attention initiale concernant la corrosion biologique, s'est surtout focalisée sur les BSR.
L'hypothèse d'une corrosion biologique par les BSR puise un certain nombre d'arguments dans leur
intervention aux cours de nombreux phénomènes géologiques: formation de dépôts de soufre non
volcaniques (HUNT, 1915 ; MURZAIEV, 1937 ; JONES, 1955 ; JONES et STARKEY, 1957;
AL-SAWAF,1977), formation de minerais de sulfures métalliques (BASTIN, 1926 ; BERNER, 1962),
intervention dans la génèse du pétrole (ZOBELL, 1947 a et b).

De nombreuses études, tant théoriques qu'expérimentales, ont tenté d'élucider les

mécanismes d'action des BSR sur la corrosion des métaux. En dépit du considérable effort fait dans
ce sens, il existe encore aujourd'hui de nombreuses controverses à ce sujet. Cependant l'ensemble
des auteurs ayant travaillé dans ce domaine s'accordent à penser que les BSR, par leur métabolisme,
sont susceptibles d'accélérer les processus électrochimiques de la corrosion décrits ci-dessus.
Plusieurs théories ont été formulées dans la littérature. Le point bibliographique qui suit est consacré
à l'exposé de ces différents modèles et au résumé des observations expérimentales apportant des
arguments favorables ou contradictoires vis-à-vis de chacun. La plus simple approche est de
considérer les différentes propriétés anaboliques et cataboliques des BSR et de voir comment
chacune a été supposée affecter les surfaces métalliques.

3.1. Utilisation de l'hydrogène Théorie de la dépolarisation

cathodique

La littérature concernant la corrosion biologique est essentiellement constituée par une

série d'évidences pour ou contre la théorie de la dépolarisation cathodique. Cette théorie, la plus
ancienne et la plus généralement acceptée, a été formulée en 1934 par VON WOLZOGEN KUHR et
VAN DER VLUGT. La découverte par STEPHENSON et STICKLAND (1931) d'une enzyme
hydrogénase permettant aux BSR d'utiliser l'hydrogène moléculaire pour la réduction des sulfates,
est le principal support de cette hypothèse. En effet cette théorie postule que les BSR accélèrent la
corrosion du fer en consommant l'hydrogène produit sur les surfaces cathodiques. Le film
d'hydrogène accumulé au niveau des zones cathodiques conduit normalement à une polarisation
(MILLER et KING, 1975; IVERSON, 1968 b) en ce sens qu'il s'oppose à l'évolution de la réaction
cathodique et par suite à celle de la réaction anodique de dissolution du fer. L'utilisation de cet
hydrogène entraine la reprise de ces deux réactions et a pour conséquence la corrosion du métal.Ce
"pompage" d'hydrogène, appelé dépolarisation cathodique, entretient donc la dissolution du fer à
l'anode. Les équations suivantes, schématisées sur la figure 2, décrivent l'ensemble du mécanisme
proposé par VON WOLZOGEN KUHR et VAN DER VLUGT :
 2-
3504 ~3H2S
PHASE
~
L1aUIDE sUbstrat~X C02
organiQues x H 20

50 2- H..,5
4~~
BIOFILM

4H
B
~
4H 0
2 2
dépolarisa t ion
cathodique

1
\ /
\ /
1 /
\ / cathode /
METAL \
/ /
\ /

-
/
" "- /
/
/'
....--............
'""------
--
--- --
/'
/

Figure 2 = Représentation shématique de la théorie de la dépolarisation cathodique

 12

Réaction anodique: 4 Fe -----> 4 Fe 2+ + 8 e- (1 )

Réaction cathodique: 8 H+ + 8 e- ----> 4 H2 (2)

Dissociation électrolytique
de reau: 8H20 < - > 8 H++80H- (3)
Dépolarisation cathodique:
(Réaction du métabolisme S04 2- + 4 H2 ______ > S2- + 4 H20 (4)

des BSR)

Formation des produits de

Corrosion à l'anode: Fe 2+ + S2- --> FeS (5)

3 Fe 2+ + 8 OH- -----> 3 Fe (OH)2 + 2 OH- (6)

Réaction globale: 4 Fe + S04 2- + 4 H20 -----> FeS + 3 Fe (OH)2 + 2 OH-

Cette théorie est le stimulant de nombreuses recherches dans le domaine de la corrosion

biologique par les BSR. Différents auteurs se sont tout particulièrement attachés à fournir des
preuves expérimentales pour ou contre ce mécanisme et ce type d'études représentent l'essentiel
de la littérature. La plupart d'entre elles ont été conduites au National Chemical Laboratory de
Teddington en Angleterre par BOOTH et TILLER et leurs associés et par MILLER et ses
collaborateurs à l'université de Manchester.

HORWATH et SOLTI (1959), TILLER et BOOTH (1962) et BOOTH et TILLER (1960,1962

a,b) utilisent les courbes de polarisation intensiostatiques pour mesurer la dépolarisation cathodique
du fer plongé dans des milieux de culture inoculés par différentes espèces de Desulfovibrio .
BOOTH et TILLER (1960) trouvent une dépolarisation cathodique seulement en présence de
Desulfovribrio desulfuricans , une espèce hydrogénase positive, les espèces hydrogénase-
négative, n'affectant pas les courbes de polarisation cathodique. Ces auteurs interprètent leurs
résultats comme une confirmation de la théorie de VON WOLZOGEN KUHR et VAN DER VLUGT. Ils
remarquent également un ralentissement de la corrosion en fin de croissance, qu'ils attribuent à la
formation d'un film de sulfure de fer semi-protecteur à la surface de l'électrode.Cependant, un peu
plus tard, en utilisant des cultures semi-continues et continues, BOOTH et al. (1965) montrent que la
protection contre la corrosion apportée par ce film de sulfure (BOOTH et TILLER, 1960) n'est
souvent que temporaire. En effet, celui-ci se détache progressivement après quelques semaines
d'exposition à l'action bactérienne et une corrosion importante reprend, même en présence d'une
bactérie hydrogénase négative. La suggestion d'une corrélation linéaire existant entre la vitesse de
corrosion et l'activité hydrogénasique des BSR (BOOTH et WORMELL, 1962), relation constituant le
concept de base de la théorie de la dépolarisation cathodique, est alors mise en doute. Cependant il
s'est avéré que la bactérie utilisée par BOOTH et al . (1965) n'était pas hydrogénase négative.
 13

Dans le même temps, une autre tentative originale est faite en faveur de la théorie
hollandaise par IVERSON (1966 a,b, 1968 b). Dans le but d'éliminer l'effet indésirable de l'H2S, il

utilise le Benzyl Viologène comme accepteur terminal d'électrons. En présence de BSR

hydrogénase positive, il met en évidence la réduction du colorant à la cathode et la migration des ions
ferreux dans le milieu à l'anode. Cependant cette expérience n'est pas considérée comme une
preuve de la théorie de la dépolarisation cathodique car la faible densité de courant mesurée entre
les deux électrodes ne permet pas d'expliquer les vitesses de corrosion importantes observées dans
les environnements naturels. D'autre part, lorsque le sulfate est utilisé comme accepteur d'électrons,
IVERSON (1968 b) n'enregistre aucun courant dépolarisant. Par la suite, il a été montré que le
colorant agissait comme agent de dépolarisation cathodique (COSTEllO, 1979).

HARDY (1983) tente à nouveau de mettre en évidence la consommation de l'hydrogène

cathodique par un culot de BSR récupéré après centrifugation d'une culture de volume important,
sur une électrode de grande dimension (7 fois plus grande que les électodes classiques). En utilisant
des traceurs radioactifs (Na2 35S0 4 ), il détecte la production d'H 2 35S produit à partir de la réduction

des sulfates par les BSR, dans des conditions de chimiolitotrophie, c'est à dire dans des conditions
où l'hydrogène produit par la réaction cathodique est le seul donneur d'électrons disponible. Il
observe une respiration uniquement dans le cas où une électrode d'acier ou de platine est introduite
dans la suspension bactérienne. Il conclut ainsi d'une part que l'hydrogène provient de l'électrode et
d'autre part que les BSR sont capables de l'utiliser pour réduire les sulfates. Il donne ainsi une
démonstration directe de l'oxydation de l'hydrogène cathodique par les BSR.

3.2. Formation de dépôts de corrosion rôle du FeS

Par ailleurs plusieurs auteurs montrent que le film protecteur initialement présent à la
surface de l'électrode après la croissance des bactéries (BOOTH et TillER, 1960) ne se forme pas si
le milieu contient des ions ferreux en concentration élevée (ADAMS et FARRER, 1953; BOOTH et
a.l. , 1967). les sulfures produits au cours du métabolisme des BSR ne peuvent pas s'accumuler
dans la phase liquide et réagir avec la surface métallique car ils sont en fait immédiatement précipités
par les ions ferreux présents en excès dans la solution. les vitesses de corrosion importantes
mesurées dans ces conditions, comparées à celles obtenues dans des cultures exemptes de fer,
soulignent alors que la concentration en ions ferreux est un paramètre significatif intervenant dans la
corrosion des métaux (BOOTH et al., 1967).

Toujours avec le désir de clarifier la théorie de VON WOlZOGEN KUHR ET VAN DER
VlUGHT, BOOTH et al. (1968) signalent le rôle important du sulfure de fer lui-même. En effectuânt
des mesures de perte de poids, ils constatent que les vitesses de corrosion mesurées dans des
suspensions de sulfure de fer préparées chimiquement sont supérieures à celles obtenues dans
 14

des cultures de bactéries hydrogénase positive. De plus, ils mettent en évidence une forte
dépolarisation cathodique lorsque le sulfure de fer et les BSR hydrogésase positive sont
simultanément présents dans la solution. En conséquence de ces observations, ils suggèrent que le
processus de corrosion est dû à "action conjointe du sulfure de fer et de "activité enzymatique des
BSR, ces deux paramètres agissant comme dépolarisants cathodiques. Ils notent cependant que le
premier facteur est prépondérant dans le phénomène de corrosion.

2H++2e- ~FeS

SURFACE CATHODIQUE---I!'...-...2H_ H2 ~ accélération de la

réaction eathJdque
contrôle cathodique R Hase+

SURFACE ANODIQUE
1 _ _ _-,-._ _.... Fe 2+
::;::::+'
2e-

L'absorption d'H2 cathodique par les cristaux de sulfure de fer est également envisagée

par MARA et WILLIAMS (1972) . Le sulfure de fer est encore incriminé par KING et al. (1973 a, b) et
KING et WAKERLEY (1973) qui suggèrent la constitution d'une pile entre ce dernier et le fer,
analogue à celle formée dans le cas d'une corrosion galvanique (couplage entre deux métaux de
nature différente). Ils considèrent que l'effet dépolarisant des BSR Hase+ s'exerce à la surface du film
de FeS, ce dernier fonctionnant comme cathode dans la cellule de corrosion. Ils concluent que le
maintien d'une vitesse de corrosion importante est dépendant du déplacement de l'hydrogène par
les bactéries.

FeS = SURFACE CATHODIQUE -..;-......,... 2H -~ H2 .. BSR H+

contrôle eathocfJqUe accélération de la

réaeton eathJdQ.Je

1
FER = SURFACE ANODIQUE _ _......_--. Fe 2 +
?
2e-

Une étude des propriétés de divers sulfures de fer (mackinawite, pyrrhotite, greigite,
marcassite), en particulier de leur rôle dans la corrosion, a conduit SMITH et MILLER (1975) à
suggérer que tous sont plus cathodiques que le fer. Reconnaissant le fait que dans les expériences
sans bactérie le sulfure de fer est incapable d'agir en permanence comme cathode, MILLER (1981)
postule alors que ces dernières régénèrent constamment le sulfure de fer et le maintiennent en
contact avec la surface du métal grâce à leurs déplacements cellulaires.
 15

Les mécanismes décrits ci-dessus sont totalement ou partiellement en faveur de la théorie

initiale de VON WOLZOGEN KUHR et VAN DER VlUGT (1934). Ils évoquent tous une activité des
BSR au niveau des zones cathodiques du métal soit par l'intermédiaire de leur enzyme hydrogénàse,
soit par la production de sulfure de fer ou par une action cumulée des deux.

3.3. Production de métabolites corrosifs

3.3.1. Rôle de l'H 2 S

la production d'H 2S au cours de la réduction des sulfates est certainement l'explication la

plus simple que l'on puisse donner quand on aborde les phénomènes de corrosion en milieu
anaérobie. Effectivement en l'absence d'oxygène, l'action agressive de l'H2S sur le fer et ses dérivés

est bien connue dans les milieux à pH acide (SÜRY, 1976; lOFA, 1970-1980 ; FOROULlS, 1980).
Même dans le cas d'alliages résistants à la corrosion, les vitesses de dissolution anodiques peuvent
être augmentées en présence d'H2S (HERBSlEB et SCHWENK, 1966 ; GREENE et WILDE, 1970 ;

CROLET et al., 1976 ; MASUO et al., 1978). L'H2S peut aussi provoquer une corrosion par

fragilisation en pénétrant dans le métal (CRAGNOLINO et MacDONALD, 1982).

Cependant, à pH neutre. l'H2S a tendance, comme nous l'avons déjà vu, à fournir une

certaine protection contre la corrosion comme l'ont montré plusieurs auteurs (BOOTH et TIllER,
1960; SHOESMITH et al., 1978 a, b; EWING, 1955).

:..HgS = STIMULANT CATHODIQUE

COSTEllO (1979) trace les courbes de polarisation cathodiques d'un acier immergé dans
des cultures de BSR et les compare à celles obtenues en présence de 0,01 mol! 1 de sulfure. Il
constate que la dépolarisation cathodique est la même dans tous les cas. Cette remarque lui permet
d'émettre l'hypothèse selon laquelle la corrosion en milieu anaérobie est entretenue par les BSR
grâce à l'action dépolarisante de l'H2S produit par ces microorganismes. La réaction impliquée dans

ce mécanisme, décrite précédemment par BOlMER (1965), est représentée comme suit:

Cependant, au pH considéré (pH neutre), l'hydrogène sulfuré est sous forme HS-,
Figure 3 = Corrosion par un composé volatile à base de phosphore (IVERSON , 1968,
1981 )
 16

- HS: = STIMULANT ANODIQUE

TOGANO et al. (1975) postulent que l'activité corrosive de l'H2S est bien plus importante

vis-à-vis de la réaction anodique que de la réaction cathodique. Cette théorie de la dépolarisation

anodique, déjà formulée plus tôt par plusieurs auteurs (HADLEY, 1943 ; WANKLYN et SPRUIT, 1952
; STARKEY, 1958) stipule que la corrosion en présence de BSR est accélérée par une stimulation de
la réaction anodique due à la précipitation des ions ferreux produits à l'anode avec les ions sulfures
libérés au cours du métabolisme de BSR suivant la réaction:

Fe 2+ + HS- --------"> FaS + H+

BOOTH et al. (1960) obtiennent des résultats expérimentaux en faveur de ce mécanisme.

Ils observent une dépolarisation anodique qu'ils attribuent à la production d'ions sulfures.
SALVARE2ZA et VIDELA (1980), en étudiant le comportement anoaique d'un acier pionoé dans
des cultures de BSR contenant 1 mM de sulfures ainsi que dans des milieux stériles à la même
concentration en sulfures, montrent également que ces derniers sont des agents dépolarisants
anodiques.

3.3.2. Production d'un composé volatil contenant du phosphore

IVERSON est à "origine de cette nouvelle théorie en (1968a, 1981,1983). Lors d'une
première expérience, il met en évidence du phosphure de fer dans les produits de corrosion
obtenus après culture de BSR en présence d'une éprouvette d'acier (IVERSON, 1968 a). Après
filtration stérilisante d'une culture de BSR et précipitation des sulfures, il met en cause un composé
volatil contenant du phosphore. Celui-ci serait produit pendant la croissance des BSR, soit
directement par leur activité, soit indirectement par réaction de l'H2S avec des composés

inorganiques à base de phosphore présents dans le milieu. Il précise que ce composé qui agit
comme dépolarisant anodique, doit venir en contact avec la suriace métallique avant le sulfure car il y
a compétition entre les sulfures (formation du film protecteur) et le composé phosphoré (corrosion)
(Fig. 3). Ce métabolite étant volatil, il n'y a pas besoin d'un contact direct entre les bactéries et le
métal, cette conclusion étant en opposition avec certains résultats expérimentaux obtenus
auparavant (GAYLARDE et JOHNSTON, 1980).

3.4. Adhésion des bactéries aux surfaces: différence de potentiel à la

surface du métal

La colonisation des surfaces par les bactéries est un concept généralement admit dans les
environnements aquatiques. Elle se déroule selon plusieures séquences (CUNDELL et MITCHELL.
1977; MARSHALL et al., 1971; FLOODGATE, 1982) (Fig. 4):
 bacterie~ aérobies + porganismes
production de composes
: carbonés
1
E 1

-o
r
1
1

.D ~2 t
(.arbone-:~_~ bacteries anaerobi.es utilisent s=
sources de carbone _ B SR ~ - ,~,(
s=

('c::I
..-
-dl
E

Figure 4 = Différentes étapes de la colonisation des surfaces par les bactéries

Figure 5 - Cellule d'aération différentielle

 17

- Adsorption de molécules organiques (polysaccharides et lipides) présentes dans le

milieu acqueux ou sécrétées par les microorganismes vivant dans ce milieu.
- Suivant immédiatement l'adsorption de ce film primaire intervient la fixation bactérienne.
Les bactéries utilisent alors les éléments nutritifs ci-dessus pour leur développement (COSTERTON
et al. ,1978). Ce biofilm est caractérisé par une structure hétérogène dans laquelle les bactéries se
développent en des endroits différents du métal sous forme de microcolonies (HAMILTON, 1985).

Les principales causes de corrosion liées à la présence et à l'activité métabolique des

microorganismes sur les surfaces métalliques sont les suivantes:

- formation de cellules de concentration d'ions: Les polysaccharides produits par les

bactéries sont susceptibles de chelater les ions métalliques présents en solution. Des rapports de
10 à 100 (selon les métaux) ont été trouvés entre la concentration des ions (Cu, Fe, Mn) dans le
milieu et ceux présents dans un biofilm formé e1"1 eau de mer circulante (GUEZENNEC et THERENE,
communication personnelle). Ce processus intervenant au niveau des microcolonies peut avoir pour
conséquence l'initiation de phénomènes de corrosion localisée analogues à ceux provoqués par
couplage galvanique ( couplage entre deux métaux différents ne présentant pas les mêiT~es

potentiels).

- Formation de cellules d'aération différentielle: La consommation locale d'oxygène par les

bactéries aérobies est susceptible de créer une déficience en cet élément dans différentes zones du
biofilm. La présence de ce biofilm et de dépôts de corrosion limitent également la diffusion de
"oxygène. Ceci aboutit à une distribution non uniforme de l'oxygène à la surface du métal de sorte
que les zones cathodiques, au contact de l'oxygène, sont dépolarisées avec pour conséquense
l'accélération du processus de corrosion (Fig. 5).

-formation de cellules de concentration d'acides: les bactéries libèrent au cours de leur

métabolisme des acides organiques. Cette production peut être plus ou moins locale de telle sorte
que le métal présente en divers points des potentiels différents en fonction de la concentration en
acides. Ceci aboutit à la génération de courants électriques et la destruction des zones présentant
les potentiels les plus bas.

- Création de zones d'anaérobiose propices au développement des bactéries anaérobies

telles que les BSR : C'est effectivement l'adhésion préalable des bactéries aérobies qui
conditionnent l'arrivée des anaérobies en créant des zones à potentiel rédox bas sous le biofilm
(COSTERTON et GEESEY, 1979 a). Les populations aérobies et anaérobies facultatives produisent
au cours de leur métabolisme, des composés qui peuvent être utilisés comme sources de carbone et
d'énergie par les anaérobies (Fig. 4).
 . CHAPITRE 2
DETECTION ET NUMERATION DES BACTERIES
SULFATO-REDUCTRICES
DANS UNE EAU GEOTHERMALE-
ISOLEMENT ET ETUDE DE LEUR METABOLISME
 2000
logements

rr
1 r-
I r-
I r-
r r-
3 échangeurs en parallèle r
r r-
r

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CI)
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Q.
N
-
....,
Q. 1
r
C'l

56' 10'
pompes à chaleur

chaudières
d'appoint

Figure 6 - Shéma de principe de l'installation géothermique de Creil

 18

CHAPITRE 2

DETECTION ET NUMERATION DES BACTERIES

SULFATa-REDUCTRICES DANS UNE EAU GEOTHERMALE
ISOLEMENT ET ETUDE DE LEUR METABOLISME

La mise en évidence de bactéries sulfato-réductrices ( BSR) au niveau d'une installation

métallique corrodée est une première approche de l'étude de leur incidence dans les phénomènes
de corrosion observés. Même si leur présen':e ne constitue pas une preuve tangible de leur
responsabilité, elle est néanmoins une première indication. Leur nombre est un index assez sensible
de leur activité ~. La connaissance de leurs capacités métaboliques peut également apporter
des renseignements intéressants quant à leur activité. Nous avons donc jugé nécessaire de
commencer ce travail par les numérations, les isolements et l'étude des BSR présentes dans le puits
géothermique étudié. L'étude physiologique et nutritionnelle a également pour but de définir les
conditions optimales de leur croissance afin de les tester au laboratoire pour leur activité corrosive.

1.MATERIEL ET METHODES

1.1. PRELEVEMENTS
1.1.1. PRESENTATION DU SITE DE PRELEVEMENT
1.1.1.1. PRINCIPE DE FONTIONNEMENT

Le puits G.C.RA de la centrale géothermique de Creil exploite les eaux chaudes d'un
réservoir du Dogger (Jurassique moyen) situé à 1725 mètres de profondeur dans le sous-sol du
Bassin Parisien (Fig. 6). C'est un puits de production "basse température", la température de l'eau
dans l'aquifère étant de 5aoC. Utilisées pour le chauffage urbain, ces eaux sont remontées à la suface
par l'intermédiaire d'une colonne en acier au carbone équipée d'une pompe immergée à 100 m de
profondeur. Cette dernière, située à l'extrêmité d'une colonne suspendue, est utilisée lorsque les
besoins en chaleur sont importants (hiver). En fonction de cette demande, on distingue deux
régimes d'exploitation sur le puits géothermique de Creil, occassionnant l'arrêt ou le fonctionnement
de la pompe (Fig. 7) :
 RE Cl ~! E D' HIVE R

TETE DU PUITS
DE PRO DUC T l 0 ;~

maitresse ouverte
2. Vannes latérales fermées
3. Circulation du fluide
géothermique
4. Pompe immergée en
fonctionnement
), Niveau de la nappe dans
le puits
6. Colonne de production
7. Eau stagnante

8. Colonne suspendCle
soutenant la po~pe
, 0
Espace annulaire

Figure 7 = Fonctionnement du puits de production

de Creil suivant le régime d'exploitation

R.2CL-!E D'ETE

1. Vanne maitresse fermée

2, Vannes latérales ouvertes
.i,.
.,. Po mp e lmmergee
. , , "
arretee
 19

* Réoime hivernal: La pompe (4) est alors en fonctionnement. Le débit pompé est de 150

m3/h. La totalité du fluide (3) transite par la pompe et la colonne suspendue (8) à la vitesse de 3,5

mis.

* Réoime d'été: Le puits fonctionne uniquement grâce à la pression artésienne du

réservoir avec un débit de 90 à 100 m3/h, largement suffisant pour subvenir aux besoins en calories
durant cette période. L'arrêt de la pompe ( 4) et la fermeture de la vanne maîtresse (1) ont deux
conséquences:
. La déviation du fluide géothermal (3 ) qui circule alors dans l'espace annulaire
(9) à une vitesse de 0,6 mis.
- La stagnation de l'eau emprisonnée (7) dans le conduit de production de la
pompe.

Le forage géothermique G.C.RA de Creil est couplé à un autre sondage destiné à la

ré-injection dans la même nappe de l'eau refroidie après passage dans un échangeur de chaleur.
L'intérêt de cette ré-injection est de se débarasser d'une eau salée impossible à rejeter dans la nature
et de maintenir la pression du gisement afin de conserver les conditions d'exploitation initiales. Dans
ce doublet, la distance entre les deux forages dans le réservoir est telle que le front de
refroidissement ne puisse atteindre Je puits de production qu'après un temps suffisant pour
permettre "amortissement des installations (de "ordre de 30 ans). Le puits fonctionne donc en circuit
ouvert, malgré la remontée et la ré-injection du fluide dans la même nappe.

1.1.1.2. CARACTERISTIQUES PHYSICO-CHIMIQUES DU

FLUIDE GEOll-iERMALE DE CREIL

Plusieurs analyses effectuées par le B.R.G.M. (Bureau de Recherche Géologique et

Minière) ont montré une constance de la nature chimique du fluide géothermique de Creil dans le
temps. Les principales caractéristiques de cette eau sont présentées ci-dessous:

Paramètres physico-chimiques;
-Température de fond de puits = 58°C
-Température de tête de puits = 55-56°C
- pH = 7,2-7,3
-Salinité totale = 28 gll
- Concentration en NaCI = 20,9 g Il
 20

Eléments majeurs (concentrations moyennes en mg II) ;

·Cations:Ca 2+=1135 ; Mg2+=375: Na+=8300; K+=119 NH4+=26

- Anions: HC03- = 370 ; cr = 15500 ; S04 2- = 810

Gaz dissous:
4,16 10-4 moles /1 soit 18,3 ppm

-02 = 1,51 10- 6 0,048

-N2 1,08 10-5 0,3

- CH4 = 3,69 10-3 59

-H2 S 1,76 10-3 60

Gaz libres;

· C02 4 % volumique à pression atmosphérique

- 02 0,3 %

10,5 %

10 ppm volumique

Concentration en sulfure dans les dépôts de corrosion - 22 à 23 % de soufre dont environ 60

%de FeS.

Isotopes;
34 S04 = + 35,6 % ± 0,2

Cette valeur exprime la proportion entre l'isotope lourd (34S) et j'isotope léger (32S) du soufre
présent dans l'eau géothermale de Creil sur le même rapport d'une troilite de la météorite de Canyor
Diablo considérée comme standard de référence.

Ces analyses n'ont pas été intégrées dans nos résultats bien qu'elles aient été enregistrées
simultanément à notre étude bactériologique du site de Creil. Néanmoins, nous les utilisons dans notre
discussion.
 21

1.1.2. METHODES DE PRELEVEMENT ET

D'ECHANTILLONNAG E

Nous avons eu l'occasion de prélever sur le puits de Creil dans deux cas:
- Puits en arrêt de fonctionnement.
- Puits en cours de fonctionnement normal.

*Echantillonnaoe sur le puits en arrêt de fonctiQnnem~

Ce prélèvement a été effectué en novembre 1983, dans le cadre d'un programme

pluridisciplinaire coordonné par l'I.M.R.G. (Institut Mixte de Recherche 3n Géothermie) à la suite d'une
opération de remplacement de la pompe de production, due à d'importants problèmes de corrosion
(photos 9, 10 et 11 p. 42). Au moment de sa remise en fonctionnement, soit un mois après sen arrêt,
le puits refusait d'entrer en production, suite à l'obstruction de la colonne, provoquée par la chute de
dépôts de corrosion lors de la remontée de la pompe. Notre intervention s'est située à ce moment-là
et a eu pour but .Ia recherche des BSR présentes dans ces dépôts. Un carottier a permis d'effectuer
un prélèvement au niveau de la zone obstnJée, à 250 m de profondeur environ. L'échantillon de
nature sédimentaire et de couleur noire, recueilli dans un flacon stérile, a été traité immédiatement sur
place.

Pour préciser la nature exacte de ce prélèvement, il est nécessaire de connaître le

déroulement de la première étape de j'opération de remplacement de la pompe. Lorsque la panne
d'un puits nécessite la remontée d'une partie des éléments qui le constituent, il faut dans un premier
temps le "tuer", c'est-à-dire stabliser la colonne d'eau à une certaine profondeur. Cette opération est
réalisée par "injection de saumures (350 gll, densité 1,18) dans le puits. Durant cette période de
panne, le puits subit de graves pertubations : entrée d'oxygène, diminution de la température, chute
de pression, augmentation de la salinité (ions chlorures).

*Echantillonage sur le puits en cours de fonctionnement normal:

Ces prélèvements ont été effectués en février 1985, dans le but d'avoir des résultats plus
représentatifs que les précédents. Cependant nous n'avons pas eu accès aux dépôts de corrosion.
Ils ont donc été réalisés en tête de production (Fig. 7), au niveau des vannes latérales. Deux types
d'échantillons ont été considérés:
- L'eau située dans les "zones mortes" du circuit, recueillie dans des flacons stériles placés
sous atmosphère inerte (N2) immédiatement après ouverture de la vanne de tête de production.
 22

- L'eau circulant dans le sondage de production, prélevée après un écoulement d'environ

5 minutes, en prenant des précautions pour éviter le contact de l'échantillon avec l'oxygène de l'air,
celui-ci pouvant être léthal pour certaines BSR.

Les numérations dans le premier prélèvement ont été effectuées environ 24 h après, au
laboratoire, alors que le second a été analysé immédiatement après sa collecte.

1.2. NUMERATIONS DES BSR

1.2.1. MILIEUX DE CULTURE

Le métabolisme général des BSR, décrit au chapitre 1, est bien défini: elles utilisent le
sulfate comme accepteur terminal d'elect'ons. Elles ont besoin d'une source d'azote ainsi que des
substances organiques simples comme source de carbone et d'énergie. Les milieux pour la mise en
évidence et la culture des BSR sont donc à base de ces différents éléments. Ils contiennent
également des vitamines et des oligoéléments ainsi que plusieurs sels minéraux dont des sels de fer
nécessaires à la culture (BUTLIN et al., 1949 a) et qui permettent de visualiser la réduction des
sulfates par formation d'un précipité noir de sulfure de fer. D'autre part ces bactéries ayant un
métabolisme anaérobie strict, des précautions sont prises lors de la préparation de ces milieux, pour
qu'ils soient exempts d'oxygène.

Bien que l'emploi de milieux solidifiés aurait simplifié l'étape de purification, notre choix
s'est porté sur des milieux liquides pour des raisons pratiques, la plupart des ensemencements étant
faits sur le terrain avec un matériel très réduit (absence de bain-marie thermostaté nécessaire au
maintien en surfusion des milieux solides).

Deux milieux de culture ont été utilisés dans ce travail:

1.2.1.1. MILIEU DE POSTGATE (19661. MODIFIE PAR LAPAGE et al . (1970)

Ce milieu préparé selon la technique d'HUNGATE (1969) a été employé pour les
numérations de novembre 1983 :
 23

Composition du milieu:
solution 1 (a / 1) :
-NaCI 20

-KH 2 P04 0,5

-NH 4 CI

-N~S04 2

-eact:22HiJ 0,1

-MgSC)4'ï'H20 2
-Na-lactate 3,5
-Na-acétate 2
-Extrait de levure
-Eau distillée q.S.p.1000 ml

Solution 2 (g / 1):

-FeS04·i'J-2° 0,5
-Eau distillée q.s.p.10 ml

Solution 3 (a / 1):
-.Acide ascorbique 0,1
-Na-thioglycolate 0,1
-Eau distillée q.s.p. 10 ml

Le milieu est réparti en tubes d'HUNGATE à raison de 9 ml par tube. 1/ est dégazé dans
chaque tube avec un mélange N 2-C0 2 (80-20 %). Les tubes sont bouchés et autoclavés pendant
30 mn à 110 oC. Le milieu ainsi préparé, en mélangeant les 3 solutions avant stérilisation, doit être
employé rapidement.

Le milieu de culture contient à la fois du lactate (10 mM) et de l'acétate (10 mM) pour le
dénombrement global des BSR : ces deux substrats permettent de cultiver toutes les espèces de
BSR et en particulier, sur acétate, les espèces nouvellement décrites. Pour respecter la
stoechiométrie de l'oxydation des substrats et pour que le sulfate ne soit pas limitant après l'ajout
d'acétate, nous avons augmenté sa concentration.
 24

1.2.1.2. MILIEU DE WIDDEL ET PFENNIG. 1977. MODIFIE PAR

WIDDEL. 1980.

Deux séries de milieux ont été préparées avec du lactate ou de l'acétate. La séparation
des substrats carbonés permet de dénombrer les B8R capables de se développer sur le substrat
choisi et donc d'orienter partiellement l'identification des espèces dénombrées. Ce clivage permet
également d'avoir une idée des substrats présents et utilisés ~

Composijion et préparation du milieu;

Ce milieu a servi pour les dénombrements de février 1985. Nous insistons ici sur la
préparation du milieu car c'est celui que nous avons employé dans l'étude électrochimique.

Solution 1 en ÇJ Il . Solution de sels minéraux

-Na 2 S 04 3
-NaCI 20
-KCI 0,3
-NH 4 CI 0,3
-MgCI 2 ·6H 20 3
-KJ-i 2 P04 0,2
-CaCI 2 ·2H 2 0 0,2
-H 2 0 distillée q.s.p.1000 ml

Solution 2 ; Solution d'olieoéléments (me / 1) :

-HCI (25%) 6,5 ml
-FeCI 2 ·6H 2 0 1500
-H 3B0 3 6
-MnCI 2 .4H 20 100
-CoCI 2 ·6H 20 120
-ZnCI 70
-NiCI 2 ·6H 20 25
-CuCI 2 ·2H 2 0 2
-Na 2 Mo0 4 .2H 20 25
-H 2 0 distillée q.s.p. 1000 ml

SQlution 3 : indicateur d'oxygène (g III :

-Résasurine
q.s.p. 1000 ml
 1
2 sortie de gaz avec soupape de sécurité

dispositif
de filtration

4
sortie d'écoulement
du milieu

Figure 8 - Principe du ballon servant à la préparation du milieu de WIDDEL (1980)

 25

Les solutions 1, 2 et 3 sont mélangées à raison de 1000 + 2 + 1 ml. Ce mélange est ensuite
autoclavé à 11 DoC pendant 45 mn, dans un ballon (Fig. 8). Dès la sortie de l'autoclavage, lorsque le milieu
est encore bouillant, donc exempt d'oxygène, l'atmosphère du ballon est évacuée (sortie 2) et
remplacée (entrée 1) par un mélange de gaz stérile N2 -C0 2 (80-20%). Le milieu est ensuite refroidi sous
cette atmosphère contrôiée et .maintenu en légère surpression (0,2 bar) (les sorties 2 et 4 sont alor~
fermées).
Les solutions suivantes sont alors rajoutées au milieu:

solution 4 : 30 ml d'une solution de bicarbonate de sodium saturée en CO 2 , préparée

anaérobiquement dans un flacon antibiotique et stérilisée par autoclavage à 11 DoC pendant 30 mn. Le
flacon est mis en surpression et la totalité de la solution est introduite stérilement dans le ballon à travers
le septum de l'entrée 3, grâce à une double aiguille

-NaHC03 2,52 g
-H 2 0 distillée q.s.p.30 ml

Solution 5: 1 ml d'une solution de vitamines stérilisée par filtration sur membrane de

porosité 0,2 ~m (les vitamines sont dénaturées par la chaleur).

-8iotine 1 mg
-Acide p-aminobenzoïque 5 mg
-Vitamine 8 12 3 mg
-Thiamine 10 mg
-H 2 0 distill,ée 100 ml

Solution 6 ; 1 ml d'une solution de dithionite de Na (solution réductrice) préparée avec de

l'eau distillée anaérobie et stérilisée par filtration.

-Na 2S 204 3 9
-H 2 0 distillée 100 ml

Solution 7 . 0,5 ml d'une solution de sulfure de Na (solution réductrice) préparée de

manière anaérobie et stérilisée par autoclavage à 11 oDe pendant 30 mn.

- Na2S.9H20 12 9
- H 20 distillée 100 ml
 26

Solution 8 ; 1a ml d'une solution de substrat organique préparée anaérobiquement et

stérilisée à l'autoclave pendant 30 mn à 11 aoc. Cette solution peut être ajoutée au ballon avant
autoclavage.

-Na-lactate 22,4 g
ou -Na-acétate 27,2 g
-H 20 distillée q.s.p. 100 ml

Ces solutions (5, 6, 7 et 8) sont prélevées avec une seringue stérile dégazée à l'N 2
(élimination de 1'02 résiduel de l'aiguille) et introduites par le septum de l'entrée 3. Une fois toutes
ces solutions ajoutées, le pH du milieu est vérifié en prélevant stérilement 5 ml de la solution. Le pH
final est théoriquement compris entre 7,3 et 7,5. Si ce n'est pas le cas, il est alors ajusté à ces valeurs
par ajoûts successifs d'une solution de NaOH 3 M ou d'HCI 3 M. Ces solutions préparées au préalable
sont évidemment stériles. Entre chaque ajoût le pH est mesuré.Le milieu est ensuite réparti
stérilement près d'une flamme, dans des tubes de HljNGATE préalablement stérilisés à 110°C
pendant 40 mn. Avant autoclavage, environ a,2 ml d'eau distillée sont introduits dans chaque tube
pour éviter une atmosphère sèche qui peut avoir pour conséquence la résistance de spores à la
stérilisation.

Le milieu s'écoule par la sortie 4 du ballon (Fig.8) grâce à la surpression de gaz maintenue
dans celui-ci. Les tubes sont complètement remplis pour évacuer tout l'oxygène présent à l'intérieur.
Ces tubes sont bouchés avec un septum en butyi noir imperméable aux gaz. Ce septum,une fois en
place, est maintenu par une virole vissée. Ce tube permet les transferts de milieu et les inoculations
sans risque d'entrée d'oxygène grâce à l'utilisation de seringues stériles et purgées à l'azote.

Pour les numérations, 8 ml de milieu sont prélevés (2 ml pour les tests de substrats, de
température, de pH, de salinité) avec une seringue contenant un volume équivalent de gaz N2-C0 2
(80-20 %). Ce mélange gazeux est injecté dans le tube au moment du prélèvement de façon à ne
pas créer une dépression pouvant entrainer l'entrée d'oxygène. Les tubes contiennent alors 9 ml de
milieu et sont prêts à être ensemencés.

1.2.2. TECHNIQUE DE NUMERATION

Nous avons utilisé la technique du MPN (Most Probable Number) avec 3 répétitions par
dilution. Cette méthode statistique est basée sur la dilution de l'échantillon; on admet que la réaction
propre à l'espèce recherchée, intervenant dans la dernière dilution positive, est due à une seule
cellule (clone).
 figure 9 = Techniques d'ensemencement et de dilutions pour la numération des BSR

ECHANTILLON DE DEPOTS DE CORROSION ECHANTILLON D'EAU GEOTHERMALE

flacons stériles
sous atmosphère inerte( N )
2

~ 19

1 er tube à dilution
dilution 10- 1
9 ml de milieu

ultra - sons homogenisation

homogen i sat ion

dilution 10- 2

homogéni sat ion homOgénisation

1 1 1 ml 1 1 1 ml
 27

1.2.2.1. ENSEMMENCEMENTS ET DILUTIONS

• Echantillon solide (dépôts de corrQsion) : 1 g de l'échantillon est prélevé avec une

seringue coupée et stérile puis mis en suspension dans un premier tube contenant 9 ml de milieu
(Fig. 9). Celui-ci pour la circonstance est ouvert. Après agitation et passage aux ultra-sons pour
décrocher les bactéries des particules, cette suspension (dilution 1/10 ème) sert à inoculer les 3
tubes de la dilution suivante le plus rapidement possible. Les autres dilutions se font en cascade de
10 en 10 jusqu'à 10- 7 , par transfert de 1 ml avec une seringue stérile. En raison de l'adhésion des
cellules aux surfaces, les numérations dans ce type d'échantillon donnent souvent des résultats par
déf aut.

• Echantillon aqueux (eau Qéothermalel : 1 ml d'eau est directement injecté avec une
seringue dégazée et stérile dans chacun des 3 tubes qui constituent la première dilution (1/10 ème)
(Fig. 9). Dans chaque tube, 1 ml est prélevé et inoculé dans le tube correspondant de la dilution
suivante. Les autres dilutions sont réalisées comme précédemment jusqu'à 10-5 .

Dans les deux cas deux séries identiques de tubes sont préparées, chacune étant
ensuite incubée à différentes températures (20 et 55"C pour le premier échantillon et 37 et 5SoC pour
le second) pendant une à deux semaines. Une incubation à 55 'OC est intéressante car elle peut
permettre la mise en évidence de bactéries thermophiles strictes, la température du biotope étudié
étant proche de cette valeur.

1.2.2.2. LECTURE ET DETERMINATION DU NOMBRE DE BSR

Dans le cas du milieu de POSGATE, le développement des BSR est visualisé par le
noircissement de la culture obtenu par la production de sulfures qui précipitent avec le fer présent en
solution sous forme de FeS. Le nombre de BSR est alors déterminé par la technique du MPN décrite
ci-après.
Le milieu de WIDDEL et PFENNIG ne contient pas suffisamment de fer pour permettre
cette réaction. On a alors recours au dosage de L'H 2S. Lorsque les tubes présentent un trouble
bactérien, la lecture par ce dosage est effectuée. Ce milieu, bien que séiectif, peut permettre le
développement d'autres espèces bactériennes anaérobies strictes ou facultatives également
présentes dans i'échantillon. Pour cette raison, la présence de BSR ne peut pas être visualisée
uniquement par l'apparition de ce trouble et nécessite donc la recherche d'un caractère propre à ce
groupe. On caractérise les BSR par l'apparition d'H 2 S dans le tube (produit au cours de la réduction
 28
des sulfates). Ce dernier est dosé dans tous les tubes positifs par la technique colorimétrique de
CORD-RUWISCH (1984) décrite au paragraprle 1.4.3. On note:

• La dilution la plus forte pour laquelle les trois tubes présentent une réaction positive
• Le nombre de tubes positifs dans les 2 dilutions suivantes.

Le nombre de tubes positifs dans chacune de ces 3 dilutions donne un nombre

caractéristique à 3 chiffres qui permet de se référer à une table statistique, celle de MAC CRADY
(1918). Cette table donne le nombre le plus probable de bactéries contenu dans j'inoculum à la
première dilution considérée.

1.3. PURIFICATION DES BSR

1.3.1. MILIEU DE CULTURE

Le milieu de culture utilisé est celui de WIDDEL et PFENNIG dont la composition est
donnée en 1.2.1.2. Ce milieu, préparé initialement sans sulfate et sans substrat carboné, constitue le
milieu de base auquel il est possible d'ajouter sous forme de solutions stériles, l'accepteur et le
donneur d'électrons choisis. Il est solidifié pour permettre la séparation et le prélèvement des
colonies bactériennes qui s'y développent. Le milieu solide est préparé selon la méthode
recommandée par PFENNIG et TRÜPER (1981) : Une suspension d'agar est lavée 5 fois à l'eau
distillée par agitation et décantation. Elle est ajustée à un volume précis de façon à obtenir une
concentration finale de S %. Cette suspension est répartie en tube de Hungate à raison de 1,5 ml par
tube. L'atmosphère des tubes est remplacée par un mélange N2-C0 2 avant stérilisation à 110°C
pendant 30 mn.
Au moment de l'emploi, les tubes sont chauffés au bain-marie pour liquéfier le culot d'agar,
puis maintenus en surfusion à SO°C. 7,5 ml du milieu liquide à la température de 45 oC, contenant du
sulfate et du lactate (20 mM), sont additionnés à chaque tube. Les tubes ainsi préparés contiennent
9 ml de milieu à 1 % d'agar et sont maintenus en surfusion dâns un bain-marie à 45°C.

1.3.2. ENSEMENCEMENTS ET DILUTIONS

Les tubes précédents (à 45°C) sont ensemencés avec 1 ml d'échantillon. Les échantillons
sont les dernières dilutions positives des tubes de numérations incubés à 37 et 55°C et un
enrichissement de l'eau géothermale sur H2 -C0 2 (20-80 %) présent en excès + sulfate + acétate (1
mM) incubé à 55°C.
A partir du premier tube ensemencé, des dilutions de 10 en 10 sont réalisées jusqu'à
10-8 . Avant chaque transfert, le contenu des tubes est homogénéisé par renversement. Le milieu
gélosé est refroidi puis incubé à la température d'origine de l'échantillon pendant environ 1 semaine.
 29

Ces dilutions permettent d'avoir des colonies bien individualisées dans la gélose ce qui
facilite leur prélèvement. En théorie les colonies obtenues dans les dernières dilutions
correspondent aux souches dominantes présentes dans l'enrichissement de départ.

1.3.3. ISOLEMENTS

Les colonies de BSR sont entourées d'un halo noir à cause de la précipitation de l'H 2S
produit avec le fer contenu dans le milieu. Ces colonies noires sont prélevées stérilement avec une
pipette Pasteur, puis repiquées et diluées séparément en milieu liquide. La dernière dilution positive
est de nouveau diluée dans une série de 8 tubes de milieu gé/osé. Deux à trois séries successives
sont généralement nécessaires pour l'obtention d'une culture pure. La pureté des souches est
vérifiée:
- par ensemencement sur milieu riche: le milieu de WIDDEL sans sulfate est supplémenté
avec 0,5 % de glucose, 0,5 % de biotrypcase et 0,5 % d'extrait de levure.
- par examen au microscope.

Quand les bactéries sont isolées en culture pure, on peut les garder en souchier en vue
de leur identification ultérieure. Elles sont conservées en milieu liquide à 4°C et entretenues par
repiquages à intervalles réguliers.

1.4. ETUDE DES BSR ISOLEES EN CULTURE PURE

1.4.1. ETUDE DES CARACTERES MORPHOLOGIQUES

Sept caractères sont recherchés au cours de cette pré-identification sommaire:

- Mobilité des bactéries
- Morphologie des cellules
-Présence de spore(s) et position de celle(s)-ci dans la cellule
-Présence de vacuole(s) de gaz dans le cytoplasme
-Paroi
-Taille des cellules
-Flagelle(s) : présence et position

L'étude des 5 premiers caractères est effectuée par observation microscopique (X1000)
de la culture pure à l'état frais et après coloration de Gram (paroi). Pour l'appréciation de la taille des
cellules nous avons réalisé des photographies (contraste de phase, X1000). Une goutte de
suspension bactérienne, obtenue après centrifugation, est déposée sur une fine pellicule d'agar
 30

séché, répartie sur une lame. La goutte est ensuite recouverte d'une lamelle lutée à la paraffine. La
suspension pénètre dans "agar et les cellules sont immobilées ce qui évite tout mouvement durant
la prise de vue.

L'observation des flagelles est réalisée en prenant des photos en microscopie

électronique en transmission: des petites grilles de cuivre sont recouvertes d'un film très fin de
formvar (150-200 A). Ce film est solidifié par vaporisation de carbone. Les grilles ainsi préparées sont
mises en contact avec une goutte de culture bactérienne en phase exponentielle de croissance.
Après élimination du surplus de la culture, les grilles sont immergées pendant 5 sec. dans une
solution de phosphotungstate de sodium à 1 % et à pH 7. L'excés de phosphotungstate est éliminé
avec du papier filtre. Les échantillons sont alors prêts pour l'observation.

1.4.2. ETUDE DE LA COMPOSITION EN BASES DE L'ADN

Une culture de 10 litres (inocuJum = 20 %) est effectuée sur le milieu liquide de WIDDEL.
En fin de phase exponentielle de croissance, les cellules sont collectées par centrifugation de la
totalité de la culture. Elles sont lavées 2 fois dans du tampon phosphate ( KH 2 PO4 50 mM - K2HPO 4
50 mM ajusté à pH 7). Le culot est récupéré puis Iyophilysé et envoyé à la DSM (collection allemande
de microorganismes, G6ttingen, RFA) pour être analysé.

La valeur du G+C % (100 X [moles guanine + cytosine] / nombre total de moles de bases)
a été déterminée par H. HIPPE, G6ttingen, F.R.G., par ultracentrifugation dans un gradient de
chlorure de césium. L'ADN de Micrococcus luteus ,dont le G+C % est de 73,77 mol % a été utilisé
comme référence.

1.4.3. ETUDE DES CARACTERES PHYSIOLOGIQUES,

NUTRITIONNELS ET BIOCHIMIQUES

La croissance des BSR est mesurée par:

·Le suivi de la densité optique à 580 nm, sur Spectronic 21 Bausch et Lomb,
directement dans les tubes de culture.
• Le dosage des produits du métabolisme tel que l'H 2S (méthode colorimétrique) ou
l'acétate (chromatographie en phase gazeuse). Parfois on mesure aussi la concentration en substrats
consommables présents au départ tel que le butyrate (chromatographie en phase liquide).
 31

Dosage de l'H2.~ cette méthode a été décrite par CORD-RUWISCH (1984).

0,1 ml de la culture sont injectés rapidement dans 4 ml de réactif HCI 50 mM-CuSO45 mM
sous agitation. Après cette acidification, l'intensité de la coloration du sulfure de cuivre formé est mesurée à
480 nm au spectrophotomètre. Une courbe étalon donne la concentration en ions S2- en fonction de la DO
mesurée. Cette technique présente l'avantage d'offrir une réponse rapide et donne. des résultats
reproductibles dans une gamme de concentrations supérieures à 2 mM de sulfure et inférieures à 20 mM.

Dosage de l'acétate: 1 ml de la culture est centrifugé. Le surnageant est récupéré puis

acidifié avec 40 ~I
d'une solution de H3 P0 4 à 50 %. 0,02 ml sont alors analysés en chromatographie en
phase gazeuse (chromatographe Varian Aerograph 2700; Injection: 250°C; Colonne Porapack Q 80-100
mesh, 2.0 m X 1 /8", 190°C, Gaz vecteur: N2 , vitesse: 70 ml / mn, détecteur: ionisation de flamme, 245°C).

Dosage du butyrate: 1 ml de la culture est centrifugé. Le surnageant est ~Iors analysé

par HPLC (pompe: Analprep 93, Touzart et Matignon, Vitry sur seine, France: vitesse: 0,6 ml / mn; Quantité
injectée: 100 ~I; Colonne: Amines lon-Exclusion HPX-87H, 300 X 7,8 mm, Bio-Rad, Richmond, Californie;
Température de la colonne: 40°C; Détecteur: Réfractomètre différentiel, Knauer, Berlin; Intégrateur:
Chromatopack C-R3A, Shimadzu, Kyoto).

1.4.3.1. ETUDE DES PARAMETRES PHYSICO-CHIMIQUES DE LA

CROISSANCE

• Température optimale de croissance

Les cultures sont réalisées sur le milieu de base de WIDDEL additionné de lactate (20 mM)
et de sulfate. Pour chaque température testée, 3 tubes de milieu sont inoculés avec 10 % (vol/vol)
d'une préculture agée de 2 à 4 jours suivant les souches. En fin de phase exponentielle de
croissance, après environ 30 h, la concentration en H2S et la DO de la croissance sont mesurées.
Dans certains cas la courbe de croissance de la souche a pu être enregistrée pour chaque
température et a permis de calculer le temps de division cellulaire en fonction de la température.

• pH optimal de la croissance

Les cultures sont réalisées comme précédemment dans des milieux à différents pH,
incubés à la même température. Le pH controlé en fin de croissance ne varie pas (milieu tamponné).
 32

• Comportement vis-à-vis de la salinité

Pour étudier l'influence de la concentration en sel sur la croissance des souches isolées,
des quantités croissantes d'une solution de NaCI à 300 g / 1ont été ajoutées à du milieu de WIDDEL
et PFENN IG liquide ne contenant pas au départ de NaCI. Une gamme de salinité de a à 10 % de NaCI
est ainsi obtenue. Deux tubes ont été utilisés pour chaque concentration. Chaque série est ensuite
ensemencée avec la même quantité (1 ml) d'une pré-culture en phase exponentielle de croissance.
Compte tenu que l'inoculum contient 20 g / 1de NaCI, la gamme varie en fait de 0,1 à 10,1 %.

1.4.3.2. ETUDE NUTRITIONNELLE

Le milieu de base de WIDDEL et PFENNIG est utilisé pour tester l'utilisation de différents
substrats constituant les sources de carbone et d'énergie et les différents accepteurs terminaux
d'électrons. Ces composés sont préparés et stérilisés séparément sous forme de solutions
concentrées (0,1 à 2 mol / 1). Ils sont ajoutés de façon à obtenir une concentration finale comprise
entre 0,1 et 20 mmol / 1. Des cultures de contrôle sont réalisées sur le milieu sans source de carbone
et d'énergie ou sans accepteur additionnel. Chaque test est effectué en double. Les tests
d'utilisation de l'hydrogène sont vérifiés par 4 repiquages successifs de façon à épuiser le milieu en
composés organiques (lactate et acétate) présents dans l'înoculum de départ.
 20°C 56°C
1er prélèvement
dépôts de Lactate + acétate Lactate + acétate
Nov. 1983 corrosion 25 bactéries / g 300 bactéries / g
3rC 56°C
Lactate Acétate Lactate Acétate
Eau du
2ème
circuit
prélèvement 50 0 2 0

Fev. 1985 Eau dans

zones 900 0 2 0
stagnantes

Tableau 2 : Numérations des B8R dans le puits de Creil exprimées,

sauf mention contraire, en nombre de bactéries / ml
 33

2. RESULTATS
2.1. DETECTION ET NUMERATION DES BSR DANS LE PUITS
GEOTHERMIQUE DE CREIL

Il faut distinguer deux séries d'enquêtes, l'une au cours de laquelle l'arrêt du puits pour le
remplacement de la pompe a donné accès aux dépôts de corrosion (cf. par. 1.1.), l'autre pendant
laquelle cette opération n'a pas été possible et où les échantillons prélevés sont de l'eau du circuit et
de l'eau des zones présentant une faible turbulence (vannes). Les résultats des numérations
présentés dans le tableau ci-contre (tableau 2) montrent la présence de BSR dans le puits
géothermique de Creil aussi bien dans l'eau que dans les dépôts de corrosion. Néanmoins, on ne
remarque pas de différences significatives du nombre de bactéries en fonction des conditions
établies dans le puits (normales ou pertubées à l'occasion des opérations de remplacement de la
pompe).
Dans les dépôts de corrosion obstruant le puits, on constate une nette prédominance des
bactéries thermophiles alors que dans l'eau de puits, le nombre de bactéries mésophiles est
supérieur.
On observe que les bactéries sont plus, nombreuses dans les zones du circuit
caractérisées par de faibles débits (eaux accumulées dans les vannes).
Aucune bactérie n'a été dénombrée sur le milieu contenant de l'acétate aussi bien à 37
qu'à 55 C.
D

2.2. ISOLEMENTS DES BSR DENOMBREES DANS LE PUITS DE

CREIL

Après la phase de numération des BSR, nous avons commencé la procédure d'isolement
des espèces dominantes présentes dans le sondage de Creil. Deux objectifs principaux ont été
assignés à cette étape de purification:

" La connaissance de l'activité métabolique et des conditions de croissance de chaque

souche pour estimer leur degré d'adaptation aux condtions écologiques du puits
" L'obtention de cultures pures pour l'étude, en conditions de laboratoire, de leurs
capacités corrosives.
Les tubes de numération du deuxième prélèvement nous ont servi de milieu
d'enrichissement. Après vérification de la production d'H2S dans ces cultures, une aliquote de

suspension a été transférée puis diluée dans un milieu maintenu liquide avant sa gélification. Les
différentes colonies développées après incubation ont été prélevées une à une et repiquées pour la
suite de la purification. Bien que le milieu soit relativement sélectif (une seule source de carbone,
présence de sulfates, milieu minimun), certaines de ces colonies peuvent être des espèces
 34

anaérobies n'appartenant pas au groupe des BSR. Les colonies de BSR sont de couleur noire ou
marron due à la précipitation des sulfures produits au cours de leur métabolisme avec les ions ferreux
présents dans le milieu. Cette couleur constitue donc un premier indice permettant de ne pas les
prélever au hasard. Des séries de repiquages sur milieux alternativement liquides et solides,
précédés de séries de dilution, s'échelonnant sur un à deux mois, ont permis de purifier des souches
de BSR.Les nombreux examens ainsi que l'observation des colonies, accompagnant ces étapes de
purification, nous ont autorisé à éliminer en cours d'isolements, les souches morphologiquement
similaires à celles retenues.
Ces nombreuses manipulations ont abouti à l'obtention de 4 espèces différentes de BSR.
Les repiquages sur milieu riche (contenant glucose, extrait de levure et biotrypcase) exempt de
sulfates, permettant le développement en masse de contaminants présents éventuellement à l'état
latent, ont confirmé que les cultures étaient vraiment axéniques:

- Une souche a été obtenue à partir d'un enrichissement de l'eau géothermale sur lactate
plus sulfates incubé à 37°C (souche A). L'ensemble des BSR développées à cette température
présentaient toutes une forme de vibrio de même dimension. L'obtention de nombreuses souches
ne constituant pas l'essentiel de notre objectif, nous avons préféré, comme nous l'avons déjà
signalé, abandonner les duplicata en cours de purification pour ne retenir qu'un représentant de ce
type morphologique.

- Deux espèces de BSR morphologiquement distinctes ont été isolées à partir

d'enrichissement du fluide géothermal sur lactate plus sulfate incubé à 55°C (souches 01 et D2)'

- Comme notre préoccupation principale était la mise en évidence de !'utilisation de

l'hydrogène par les souches isolées, nous avons effectué un enrichissement de l'eau géothermale

sur H2-C02 (20-80 %) plus sulfate, contenant 1 mmol/ 1 d'acétate. Cette quatrième souche (03), de

morphologie différente des précédentes, a été obtenue sur ce milieu incubé à 55°C.

2.3. ETUDE DES SSR ISOLEES EN CULTURE PURE

2.3.1.ETUDE DE LA SOUCHE A

MorpholoQie des colonies; Elles apparaissent après 4 à 5 jours sur milieu gélosé incubé à

37°C et sont punctiformes et de couleur ncire. Après 8-10 jours, elles mesurent environ 1/2 mm de

diamètre. Elles sont rondes, à bords irréguliers et de couleur marron foncé.

MorpholoQje des cellules: Les cellules en phase exponentielle de croissance ont une
forme de vi brio et font 2,5 à 3 )..lm de long sur 0,5 )..lm de large (Photo 1). Elles sont mobiles et un
flagelle polaire a pu être observé en microscopie électronique à balayage (Photo 2). Leurs
 Photo 1 : Forme vibrioïde des cellules de la Photo 2 : Flagelle polaire de la souche A
souche A (Contraste de phase) Microscopie à transmission)

,
\ 1
<

10 lJrn , ,
Photo 3 : Cellules de la souche 0,- Sporulation Photo 4 : Cellules de la souche 02 - Sporulation
(Contraste de phase) (Contraste de phase)
 E Q,3 12
c
,... ...
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-...
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2

20 30
température CC)
FiQure 10 = Influence de la température sur la croissance
de la souche A et la produC1îon de sulfure

E
c ...
G)

,...a:l
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1 0,2 8
-0
E
E

6 l
0,1 4

6 7 8 9
pH
Figure 11 = pH optimal de croissance de la souche A à 37°C.
 35

mouvements cellulaires très rapides leur donnent une apparence de batônnets lors de leurs
déplacements. Les cellules se lysent très rapidement lorsqu'elles sont en phase stationnaire de
croissance. Elles réagissent négativement à la coloration de Gram.

Etude physioloQiQue

* Température de croissance: L'influence de la température sur la croissance et la

production d'H28 a été étudiée (Fig. 10). La température optimale de croissance de la souche est

37-38°C à pH 7,5. La température minimale est un peu inférieure à 20°C et la température maximale
n'excède pas 43°C. C'est une espèce mésophile.

* pH de croissance : A 37°C une croissance est observée entre pH 6,3 et 8,2.

Cependant, la croissance de la bactérie et la synthèse d'H28 sont optimales à environ pH 7,7-7,8

(Fig. 11).
* Comportement vis-à-vis de la salinité : La souche se développe à des concentratir:ms
en l'laCI comprises entre 1 et 50 gll.

Etude nutrionnelle

* Donneurs d'électrons: la souche A dégrade les substrats classiques des B8R, dont
l'utilisation a été décrite dans la littérature (P08GATE, 1959) : lactate, malate, éthanol (Tab. 3). Les
substrats plus originaux comme les acides gras ont été testés car deux espèces de Desulfovibrio
capables de les dégrader ont été nouvellement décrites (WIDDEL, 1980: WIDDEL et PFENNIG,
1981). Cependant la souche A est incapable de les utiliser. Cette souche utilise l'H2 et le formiate

comme donneurs d'électrons mais seulement lorsque le milieu est supplémenté avec de l'acétate
qui sert exclusivement de source de carbone.

* Accepteurs d'électrons: La souche utilise le 8°4 2-, le 8°3 2- et le soufre élémentaire

comme accepteurs terminaux d'électrons.

2.3.2. ETUDE DE LA SOUCHE 0 1

MorpholoÇlie des colonies: Elles sont rondes et de couleur noire.

MorpholoÇlie des cellules: Elles ont une forme de batonnets, assez longs (4,5 llm x 1 llm),
faiblement mobiles et sporulés (Photo 3). Les cellules forment des spores en phase stationnaire de
croissance et se renflent progressivement en fonction du stade de sporulation (1,5 llm de
large).Elles sont Gram-négatif.
 Tableau 4 = Composés utilisés par la souche D1

SUBSTRATS UTILISES SUBSTRATS TESTES ET

NON UTILISES

Substrats H2-C02 (20-80 %) excès (1) Acétate (10 mM)

donneurs H2-C02 (20-80 %) propionate (20 mM)
d'électrons Formiate (20 mM) (1) butyrate (5 mM)
Benzoate (5 mM)
(a) Lactate (20 mM)
Ethanol (20 mM) Fructose (20 mM)
Méthanol (20 mM)

Substrats Soufre élémentaire

Accepteurs Sulfate (10 mM)
C02 (en excès)
d'électrons Sulfite (10 mM) Fumarate (20 mM)
(b) Nitrate (10 mM)

(a) : Les substrats donneurs d'électrons ont été testés dans un milieu
contenant du sulfate en excès
(b) : Les différents accepteurs d'électrons ont été testés dans un
milieu contenant 20 mmole /1 de lactate utilisé comme source de
carbone et d'énergie.
(1) : Présence d'une mmol / 1 d'acétate servant exclusivement de source
de carbone.
 36

Etude ohysiologiQue:

'Température de croissance: En testant différentes températures. nous avons pu

établir que l'optimun de température de la souche se situe entre 51 et 53 oC à pH 7,5 (fig. 12). A
55°C, on observe encore un développement alors qu'à 58 c e la souche ne pousse plus. La
température minimale de croissance est légèrement au dessous de 37°C. Cette bactérie peut être
considerée comme une espèce thermophile modérée.

•pH de croissance: Le pH optimum de la croissance, testé à 52°e, est d'environ 8 (fig.

13). Relativement basique, il s'explique par une sensibilité de la souche aux concentrations élevées
en H 2 S. Il existe un équilibre entre les ions S2-, HS- et l'H2S en fonction du pH. A pH basique

l'équilibre est déplacé vers la formation des ions S2- et HS-, non toxiques pour la bactérie. Les pH
minimum et maximum sont respectivement de 6,4 et 8,9.

•Comportement vis-à-vis de la salinité: La croissance de la souche a été observée

dans une gamme de concentration en NaCI allant de 1 à 50 g! 1.

Etude nutritionnelle:

• Donneurs d'électrons: Parmi les composés organiques testés, la souche utilise un

spectre assez limité de substrats (Tab. 4). Aucune croissance n'a été observée sur acides gras à
courte chaîne (acétate, propionate et butyrate) et sur acide aromatique (benzoate). La souche se
développe sur H2-eo2 et sulfate comme seule source d'énergie et de carbone, en absence ou en

présence d'acétate.

•Accepteurs d'électrons: Parmi les différents accepteurs testés, seul le sulfate et le

sulfite sont utilisés par la souche 01.

2.2.3. ETUDE DE LA SOUCHE 02

MorpholoÇlie des colonies: Les colonies sont de forme lenticulaire et de couleur noire.

Morph%Çlie des cellules: Les cellules mesurent 2,8-3,8 ~m de long et 1,1 flm de large
(photo 4). Ce sont des batônnets, faiblement mobiles, qui forment des spores et qui sont Gram-
négatif. En phase stationnaire de croissance, les formes sporulées sont nombreuses et leur largeur
est environ le double des cellules en phase exponentielle de croissance (2,2 ~m).
 Tableau 5 - Comparaison des caradéristiques physiologiques et nutritionnelles
des souches 02 et 03 avec celles des espèces de Desulfotomaculum
déjà répertoriées

SUBSTRATS m'!!.QJ!lQ: orJentis O. rumin/s O. nigri/lcans TEP TWC ~ D. acetoxidans _FD-=-. ----=--::I:....::....:.=:..:..:..::=.:c'-=--f-----==-=:..:.=~~:::.=~:.:::.-~I
t! 2- c °
L(~~~~~ L_~l L - _ + + + + + . __~ - .__--=--=-=--_
H2-C02 __ ~~cè.?L-~__~_ _ f-_ _ - . - 1-----=-__'-__-= t_!T -'-- _
fORMAI~~~L~~ + + + + + __ ~ .j--------

~CETAI~_(!QL -=___ _ _ .":- 1±.L_L-_(_~L_ ----:f:...----t----

E.!!O PJQN_ATE-.JlQl - = + __... - - -_ _ . --+-- -+-_---"-_ _ 1
8 UIY_R AT Lj§l____ _ --=- - ----f--- + + !.--- ----------'+----t----~---+_--------I---~-_1
ç~jJJ!Q~.lL(~ ~T NT NT + + +
tt~~!_~_t_!Q~I~.l~l_.__ NT -.-!'!T NT N~__ NT N_T + j -_ _- ' -_ _ -+
Qf.T~~Q~TE _(~1 ln .J!T__ NT .__t!:L t!! !'!I__ -----------t-------'-------t---'-=-'----if----"----I
DECAt-!Q~I~_jlL
__. tfr !'!.~_ NT _JfL_----.!:!l JiI__ . 1_ _
P.f~A!:!QONA T~ _HL_ _ NT !'!T__ NT _!!T_ ~ L !'!I 1-- --'--_ _- + _ - - ' ' - -_ _1 - - _ - ' -_ _1

EAlM!lATLU1 t_!! NT NT + _L±L :!. - +-__

~I~_JlliAIE (!L NT NT NT + J.±) -~---------f_----'-----j
.êfl!ZO~l~..J§J ~__ _~ - C- _ _- + -----' --+- 1-

~~Ç_IATE _1 20 L + _._ + + _ + + .-=--_ ------------i---------

METH ANOl _1~ !.____ _ _ ü.l : . - :. . : . . :. ._ _--1- 1- 1

ETtiANO!::.-.i201 :f:...___ + + ---+_ ---+-----±--- -------+.:._----t-----'------+----=------+

f.fWCTO~~__(20L ..: -= -±_. -_ _. - - - - - - - - - - - - - - - + - - - - - - - t - - - - ' - - - - - t
fRUCTO~_L~a__'_~__ S04. !LT ---.!iL ..!... !:J.L NT -----.!'!J .J'!l_ _ I -_ _
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GC ..!nolQ._% 4..L.?. liJ~ __ ___.!.1~_~_L§. L. _ _ tn ...!!!....__JtT ...l.?_2 -'-= _

références a a a b b b a

{+) : Production cfH2S sans croissance

a) : Bargey's Manual of Systematic Baeteriology, 1986
b) : KLEMPS 01 a/., 1985 + : Croissance et production d'H2S
:c) : CORD-RUWISH et GARCIA, 1985 NT : non testé
:d) : Présence cfune rnrnol / 1d'acétate servant exclusivement de source da carbone
~e) : Les substrats donneurs d'électrons ont été testés dans un milieu contenant du
su\1a\e en excès
 :I: 20

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température (c)
Figure 16 = Influence de la températuresur le temps de
génération de la souche 03

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1
6 7 8 9
pH
Figure 17 - Influence du pH sur le temps de génération
de la souche 03
 37

Etude physioioQique :

• Température de croissance: Un développement a été observé entre 45 et 57 cC mais

la température optimale de croissance de la souche 02 se situe aux environs de 52-53 oC (Fig. 14).

C'est une bactérie thermophile car aucune croissance n'a été obtenue en dessous de 40 oC.

• pH de croissance : La souche 02 se développe dans une gamme de pH comprise

entre 6 et 8, son optimum de pH étant voisin de 7 (Fig. 15).

• Comportement vis-à-vis de la salinite : Aux différentes concentrations en NaCI

testées, la souche pousse de 1 à 50 g / 1.

Etude nutritionnelle;

• Oonneurs d'électrons: Hormis les composés traditionnels, cette souche utilise les
substrats nouvellement testés par PFENNIG et WIOOEL (1981), tels que le butyrate, le ;Jropionate et
certains acides gras à plus longue chaîne comme le palmitate et le pélargonate (Tab. 5). Cependant,
aucune croissance sur acétate n'a été observée, comme dans le cas des souches étudiées par
KLEMPS et al. (1985).Elle n'utilise pas les acides aromatiques. La souche se développe sur fructose
en absence et en présence de sulfate. Comme la souche précédente, celle-ci affict18 un
métabolisme autotrophe strict.

• Accepteurs d'électrons: La souche n'utilise que le sulfate et le sulfite parmi les

accepteurs terminaux d'électrons testés (Tab. 6).

2.2.4. ETUDE DE LA SOUCHE 03

MorpholoQie des colonies: Elles sont de forme lenticulaire et de couleur noire.

MoroholoQie des cellules: Les cellules sont des batônnets (2,6 !lm X 0,5 llm), mobiles.
Une flagellation péritriche (2 à 3 flagelles) a pu être observée en microscopie électronique à
transmission (photo 6). Dans le cytoplasme, on observe en contraste de phase, une spore et une
autre structure très réfringente (Photo 5). La spore est légèrement décentrée à cause de la présence
de cette structure qui a pu être identifiée comme étant une vacuole de gaz car elle disparait des
cellules après une centrifugation de 5 mn. En microscopie à balayage, on observe la forme en citron
que prennent les cellules par suite de la présence de ces deux éléments. Les cellules sont
légèrement plus courtes et surtout plus larges pendant la sporuiation (1,2 llm) (photo 6 et 7). ,A.près
une pasteurisation (10 mn à SO°C)les spores redonnent des cellules identiques à celles initialement
présentes dans le milieu de culture. La souche, après coloration spécifique, est Gram-négatif.
 i
..
o'

10 ~m

Photo 5 : Spore et Vacuole de gaz dans les cellules de la souche D3

(Contraste de phase)

. .
;
'

..
1 fJ m .

Photo 6 : Disposition des vacuoles et présence de plusieurs flagelles·

Soucl1e D3 (Microscopie en transmission)

Photos 7 et 8 : Forme en "citron" des cellules de la souche D3

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LU
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LU
1-

10 20 30 40
NaCI (g/I)

Figure 18 - Influence de 13 concentration en NaCI sur le

temps de génération de la souche 03
 Acétate théorique sulfure théorique Sulfure Bilan
Butyrate Acétate Acétate Sulfure électronique
dans le cas d'une dans le cas d'une en trop
dégradé produit en moins produit oxydation incomplète
oxydation incomplète

4,5 5,5 9 3,5 4,5 2,25 2,25 89 %

1,35 99,2%
6,5 11,5 13 1,5 4,6 3,25

1,8 88 0/0
10 15,2 20 4,8 6,8 5

TABLEAU 7 :

Dégradation du butyrate par la souche 03

Les valeurs sont exprimées en mmol / 1.
 38
présentes dans le milieu de culture. La souche, après coloration spécifique, est Gram-négatif.

Composition en bases de l'ADN: La valeur du G + C % de l'ADN de la souche D3 est de

50,4 mol %.

Etude physioloÇ1ique :

* Température de croissance: La température optimale de la souche D3 est d'environ

54°C (fig. 16). Elle est thermophile modérée, aucune croissance n'ayant été observée à 58°C et au
dessous de 35°C.

* pH de croissance: La croissance de la souche à 52°C est optimale à pH 7,2 (fig. 17).

Elle se développe entre pH 6 et 8.

* Comportement vis-à-vis de la salinité: La gamme de concentration en NaCI :estée

jusqu'à 100 g / l, a donné une croissance de 1 à 50 g /1 avec un optimun situé entre 24 et 28 9 / l, sei!
à une teneur totale en sels comprise entre 30 et 34 g /1 (fig. 18).

Etude nutritionnelle:

* Donneurs d'électrons: Comme la souche D2. cette bactérie a la particularité d'utiliser

un très grand nombre d'acides gras à courte et longue chaîne mais elle ne dégrade pas l'acétate (Tab.
5). L'analyse des produits du métabolisme, après croissance sur butyrate, est présentée dans le
tableau 7. Elle est également capable d'utiliser l'énergie fournie par l'oxydation de l'hydrogène pour

assimiler le C02 comme seule source de carbone.

* Accepteurs d'électrons: Elle utilise le S04 2 - et S03 2 - comme accepteurs terminaux

d'électrons mais pas le soufre élémentaire, le fumarate et le N03- (Tab. 6).

3. DISCUSSION
3.1. POSITION TAXONOMIQUE DES SOUCHES ISOLEES DU
FLUIDE GEOTHERMAL DE CREIL

Les quatres souches isolées du puits de Creil ont été identifiées ou jugées comme des
espèces nouvelles sur la base de leurs propriétés morphologiques, physiologiques et
nutritionnelles, par référence au Bergey's Manual (WIDOEL et PFENNIG, 1984), au tome 2 de "The
Prokaryotes" (PFENNIG et al., 1981) et à différentes publications de taxonomie (WIODEL et
PFENNIG, 1977; KLEMPS et al., 1985; CORO-RUWISCH et GARCIA, 1985).
 39

Les caractéristiques morphologiques de la souche A, vibrioïde Gram-négatif, mobile et

non sporulée ainsi que son caractère mésophile et sa capacité à utiliser le lactate et l'éthanol orientent
la classification de cette souche dans le genre Oesulfovibrio (PFENING et al., 1981). L'oxydation de

l'H2 n'est pas un caractère penmettant une identification complète de cette souche car c'est le propre

de plusieurs espèces de Oesulfovibrio : O.desulfuricans (SOROKIN, 1966 a,b), O.thermophilus

(ROZANOVA et KHUOYAKOVA, 1974) et O.vulgaris (BADZIONG, THAUER et ZEIKUS, 1978). Par
contre, le test de dégradation du malate permet d'identifier la souche à l'espèce O.desulfuricans
(PFENNIG etai., 1981).

La présence ou l'absence de spores est un critère important au niveau de la taxonomie

des BSR. Comme nous l'avons déjà indiqué dans l'exposé bibliographique, les BSR caractérisées
par la formation de spores sont regroupées dans le genre Oesulfotomaculum (CArv1PBELL et
POSTGATE, 1965) et cette démarche a été conservée dans la nouvelle classification adoptée par le
Bergey's Manual (WI DOEL et PFENN IG, 1984; CAMPBELL et RIVERS, 1986) après les nombreux
bouleversements dus à la découverte d'espèces et genres nouveaux (PFENNIG et BIEBL, 1976;
WIDDEL et PFENNIG, 1977; WIDDEL, 1980; WIDDEL et PFENNIG, 1981) . Par sa capacité de

sporulation, la souche 01 se rattache donc à ce genre, à l'intérieur duquel elle peut être identifiée à

O. nigrificans seule espèce thermophile de ce genre décrite jusqu'à maintenant. D'un point de vue
nutritionnel, ces deux souches sont également identiques bien que contrairement à O.nigrificans , la

souche 01 soit capable d'utiliser le méthanol.

L'utilisation de l'H2 comme donneur d'électrons pour la réduction des sulfates en

l'absence totale de matière organique est surprenante en raison de l''apparente incapacité, observée

depuis longtemps, des espèces de Oesulfotomaculum à se développer sur H2' Ce n'est que

récemment que cette propriété a été démontrée avec des souches déjà répertoriées et
nouvellement isolées appartenant à ce genre (KLEMPS et al.,1985).

Bien que la souche O. nigrificans étudiée par KLEMPS et al. (1985) soit incapable d'un
mode de croissance autotrophe stricte, nous ne proposons pas la définition d'une nouvelle espèce

pour la souche 01 en raison de la grande similarité existant par ailleurs entre ces deux souches.

La formation de spores par la souche 02 est encore un critère morphologique essentiel

pour l'identificâtion des BSR qui nous autorise à la rattacher au genre Oesulfotomaculum. Le tableau
5 résume les caractéristiques principales de plusieurs espèces du genre Oesulfotomaculum et

permet de les comparer à celles de la souche 02' L'analyse de ce tableau souligne deux

observations importantes:
- Une seule espèce thermophile a été décrite jusqu'à maintenant dans ce genre. Il s'agit de
O.nigrificans qui n'utilise pas les acides gras.
- Toutes les espèces capables de dégrader les acides gras sont mésophiles.
 40

On constate alors que la souche 02 de par son caractère thermophile et sa capacité à se

développer sur acides gras ne se rattache à aucune des espèces précédemment décrites.

La croissance sur fructose de cette souche ainsi que de la souche 03, permet d'expliquer

le trouble bactérien obtenu dans les tests de pureté effectués à 55°C en l'absence de sulfate, ceux à
37°C étant complètement négatifs. Les tests à 55°C ne contenaient pas de fructose mais seulement
du glucose sur lequel les deux souches sont incapables de se développer. En fait, une partie du
glucose dans les solutions autoclavées se décompose en fructose sous l'effet de la chaleur. La
croissance sur glucose de O.nigrificans décrite par CAMPBELL et al. (1957) et AKAGI et JACKSON
(19ô7) n'a été observée par KLEMPS et al. (1985) qu'à partir de solutions de glucose autoclavées et
non avec des solutions stérilisées par filtration, indiquant effectivement l'isomérisation partielle à la
chaleur du glucose en fructose.

La souche 03 par sa faculté à sporuler appartient au genre Oesulfotomaculum. Nous

avons reporté sur le tableau 5 ses principales caractéristiques de façon à pouvoir également les
comparer à celles des espèces déjà existantes et à la souche 02' Cette étude comparative faite en

suivant la même démarche que celle adoptée pour la souche 02, nous montre que !a souche étudiée

ne peut être assimilée à aucune des espèces du genre Oesulfotomaculum déjà décrites.
Morphologiquement (formation de vacuoles et sporulation), elle se différencie aussi de la souche 02-

Cependant la définition de deux nouvelles espèces apparaît injustifiée en raison des caractéristiques

physiologiques et nutritionnelles similaires de 02 et 03' Par conséquent, seule la souche 03 a été

étudiée de manière plus approfondie (GC %, pigments, tests de l'utilisation de nombreux acides gras,
suivi de la croissance sur butyrate et analyse des produits du métabolisme).
La souche 03 semble théoriquement faire une oxydation complète du butyrate.

Cependant, nous avons vu qu'elle est incapable de dégrader l'acétate seul et qu'à partir du butyrate il
y a excrétion de quantités variables d'acétate dont les valeurs sont très proches sans être identiques
de celles que l'on aurait obtenues dans le cas d'une oxydation complète. On peut en déduire que le
butyrate se dégrade plus vite que l'acétate et que les souches meurent avant d'avoir totalement
oxydé l'acétate. Cette hypothèse a déjà été envisagée à propos de la dégradation de l'éthanol
(IMHOFF-STUCKLE et PFENNIG, 1983). Etant donné que l'acétate seul n'est pas dégradé, il existe
peut-être une co-oxydation obligatoire de l'acétate et du butyrate.
Les résultats nous permettent de classer 03 dans le groupe des BSR réalisant une

oxydation complète de leurs substrats. L'originalité de cette souche réside dans son caractère
thermophile et sa capacité à utiliser l'hydrogène comme donneur d'électrons pour la réduction des
sulfates dans des conditions d'autotrophie stricte. Il nous a paru nécessaire de créer une nouvelle
espèce que nous avons appelée Oesulfotomaculum geothermicum et qui a été déposée dans une
collection européenne de souches: Oeutsche Sammlung von Mikroorganismen (OSM), Gëttingen,
F.R.G., sous le numéro 3669. Elle a fait l'objet d'une publication (OAUMAS et al . ,1987, soumise à
Antonie V. Leeuwenhoek, J. Microbiol.).
 41

3. 2. PARTICIPATION POSSIBLE DES SSR DANS LES

DEGRADATIONS OBSERVEES SUR L'OUVRAGE
GEOTHERMIQUE DE CREIL

L'hypothèse de l'intervention des BSR dans la corrosion des métaux a été fréquemment
avancée dans de nombreux cas concrets de corrosion (BUTLIN et al., 1949 b; KOBRIN, 1976;
TUTTLE et KANE, 1981; TATNALL, 1981 a; STOECKER, 1984). Elle puise l'un de ses arguments
dans la mise en évidence presque systématique de ce groupe bactérien au niveau des ouvrages
endommagés, ces derniers présentant généralement, une morphologie de corrosion en piqûre.
Cette corrosion localisée, beaucoup plus sournoise qu'une corrosion uniforme car elle conduit très
rapidement à des periorations pouvant entrainer ['arrêt des installations, a généralement été attribuée
aux BSR (KOBRIN, 1976; CROMBIE et al., 1980; TATI\JALL, 1981 b; GOYENECHE et LONGIN,
1981; TILLER, 1983; HAMILTON, 1985).

Des phénomènes de corrosion importants (Photos 9, 10, 11), ont entraîné à deux
reprises, sur une période de fonctionnement de 8 ans, le changement de la pompe et d'une partie
des canalisations du puits de production de la centrale géothermique de Creil.
Le facies d'attaque observé présente une forme générale de cratères ou de piqûres
pouvant aller jusqu'à la perforation du métal (photo 10 ). Notre étude a permis de mettre en évidence
la présence de BSR dans ce puits. L'ensemble des conditions précédentes sont réunies pour
conclure à une corrosion d'origine biologique. Cependant la présence de BSR au niveau des lésions
n'implique pas forcément qu'elles en sont activement responsables. Une analyse de nos résultats
permet de préciser les possiblités de développement de ces bactéries dans les conditions qui
règnent lo....s.i!.!..1, possibilités dont découlent leur participation active dans les processus de corrosion.

3.2.1. PRESENCE DE SSR DANS LE PUITS DE

PRODUCTION DE CREIL

Les résultats des numérations révèlent l'existence de BSR aussi bien dans l'eau du circuit
que dans les dépôts de corrosion prélevés dans le conduit de production de Creil.Bien que la
présence concomitante de ces bactéries et des phénomènes de corrosion suggère leur participation
dans ce processus, il est quand même risqué de conclure si rapidement. En effet, leur effectif n'est
pas en rapport avec l'ampleur des dégats observés. Cependant les résultats ne sont peut-être pas
représentatifs de la population réelle pour plusieurs raisons:
 'l~1r~~~~!iici~~~~~~lpa rt je
superieure
de la
colonne de
production

~~~+~:;..:..:.~~per for.at ions

9,10,11 : ASPECT DES CANALISATIONS

perforat ion s

. -.:.
APRES LEUR SORTIE DU PUITS GEOTHERMIQUE DE CREIL

aspect de
la partie
:.:.-""11:;. cou r an t e
de la
colonne
 42
* Dans l'eau du réseau

- Les faibles concentrations bactériennes détectées dans l'eau du sondage peuvent

traduire une adsorption des cellules sur les parois des canalisations. Effectivement, les propriétés
d'adhésion des bactéries sont bien connues depuis les travaux de nombreux auteurs (ZOBELL et
ALLEN, 1933; MARSHALL et al., 1971; CORPE, 1973; CUNDELL et MITCHELL, 1977; FLETCHER
et LOEB, 1979; KIELLEBERG et al., 1982; MAC COY et COSTERTON, 1982; FLOODGATE, 1982;
GUEZENNEC, 1986) et le concept selon lequel dans les environnements aquatiques elles sont liées
aux surfaces sous forme de biofilm plutôt que libres dans la phase aqueuse est maintenant largement
admis.
Par exemple, une surface immergée d'un cm 2 peut fixer jusqu'à 10 6 bactéries alors qu'un
cm 3 d'eau, en regard de cette surface, n'en contient que 10 3 (COSTERTON et al., 1978). Dans les
sédiments, selon VIAN NA DORIA et BIANCHI (1982), 95 % des cellules bactériennes sont liées aux
particules et seulement 5 % sont libres dans la phase acqueuse intersticielle. Un constat semblable
est fait par IVANOV (1961) et LJ (1975) concernant les bactéries de sources profondes similaires à
l'aquifère de Creil.

Par conséquent, les effectifs mis en évidence dans l'eau géothermale pou rraient
correspondre à une faible fraction de la communauté fixée se détachant soit spontanément soit sous
l'influence de la vitesse de circulation de l'eau ( 0,6 à 3 m / s en fonction des conditions d'exploitation)
et véhiculée par le fluide' géothermal jusqu'à la surface. D'après COSTERTON et al. (1978), cette vie
sédentaire est très favorable à la prolifération des bactéries grâce à un apport et un renouvellement
continuel "d'aliments" par l'eau courante.

La vitesse de circulation du fluide dans la conduite peut devenir un facteur limitant pour
l'adhésion des bactéries et la formation de biofilm (DUDDRIGE et PRITCHARD, 1983; GUEZENNEC,
1986). Cependant lorsque le puits fonctionne en production artésienne (période de 6 mois),
l'intérieur du conduit dans lequel est suspendue la pompe se trouve envahi par une eau géothermale
stagnante favorable à la colonisation bactérienne des surfaces. C'est d'ailleurs au niveau de ces
canalisations qu'ont été observées les perforations les plus rapides (GOYENECHE, 1981). Les
possibilités de dégradation des métaux sous ce biofilm ont été décrites par plusieurs auteurs
(ZOBELL, 1943; COSTERTON et GEESEY, 1979 b, OBUEKWE et al., 1981).

- La détection d'un nombre restreint de bactéries thermophiles dans l'eau du réseau peut
également s'expliquer par l'emploi d'une méthodologie différente à l'occasion de ce prélèvement. En
effet, le milieu de culture utilisé, en comparaison de celui employé lors du premier dénombrement,
était pauvre en matière organique et ne contenait qu'une source de carbone et d'énergie (lactate ou
acétate). Or l'étude taxonomique des souches thermophiles isolées du puits de Creil a montré
 43

qu'elles s'apparentaient toutes au genre Oesu/fotomacu/um (sporulation). Les études relatives à ce

genre de BSR soulignent toutes l'utilisation de milieux de croissance complexes riches en composés
organiques tel que extrait de levure, peptone, cystéine, thioglycolate et ascorbate. KLEMPS et al.
(1985) signalent que les Oesu/fotomacu/um se développent mal sur des milieux pauvres de
composition identique à celui employé dans la deuxième technique de numération décrite dans ce
travail. L'appréciation du nombre de ces bactéries est probablement faussée car certaines d'entre
elles n'ont peut-être pas trouvé dans les tubes de culture toutes les circonstances idéales favorisant
leur développement. Nous avons remarqué lors de l'étude nutritionnelle que la croissance de ce type
de bactéries n'était pas systématique sur le milieu non supplémenté en extrait de levure.

• Dans les dépôts de corrosion

- Le nombre de BSR, dans les dépôts de corrosion, est certainement sous-estimé en

raison des graves pertubations intervenues sur le puits antérieurement à leur prélèvement (1 mois).
Bien que le taux de BSR dans ces dépôts corresponde à ceux rencontrés dans d'autres enquêtes
de corrosion biologique, à savoir entre 20 et 3.10 3 bactéries 1 g (LECLERC, 1975; CROMBIE et a/.,
1980), les conditions instaurées à l'occasion du remplacement de la pompe (baisse de température,
chute de pression, injection de saumures) ont pu être léthales pour certaines d'entre elles. La
prédominance d'espèces thermophiles dans cet échantillon, possédant des formes de résistance
comme l'a révélé l'étude morphologique, renforce nos soupçons. En effet, les spores permettent
aux bactéries de se maintenir à l'état latent lorsque les conditions environnantes deviennent hostiles
à leur croissance. La subsistance, après ce traumatisme, de quelques mésophiles non dotées de ces
formes de résistance, n'est pas non plus surprenante. La tolérance des BSR aux variations brutales
et importantes de leurs conditions de milieux a été signalée par ZOBELL (1958). Par ailleurs la nature
particulaire de ces dépôts est propice à l'existence de microniches stables favorables à la survie des
bactéries non sporulantes .
Les effectifs, en particulier les BSR thermophiles, sont plus importants dans les dépôts
que dans l'eau, ce qui conforte la thèse de la colonisation bactérienne des surfaces.

3.2.2. ACTIVITE ET ADAPTATION DES SOUCHES AU

BIOTOPE GEOTHERMAL DE CREIL

La présence de BSR dans un biotope défini n'implique pas forcément qu'elles soient
actives dans les conditions lrL.s.i1JJ. de leur habitat. En ce qui concerne le site géothermique de Creil,
leur participation active aux phénomènes de corrosion n'est pas parfaitement établie. Toutefois
plusieurs observations apportées par l'analyse physico-chimique de l'eau géothermale et l'étude
physiologique et nutritionnelle des souches militent en faveur de leur intervention:
a- Présence d'éléments nutritionnels et de conditions physico-chimiques requises pour le
développement des BSR (anoxie, pH, sulfates, source d'azote, matière organique).
b- Adaptation des souches isolées à leur environnement (température, salinité).
 44
Nous rappelons que la composition de l'eau géothermale est donnée dans le chapitre
"matériel et méthodes". Nous n'avons pas intégré ces résultats aux notres bien qu'ils aient été
enregistrés parallèlement à notre étude bactériologique. Cependant il est nécessaire de les utiliser
dans notre discussion car ils apportent des renseignements intéressants quant aux possibilités de
prolifération des BSR dans le site étudié. Nous faisons également référence à des rapports internes
au B.R.G.M. ou à l'I.M.R.G. concernant le puits géothermique de Creil.

3.2.2.1. Présence d'éléments nutrttionnels et de condITions

physico-chimique requises pour le développements
de ces bactéries:

• Dans ces eaux fossiles non renouvelées comme a tendance à le montrer le maintien
d'une salinité importante (28 g / 1) et d'une température élevée (56 OC), la concentration en oxygène
dissous est égale à 0,048 ppm. Ces traces d'oxygène décelées lors des analyses, qui peuvent
néanmoins être préjudiciables à la croissance des BSR, ont été attribuées à une contamination des
échantillons lors des prélèvements (GOYENECHE. 1981). Cette anoxie est tout à fait favorable au
développement des BSR dont le métabolisme respiratoire est anaérobie strict.

Le potentiel rédox de l'eau géothermale n'a pas été déterminé mais celui requis par les
BSR se situe, en plus de l'abscence d'oxygène, en dessous de - 100 mv / E.N.H. (LEGALL et
POSTGATE, 1973; WIDDEL et PFENNIG. 1977). Si l'on s'en réfère au processus de colonisation des
suriaces par les bactéries, on conçoit aisément que les BSR puissent trouver sous les dépôts de
corrosion des micro-environnements leur assurant un potentiel d'oxydo-réduction satisfaisant. Ces
conditions d'anaérobiose peuvent également être réalisées par l'adhésion préalable de bactéries
aérobiesou anaérobies facultatives (COSTERTON et LASHEN, 1983). Sous ce biofilm qui limite la
pénétration de l'oxygène, l'environnement est propice au développement des anaérobies telles que
les BSA. Il a été postulé par DOCKINS et al. (1980) que les BSA sont plus actives dans un état
adsorbé au niveau de ces microzones, probablement parce qu'elles y trouvent les conditions
adéquates à leur croissance.

• Nous avons évoqué lors de l'étude physiologique des souches, l'importance du pH sur la
croissance des BSA. Cette notion réduit le champ d'activité des bactéries car de manière générale
elles se développent dans une fourchette allant de pH 6 à pH 8 avec un optimum proche de la
neutralité. Cependant ce dernier correspond au pH du fluide géothermal. Ce paramètre est donc
compatible avec une croissance bactérienne.

• L'eau du réservoir desservant le puits de production de Creil contient des sulfates (en
moyenne 740 mg / 1). Cet ion constitue l'élément clé du métabolisme des BSR puisqu'elles l'utilisent
comme accepteur terminal d'électrons dans l'oxydation anaérobie de leurs substrats. Dans les
 DONNEURS D'ELECTRONS

LES PLUS REPAN DU S

DANS LA NATURE

. / ) ACET:TE I~~~~
./ /'-
./ . \, absence ./ .........................
faible effectif ./ ", /" ....... SS R accélération
dans le--",r, i eu .~
Hase+-----.. des processus
bacteries
fermentatives de c.orrosion

surf a ces cathodiques

des canalisations en cours
de corrosion

Figure 19 = Possibilité d'une dépolarisation cathodique par les

B8R dans le puits de Creil
 45
écosystèmes naturels exempts d'oxygène, en plus de la carence en matière organique, la limitation
de l'activité des 8SR peut s'expliquer par une faible concentration en sulfate. Dans ce cas, il peut y
avoir développement simultané de bactéries méthanogènes comme semble l'indiquer la présence
de méthane dans le puits de Creil (59 ppm). Ces deux populations microbiennes peuvent alors être
en compétition pour les mêmes substrats donneurs d'électrons (acétate et hydrogène). Cependant,
outre le fait que la réduction des sulfates est thermodynamique ment plus favorable que la réduction
du gaz carbonique en méthane (CLAYPOL and KAPLAN, 1974), il a été démontré, dans les
biotopes où le sulfate n'est pas limitant comme c'est le cas à Creil, que la réduction de ces derniers
est le processus dominant au détriment de la méthanogénèse (WINFREY et ZEIKUS, 1977; ABRAM
et NEDWELL, 1978 a,b; WIN FREY et WARD, 1983). En plus de l'existence de cet ion en
concentration non limitante, la présence de sulfures en quantité importante au niveau des dépôts de
corrosion (23 %) et dans le fluide géothermal (60 ppm) est également le signe d'une activité
sulfato-réductrice dans le puits, bien qu'il soit difficile de savoir s'il s'agit d'une activité récente et fou

antérieure au forage (FOUILLAC et CRIAUD, communication personnelle).

La présence de FeS dans les dépôts de corrosion permet d'envisager la participation des
BSR dans les phénomènes de corrosion, l'action corrosive de ce dernier ayant été postulée par
plusieurs auteurs (KING et WAKERLEY, 1973; KING et al., 1973 a, b; SMITH et MILLER, 1975).

* La disponibilité en substrats organiques est probablement le facteur le plus limitant de

l'activité des BSR dans ce milieu profond dépourvu de production photosynthétique. Dans les
écosystèmes riches en sulfates, les BSR fonctionnent généralement en tant que dernier maillon de
la chaine de dégradation de la matière organique, utilisant ainsi les produits de fermentation des
espèces auquelles elles succèdent (bactéries fermentatives). Cependant ces bactéries
fermentatives sont peu nombreuses dans des aquifères géothermiques similaires à celui étudié ici
(DAUMAS etai., 1985).

Par ailleurs, les BSR isolées du puits de Creil utilisent l'hydrogène en particulier les
espèces thermophiles qui sont capables de l'oxyder en l'absence totale de carbone organique. Dans
ce même ordre d'idée, il est également intéressant de constater qu'aucune BSR ne s'est
développée sur acétate (la méthodologie qui consiste à séparer les substrats dans les tubes de
culture permet d'avoir une idée de ceux qui sont présents et utilisés dans le puits). Ce résultat est
surprenant car l'acétate ainsi que l'hydrogène sont les donneurs d'électrons les plus répandus dans
la nature pour la sulfato-réduction (BALSA et NEDWELL. 1982; WINFREY et WARD, 1983). Cette
absence de croissance sur acétate et, par la suite l'incapacité des souches à utiliser ce substrat in
ïi1.!:Q.. sous-entend une carence en cet élément (Fig. 19) et conforte la thèse de l'inhibition de la
production de matière organique dans le fluide géothermal, par voie fermentative, les principaux
métabolites de ce processus étant l'acétate et l'hydrogène. D'autre part l'affinité pour l'H2 affichée par
 46
les souches lors de l'étude nutritionnelle laisse entrevoir que ce dernier serait l'un des principaux
donneurs d'électrons dans l'écosystème étudié. Si l'H2 n'est pas synthétisé par le biais des

fermentations il peut avoir pour origine sa production au niveau des zones cathodiques des
canalisations en fer corrodées (ZOB ELL, 1958). L'utilisation de cet H 2 permet alors d'envisager

l'accélération des processus de corrosion par le mécanisme de la dépolarisation cathodique (VON

WOLZOGEN KHUR et VAN DER VLUGHT, 1934). La capacité des BSR à se développer à des
pressions partielles d'H2 très basses (ZOBELL, 1958) est également en faveur de cette hypothèse.

Le fluide exploité à Creil contient du C02 sous forme dissoute (18,3 ppm) pouvant servir de source

de carbone dans le cas d'un métabolisme autotrophe strict.

Nous ne possédons pas de données sur la concentration en matière organique dans

l'aquifère de Creil. Cependant une étude réalisée sur le forage géothermique de Blanc-Mesnil a
montré que la teneur en carbone organique variait de 0,3 à 3,5 % dans les dépôts de corrosion
(GAUTHI ER et al., 198ô). Des valeurs sensiblement identiques ont été trouvées dans d'autres puits
géothermiques de la région parisienne (Aulnay, Bondy, Achères, ...) et une teneur de 8,1 mg / 1 de
carbone organique dissout a été mesurée sur le puits de Fontainebleau (CRIAUD et FOUILLAC,
communication personnelle). Par ailleurs, la concentration en matière organique est généralement
élevée dans les bassins sédimentaires de même origine que le bassin parisien. La présence plus que
possible de matière organique dans le puits géothermique de Creil n'exclut donc pas un métabolisme
hétérotrophe.

En plus, les additifs rajoutés dans les boues au moment des opérations de forages sont
une source potentielle de substrats carbonés. Ces additifs sont généralement des viscosifiants et
des produits anti-moussants. Les premiers contiennent des polymères cellulosiques et des
carboxyméthylcelluloses de sodium alors que les seconds sont essentiellement à base d'acides gras
et autres composés organiques (stéarate, isobutanol). Certaines souches isolées du puits de Creil
utilisent les alcools et les acides gras comme source de carbone et d'énergie: par exemple, la souche
03 est capable de dégrader le stéarate. Les composés cellulosiques ne sont pas des substrats des

BSR, mais ils peuvent être dégradés par d'autres bactéries en petites molécules directement
assimilables par les BSR. L'injection de ces produits, dans un but initial bien défini, peut donc avoir de
graves conséquences secondaires en particulier en favorisant directement ou indirectement le
développement des bactéries corrosives.

3.2.2.2. Adaptation des souches à leur environnement

• Les bactéries thermophiles isolées de la colonne de production de Creil sont bien

adaptées aux conditions de température de leur milieu ambiant, la température de l'aquifère
correspondant pratiquement à leur optimum de croissance. On conçoit alors aisément qu'elles soient
actives dans le puits.
 47
Par contre, La présence de bactéries mésophiles est plus paradoxale et il est plus difficile
d'envisager leur croissance dans les conditions de température l.o....sl1.u.. Cependant, les températu res
maximale et optimale de croissance des BSR augmentent lors d'une compression (ZOBELL, 1958).
Les hautes pressions (environ 200 bars) présentes dans le puits pourraient avoir un effet protecteur
sur la thermotolérance des espèces mésophiles qui présenteraient alors dans le puits un optimum de
température supérieur à celui défini par l'étude physiologique réalisée à pression normale (ZOBELL
et JOHNSON, 1949; JOHNSON, 1957). De hautes pressions étant difficiles à établir dans les tubes
de culture, cette hypothèse n'a pû être vérifiée au laboratoire.
Ces espèces bactériennes mésophiles ne sont en aucun cas à négliger, car elles sont
susceptibles d'avoir un rôle et une activité importants dans ie sondage de réinjection où la
température instaurée après passage dans l'échangeur devient proche de leur optimum (37°C).

La mise en évidence de ces bactéries en quantités non négligeables (900 BSR / ml) au
niveau des zones du circuit caractérisées par un faible débit indique manifestement qu'elles ont
trouvé des conditions physico-chimiques favorables à leur prolifération dans ces gites facilitant leur
adhésion et leur assurant probablement une température moins élevée.

• Le fluide géothermal de Creil issu de la formation géologique du Dogger contient des

sels principalement sous forme de NaCI (20 g / 1). La présence de bactéries dans un tel milieu
n'implique pas forcément un optimum de croissance à cette salinité. En effet la recherche des limites
supportées a montré que les BSR isolées se développent normalement dans une gamme de
concentrations comprises entre 1 et 50 g /1, dépassant largement celle de l'eau géothermale. Il n'y a
donc pas une véritable adaptation aux conditions de salinité de l'aquifère. Ce résultat reflète plutôt le
caractère eurhyalin des bactéries, c'est-à-dire leur capacité à tolérer des salinités différentes.

Les divers points développés ci-dessus mette'nt" en reiief les notions de facteurs limitants
la croissance et de seuils. Ces notions étant prises en considération, il apparait que toutes les
conditions indispensables à la survie et à la croissance des BSR, en particulier des thermophiles, sont
réunies dans l'écosystème de Creil pour que ces dernières puissent y exercer une activité. Des
mesures d'activité ~ spécifiques de ces bactéries (réduction des sulfates) pourraient permettre
d'évaluer sans ambiguité leur activité dans l'aquifère. En ce qui concerne leur incidence dans les
phénomènes de corrosion, la capacité des souches à utiliser l'H2 suggère leur participation aux

lésions observées.

3.2.3. ORIGINE DES BSR PRESENTES DANS LE PUITS

Cette étude est une étape préliminaire à la définition de moyens de lutte contre la
corrosion biologique. La présence de BSR dans le sondage de production de Creil pose le problème
 48
de leur provenance. La connaissance de leur origine influe directement sur le choix des solutions à
développer, ces dernières pouvant être préventives ou curatives. Trois hypothèses peuvent être
envisagées en ce qui concerne l'origine des BSR :

- Elles sont introduites lors des opérations de forage, soit par l'intermédiaire des boues,
soit par une contamination au moment de la traversée de couches géologiques sus-jacentes à la
nappe, riches en germes.
- Elles peuvent être également issues d'une contamination par les eaux de surface
pénétrant dans l'aquifère par migration verticale ou horizontale.
- Elles pré-existent dans le réservoir soit à l'état développé actif soit à l'état passif sous
forme de spores permettant une latence prolongée.

L'absence de comparaison avec les communautés bactériennes susceptibles de

contaminer l'aquifère (bactéries des boues de forage, bactéries des couches sédimentaires
sus-jacentes) ne permet pas de statuer sur l'origine allochtone ou autochtone des BSR.

L'introduction systématique, en cours de forage, de bactéricides dans les boues élimine à

priori la première hypothèse. Cependant, les volumes de boues à traiter étant importants et
hétérogènes, il est possible que la stérilisation ne soit pas parfaite. D'autre part ces bactéricides sont
très sélectifs et peuvent aboutir à un résultat opposé à celui désiré par la sélection de microflores
résistantes.

Les bactéries mésophiles, mal adaptées à la température du puits, sont susceptibles

d'avoir une origine allochtone, leur présence dans le puits s'expliquant alors par "une des deux
premières hypothèses. Par contre les BSR thermophiles peuvent être considérées comme
pré-existantes dans l'aquifère, en raison de leur bonne adaptation aux conditions ~ de leur milieu
ambiant. Il a été signalé par MC NABB et DUNLAP (1975) que la détection répétée dans un biotope
d'un groupe physiologique de bactéries indique qu'il est natif de cet habitat et qu'il y exerce une
activité.

En faveur de l'origine autochtone des BSR, une analyse de la composition isotopique du

soufre a été réalisée par le B.R.G.M. (GOYENECHE et LONGIN, 1981) sur les sulfates présents dans
le fluide de Creil et plusieurs analyses de même type ont été effectuées sur d'autres puits
géothermiques de la région parisienne (FOUILLAC et al., 1986). Les résultats de ces analyses ont
montré un enrichissement en 34S. Or cet enrichissement en soufre lourd a pour origine une
réduction biologique du S04 2 -, due à l'utilisation péférentielle de l'isotope léger par les BSR (32S)

(THODE et al., 1949,1951; TROFIMOV, 1949; SZABO et al., 1950; MACNAMARA et THODE,1950,
1951; JONES et STARKEY, 1957). Il est impossible à partir de ce type d'analyses de déterminer si
cette variation isotopique est le résultat d'une activité ancienne (origine autochtone) ou récente
 49
(contamination au moment du forage) (FOUILLAC et CRIAUD, B.R.G.M., communication
personnelle). Cependant, le processus d'enrichissement en soufre 34 dans la forme oxydée (S04 2 -)

étant très lent, il semblerait que cette activité remonte à la période géologique de formation du bassin
sédimentaire de la région parisienne. Cette remarque qui n'exclut pas qu'il existe également une
activité contemporaine depuis la réalisation du forage, témoigne d'une origine autochtone des BSR
dans le puits de Creil.
 CHAPITRE 3
ETUDE DES POTENTIALITES CORROSIVES
DES aSR ISOLEES DU
PUITS DE GEOTHERMIQUE DE CREIL
 50

CHAPITRE 3
ETUDE DES POTENTIALITES CORROSIVES
DES BSR ISOLEES DU
PUITS GEOTHERMIQUE DE CREIL

Après la mise en évidence et la caractérisation des BSR isolées du sondage de

production de Creil, nous nous sommes proposés, dans la troisième partie de ce travail, d'étudier, en
conditions de laboratoire, leurs potentialités corrosives vis à vis des métaux utilisés en géothermie.
Dans ce but, nous avons employé les techniques électrochimiques de mesure de la corrosion. Parmi
16 large éventail de ces techniques, certaines permettent d'évaluer la résistance à la corrosion des
métaux testés alors que d'autres plus spécifiques, apportent des renseignements intéressants sur
les mécanismes de corrosion des métaux. Nous avons mis à profit quelques unes de ces techniques
et les avons adaptées aux mesures microbiologiques pour tenter également d'élucider les
mécanismes de la corrosion biologique et en particulier pour infirmer ou confirmer une ou plusieurs
des théories proposées dans la littérature.

1 . MATERIEL ET METHODES
1.1. ECHANTILLONS
1.1.1. origine et composition chimique des échantillons

Les deux aciers testés dans cette étude pour leur résistance à la corrosion en présence
de BSR sont utilisés dans les installations géothermiques. Des échantillons issus de deux tubes
nous ont été fournis par la Société VALLOUREC sous forme de plaques de 50 X 25 x 3 mm.
- K55 = Acier au carbone à structure ferrite-perlite. Il est principalement employé dans la
centrale géothermique de Creil pour l'équipement des puits.
-LaO VC 13 = Acier inoxydable ferritique à 13% de chrome actuellement utilisé en
géothermie dans les organes de pompe.

La composition chim!que et les caractéristiques de traction de ces deux aciers sont

présentées dans les tableaux ci-contre (8 et 9). L'acier LaO VC 13 utilisé dans cette étude est
conforme à la spécification AFNOR Z 20 C13. Le standard de l'American Petroleum Institute (API) ne
précise pas la composition chimique de l'acier API K55 mais spécifie par contre ses caractéristiques
mécaniques. Ces caractéristiques pour l'acier K55 utilisé dans notre étude sont conformes aux
normes API. Dans la suite de notre étude nous continuons de dénommer API K55, l'acier au carbone
étudié. La Société VALLOUREC fournit en effet sous cette référence des produits dont la
composition chimique moyenne, donnée dans le tableau 8, est voisine de celle mesurée sur cet
acier. Dans l'étude des mécanismes d'action des BSR seul cet acier au carbone a été testé.
 Tableau 8 = Composition chimique des aciers K55 et L80 VC13 (% poids)

Repère C Si Mn P S Cr Mo

API K55 0,29 0,25 1,25 0,016 0,032 - -

K55 0,411 0,312 1,11 0,011 0,007 0,071 0,023

Z 20 C13 0,15-0,24 <1 <1 < 0,04 < 0,03 12-14 -

L 80 VC 13 0,206 0,303 0,46 0,019 0,007 12,92 0,013

Tableau 9 = Caractéristiques de traction des aciers K55 et L 80 VC13

Repère Limite d'élasticité Résistance mécanique Allongement à la rupture

Re 0,2 (Mpa) (Mpa) (%) 2"

API K55 > 378 - -

K55 471 700 28

Z 20 C13 > 540 730-930 >14

L 80 VC13 600 752 25
 /4---- connect ion electrique

........----tube en verre

1'*-----1il electrique

------------ - - -~----

.-f"-1..........""'l- - - --------

soudure éch ant ilion

resine
........
"'--' ~---------------~~..-

1.. "'1
1cm

figure 20 = Montage de l'échantillon métallique en électrode de travail

 51

1.1.2. Montage des échanti Il ons sous forme d'électrode de

travail

La reproductibilité des mesures électrochimiques nécessite, en premier lieu, que la

surface métallique ait une aire bien définie.
Les échantillons sont usinés sous forme de carrés de 1 cm de côté et 0,3 cm d'épaisseur.
L'électrode de travail (Fig. 20) est réalisée en soudant un fil électrique sur l'une des faces. Le fil
électrique est gainé dans un tube en verre et l'étanchéité au niveau de la soudure est assurée par un
enrobage dans une résine époxyde. Les faces non étudiées du métal sont également masquées
par cette résine inerte. L'aire utilisée de l'électrode est de 1 cm 2.

1.1.3. Préparation de la surface de l'électrode de travail

Pour tendre vers un état de surface initial reproductible d'une expérience à l'autre,
l'échantillon est poli par abrasion mécanique, sous courant d'eau, avec du papier émeri de graduation
de plus en plus fine (200,350,640, 1000). Après le polissage, l'échantillon est dégraissé à l'alcool
éthylique de façon à éliminer toute trace de matière organique, rinçé à l'eau distillée et séché avec du
papier joseph. L'ensemble du montage est ensuite rapidement stérilisé par flambage à l'alcool avant
son introduction dans l'électrolyte pour éviter toute contamination par des espèces bactériennes
autres que la souche étudiée durant l'expérience. L'électrode de travail est alors immédiatement
immergée dans la solution afin d'éviter l'oxydation à l'air de la surface de l'échantillon.

1.2. CELLULE ELECTROCHIMIQUE

Deux impératifs nous ont guidés dans la réalisation de la cellule d'essai utilisée dans ce
travail:
-Le réacteur devait être complètement étanche à l'oxygène pour permettre les cultures de
BSR dont le métabolisme est anaérobie strict.

- L'ensemble de la cellule devait résister à un autoclavage à 110°C pendant 45 mn. Cette

stérilisation est destinée à l'élimination des contaminants pouvant se développer durant l'étude en
culture pure des BSR.

Les différents réacteurs stérilisables et étanches à l'oxygène, proposés sur le marché,

comprennent différents éléments métalliques (pales d'agitation, arrivées de gaz) susceptibles
d'influencer les mesures électrochimiques. Nous avons donc conçu et fait construire une cellule qui a
été utilisée pour nos essais.
 3

/
4

Figure 21 = Shéma de la cellule de mesure

 52

1.2.1. Description de la cellule

La cellule de mesure est constituée d'un corps en verre pyrex dont le volume utile est
d'environ un litre. Cette contenance est largement suffisante pour que la corrosion de l'échantillon
ne modifie pas notablement la composition de l'électrolyte. Elle est munie d'un couvercle également
en pyrex. Celui-ci est pourvu de plusieurs tubulures permettant suivant les expériences, le passage
de divers éléments (Fig. 21) :

- Une électrode de travail (1).

- Une électrode auxiliaire (2) = grille de platine ayant une grande surface destinée à assurer
le passage du courant dans les montages à 3 électrodes.
- Une électrode de référence (3) = électrode au calomel! KCI saturé constituée par le
système Hg! H92 C12! KC!. Dans certains cas l'électrode est placée dans une allonge contenant du

KCI saturé (4). L'allonge se termine par un effilé qui aboutit à proximité de la surface de l'échantillon
de façon à minimiser l'importance de la chute ohmique lors des mesures dynamiques.
- Une entrée de gaz avec un dispositif de filtration permettant la stérilisation du gaz avant
son entrée dans la cellule (5).
- Une sortie de gaz (6).
- Un passage avec bouchon septum permettant l'introduction de l'inoculum ou de produits
chimiques en cours d'expérience (7).
- Un passage permettant d'effectuer les prélèvements en cours d'expérience (8) en
faisant circuler le fluide grâce au maintien d'une légère surpression de gaz introduite dans la cellule
par l'entrée (5) (d. par. 1.5.1.).

L'étanchéité de l'ensemble est assurée par un joint torique (9) placé entre la cellule et le
couvercle et par des raccords SVL (10) à bouchons vissés au niveau des passages. Cette cellule a
fait l'objet de nombreuses mises au point notamment en ce qui concerne la contamination par
l'oxygène. Par exemple les joints des SVL se sont avérés insuffisants pour assurer cette étanchéité
et ont été remplacés par des bouchons en caoutchouc que nous avons percés en les adaptant au
diamètre de chaque élément (électrodes et tubes en verre). Pour éviter que les bouchons sautent
lors de l'introduction d'une surpression, nous les avons choisi de diamètre assez petit pour les
enfoncer suffisamment et ainsi les maintenir avec les bouchons vissés des raccords SVL initiaux.

1.3. LES SOLUTIONS

Des solutions fraiches sont préparées avant chaque expérience. Dans un tout premier
temps nous avons utilisé une solution d'eau géothermale reconstituée dont la composition est
donnée dans le tableau 10.
 Tableau 10 = Composition chimique de l'eau utlisée dans les essais

Eau aéothermale Eau utilisée

1
Cations majeurs mg/I mmol/I Sels mg/I mmolll

Ca 2 + 1135 28,31 KCI 226 3,05

Mg 2 + 375 15,41 NaHC03 504 6
Na + 8300 360,9 MgS04 1012 8,43
K+ 119 3,05 CaCI2 3114 28,31
NH 4 + 26 1,44 MgCI2 663 6,98
NH4C\ 77 1,44

Anions maieurs NaCI 20943 358

HC0 3 - 370 6 Salinité 26,5 g/I

CI- 15500 437,2 Totale
SO 2- 810 8,43
4
pH 7,2
 53

Les manipulations en présence de BSR ainsi que les expériences de contrôle ont été
réalisées sur le milieu de WIDDEL et PFENNIG (1977), modifié par WIDDEL (1980), dont la
composition et la préparation sont données au chapitre 2 (par. 1.2.). Suivant les cas, nous avons
modifié le donneur ou l'accepteur d'électrons. Certaines expérimentations ont été effectuées en
l'absence totale d'ions S2-. Le Na2S servant à réduire le milieu a alors été remplacé par de la cystéine

à une concentration équivalente.

1.4. MONTAGES ELECTROCHIMIQUES

Plusieurs dispostifs expérimentaux ont été utilisés dans cette étude correspondant à
plusieurs types de mesures électrochimiques.

1.4.1. Montage à trois électrodes

Ce montage classique est utilisé pour le tracé des courbes de polarisation. Il permet
d'imposer une différence de potentiel (d.d.p.) entre l'électrode de travail et la contre-électrode. Cette
d.d.p. est pilotée de manière à pouvoir explorer les zones de potentiels anodiques ou cathodiques
et d'enregistrer la courbe E = f ( 1 ) ou E = f ( log 1 ). Ce montage potentiocinétique (Fig. 22) comprend:

- Un potentiostat électronique TACUSSEL, type PRT 10-0,5 L qui délivre un courant de

sortie compris entre ± 0,5 A.
- Un pilote automatique TACUSSEL type Servovit 10 A, réalisant le pilotage en potentiel
en fournissant au potentiostat un programme de variation en fonction du temps.
- Un enregistreur potentiométrique TACUSSEL, type EPL2 qui comporte un tiroir TILOG
101 pour l'enregistrement des courants en échelle logarithmique ou linéaire. L'électrode de travail
est placée en série avec ce tiroir.
- Un multivoltmètre électronique PSD 11 de HEITO Paris (± 2 V) à haute impédance
d'entrée (10 12 Q). Il indique le potentiel de corrosion en circuit ouvert et la d.d.p. entre j'électrode de
travail et l'électrode de référence pendant le tracé des courbes de polarisation.
- Une cellule électrochimique.

Les appareils que nous venons de décrire (sauf l'enregistreur) constituent le circuit de
mesure proprement dit. Certaines courbes ont été obtenues par acquisition numérique de données.
Dans ce cas l'enregistreur et le multivoltmètre sont supprimés et l'installation (Fig. 23) comporte en
plus du potentiostat, du pilote et de la cellule les appareils annexes suivants:
-Un multimètre KEITHLEY 195 A est utilisé comme voltmètre. Il mesure par l'intermédiaire
d'un adapteur d'impédance la tension (d.d.p.) entre l'électrode de travail et l'électrode de référence.
Cet adapteur est indispensable car l'impédance d'entrée du 195 A est nettement inférieure à 10 12
Q.
 ----!I----1f----------'
(
l777T7
pi lote

enreg ist reu r

l,
potentiost at
J

0 C. E .

E.R.l"'"---
, "-.:.-
E.T.

, - - - - - - - -1
voltmètre

Figure 22 = Montage électrochimique à 3 électrodes

Poten Li os till

PILOTE
C.E.

E.IL

VoL l[11è l re

UniLé CD,trale

Figure 23 = Montage électrochimique à 3 électrodes couplé

l'acquisition automatique de données
 54

-Le multimètre est interfacé par le BUS IEEE avec une unité centrale.
-Une unité centrale C.B.M. 4032.
-Une unité de lecteur de disquette COMMODORE 2031 LP.
-Une table traçante HP 7470 A permettant le traitement graphique des données.
-Les vitesses de balayage sont alors de l'ordre de 0,2 à 0,5 mv / s.

Ce montage informatisé ainsi que les programmes d'acquisition et d'exploitâtion des

résultats ont été mis au point au laboratoire par MASSIANI (1986).

Les valeurs numériques sont automatiquement stockées sur disquettes et utilisées en

différé, soit dans les calculs soit par restitution graphique dans des systèmes de coordonnées
différents (Log, semi-Log, linéaires). Une installation équivalente mais comportant des appareils
différents a été utilisée au laboratoire Chimie-Corrosion marine de l'IFREMER, pour l'évaluation d~s
courants de corrosion en l'absence de bactéries et durant la croissance de ces dernières:

- Un SOLARTRON SLHLUMBERGER 1286 electrochemical interface, servant à la fois de

potentiostat, de pilote et de millivolmètre.
- Une unité centrale TEKTRONIX 4052, comprenant un lecteur de cassettes.
-Une table traçante HP 7225A.
Les courbes sont tracées au fur et à mesure de l'enregistrement des données à la vitesse
de 0,2 mv.s- 1 .

1.4.2. Montage à 2 électrodes

Ce dispositif est utilisé pour le suivi du potentiel en fonction du temps. Le montage

électrochimique est équivalent à celui décrit sur la figure 23 mais le potentiostat, le pilote et la contre
électrode de platine n'interviennent pas dans la mesure. Ces éléments sont utilisés uniquement en
début d'expérience pour un traitement électrochimique éventuel de la surface de l'échantillon par
imposition d'un potentiel légèrement cathodique. Les couples de points (E,t) sont stockés par
l'intermédiaire de l'unité centrale CBM 4032 et les courbes correspondantes sont tracées en différé
sur table traçante.

1.4.3. Montage de la pile

Ce dispositif a été utilisé pour mesurer, en fonction du temps, le courant de court-circuit ou

la force électromotrice en circuit ouvert d'une pile constituée par deux électrodes de travail
identiques, plongeant dans deux solutions indépendantes mais chimiquement identiques. Les deux
solutions sont raccordées par un pont électrolytique ou simplement séparées suivant les cas par une
membrane dialysante. Le montage expérimental de mesure comprend en plus des appareils déjà
décrits sur le figure 23:
 55

-Un multimètre KEITH LEY 195 A utilisé comme ampèremètre et placé en série sur le circuit
permet de mesurer \e courant de court-circuit traversant la pile. L'idéal aurait été un
microampèremètre à résistance d'entrée nulle, celle du multimètre étant de 10 3 n.
- Un générateur de courant TAKEDA RIKEN type 6141 qui est utilisé pour mesurer le sens
du courant dans le circuit.

1.5. MESURE DES PARAMETRES BIOLOGIQUES

1.5.1. Techniques de prélèvement

Les prélèvements ont été réalisés au cours du temps en introduisant au moment voulu
une légère surpression dans la cellule électrochimique. Le milieu s'écoule alors par la sortie prévue à
cet effet dans un tube contenant une atmosphère inerte ou dans des petits tubes qui sont
complètement remplis pour éviier toute oxydation du prélèvement au contact de l'air en particulier
lorsqu'il s'agit des échantillons destinés au dosage de l'H2S,

Les échantillons prévus pour le dosage des phospholipides dans les membranes des
bactéries adhérées aux surtaces, sont suspendus dans la culture bactérienne. Ils sont donc retirés
sous flux de gaz et immédiatement traités.

1.5.2. Techniques de dosage des composés en solution

La production d'H2S dans les cultures est dosée par une méthode colorimétrique

(CORD-RUWISH, 1985) décrite au chapitre 2.

La production de succinate ou d'acétate et la disparition du lactate sont mesurées dans

chaque prélèvement par chromatographie en phase liquide (HPLC). Les caractéristiques du
chromatographe sont données au chapitre 2.

1.5.3. Technique de dosage des phospholipides

1.5.3.1. Extraction des lipides totaux

Les lipides sont extraits du biofilm par la méthode BLlGH-DYER (1959). Les échantillons
sont placés, pour chacun d'entre eux, dans un bécher contenant 25 ml d'un mélange méthanol /
dichlorométhane / eau, 2/1 /0,8 (v / v / v).

La solution est agitée et après 2 heures d'extraction, des volumes égaux de

dichlorométhane et d'eau sont ajoutés à la solution initiale afin d'y créer un mélange diphasique. Les
proportions des 3 constituants sont alors 1 / 1 / 0,9 (v; v / v).
 56

La solution est placée dans une ampoule à décanter de 125 ml, agitée, puis laissée au
repos pendant 24 heures. La phase organique contenant les lipides est alors récupérée après
filtration sur filtre de verre (Whatmann GF / C) et conservée à -18°C.

1.5.3.2. Séparation des lioides

Les composés recherchés dans cette étude sont les acides gras dérivés des
diacylphospholipides dont la majeure partie se trouvent confinés dans la membrane cytoplasmique
des bactéries:

Il est donc nécessaire de réaliser une séparation préalable de ces phospholipides.

Les lipides totaux récupérés dans la phase organique sont séparés en 3 grandes classes
par chromatographie sur colonne. La phase stationnaire utilisée est de l'acide silicique (UNISIL réf. C.
E. 410.005) activé à 1aaoc pendant une heure.

La phase organique est donc amenée à sec, puis reprise dans 2 ml de dichlorométhane et
transvasée dans un tube. L'analyse quantitative a été rendue possible par adjonction, à cette étape,
d'un étalon interne. Il s'agissait en l'occurence de j'acide nonodécanoique C19:a absent dans les
échantillons analysés. Le fait d'introduire cet étalon dès la première étape du schéma opérationnel,
permet de faire abstraction des différentes pertes intervenant lors de chaque étape de préparation et
séparation des acides gras.

Les 2 ml sont appliqués en haut d'une colonne contenant environ 1 9 de phase

stationnaire. La préparation est alors réalisée par élution à l'aide d'une série de phases mobiles de
polarité croissante (WHITE et FRERMAN, 1967 ; GEHRON et WHITE, 1983) :

a
- 1 ml de chloroforme (lipides neutres)
- 1a ml d'acétone (glycolipides)
- 1a ml de méthanol (phospholipides)
La dernière fraction est recueillie dans un tube conique, réduite de volume et stockée à
 [CHAN TILLON

Extraction BLIGH-DYER

~
/
Phase aqueuse
~ Phase organique------t Lipides

séparation
chromatographie sur colonne

MeOH

Acé1:one

Phospholipides Glycolipides Lipides neutres

l
Esterification
/(MeOHICH 2CI/~

Phase aqueuse Phase organique'-----" Esters

"
Chromatographie
sur couche mince
C. C.,\{.

1
Esters méthYliques diacides gras
et d'ac'ides gras h)'Ciroxylés

CPG/SM

Figure 24 = Shéma opérationnel de la préparation et de l'analyse du voile bactérien

déposé sur les surfaces métalliaues
 57

1.5.3.3. Estérification

L'estérification des phospholipides a pour but d'isoler les acides gras liés à la molécule de
glycérophospholipides et de les transformer en esters méthyliques plus facilement analysables par
chromatographie en phase gazeuse.

Les phospholipides séparés par chromatographie sur colonne, sont amenés à sec et
repris par le minimum de dichlorométhane (10 à 20 ~l) et estérifiés par méthanolyse acide: 2 ml d'un
mélange méthanol! dichlorométhane ! acide chlorhydrique concentré 10 ! 1 ! 1 (v! v ! v) sont
introduits dans le tube contenant les phospholipides. Les tubes sont alors placés dans une étuve à
100°C pendant 1 heure.

La solution est ensuite refroidie et 1 ml de dichlorométhane y est ajouté afin de créer un

mélange diphasique. Après centrifugation de 15 mn à 3000 t ! mn, la phase supérieure (phase
aqueuse) est éliminée et 1 ml d'eau est de nouveau ajouté à la phase organique. Après une nouvelle
centrifugation, la phase inférieure contenant les esters méthyliques d'acides gras est recueillie,
réduite de volume et stockée à -18°C. La figure 24 résume l'ensemble des opérations nécessaires à
l'obtention des esters méthyliques.

1.5.3.4. Purification

Les esters méthyliques sont ensuite séparés par chromatographie sur couche mince
(CCM). 100 ~I du mélange estérifié sont appliqués à la base d'une plaque de chromatographie sur
couche mince (réf. MERCK 5628) - épaisseur 250 ~m. Les plaques sont placées dans une cuve à
développement contenant 100 ml d'une solution de diethyl ether-hexane 2! 1 (v! v).
Après élution, les acides gras (acides gras saturés et insaturés) sont révélés à l'aide de
dichlorofluorescéine.
Après identification (grâce à un mélange d'acides gras de référence élué en même temps
que l'échantillon), les bandes correspondantes aux acides gras saturés et insaturés sont grattées.
placées en tête d'une microcolonne de verre obturée par de la laine de verre et contenant environ 1
g de Florisil (réf. MERCK 12999, 100-200 Mesh ASTM) et éluées par 1 ml d'un mélange
dichlorométhane ! héxane 1! 1 (v/v) (GUEZENNEC, 1986).
Les esters méthyliques sont alors prêts pour une analyse de leur structure par
chromatographie en phase gazeuse. Le chromatographe utilisé est un chromatographe HRGC
CARLO ERBA "mega 5160" équipé d'un détecteur à ionisation de flamme et d'un injecteur "on
column". La colonne capillaire utilisée est une colonne polaire CP tm SIL 88 (CHROMPACK SA) -
indice de polarité CP 88 ; Longueur: 50 m; diamètre intérieur: 0,22 mm ; épaisseur du film: 0,12 mm
; gaz vecteur: hydrogène à un débit de 0,7 ml .mn -1. L'enregistrement et le calcul des surfaces de
pics sont réalisés sur un enregistreur-calculateur MERCK "D2000".
 58

2. COMPORTEMENT A LA CORROSION DES ACIERS K55 et LV

SOC13

Avant d'aborder l'étude de l'influence des BSR sur la corrosion de l'acier au carbone K55
et de l'acier inoxydable L80 VC13 utilisés en géothermie, il nous a semblé nécessaire de connaitre
leur comportement électrochimique dans une eau de composition chimique identique à celle du
fluide géothermal. Ces essais avaient également pour objectif une adaptation à des techniques
nouvelles ne relevant pas de notre formation initiale et le test de la cellule de mesure précédemment
décrite.

2.1. TECHNIQUE UTILISEE

Nous avons traçé les courbes de polarisation potentiocinétiques. Ces courbes sont en
quelque sorte la "carte d'identité" des métaux et permettent d'avoir une vue générale de leur
comportement anodique et cathodique.
Rappelons qu'à la surface d'un métal ferreux immergé dans une eau désoxygénée, les
deux réactions suivantes se produisent:

- (1) La réaction anodique = Fe ------> Fe 2 + + 2e-

-(2) La réaction cathodique = 2H+ + 2e- --------> 2 H ------> H2

Les débits d'électrons mis en jeu par ces deux réactions sont représentés par les

intensités électriques 1 A (courant anodique, positif par convention) et 1 K (courant cathodique,

négatif par convention) par unité de surface, ces deux intensités étant respectivement une mesure
de la vitesse des réactions (1) et (2). En corrosion naturelle, c'est-à-dire sans apport de courant
extérieur, le nombre d'électrons mis en jeu au cours des deux réactions est égal, ce qui signifie que

le métal acquiert spontanément son potentiel de corrosion (Ecorr) tel que 1 A = -1 K. La valeur absolue

commune des courants A et1 1 K est appelée densité de corrosion: Icorr.

Les courbes de polarisation individuelles des réactions anodiques et cathodiques se

déroulant à la surface du métal qui se corrode ne sont pas accessibles; par contre, la courbe globale,
résultante des courbes élémentaires peut être tracée expérimentalement (Fig. 25). Elle donne la
variation de la densité du courant entre l'électrode de travail et la contre-électrode, en fonction du
potentiel imposé à l'électrode de travail, repéré par rapport à une électrode de référence. Cette
courbe de polarisation transcrite en coordonnées semi-Iog, fait apparaître 2 parties linéaires dites
droites de TAFEL, dont l'extrapolation coupe l'axe des potentiels aux potentiels d'équilibre des
réactions anodique et cathodique (Fig. 25 a). L'intersection de ces deux droites au potentiel à

courant nul donne le courant de corrosion (I corr )'

 log 1 c~
O'
/{
C' ~
~('., 0$
o ~
0'.
/9 "~ a
Y /
~

le

•
l EAI
1
1
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_ _ _ _ _ _E~1 _!/
-/E K E
jiKi=i e f /

Figure 25 = Détermination de 1corr par extrapollation des droites

de Tatel obtenu par le tracé des courbes E = t (Logl)
 59

La densité de courant ainsi obtenue permet de calculer à partir de la loi de FARADAY la

perte de masse m subie par 1 cm 2 de métal en fonction du temps t :
m = lcorr x A x t
nxF

A = masse atomique du métal

n = nombre d'électrons mis en jeu
F = constante de FARADAY = 96500 Coulombs

2.2. PROTOCOLE EXPERIMENTAL

- La cellule de mesure contenant le fluide géothermal reconstitué (500 ml), ajusté à pH

7,2, est placée dans un bain marie thermostaté, une variation de la température pouvant en effet
affecter les résultats de la mesu~e.

-La solution reconstituée est donc dégazée par un barbotage à l'argon pencant environ
20 mn car le fluide géothermal ne contient pas d'oxygène. Au moment des mesures, l'arrivée du gaz
est mise en position de "léchage". L'efficacité de cette désaération a été testée par Y. MASSIANI
(1986).

- Après cette désaération et l'obtention de la tempé"rature désirée au sein de la solution,

l'électrode de travail est polie et dégraissée, puis introduite dans l'électrolyte en même temps que
l'électrode de référence et l'électrode de platine.

- Aprés 15 mn d'attente en corrosion libre, nécessaire à la stabilisation du potentiel,

l'électode est polarisée à un potentiellégérement supérieur à la valeur de Ecorr (sunension = 30 mV)
de façon à pouvoir enregistrer le potentiel à courant nul.

- On trace d'abord la courbe de polarisation cathodique (dans le sens des potentiels

décroissants) à la vitesse de balayage de 30 mv.s· 1 jusqu'au potentiel de -1200 mv.

- La polarisation est coupée et le potentiel reprend une valeur très proche de Ecorr. Ce
componement indique que le tracé de la courbe cathodique n'a pas penubé la surface du métal. La
courbe anodique est alors tracée (dans le sens des potentiels croissants) sur le même échantillon, à
la même vitesse de balayage.
 Figure 26 = Courbe cathodique et anodique de l'acier K55 à 20°C

E (mv/e.c.s.) E (mv/e.c.s.)

-]00 -100-

- Boo - 200-

-900 -300 -

-1000- -400

-1100- -500 -

-1200 -600 -

-1300 -]00
 60

2.3. COURBES POTENTIOCINETIQUES DES DEUX ACIERS

2.3.1. Influence de la composition chimique des aciers

Les courbes obtenues à température ambiante (20°C environ) pour les deux aciers
étudiés sont présentées sur les figures 26 et 27. Un grand nombre d'enregistrements ont été
effectués pour tester la reproductibilité des courbes. Ils ont montré que cette reproductibilité était
bonne pour un même état de polissage. Nous n'avons donc reproduit ici qu'un tracé. Nous avons
rassemblé les valeurs des différents paramètres obtenues à partir de ces courbes intensité-potentiel
dans le tableau qui suit:

Tableau 11 : Caractéristiques électrochimiques des alliages utilisés en

géothermie.

CathxJiq.Je

K55 LBOVC13 KS5 L80VC13

Ecorr (mV/ e.c.s.) -757 -754 -751 -755

Eco (mV/ e.c.s.) -760 -766 -758 -776
Pente de Tafel 200 196 104
(mV / decade)
Icorr 1 (f1.A! cm 2) 7 5 15

1. Cette valeur est généralement déterminée à partir des droites de TAFEL

cathodiques.

On constate que la cinétique de décharge du proton est identique pour les deux métaux
(pentes cathodiques). Par contre l'allure générale des courbes anodiques est complètement
différente. En ce qui concerne l'acier au carbone K55, ce comportement traduit sa faible résistance à
la corrosion dans ce milieu.
La partie anodique de la courbe de polarisation de l'acier inoxydable présente une forme
particulière dans laquelle on distingue trois domaines:
- Une première zone durant laquelle le courant augmente rapidement dans un faible
domaine de variation du potentiel.
- Un domaine qui s'étend sur 570 mV caractérisé par une stabilisation de l'intensité du
courant à environ 6 f1.A / cm 2 . Celle-ci est pratiquement constante même quand le potentiel imposé
continue à croitre jusqu'à -140 mv / e.c.s ..
 r-----------.---------......- - - - - - - - - - - - - - - - - - - ,
E (m v/ e .C . s .) E (mv/e.c.s.)

-700- - -100 -

-800 - 200-

-900- -300

-1000 - 400- -

-1100-- -500

-1200- -600 -

-1300 - -700

Figure 27 == Courbe cathodique et anodique de l'acier L80 VC 13 à 20°C

 61

-A ce potentiel de -140 mV / e.c.s. débute le troisième domaine au cours duquel l'intensité

augmente à nouveau brutalement.

Ce comportement est celui d'un métal passÎvable. La zone où l'intensité n'évolue plus
correspond au palier de passivation. Cette passivité est due généralement à la formation d'une
couche qui constitue une barrière efficace contre le passage en solution des ions métalliques. La
corrosion s'en trouve donc considérablement freinée ou stoppée. L'absence d'un pic d'activité,
généralement suivi d'une chute brutale du courant, traduit un phénomène de passivation
spontanée. Nous avons effectivement observé que si l'électrode n'était pas introduite dans la
solution immédiatement après le polissage, nous avions des potentiels de corrosion d'environ - 450
mv / e.c.s., traduisant la présence d'une couche protectrice formée spontanément à l'air.

2.3.2. Influenca de la température

La tempéré'ture du fluide géothermal étant de 56°C, nous avons donc étudié le

comportement à la corrosion des 2 alliages à cette valeur (Fig. 28 et 29). On notera cependant c;ue :2
température est susceptible d'influer sur le potentiel de j'électrode de référence.

Les potentiels à courant nul, déterminés à partir des courbes cathodiques, sont -750
mv/e.c.s. pour l'acier K55 et -740 mv/e.c.s. pour l'acier L80 VC13. L'augmentation de la température
entraîne l'accélération de la réaction cathodique. Mais la vitesse de cette dernière évolue
sensiblement de la même manière pour les 2 métaux, !a valeur des pentes cathodiques étant
pratiquement identique et respectivement égale à 220 et 240 mv / décade. Le courant de corrosion
de l'acier K55, déterminé à partir de la courbe cathodique, augmente également en fonction de la
température et passe de 7 à 40 ~ / cm 2 . En ce qui concerne l'acier inoxydable, ce courant évolue de
5 à 25 ~ / cm 2 . Sur cet acier, on observe encore une passivation spontanée sans pic d'activité
anodique, l'influence de la température sur ce phénomène se traduisant par un accroissement du
courant de passivation (27,5 ~ / cm 2) et une faible diminution de la longueur du palier de passivation
(570 à 540 mv).

2.4. CONCLUSION

L'acier au carbone K55, largement utilisé dans la boucle géothermale, est sensible à la
corrosion généralisée dans ce milieu. En contrepartie, l'acier inoxydable à 13 % de chrome L80
VC13, par sa capacité à se passiver spontanément, apparait plus résistant à ce type de corrosion. En
général la résistance à la corrosion de ce type d'acier repose sur la présence de certains éléments
alliés. La haute teneur en chrome est l'une des causes principales de la passivation de ces aciers
inoxydables.
 E (mv/e.c.s.) E (nw/e.c.s.)

-700 -100--

-800 - 200- -

-900 -300--

-1000 - -400

-1100- - -500 -

-1200- -600- -

-1300--
-700 /

1-----

1 10 1 10

Fi<Jill~ = Courbe cathodique et anodique de l'acier K55 à 5G D C

 E (m v/ e.c .s . ) E (mv/e.c.s.)

-700- - -100

-800- - 200- -

-goo -300 -

-1000 -400-

-1100-- -500 -

-1200- -600- -

-1300 - -700

Figure 29 = Courbe cathodique et anodique de l'acier L80 VC13 à 56°C

 62

Dans la poursuite de l'étude, relative à l'influence des BSR sur la résistance à la corrosion
des métaux, nous avons choisi de travailler sur l'acier K55 pour ne pas compliquer les interprétations
des résultats avec les phénomènes de passivation se manisfestant à la suriace de l'acier inoxydable.
En effet, l'acier au carbone K55 ne comprenant pas d'éléments d'alliage important, on pouvait
espérer un comportement simple, proche de celui du fer. Sa grande sensibilité à la 8orrosion devait
également permettre d'enregistrer des différences évidentes en fonction des conditions opératoires
destinées à caractériser le rôle des BSR.
 SRB

Figure 30 = Principaux mécanismes de corrosion par les BSR

 63

3. SUIVI DU POTENTIEL DE CORROSION DE L'ACIER K55

3.1. INTRODUCTION

La corrosion du fer et des aciers en l'absence d'oxygène et à pH neutre a souvent été

attribuée aux BSR (GAINES, 1910; VON WOLZOGEN KHUR, 1922; BUTLIN et al., 1949 b; KOBRiN,
1976; TUTILE et KANE, 1981; TATNALL, 1981 a, STOECKER, 1984). Ces bactéries n'attaquent
pas directement le métal mais sont susceptibles d'accélérer les processus électrochimiques de la
corrosion. Nous rappelons que dans la littérature, trois mécanismes principaux sont supposés initier
la corrosion anaérobie des métaux ferreux (fig. 30):

1- Dépolarisation cathodique par oxydation biologique de l'hydrogène produit sur la

surface métallique polarisée (VON WOLZOGEN KHUR et VAN DER VLUGHT, 1934) :

4 H2 + S042- ----> HS- + 3 H20 + OH-

2- Stimulation anodique par précipitation des ions ferreux produits à l'anode avec le sulfure
biologique (HADLEY, 1943; WANKLYN et SPRUIT, 1952; STARKEY, 1958) :
Fe 2+ + HS- ------> FeS + H+

3- Formation d'un couple galvanique entre le métal nu et le précipité de sulfure de fer,

jouant le r61e de cathode, avec pour conséquence l'accélération de la vitesse de la réaction
cathodique (KING et al., 1973 a, b; KING et WAKERLEY, 1973; SMITH et MILLER, 1975; MILLER,
1981).

L'étude engagée ici porte donc sur l'influence respective de ces trois phénomènes sur
l'évolution du potentiel de corrosion du métal. l'Jotre choix s'est orienté vers ce type de mesure pour
respecter au maximun les conditions de corrosion na~urelle. En effet, dans la nature les métaux sont
généralement en conditions d'abandon.

Le potentiel de corrosion est le potentiel que prend un métal par rapport à une électrode
de référence dans un électrolyte donné. Il tend généralement vers une valeur stationnaire pour une
certaine durée d'immersion du métal. C'est une grandeur complexe qui n'est pas seulement une
caractéristique du métal mais qui dépend aussi de son état de surface et des conditions
expérimentales, en particulier de la nature, de la concentration, du pH et de la température de la
solution. Oans l'étude qui suit, pour avoir des résultats comparables, nous avons fixé certains de ces
paramètres:
a. La mesure du potentiel que prend un métal par rapport à une solution est impossible
à réaliser directement. Pour pallier cette difficulté on réalise une pile constituée de deux demi-piles:
- métal à étudier-solution
- électrode de référence
 64

Dans notre étude, nous avons choisi l'électrode au calomel / KCI saturé à cause de sa
bonne reproductibilité et de son emploi commode. Cette électrode a été régulièrement vérifiée et
est toujours restée stable. Sauf i~dicat:on co~traire, toutes les valeurs de potentiel seront données
par rapport à cette électrode.

b. Nous avons opéré à température constante en plongeant la cellule de mesure dans

un bain-marie thermostaté. La température choisie (3rC) correspond à la température optimale de
croissance des BSR testées.

c. Le métal utilisé est le même dans tous les cas " il s'agit de l'acier K55. Pour une
bonne reproductibilité des résultats, la surface de l'échantillon a été préparée par polissages
successifs et dégraissage à l'alcool avant chaque expérience. Cependant, cet état de surface va se
modifier au cours du temps en fonction des paramètres étudiés; c'est ce cha~gement que nous
voulons caractériser par ie suivi du potentiel de corrosion.

d. Nous avons utilisé un milieu de base identique (WIDDEL, 1980) dans toutes les
expériences de façon à fixer la nature et la concentration de l'électrolyte. Nous avons essayé de
respecter rigoureusement les mêmes conditions dans chaque essai notamment en ce qui concerne
la concentration des divers éléments entrant dans la composition du milieu. Cependant, au cours de
la croissance des bactéries, certains composants du milieu seront dégradés et en fonction de leur
nature, d'autres métabolites seront synthétisés. Pour pallier cet inconvénient nous avons effectué
certaines expériences de contrôle dans des électrolytes statiques. Nous avons également considéré
que des composés comme le lactate, l'acétate, le fumarate et le succinate, thermodynamiquement
stables, n'intervenaient pas dans les réactions électrochimiques.

e. Le milieu était tamponné, de façon à ce que le pH reste stable et voisin de la

neutralité durant toute la mesure. Ce pH correspond également à l'optimum de croissance des BSR
étudiées. Il a été vérifié systématiquement en début et en fin de manipulations. Il est généralement

constant ou augmente sensiblement de 1 à 2! 10 ème unité pH.

3.2. PROTOCOLE OPERATOIRE

La valeur du potentiel déterminée par une seule mesure n'est pas précise (GOLDOWSKI,
1969). Par conséquent nous avons suivi sa variation par rapport à l'électrode de référence en
fonction du temps. Dans toutes nos expériences, nous avons procédé comme suit:

• Le milieu est préparé directement dans la cellule de mesure sUÎvant le protocole

décrit au chapitre 2. Il est donc stérile, exempt d'oxygène et tamponné à pH 7,2-7,3.
 Figure 31 = Evolution du potentiel de corrosion en milieu stérile

<Ji
~
Q) -600-
~
E
W

- 650- -

- 700--

-750- -
B

- - - ---- Na S
2
=0 mmol.l-1

- 000 - -

12 24 36 40
TE M PS (H)
 65

* L'ensemble est placé dans le bain-marie et une attente j'une demi heure environ est

nécessaire pour l'obtention de la température désirée, dans la masse du milieu.

* Dans les expériences en présence de bactéries, le milieu est inoculé à raison de 10

% v / v avec une préculture en phase exponentielle de croissance .

• L'éprouvette décapée et dégraissée est rapidement introduite dans la solution où

l'électrode de référence et de platine plongent déjà. Cette opération est effectuée sous courant
d'azote pour éviter toute introduction d'oxygène au moment de l'ouverture du passage prévu à cet
effet. Les trois électrodes ont été au préalable stérilisées par un flambage rapide à j'alcool.

* On vérifie le bon fonctionnement des appareils. Les branchements électriques sont

réalisés en ayant eu soin au préalable de faire le zéro entre les 2 connections de l'électrode de travail
et de référence.

* Le potentiel évolue très vite au départ. Environ un quart d'heure 2orès, ii se stabilise.

Pour parfaire l'état de surface de l'électrode. nous avons effectué un traitement électrochimique
cathodique en polarisant pendant 5 mn l'échantillon à - 800 mv, c'est-à-dire à un potentiel légèrement
inférieur à son potentiel d'équilibre. Lorsqu'on coupe la polarisation, le potentiel diminue très
rapidement et revient à une valeur proche de la valeur initiale. Quand il est de nouveau stable
(variation < à 1 mv pour 5 mn) , l'enregistrement de la mesure commence (acquisition de données
automatique).

* Des prélèvements successifs sont réalisés parallèlement à la mesure du potentiel

pour déterminer la croissance des bactéries. Suivant les cas on dose la production d'H2S ou la

synthèse de succinate.

3.3. RESULTATS
3.3.1. ESSAI DANS LE MILIEU STERILE

Nous avons effectué deux types d'essais dans le milieu stérile de WIDDEL (1980), l'un
contenant 0,35 mmol / 1 de Na2S servant à réduire la solution et l'autre en l'absence de su:fure qui a

été remplacé par de la cystéine à une concentration équivalente. Les courbes (fig. 31) obtenues en
50 h d'essai présentent quelques particularités qui seront nos références tout au long de cette
étude. Le potentiel de corrosion initial se situe dans les deux cas autour de -740 mv / e.c.s. Il décroît,
au départ, de 30 mv en 5 h pour se stabliser en quelques heures à -768 mv / e.c.s. En l'absence de
sulfure (courbe B) il se stablise alors que dans le cas contraire il évolue de nouveau et prend une
valeur stationnaire située à -730 mv / e.c.s (courbe A). Les échantillons observés à la fin de la mesure
 66

sont caractérisés par la perte de leur brillance. Dans le milieu contenant du sulfure, la surface est en
outre recouverte d'une pellicule grise-noire pulvérulente qui contribue à son ternissement. Cette
couche s'enlève facilement aussitôt après la sortie de l'échantillon du milieu. Par contre, si on la laisse
sécher, elle devient très adhérente.
Nous signalons que toute référence à ces courbes témoins durant l'étude, ne signifie pas
qu'elles traduisent une absence de corrosion. En effet, au potentiel de corrosion, nous pouvons
simplement considérer que le courant anodique est égal au courant cathodique en valeur absolue
sans pouvoir anticiper sur la vitesse de ces deux réactions. La courbe obtenue dans le milieu
contenant 0,35 mmol / 1 de Na2S (nécessaire pour une réduction efficace du milieu) a été utilisée,

sauf mention contraire, comme courbe témoin du milieu avant introduction des BSR. C'est donc à
cette courbe qu'il faudra se reporter dans les études comparatives.

3.3.2. ESSAI AVEC UNE BSR HYDROGENASE POSITIVE

(Hase+) EN PRESENCE DE SULFATES:

Les expériences suivantes ont été réalisées dans le but de mettre en évidence j'influence
du système enzymatique hydrogénase des BSR sur le potentiel d'abandon de l'acier K55.
Rappelons que cette enzyme est susceptible d'accélérer la vitesse de corrosion en stimulant la
réaction cathodique. Nous avons utilisé une bactérie isolée du fluide géothermal de Creil qui a été
identifiée à Desulfovibrio desulfuricans dont l'étude métabolique a montré qu'elle était Hase+' Le
choix de cette souche se justifie pour des raisons pratiques, son temps de latence étant court et sa
croissance très rapide (t 1/2 = 7 h environ à 37 oC et à pH 7,3) en comparaison avec les autres
souches isolées du puits de Creil se développant à 55 oC. D'autre part nous avions à notre disposition
au laboratoire des souches de collection ayant des caractéristiques proches de cette dernière et
devant cependant nous permettre d'éliminer l'influence de certains paramètres au cours des
différents essais.

La concentration en sulfate, accepteur terminal d'électrons, est constante et présente en

excès. Un métal plongeant dans une solution aggressive comme c'est le cas dans les expériences
décrites ici est, sur le plan électrochimique, analogue à une pile fonctionnant en court-circuit,
c'est-à-dire que les réactions anodiques et cathodiques évoluent simultanément en des points
donnés de sa surface en contact les uns des autres. Par conséquent au cours de nos essais,
l'hydrogène produit par la réaction cathodique est supposé pouvoir servir d'équivalents réducteurs
pour la réduction dissimilatrice du sulfate dans les cultures de BSR.

La présence d'une source organique d'électrons est un facteur important dont l'influence
sur l'utilisation de l'hydrogène cathodique a été montrée par CORD-RUWISH et WIDDEL (198ô).
Effectivement, ces auteurs observent une production significative d'H2S uniquement dans les
 67

cultures bactériennes contenant en plus du métal un donneur d'électrons organique. L'oxydation

simultanée de ce substrat et de J'hydrogène cathodique serait à l'origine de la production de sulfures
dont la concentration mesurée était supérieure à celle espérée sur le donneur organique seul.
Tenant compte de ce résultat , certains tests ont été effectués en présence d'une source
additionnelle d'électrons, le lactate dont nous avons fait varier la concentration, celle-ci étant toujours
le paramètre limitant en solution la croissance de la souche (les bactéries seront en phase stationnaire
de croissance lorsque tout le lactate sera dégradé).

Dans d'autres tests réalisés en conditions de chimiolithotrophie (donneur d'électrons

inorganique), l'acétate présent dans l'inoculum est la source carbonée (lactate = 0 mmol / 1). ~lous

précisons que ce dernier sert exclusivement de source de carbone et n'est dans aucun cas oxydé
suivant le mème processus que le lac,ate.

Si l'on considère l'équation globa:e de la bactérie testée, en remarque que la

concentralion initiaie en lactate détermine celle de l'hydrogène sulfuré mesurée en fin de croissance

2 CH3-CHOH-COO- + S04 2+ - - - > 2 CH3-COO- + HS- + H+ + 2C02

lactâle acétate

D'autre part, il y a proportionnalité entre le nombre de bactéries en fin de croissance et la

concentration initiale en substrat énergétique:

Xf - Xi k (S)i (>Ct et Xi représentent les concentrations finales

et initiales de bactéries dans le milieu)
soit si l'on considère la concentration de l'inoculum (10%) constante et négligeable par
rapport à la concentration finale de bactéries:

Xf = k (S)i

Les figures 32, 33, 34 et 35 montrent les variations du potentiel de corrosion durant la
croissance "en batch" de DesulfovibrÎO desulfurÎcans , respectivement sur 0, 5, 10 et 20 mmol / 1 de

lactate.Sur 10 et 20 mmol / 1 de lactate, la croissance est représentée en mmol / 1 d'H2S produit. On

remarque que les courbes E = f ( t ) sont d'allure générale identique et qu'elles divergent assez
rapidement de celle relative au témoin. Une analyse de chacune permet de distinguer plusieurs
phases dans l'évolution du potentiel:
a. La valeur initiale du potentiel se situe dans les quatre cas entre -750 et -770 mv /
e.c.s.
b. Après une faible diminution du potentiel initial, on obtient un palier relativement
stable à environ -800 mv 1 e.c.s. Durant cette période, la croissance des bactéries n'est pas
détectable.
U'l
U
(1) -600
~
E la
W

- 650-- -
-- 0

-700 - - - 6

si cr i le - - 4

-2

- 0 00 - -

12 24 36 48

TEMPS (Il)

Figure 32 == Evolution du potentiel de corrosion dans une culture de O. desulfuricans

(0 mmol / L de lactate)
en
~
(1)-600--
'>
E
W

- 650- -
t
H2S =2,6 Olmol 1- 1

-700-

-----~--- ----------------------
~- stérile

-750-~_ _

-800- -

12 24 36 48
TE M PS (H)

Figure 33 = Evolution du potentiel de corrosion dans une culture de 0, desulfuricans

(5 mmol / L de lactate)
U)

~
~-600- .,. - -0
>
E
W - -7
W
0::
- 650-- ~.-.~ ::>
_ 6 I.L
..J
::>

/
Cf)

r-

- -5 ~
..J
- 700- - o
:'!
- - 4 :'!

- -3
l
-750- -

- -1
-000- -

12 . 24 36 48
e
• - e croissance bacterienne
TE MPS (H)

Figure 34 = Evolution du potentiel de corrosion dans une culture de D. desulfuricans '

(10 mmol / L de lactate)
 ui
0
(1) - 600- - Q)
'-...... ~

E
:>
• - -10
'0-
::J
::J
(f)
W
r-
I

- 650- - -0
- 8 E
E

- 700- - 6
l
~----------~-------------.
sterile 4
-750- -

- -2

- 800 - -

12 24 36 48
TE MPS (H)

Figure 35 = Evolution du potentiel de corrosion dans une culture de 0. desulfuricans

(20 mmol / L de lactate)
 68

c. Puis il y a inversion du potentiel qui croit très rapidement et régulièrement vers des
valeurs plus positives. Cette période correspond à la phase de croissance exponentielle des
bactéries.
d. La phase précédente se termine par un deuxième palier très pertubé par des
oscillations d'environ 50 mv. Cepencant, l'amplitude des oscillations tend à s'amortir et on peut
considérer, en extrapolant les courbes, que le potentiel se fixe à une valeur stationnaire. Ce plateau
semble se superposer à la phase de ralentissement et à la phase stationnaire de la croissance de la
souche. La différence entre ce palier et celui évoqué en b. est d'environ 160-180 mv! e.c.s.

Nous avons arrêté les enregistrements à la fin de la croissance car seule l'influence de
j'activité des bactéries sur le potentiel nous intéressait.
Dans le tableau ci-dessous nous avons reporté les valeurs nous semblant significatives
dans les courbes d'évolution du potentiel en milieu stérile et inoculé afin de pouvoir mieux juger de
l'influence des BSR.

Tableau 12: Valeurs caractéristiques des courbes d'évolution du potentiel

de corros:on de l'acier K55.

Términ OmM 5 mM 10mM 20mM

Valeur initiale -736 -765 -764 -759 -767

du potentiel (mv)
Valeur minimale -765 -790 -800 -800 -805
(mv)
Valeur maximale -730 -628 -615 -610 -605
(mv)
Valeur stationnaire -730 -628 -640 "-620" -620
(mv)
Pente (mv/ll) 12 28 21 18

T112 (h) 6h4O 5h

(HzS) finale (mM) 0,5 2,6 6,3 10,8

Ecart entre les 2 35 162 160 "180" 185

plateaux (mv)

Ces expériences montrent que le potentiel de corrosion du métal est influencé par
l'activité des bactéries. Cependant, les valeurs de la pente des courbes précédant l'équilibre et la
 69

valeur du potentiel en fin de manipulation ne paraissent pas dépendre de la concentration finale en

solution de l'H2S et des bactéries. En l'absence de lactate nous n'avons pas mesuré la croissance

des BSR, les techniques de dosage n'étant pas assez sensibles pour détecter des changements de
concentrations en sulfure très faibles. Pourtant la courbe d'évolution du potentiel est similaire aux
autres. Cela suggère que les phénomènes observés en solution ne sont pas forcément concordants
avec ceux intervenant à l'interiace métal-solution. En effet, les bactéries ont pu se développer à la
suriace de l'échantillon métallique et la modifier sans que l'on enregistre de changement dans la
solution.

D'autre part, l'observation des échantillons en fin d'expérience, a montré l'existence d'un
dépôt noir, irrégulier et non adhérent, formé sur la surface. Cette couche s'enlève facilement lorsque
l'échantillon est encore humide et devient très adhérente quand on le laisse sécher. Un film de base
très adhérent, sous-jacent au précédent, recouvrait l'électrode et avait pour conséquence le
ternissement de l'acier. Un même constat sera fait dans les expériences suivantes en présence

d'H2S A proximité de l'électrode incubée dans des conditions chimiolithotrophes, nous avons

également observé au bout de 4 jours un voile noir et assez dense. Seul, cet échantillon présentait
des piqures sous le dépôt noir. Ce voile peut correspondre à la corrosion du fer qui en réagissant

avec l'H2S présent dans le milieu (réducteur + H2S produit par les bactéries à l'interface

métal-solution) forme du sulfure de fer en solution.

L'activité hydrogénase des BSR et l'H2S produit pendant leur croissance sont

susceptibles d'avoir un effet sur le potentiel de corrosion et la dissolution du métal. ~~ous avons donc
réalisé une série d'expériences ayant pour but de séparer "influence de ces deux facteurs.

3.3.3. ESSAI AVEC UNE SSR Hase+ EN PRESENCE DE

FUMARATE :

Le but de cette expérience était d'éliminer la production d'H2S durant la croissance de la

souche. Pour cela, on pouvait envisager d'utiliser, comme accepteur final d'électrons provenant de
l'oxydation du lactate, du fumarate à la place du sulfate. L'étude préliminaire du métabolisme de la
souche Oesulfovibrio desulfuricans ,a montré qu'elle est incapable de se développer en présence
de lactate et de fumarate. Ceci nous a conduit à utiliser une autre souche, ayant cependant des
caractéristiques physiologiques et biochimiques très proches de la précédente. Il s'agissait d'une
espèce appartenant au genre Oesulfovibrio dont la température optimale de croissance était aussi de
3rC (JONES et al., 1984; CORD-RUWISH et al., 1986) : Oesulfovibrio fructosovorans. Dans un
premier temps, l'activité hydrogénase de la souche a été vérifiée et montrée positive, en particulier
lorsque le fumarate est utilisé comme accepteur exogène.
 Figure 36 = Evolution du potentiel de corrosion dans une culture de bactérie
Hase+, D. fructosovorans (0 mmol /1 de sulfure)

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12
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-10

-700-
- 8

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stérile

Na2S = 0,35
1 mmol.l- 1
- 6

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\ ~~~~----A 4
\
\ -------.----- ~---------- Na2S:ommol.l-1

\ ------
• B 2
-800
" ""-
---
~----- ---..............
-- - - -----
12 24 36 48
TEMPS (H)
 70

Tableau 13 : Utilisation de l'hydrogène par D. frJCtosovorans

DO finale de la croissance (578 nm)

fumarate 40 mM 0,08

fumarate 40mM + H2-C02 (20-80%)* 0,31

0,03

SO4 2- 40 mM + H -CO 2 (20-80%) * 0,15

2

* présent en excès

Les quatre tests biochimiques ont été inoculés et 1 mrnol;' d'acétate a été utilisée comme
1

source de carbone. On observe une croissance importante en présence d'hydrogène comme

donneur d'électrons à la place du lactate, en particulier lorsque le fumarate est utilisé comme
accepteur d'électrons.

Les deux expériences de suivi de potentiel ont été conduites exactement dans ies
mêmes conditions que précédemment avec 20 mmol / de lactate; Seul le sulfate a été remplacé par
1

40 mmol / 1 de fumarate. La courbe A (fig. 36) a été obtenue en présence d'une concentration de
sulfure équivalente à celle du témoin stérile et la courbe B (fig. 36) en l'absence totale de sulfure.
Dans la seconde expérience, le sulfure destiné à réduire le milieu, a été remplacé par de la cystéine
(0,35 mmol / 1), considérée comme une espèce chimique non active. La croissance de la bactérie
représentée sur la figure 36 par \a disparition du lactate et la production du succinate correspond à la
courbe A.

La comparaison des deux tracés montre que les résultats sont assez concordants.
Cependant, en l'absence de sulfures, la décroissance du potentiel est plus importante et plus rapide.
Puis le potentiel tend vers un équilibre, se situant respectivement à -800 mv et -765 mv! e.c.s. Ces
valeurs sont inférieures de 30 mv à celle prise par le potentiel dans les milieux stériles
correspondants.

Ces deux enregistrements, comparés aux précédents, semblent montrer une nette

influence de l'H2S, mais aussi un effet de l'activité hydrogénase si l'on s'en réfère aux courbes

témoins. En effet l'écart entre les valeurs stationnaires du potentiel obtenues en milieu stérile et
durant la croissance des bactéries Hase+ sur fumarate est considéré comme significatif et ne peut
être attribué qu'à l'existence de ce système enzymatique chez la bactérie.
 Figure 37 = Evolution du potentiel de corrosion en milieu stérile contenant
10 mmol / 1de sulfure

(/)

~
Q) -600-
;-..
E
UJ

-650

-700

-750
lemoins
/

t bactéries en phase stationnaire

-800 _ ajout de I"électrode

12 24 36 48

TEMPS (t-n
 71

L'ensemble des courbes obtenues jusqu'à maintenant nous amène à considérer deux
phénomènes importants, dans leur allure générale:

1. La période précédant l'établissement de l'équilibre final, durant laquelle le potentiel

varie constamment. Il faut donc distinguer, à ce stade de l'exposé, les courbes à potentiels croissants
et celles à potentiels décroissants.
2. La valeur finale moyenne prise par le potentiel de dissolution.

Il est à noter qu'en dehors de l'allure moyenne des courbes, on doit tenir compte, si elles
sont présentes, des oscillations observées sur le palier obtenu en fin d'expérience (courbes 32 à
35). Nous avons tenu à souliÇJner ces différents phénomènes pour pouvoir comparer les résultats
obtenus dans des conditions différentes et en tirer une conclusion quant à l'influence des divers
facteurs étudiés sur le potentiel de dissolution du métal.

3.3.4. ESSAI EN MIllEU STERILE ADDITIONNE DE 10

mmol 1 1 DE Na2S

Il était intéressant d'étudier l'influence du seul H 2 S. Une concentration de Na2S

équivalente à celle produite en fin de croissance sur 20 mmol /1 de lactate, a donc été rajoutée dans
le milieu, dès le début de la mesure. Le pH a été immédiatement réajusté à 7,3 avec une solution
sténle d'HCI 3M. La courbe obtenue (fig. 37 A) montre que le potentiel augmente brutalement et se
stabilise très vite à environ -680 mv / e.c.s., soit 50 mv au dessus du témoin stérile et 60 mv en
dessous de la valeur de potentiel prise en présence de bactéries Hase+ sur 20 mmol /1 de lactate et
sur sulfates.

3.3.5. ESSAI EN PRESENCE DE 10 mmol 1 1 D'H 2 S

PRODUIT PAR VOIE BIOLOGIQUE

Dans cette expérie nce nous avons attendu que les bactéries (Oesulfovibrio desulfuricans,

20 mmol / 1 lactate + S04 2 -) soient en phase stationnaire pour introduire l'électrode de travail et

mesurer l'évolution du potentiel en fonction du temps. Comme dans l'enregistrement précédent, le

milieu contient dès le départ environ 10 mmol / 1 d'H2S, D'autre part on peut considérer que l'activité

des bactéries est nulle. Le potentiel (fig. 37 B) croit lentement et tend asymptotiquement vers -680

mv / e.c.s. Le Na2S chimique semble plus actif que celui produit par voie biologique. Cette différence

peut être liée à la présence d'une concentration élevée de bactéries à la surface de l'électrode dans
la seconde expérience.
 Figure 38 = Influence de la membrane dialysante sur la mesure du potentiel de
corrosion de l'acier K55

vi
~
QJ -600--
;-.
E
W

- 650-
slerile 10 010101.1-1 sulfure

- 700- -

lemoin sler i le
-750--
A

- 000 -

12 24 36 40
TEMPS (If)
 72

Au cours de ces deux enregistrements (fig.37 A et B), il faut souligner que le milieu est
stable car il n'y a pas, durant les essais, de croissance bactérienne avec production progressive

d'H2S, L'ensemble des courbes décrites dans les paragraphes précédents ne sont donc pas tout à

fait comparables entre elles. Dans la suite de ce travail, les influences présumées de l'activité

hydrogénase et de l'H 2 S ont été dissociées, mais suivant un protocole permettant d'avoir une

évolution du milieu parallèlement à une croissance des bactéries.

3.3.6. ESSAI AVEC BSR Hase+ SUR SULFATES, LES

BACTERIES N'ETANT PAS EN CONTACT AVEC
LA SURFACE METALLIQUE

Nous avons supposé ici que les bactéries utilisent l'hydrogène cathodique, non pas à
distance, dans la solution, mais à la surface de l'électrode. Pour éviter la consommation de
l'hydrogène, nous avons placé autour de l'électrode une membrane échangeuse d'ions (tube de

dialyse), située à une distance de la surface d'environ 1 cm. Elle est destinée à laisser diffuser !'H2S

produit en cours de croissance mais à empêcher tout contact physique entre les bactéries et la
surface du métal, ces dernières étant inoculées à l'extérieur du tube de dialyse.
Pour mettre en évidence un effet de cellule éventuel, en particulier du à la séparation des
électrodes de travail et de référence. nous avons recommencé quelques expériences de contràle.

3.3.6.1. Essai en milieu stérile

Avant de considérer la courbe obtenue, précisons quelque peu le protocole opératoire

relatif à la préparation du milieu. Nous rappelons que seulement quelques constituants sont
autoclavés ensemble (sels, oligoéléments, substrat), les autres composantes du milieu étant
stérilisées séparément et ajoutées Dar la suite pour les raisons suivantes:

- Un des passages du couvercle de la cellule reste ouvert pendant l'autoclavage pour

éviter une surpression. Une quantité importante de bicarbonate peut alors s'échapper sous forme de
gaz, par le passage ouvert, durant la stérilisation.
- Le réducteur Na 2 S peut former au cours de la stérilisation des composés toxiques pour
les bactéries avec la matière organique présente dans le milieu.
- Les vitamines et la dithionite se dénaturent à la chaleur.

Nous avons donc introduit ces substances après autoclavage à l'extérieur du sac de
dialyse. Cependant nous avons attendu environ 2 heures avant la mise en route de chaque
manipulation pour leur permettre de diffuser à travers la membrane (jusqu'à la décoloration de la
résazurine dans le tube). La membrane est perméable aux molécules de poids moléculaire inférieur à
12-14000. Cette porosité est suffisamment petite pour arrêter les bactéries.
 Figure 39 = Evolution du potentiel de corrosion lorsque les bactéries Hase+ ne sont
pas en contact direct avec la surface métallique

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-600- -
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16 8

12 24 36 48
TEMPS (H)
 73

La valeur initiale du potentiel en milieu stérile est -730 mv / e,c,s, (Fig, 38, A). Le potentiel
décroit assez rapidement puis se stabilise au bout de 7 heures vers -770 mv! e.c.s. Cette courbe est
similaire à l'enregistrement du potentiel de corrosion dans le milieu stérile exempt de sulfure, en
absence de membrane (Fig. 31, B). Il est probable que cette dernière ait limité la diffusion vers la
surtace métallique, du Na 2S présent en faible concentration (0,35 mmol /1) et ajouté à l'extérieur du
sac de dialyse.

3.3.6.2. Essai en présence de Na2S

Une solution de Na2S a été injectée à l'extérieur du sac à une concentration de 10 mmoll
1. Le milieu est ensuite neutralisé avec une solution d'HCI 3 M. Entre chaque ajoût le pH est contrôlé.
Le potentiel de corrosion (Fig. 38, B) commence par décroître, puis il subit un brusque
accroissement et se fixe à une valeur de - 690 mv / e.c.s., analogue à celle obtenue précédemment
dans le même électrolyte (Fig. 37, A).

3.3.6.3. Essai en présence de bactéries en contact

direct avec la surface métallique

Cette expérience est tout à fait similaire à celle décrite au paragraphe 3.3.2. La bactérie
testée est toujours Oesu/fovibrio desu/furicans sur 20 mmol/l de lactate et sur sulfate présent en
excés mais à une concentration définie (0,3 %). Nous avons injecté 1 13 de l'inoculum dans le tube
de dialyse et 2 13 à l'extérieur de façon à respecter la proportion de 10 % dans chaque volume. La
courbe obtenue présente la même évolution que celle observée sur les enregistrements 32 à 35. La
concentration finale en H 2S dans le sac et la cellule est d'environ 10 mmoi/i.
En conclusion, à partir de ces 3 expériences de contrôle, on peut remarquer que la
membrane échangeuse d'ions n'instaure aucune résistance susceptible de pertuber la mesure du
potentiel.

3.3.6.4. Essai en présence de SSR Hase+ non en

contact avec la surface métallique

La manipulation se déroule exactement dans les mêmes conditions que la précédente à la

différence près que seul le compartiment ne contenant pas "électrode de travail est ensemencé avec
la bactérie D. desu/furicans . Si l'on suppose que les BSR Hase+ utilisent l'hydrogène directement à
la surtace du métal, ce protocole permet de se placer dans le cas d'une BSR Hase -. Nous avons
effectué plusieurs essais dont deux sont présentés dans la figure 39 (B, B'). Dans tous les cas l'allure
générale des courbes est identique même si les tracés ne se superposent pas exactement. Dans un
premier temps on observe une décroissance du potentiel jusqu'à une valeur voisine de -795 mv 1
 Q)

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temps (mn)
Fiçjl..He 4Q = Vitesse de diffusion du Na2S à travers la membrane dialysante
 EiQure 41 :;;; Evolution du potentiel de corrosion dans une culture de BSR Hase-,
D. sapovorans

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l
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4

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12 24 36 48

TEMPS (H)
 74

e.c.s. Puis après une tendance à la stabilisation, il augmente progressivement de 40 mv environ et

prend finalement un niveau stationnaire situé légèrement au-dessus du potentiel mesuré dans le
témoin stérile. La stérilité dans le tube de dialyse a été vérifiée en fin de chaque expérience.

La concentration en H 2 S arrivant au niveau de la surface métallique est influencée dans le

temps par sa diffusion au travers de la membrane dialysante. Le décalage entre l'arrivée de l'H 2 S dans
le sac et la production d'H 2S mesurée dans le compartiment inoculé est à peu près de 2 heures (Fig.
40). Les enregistrements ont été poursuivis suffisamment longtemps pour éventuellement noter un
effet à retardement de l'H 2S par rapport aux courbes précédentes réalisées en présence de Na 2 S ou
en présence de bactéries produisant du sulfure directement au contact de j'électrode. Aucune
influence n'a été observée et le potentiel est resté constant pendant toute la durée de la mesure soit
environ 28 heures après le début de sa stabilisation. Les concentrations en H 2 S, dosées dans la
cellule et dans le sac en fin de manipulations, étaient pourtant équivalentes et respectivement égales
à 10,56 et 9,9 mmol /1.
Ces essais semblent annuler l'effet de l'H 2S et sont en faveur de l'utilisation de l'H 2
cathodique par les BSR à proximité de l'échantillon métallique.

3.3.7. ESSAI AVEC UNE BSR Hase- EN PRESENCE DE

SULFATE
3.3.7.1. Inoculation au départ de la mesure

Toujnurs dans le but de séparer l'influence de l'H 2 S de l'activité enzymatique des BSR,
nous avons testé une bactérie hydrogénase négative. Il s'agit de Desulfovibrio sapovorans
(WIDDEL, 1980). A l'exception de l'enzyme hydrogénase, cette souche possède pratiquement les
mêmes caractéristiques physiologiques et biochimiques que D. desulfuricans , en particulier la même
température optimale de croissance. Le potentiel de corrosion a été mesuré durant la croissance de
cet organisme sur 20 mmol / 1 de lactate en présence de sulfate comme accepteur exogène
d'électrons. La dégradation du lactate effectuée par cette souche étant également incomplète
(oxydation incomplète). la concentration iinale en H 2S est normalement de 10 mmol / 1.

Comme dans tous les enregistrements précédents, la courbe (Fig. 41, A) débute par une
décroissance du potentiel à partir d'une valeur initiale de -732 mv / e.c.s. Sans vraiment se stabiliser,
le potentiel passe par une valeur minimale de -787 mv / e.c.s. et augmente (15 mv / h) ensuite
conjointement avec la croissance de la souche (Fig. 41, B) (Temps de génération = 5 h) pour prendre
une valeur asymptotique de -670 mv i e.c.s. Les potentiels stationnaires mesurés dans les solutions
de Na2S chimique (Fig. 37, A) et d'H 2S produit par voie biologique (Fig. 37, B) sont tout à fait
proches de cette dernière valeur. Par contre en présence de BSR Hase+ sur sulfate (Fig. 32 à 35) le
palier obtenu en fin de mesure se situe à 50 mv au-dessus.
 Eioure 42 = Evolution du potentiel de corrosion dans une culture de BSR Hase-,
O. sapovorans réalisée après immersion prolongée du métal en
milieu stérile

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4
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B5R Hase-
2
-800

12 24 36 48 60 72

Temps ( h )
 75

3.3.7.2. Inoculation après immersion prolongée de

l'échantillon en milieu stérile

Cette expérience avait pour but d'expliquer les diflérences non justifiées, obtenues entre
les 2 essais précédents (courbes 39 et 41). Etant donné que le potentiel évolue très peu dans l'essai
39, nous avons supposé que l'arrivée retardée de l'H 2 S sur la surface métallique permettait une
modification de cette dernière, de telle sorte qu'ultérieurement, l'H 2 S n'aurait pas eu d'influence sur
le potentiel de corrosion.

Pour simuler l'arrivée retardée de l'H 2S, nous avons inoculé les bactéries après obtention
du potentiel stationnaire en milieu stérile (soit après une immersion prolongée de l'échantillon en
milieu stérile). Après ensemencement, le potentiel croit lentement (Fig. 42), simultanément à la
croissance bactérienne, jusqu'à une valeur asymptotiqL.:e de -ô80 mv 1 e.c.s. identique à celle
mesurée en présence d'une BSR Hase· introduite dans le réacteur en même temps que l'électrode.

3.4. ESSAI D'INTERPRETATION DES RESULTATS

Les résultats obtenus montrent que le potentiel à l'abandon du métal varie

considérablement au cours du temps en fonction des conditions opératoires, aucune courbe n'étant
parallèle à l'axe des temps. Même en milieu stérile le potentiel ne s'établit pas immédiatement et
montre ainsi qu'il est illusoire de vouloir caractériser le potentiel de corrosion d'un métal par une
mesure unique effectuée peu de temps après l'immersion.
Pour l'interprétation des courbes de potentiel-temps, il faut distinguer trois phases
distinctes dans l'évolution du potentiel:
- La phase transitoire, commune à tous les enregistrements, qui se traduit généralement
par la diminution initiale du potentiel.
- L'évolution croissante ou décroissante du potentiel de corrosion vers un palier de
stabilité.
- La valeur stationnaire prise par le potentiel après sa croissance présentant dans certains
cas des oscillations.
De manière générale, la variation du potentiel dans le temps est due à la modification de
l'interface métal-solution par formation ou destruction de couches superficielles, la valeur finale du
potentiel étant caractéristique de la surface obtenue.
 Tableau Î 4 = Ensemble des potentiels stationnaires obtenus en
fin d'essai de suivi de potentiel de corrosion

Conditions de culture Potentiel

Sans sulfure Stérile -770 mv/e.c.s.

BSR Hase+ + fumarate -800 mv/e.c.s.

Faible teneur Stérile (0,35 mM sulfure) -730 mv/e.c.s

en su Ifure BSR Hase+ + fumarate -765 mv/e.c.s.
(0,35 mM sulfure)
BSR Hase+ +sulfate + 0 mM lactate -630 mv/e.c.s.
(0 mM sulfure en solution)

Forte teneur BSR Hase+ + sulfate + 5 mM lactate -640 mv/e.c.s.

en sulfure (2,5 mM sulfure)
BSR Hase+ + sulfate + 10 mM lactate -620 mv/e.c.s.
(5 mM sulfure)
BSR Hase+ + sulfate + 20 mM lactate -620 mv/e.c.s.
(10 mM sulfure)

BSR Hase+ + sulfate + 20 mM lactate -740 mv/e.c.s.

Membrane dialysante
(10 mM sulfure)

Stérile (10 mM sulfure) -680 mv/e.c.s.

BSR Hase- + sulfate + 20 mM lactate -680 mv/e.c.s.

(10 mM sulfure)
 76

DECROISSANCE DU POTENTIEL

Sur tous les enregistrements, l'équilibre correspondant au premier plateau est atteint par
des valeurs décroissantes. Il semble qu'on puisse attribuer cette période initiale à la dissolution d'un
film superficiel formé spontanément à l'air sur la surface de l'échantillon avant son immersion dans
l'électrolyte. En effet, GLODOWSKI (1969) préconise les décapages dans les solutions, car selon cet
auteur on ne se trouve jamais en présence d'un métal proprement dit mais d'un métal recouvert d'un
revêtement superficiel. Par conséquent la mesure des potentiels étant essentiellement un
phénomène de surface et l'échantillon ayant été décapé à l'air, on peut en conclure que la valeur
initiale enregistrée correspond au potentiel du film d'oxyde qui le recouvre, Par la suite l'électrolyte
agit non sur le métal lui-même mais sur son oxyde qu'il détruit progressivement pour faire place au
métal nu, la disparition de la couche se traduisant par la diminution du potentiel. Dans le milieu stérile
exempt de sulfure, le potentiel d'équilibre pris après décroissance équivaut donc à celui du métal à
l'état nu.

AUGMENTATION DU POTENTIEL

Le potentiel d'équilibre final est suivant les cas plus élevé ou plus faible que le potentiel
initial. Quand le potentiel devient plus négatif il y a attaque continue du métal. Un potentiel plus positif
traduit généralement un ennoblissement du métal du à la formation d'un film protecteur ou non
protecteur par précipitation de produit de corrosion insoluble à sa surface, Parfois l'existence de ce
film peut traduire un phénomène de passivation qui correspond à une inhibition ou à un
ralentissement du processus de corrosion. Plus le potentiel augmente, plus la protection apportée
par la couche est importante.

POTENTIEL STATIONNAIRE

Les expériences décrites dans ce chapitre ont été réalisées dans le but de confirmer ou
d'infirmer le rôle indirect ou direct des BSR dans les mécanismes de corrosion. Nous avons donc
particulièrement recherché les influences de l'H 2S, du FeS et de l'enzyme hydrogénase, ces trois
paramètres étant les agents corrosifs les plus cités dans la littérature. A la lumière des interprétations
ci-dessus et surtout en se référant à la valeur stationnaire du potentiel de corrosion obtenue en fin
d'essai (Tab. 14), nous allons essayer d'analyser le rôle de chôcun. L'examen des courbes de
potentiel permet de dégager quelques hypothèses qui devront être confirmées ultérieurement par
des expériences complémentaires:

- Le déplacement très net du potentiel vers des valeurs plus positives observé sur les
enregistrements en présence de sulfures (Tab. 14) peut être attribué à la formation d'un film de
sulfure de fer visualisé à l'oeil nu par sa couleur noire. Les diagrammes de POURBAIX (1963)
(diagrammes potentiel-pH) indiquent les conditions théoriques d'immunité, de corrosion et de
passivation d'un système donné et l'équilibre chimique existant entre les différentes espèces de ce
 :r H50
. .
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1

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1
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1

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1

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2 4 6 8 10 12 14
pH

Figure 43 = Diagramme d'équilibre potentiel-pH du système Fer-Soufre, à 25°C

 77
système en fonction du pH. La considération de ce diagramme pour le couple Fe-S dans l'eau à 25°C
(Fig. 43) confirme que "on se trouve effectivement dans le centre du domaine de formation des
sulfures de fer (FeS2)' L'augmentation importante du potentiel suppose que le sulfure de fer apporte
une protection partielle ou totale contre la corrosion. Le potentiel étant plus noble qu'initialement, il
est possible que la surface soit devenue globalement plus cathodique que le fer sous-jacent.

- Les courbes de la figure 36 obtenues après substitutio'l du sulfate par du fumarate de

façon à éviter la production génante d'H 2 S, montrent que le métal subit une attaque continue
puisque la valeur stationnaire du potentiel se situe nettement en dessous du potentiel initial et du
potentiel en milieu stérile (Tab. 14).
Ce résultat semble confirmer le rôle important et protecteur du sulfure de fer. Pourtant
dans cette expérience nous ne pouvons pas écarter l'action de l'activité hydrogénase du fait de
l'accroissement de susceptibilité corrosive du métal dans ce milieu par rapport au témoin stérile (Fig.
44). L'examen du diagramme de POURBAIX pour le système fer-eau à 25°C, montre que l'on se
trouve effectivement dans le domaine du Fe 2 4- (Fig. 44).

- Les expériences qui consistent à simuler l'action d'une BSR Hase-, en empêchant to[,;t
contact physique entre les bactéries Hase+ et la surface métallique sont intéressantes car elles
suggèrent l'utilisation de l'H 2 cathodique directement au contact du métal. En eifet, alors que l'H 2S
diffuse sans difficultés à travers la membrane dialysante pour venir en contact avec la surface
métallique, le potentiel se stabilise sensiblement à la même valeur qu'en milieu stérile suggérant que
c'est l'activité enzymatique des bactéries qui initie la montée de potentiel en présence de sulfure ou
sa décroissance dans les expériences sans sulfure. Ce résultat qui semble annuler le rôle ,jes
sulfures est difficilement explicable puisque dans les solutions de sulfure chimique, le potentiel
augmente jusqu'à -680 mv / e.c.s. Il peut être du à une déficience du protocole adopté, que nous
n'aurions pu mettre en évidence lors des expériences de contrôle.

Ce résultat suggère également l'existence d'une action cumulée du sulfure et de l'activité

hydrogénase. Mais dans ce cas la valeur stationnaire mesurée aurait du être identique au potentiel
obtenu en présence d'une BSR Hase-. Nous pouvons peut-étie l'attribuer à la formation d'hydroxyde
à la surface de l'électrode, due à une immersion assez prolongée de cette dernière en absence de
sulfure (retard dans la diffusion de sulfure à travers la membrane). Le sulfure n'aurait plus aucune
action lors de son arrivée sur ce film pré-existant. Nous avons vérifié cette hypothèse en testant
l'action d'une bactérie Hase- directement au contact de l'électrode. La bactérie a été inoculée aprés
obtention d'un niveau stationnaire en milieu stérile (Fig. 42). La croissance de la souche est très lente
ce qui peut expliquer l'augmentation progressive du potentiel. Cependant celui-ci finit par se
stabiliser asymptotiquement à la même valeur que le potentiel enregistré en présence de 10 mmol / 1

de Na2S ou d'une BSR Hase- ensemencée dès le départ de la mesure (Tab. 14). Cette expérience
ne permet donc pas de conclure à la formation préalable d'un film d'hydroxyde sur la surface du métal.
La différence entre les courbes 39 et 41 traduit probablement l'importance de la
colonisation des surfaces par les bactéries sur l'évolution du potentiel, cette possibilité n'existant pas
lorsque l'accés à l'électrode est rendu impossible par la présence d'une membrane dialysante.
 -2 -1 0 3 4 5 6 7 8 9 la Il 12 13 14 15 16

~~~
~~O --?
b
-11, Z
! 1

1~,~~
l"
I ......l /0~
--1

- 0,4
---O,Sj=---=~ - --- ------j

:
-D,ô
1 i

-~~l
-0,8

~;::l
-1,2

Fe i -1,4

-1,6 1 -1 6
-18 ' i 1-1'3
'-2 -1 a 2 3 4 5 ô 7 8 :3 10 11 12 iJ 14 i5
• ~
:0
1

pH

Figure 44 = Diagramme d'équilibre potentiel-pH du système Fer-Eau, à 25°C

 78

- L'ensemble des courbes relatives à la présence de sulfure présentent la même

évolution. Cependant, malgré cette similitude apparente, il existe des différences notamment en ce
qui concerne la valeur stationnaire prise par le potentiel.

On observe un effet de saturation de la surface par le sulfure, les paliers n'étant

absolument pas fonction de la teneur en sulfure de la solution. Après le recouvrement de la surface
(assez rapide même à faible concentration en ions S2-), les paramètres mesurés en solution sont
probablement indépendants des phénomènes intervenant à l'interface métal-solution.

La montée de potentiel observée dans l'expérience de chimiolithotrophie indique qu'II y a

eu croissance des bactéries à proximité de l'échantillon et donc une synthèse d'H 2 S suffisante pour
provoquer cette évolution. Mais cette production de sulfure signifie également que les bactéries ont
utilisé l'hydrogène cathodique, seul donneur d'électrons disponible pour leur croissance dans ces
conditions. Les piqûres observées sur cet échantillon sont un indice de cette activité. L'importance
de l'activité hydrogénase des bactéries est également soulignée par l'obtention d'un potentiel de
corrosion très élevé après le développement des BSR Hase+ (+ sulfure) en comparaison du potentiel
mesuré dans les cultures de BSR Hase" (+ sulfure) ou dans les solutions de sulfure c:-IÎmique ou
produit par voie biologique (Tab. 14). La présence de lactate n'exclut pas l'utilisation de l'hydrogène.
En effet dans des conditions hétérotrophes où l'hydrogène est disponible, on sait que Oesu/fovibrio
desulfuricans (Hildenborough) utilise préférentiellement l'hydrogène (POSTGATE, 1958, 1960). Le
potentiel de corrosion de - 630 mv environ obtenu dans ces cultures de BSR Hase+ se situe sur le
diagramme de POURBAIX (Fig. 43) au-dessus de la droite représentant la décharge du proton,
c'est-à-dire dans un domaine où cette réaction est thermodynamiquement possible seulement à des
pressions partielles d'hydrogène inférieures à 1. Cela suggère que les bactéries Hase+ sont
capables d'utiliser l'hydrogène à des pressions partielles très faibles.
Ces différences de potentiel peuvent traduire une nature ou une épaisseur de couche
variable suivant la présence ou non d'une hydrogénase.

D'autre part seules les courbes en présence d'une bactérie Hase+ présentent des
oscillations caractéristiques au niveau de leur palier stationnaire. Ces oscillations peuvent traduire
une dissolution périodique du métai. Ce phénomène de périodicité qui est vraisemblablement
entretenu par l'activité enzymatique de la souche, est lié d'après GOLDOWSKI (1969) à l'existence
d'une couche poreuse. En effet si le métal est nu ou au contraire recouvert d'un film superficiel uni,
les pertubations du potentiel ne devraient pas se produire. Par contre, si la couche est poreuse, le
potentiel qu'on enregistre traduit l'hétérogénéité de la surface et se rapporte tantôt à celui du métal,
tant6t à celui de la couche. La durée de nos expérimentations étant relativement courte, nous
n'avons pas pu mettre en évidence la destruction du film, processus observé par BOOTH et al.
(1965) après plusieures semaines d'incubation de "échantillon dans des cultures de BSR.
 79

3.5. CONCLUSIONS

Aucune des expériences décrites dans ce chapitre n'est en elle-même décisive.

Toutefois certains résultats expérimentaux cohérents constituent un faisceau de présomptions en
faveur d'un mécanisme d'action cumulée du sulfure de fer et de l'activité hydrogénase.

Globalement, le métal s'ennoblit dans les solutions de sulfure (H 2 S) et lors de la présence

simultanée de ces derniers et d'une bactérie Hase+. Cette croissance de potentiel semble être la
conséquence de la formation d'un film de sulfure de fer (FeS2) à la suriace de l'échantillon métallique.
Cependant le potentiel final est plus élevé dans les cultures de BSR Hase+ en présence de sulfure,
suggérant l'importance de l'activité enzymatique de ces bactéries.

Dans le milieu stérile et lorsque les bactéries sont physiquement séparées de [a suriace
métallique, le potentiel se stabilise sensiblement à la même valeur située très en dessous de celles
obtenues précédemment. Ce résultat semble annuler l'action des sulfures (H 2 S, FeS2)'

Dans les cultures de BSR Hase+ en l'absence totale de sulfure (H 2 S, ~Ja2S), le potentiel
est très inférieur à celui mesuré intialement et en milieu stérile suggérant une corrosion continue du
métal entretenue par l'activité hydrogénase.

Les expériences décrites jusqu'à maintenant sont intéressantes d'un point de vue
qualitatif. Dans la suite de ce travail nous avons essayé de préciser et en particulier de quantifier les
phénomènes observés en présence et en ['absence de BSR.

4. EVOLUTION DU COURANT DE CORROSION DE L'ACIER K55

DURANT LA CROISSANCE DES BSR

Les expériences suivantes ont été entreprises dans le but d'estimer la corrosion de J'acier
K55 par des mesures de vitesses de corrosion. Deux méthodes ont été utilisées pour calculer ces
vitesses:

. Mesures de perte de poids couplées au dosage du fer en solution.

- Estimation de 1corr à partir des droites de TAFEL obtenues par le tracé des courbes de
polarisation cathodiques et anodiques E = f (Log 1).

La première technique donne une moyenne de la vitesse de corrosion sur toute la durée
de l'essai mais ne permet pas de discerner une évolution en fonction du temps. La seconde
méthode permet une mesure ponctuelle de la vitesse de corrosion à des temps précis.
 Tableau 15 = Vitesses de corrosion en présence et en absence de BSR

Perte de poids (g) dosage du fer vitesse

corrodé de corrosion

pesée pesée en solutO dans les dépots mg/dm2/j

essais initiale en fin d'essa (l1g) de corrosion (l1g)

1 2,6753 2,6768 72,90 (a) 174,20 6,81

milieu
stérile 2 2,6130 - 83,22 (a) - -

3 2,6521 2,6512 75,24 (a) 77,22 4,20

4 2,6207 2,6807 59,28 (a) 97,70 4,33

1 2,5203 2,5193 5,47 (b) 254,3 7,16

Culture
bactéries
2 2,6277 - 6 (b) - -

CD
CD
3 2,5677 2,5666 3,76 (b) 272,7 7,62
3 3
CD
CD C
C
4 2,6229 2,6227 4,33 (b) 248,7 6,98
0
OJ
-,::
(0

Témoin 2,6207 2,6187 - 31,3

-
 8D

4.1. MESURE DE PERTE DE POIDS - DOSAGE DU FER

4.1.1. Conditions d'expérience

Des échantillons de 2,9 cm 2 de surface, décapés et dégraissés, sont suspendus aprés

pesée précise, dans 50 ml de milieu stérile ou dans 50 ml d'une culture "en bat ch" de BSR Hase+ (O.
desu/furicans) produisant des sulfures (lactate 20 mmol/I). Chacun de ces deux essais a été répété
4 fois dans quatre flacons différents.

Le suivi des croissances bactériennes à 37 oC, par la mesure de la production de sulfures,

nous a permis de connaitre avec exactitude le début de la phase stationnaire, ce temps ayant
déterminé celui du retrait des échantillons. Nous avons ainsi mesuré la vitesse de corrosion de l'aCÎer
uniquement pendant la période d'activité de la souche.

Les échantillcns sont par conséquent prélevés aussi bien dans !e milieu stérile que dans
le milieu ensemencé, au bout de 30 h d'incubation. La concentration en H 2 S dans les cultures est
alors de l'ordre de 10,5 mmol / 1. Les produits de corrosion déposés à !a surface des échantillons
pendant les tests sont enlevés par un décapage chimique: les éprouvettes sont rinçées pendant 5
mn dans 5 ml d'une solution d'acide chlorhydrique (d = 1,19) à 50 % en volume contenant 5 g /1
d'héxaméthylène tétramine comme inhibiteur. Un essai à "blanc" est effectué suivant le même
procédé sur un échantillon neuf de façon à évaluer le taux de fer dissout par ce nettoyage. Après ce
traitement, les éprouvettes sont de nouveau pesées avec précision. Des dosages de fer ont été
également effectués:

- Dans les cu~ures et les milieux stériles dans lesquels ont séjourné les
échantillons.
- Dans le milieu frais.
- Dans les inoculums.
- Dans les différentes solutions de décapage ce qui équivaut à la teneur en fer dans les
dépôts de corrosion.
Les solutions ont été acidifiées avec de l'acide nitrique et conservées à 4 oC avant le
dosage.

4.1.2. Résultats et discussion

Les résultats rassemblés dans le tableau 15 montrent la difficulté de la détermination de la

perte de masse en fonction du temps étant donné la faible perte de masse de l'échantillon (environ 1
mg) par rapport à un poids considérable (2,61 g environ). Néanmoins, les vitesses de corrosion ont
pu être calculées précisément à partir des dosages du fer dissout dans les solutions.
 Tableau Î 6 = Vitesses de corrosion mesurées par différents auteurs
en culture batch et en culture continue

Auteurs méthodes souches vitesses de

corrosion
(mg/dm2/j)

Booth et Wormel! cu Iture batch D. desulfuricans

(1 962) perte de poids Hildenborough 5,6
L1anelly 6,6
Teddington 3,9

Cord- Ruwisch culture batch Souches 7,4

Widdel (1986) dosage H2S en Desulfovibrio
presence ou non
de métal

Iverson (1966) culture batch D. desulfuricans 2,5

mesure du courant (API)
entre 2 électrodes

Booth et al. culture D. desulfuricans

(1965) semi-continue Hildenborough 44,9

Booth et al. culture D. desulfuricans

(1966) semi-contînue Hlldenborough 22
L1anelly 22
Teddington 20

Booth et al. culture Souches

(1967) semi-continue Desulfovrio 95 à 221
perte de poids ,

Mara, Williams Culture D. vulgaris 35

(1971) continue
perte de poids

Bell, Chor-Kiang Culture Souches 25 à67

(1981 ) continue Desufovibrio
perte de poids
 81

On remarque que le passage en solution du fer est limité par le produit de solubilité du
sulfure et du fer dans le milieu. En effet, dans les cultures bactériennes produisant du sulfure, la
concentration en fer passé en solution est 14,5 fois inférieure à cette même valeur mesurée en
milieu stérile (0,35 mmol / 1 de sulfure). On peut supposer qu'en présence d'une concentration
importante de sulfure, le fer qui se corrode précipite à la surface de l'échantillon sous forme de dépôt
de sulfure (échantillon noir). Durant la croissance des bactéries, la vitesse de corrosion de l'acier est
plus rapide qu'en milieu stérile.

Les vitesses de corrosion obtenues par cette méthode de dosage sont du même ordre
de grandeur que celles observées par des mesures de perte de poids dans des cultures en "batch"
(BOOTH et WORMWELL, 1962) ou par dosage de l'H 2 S en présence ou en absence d'échantillon
métallique (CORD-RUWISH et WIDDEL, 1986) (Tableau 16). Cependant des vitesses de corrosion 3
à 30 fois supérieures sont observées dans des expérienc8s de cultures se mi-continues (BOOTH et
al., 1965,1966,1967) ou continues (MARA et WILLIAMS, 1J71 : BELL et CHOR KIANG L1M, 1981).

Les montées de potentiel observées précédemment (étude des potentiels de corrosion)

durant la croissance de BSR Hase+ correspondent donc à une dissolution du fer, celle-ci étant plus
faible en milieu stérile où le potentiel reste stable.

4.2. MESURE DE 1 corr PAR EXTRAPOLATION DES DROITES

DE TAFEL - COLONISATION BACTERIENNE DES
SURFACES
4.2.1. Conduite de l'expérience

Dans cette série d'expériences nous avons utilisé deux réacteurs respectivement
destinés aux tracés des courbes de polarisation cathodiques et anodiques. L'observation préalable
de phénomènes de formation de film nous a conduit à tracer indépendamment ces courbes de façon
à ne pas détruire les couches en enregistrant sur le même échantillon, la portion cathodique avant la
portion anodique.

La composition des milieux est identique à celle du milieu utilisé dans les essais
précédents. Dans chaque réacteur nous avons placé un porte-échantillon pouvant contenir entre 5
et 8 échantillons métalliques de dimension 50 x 25 x 3 mm. La surface exposée est de 6,45 cm 2 .
Chaque échantillon peut être indépendamment connecté de l'extérieur des réacteurs, avec
l'appareillage de mesure. Les expériences se déroulent exactement dans les mèmes conditions et
suivant le même protocole que dans les essais de suivi de potentiel d'abandon.

Les mesures ont été effectuées successivement, chaque éprouvette étant testée à une
période d'exposition différente et de plus en plus longue. La croissance bactérienne dans le milieu et
l'évolution du potentiel d'abandon des échantillons ont été contrôlés pendant toute la durée des
 Figure 45 : Evolution des courbes de polarisation cathGdiques dans une culture de
O. desulfuricans

E rnv/e.c.5.

- 600

24 -------------------------- _

- 700 A

~~-=----
- 800

- 900

-1000 - c

-1100

-1200

10
 82

expenences, ce qui nous a permis de déterminer les temps de mesure. L'enregistrement des
courbes anodiques a été limité à un courant de 1 mA 1cm 2 de façon à ne pas saturer la solution en fer
dissout, celui-ci pouvant influer sur la vitesse de corrosion (BOOTH et al., 1968: KING et al., 1973 b).

Pour contrôler les phénomènes se déroulant à l'interface métal-solution, nous avons

étudié la colonisation bactérienne des surfaces métalliques. Cette étude a été conduite,
parallèlement à la précédente, dans un troisième réacteur contenant également une culture
bactériennne dans laquelle plusieurs échantillons ont été immergés (suriace de chaque échantillon =
13,2 cm 2 ). Avant immersion, les échantillons ont été polis et dégraissés mais aussi nettoyés au
dichlorométhane de façon à enlever toute trace contaminante de lipides pouvant intenérer dans la
mesure. Puis ces éprouvettes ont été retirées successivement de la solution pour être analysées.
Les prélèvements ont été effectués simultanément aux mesures électrochimiques.

Pour quantifier la colonisation du support métallique. nous avons dosé les acides gras
des phospholipides bactériens après avoir décroché les cellules de la surface du métal. Le principe
de cette méthode est le suivant:

- Dans les conditions normales, toutes les membranes cytoplasmiques des bactéries
possèdent une proportion relativement constante de leurs lipides sous forme de phospholipides
(WH ITE et al., 1977). Ces phosphOlipides représentent 90 à 98 % des lipides bactériens, soit
environ 50 f1mo1es par gramme de poids sec de bactéries (KING et WHITE, 19ï7; WHITE et al.,
19ï7). Dans notre étude réalisée en culture pure, le dosage des phospholipides est une méthode
qui permet de quantifier le nombre de bactéries qui adhèrent à la surface des échantillons
métalliques testés.
En outre, cette mesure présente l'avantage que les phospholipides bactériens se
dégradent et disparaissent lors de la mort des cellules bactériennes. Lorsqu'il est possible de les
doser, leur mesure constitue donc aussi une mesure de biomasse vivante (WHITE et al., 1977;
WHITE et al., 1979; GUEZENNEC, 1986).
Les phospholipides sont analysés sur la phase organique obtenue lors de l'extraction des
composants du voile biologique par la méthode BLiGH et DYER (1959) (WHITE et al.. 1979;
GUEZENI\JEC, 1986).

4.2.2. Résultats et discussion

Les résultats sont reportés graphiquement sous la forme de courbes de polarisation. Les
figures 45 et 46 représentent la partie cathodique des courbes de polarisation descendantes
déterminées en milieu stérile et durant la croissance de BSR Hase+ dans un milieu de culture
contenant du sulfate (0. desulfuricans isolé du puits géothermique de Creil) ou du fumarate (O.
fructosovorans ). Les figures 47 et 48 présentent la partie anodique des courbes de polarisation
obtenues exactement dans les mêmes conditions que les portions cathodiques.
 E mvje.c.s.

- 600

- 700-

~----------------------------

- 800

A
- 900-
24H (17et 20 H)

15mn
-1000-

-1100
B

-1200

1 10

FiÇJure 46 : Evolution des courbes de polarisation cathodiques dans une culture de

D. fructosovorans
 E mvje.c.s.

-20C

-300

45H

/ 42 H
-400- -
1;i23 H
~--- <H3 H

-500

- 600- -

1H

-700

- 000- -

10

FiQure 47 : Evolution des courbes de polarisation anodiques dans une culture de

D. desu/furicans
 E mv/a.c.s.

-20C

-300

-400

-500

-600

-700

-800

1 10

Eioure 48 : Evolution des courbes de polarisation anodiques dans une culture de

D. fructosovorans
 Tableau 17 = Evolution des quantités d'acides gras à la
surface du métal immergé dans une culture
de O. desu Ifuricans

TO+3h TO+17h TO+20h TO+25h TO+44h

C14:0 703 1285 1359 1618 810

iC15:1 w7c 57 97 110 127 57
iC15:0 483 712 762 981 618
aC15:0 310 532 512 661 412
C15:0 108 247 257 312 182
îC16:0 212 438 459 613 318
C16:1 w7c 789 1501 1528 2012 1007
C16:1w5 - - - - -
C16:0 5307 7923 8083 10520 4509
iC17:1 w7c 1030 1318 1459 2807 912
aC17:1w7c 468 594 682 1008 310
îC17:0 267 378 389 781 215
aC17:0 763 810 989 1510 710
C17:0 197 327 383 512 218
iC18:0 952 1318 1498 2018 1087
C18:1 w7c 1011 1812 2407 2805 1018
C18:0 6818 6518 6879 8302 8327
C19:1 910 1681 1757 2308 618

Nomenclature:

i : iso (a = anteiso)
i C17:1w7c C17 : nombre de carbones
1 : nombre de doubles liaisons
w : position de la double liaison à compter
du carbone terminal
c: cis (t=trans)
 83

On retrouve sur toutes les courbes la même évolution du potentiel déjà observée, dans
des conditions identiques, lors des essais de suivi de potentiel d'abandon de l'acier K55.
En milieu stérile, seule la courbe globale obtenue après 40 h d'immersion de l'échantillon
est représentée. Elle est identique aux courbes enregistrées au départ de l'expérience et aux temps
intermédiaires. Si l'on compare les courbes cathodiques mesurées en milieu stérile et une heure
après inoculation dans les milieux contenant du sulfate et du fumarate, on observe, pour une
surtension de 130 mv, une augmentation de la vitesse de la réaction d'électrode. Celle-ci semble être
fonction de la faible concentration en sulfure présente à ces temps d'immersion:

Milieu [ sulfure] en mmol.l-1 Courant en ~an2

stérile rédJcteur = 0,35 17

sulfate+lactate+8SR réducteur ...inoculum = 1,1 30
furnarate +lactate+8SR o 6

Ces résultats peuvent s'interpréter par une petite dép'olarisation anodique intervenant au
départ juste après immersion des échantillons.

La détermination quantitative, en fonction du temps d'exposition, des différents acides

gras dérivés des lipides bactériens (Tab. 17 et 18), permet de suivre l'évolution du degré de
colonisation bactérienne des surfaces métalliques placées dans le milieu expérimental. Ce suivi de la
colonisation est beaucoup plus précis que les méthodes microbiologiques couramment utilisées qui
peuvent très sensiblement sous-estimer la biomasse bactérienne réelle présente sur le support du
fait de "l'engluement" des bactéries dans le biofilm ou dans les produits de corrosion présents sur les
suriaces (WHITE et al., 1979; GUEZENNEC, 1986).

Un exemple de la différence observée sur les chromatogrammes en fonction du temps

d'exposition des échantillons métalliques est donné sur la figure 49 pour la souche O. desulfuricans
poussant sur le milieu contenant du sulfate. La présence d'une densité bactérienne importante à la
suriace du métal est également mise en évidence par j'observation en fin d'essai des échantillons en
microscopie électronique à balayage (photo 14).
Dans le cas de monocultures comme dans cette série d'expérimentations, il convient
simplement de s'attacher à l'évolution quantitative des principaux acides gras d'origine purement
bactérie nne comme notamment les acides iso et anteiso C 15:0 et C 17:0, les iso et anteiso C17: 1w7c
et acide cis vaccénique C18:1w7c.

La colonisation des substrats métalliques par les bactéries Hase+ diffère selon le milieu
considéré. Il apparaît en effet qu'en présence d'ions sulfates comme accepteurs d'électrons, cette
colonisation est maximum au bout de 25 h pour se stabiliser et diminuer par la suite. Après 44 h dans
 Tableau 18 = Evolution des quantités d'acides gras à la
surface du métal immergé dans une culture
de D. fructosovorans

acides gras TO+15' TO+17h TO+20h TO+24h TO+41h

C14:0 110 1510 1810 2012 2371

iC15:1w7c tr 127 128 312 283
iC15:0 75 812 91ï' 1132 1510
aC15:0 47 563 612 739 1013
C15:0 tr 128 130 127 183
iC16:0 - 318 354 412 518
C16:1w7c 108 1617 1810 2108 2302
C16:0 810 7510 8081 9018 9404
iC17:1w7c 92 1528 1610 1817 2510
aC17:1 w7c 41 710 751 822 1089
iC17:0 27 389 520 611 825
aC17:0 54 871 1010 1213 1514
C17:0 tr 327 318 382 412
iC18:0 108 1583 1810 2011 2514
C18:1w7c 107 1071 1271 1312 1511
C18:1w5 tr 18 907 810 1014
C18:0 5810 8810 8917 8805 9305
C19:1 tr 2310 2100 1800 1713

Nomenclature:

i : iso (a = anteiso)
i C17:1 w7c C17 : nombre de carbones
1 : nombre de doubles liaisons
w : position de la double liaison à compter
du carbone terminal
c : cis (t = trans)
 ,-
.',

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~ "
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r _--

t= 1 7 H
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C·
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"

.~,

-1 r'l •

i~lJ~J~~i~jLllj~ J!\~:;0G;.
Figure 49 = Distribution des acides gras sur les échantillons exposés dans un milieu
inoculé avec O. desulfuricans à différents temps d'exposition

Principaux AG présents: 31 = C14:0; 32 = îC15:1w7c; 35 = iC15:0; 36 = aC15:0;

38 = C15:0; 43 = iC16:0; 31 = C16:1 w7; 48 = CI6:0;
51 = iC17:1 w7c; 52 = aC17:1 w7c; 55 = iC17:0; 56 = aCî 7:0;
60 = C17:0; 65 = iC18:0; 67 = C18:1 w7c; 71 = C18:0;
76 = C19:1 ; 80 = C19:0 (étalon interne)
 84

le milieu, la densité bactérienne présente sur les échantillons est alors proche voire même inférieure
à celle observée après 3 h d'exposition (Tab. 17). En présence de fumarate, il est au contraire
observé une colonisation croissante en fonction du temps des suriaces considérées même si celle-ci
se ralentit après 24 h d'exposition.

La présence d'une densité bactérienne importante à la surface du métal peut

correspondre à une utilisation ce l'hydrogéne cathodique par la population considérée alors que les
bactéries présentes dans la solution utiliseraient I~ lactate rajouté dans le milieu.

Ces différences dans la colonisation des substrats traduisent l'importance de la nature de

l'accepteur d'électrons. Il est possible de relier la diminution de densité bactérienne observée sur les
supports placés en milieu sulfaté, à un effet toxique de l'H 0 8 produit durant la croissance vis-à-vis des
"-

microorganismes considérés. Cette observation suggère le role essentiel que pourrait jouer la
couche passive de sulfure de fer dans la ;Joursuite du processus de corrosion du métal.

Les courbes de polarisation cathodique présentent ég2lement des tracés différents

suivant les conditions de culture, c'est-à-dire suivant la présence ou non de sulfure. Ces tracés, à
l'inverse de la série de courbes correspondant au milieu stérile, montrent une évolution en fonction
du temps d'immersion des éprouvettes métalliques. En présence de suifure produit par les bactéries
à partir de la réduction des sulfates, cette évolution apparaît au début des tracés qui par la suite ont
tendance à se rejoindre quand la surtension est très élevée. Cette évolution qui se concrétise par un
accroissement de l'intensité dans cette zone initiale en fonction du temps d'immersion, peut être
reliée à l'augmentation de la concentration en sulfures progressivement synthétisés au cours de la
croissance des bactéries. Le processus cathodique se déroulant dans cette zone (A, Fig. 45) peut
s'interpréter théoriquement comme suit:
- Il peut correspondre à l'existence d'une réaction de réduction autre que la réduction des
ions H+ de la solution, par exemple la réduction d'un composé déposé à la surface de l'électrode.

A partir de la zone 8 (Fig. 45), la courbe de polarisation cathodique enregistrée peut être
considérée comme une mesure de la résultante des deux réactions de réduction (réduction des
protons de la solution et réduction du ou des composés déposés à la surface du métal) se dérou lant
simultanément à la surface de l'échantillon métallique. Cependant cette zone est régie par une forte
polarisation de diffusion:

- Il est impossible, dans la gamme de potentiel correspondant à cette zone, que la vitesse
de la réaction d'électrode soit limitée par ia diffusion des ions H+ de la solution vers la surface
métallique. En effet, la vitesse de diffusion des protons est encore suffisament rapide pour que la
cinétique soit contrôlée par l'activation (transfert de charge).
 Tableau 19 ~ Vitesses de corrosion en présence de
BSR calculées à partir des droites de
Tafel anodiques

Temps icorr icorr vitesses de corrosion

Milieu d'immersion cathodiques anodiques (Loi de Faraday)
(h) (~lNcm2) (flNcm2) (mg/dm2/jour)

1 3,8 3,9
stérile
3 3,8 3 4,2
19 4 1,3
26 3,4 2

BSR Hase+ 1 10 11
+ 18 DI 5
sulfure 21 DI 3,8
23 DI 4 8,8
25 DI 3,7
42 DI 1,5
45 DI 3,8

B8R Has8+ 15 mn 1 2,5

sans 17 10 10,5
sulfure 20 10 11 25,3
24 10 11
41 8 10

DI = détermination impossible
 85

- Il est également impossible que la cinétique de la réaction d'électrode soit limitée par
l'accumulation d'hydrogène à la surface du métal. En effet, les bactéries colonisatrices de la surface
métallique, susceptibles d'utiliser l'hydrogène cathodique, sont très nombreuses aux temps 17, 20,
24 et 44 h (Tab. 17) : si on considère que la quantité de C16:0 mesurée au temps t = 3 h représente
les phospholipides des bactéries de l'inoculum, on peut estimer que ia densité bactérienne sur la
surface du métal est de 3,2 10 6 bactéries / cm 2 au temps t = 17 h (voir calculs en annexe) et qu'elle
double entre 17 et 25 h (6,43 10 6 bactéries / cm 2).

Il semble donc que dans cette zone la vitesse de la réaction soit régie par une polarisation
de résistance due à la présence d'une couche de sulfure formée à la surface du métal, qui rendrait
difficile la diffusion des protons jusqu'à la surface métallique. On retrouve cet effet de barrière sur la
partie anodique des courbes de polarisation (Fig. 47).
Dans la portion C des courbes de polarisation cathodique (Fig. 45) la réaction d'électrode
est contr6iée par une polarisation d'activation, ce qui suggère que la réaction de réduction du
composé précipité sur fa surface métallique n'interv'ient plus.
En absence totale de sulfure, la tendance des courbes de polarisation cathodique est
classique (Fig. 46). Au départ de la polarisation, la cinétique de la réaction d'électrode est pilotée par
une polarisation d'activation. Aucune réaction secondaire ne se superpose à la réaction de réduction
des protons qui dépend donc du transfert de charge. On constate que pour une même surtension
(par exemple -950 mv), la vitesse de la réaction augmente en fonction du temps d'exposition ce qui
semble traduire l'influence de l'activité hydrogénasique de la BSR testée.

Dans la deuxième phase des courbes, à environ - 1000 mv / e.c.s., on observe un léger
ralentissement de la vitesse de la réaction quel que soit le temps d'exposition. Dans cette zone de
potentiel, le transfert de charge augmente beaucoup parallèlement à la surtension. La vitesse de
diffusion des ions H+, qui reste constante, peut alors limiter la cinétique de la réaction de décharge
du proton.
Les vitesses de corrosion ont été estimées par extrapollation des droites de Tafel
anodiques des coubes de polarisation (Tab. 19). Les phénomènes de diffusion observés sur les
portions cathodiques ont rendu impossible le tracé des droites de Tafel cathodiques. Pour la
détermination de la vitesse moyenne de corrosion, nous avons pondéré les vitesses instantanées
des durées correspondantes
On remarque que la vitesse de corrosion enregistrée en l'absence totale de sulfure durant
la croissance de O. fructosovorans (Hase+) est respectivement 2,9 et 6 fois supérieure à celles
mesurées en présence de sulfure produit pendant la croissance de O. desulfuricans (Hase+) et en
milieu stérile. Cela suggère d'une part l'importance de l'activité hydrogénasique des bactéries dans le
processus de corrosion du métal et d'autre part que la couche de sulfure formée à la surface du métal
ralentit ce processus. Il ne s'agit toutefois que d'un ralentissement puisque la vitesse mesurée en
milieu stérile est 2,1 plus faible qu'en présence de bactéries.
 86

4.3. CONCLUSIONS

Les deux techniques utilisées pour estimer les vitesses de corrosion en présence ou non
de bactéries ont montré que ces vitesses étaient environ deux fois plus élevées dans les cultures
bactériennes produisant du sulfure par rapport à celles mesurées dans le milieu stérile.

Les dosages du fer en solution et dans les dépôts de corrosion après essais de corrosion,
ainsi que l'examen des courbes de polarisation obtenues durant la croissance de B8R Hase +
produisant du sulfure, ont confirmé la formation d'une couche de sulfure à la surface du métal dont
nous avions pressenti l'existence lors des expériences de suivi de potentiel de corrosion de ['acier
K55 en fonction du temps dans ces mêmes conditions. Cette couche semble ralentir le processus de
corrosion du métal, mais les vitesses de corrosion restent néanmoins supérieures dans ces
conditions en comparaison de celles mesurées en milieu stérile. Ce ralentissement peut
correspondre à une baisse de ;'activité hydrogénasique des bactéries à cause de la toxicité qL.:e
semblent provoquer les sulfures présents à forte concentration vis-à-vis de ces bactéries, plutôt qu'à
un phénomène de passivation.

L'influence de "activité hydrogénasique des bactéries dans la corrosion du métal étudié a

été révélée par l'obtention de vitesses de corrosion très importantes dans les cultures sans sulfure,
de bactéries Hase+. La colonisation non négligeable des surfaces métalliques par les bactéries de ce
type suggère que les paramètres mesurés en solution ne sont peut-être pas représentatifs des
phénomènes se déroulant à l'interface métal-solution. En effet les bactéries qui adhèrent sur !e
support métallique peuvent utiliser l'hydrogène cathodique produit au cours de la corrosion du métal
alors que les bactéries présentes dans la solution utilisent le lactate ajouté au milieu. Or le dosage de
l'H 2 8 ou du succinate produit durant la croissance des bactéries correspond plutôt à la dégradation
du lactate.
FiQure 50 Montage de la pile à deux compartiments physiquement séparés.

Inocula lion
steel

~\
elec~rode

iJl'II~_U
c= I II~

: .... -
- -

STERILE
-~-~I
 87

5. INFLUENCE DES BSR SUR L'ETABLISSEMENT D'UN

COURANT ENTRE DEUX ELECTRODES

L'étude des suivis de potentiel de corrosion en fonction du temps nous a montré que
l'écart entre les potentiels stationnaires mesurés en milieu stérile et ensemencé par des BSR Hase-i-
était d'environ 110 mv. Nous avons profité de cette différence pour construire une pile électrique.
Notre idée était de séparer les sites des réactions anodiques et cathodiques, tout en respectant au
maximum les conditions de corrosion naturelle. Ce problème était intéressant car il se produit souvent
dans la pratique. Nous avons donc tenté de mettre en évidence et de quantifier le flux d'électrons
passant entre deux électrodes identiques, l'une exposée au milieu stérile et l'autre au même milieu
inoculé par des BSR. En étudiant séparemment les différents facteurs évoqués antérieurement, Il
était intéressant de déterminer l'influence de chacun sur le sens du courant circulant d'une électrode
à l'autre.

5.1. MONTAGE DE LA PILE ET CONDITIONS EXPERIMENTALES

Nous avons commencé par étudier la force électromotrice (fe.m.) de la pile. Deux types de
montage ont été réalisés:

- La première pile (Fig. 50) est constituée de deux cellules individuelles contenant le milieu
de croissance des bactéries. Elles sont reliées entre elles par un pont KCI saturé assurant le passage
des ions. Ces deux réacteurs sont préparés en même temps suivant les procédures déjà décrites.
Une électrode d'acier K 55 est immergée dans chacun des compartiments. Les deux éprouvettes
métalliques sont identiques (même aire et même préparation de l'état de surface). Le circuit est fermé
en réunissant les deux électrodes par un conducteur électrique. Sur cette boucle nous avons placé
en série un millivolt mètre à résistance d'entrée de 10 12 Q de façon à mesurer le potentiel aux bornes
de la pile en circuit ouvert (une résistance "infinie" équivaut à se mettre en circuit ouvert puisque les
électrons ne pourront pas circuler dans le circuit extérieur).

- La seconde pile ne comporte qu'une seule cellule divisée en deux compartiments par
une membrane échangeuse d'ions placée autour de l'une des électrodes et faisant le même office
que le pont,salin. Le même appareillage de mesure est placé sur le circuit extérieur.

Dans un deuxième temps, nous avons essentiellement travaillé sur le premier montage sur
lequel nous avons remplacé le millivoltmètre par un milliampère mètre à résistance d'entrée assez
faible (10 3 Q) permettant de mesurer le courant de court-circuit de la pile. Une résistance d'entrée
nulle aurait cependant été souhaitable.
 Figure 51 - Evolution de la f.e.m. de la pile: influence simultanée des sulfures et de
l'activité hydrogénase sur la même électrode.

en
~
cD
~ 16 Cf)

E ...
Q)

UJ
+40

B5R 14
-:J

:J
Cf)
..-
1
Q) -
+20 "'0 0
12 C
E
0 E
.....
<.)
sterile 10 :J
0 "'0
...a.0
8
•
-20 inoculation
r
-40
/ 6

2
-60-

12 24 36 48

TEMPS (H)

1_. 1
 88

Les étapes successives décrites ci-dessous précèdent chaque expérience. Nous

n'insistons pas ici sur le protocole de chaque étape car ils sont identiques à ceux utilisés
précédemment.

- Mise en place du montage dans le bain marie thermostaté à 37 oC.

- Introduction des électrodes stérilement et sous flux d'argon.
- Une attente de 2 à 3 heures est souvent nécessaire pour que les deux électrodes se
mettent à l'équilibre. En effet la préparation des échantillons peut induire quelques imperfections et
différences de leur état de surface, provoquant une petite diHérence de potentiel et donc le passage
d'un courant immédiatement après leur immersion. Lorsque ces grandeurs se stabilisent à 0 on
procède à l'étape suivante.
- Ensemencement à raison de 10 % v 1 v de l'un des compartiments avec une pré-culture
de BSR en phase exponentielle de croissance.

La I.e.m. ou le courant de court-circuit de la pile sont enregistrés automatiquement par

acquisition numérique de données. Plusieurs prélèvements sont eHectués au cours du temps,
permettant le suivi de la croissance des bactéries parallèlement à l'évolution des grandeurs
électriques.

5.2. RESULTATS EXPERIMENTAUX - DISCUSSION

5.2.1. MESURE DE LA F.E.M. DE LA PILE

La bactérie testée est Desulfovibrio desulfuricans . Le lactate est utilisé comme donneur
d'électrons organique à raison de 20 mmol / 1. L'hydrogène issu de la réaction cathodique est
également une source potentielle d'équivalents réducteurs pour la réduction du sulfate. Ce dernier,
présent en proportion non limitante, sert d'accepteur terminal d'électrons au cours du
développement de la souche.

La pile à doubles compartiments chimiquement indépendants permet de tester l'eHet

simultané de l'H2S et de l'enzyme hydrogénase des bactéries sur l'une des deux éprouvettes, la

seconde immergée en milieu stérile étant protégée contre l'agression de ces deux paramètres. Dans

le deuxième montage, l'H2S produit dans l'un des compartiments au cours du métabolisme de la

souche peut diHuser dans le second au travers de la membrane dialysante. Par conséquent son
activité s'exerce sur la surface des 2 électrodes alors que l'utilisation de l'hydrogène cathodique n'est
à priori envisageable que dans le compartiment ensemencé.

Les courbes 51 et 52 présentent l'évolution de la f.e.m. de la pile obtenue dans ces deux
cas de figures parallèlement à la croissance des bactéries. Une différence de potentiel de - 15 mv
 Figure 52 :;:: Evolution de le f.e.m. de la pile: influence de l'activité hydrogénase des
bactéries.

(J)

~
(1)

~ 16 (1)
(/)
E
--
~

+40 :J
UJ -:J
14 (/) ~
(1)
'U 0
BSR
+20-

.-- 12 gE
-oJ-S
u
:J
stérif!!...- 10 "0
o o
~

a..
-8
l
inoculation 6

--2
-60 -
--.--.--- 36 48
24
TEMPS (H)
 89

s'établit entre les deux électrodes immédiatement après inoculation. Cette dissymétrie négative
signifie que l'électrode exposée au milieu stérile devient dans un premier temps le pôle positif de la
pile c'est-à-dire la cathode. Simultanément, l'autre échantillon devient l'anode ce qui suppose que le
métal commence à s'y dissoudre. Etant donné que la croissance des bactéries n'a pas commencé,
seul un composé chimique introduit par l'intermédiaire de l'inoculum dans le compartim9nt
ensemencé a pu induire cette dépolarisation anodique. La faible quantité d'H2S synthétisée dans la

pré-culture est peut-être suffisante pour provoquer ce phénomène. Cette stimulation anodique n'est
que provisoire puisque au bout de quelques heures, les pôles de la pile s'inversent et l'électrode
concernée devient progressivement, dès le début du développement de la souche, l'élément
cathodique de la pile.

Au cours de la phase exponentielle des bactéries, une différence de potentiel de 50 mv

s'établit entre les deux électrodes. Cette différence plus faible que celle obtenue par la mesure
individueile des potentiels de corrosion, peut s'expliquer par une résistance sur le circuit instaurée
par le pont salin ou la membrane.

Au départ, l'évolution de la différence de potentiel suit la production d'H2S et

indirectement la biomasse bactérienne. Au cours de la première expérience, la f.e.m. se stabilise

avant la fin de la phase exponentielle de croissance des bactéries et se maintient constante par la
suite. Par contre, sur la figure correspondant à la seconde expérience, on remarque que la
dyssimétrie entre les deux électrodes a tendance à s'annuler. Cette dernière observation est en
première analyse liée à l'élaboration d'une couche de FeS sur les deux électrodes en fin de
manipulation. La membrane dialysante en retardant la diffusion de l'H2S aurait instauré une différence

de potentiel entre les deux éprouvettes, celle exposée directement à l'activité des SSR se
recouvrant progressivement d'un précipité de FeS. Après un temps de latence nécessaire à l'arrivée
de l'H2S et à la formation du film sur j'électrode plongée en milieu stérile, les deux suriaces seraient

devenues identiques. Cette explication, confirmée par le maintien d'une différence de potentiel
entre les deux électrodes lorsque seule l'une d'entre elles est incubée en présence de sulfure, est
en accord avec l'hypothèse que le FeS est plus cathodique que le fer lui-même (MILLER, 1981).

Finalement ces expériences ne nous ont pas permis de discerner l'activité

hydrogénasique des bactéries de l'influence du FeS, ces deux facteurs étant supposés faire évoluer
la f.e.m. de la pile dans le même sens (BOOTH et al., 1968; KING et WAKERLEY, 1973; KING et al.,
1973 a,b).

CONCLUSION INTERMEDIAIRE

L'électrode immergée dans la culture de SSR Hase+ devient cathodique durant la

croissance de ces dernières. Cette protection semble liée en première approximation à la formation
d'un film de sulfures plutôt qu'à l'activité enzymatique de la souche.
 Figure 53 :;:: Influence d'une BSR Hase+ produisant du sulfure.sur l'évolution du
courant de court-circuit de la pile

-4 2

-5 l------~~---_..:...._+------":'t:_-----___:~
12 24 36 48
...
TEMPS (H)
 90

5.2.2. MESURE DU COURANT DE COURT-CIRCUIT DE LA

PILE
5.2.2.1. Influence simultanée de l'activité
hydrogénasique et des sulfures

L'une des cellules a été ensemencée avec Oesulfovibrio desulturicans . Les conditions de
culture sont les mêmes que précédemment. Pour minimiser le déséquilibre introduit au moment de
l'inoculation entre les deux compartiments, le culot bactérien de la pré-culture a été récolté après
c'3ntr i fuQ2tion, puis suspendu dans 2 ml de milieu neuf avant d'être injecté. Malgré cette précaution,
on observe immédiatement après inoculation, l'induction d'un flux d'électrons circulant, dans le
circuit extérieur, du compartiment ensemencé vers le compartiment stérile (Fig. 53 B). L'inversion de
la polarité de la pile coïncide avec le début de la croissance de la souche. Après inoculation, lorsque
les bactéries sont inactives (fig. 53 A), l'électrode en milieu ensemencé devient, comme
précédemment, l'élément anodique de la pile, mais ce comportement se maintient pendant toute la
durée de l'expérimentation. Par conséquent, l'intensité mesurée pendant le développement
bactérien est la résultante de deux courants antagonistes.

- Le premier s'instaure dès l'inoculation et équivaut à un transfert d'électrons du métal

immergé dans la culture de bactéries vers le métal en milieu stérile.
- Le second consécutif au déclenchement de la croissance bactérienne, se superpose en
sens inverse au précédent. Il correspond au passage d'un flux d'électrons véhiculés du
compartiment stérile vers le compartiment bactérien.

Sans qu'î1 soit possible de quantifier j'intensité de ces deux courants, on remarque
cependant qu'ils ont tendance à s'égaliser ce qui se traduit sur la courbe par l'annulation de la densité
du courant. En fin d'expérience, le métal incubé dans la culture de BSR est recouvert d'un dépôt noir
de sulfure. Sous ce dépôt on observe une perte de brillance de l'acier qui peut correspondre à
l'existence d'un film de base très adhérent. La surface de l'électrode exposée au milieu stérile,
présente en plus du ternissement du métal, des traces d'attaque très nettes (photos 12 et 13).
L'aspect de cet échantillon après deux jours d'immersion, suggère "existence d'une "pompe à
électrons" très puissante dans le compartiment bactérien. Effectivement, les phénomènes de
transfert d'électrons sont forcément induits au niveau du métal en contact avec la culture de bactéries
puisque le milieu stérile ne subit aucune évolution dans sa composition durant toute l'expérience.

Pour alléger la suite de l'exposé nous avons adopté les symboles suivants pour nommer
les deux électrodes:

- EE = Electrode plongeant dans le compartiment ensemencé (E).

- ES = Electrode plongeant dans le compartiment stérile (S).

compartiment compartiment
ste r i 1 e ensemense

PHOT012: ETAT DE SURFACE DES ELECTRODES APRES CROISSANCE

DE Oesu/fovlbrio desu/furican DANS L'UN DES

COMPARTIMENTS DE LA PILE.

compartiment compar~ ,men;

sterÎe ensemen e

PHOT013: ETAT DE SURFACE DES ELECTRODES APRES CROISSANCE

DE oesu/fovibrio desulfu(/cans DANS L' UN DES

COMPARTIMENTS DE LA PI LE (électrodes nettoyées)

5pm

PHOTO 14: BACTERIES A LA SURFACE DU METAL INCUBE DANS

UNE CULTURE DE Oesu/fovibrio desu/furicans.

 91

Deux possibilités sont à envisager pour expliquer le départ d'électrons de EE vers ES'

- Dissolution du fer dans le compartiment sous "influence des ions sulfures présents
dans l'inoculum (Fe + HS- -------> FeS + e- ).
- Oxydation à la surface de EE d'une espèce chimique en solution introduite par

l'intermédiaire de l'inoculum.

L'apparence de EE après croissance des bactéries est en défaveur de la dissolution du

fer. Cependant la faible proportion de l'inoculum par rapport au volume du milieu ne nous permet pas
d'admettre la seconde hypothèse.

Durant la croissance des bactéries, un flux d'électrons s'instaure entre les deux
électrodes, dans le sens EE vers ES, signifiant que les deux échantillons deviennent

respectivement J'anode et la cathode de la pile. Ceci est en accord avec l'examen visuel des deux
éprouvettes en fin de manipulation. Cette circulation d'électrons à partir du compartiment ensemencé
peut être attribuée :
- Soit à la réduction d'un composé chimique produit au cours du métabolisme des
bactéries.
- Soit à l'utilisation de ces électrons par les bactéries elles-mêmes.

Considérons l'équation globale du métabolisme des bactéries:

2 CH3-CH(OH)-COO· + S04 2- --------> 2 CH3-G00- + 2 HC03 - + HS- + H+

lactate Acétate

Dans cette réaction il n'y a apparemment aucun métabolite chimique produit au cours de la
croissance des bactéries qui soit susceptible d'avoir consommé des électrons au niveau de la surface
cathodique.

- L'acétate est thermodynamique ment stable.

- Du bicarbonate a été utilisé pour tamponner le milieu. La quantité de HC03- produite (20

mmol / 1) représente seulement 30 % de la concentration totale en ions HC03- présents en fin

d'expérience. Sans être négligeable, cette variation ne peut expliquer ce transfert d'électrons car la
proportion de bicarbonate était importante dès le départ.
- Les ions sulfures synthétisés au cours de la croissance bactérienne représentent le
stade ultime de réduction de cette espèce chimique.
- Le pH reste stable pendant toute la durée de la manipulation. Ceci pourrait être en faveur
de la réduction des ions H+ libérés en solution. Cependant le pH n'évolue pas non plus dans les
cultures de bactéries sans source d'électrons. Cette observation implique que le pouvoir tampon du
milieu est en fait responsable de cette stabilité.
 Figure 54 = Influence des sulfures sur l'échantillon immergé dans le compartiment
stérile de la pile.

-
C\l
:!
16
en
U LU
..............
r.c:
<X: +2 ::>
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z Cf) 1
ct -.J
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0 0
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::> 0 - .....-
10 ....
c
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1- a
-
Cf) 0
-1 8 r.c:
z a..
UJ
a

-2 6 l
-3 4

-4 2

-5 L--------t--------+------..-.....-------~-
12 24 36 48
TEMPS (H)
 92

Par conséquent, seules les bactéries ont pu provoquer ce transfert d'électrons en

consommant l'hydrogène cathodique. Cette utilisation de l'hydrogène correspondant à une véritable
pompe à électrons ( 2 H+ + 2 e- -----> H2 ) est en accord avec la théorie de la dépolarisation

cathodiqüe (VON WOLZOGEN KHUR et VAN DER VLUGT, 1934).

5.2.2.2. Influence des sulfures sur l'anode

L'expérience se déroule suivant le même protocole que précédemment. Mais pour

étudier l'effet de l'H2S dissout comme agent de dépolarisation anodique, nous avons ajouté,

simultanément à l'inoculum, 2 mmol / 1 de sulfure dans la cellule stérile. La figure 54 ne révèle pas de
variation significative du courant de court-circuit de la pile en comparaison de la courbe relative à cette
même mesure obtenue lorsque le compartiment stérile était exempt de sulfures. Ceci suggère que
l'action anodique de l'H2S est négligeable par rapport à l'impact des BSR sur la réaction cathodique.

5.2.2.3. Exclusi on de l'effet du FeS

L'action de dépolarisant cathodique du sulfure de fer a été éliminée en testant une culture
de BSR capable d'oxyder l'hydrogène, mais ne produisant pas d'H2S, Le fumarate est par

conséquent le seul accepteur terminal d'électrons disponible. L'ensemble de la courbe (fig. 55) est
comparable à celle obtenue en présence de sulfure (Fig. 53 B). On observe toujours l'existence des
deux courants antagonistes tels que nous les avons définis précédemment. Cependant l'évolution
de ces courants traversant la pile est moins marquée ce qui semble lié à une croissance plus lente de
la bactérie (reportée sur la courbe par la production de succinate) et de fait à une activité enzymatique
plus réduite. Cette diHérence peut également s'expliquer par l'absence de film de sulfure à la surface
de EE qui, dans le cas où il peut se former, accentue le passage du courant car il est plus cathodique

que le fer resté nu dans le milieu stérile.

5.2.2.4. Exclusion de J'oxydation de l'hydrogène

Dans ces expériences nous avons pratiquement supprimé le courant "négatif" circulant de
la cellule stérile vers la cellule ensemencée. Ce résultat a été obtenu en injectant dans le
compartiment stérile une pré-culture autoclavée, chimiquement identique à l'inoculum actif. A part
cette légère modification de protocole, la courbe B de la figure 56 a été obtenue exatement dans les
mêmes conditions que l'enregistrement présenté sur la figure 53 B. Seul persiste le courant dans le
sens EE vers ES' Il apparait positif et confirme notre raisonnement antérieur selon lequel la seconde

partie des courbes précédentes correspond à la mesure de deux courants se déplaçant en sens
inverse dans la pile.
 -
C'l 32
E
0
...........
ct +2

- :::::L- 28 ro
e
-
(1)

-e
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Loo
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0

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-3 8

-4 4

-5 '---------+---------+--------+--------......--------..
36 48
12 24
TEMPS (h)

~- -- --~---

FÎQlHe 55 = Influence d'une B8R Hase+ sur l'évolution du courant de court-circuit de la

pile en l'absence totale de sulfure.
 •
!~.
-
N
2
+4
,.'1
t'II

u
'-
< B
- ~

t-
Z
+3 6
Cf)
UJ
a:
::J
~ U-
0: ..J_
::J ::J_
O 5 Cf)
1
0 +2 UJ ..J
::J 0 ..J
a z 0
0 :1
...-
-
UJ
t- 4 :1
-
UJ +1 U
::J
Z
UJ inoculation 0
a 0
0:
3 ll.

2
l
- 1
A
1

-2
12 24 36 4b
TEMPS (H)

figure 56 == Influence du BSR Hase - sur l'évolution du courant de court-circuit de la

pile.
 93

La croissance d'une bactérie hydrogénase-négative (O. sapomendens ,fig. 56 C) ne

provoque pas le passage d'un courant significatif (fig. 56 A). L'absence de transfert d'électrons est
confirmée par l'observation des électrodes en fin de mesure. En effet, les deux échantillons sont
recouverts d'un dépôt noir. Sous ce revêtement non adhérent, l'aspect du métal est mat-gris mais 'a
surface des deux éprouvettes est pratiquement intacte. Il est probable que les sulfures présents
dans les deux inoculums (un inoculum stérilisé après culture bactérienne et un inoculum actif) aient
rendu les échantillons plus nobles dès le départ de la manipulation en leur donnant une valeur de
potentiel identique et équivalente à celle mesurée dans les solutions de sulfures lors de l'étude des
potentiels de corrosion (figure 37). Ces deux enregistrements correspondraient alors à la mesure du
courant de court-circuit d'une pile constituée non pas de deux électrodes de métal nu mais par des
électrodes d'acier K55 recouvertes de sulfure de fer.
La différence observée entre les deux courbes A et B (fig. 56) met en évidence
l'importance de l'activité hydogénasique des BSR.

5.3. CONCLUSIONS

Les BSR actives sont capables d'induire un transfert d'électrons entre deux électrodes
d'acier à partir de l'échantillon avec lequel elles sont en contact direct. Cette conclusion résulte des
observations suivantes:

- Dans la pile en circuit ouvert, la surface métallique en contact avec les BSR
devient plus cathodique durant leur croissance. Une Le.m. de· 50 mv s'établit entre les deux
électrodes.
- Dans la pile en court-circuit, j'activité des bactéries provoque le passage d'un
courant corrosif de l'électrode incubée en milieu ensemencé vers l'électrode immergée en milieu
stérile. Seule la seconde éprouvette montre des signes évidents de corrosion indiquant que la
mesure du flux d'électrons dérive de la réaction de dissolution du fer.

L'oxydation de l'hydrogène cathodique semble être le mécanisme corrosif dominant. Ceci

réside dans les principaux résultats suivants:

-Les sulfures dissouts ne stimulent pas la réaction anodique par dépolarisation.

-Le courant corrosif observé en présence de BSR Hase+ ne se développe pas
lorsque des BSR Hase- sont utilisées.
-Les cultures des BSR Hase+ ne produisant pas de sulfure, provoquent également
le passage d'un courant corrosif.

Le rôle du sulfure de fer est néanmoins mis en évidence par le fait que la f.e.m. de la pile
en circuit ouvert a tendance à s'annuler entre les deux électrodes exposées successivement dans le
temps à l'action des sulfures, l'une d'entre elles étant toujours soumise à l'action des BSR Hase +.
 94

6. ETUDE DE L'ETAT DE SURFACE DES ECHANTILLONS EXPOSES

AUX BSR
6.1. PROTOCOLE EXPERIMENTALE

Les analyses de suriace ont été réalisées en spectrométrie à décharge luminescente et

par diffraction de rayons X, sur des échantillons d'acier K55 traités différemment. Les échantillons ont
été immergés pendant 30 heures dans les solutions suivantes:

- Milieu stérile contenant 0,6 mmol / 1de Na2S (réducteur du milieu).

- Milieu stérile contenant 10 mmol / 1de Na2S,

- Culture active de D. desulfuricans (Hase+) additionnée de sulfate comme

accepteur terminal d'électrons (10 mmol / 1d'H2S),

- Culture active de Desulfovibrio (Hase+) additionnée de fumarate comme

accepteur terminal d'électrons.

Après prélèvement des échantillons, ces derniers ont été stockés dans une atmosphère
desséchante de façon à éviter une oxydation de la suriace avant les mesures.

6.2. COMPOSITION CHIMIQUE ELEMENTAIRE DES COUCHES·

DISCUSSION

L'étude des couches déposées à la suri ace des échantillons après immersion dans les
solutions décrites ci-dessus a été effectuée en spectrométrie à décharge luminescente. Le principe
de cette méthode est d'exciter les atomes et les ions présents dans l'atmosphère (argon) comprise
entre deux électrodes. Le matériau à analyser sert de cathode et est bombardé par des ions positifs
(ceux de l'argon) fortement accélérés par le champ électrique élevé qui règne entre les deux
électrodes. Ce phénomène appelé pulvérisation cathodique, correspond à l'érosion du métal. Il y a
émission spectrale par les atomes et les ions arrachés à l'échantillon. Cette émission est
représentative à chaque instant de la composition de la suriace bombardée. Il existe en plus une
proportionnalité directe entre la profondeur du cratère formé à la suriace de l'échantillon et la durée
de la décharge (temps d'érosion) et entre l'intensité lumineuse émise et la concentration en chaque
élément.

Les résultats de ces analyses de spectrométrie en décharge luminescente, illustrés par les
figures 57 à 60, révèlent "existence de couches superficielles d'épaisseurs variables suivant les
milieux dans lesquels ont été immergés les échantillons.
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Figure 58 = Composition de la couche formée à la suriace de l'échantillon immergé en

milieu stérile (10 mmol/ 1de sulfure)
 ... 0
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o
.. si
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E
o
~o
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Figure 59 = Composition de la couche formée à la surface de l'échantillon immergé

dans une culture de 0. desulfun'cans (10 mmol/ 1 de sulfure) '

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f.mps d'.ros:on l, )

Figure 60 = Composition de la couche formée à la surface de l'échantillon immergé

dans une culture de D. fructosovorans (0 mmol /1 de sulfure)
 95

Il faut signaler que nous n'avons pas fait de calibration. Par conséquent, il est possible de
comparer les différentes courbes entre elles mais aucune comparaison ne peut être effectuée entre
2 éléments différents. Les courbes correspondant à l'oxygène et à l'hydrogène ont été amplifiées, ce
qui se traduit par des oscillations importantes du signal, car ces éléments sont présents à l'état de
traces dans les couches formées à la surface du métal. L'oxygène et l'hydrogène présents dans ces
couches peuvent correspondre à une contamination par l'air après le retrait des échantillons du milieu
d'essai.

Les allures des courbes en milieux stériles additionnés de 0,6 et 10 mmol / 1de sulfure et
en présence de bactéries produisant des sulfures sont équivalentes car elles montrent, toutes trois,
un enrichissement en soufre du film recouvrant l'électrode. La présence de soufre correspond,
comme nous l'avions déjà envisagé, à la formation d'un dépôt de sulfure. La présence de fer dans la
couche suggère qu'ils sont précipités' sous forme de sulfure de fer.

Les hauteurs de pics du soufre sont sensiblement identiques dans les milieux contenant
10 mmol / 1de sulfure (milieu stérile + 10 mmol /1 de sulfure et culture bactérienne + S04 2- + 20 mmol

/ 1de lactate) indiquant que la teneur en sulfure est constante sur toute l'épaisseur des couches
formées à la surface de ces échantillons. D'autre part, après croissance des bactéries dans le milieu
additionné de fumarate, on n'observe aucune trace de soufre à la surface de l'échantillon métallique
et en milieu stérile (0,6 mmol /1 de sulfure), la concentration en soufre de la couche est environ 4 fois
plus faible qu'en présence de 10 mmol / 1de sulfure. Il semble donc exister une relation entre les
teneurs en ions S2- de la solution et celles mesurées dans la couche.

D'autre part, ces analyses en spectrométrie à décharge luminescente ont révélé la

présence de fer dans les couches. Ce composé correspond à du fer corrodé et présent initialement
dans la structure alliée de l'acier K55. En ce qui concerne la nature des produits de corrosion, il est
possible d'affirmer d'après la coloration noire des couches et d'après la présence simultanée de fer et
de soufre dans ces couches, qu'il s'agit d'un sulfure de fer, autrement dit que le soufre est combiné
avec les ions ferreux sous forme de sulfure. Le métal étant pratiquement pur, on peut considérer que
sa teneur en fer est de 100 %. La teneur en fer des couches de sulfure mises en évidence par
décharge luminescente est alors d'environ 42 % en poids. Le sulfure de fer formé serait donc de
composition approximative FeS2 ,4,

Les analyses par diffraction de rayons X, réalisées sur les dépôts récupérés par "grattage"
des produits de corrosion placés en milieu fortement chargé en sulfure, ont mis en évidence la
structure amorphe des sulfures formés. Cependant, des analyses identiques des dépôts de
•
corrosion prélevés sur le puits de Creil, ont montré la présence de mackinawite (FeS) et de pyrite
(FeS2) comme composé minoritaire (GOYENECHE et LONGIN, 1981).
 96

En considérant la vitesse moyenne d'érosion d'un acier au carbone, à savoir 1,5 Jlm . mn- 1
et en se basant sur les profils du fer et du soufre, on peut évaluer l'épaisseur des différentes couches
en fonction de leur temps d'érosion (Fig. 61):

1. Milieu stérile (0,6 mmol.l- 1 de sulfure) = 0,375 IJ.m

2. Milieu stérile + 10 mmol.l- 1 de sulfure =0,78 IJ.m
3. Milieu ensemencé (BSR Hase+ + S04 2 - (10 mmol.l- 1 de sulfure) = 1,6 J..lm

4. Milieu ensemencé (BSR Hase+ + fumarate (0 .. .. ) = 0,1 IJ.m

On note que les épaisseurs de couche varient en fonction des conditions opératoires et
qu'elles dépendent de la présence de sulfure dans la solution.

On remarque que la couche formée après production de sulfures par les bactéries est
deux fois plus épaisse qu'en milieu stérile contenant la même concentration en sulfure (10 mmol.l- 1).
On peut admettre que l'épaisseur des couches (produits de corrosion) est proportionnelle à la
quantité de fer corrodé combiné sous forme de sulfure à la surface du métal (On néglige ici le fer
passé en solution car nous avons montré précédemment que, dans les solutions de sulfures, cette
grandeur était faible par rapport à la quantité de fer piégé dans les dépôts de corrosion à la surface du
métal).

En examinant les résultats obtenus précédement, lors de l'étude de l'évolution du

potentiel de corrosion dans les cultures de BSR, on peut remarquer qu'il existe une autre relation
entre l'épaisseur des couches et le potentiel mesuré en fin d'enregistrement (en fin de croissance
des bactéries) : plus la couche est épaisse, plus le potentiel est positif (Fig. 62).
Ces deux relations, Epaisseur de la couche - Fer corrodé et Epaisseur de la couche-
Potentiel en fin d'essai, nous amènent à conclure, par transitivité, que plus le potentiel est élevé, plus
la corrosion du métal est accélérée. Cette triple équivalence pennet les conclusions suivantes:

• Si l'on s'en réfère aux épaisseurs de couches, il y a deux fois plus de fer qui se corrode
par corrosion et reste piégé dans la couche de produits de corrosion, en présence de "activité
hydrogénasique des bactéries et de sulfure qu'en présence de sulfure seul. Cet écart qui se traduit
par une différence de potentiel de 50 mv, ne peut être relié qu'à l'activité enzymatique des bactéries
Hase+. Cette conclusion peut également s'appliquer aux essais avec badéries Hase" comparés aux
expériences en présence de BSR Hase+, puisqu'une même différence de potentiel a été obtenue
entre ces deux cas su r les courbes d'évolution du potentiel.

En accord avec la théorie de la dépolarisation cathodique (VON WOLZOGEN KHUR et

VAN DER VLUGHT, 1934), nous avons montré que l'accélération du processus de corrosion du fer
est en partie due à l'utilisation de l'hydrogène cathodique par les BSR Hase+. Cependant, en
 o o BSR+5ulfate
• Ste ri le + 10 mM S 2 .

* St er i 1e + O. 35 m M S 2-
• BSR + fuma rate

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Figure 61 = Evolution de la teneur en soufre de la couche en fonction des conditions

opératoires

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a.

- 800-

1 2
epaisseur couche (pm)
Figure 62 = Relation entre l'épaisseur des couches et le potentiel stationnaire obtenu
en fin d'essai de suivi de potentiel de corrosion
 97

comparaison du témoin stérile pauvre en sulfure, on peut également attribuer au film de sulfure de fer

formé à la surface du métal dans les solutions riches en H2S, un rôle important dans les processus de

corrosion des métaux ferreux, probablement parce que ce dernier joue le rôle de cathode dans le

couple Fe / FeS (KING et AL., 1973 a,b; KING et WAKERLEY, 1973).

• Toujours en référence aux épaisseurs de couches, la quantité de fer corrodé retenue sur
la surface de "échantillon placé en milieu stérile pauvre en sulfure est 4 fois plus faible qu'en
présence de BSR Hase+ produisant 10 mmol / 1 de sulfure. Ce rapport est probablement erroné car
nous avons trouvé précédement, après essais de corrosion, 14 fois plus de fer en solution dans les
milieux pauvres en sulfures (milieux stériles) que dans les milieux riches. Cependant, les rapports

Fe 2+ (FeS) / Fe 2 + (solution) étant respectivement égaux à 1,3 et 52 (Tab. 15), on peutquand même

en déduire qu'il y a globalement plus de fer qui se corrode dans les cultures bactériennnes qu'en
milieu stérile. Lors des mesures de vitesse de corrosion par extrapolation des droites de Tafel, nous
avons trouvé un rapport de 2,1 .

• En ce qui concerne l'expérience réalisée en l'absence totale de sulfure (BSR Hase-+- +

fumarate), on pourrait conclure, en se reportant à la triple équivalence évoquée ci- dessus, que la
corrosion de l'échantillon métallique est négligeable par rapport aux 3 cas précédents. Cependant,
comme nous venons de le voir dans le paragraphe ci-dessus, peu de fer corrodé est retenu à la
surface du métal plongé dans les solutions très pauvres en sulfure. On peut donc supposer qu'en
l'absence totale de sulfure, la totalité des ions ferreux issus du processus de corrosion, passent en
solution ce qui expliquerait l'absence de produit de corrosion à la surface de l'échantillon considéré.
Pour appuiyer cette supposition, on peut rappeler que dans ces mêmes conditions (BSR Hase+ +
fumarate), nous avons enregistré des vitesses de corrosion très supérieures à celles obtenues en
milieu stérile (rapport de 6). Toujours dans ce cas, lors des suivis de potentiel de corrosion, la
décroissance rapide du potentiel et l'obtention d'un niveau stationnaire situé en dessous du
potentiel mesuré dans le contrôle stérile, nous avait également amenés à conclure à une corrosion
continue du métal, entretenue par l'activité enzymatique des bactéries.

6.3. CONCLUSION

L'augmentation des potentiels de corrosion observée précédemment dans les solutions

de sulfures a été interprétée comme un ennoblissement du métal par la formation d'une couche de
sulfure de fer en surface. Dans cette étude effectuée en spectrométrie à décharge luminescente,
nous avons confirmé l'existence de cette couche.

Cependant, il ne s'agit pas vraiment d'une couche de barrage car, si elle diminue
légèrement le processus de corrosion, elle ne le stoppe pas. On rappelle, en effet, que sa présence
 98

diminue légèrement la vitesse du processus de corrosion comparée à celle mesurée dans un milieu
exempt de sulfure. Par contre, cette vitesse reste supérieure à celle enregistrée en milieu stérile
(0,35 mmol / 1 de sulfure). La stabilisation du potentiel en fin d'expérience correspond donc à
l'obtention d'un état d'équilibre.
Lorsque cette couche est absente, l'activité hydrogénasique des bactéries stimule
d'autant plus la corrosion du métal.
CONCLUSIONS GENERALES
 99

CONCLUSIONS GENERALES

Le travail exposé dans les chapitres précédents a été entrepris dans le but d'étudier, dans
un premier temps, par une approche écologique, les possibilités de participation des SSR aux
dégradations par corrosion des parties métalliques du circuit géothermal, observées sur l'ouvrage
G.C.R.4 de la centrale géothermique de Creil.

Les numérations bactériennes, réalisées au cours de deux enquêtes différentes (puits en

arrêt de fonctionnement et puits en cours de fonctionnement normal) ont permis de mettre en
évidence la présence de SSR aussi bien dans l'eau du réseau que dans les dépôts de corrosion. Les
effectifs, en particulier les BSR thermophiles, étant supérieurs dans les dépôts, il semble que ces
bactéries soient essentiellement fixées aux parois des canalisations sous formes de biofilm. Les
dépôts de corrosion volumineux constituent des niches écologiques stables sous et dans lesquelles
les conditions d'anaérobiose et nutritionnelles (0,3 à 3,5 % de carbone organique et Hydrogène

cathodique) sont favorables à la prolifération des BSR. La vitesse de circulation du fluide géothermal
peut être considérée comme un critère de sélectivité vis-à-vis de la colonisation bactérienne des
surfaces métalliques. En effet, les résultats des dénombrements bactériens ont montré que les BSR
sont plus nombreuses au niveau des zones du circuit caractérisées par une faible vitesse du fluide.
En outre, c'est au niveau de la pompe de production, envahie, suivant le régime d'exploitation du
puits, par une eau stagnante favorable à l'adhésion des bactéries, que les periorations du métal les
plus rapides ont été observées.

La présence de BSR dans le puits géothermique de Creil n'implique pas forcément

qu'elles soient actives dans les conditions in situ et à fortiori qu'elles sont responsables des
processus de corrosion intervenant dans ce biotope. Cependant, l'étude physiologique et
nutritionelle réalisée sur les souches sulfato-réductrices isolées du fluide géothermal de l'ouvrage de
Creil, a révélé qu'une croissance et une activité bactérienne étaient tout à fait compatibles avec les
paramètres physico-chimiques du puits:

-Absence d'oxygène dans "eau et potentiel rédox suffisamment bas dans les
dépôts de corrosion pour permettre le développement des BSR dont le métabolisme est anaérobie
strict.
-pH proche de la neutralité correspondant à l'optimun de croissance des souches.

-Température élevée et équivalente à la température optimale de croissance de 3

des espèces sulfato-réductrices isolées.
 100
-Présence de sulfate, cet ion étant essentiel pour le métabolisme des BSR.

-Présence de matières organiques, soit dans le bassin sédimentaire (aquifère)

alimentant le puits de Creil, soit introduites par adjonction de produits carbonés (stéarate, isobutanol)
dans les boues de forage au moment de la réalisation du puits, permettant un métabolisme
hétérotrophe.

-Présence d'hydrogène cathodique sur la surface des canalisations corrodées.

L'étude taxonomique effectuée sur les souches de BSR obtenues en culture pure a
permis de mettre en évidence, comme c'est souvent le cas dans un biotope peu étudié d'un point de
vue bactériologique, tel que l'eau géothermale de Creil issue de bassins sédimentaires profonds,
deux nouvelles espèces de BSR thermophiles, appartenant au genre Oesulfotomaculum, capables
d'utiliser l'hydrogène comme source d'énergie en présence de sulfates même dans des conditions
d'autotrophie stricte. Toutes les autres souches isolées étaient également Hase+. Or les essais
éllectrochimiques ont montré que ces souches capables d'oxyder l'hydrogène avaient un rôle plus
important dans les processus de corrosion que les souches Hase-.

La bonne adaptation des souches aux conditions qui règnent dans l'aquifère suggère que
leur présence dans le puits est antérieure au forage géothermique. La thèse de "origine autochtone
avait été confortée par les analyses isotopiques du soufre qui ont montré un enrichissement en
soufre 34 sous forme oxydée suite à une activité bactérienne sulfato-réductrice ancienne. Cette
activité a pu soit ne jamais cesser, soit reprendre après la réalisation du forage.

Si la prise en compte des résultats partiels qui sont l'aboutissement des différentes
phases de l'étude écologique (présence de BSR Hase+ dans l'eau et les dépôts de corrosion,
adhésion des bactéries aux surfaces, oxydation de l'hydrogène par les souches en culture pure,
présence de FeS dans les dépôts de corrosion et d'H2S dissout dans le fluide géothermal,

morphologie de corrosion en piqures et en cratères, adaptation des souches à leur environnement)

ne peut indépendament permettre de conclure à une corrosion d'origine bactérienne des portions
du circuit présentant une attaque localisée, il apparait que la synthèse de ces observations tend vers
cette conclusion.

Les résultats des essais de corrosion, effectués en conditions de laboratoire, dans le but
de présicer les mécanismes de corrosion biologique par les BSR, militent également en faveur de
leur intervention dans les processus de corrosion.

Les études de suivi de potentiel d'abandon de j'acier au carbone constituant l'essentiel

des équipements géothermiques, ont mis en évidence l'importance de l'oxydation de l'hydrogène
par les BSR Hase+ dans les processus de corrosion. Cela se traduit par une différence de potentiel
 101

de 50 mv entre les potentiels d'abandon stationnaires obtenus d'une part dans les cultures des BSR
Hase+ produisant du sulfure et d'autre part dans les solutions de sulfure et lors de la présence
simultanée de sulfure et de BSR Hase·. Par ailleurs, les vitesses de corrosion obtenues dans les
cultures de BSR Hase+, en particulier lorsque le milieu est exempt de sulfure, sont supérieures à
celles mesurées en milieu stérile.

La formation d'un film essentiellement constitué d'un sulfure amorphe de composition

approximative FeS2,4 à la surface des échantillons métalliques, mis en évidence lors des analyses de

composition des couches, contribue à l'ennoblissement du métal observé dans ces conditions.
L'étape d'accroissement du potentiel qui précède l'établissement du film, se superpose à la phase
exponentielle des bactéries. La remontée du potentiel correspond à la formation de cette couche de
sulfure et également à l'activité hydrogénasique des bactéries.

Dans les cultures ne contenant pas de sulfure, l'activité de l'hydrogénase des BSR
entretient la corrosion du métal ce qui se traduit par une décroissance du potentiel qui se stabilise à
une valeur inférieure à celle obtenue en milieu stérile (0,35 mmol 1 1de sulfure). Les examens en
spectrométrie à décharge luminescente ont montré qu'aucune couche ne se formait à la surface des
échantillons dans ces conditions, facilitant ainsi le passage du fer sous forme d'ions ferreux dans la
solution.

En poursuivant notre étude, il a été possible de montrer que les vitesses de corrosion,
dans les cultures de BSR Hase+ ne produisant pas de sulfure, sont respectivement 2,9 et 6 fois
supérieures à celles mesurées lors de la présence concomitante de SSR Hase+ et de sulfure et en
milieu stérile, suggérant l'influence positive du film de sulfure de fer sur la résistance à la corrosion du
métal étudié. Cependant il ne s'agit que d'un ralentissement du processus de corrosion. Dans nos
essais de corrosion, ce ralentissement pourrait avoir pour origine une baisse de l'activité
hydrogénasique des bactéries due à la production importante de sulfure dont "effet toxique s'est
traduit par une diminution de la colonisation bactérienne des surfaces en fin de croissance après
culture de bactéries produisant des sulfures.

La nature des couches formées à la surface des échantillons d'acier au carbone en

présence de sulfure (Na2S ou H2S biologique) est identique. Cependant le potentiel du métal est

d'autant plus positif que l'épaisseur des couches est importante. Ce résultat est très important car il
est souvent reproduit dans les cas concrets de corrosion. En effet, la répartition des dépôts de
corrosion est souvent non uniforme, en particulier dans les périodes d'initiation du processus de
corrosion. Si les microcolonies de SSR sont également réparties de manière aléatoire, on se retrouve
dans les mêmes conditions que celles mises en oeuvre dans nos expériences de laboratoire, c'est à
dire couplage entre des zones peu recouvertes et des zones recouvertes d'un dépôt épais. Ces
zones très recouvertes présenterent un potentiel d'autant plus élevé que l'oxydation de l'hydrogène
à leur surface par les SSR Hase+ y est effective.
 102

L'activité cathodique du sulfure de fer a été également mise en évidence dans la

constitution d'une pile biologique devant permettre de séparer les sites des réactions anodique et
cathodique. Une différence de potentiel s'instaure et se maintient lorsque seule une électrode est
en contact simultané avec une BSR Hase+ + sulfure, la seconde étant immergée en milieu stérile,
alors que cette différence a tendance à s'annuler lorsque les deux électrodes sont exposées
successivement dans le temps à l'action des sulfures, l'une d'entre elles étant toujours le siège d'une
oxydation de l'hydrogène par les BSR Hase+.

La colonisation des surfaces par les bactéries est très importante. Cela leur permet
probablement une meilleure utilisation de l'hydrogène cathodique. L'importance de l'adhésion des
bactéries dans la théorie de la dépolarisation cathodique est suggérée, comme en milieu stérile, par
l'absence de croissance du potentiel lorsque les SSR sont physiquement séparées de la surface
métallique par une membrane dialysante. En outre, une BSR Hase- est incapable d'induire un
courant significatif dans une pile biologique constituée par deux électrodes identiques plongeant
dans le même milieu contenant du sulfure. Dans nos essais, les phénomènes se déroulant à
l'interface métal-solution sont probablement indépendants des processus biologiques mesurés en
solution. Cela est suggéré par l'augmentation importante du potentiel de corrosion observé dans le
milieu sans donneur d'électrons organique (lactate). Dans les milieux contenant une source
d'énergie organique, la vitesse de corrosion n'est pas liée à la présence en solution de bactéries qui
dégradent le "lactate mais à la présence de bactéries colonisatrices de la surface métallique qui
oxydent l'hydrogène cathodique directement sur la surface du métal.

Cette étude est une étape préliminaire qui a montré l'importance des BSR dans les
phénomènes de corrosion observés sur le puits de Creil. Les résultats obtenus sont suffisamment
encourageants pour orienter les futures étapes de recherche vers les solutions à apporter à ces
problèmes de corrosion bactérienne. Ces recherches doivent s'orienter vers des traitements curatifs
plutôt que préventifs du fait de l'origine probablement allochtone des BSR ou vers le choix de
nouveaux matériaux. En outre, la contamination de l'eau par des composés organiques est à éviter
dans les furures installations ainsi que les zones d'eau stagnante favorable à la formation de biofilm.

Les techniques électrochimiques associées aux méthodes micro biologiques nous ont
permis de mettre en évidence l'activité corrosive des BSR et en particulier le rôle important joué par
l'enzyme hydrogénase des bactéries Hase+ et également par la couche de sulfure de fer. Ces
techniques pourraient être mises à profit ultérieurement, de manière plus systématique, par exemple
pour diagnostiquer une corrosion biologique dans d'autres cas concrets de corrosion ou pour définir
la meilleure solution à apporter contre cette corrosion au cours d'études comparatives effectuées au
laboratoire: tests de l'activité des BSR vis-à-vis de différents matériaux ou différents bactéricides.
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
 103

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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12-29.
ANNEXE
 ANNEXE

Estimation du nombre de bactéries à la surface des échantillons à partir du dosaQe des acides gras
dérivés des phospholipides bactériens.

Exemple: D. desulfuricans après un temps d'exposition de 25 h, C16:0 = 10520 ng pour la

totalité de la surface.
On considère que la quantité de C16: 0 présente au départ après 3 h d'immersion
correspond aux acides gras des bactéries de l'inoculum. On ôte ce chiffre au précédent, soit 10520 -
5307 = 5213 ng pour la totalité de la surface, soit si la surface de l'échantillon est égale à 13,2 cm 2
395 ng / cm 2
On sait que 98 % des lipides bactériens sont des phospholipides (KING et al., 1977; WHITE et
al., 1977) et qu'il y a environ 50 llmoles de phospholipides par gramme poids sec de bactéries.
PM de C16:0 = 256 9
On a donc 1,54 10- 3 llmoles de phospholipides par cm 2 de suface métallique, soit 30,8 10- 6
llmoles par gramme poids sec de bactéries.
~30,8 10- 6 X 0,23 = 7,OS 10- 6 grammes de bactéries (poids hU!T1ide) par cm 2 .
On sait qu'une bactérie pèse environ 1,10 10- 12 g.
Donc on a : 6,43 10 6 bactéries par cm 2 de surface métallique.
Ce calcul est approximatif car nous n'avons pas tenu compte de tous les acides gras
spécifiquement bactériens présents à la surface de l'échantillon.
 RESUME

Un vaste programme de recherche a été entrepris sous l'impulsion de l'Agence Française pour
la Maîtrise de l'Energie dans le but de déterminer les causes des déteriorations par corrosion observées
au niveau des équipements métalliques des circuits géothermiques exploités en région Parisienne.
Cette étude devait préciser l'importance respective, dans ces phénoménes de corrosion, des
processus physico-chimiques et de l'intervention bactérienne, en particulier de l'incidence des bactéries
sulfato-réductrices (BSR), de façon à justifier ultérieurement, le développement de moyens de lutte
spécifiquement anti-bactériens. Ce travail s'inscrit dans cet objectif et constitue également une
contribution à la compréhension des mécanismes liés à l'attaque des métaux ferreux par les BSR, la
littérature à ce sujet étant très contracdictoire.

Une approche écologique du fluide prélevé sur la centrale géothermique de Creil a permis de
mettre en évidence, par des numérations bactériennes, la présence de BSR aussi bien dans l'eau que
dans les dépôts de corrosion. Quatre espèces différentes de BSR ont été isolées en culture pure et
étudiées d'un point de vue physiologique et nutritionnel : Desulfovibrio desulfuricans,
Desulfotomaculum nigrificans et deux espèces nouvelles, thermophiles, appartenant également au
genre Desulfotomaculum, qui utilisent en particulier les acides gras comme donneurs d'électrons ainsi
que l'hydrogène qu'elles sont capables d'oxyder en l'absence totale de source de carbone organique.
Cette étude a aussi montré que ces souches, bien adaptées aux conditions de l'aquifère (température,
pH, salinité, anaérobiose, potentiel rédox, présence de sulfate et de donneurs d'électrons), pouvaient
avoir une activité in situ et donc être responsables des phénoménes de corrosion des portions du circuit
présentant une attaque localisée observée en particulier au niveau des zones au contact d'eau
stagnante.

Pour mener à bien l'étude des mécanismes de corrosion par les BSR, étude qui constitue la
deuxième partie de ce travail, des techniques électrochimiques de mesure de la corrosion ont été
utilisées et adaptées aux processus biologiques et à la spécificité du milieu considéré. Les différentes
mesures réalisées sur l'acier au carbone (constituant l'essentiel des équipements géothermiques)
immergé en conditions stériles et dans des cultures bactériennes de BSR : suivi du potentiel d'équilibre
du métal, estimation des vitesses de corrosion par dosage du fer corrodé et par extrapollation des
droites de Tafel obtenues après tracé des courbes de polarisation, estimation de la biomasse
bactérienne présentes sur les surfaces métalliques par dosage des phospholipides bactériens,
constitution d'une pile biologique, étude de la composition chimique des couches formées à la surface
des échantillons par spectrométrie à décharge luminescente et par diffraction de rayons X, ont montré
l'importance de l'oxydation de l'hydrogène cathodique par les BSR dans l'accélération des processus
électrochimiques de la corrosion. Les résultats sont en accord avec la théorie de la dépolarisation
cathodique initialement postulée en 1934 par Von Volzogen Kuhr et Van Der Vlugt.

Mots - clés : Corrosion bactérienne, bactéries sulfato-réductrices, géothermie, hydrogénase,

dépolarisation cathodique, sulfure de fer, pile biologique, potentiel d'équilibre.