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THESE
Présentée par
Papa NDIAYE
Président:
M. Omar Thiom THIAW Université Dakar
Membres:
Mme Françoise Le MENN Université Bordeaux 1
M. René Le MENN Université Bordeaux 1
M. Mady NDIAYE Université Dakar
M. Abdoulaye SAMB Université Dakar
M. Meissa TaURE Université Dakar
'.
A la mémoire de mon père.
5tvant-propos
Le présent mémoire est Ce fruit tie nuit années ae coopération partagée entre
['Université CneiR..fi f4.nta Viop de fJ)aKg.r (Sénégal) et CV.nivtrsité (&mieau~ l
(:France) .
Jf fJ)af;g.r U travai{ a été mené sous Ca tiireetion tie Monsieur O.fJ". %iaw,
J
3.1. Introduction 45
3.2. Les colorations en microscopie photonique .45
3.2. 1. Cokxati:Jn à rhémliJxyline '9:Iue0JÇ.liJœ
3.2.2. Coloration à l'hématoxyline de Groat-éosine-vert lumière
3.2.3. Coloration au trichrome de Masson
3.2.4. Coloration par l'azan de Heidenhain
3.3. Résultats de microscopie photonique et électronique 47
3.3.1. Les différents stades de l'ovogénèse .47
3.3.1.1. ovogonies
9vl 9vl Cornet, ingénieur ae redterdu au C9{{/{S aans Ce Laborawire
a'OciaMgrapfiie bio!ogiqu.e, a su mettre sa gentillesse et sa rompéterta à mon
semee dz.aque fvis que cela s'avérait nécessaire.
Je remercie 9vl PfIacon pour fe.s informations qU'if a 6ien voulu me {ivrer sur
f.e. comportem ent aes ftm elles a'Oreoch.rom is nifo tieus.
3.1. Introduction 45
3.2. Les colorations en microscopie photonique .45
3.2. 1. Cokxati:Jn à rhémliJxyline '9:Iue0JÇ.liJœ
3.2.2. Coloration à l'hématoxyline de Groat-éosine-vert lumière
3.2.3. Coloration au trichrome de Masson
3.2.4. Coloration par l'azan de Heidenhain
3.3. Résultats de microscopie photonique et électronique 47
3.3.1. Les différents stades de l'ovogénèse .47
3.3.1.1. ovogonies
3.3.1.2. stade 1
3.3.1.3. stade 2
a) microscopie photonique
b) microscopie électronique
3.3.1.4. stade 3
a) microscopie photonique
b) microscopie éleCTronique
3.3.1.5. stade 4
a) microscopie photonique
b) microscopie électronique
3.3.1.6 sTade 5
3.3.1.7. oeufdans la cavité buccv-pharyngienne en MER
3.3.2. Evolution de la répartition des follicules ovariens en classe de taille .54
3.3.3. Les paramètres morphologiques ovariens 54
3.3.3. J. Rappon gonoov-somarique (RGS)
3.3.3.2. Rappon hépato-somatique (RHS)
3.4. Discussion 55
3.4.l.Les étapes du développement ovocytaire 55
3.4.1.1. Les étapes de la vitellogénèse.
La prévitellogénèse
La vitellogénèse.
3.4.1.2. Les mécanismes de l'endocytose de l.a vireJ/ogénine.
14. J.l Les mœiœs emu:elJukiJr!s du.folJimk O\I~
Elahororion de la wna radia/a
Elaboration des fiiamerus granulosaires.
3.4.2. La répartition des follicules ovariens 62
3.4.3. Les paramètres morphométriques 63
Nous avons transposé sur notre tilapia les diverses techniques mises
au point depuis une vingtaine d'années pour obtenir les outils biologiques
spécifiques pennettant d'aborder l'étude de la reproduction femelle de ce
pOIsson.
Nous avons purifié par des techniques chromatographiques en basse
pression, et électrophorétiques, la vitellogénine contenue dans le sang des
femelles, après l'avoir induite expérimentalement en quantité importante
dans le sang par traitements œstrogéniques.
4
Ch 1 : Présentation de l'espèce
Super-classe Poissons
Classe Ostéichthyens
Sous-classe Actinoptérygiens
Super-ordre Téléostéens
Ordre Perciformes
Sous-ordre Percoïdés
Famille Cichlidae
Genre Oreochromis
Espèce O. niloticus
B mt
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,
I~
,
~
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/',
,
,'~,,
, . ",
.. .
,
1
y
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9
Fig. 1.2.
6
à revoir régulièrement la taxonomie rassemblant actuellement plus de 90
espèces. C'est ainsi que TIlapia nilotica dont seule la femelle pratique
l'incubation buccale, s'est vu regroupé avec tous les tilapias incubateurs
buccaux dans un premier sous-genre : SarotheroCÙJn , qui a été élevé
ensuite, au même titre que TIlapia (incubateur sur substrat), au niveau
générique (Trewavas, 1973).
Fig. 1.3.
7
. le sexe se distingue en examinant la papille génitale qui chez
le mâle est protubérante en forme de cône et porte un pore urogénital à
l'extrémité, alors que chez la femelle, elle est arrondie avec une fente
transversale au milieu (pore génital) et un pore urinaire à l'extrémité.
1.3. Ecologie
1.31. Répartition géographique
L /lI.ly
JO
20
le
c+------.,.--------r---------,,....------,
o 2
" 6
40
3000
B
30
2'JJO
20
<) ..
-'
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1000
r 10
c....L----I~=T_--"""T"""--___._---r--__._-----___.-----4- o
o 2 5 a
"
Fig. 1.4.
8
1.3.2. Alimentation
1.3.3. Croissance
mâle:
A partir du moment où le mâle a réalisé dans le milieu naturel sa
première spermiogénèse vers l'âge de 2 ans, des spennatozoïdes sont
présents en pennanence dans la lumière centrale de chaque testicule.
femelle:
Les phénomènes de reproduction revêtent généralement un caractère
saisonnier et le cycle reproducteur correspond â une adaptation aux
variations de l'environnement
D'après le développement ovocytaire, les poissons Téléostéens
peuvent être classés en 3 types (Nagahama, 1983) :
- les poissons â développement totalement synchrone,
contenant dans les ovaires des ovocytes tous au même stade de
développement. Les femelles ne pondent qu'une seule fois dans leur vie,
puis meurent.
- les espèces â développement synchrone par groupes,
possédant un ovaire constitué par plusieurs populations d'ovocytes. Ces
espèces ne pondent qu'une seule fois par an pendant une saison très
courte.
- les espèces à développement asynchrone, dont la ponte a lieu
plusieurs fois par an pendant une période assez longue.
Oreochronis niloticus se rapproche du troisième cas. Il présente un
ovaire constitué par plusieurs populations d'ovocytes. Les femelles
participent activement à la reproduction pendant toute l'année sauf durant
la courte période de fraîcheur (de mi-décembre à mi-février) comme
nous avons pu l'observer au Sénégal dans les étangs piscicoles de Nianga.
La ponte est fractionnée et elle est immédiatement suivie de la
fécondation. Les ovules sont ovoïdes et n'ont pas de substance collante
comme les tilapias qui pondent sur substrat.
La taille, le poids et le nombre d'oeufs émis augmentent
généralement avec la taille des femelles. Mais à poids égal, le nombre
d'ovules constituant une ponte peut varier de façon importante. En effet,
la fécondité absolue d'O. niloticus (nombre d'ovules pondus en une fois)
est très variable puisqu'elle fluctue fortement comme le montre Moreau
(1979) en fonction :
- du poids dans un même lac (1200 ovules/femelle de loog à 3800
ovules/femelle de 700g)
- et de l'endroit:
. dans le lac Itasy, 650 ovules/femelle de 200g
. dans le lac Mantosoa, 1800 ovules/femelle de 200g.
Babiker et Ibrahim (1979) ont trouvé que la fécondité d'O. niloticus
varie en fonction de la taille: chez les jeunes poissons en reproduction
t 2
Babiker et Ibrahim (1979) ont trouvé que la fécondité d'O. niloricus
varie en fonction de la taille : chez les jeunes poissons en reproduction
(entre 11 et 12,9 cm), elle est comprise entre 300 et 500 ovocytes/poisson
et croît avec la taille pour atteindre 2800 ovocytes/poisson chez les
individus de 29-32 cm, puis décroît avec la taille pour atteindre 800-2100
ovocytes/femelle chez O. ni/oticus de taille supérieure à 55 cm. Le
diamètre des ovocytes est compris entre 1100mm-2200mm, il varie selon
j'état de l'évolution sexuelle.
1 CH : 2 - Matériel et méthodes 1
Pour certains tilapias, des échantillons ont été prélevés sur place et
ramenés au laboratoire de Dakar dans un mélange glace-sel de mer Cà
-12°C) et congelés à -20°C.
D'autres tilapias ont été ramenés vivants au laboratoire de Dakar,
transportés dans un bac adapté, dans leur eau d'origine dont la
température était abaissée à environ 15°C, sous une aération constante
d'oxygène. Au nombre total de 212 ils sont surtout constitués de femelles
assez homogènes, d'un poids moyen de lOOg et d'une taille moyenne de
18,14 cm.
Après un transport nocturne de 6 heures, les poissons sont sexés,
séparés et placés dans des bacs en polyéthylène de 250 litres recouverts de
grillage pour les empêcher de sauter, à raison de 12 poissons d'environ
100 g par bac. L'eau de transport est ajoutée à un même volume d'eau de
ville préparée, déchlorée et aérée en permanence pendant deux jours. Ce
traitement permet de stabiliser la température (24-26°C), l'oxygénation et
le pH. Après 48 heures, l'eau ainsi vieillie est débarassée de la majeure
partie du chlore initial et son pH est stabilisé à 7,5.
15
24 heures après leur arrivée, les poissons sont nourris une fois par
jour ad libitum avec des aliments pour chat (croquettes Friskies enrichies
en calcium et sels minéraux).
Pour éviter l'accumulation des produits toxiques en particulier les
nitrites, reau est filtrée (pompe Rena). Elle est également partiellement
renouvelée tous les deux jours (l/3 du volume environ). Son aération
permanente assure des teneurs en oxygène supérieures à 7 mg.l- 1. Chaque
jour les paramètres physico-chimiques de l'eau sont mesurés avec un kit
pour vérifier les conditions d'élevage.
Le foie est prélevé en même temps que les gonades sur des poissons
mâles et femelles, matures et immatures à des intervalles réguliers (une
fois par mois). Il est pesé comme les gonades à l'aide d'llile balance
électronique, enveloppé dans un papier aluminium, étiqueté et
Q
immédiatement conservé au congélateur à -20 C.
Alcools à ob/mir
95
0
9°° 80 0 70 .1 60 0
~ o' 40° 3°° 20' 10·
-- -- -- -- -- --
- -- -- - -
Nom~rc de \ J'alcool à 1000 . G l , 28 48 73 1°7 1~8 24 2 40 8 9°7
fI.ll dcau à, J'alcool à 9}0 - G 21 39 63 96 144 224 3 82 85~
ajouter à 100 { J'alcool à 900 - 8~ 20G
ml
-- 14 3l 54 13 1 35 6 804
Fig. 2.1.
l6
2.3. Préparations microscopiques
Immédiatement aprés le sacrifice de la femelle, la cavité abdominale est
ouverte et un ovaire est fixé en parallèle pour la microscopie photonique et la
microscopie électronique.
2.3.1./. Fixation
Les techniques utilisées en microscopie photonique sont décrites par
Martoja et Martoja -Pierson (1967) et par Gabe (1968).
Pour les gonades nous avons choisi le liquide de Bouin Hollande et
une fixation de 72 heures.
2.3.1.3. Coupes
Les coupes classiques de 7 IJm d'épaisseur sont faites au microtome.
De sérieuses difficultés ayant été rencontrées pour la confection des
coupes d'ovocytes riches en vitellus, nous avons utilisé le procédé de
Baker (1941) cité par Martoja-Pierson (1967). L'auteur propose de traiter
les blocs entamés, non à l'eau comme dans le procédé classique, mais par
le mélange suivant:
- alcool éthylique à 60 %: 9 volumes
- glycérine 1 volume
Nous avons laissé les blocs entamés séjourner dans cette solution
pendant 48 h, avant de réaliser les coupes.
Les coupes semi-fines sont réalisées à partir de blocs d'Epon pour la
microcopie électronique, à l'ultramicrotome "Ultra eut EU, avec une
épaisseur de 0,95 nm et sont déposées sur lames de verre.
2.3./..4. Coloration
a) Coupes classiques
Préparation des coupes.
Les coupes, imprégrées de paraffme, doivent être déparaffinées et
réhydratées, la coloration se faisant en milieu aqueux.
b) Coupes semi-fines
Le colorations se pratiquent directement SUT les coupes sans
traitement préalable.
La coloration au bleu de toluidine classiquement utilisée pour ces
coupes est préparée comme suit:
solution A : 1 g de bleu de toluidine dans 100 ml d'eau
distillée
solution B : 1 g de bleu de méthylène + 1 g de borax
dans 100 ml d'eau distillée.
solution finale: 112 A + 1/2 B = filtrés
La coloration de Parry a aussi été employée. Cette technique se
pratique en chauffant le colorant (bleu de méthylène à 1% - Azur 2 à 1 %,
111) pour qu'il puisse se fi xer sur le tissu à étudier.
Post-fixateur osmique:
tampon:
concentration finale
osmIUm 1%
cacodylate de sodium 0,1 M
ferricyanure de potassium 1,5%
pH 7,0 et pression osmotique: 655 mOs
Fig. 2.2.
8 1
Après rinçage, elles sont déshydratées dans des bains successifs
d'éthanol (30%) 50%, 70%, 95%, 100%), puis imprégnées dans trois
bains de mélange oxyde de propylène-épon (113 - 2/3 ; 112 - 112 ; 213 -
113). Les pièces séjournent ensuite dans la résine pure pendant toute une
nuit.
L'inclusion a eu lieu le lendemain matin et les échantillons sont
polymérisés à l'étuve pendant 24 h à 60 oC.
b) Perfusion d'ovaire (en France)
Les poissons sont sacrifiés par section bulbaire et rapidement incisés
selon une ligne médioventrale. Un ovaire est dégagé et l'artère ovarienne
cathétérisée en direction de la gonade alors que le coeur continue à battre.
L'extrémité de la gonade est coupée de façon à éviter une surpression du
fixateur dans l'organe.
Le fixateur de perfusion préparé extemporanément et dégazé, est
alors introduit. La progression du liquide est assurée par une pompe
péristaltique dont le flux est réglé à 700 microlitres à la minute. La
perfusion est poursuivie pendant une demi-heure. Puis la partie la plus
durcie de la gonade est découpée en tout petits cubes placés en immersion
dans du fixateur neuf pendant 1 heure, puis rincés dans le tampon
véhicule.
Les pièces destinées à une révélation immunocytochimiques ne sont
pas postfixées à l'osmium. Les autres sont traitées comme précédemment.
2.3.2.3. Contrastage
Elles ont ensuite été contrastées à l'acétate d'uranyle en solution dans
l'alcool à 50% et au citrate de plomb.
2.3.2.4. Observations
Elles ont été effectuées avec les microscopes électroniques à
transmission SIEMENS-ELMISKOP 10] et JEOL 100 eXIl.
2.3.3.2. Déshydratation
Après trois séries de lavage de 30 min dans le tampon phosphate. les
échantiJJons sont deshydratés dans un gradient de solution d'acétone :
acétone 70% 2 fois pendant 30 min
acétone 90% 2 fois pendant 30 min
acétone 90% 2 fois pendant 1 h.
Puis, on les laisse séjourner dans l'acétone pendant une nuit.
2.3.3.4. Observations
Les observations ont été effectuées â Dakar en utilisant un
microscope à balayage JEOL J .S.M. 35C.F.
PC-AT
\.";\1"1<; de l\lIll\~riS;llilll\
~--~.---~
~UIUlAI",""",~~ )~ __
~:~;~;";i~?~)1~:,\-~.\~,--,
IllIprill\:llllC
Fig. 2.3.
20
2.3.4. Microscopie pour analyse d'images
2.3.4.1. Fixation
Le fixateur de Gilson est composé de :
1()() ml alcool à 60%
880 ml H20
15 ml acide ni trique à 68 % (Prolabo 20406)
15 ml acide acétique (Prolabo 20104)
20 g chlorure de mercure (Merck 1447).
tampon gélatiné :
10 ml de tampon phosphate 20 mM à pH 7
100 mg de gélatine en poudre à dissoudre à 40°C
584 mg de NaCl
Ce tampon gélatiné est ajusté à 100 ml avec de l'eau distillée.
tampon phosphate 20 mM à pH 7 :
solution A : NaH2P04 2H20 (Prolabo) (3,1 gll ~ 20 mM)
solution B : Na2 HP04 12H20 (Pro labo) (7,2 g/J = 20 mM)
Pour obtenir un pH de 7, 39 ml de la solution A ont été mélangés à
61 ml de la solution B.
---~--------------------------'
Fig. 2.4.
2 l
2.4. Œstrogénisation
2.4.1. Solutions d'œstrogénisation
2.5.1.1. Principe
Cette méthode permet de séparer les protéines en fonction de leur
différence de mobilité dans un champ électrique à un pH détenniné. Les
protéines migrent en fonction de leur charge nette et de leur taille dans le
tampon de migration à l'intérieur d'un support constitué par un gel de
polyacrylamide. Ce gel est obtenu par polymérisation d'un monomère
principal, l'acrylamide et d'un monomère de liaison, la N- N' éthylène-
bis-acrylamide. La gélification se fait à l'abri de l'air en présence d'un
catalyseur et d'un oxydant.
La technique que nous avons adoptée utilise deux gels différents, gel
supérieur ou gel de concentration à larges pores et un gel inférieur ou gel
de séparation à pores choisis par l'expérimentateur. La taille des
Fig. 2.5
22
pores du gel est inversement proportionnelle à la quantité de
bisacrylamide présente.
La polymérisation des gels se fait avec le système persulfate
d'ammoniumfTemed dont l'action catalysante se manifeste à la lumière
solaire et à une température de l'ordre de 20°C.
POUI un gel à pores définis, la migration des protéines dépend, outre
de leur charge électrique, de leur structure quaternaire.
2.5.1.3. Appareil/age
Dans le cadre de nos travaux, nous avons utilisé:
- un générateur : "Electrophoresis constant power" ECPS
)0001150 (Pharmacia)
- et une cuve verticale: Mini-Protean II System" (Bio-Rad).
11
colorant
Bleu de Coomassie (brillant R250) (Merck) 19
méthanol 400 ml
acide acétique 100 ml
eau distillée 500 ml
décolorant
méthanol 400 ml
acide acétique 100 ml
eau distillée 500 ml
Fig. 2.6.
23
solutions stocks de tampon tris
Deux solutions tris rune de 1,5 M à pH 8,8 et l'autre de 0,5 M à pH
6,8 sont conservées à 4°C pour une durée maximale de deux mois.
les catalyseurs
L'ammonium persulfate (APS) et le Temed (N-N-N'-N'tétraméthyl-
éthylènediamine) se préparent extemporanément.
Fig. 2.7.
24
Après fixation sur le support, le montage est vérifié en versant de
l'eau distillée entre les deux plaques qui doivent recevoir le gel de
polyacrylamide. Slii n'y a pas de fuite, l'eau est éliminée par
renversement et les bords des plaques bien essorés avec du papier
absorbant. Le montage est alors prêt pour abriter les gels.
ampon de
migration
Gel de concentration
Gel de séparation
Sens de migration
(-)
Fig. 2.8.
25
Les échantillons dilués au 1120 avec le tampon d'échantillon sont
vortexés et déposés un à un à raison de 20 JJI par puits dans les 10 puits de
migration, à raide d'une seringue Hamilton bien rincée avec du tampon
de migration entre chaque dépôt. Le dépôt se fait très doucement pour
éviter les turbulences dans chaque puits. Le glycérol contenu dans le
tampon d'échantillon alourdit le poids du dépôt et évite toute
contamination entre les puits.
Les électrodes sont alors branchées. Le générateur est allumé et réglé
à un voltage constant de 120 V pour une seule plaque et 150 V pour deux
plaques.
La migration s'effectue à la température du laboratoire (environ
20°C).
L'électrophorèse est arrêtée quand le frond de migration atteint le
bas du gel de séparation. Elle dure en moyenne une heure dans les
conditions utilisées.
b) Décoloration
Le gel coloré est décoloré. Quand l'éclaircissement du fond paraît
suffisant (environ au bout d'une demi-heure), le gel décoloré est enlevé et
transporté dans une boîte contenant de l'eau distillée et un antibactérien,
de l'azide de sodium (NaN3) (Prolabo) à 0,01 %.
c) Photographie
Les gels sont photographiés sur fond transparent avec un film APX
noir et blanc.
Fig. 2.9.
26
2.5.2.1. PAGE·SDS et PAGE·SDS ~-mercapto
éthanol
Ces sigles correspondent à la désignation de la technique en anglais:
Poly Acrylamid Gel Electrophoresis en présence de SDS.
On peut également rajouter au SDS du B-mercaptoéthanol, agent
réducteur coupant les protéines au niveau des ponts disulfure.
Ainsi les électrophorèses peuvent être effectuées respectivement en
conditions dissociantes non-réductrices ou réductrices .
a) Solutions particulières (Fig. 2.9).
solution de SDS
Les diverses solutions nécessaires à l'élaboration des gels et à la
migration électrophorétique contiennent du SDS.
Elles sont faites à partir d'une solution stock à 10%, conservable à la
température ambiante du laboratoire pendant plusieurs semaines. Placée à
basse température, la solution cristallise et doit être réchauffée.
kit de poids moléculaires
Les conditions électrophorétiques permettent de faire migrer des
molécules de poids moléculaires connus permettant d'établir une courbe
étalon de référence et de connaître le poids moléculaire des sous-unités
des protéines recherchées.
Nous avonsutilisé un kit de poids moléculaires élevés (Biorad) dilué
au 1120ème dans du tampon échantillon et déposé à raison de 5 /JI par
puits. Les molécules sont les suivantes:
myosine: 200 000 Da
B-galactosidase : 116250 Da
phosphorylase b : 97400 Da
albumine bovine sérique : 66 000 Da
ovalbumine: 45000 Da
b) Préparation des gels
On ajoute 50 !JI de SDS 10% et on diminue d'autant la quantité d'eau
distillée utilisée, aussi bien pour fabriquer le gel de séparation à 7 % que
le gel de concentration à 4%.
2.5.2.2. Electroélution
a) Extraction de la bande choisie
Aussitôt après avoir réalisé une électrophorèse dans laquelle la bande
choisie se trouve, on découpe les deux bandes latérales du gel pour les
Fig. 2.10.
27
colorer rapidement pendant que l'autre partie du gel est mise en attente en
atmosphère humide. Les bandes latérales du gel sont alors colorées,
décolorées et réhydratées jusqu'à obtenir la dimension initiale du gel
avant coloration. Elles vont pennettre de choisir la portion du gel où est
localisée la protéine qu'on désire isoler à partir du reste du gel non
coloré.
Ces parties de gel sont coupées au rasoir et hachées au scalpel le plus
finement possible.
h) Cellule d'éleelroéLulion
Chaque cellule d'électroélution est constituée par deux réservoirs
cylindriques de diamètre différent, réunis par un pont de communication
transversal (Fig. 2.10.). La base de chaque réservoir est munie d'une
membrane à dialyse filtrant à 10 000 Da.
Lors d'une électroélution, le matériel à électroéluer est déposé dans
le grand réservoir) côté cathode.(-). Du tampon d'électrophoèse remplit
les deux réservoirs et le pont de communication. Au cours de
l'électroélution, les protéines désirées migreront dans le petit réservoir
placé du côté de l'anode (+) où elles seront récupérées à l'aide d'un
cathéther souple de façon à ne pas léser la membrane de dialyse de
l'anode.
Entre chaque électroélution) les cellules, après rinçage soigneux, sont
remplies et immergées dans de l'éthanol à 70% et conservées à 4°C pour
prévenir tout dessèchement des membranes.
c) PréparaLion des soLutions (Fig. 2.11).
Différents tampons sont préparés à partîr du bicarbonate
d'ammonium (NH4 )HC03 sous l'abréviation (AHC). Ils sont stockés et
prêts à être dilués au moment de l'emploi:
d) Installation des cuves (Fig. 2.10).
Les deux cuves sont placées côte à côte. Elles sont remplies de
tampon d'électroélution : 0,05 M (AHC4) + 0,1% SDS à raison de 600
ml par cuve. La mise à niveau du tampon des deux cuves est effectuée à
l'aide d'un cathéter en T pendant 10 min
e) Préparation des échantillons (Fig. 2. 10.)
Les bandes identifiées et hachées sont placées dans le grand réservoir et
recouvertes de 100 !JI de tampon concentré (ACH 1). Puis, le tampon
d'élut ion (AHC 4) est introduit dans l'ensemble de la cellule à partir du
petit réservoir par inclinaison pour éviter la formation des bulles d'air et
pennettre à ce tampon de passer dans le grand réservoir. Les cellules sont
remplies juste au-dessus du pont de communication et bouchées
simultanément. Chaque cellule est posée à cheval entre les deux cuves
tampon de transfert
pour PAGE natif :
tris base 48 mM 5,8 g
glycine 39mM 2,93 g
méthanol 20% 200 ml
eau distillée qsp 1000 ml
Le pH est ajusté à 8,3 avec HCI.
pour PAGE-SDS
on rajoute
duSDS 0,035% 375 mg
Fig. 2.11.
28
d'électrophorèse, le grand réservoir côté de la cathode et le petit côté de
ranode. Les fonds des réservoirs baignent dans le tampon
d'électrophorèse (AHC 1) de chacune des cuves de façon à ce que le
courant puisse passer.
Les bulles d'air qui auraient pu se coincer sous les membranes de
dialyse sont éliminées par aspiration avec une seringue munie d'une
aiguille courbe.
.n Conditions électriques
Le générateur est réglé à 50 V. La puissance affichée par cellule est
de l'ordre de 4 à 6 mA. Le temps de séparation des protéines est de
l'ordre de sept heures. Le voltage du générateur commence à changer
lorsque les protéines s'accumulent du côté du petit réservoir.
g) Récupération des protéines
Les protéines électroéluées sont récupérées dans le petit réservoir à
l'aide d'une seringue munie d'un cathéter afin de ne pas percer la
membrane de dialyse. Elles sont concentrées à l'aide d'une cellule Amicon
coupant à 30 ()()() Da.
Une aliquote sert pour contrôle électrophorétique sur PAGE-SnS, et
une autre est utilisée pour détenniner par Bradford (1976), la quantité de
protéines récupérées.
S.2.2.3. Electrotransfert
Le principe est de transférer les protéines séparées sur gel de poly-
acrylamide sur un support pennettant des révélations ultérieures non
réalisables sur le gel.
a) Support de transfert
Nous avons utilisé de l'immobilon PVDF (polyvinylidène difluoride)
de 0,45 J.lm de porosité. Avant utilisation, l'immobilon est rapidement
immergé dans du méthanol à 20% puis rincé à l'eau distillée.
.,..
••
- . t:.:
B
- Plaques de graphite
PAGE-SOS
============J- Papiers filtres
-- PAGE-SOS
de transler'
Papiers filtres
de graphite
- - PAGE-SOS
..r:~
.... ..
~.lIUlCIL._ _.3.IL:.
• ..., __ Me m b ra ne de
transfert
Fig. 2.12
29
est placé sur un support relié à un cryostat (Multitemp Il. LKB) et
réfrigéré à 4°C.
L'alimentation est branchée de sorte que les protéines passent du gel
vers l'immobilon, sous une intensité de 0,8 mAlcm 2 de gel transferé. ceci
pendant 3 heures. La conduction électrique est assurée par le tampon de
migration imbibant le sandwich.
Après transfert, la feuille d'immobilon est séchée à l'air libre et
soigneusement conservée entre deux feuilles de papier Whatman jusqu'à
utilisation ultérieure.
d) Colorations de contrôle
La feuille d'immobilon est éventuellement colorée au rouge Ponceau
pour vérifier le bon transfert des protéines. Après rinçage et séchage à
rair. la feuille de transfert peut être utilisée sans inconvénients pour
d'autres révélations.
Le gel transféré est coloré au bleu de Coomassie afin de vérifier la
quantité de protéines transférées en comparant avec un PAGE coloré
témoin.
2.6.1. J. Principe
La matrice de filtration sur gel est composée de minuscules billes
poreuses.
La solution protéique à séparer est placée en haut d'une colonne
remplie avec la matrice et est éluée par un tampon dont le flux est assuré
par une pompe péristaltique
Les molécules de dimensions supérieures restent dans le tampon
circulant entre les billes, alors que les molécules plus petites se déplacent
en pénétrant dans les canalicules creux des billes, plus ou moins
profondément suivant leur dimension et leur forme. Les molécules sont
éluées de la matrice dans un ordre de masse moléculaire décroissant, les
plus grosses sortant les premières et les plus petites se retardant par suite
de leur pénétration dans la matrice. Ce type de chromatographie est
encore appelé tamisage moléculaire.
Du fait que les molécules traversent la matrice à des vitesses
différentes. elles sont à la sortie de la colonne. séparées les unes des
autres.
Fig. 2.13
30
Quand toutes les molécules ont été éluées du gel, la colonne est prête
pour l'opération suivante. La régénération est inutile. La même colonne
peut en règle générale être utilisée pour un grand nombre d'expériences.
A partir d'une courbe d'étalonnage obtenue par chromatographie de
protéines de poids moléculaires connus, le poids moléculaire des
substances séparées peut éventuellement être estimé.
b) Préparation de la colonne
Le plus grand soin est apporté au choix de la colonne afin d'obtenir
la meilleure efficacité en filtration sur gel.
Pour les travaux analytiques, une colonne de verre d'un diamètre
intérieur de l'ordre de 2,5 cm donne satisfaction. La hauteur du gel à
utiliser dépend de la nature de la séparation. Pour des séparations plus
difficiles, des hauteurs de gel plus longues doivent être utilisées. Nous
avons choisi une colonne verticale en verre d'une hauteur de 1 mètre.
La suspension de sépharose 6B telle qu'elle est fournie dans le
commerce est trop dense pour être versée directement dans la colonne.
Elle doit ainsi être diluée au préalable dans le tampon Tris base 100 mM,
pH 7,8 utilisé comme éluant et préalablement filtrée et dégazée sous
agitation très lente.
Le remplissage régulier de la colonne de filtration est très important
si l'on veut obtenir de bons résultats. Un remplissage irrégulier entraîne
inévitablement une augmentation de la dilution et peut causer le mélange
de zones qui normalement seraient patfaitement séparées. Si une pression
trop élevée est employée pendant le remplissage, le gel se trouve
comprimé et opposera une résistance élevée à l'écoulement.
Après décantation, le gel est équilibré de façon mécanique en faisant
passer le tampon d'élution pendant 24 heures à débit mesuré en sortie de
colonne Cl mVmin) par réglage de la pompe péristaltique. Un débit trop
élevé entraîne une diminution du rendement final et la dilution du
produit.
2.6.1. 3. Tampon d'élu/ion (Fig. 2.13)
Nous utilisons un tampon tris 100 mM contenant 2 mM de chlorure
de calcium comme protecteur de la structure de la vitellogénine.
Nous préparons une solution mère 10 fois plus concentrée, stockée à
4°C et que nous diluons au 11l0ème au moment de l'emploi.
Robinet
Collecteur de fractions
Injection de plasma
induit d' O. niloticus.
Trizmabase
(IOOmM, pH=7,8)
Fig. 2.14.
3 1
Une quantité suffisante est préparée, filtrée dans une fiole placée sous
agitation très lente, et dégazée pendant 10 min à ['aide d'une pompe à vide
pour éliminer les bulles d'air qui géneraient l'écoulement des molécules.
2.6.1.4. Mode opératoire (Fig. 2.14)
L'échantillon dilué trois fois avec le tampon Tris base à 1()() mM est
centrifugé pendant 5 min à 3000g et à 4°C de façon à récupérer en
surface et éliminer les lipides libres dans le plasma. Il est ensuite injecté
dans la circulation du tampon, en amont de la pompe péristaltique, à l'aide
ct 'un tuyau branché sur un robinet à trois voies. Une fois l'échanti lion
passé dans le circuit, le sens du robinet est inversé pour permettre
l'écoulement du tampon directement dans la colonne pendant 10 heures.
Le volume des fractions recueillies avec le collecteur (Pharmacia
LKB) est de 10 ml/IOmin/tube.
2.6.1.5. Lecture de l'absorbance des fractions
L'absorbance de chaque fraction est déterminée au spectro-
photomètre (Kontron Uvikon 810) à 280 nm en utilisant des cuves de
quartz. La valeur de la DO obtenue est reportée sur un graphique en
fonction des tubes d'élution.
2.6.2./. Principe
Un échangeur d'ions est une matrice insoluble qui contient des
groupes chargés fixes et des contre-ions mobiles. On parle d'échangeurs
anioniques ou cationiques suivant qu'ils ont une affinité pour les ions
négatifs ou pour les ions positifs.
La séparation des produits est obtenue par adsorption réversible. Elle
est fonction de la charge nette des molécules à même pH donné. La
chromatographie d'échange d'ions nécessite deux étapes:
- l'adsorption qui intervient dès l'application de l'échantillon.
Les substances non liées sont éliminées par lavage avec du tampon.
- l'élution sélective qui se fait soit:
. par une variation du pH du tampon d'élut ion vers le point
isoélectrique de la molécule entraînant une diminution de sa charge neue,
d'où une élution plus aisée
. ou par augmentation de la force ionique, c'est-à-dire augmentation
du nombre de contre ions compétitifs dans le tampon avec la molécule
chargée. Les molécules les plus chargées sont éluées les dernières. Cest
cette modalité que nous avons choisie.
Robinet
Collecteur de fractions
--O~~88--
FF" Injection de VTG
V recueillie au Sépharose 6B.
L=========~ < - .
Trizma base
(lOG' mM, pH = 7,8 ) A
~
(~
OOmtvl. 80:; mM
---;k=1h
Gradient de trizma base
( 100 mM à 300 mM, pH = 7,8 )
Fig. 2.15
32
2.6.2.2. Matrice utilisée :
Nous avons choisi la DEAE-Trisacryl M (IHF) :
Elle est présentée sous forme d'une suspension aqueuse dans du NaCI
lM:
OCH2 CH2 NH (CH2 CH3)2
a) Caractéristiques:
La matrice Trisacryl est formée de deux monomères différents :
- le monomètre principal est un groupement Tris jouant le
rôle de squelette rigide.
- l'autre monomère porte les groupements diéthylaminoéthyl
(DEAE) qui confèrent au support chromatographique ses propriétés
d'échange d'anions.
b) Coulage de la matrice:
Nous utilisons une colonne en verre de 50 cm de longueur sur 1,8
cm de diamètre.
Le gel de la DEAE - Trisacryl M préparé dans le tampon Tris base à
100 mM et dégazé, est introduit par fractions dans la colonne. Apres
décantation, il est équilibré par la circulation du tampon pendant 16
heures à un débit de 3 mU5 min.
2.6.2.3. Tampons
La matrice échangeuse étant de nature an ionique, nous avons choisi
des tampons cationiques, Tris base à pH 7,8.
a) Tampon d'équilibration :
Pour obtenir de bonnes séparations en chromatographie par échange
d'ions, il est essentiel que les conditions de l'expérience soient favorables
à l'établissement d'un équilibre. Le débit pour lequel est atteint cet
équilibre, surtout pour des solutés de poids moléculaires élevés, est assez
faible. Il faut donc que J'écoulement soit lent. Les conditions requises sont
obtenues à l'aide d'une pompe péristaltique.
Le tampon choisi, Tris base, est identique à celui qui a été utilisé
pour 1a fi ltration sur gel.
Toutes les protéines de point isoélectrique inférieur à pH 7,8 sont
chargées négativement et sont retenues sur la colonne.
b) Gradient d'élution :
L'élution se fait par utilisation de tampons à concentration IOmque
croÎssante de 100 à 300 mM et à pH constant. On peut utiliser soit un
gradient de tris, soit W1 gradient de chlorure de sodium ajouté au tampon
tris 100 mM de rélution.
2.7.1.2. Immunisation
C'est l'introduction de l'antigène dans rorganisme ou stimulation
antigénique, à laquelle le système immunitaire répond par la fonnation
d'anticorps ou réponse antigénique.
Les anticorps fonnés sont libérés dans le sang de l'animal immunisé.
Ils sont récupérés dans le sérum appelé immunsérum.
L'introduction de l'antigène se fait, en général, par injections intra-
musculaires ou sous-cutanées répétées.
Nous avons utilisé le lapin comme animal donneur.
L'immunsérum obtenu est aliquoté, éventuellement dilué de moitié
avec du glycérol et conservé au congélateur à -30°C.
Tuyau à. vide
Lapin
Fig. 2.16.
34
2.7.2. Préparation de l'antigène
solut.ion de coloration
Amidoschwarz 5% Sg
Méthanol 40% 40 ml
Acide acétique 10% 10 ml
Eau distillée SO% SOml
solution de décoloration
Acide acétique 2% 2 ml
Eau distillée 98% 98 ml
Fig. 2.17.
. ,
\",0;','
a ,.,~",
; ,
Fig. 2.18.
35
2.7.4.2. Contrôle de [limmunsérum par immuno-
précipitation (Ouchterlony, 1953)
Une immunoprécipitation est réalisée pour tester la réaction ag-ac
entre l'immunsérom obtenu et l'antigène innoculé. Cette réaction suit le
protocole décrit par Ouchterlony en 1953.
Les diffusions se font en agarose (gélose purifiée, Merck) à 1,5%
dans du tampon véronal 0,05 M (diéthylmaionylurée sodée) (Fig. 2.17.).
Ce tampon préparé est conservé à 4°C. Au moment de réaliser les
dépôts d'immunoprécipitation, une solution dtagarose à 3% est préparée
avec de l'eau distillée (3 g d'agarose + 100 ml d'eau distillée). Cette
solution est solubilisée au bain marie et elle est répartie dans des tubes en
verre à raison de 1,5 ml par tube. Puis, après avoir rajouté 1,5 ml de
tampon véronal sodé, le mélange (3 ml) est déposé SUT une lame
d'histologie recouverte de gel-bond Pharmacia à l'aide d'une pipette en
verre à écoulement rapide, préalablement rechauffée dans le bain~marie.
Après solidification de la gélose à la température de la pièce, des puits
cylindriques de 20 /...Il sont réalisés grâce à un emporte~pièce. Les réactifs
y sont déposés jusqu'à ras bords à raide d'une pipette Pateur effilée à la
flamme d'un bec Bunsen.
Les affrontements se font par diffusions concentriques dans la gélose
de puits à puits (Fig. 2.18.a) au moins pendant 12 heures dans un milieu
humide contenant 0,01 % d'azide de sodium. Quand les traits de
précipitation révélateurs de la réaction ag-ac sont apparus, les excédents
protéiques non précipités sont éliminés de la gélose par immersion dans
de l'eau distillée contenant de 0,01 % d'azide de sodium, renouvelée
abondamment pendant plusieurs jours. La coloration des traits
dtimmunoprécipitation est réalisée avec de J'amidoschwarz (Fig. 2.18.)
durant une minute après déshydratation du gel par pression prolongée
contre du papier absorbant. Après décoloration le gel solidaire du gel-
bond est séché à l'étuve à 37°C.
1000
500
250
125
1
1
1
ac ~ 1/5000 1 1/1 0000 1/20000 1/40000 1/80000 1/160000
Fig. 2.19.
36
L'antigène est greffé, c'est à dire adsorbé, sur une plaque de
microtitration de 96 puits à fond plat, en plastique traité, en laissant
incuber toute une nuit à température ambiante ou 2 heures à 37°C la
solution antigénique dans les puits. On greffe une gamme de dilution de
l'antigène, de 1000 à 125 ng/ml.
Après rinçages, on dépose en sens perpendiculaire une gamme de
dilution de l'immunsérum du 1/5 OOOème au 1/160 OOOème (Fig. 2.19.).
Les étapes de révélation des compexes antigène-anticorps formés sont
identiques à celles d'un ELISA normal (cf. paragraphe 2.8).
La lecture de la réaction colorée se fait de façon identique à l'aide
d'un lecteur de plaques. Nous considérons que le lapin a bien répondu, si
nous pouvons obtenir une DO de 1,5 avec un anticorps dilué au
1/40000ème pour une dose d'antigène n'excédant pas 500 ng/ml.
L'obtention d'une réaction colorée avec un antigène supposé ne pas
réagir avec l'anticorps signifie que cet anticorps a été induit par un
antigène contaminé.
rinçage
~aC2
ri nçage
3
8• 0C1
a9
Incubation avec l'anticorps secondaire, Be2
rinçage
4
8
~ag
ac1
rinçage
Fig. 2.20.
3 7
2.8. Immunocytochimie
2.8.1. immunocytochimie photonique (Fig. 2.20.)
Elle sert à tester l'anticorps spécifique lorqu'on connaît la
localisation histologique de l'antigène correspondant, mais elle sert
surtout à localiser cet antigène dans les tissus ou les cellules préalablement
traités en histologie.
Une série de dilutions d'anticorps primaire spécifique a été
expérimentée en immunocytochimie photonique, comme suit, à la
température du laboratoire. Celle qui a donné les meilleures révélations a
été retenue pour faire le marquage à l'or dans les grilles réservées pour la
microscopie électronique.
2.8.1.2. Saturation.
Les coupes sont saturées durant 20 minutes dans une solution
contenant 200 ml de tampon phosphate et 2 ml de NPS (normal pig
serum, c'est à dire sérum nonnal de porc). Cette étape à pour but de
bloquer tous le sites antigéniques aspécifiques.
révélateur : a~chhloronaphtol
tampon de révélation
acétate d'ammonium (NH4C2H202)
0,05 M ajustée au pH 5 7 volumes
acide citrique C6H807,H20 1 volume
solution d'a-chloronaphtol
4 Chlora 1 a Naphtol 20 mg
méthanol 4 ml
(dissous à l'obscurité)
tampon de saturation
ovalbumine à 0,1% (Sigma) 6 ml
tampon phosphate 575 ml
sérum nonnal de chèvre 20 ml
Fig. 2.21.
38
2.8.1. 5. 1IlC ubation du comptexe PAP
Les coupes sont ensuite incubées avec une solution de PAP au
1/5OO0ème, solution qui contient l'enzyme permettant la coloration : la
peroxydase. Le PAP oU complexe Péroxydase-anti-Péroxydase est
constitué de deux immunoglobulines de type G (lgG) fixant trois
molécules de péroxydase. Pendant cette incubation le PAP se fixe sur
l'anticorps secondaire de liaison.
2.8.1.6. Révélation
Le tampon de révélation (Fig. 2.21.) est préparé extemporanément et
conservé à l'obscurité. Les coupes sont révélées pendant dix minutes
environ dans une solution d'a-chloronaphtol. Cette molécule incolore à
l'état réduit, prend une teinte brun foncé lorqu'elle est oxydée par la
péroxydase. Elle sert donc de substrat de coloration.
Les coupes sont rincées, déshydratées pendant cÎnq minutes dans de
l'alcool à 100% et les lamelles montées avec du baume du Canada
2.8.2./. Réhydratation
Les grilles sont passées rapidement dans de l'eau distillée, puis elles
restent 15 minutes dans le tampon phosphate.
2.8.2.2. Saturation
La solution utilisée pour la saturation (Fig. 2.21.) est composée de
0,1 % d'ovabu1mine dans du tampon phosphate contenant 0,3% de sérum
normal de chèvre. Les grilles sont laissées 20 minutes dans cette solution
et sont rincées successivement dans 6 bains de tampon phosphate.
e \ 1,/
--~-
\
Fig. 2.22.
tampon PBST
tampon phosphate 0, l M 100 ml
NaCIO,9% 9g
Tween 20 (Merck) 500 ~l
eau distillée q.s.p. 1000 ml
Fig. 2.23.a
39
incubées dans cet antîcorps secondaire ou G-GAR ( Gold labelled Goal
anti-rabbit IgG, Amersham) dilué au l/l00ème dans le tampon phosphate
pendant 40 minutes. Ensuite toutes les grilles sont rincées successivement
dans trois bains de tampon phosphate et passées rapidement à la pissette
d'eau distillée. Elles restent dans cette solution pendant trois minutes et à
l'obscurité, puis sont séchées à l'aide de papier filtre. EUes sont ainsi
prêtes pour être observées au microscope électronique.
Les solutions qui nécessitent d'être stockés, sont conservés pour une
durée n'excédant pas trois semaines (Fig. 2.23.a et 2.23.b).
tampon citrate-phosphate, pH 5
solution A
acide citrique C6HS07, H20 (Merck) 0,1 M 5,25 g
eau distillée q.s.p. 250 ml
solution B
Na2HP04 (anhydre) (Sigma) 0,2M 8,9 g
eau distillée q.S.p. 250 ml
La solution A est ajoutée à la solution B. Le pH est alors à 5.
Ce mélange est conservé dans l'obscurité à 4°C.
solution de révélation
tampon citrate-phosphate. pH 520,9 ml
OPD 1,1 ml
H202 30% 5,5 ml
Fig. 2.23.b
40
2.9.3. Protocole du dosage par ELISA de la vitellogénine
d'Oreochromis niloticus
2.9.3.2. Préincubation
Une gamme de vitellogénine purifiée est préparée en huit points de
concentration décroissante. Une gamme en 12 points de concentration
également décroissante est préparée pour le plasma femelle d'une part et
pour le plasma mâle d'autre part.
Une quantité constante d'anticorps primaire anti- VTG est ajoutée à
chaque point de concentration. Cette préincubation sert à réaliser une
compétition entre la VTG du greffage, la VTG purifiée, le plasma de
femelle en viteIlogénèse ou de mâle et ('anticorps spécifique.
La durée de cette préincubation est de une nuit à 4°C.
2.9.3.8. Révélation
La solution de révélation de la péroxydase, la diaminobenzidine, est
préparée extemporanément pour chaque plaque, placée à l'abri de la
lumière et déposée à raison de 200 }.JI/puits. C'est un substrat qui a l'état
réduit est incolore et qui oxydé par la péroxydase prend une couleur
orangée.
La coloration se développe à l'obscurité pendant 20 min à la
température ambiante.
Fig. 2.24.
divers tampons
tampon RIA:
tampon phosphate 0,01 M, 7,25
tampon gélatiné à 0.01 % azoture de sodium
tampon d'anticorps:
tampon RIA additionné de 0,5% (poids/volume) de gamma-
globulines de lapin.
gamme étalon
La gamme étalon de stéroïdes non radioactifs purs est réalisée à partir
d'une solution mère à 1()() J.lg/ml du stéroïde dans l'éthanol absolu. par
dilution dans le tampon RIA.
traceur
Le traceur est constitué d'une solution de stéroïde tritié à 10000
cpm/lOOml dans le tampon RIA.
anticorps
L'anticorps est dilué dans le tampon RIA de façon à lier 40% à 50%
de la radioactivité ajoutée en incubation. En pratique, cette dilution
optimale est déterminée en incubant des dilutions sériées de l'anticorps
avec le traceur en concentration constante 00000 cpm/loo ml).
Fig. 2.25.
42
2.10. RIA ou dosages radioimmunologiques.
La technique utilisée est basée sur le protocole RIA développé par
Fostier et al. (1978, 1982).
Cette technique comprend trois étapes :
- extraction du stéroïde plasmatique
- chromatographie de l'extrait sur colonne de Sephadex LH-
20 pour séparer les différentes classes de stéroïdes
- dosage.
Ch 3 : Etudes microscopiques du
•
cycle ovarien
3.1. Introduction
Le processus de développement des ovaires est très diversifié chez les
poissons (forme, coloration, volume).
Comme beaucoup d'auteurs, nous avons établi une description basée
à la fois sur robservation microscopique des ovaires, tant en microscopie
photonique qu'en microscopie électronique. Nous avons également
analysé au cours du cycle, la répartition des ovocytes dans l'ovaire en
fonction de leur taille par analyse d'image après fixation dissociative.
Ceci nous a permis d'obtenir des résultats sur le cycle ovarien d'O.
niloticus.
Fig. 3.5
47
3.3. Résultats de microscopie photonique et électronique
3.3.1. Les différents stades de 1t ovogénèse
3.3.1.1. ovogonies
Elles n'ont été observées qu'en microscopie photonique sur coupes
semi-fmes incluses à l'Epon (Fig. 3.25.).
D'un diamètre d'environ la
/Jill, elles sont caractérisées par un
rapport nucléa-cytoplasmique élevé. Le noyau ne présente pas de nucléole
et l'ADN est sous forme réticulée. Le cytoplasme est peu coloré par le
bleu de toluidine. Les rares ovogonies isolées possèdent une enveloppe de
cellules granulosaires très aplaties et en nombre limité.
3.3.1.2. stade J
a) microscopie photonique
Ce stade ovocytaire est caractérisé par un cytoplasme présentant un
aspect homogène extrêmement dense et très colorable. Le rapport nucléo-
cytoplasmique est élevé. Le noyau présente très tôt un début de
fragmentation de ses nucléoles, dispersés dans le nucléoplasme pour les
ovocytes les plus jeunes, ou placés en périphérie nucléaire pour les plus
développés (Fig. 3.4., 3.5., 3.25.). Dans le cytoplasme périnucléaire un
matériel très colorable semble émerger de l'enveloppe nucléaire
(Fig.3.5.)
Les ovocytes de ce stade dont la taille varie de 10 à 80 j.1ill présentent
tous un épithélium granulosaire séparé d'une thèque en monocouche par
une lame basale, les différentes couches étant très aplaties et les noyaux
très allongés. La Fig. 3.5 illustre la mise en place des premières cellules
thécales, migrant du tissu mésoépithélial vers la lame basale sécrétée par
les cellules granulosaires.
3.3.1.3. stade 2
a) microscopie photonique
Les ovocytes prévitellogéniques dont le diamètre varie de 80 à 120
I..Im, sont caractérisés par un noyau possédant de nombreux nucléoles et
par un cytoplasme moins colorable qu'au stade 1. L'ovocyte est alors
entouré par des enveloppes constituées par une mince couche de cellules
granulosaires très aplaties, doublée par des cellules thécales également très
aplaties. La lame basale séparant la granulosa de la thèque est toutefois en
général bien visible en microscopie photonique à immersion lors de
l'utilisation de coloration spécifique tel l'Azan de Heidenhain.
Les ovocytes entrant en vitellogénèse de type [ dont la taille varie de
120 à 200 !Jm présentent quelques rares vacuoles à la périphérie de
l'ovoplasme de nature PAS+ correspondant aux premiers alvéoles
corticaux. Les premiers globules lipidiques sont identifiés par coloration
au bleu azur. La vitellogénèse glycoprotéique et lipidique au cours de
laquelle se mettent en place les alvéoles corticaux et les enclaves lipidiques
est déclenchée (Fig. 3.6). Les coupes semi-fmes confirment les
observations précédentes et soulignent la précocité d'apparition des
globules lipidiques et des alvéoles corticaux en fm de stade 2 (Fig. 3.7.).
b) microscopie électronique
Chez les plus jeunes ovocytes observés à ce stade, la membrane
plasmique ovocytaire ou ovolemme est à peu près lisse. Elle est séparée de
la couche de cellules de la granulosa par une matrice extracellulaire très
mince et peu dense aux électrons.
3.3.1.4. stade 3
a) microscopie photonique
La taille varie de 200 à 600 /.lm.
Le cytoplasme ovocytaire finement réticulé présente une série de 3
couronnes (Fig. 3.9., 3.26.). La première, la plus externe, est formée par
des alvéoles corticaux à la base de l'ovoplasme périphérique. La couronne
médiane est constituée par de petits globules vitellins. En position plus
centrale, la troisième couronne est constituée par des globules lipidiques.
fig. 3.13
Fig. 3.14
50
Le nombre de nucléoles semble moins important qu'au stade
précédent, mais ils sont beaucoup plus gros. La zona radiata est visible à
un grossissement de x 160 lors de colorations à l'azan de Heidenhain.
L'épithélium granulosaire est fonné par des cellules cubiques à noyau
arrondi et on y devine de place en place des lacunes intercellulaires. La
lame basale de la granulosa est identifiable même à faible grossissement (x
63). Les cellules thécales pluristratifiées ont des noyaux toujours aplatis et
forment une thèque dont l'épaisseur est à peu près équivalente à celle de la
granulosa.
L'examen des semi-fmes (Fig. 3.10.) conforte les observations
précédentes et pennet de voir les petits granules vitellins dans l'ovoplasme
périphérique fusionnant pour donner de petits globules vitellins. Ils
migrent de façon centripète pour constituer la couronne moyenne bien
identifiable sur les coupes en paraffine. Les espaces entre les cellules de la
granulosa présentent des accumulations de matériel très fortement coloré
par le bleu de toluidine apparaissant soit sous fonne de sections arrondies,
soit sous forme de filaments allongés suivant les plans de coupes. Nous les
avons appelés filaments granulosaires.
Fig. 3.17
Fig. 3.18
5 1
3.3.1. 5. stade 4
a) microscopie photonique
Clest le stade de grand accroissement de l'ovocyte correspondant à la
pleine vitellogénèse ovocytaire de type II au cours duquel les processus
endocytotiques prennent le pas SUT les processus de synthèse des alvéoles
corticaux et des globules lipidiques. Les ovocytes présentent alors un
diamètre allant de 600 à plus de 2000 !Jm.
Les globules vitellins occupent alors tout le cytoplasme sauf au
niveau de rovoplasme périphérique (Fig. 3.12.). Ils fusionnent entre eux
pour former des globules énonnes pouvant atteindre un diamètre de plus
de 60 Ilm. Leur hétérogénéité structurale (Fig. 3.14., 3.15.b),
parfaitement visible en microscopie photonique à immersion, correspond
à une condensation cristalline du vitellus en plaquettes fusifonnes
disséminées dans une matrice d'aspect homogène (Fig. 3.17.,3.18.).
Les globules lipidiques sont en nombre relativement peu important,
disséminés dans l'ensemble du cytoplasme. Les alvéoles corticaux, de
taille beaucoup plus petite, environ 3 à 4 !Jm cement l'ovoplasme
périphérique en une ligne continue. A la fin du stade 4 ils se regroupent
par paquets plaqués contre llovolemme fonnant des masses coniques
pénétrant le domaine des globules vitellins (Fig. 3.15.a et b). Leur
structure non homogène, reticulée, apparaît nettement sur les coupes
semi-fines (Fig. 3.18., 3.28.c, 3.29.).
Au fur et à mesure que l'ovocyte s'agrandit et se charge de réserves
vitellines, l'épaisseur de l'ovoplasme périphérique diminue. Lorsque la
vitellogénèse est tenninée, il n'est plus distingable en observation
photonique.
b) microscopie électronique
Ce stade est caractérisé par la mise en place de la zona radiata
interna. Elle se développe se déposant entre les microvillosités ovocytaires
(Fig. 3.14.). Au fur et à mesure que les microvollosités granulosaires se
développent vers l'ovocyte, elles pénètrent dans les canaux de la zona
radiata où se trouvent les microvillosités ovocytaires. En effet, les
sections radiales montrent la coexistence dans les puits de chaque type de
microvillosités (Fig. 3.30.c). De façon identique les sections transversales
(Fig. 3.30.d) montrent plusieurs microvillosités coupées dans chaque trou,
dont on peut identifier l'origine. Les microvillosités ovocytaires ont une
section transversale plus faible que celle des microvillosités granulosaires
et apparaissent plus denses aux électrons par suite de la présence de
microfilaments d'actme. Cette zona radiata interna présente une structure
réticulée en arceaux, formée par un matériel fibrillaire noyé dans une
matrice homogène (Fig. 3.18., 3.30.b,c).
C'est à ce stade que l'endocytose de vitellogénine est la plus active.
De très nombreux puits à clathrine se détachent de l'ovolemme donnant
des vésicules à clathrine s'enfonçant dans l'ovoplasme périphérique (Fig.
3.13., 3.28.). Ces vésicules fusionnent probablement avec des vésicules
d'origine golgienne pour constituer les corps multivésicuJaires. Nous
n'avons pas observé les phases de transition de ces corps multivésiculaires
en petits globules vitellins. Ces derniers fusionnent entre eux pour donner
des globules vitellins de plus en plus volumineux à l'intérieur desquels on
observe de nombreuses plaquettes vitellines fusiformes.
A la fin de ce stade, les filaments très denses aux électrons se situant
dans les espaces intergranulosaires présentent à leur surface, sur des
coupes transversales, des formations ramifiées semblant les relier plus ou
moins entre eux (Fig.3.31.c, d et e). Le cytoplasme des cellules de la
granulosa montre alors un aspect caractéristique de synthèse exogène avec
un ergastop1asme développé, laissant supposer que ces filaments sont
d'origine granulosaire (Fig. 3.31.c, 3.32.). Des filaments identiques
apparaissent à la base de la thèque le long de la lame basale de
l'épithélium granulosaire.
Fig. 3.20
pi 9. 3.22
Fig. 3.21
53
3.3.1.6 stade 5
C'est la période de maturation ovocytaire précédant la ponte. Les
follicules ovocytaires ont atteint un diamètre d'environ 2,5 mm. Ce stade
très fugace se caractérise par une migration du noyau (vésicule
germinative) vers la périphérie ovocytaire. Après la reprise de la
première division méiotique et l'expulsion du premier globule polaire,
c'est à dire la première étape de transformation de l'ovocyte en ovule, les
ovocytes sont expulsables par légère pression sur l'abdomen. La femelle
ne mange presque pas. L'ovocyte est jaune foncé. L'ovaire est au
maximum de son volume et il occupe une bonne partie de la cavité
abdominale.
La fin de ce stade est caractérisé par l'ovulation par la rétraction et
la disparition des microvillosités ovocytaires et folliculaires. La zona
radiata se transforme en un chorion plus mince dont les pores sont
partiellement bouchés. La rupture du follicule entraîne la libération de
l'ovocyte dans la cavité ovarienne. Le RGS est à 3%.
RGS
(en %)
1 2 3 4 5 av
Stade de maturité
RHS
(en %)
1
1 2 3 4 5 av
Stade de maturité
54
3.3.2. évolution de la répartition des follicules ovarIens
en classe de taille
vi tellogéniq ues.
f'hotopériocle
(~,=+ :) 1
~"'\O,,"'''
H
CH
GtH 1 GH
El
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... \
L- S'érooo<s - - - - - - 1 \ }
5e.<""" \ Ovocyte /
Fig. 3.27.
Fig. 3.9
Fig. 3.10
57
La vitellogénèse.
Chez Oreochromis niloticus, comme chez de nombreux téléostéens,
nous avons observé les premières manifestations vitellogéniques dès la fin
du stade 2.
Elles se traduisent par rapparition dans l'ovoplasme de petits
globules lipidiques ainsi que de petits alvéoles corticaux. Ces derniers ne
font pas à proprement parler partie des réserves vitellines. Ils seront en
effet expulsés de l'ovocyte par exocytose au moment des processus de
maturation (Anderson, 1968 ; Selman et al., 1988) pour fonner le liquide
périvitellin isolant l'œuf de sa "coquille" ou chorion. Alvéoles corticaux
et premiers globules lipidiques correspondent aux premières
manifestations dl une activité synthétique vitellogénique ovocytaire
constituant la ~'itellogénèse endogène de type J. Une étude en microscopie
électronique montre que c'est au cours de cette vitellogénèse que
l'ovolemme commence à émettre des microvillosités groupées en bouquets
en direction de la granulosa alors que les cellules granulosaires en
émettent de place en place vers l'ovocyte (Fig. 3.8.).
Cette première vitellogénèse, probablement très courte, compte tenu
de la rapidité de la croissance ovocytaire, est suivie par une étape
d'accumulation de vitellogénine plasmatique, synthétisée par le foie en
réponse à l'action des œstrogènes sécrétés par les enveloppes de l'ovocyte.
Cette vîtellogénèse exogène se produit alors que l'endogène se poursuit,
constituant la vitellogénèse de type Il. Parallèlement aux premières
images d'entrée de la vitelIogénine dans l'ovocyte, la microscopie
électronique montre la mise en place entre les microvillosités ovocytaires
d'une nouvelle matrice, très dense aux électrons, se déposant dans la
matrice extraovocytaire légère située entre l'ovocyte et la granulosa.
C'est la zona radiata extema dont le dépôt entre les microvillosités
implique la structure ponctuée. Elle serait fOffilée par exocytose
ovocytaire de matériel d'origine golgienne contenu dans des vésicules à
coeur dense (Fig. 3.28.) (Tesoriero, 1977, 1978) retraitant des protéines
dites vitellines (Oppen-Berntsen et al., 1992 ; Hyllner & Haux, ]992)
synthétisées par le foie sous induction œstrogénique (Hyllner et al., 1994 ;
Larson el al., 1994) et internalisées par une voie encore inconnue.
L'observation simultanée sur les micrographies électroniques de
l'endocytose de la vitellogénine et du dépôt de la zona radiata signe les
synthèses parallèles de ces deux types moléculaires (Fig. 3.30.a). Cette
simultanéité caractéristique des premières étapes de la vitellogénèse de
type II pennet l'identification du début du stade 3 sur les coupes
observées à l'immersion en microscopie photonique avec une zona radiata
visible alors que les inclusions vitellogéniques ne le sont pas encore (Le
Menn & Burzawa-Gérard, 1985).
Nous pouvons distinguer aisément chez le tilapia comme chez la majorité
des téléostéens, deux phases dans cette vitellogénèse de type II. Lors de la
première qui correspond au stade 3, on constate une prédominance
Fig. 3.8
60
chez notre tilapia le passage de la vitellogénine par les pores de la zona
radiata (Fig. 3.29.b) et sa localisation à la fois dans les corps multi-
vésiculaires et dans les petits globules vitellins (Fig. 3.29.a, c). Ces
observations confirment chez ce poisson les processus généraux
d'endocytose de la vitellogénine par l'intermédiaire de récepteurs
spécifiques (Chan et al., 1991).
~o
~o
STADE 1 lO
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1000 150<1 2000 2$l>O soo 1000 1$00 :1:OCXI 2500
CLASSES DE TAILLE Il'ml CLASSES DE TAILLE l$iffil
Fig. 3.33
62
du stade 4 certaines polymérisations se font de façon isolée donnant, sur
coupes transversales des filaments granulosaires, un aspect périphérique
chevelu (Fig. 3.31.c, ct).
L'ultrastructure granulosaire au cours de la vitellogénèse révèle une
activité synthétique certaine (Fig. 3.31.c, Fig. 3.32.). Le reticulum endo-
plasmique est développé, les mitochondries sont nombreuses et les
vésicules golgiennes évidentes. Les micrographies électroniques (Fig.
3.3l.c, e ; 3.32.) plaident en faveur d'une sécrétion classique élaborée à
partir de l'ergastoplasme (reticulum endoplasmique) et des dictyosomes
de l'appareil de Golgi, puis évacuée par exocytose au niveau des
membranes latérales granulosaires à partir de vésicules de sécrétion
formées par la confluence des vésicules golgiennes.
L'absence de la plupart de ces filaments à la surface ovulaire (Fig.
3.21.) pose le problème de leur disparition en fm d'ovogénèse. Cette
absence chez une espèce à développement bucco-pharyngien mériterait
une étude spécifique anatomo-physiologique à mettre en relation avec une
présence de filaments adhésifs chez les espèces déposant leurs œufs sur le
substrat (Thiaw, 1993).
Etant donné que l'activité gonadique n'est pas saisonnière mais liée
exclusivement à la température de l'eau, nous avons établi les courbes
dtévolution du RGS et du RHS en fonction des stades de développement
ovocytaire lors de prélèvements effectués pendant un cycle complet de
reproduction à diverses périodes de l'année. Toutefois cette étude a été
effectuée sur des poissons issus toujours de la même population et du
même élevage à Nianga.
La courbe du RGS permet de comparer l'activité reproductrice de
diverses espèces de poissons et de déterminer les différentes étapes du
cycle reproducteur, mettant en valeur les faits spécifiques de l'évolution
de la gonade. Lorsque la ponte a lieu en une seule fois, le ROS est
toujours élevé: 27% chez la plie Plewzectes platessa (Lahaye, 1980), 25%
chez les Mormyridae (Albaret, 1982). Par contre chez le Cichlidae où la
ponte est étalée presque pendant toute l'année, le ROS est au maximum de
64
3 % (Babiker & Ibrahim, 1979 ; Albaret, 1982 ; Adebisi, 1987). A la
station de pisciculture de Nianga, Oreochromis niloticus présente un RGS
de 3 %, valeur identique à celles indiquées pour cette espèce par les
auteurs précédemment cités .
Le RHS chez les femelles d'O. niloticus chute au stade 2 au moment
où la gamétogénèse est déclenchée et atteint une valeur maximale au stade
4 avant de rechuter pendant la maturité sexuelle et la période de
l'incubation buccopharyngienne des œufs. Ces variations sont
essentiellement dues à une mobilisation des lipides. Les auteurs distinguent
deux catégories de poissons (Rangis, 1937 ; Bougis, 1952 ; Lahaye, 1980)
Ch 4 : Purification de la vitellogénine
et mise au point de son ELISA.
4.1. Introduction
Chez les Poissons, en particulier les Téléostéens, la VTG est une
lipoprotéine glycophosphorylée, de haut poids moléculaire variant de 300
à 600 kDa. Elle est synthétisée par le foie sous stimulation œstrogénique
et est stockée dans les ovocytes pour servir de réserves au futur embryon.
Les taux plasmatiques de VTG sont variables au cours du cycle sexuel,
passant de quelques ng/ml chez la femelle adultes n'ayant pas commencé
une nouvelle vitellogénèse à quelques dizaines de milligrammes par
millilitre en fin de vitellogénèse. Chez les Salmonidae, cette augmentation
commence plusieurs mois voire plus d'un an avant la ponte (ldler, 1979 ;
Sumpter, 1985 ; Copeland et aL, 1986). Elle a été détectée chez le mâle
indépendamment d'un traitement œstrogéruque (Ding et al., 1989 ;
Pelissero et al., 1991 ; Goodwin et al., 1992 ; Kisbida et al., 1992). Quand
elle est détectable elle est indépendante de la maturité sexuelle (Copeland
et al., 1986).
La VTG est une molécule liant le calcium (Bailey, 1957 ; Booke,
1964 ; Woodhead, 1969). Certains auteurs ont aussi montré l'existence
d'un transport de fer (Hara et al., 1980). Elle se lÎerait également avec les
hormones thyroïdiennes (Mackensi et Ray, 1988).
Différentes méthodes ont été décrites pour détermÎner le taux de la
VTG plasmatique, soit indirectes comme la mesure du phosphore
protéique (Craik & Harvey, 1984 ; Nagler et aL, 1987) ou du phosphore
alkali-Iabile (Wallace & Jared, 1968 ; Emmersen et al., 1979 ; Pelissero et
aL, 1988) et du calcium liés aux protéines (Elliot et al., 1979 ; Hari et al,
1979), soit directes par reconnaissance immunologique. Parmi ces
dernières, certaines sont utilisables sur le terrain, comme
l'immunoagglutination (Le Bail & Breton, 1981). Si sa faible spécificité
permet de l'utiliser pour différentes espèces, son manque de sensibilité en
limite l'usage.
Un certain nombre de dosages radioimmunologiques (RIA) ont été
développés chez les poissons (la carpe : Tyler & Sumpter, 1990 ;
l'anguille: Burzawa-Gérard & Dumas-Vidal, 1991) et particulièrement
chez les Salmonidae (ldler et al., 1979 ; 50 et al, 1985 ; Sumpter, 1985 ;
Copeland & Thomas, 1988 ; Norberg & Haux, 1988 ; Benfey et al.,
1989). Ces dosages sont sensibles et spécifiques mais présentent des
difficultés de marquage radioactif de la VTG et une instabilité dans le
temps de ce complexe.
KDa PM t 0 t 2 t 4 t 6 t8 t10 t 12 t14
200 _
116 _
96 _
Fig. 4.1.
66
Les dosages immunoenzymatiques (ElA et ELISA) pallient ce défaut
car ils n'utilisent pas d'antigènes marqués. Ils ont été développés
notamment pour la VTG chez les poissons (l'esturgeon sibérien: Cuisset
et al., 1989 ; la sole ; Nufiez Rodriguez el aL, 1989 ; le poisson chat :
Goodwin et al., 1992 ; le bar: Mananos et aL, 1994 ; la sardine :
Matsubara el al., 1994 ; l'anguille japonaise : Okumura et al., 1995 ; la
truite : Mourot & Le Bail, 1995 et Bon et al., 1996). Ils ont des
sensibilités égales, voire supérieures à celles des RIA et leur spécificité
est très élevée.Un anti-sérum anti-VTG de truite Oncorhynehus mykis
n'offre pas de réactions croisées avec la VTG de la carpe Cyprinus earpio
ou du turbot Psetta maxima, les réactions d'immunoagglutination n'ayant
lieu qu'avec les Salmonidae (Le Bail & Breton, 1981).
Du fait de cette spécificité immunologique, la purification de la VTG
s'avère nécessaire pour chaque espèce afm d'obtenir des anticorps anti-
VTG spécifiques. C'est ce que nous avons réalisé avec l'espèce
Oreochromis ni/otieus.
4.2. Résultats
4.2.1. Oestrogénisation
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Fig. : 4.2.
67
4.2.2.1. Purification par double chromatographie
La combinaison d'une chromatographie d'exclusion moléculaire
(Sépharose 6B) avec une deuxième chromatographie échangeuse d'anions
(DEAE-Trisacryl-M) constitue une méthode progressive qui permet
d'obtenir une purification de la VTG en fonction de deux paramètres
physico-chimiques, le poids moléculaire et la charge électrique. Cette
technique a déjà été utilisée avec succès au laboratoire pour l'obtention de
plusieurs molécules, notamment la VTG de la sole Solea solea (Nunez
Rodriguez, 1985), celle de l'esturgeon sibérien Acipenser baeri (Pelissero
et al., 1987), celle du bar Dicentrarchus labrax (Mafianos et al., 1994) et
celle de la truite arc en ciel Oncorhynchus mykiss (Bon et aL, 1996).
C'est pourquoi, nous l'avons choisie.
a) chromatographie d'exclusion moléculaire
La vitellogénine est une protéine de haut poids moléculaire j elle peut
donc être facilement séparée des autres protéines sériques par
chromatographie d'exclusion moléculaire, comme cela a été fait chez
Gadus morhua (Plack et al., 1971), Platichthys jlesus (Emmersen &
Petersen, 1976), Salmo gairdneri (Hara & Hirai, 1978), Anguilla japonica
(Hara et aL, 1980) et Heteropneustesfossilis (Nath & Sandararaj, 1981).
Séparation des pics
La VTG contenue dans un pool (3 ml) de plasmas induits par le bE2
est injectée sur la colonne contenant la Sépharose 6B. Ce volume
représente une quantité suffisante pour pennettre la mise au point de cette
puri ficat ion.
Le vol ume des fractions collectées en sortie de colonne est de 10
mUID min. Nous remarquons à fexamen de chaque chromatogramme
effectué que les profils d'élution des plasmas induits sont assez semblables
pour toutes les purifications. Nous présentons trois d1entre ceux qui nous
paraissent caractéristiques. Ils appellent toutefois certains commentaires:
Un premier pic est généralement obtenu aux alentours de 170 min. Il
correspond au pic d'exclusion de la colonne et contient les éléments les
plus volumineux ne passant pas par les pores de la sépharose. Ces
éléments sont souvent des goutellettes lipidiques de très faible diamètre et
des agrégats protéiques présents dans le plasma qui confèrent un aspect
irisé aux tubes contenant ces fractions. Ce pic o'a pas été observé avec le
plasma induit recueilli chez les individus ayant servi à étudier la
dynamique de l'induction de la VTG par le bE2. Ainsi dans la figure 4.2.a
le pic est totalement absent et dans la figure 4.2.b, il est d'une moindre
importance si on le compare à celui qui est observé pour un plasma
prélevé en fin d'induction œstrogénique comme c'est le cas pour
200 -
116 -
96 -
Fig. 4.3.
68
le plasma représenté en figure 4.2.c. Ce plasma nous servira de référence
pour l'étude du profil d'élution en chromatographie.
Le deuxième pic dit d'élution de la VTG est obtenu au bout de cinq
heures. Il faut noter que l'absorbance ne revient jamais au niveau de base
entre l'exclusion et ce deuxième pic.
L'absorbance décroît très rapidement en fin délution du deuxième
pic puis réaugmente à nouveau, légèrement, pour former un troisième
pic. Celui-ci correspond à l'élution des dernières molécules plasmatiques
environ neuf heures après l'injection.
400 37
300
0
0
0
.,.... 300
)( 2:
---
Q>
200 E
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C IJ)
C'Cl 200 .....
-e0 t-
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<I:
\00
0 0
0 20 40 bO SO 100
Fractions (3ml/5min.)
Fig. 4.4.
KDa PM 0 "* 13 37 50 52 64
200 _
116 -
96 _
Fig. 4.5.
69
minutes environ de façon à éliminer les molécules non fixées sur la
résine. Puis on applique un gradient linéaire de Tris-Base allant de 100 à
300 mM pendant quatre heures. Le volume des fractions recueillies est de
3 ml. Elles sont collectées toutes les cinq minutes. Les densités optiques
des fractions éluées sont reportées sur une courbe en fonction de
rabsorbance à 280 nm.
La courbe obtenue (Fig. 4.4.) est caractéristique de toutes les DEAE
que nous avons réalisées. On observe:
. un premier pic d'élution de la colonne d'une intensité variable
suivant la nature du pool du matériel collecté à la fin de la
chromatographie d'exclusion moléculaire.
. puis après la mise en route du gradient, trois pics successifs, bien
distincts, les deux premiers présentant des DO élevées.
Identification des pics en électrophorèse
L'identification des pics contenant la VTG se fait là encore, par
électrophorèse en PAGE-SDS. Les bandes obtenues montrent que:
- le premier pic élué est constitué par l'exclusion qui est
collectée au 13e tube (Fig. 4.4.a). II correspond aux molécules qui ne se
sont pas fixées sur la colonne. La figure 4.5. montre que ce pic analysé
dans le créneau 13 présente un électrophorégramme identique à celui du
pool concentré de la chromatographie d'exclusion moléculaire, analysé
dans le créneau marqué par une étoile (,*). C'est un pic de rinçage,
souvent majoritaire, en particulier si la quantité injectée du pool
concentré de la chromatographie précédente est importante.
- le deuxième pic correspond au premier pic élué dès qu'on a
appliqué le gradient. Le contrôle électrophorétique de la fraction 37 de la
chromatographie 4.4. (Fig. 4.5.) montre qu'il s'agit de matériel lipidique
puisque bien que la DO soit très élevée, nous ne détectons pas de
protéines.
- la VTG est obtenue au niveau du troisième pic, c'est-à·dire
dans le second pic suivant l'application du gradient.
L'analyse électrophorétique des fractions de ce pic (Fig. 4.5.) montre que
la VTG est en quantité plus importante dans la partie descendante de ce
pic : elle est présente dans les tubes 50 à 56. Elle apparait sous la forme
d'une seule bande d'un poids moléculaire d'environ 130 kDa.
· ...... 116
...... 96
Fig. 4.6.
70
L'étude des différents gradients de concentration allant de 100 à
300mM de Tris base permet de constater que la VTG est décrochée de la
résine échangeuse d'ions autour de 200mM.
Préparation des aliquotes de vrc purifiée.
Les fractions où la VTG est localisée sont rassemblées et concentrées
sur cellule Amicon coupant à 10 000 Dalton de façon à obtenir une VTG
à environ 2 mg/ml. Ceci nécessite en général une concentration d'environ
8 fois.
Des aliquotes de 100 1-11 sont préparées et stockées à -30°C. Une
aliquote est utilisée pour chaque injection à un lapin.
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y 1,65 - 1,08x
17 R = 0,991
1/,
15
Jl,Î 0,<1 lU
Log (Rf)
Fig. 4.7.
71
graphe des Log des PM connus du kit en fonction du Log de leur Rf. En
se rapportant au graphique obtenu et en connaissant le Log du Rf de la
protéine inconnue, on peut en déduire son PM.
La VTG telle que nous pouvons l'observer en électrophorèse dans le
plasma induit comporte deux fractions Vtg 1 et Vtg 2 dont les P.M. sont
respectivement de 130 et 170 kDa (Fig. 4.7.).
Fig. 4.8.
72
- épuisé (Fig. 4.8.1 b)
Les traits de précipitations restent identiques honnis celui qui apparaissait
avec le plasma de mâle et qui disparaît alors.
anti- Vtg 2 électroéluée
- non épuisé (4.8.2a)
Nous observons une réaction nette entre l'anticorps et
· la VTG purifiée par double chromatographie
· le broyat de vitellus
· le plasma induit
· le plasma de femelle en vitellogénèse.
Il n1y a pas de réaction avec le plasma de mâle témoin.
- épuisé (Fig. 4.8.2b)
Nous observons une réaction nette entre l'anticorps et uniquement
· le plasma induit
· et le plasma de femelle en vitellogénèse.
b) immunotransferts
Les immunsérums entiers ou épuisés, développés contre les deux
VTG ont également été testés en présence de différents antigènes séparés
en PAGE-SnS et transférés sur membrane d'immobilon (cf protocole,
chapitre 2).
Nous avons utilisé pour chaque blot :
· le plasma de mâle témoin
· le plasma induit
· la VTG purifiée par double chromatographie
· la Vtg 2 électroéluée
Nous avons ici encore testé les immunsérums avant et après
épuisement.
l'an ti- VTG purifiée par chromatographie révèle:
- non épuisé (Fig. 4.9.1a)
· le plasma de mâle témoin sur toute la longueur du créneau
d'électrophorèse
· le plasma induit avec les deux bandes de VTG ainsi que d'autres
bandes protéiques plus légères
Fig. 4.9
7 3
d) ELISA direct
Le contrôle immuno\ogique a été également poursuivi en ELISA
direct, technique plus sensible que les précédentes. Les deux
immunsérums ont chacun été testés, épuisés ou non, en présence de plasma
de mâle témoin ou de vitellogénine purifiée par chromatographie ou par
électroé 1ution.
Les résultats ont démontré une réaction avec le plasma de mâle
lorsque les immunsérums n'étaient pas épuisés, mais cette réaction non-
spécifique s'annulait après l'épuisement.
Les meilleures réactions immunologiques ont été obtenues avec
l'anticorps anti-Vtg 2 électroéluée, pour lequel on obtient une DO de 1,7
(condition optimale compte tenu du lecteur de plaque utilisé) en faisant
réagir cet antî-corps dilué au lI40000è sur une VTO greffée
(indifféremment VTG 2 électroéluée ou VTG purifiée par double
chromatographie) diluée à 600 ng/ml.
4.2.4.1 Principe
Le but de notre travail était de mettre au point une méthode ELISA
pour l'anti-vitellogénine d'O. niloticus afin d'offrir une alternative aux
dosages radioimmunologiques déjà existants dans d'autres espèces.
Notre propos dans le présent paragraphe, est de détailler les tests que
nous avons effectués au cours des différentes étapes de mise au point du
protocole standard.
76
4.2.4.2 Protocole standard
80
60
a 40
10
ol " " , , '" l" , " '" 1 " l " " '" 1 "" 1
Dose (ng/ml)
Logil (Bi/Bo)
~
b ·1
-3
Dose (Dg/ml)
Fig. 4.11
77
notre objectif a été de s'approcher d'une valeur d'environ 1.8 unités de
densité optique afin d'augmenter l'écart entre les valeurs des puits
"blancs" et celles des puits "NSB". En utilisant une dilution de l'AC laire
au 1/40 000 en présence d'un greffage de la VTG à 600 ng/ml, nous avons
obtenu des valeurs de Bo proches de 1.8 unité D.O. et des "NSB" voisins
de 0.1 unité 0.0.
Ceci nous a permis, dans un second temps de passer à l'établissement
des courbes standards (BlBo et Logit BIBo) tout en sachant qu'un bon
écart entre les densités optiques des puits "NSB" et des puits "Bo"
permettrait un meilleur étalement et une meilleure observation de ces
courbes standards.
o
-)
-2
Dose (n~/ml)
Fig. 4.12.
78
4.2.4.5 Vérification de la spécificité du dosage
Dans le cas présent, nous avons testé dans une même manipulation,
des dilutions sériées (de deux en deux) de plasmas de femelles en
vitelJogénèse ou de mâles.
Nous savions déjà, pour ravoir démontré précédemment, que notre
anticorps développé contre la Vtg 2 électroéluée, lorsqu'il est épuisé, ne
réagit pas avec le plasma de mâle en immunoblotting ni en
immunoprédpitation. Il nous fallait toutefois vérifier cette absence de
réaction en ELISA, qui est une technique beaucoup plus sensible que les
deux précédentes.
Sur la figure 4.12. sont représentées les droites de régression
obtenues pour les dilutions de plasma de femelles en vitellogénèse : leur
parallélisme avec la gamme étalon de VTG prouve l'identité entre
l'antigène reconnu dans ces plasmas de femelles et la VTG purifiée.
Sur cette même figure ne sont pas présentées les dilutions sériées de
plasma de mâles, qui auraient pu être figurées par un trait horizontal,
absolument pas parallèle à la gamme étalon.
4.3. Discussion
La vitellogénèse est une étape importante du développement ovarien.
L'embryon devra trouver dans l'oeuf, les substances nutritives qui lui
seront nécessaires pour assurer sa croissance. Ces substances constituent le
vitellus. Pour tous les Vertébrés inférieurs le vitellus est formé à partir
d'une protéine plasmatique précurseur: la vitellogénine (VTG). Elle est
synthétisée dans le foie chez la femelle pendant la période de l'ovogénèse J
et chez le mâle ou la femelle immature après une induction œstrogénique.
Elle est incorporée sous stimulation gonadotrope dans l'ovocyte en
croissance et transfonnée en vitellus. L'ensemble de ces phénomènes
constitue la vitellogénèse dite exogène (Wallace, 1985 ; Le Menn &
Pelissero, 1991).
Chez les poissons, en particulier les Téléostéens, la VTG est une
lipoprotéine glycophosphorylée, d'une masse moléculaire variant de 300 à
600 kDa. Chez certaines espèces, le contenu lipidique de cette VTG est
très élevé et représente environ 20% du poids de la protéine (Campbell &
Idler, 1980 ; De Vlaming et al., 1980).
- - OOZ
4 6 J a p ~ q B II\Id Ba~
80
4.3.2. L'identification de la VTG plasmatique par
électrophorèses et techniques associées
4.3.2.1. Généralités
a) PAGE ·SDS
Les électrophorèses en gel de polyacrylamide nous ont permis de
localiser la YTG plasmatique, de suivre sa dynamique d'apparition dans la
plasma sous l'action du benzoate d'œstradiol chez les mâles ou les femelles
immatures, et de préparer l'électroélution des fractions vitellogéniques
pour vérifier la pureté de la purification pratiquée. Cette méthode a en
outre l'avantage de pouvoir, à partir d'un prélèvement sanguin non
traumatisant, séparer les poissons vitellogéniques des immatures et des
mâles sans passer par l'histologie qui est non seulement beaucoup plus
longue mais nécessite également de sacrifier les animaux.
Les études consacrées à l'électrophorèse des protéines sériques des
poissons sont déjà nombreuses. Diverses modalités de cette technique ont
prouvé leur application dans ce domaine. Les premiers travaux réalisés
sur gel d'amidon (Drillon et al. 1963 ; Creyssel et aL, 1964) ont identifié
les différentes fractions plasmatiques qui opposent les Téléostéens,
Sélaciens et Cyclostomes. L'électrophorèse sur gel d'acétate de cellulose a
ensuite permis une meilleure définition des différents constituants
plasmatiques et, pour la première fois, la visualisation en électrophorèse
native de deux fonnes de vitellogénine chez Gobius niger (Le Menn,
1978). Olivereau & Ridgway (1962) ont les premiers utilisé le PAGE-
SDS pour séparer les Oncorhynchus sp en vitellogénèse ou immatures.
Le gel de polyacrylamide est un excellent support pour la séparation
électrophorétique des différents constituants protéiques. Ce gel est formé
d'un réseau dont les mailles constituent un tamis qui retient les différentes
fractions suivant leur taille. La séparation des constituants du mélange
protéique se fait à l'intérieur du gel sous l'influence du courant électrique,
)es protéines chargées différemment se déplacent et se séparent les unes
des autres. Lors d'une électrophorèse de type natif la séparation se fait en
fonction du poids moléculaire, de la fonne et de la charge de la molécule.
Lors d'une électrophorèse en milieu sns qui charge toutes les protéines
de façon négative, la séparation se fait uniquement en fonction du poids
moléculaire.
4.3.6.1. Généralités
L'ELISA adapté sur O. niloticus a permis de quantifier la
vitellogénine pour détenniner sa sensibilité en mettant en compétition la
VTG libre (en solution dans la gamme étalon ou dans l'échantillon à
doser) et la VTG greffée (par adsorbtion sur la plaque de microtitration),
pour les sites de fixation de l'anticorps spécifique anti-vitellogénine.
Le principe même de cette technique immunologique est de pouvoir
doser une quantité d'antigène présente dans une solution en comparant la
D.O. observée pour cet échantillon à celle obtenue pour une gamme
étalon d'antigène de concentration connue.
La technique ELISA (Enzyme-linked-immuno-sorbent-assay) que
nous avons utilisée tend maintenant à se généraliser parce qu'elle présente
une sensibilité similaire à celle obtenue par RIA, voire meilleure, et
présente l'avantage de ne pas nécessiter l'utilisation de radio-isotopes. En
effet, le marquage préalable de l'antigène par des radioisotopes peut
entrainer une perte d'immunoréactivitê de l'antigène marqué. D'autre
part, ces traceurs à cause de leur demi-vie assez courte, ne peuvent être
stockés durant de longues périodes. Aussi, depuis le travail réalisé par
Nufiez-Rodriguez et al. (1989) sur la VTG de Sole Solea vulgaris, la
technique ELISA a été pratiquée pour le dosage de la YTG de plusieurs
espèces de poissons : le poisson chat lctalurus punctatus (pacoli et al.,
1990), l'esturgeon sibérien Acipenser baeri (Cuisset et aL, 1991 ; Cuisset,
1993), Anguilla anguilla et Labeo rohita (Burzawa-Gérard et al., 1991),
la truite fario Salmo trutta (Maisse et al., 1991), le bar Dicentrarchus
labrax (Mafianos et aL, 1991), et récemment sur Oreochromis
mossambicus (Kishida & Specker, 1994).
4.3.6.2. Spécificité
La spécificité du dosage est liée à celle de l'anticorps vis à vis de son
antigène. Nous avons dans une première étape mis au point cet ELISA en
utilisant l'anticorps anti-vitellogénine fabriqué avec la Vtg 2 électroéluée.
Nous avons choisi cet anticorps parce qu'il est hautement spécifique ne
reconnaissant pas les protéines plasmatiques autres que la viteIlogénine
En choisissant des transformations statistiques de la dose beaucoup
d'auteurs comme Nufiez Rodriguez et al. (1989), Cuisset et al. (1991),
Cuisset (1993), Kishida et al. (1994), Mafianos et aL (1994) et nous-
mêmes avons observé un très bon parallélisme entre la droite de
régression de la gamme étalon de YTG et celles des différentes dilutions
de plasmas contenant de la vitellogénine : plasma induit, plasma de
poissons en vitellogéne et broyat de vitellus. Les plasmas de juvéniles ou
ceux des vrais mâles témoins ne sont pas parallèles, donnant une droite de
régression linéaire horizontale.
La comparaison des droites de régression est basée sur l'analyse de
covariance utilisant le test F (Snedecor & Cochran, 1957 ; Sokal & Rohlf,
1981), après avoir testé l'homogénéité de leur variance par le test de
Bartlett.
87
4.4.6.3. Sensibilité
~,.,..----,---...,.,-.J J_ _
o Incubation buccale Garde
22 27
.
o
1 -
1
- - - 15
Fig. 5.1.
89
9 z L
o o
Ol Ot 0
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09 09
90
5.4 Résultats
La Fig. 5.2. exprime les valeurs obtenues en fonction des stades de
développement ovocytaire chez les femelles prélevées mensuellement à
Nianga.
Dans les Fig. 5.3. et 5.4., les résultat des dosages effectués par Ph.
Tacon sont exprimés en fonction des jours du cycle sexuel et
correspondent à des femelles élevées en aquarium.
5
~
4
CI)
C' 3
a:
2
1
-- /
S P
o~ i
lli..C.
)
• G ~
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
JOURS
10
1
b
1
8
--
~ 6
CI)
"a: 4
0
2 3 4 5 6
STADES OVAR(ENS
Fig. 5.3.
9 l
jour. Les taux d'E2 diminuent ensuite significativement le 15ème jour,
puis restent ensuite à peu près constants jusqu'à la fin du cycle sexuel
avec quelques fluctuations autour d'une vingtaine de ng/ml.
5.3. Discussion
L'analyse des résultats des paramétres plasmatiques obtenus chez
les femelles d 'Oreochromis nilOfieus pennettent de distinguer deux
phases de développement de la maturité sexuelle chez cette espèce ;
avant et après le 12ème jour du cycle sexuel.
Chez les femelles prélevées au laboratoire, Tacon (1995) constate
que l'ensemble des paramètres étudiés présente une variation dans le
profil des données avec une chute significative temporaire des valeurs
au douzième jour du cycle (Fig. 5.4.). L'évolution des RGS des
femelles incubantes montre un profil similaire, confirmant un
ralentissement de la vitelIogénèse pendant cette première partie du
cycle sexuel (Fig. 5.3.).
L'eKarnen des taux de vitellogénine chez les femelles sauvages
prélevées à Nianga rapporté aux stades de développement ovocytaire
-
w
Ct
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E
30
1 a
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> INC G
o 1 [ , 1 I i i 1 \ l
o 3 6 9 12 15 18 2~ 24 27
Fig. 5.4.
92
montre également une chute ou tout au moins un plateau au cours des
stades 3 et 4. Si nous nous reportons aux RGS de cette même
population de femelles, exprimés en fonction des stades de
développement ovarien (Fig. 3.23.) nous constatons que ce rapport
évolue lentement jusqu'au stade 3, la croissance rapide de l'ovaire
n'intervenant que pour les stades 4 et 5. La corrélation entre les stades
de développement ovarien et le RGS, faite par Tacon (1995) sur des
femelles élevées en laboratoire, montre que le stade 3 correspond au
stade de développement ovarien acquis dans la première partie du cycle
sexuel, jusqu'aux environs du 12ème jour, les stades 4 et 5
n'apparaissant que dans la deuxième partie du cycle (Fig. 5.3).
Or c'est à partir de ce 12ème jour que les alevins sortent de la
cavité buccopharyngienne de la mère qui commence leur garde se
poursuivant pendant une semaine.
Il semblerait que les soins parentaux aient une répercution
physiologique chez la mère, freinant temporairement le développement
ovocytaire en cours. Ce ralentissement de l'ovogénèse apparaît au
niveau des paramètres plasmatiques dont les profil présentent une chute
significative entre le 12ème et le 15ème jour du cycle de femelles
élevées en laboratoire. On le perçoit également dans les données
obtenues chez les femelles sauvages, avec une diminution des taux de
vitellogénine circulante pendant les stades 3 et 4 du développement
ovarien, stades présentés par l'ovaire pendant cette période de garde
parentale.
Nos résultats mettant en évidence l'existence de deux phases dans
le cycle sexuel confirment les données précédemment acquises chez
d'autres espèces de tîlapia. Chez Oreochromis mossambicus, la
croissance des ovocytes reste bloquée pendant la garde parentale, ne
reprenant qu'en fin de cycle. L'analyse des profils d'E2 et de
testostérone confirment le ralentissement du développement ovarien
pendant les soins parentaux (Smith et Haley, 1987).
5. 6. Conclusions
Les variations des taux de stéroïdes sexuels et de vitellogénine au
cours du cycle sexuel chez Oreochromis niloticus s'incrivent dans les
mécanismes généraux de reproduction rencontrés chez la plupart des
poissons Téléostéens.
La vitellogénine semble être le paramètre plasmatique circulant le
plus déterminant pouvant être corrélée au RGS. Les courbes des taux de
testostérone et d'œstradiol se comparent aisément avec celle obtenue pour
le RHS (Fig. 3.24.).
L'ensemble des paramètres plasmatiques étudiés soulignent un
ralentissement temporaire de l'ovogénèse occasionné par le comportement
maternel lors de la garde des alevins.
Conclusions et perspectives
Dans cette étude, nous nous sommes attachés à décrire les différents
stades de l'évolution des ovocytes à l'aide de la microscopie photonique,
de la microscopie électronique à transmission et à balayage, de l'analyse
d'images ainsi que de techniques immllllologiques variées. Nous avons
déterminé 6 stades correspondant aux différentes étapes physiologiques de
l'ovogénèse.
Nous avons constaté que le développement des ovocytes n'est pas
synchrone. Chez les femelles matures il est fréquent de trouver toutes les
générations d'ovocytes du stade 1 au stade 6. Le cycle très court de
l'ovogenèse ne facilite pas les observations de tous les changements
ovocytaires.
L'étude en microscopie électronique associée â de l'immuno-
cytochimie photonique et électronique nous a pemis de suivre
l'élaboration du follicule ovocytaire et les différentes étapes de
l'endocytose de la vitellogénine dans l'ovocyte.
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