010004460

REMERCIEMENTS
Les Irovou)' préselllés dOlls ce mémoire olll élé réolisés ou seill d'ulle équipe mùle
ORSfOU/CIRAIJ-CP ou Loboroloire des Ressources Célléliques el Amé/iorolioll des
Plollies frop/coles (L RCAPr). Je remercie IJ. /lAJlOIi pour l'occueil qu'il m'o offert ou
Seill de SOIl loboroloire.
Je liells d remercier IJ. HlC/IiIAC pour m 'ovoir occeplée dOlls so formolioll doclorole,
que /'oi rejoillie d 10 fill de mOIl IJEA, el m 'ovoir permis de réoliser celle Ihèse. ()u 'il
Irouve /ci mo grol/lude pour 10 compréhellsloll d01l1 il 0 foil preuve d mOIl égord el
pour 10 cOIl(;ollce qu'il m'o lémoigllée.
Ues plus vifs remerciemellis el mo grolilude v01l1 d Ume 8t/FFA/?/J-UO/?ff el d

Jeoll-Luc JlF/?/Jflf, qui olll ellcodré celle Ihèse, pour ovoir loujours suivi ovec illlérêl
10 progressioll de mOIl Irovoll, pour leurs cOllseils el leur poliellce, el pour m 'ovoir
loujours soulellue pelldolll ces quolre ollllées. ()u 'ils Irouvelll ici I(;>)'pressloll de mo
profollde eslime.
J'odresse mes remerciemellis d Ume HlClIAt/)'-FF/?/?/F/?F pour ses précieu)' cOllseils el

pour ovoir occeplé 10 lourde lôche d'êlre roppor/eur de ce IrovOiI.
Ues plus vifs remerciemellis V01l1 égolemelll d Ume SAIICIfAIi pour ovoir occeplé
d'êlre ropporleur de celle Ihèse, d IJ. CO/?IIt/ el IJ. 8At//J0t//1i pour ovoir occeplé d'êlre
e)'omilloleurs ou seill du Jury.
()ue IJ. JAC08SFII reçoive mo profollde groll/ude d'ovoir occeplé de vellir de /lollovre
pour êlre préselll dOlls le Jury de Ihèse ell 10111 qu (;>)'omilloleur. Je le remercie
égolemelll de m 'ovoir ouporovolli occueillie dOlls SOIl Loboroloire, lors d'ull sloge sur 10
recherche des morqueurs proléiques effeclué dOlls le codre du progromme européell
SflJJ.
Je remercie vivemelll Uichel #0//?01, Ilolre géllie slolisl/Ciell, pour ses cOllseils
judicieu)' el SOIl oide illeslimoble ou cours de l'ollo(yse slolislique des résullols el lors
de 10 rédoclloll des or/ie/es.
Je liells d e)'primer mo recolllloissollce d Frédûique C/?OS/JFJlAIICF pour SOIl oml/ié el

pour SOIl oide précieuse loulou 10llg de celle Ihèse el d qui /'oi fo/l posser de
10llgues heures, soir el wee,f-elld, lors de 10 réolisolloll des plollches pholos, /e solue
SOIl lolelll,'
d Jlolûie /lOCIIFI?, qui 0 rejoilll récemmelll 10 (' Cocollul leom ,l, pour SOIl omilié, ses
cOllseils el SOIl souliell mois oussi pour so dispollibi/;/é "
d Alllle 8fA11FS, pour SOIl om/lié, SOIl oide el SOIl elllhousiosme loulou 10llg de ses
sù mois de sloge pelldolll lesquels IlOUS OVOIlS colloboré,'
d fhierry 8Ft/ff, d #olho/;e CIIA8/?/ffAIICf, el Alllle CO/II el Frédérique R/CIIAt/!J, pour
leur om/lié el leur SOUllell, el je souho/le bOlllle cOlllilluollOIl d lous les Ihésords el
IJEA.
je lie/7s 101J1 spécioleme/71 d remercier Yéro ilARlJllI1 qlJi 0 osslJré, ovec or/, 10 mise
e/7 forme de ce mémoire, pOlJr leqlJel elle 0 i/7vesli de 10/7glJes helJres.
Uerd d 1'e/7semble des membres dlJ Loboroloire pOlJr lelJr occlJe/1, d Uoryse el d
Yéro OIJ secréloriol.
Ues remercieme/7ls v0/71 d 101JIes les perSO/7/7es qlJi m 0/71 occordé lJ/7e oide
lech/7iqlJe précielJse el eflïcoce OIJ cOlJrs de celle Ihèse .. A/7/7e 81ATTES el ElJgé/7ie
IIE8RARIJ qlJi 0/71 réolisé lJ/7e por/ie des dosoges des besoi/7s /7lJlri/ifs OIJ COlJrs de lelJr
sloge OIJ Loboroloire, Chrisli/7e IIIJET lors des éllJdes hislo el cylologiqlJes, JI. CIIAIIIJT el
Sylvie /J1J1J18EAIJ lors des o/7o/yses IIPL C, AIOIo /?lrAI pOlJr 10 réolisolio/7 des clichés
phologrophiqlJes. Ues remercieme/7ls vo/71 d l'éqlJ/pe de JI. PIIJJl81J dlJ CI/?A/J-CE/?/JAf qlJi
o réolisé les dosoges des slJcres sollJbles. je remercie e/7lio 10 slolio/7 Cocolier Uorc
/Jelorme de lï/JErO/?-/Jpo e/7 Côle dïvoire pOlJr 10 fOlJr/7illJre dlJ molériel végélo/' e/7
por/iclJlier, JI. SAIICARl, JI. 81J1JRlJfI), el JI. iI'C1I1J pOlJr lelJr eJ'celle/7le colloborolio/7.
Uerci d mes omis el d mes proches, pOlJr lelJr sOlJlie/7 cO/7slo/7/, /e sois qlJ 'ils /7 0/71
pos besOlo d'êlre cilés pOlJr se reco/7/7oÎlre, el/e sollJe 10IJs mes omis mlJsicie/7s.
E/7lio, merci d mes pore/7ls qIJ/' m '0/71 101J/01Jrs sOlJle/7lJe el e/7colJrogée 101J1 OIJ 10/7g
de ces o/7/7ées...
ABREVIATIONS
1 ABREVIATIONS 1
2,4-D: acide 2,4 dichlorophénoxyacétique
2,4,5-T: acide 2,4,5-trichlorophénoxyacétique
ADP: adénosine diphosphate
ATP: adénosine triphosphate
Ala: alanine
ANOVA: analyse de variance
ANCOVA: analyse de covariance
Arg: argmme
Asn: asparagine
Asp: acide aspartique
BAP: benzylaminopurine
CAH: classification ascendante hiérarchique
CIRAD: Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le
Développement
Cys : cystéine
DNS : dinitrosalycilate
DTT : 1,4-Dithiothréitol
EtOH : éthanol
FDA: fluorescéine diacétate
F-6-P : fructose-6-phosphate
Gin: glutamine
Glu: acide glutamique
G-6-P: glucose-6-phosphate
Gly : glycine
His : histidine
HPLC : High Perfonnance Liquid Chromatography
Ile : isoleucine
Leu: leucine
LI, L7, L82: noms attribués aux différentes lignées de cals isolés et multipliés à partir
d'explants inflorescentiels de cocotier
Lys: lysine
MetOH: méthanol
Met: methionine
MF: matière fraîche
MS: matière sèche
NADP/
NADPH: nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate
NJM: Nain Jaune Malais
Norl: norleucine
PB121 : Hybride Nain Jaune Malais x Grand Ouest Africain
ORSTOM: Institut Français de Recherche Scientifique pour le Développement en
Coopération
PBC 23 à 26: noms attribués aux différentes lignées de cals isolés et multipliés à partir
d'explants foliaires de cocotier
PBS : tampon phosphate salin
Phe: phénylalanine
PITC : phénylisothyocyanate
Pro: proline
RT: temps de rétention
SAB : sérum albumine de boeuf
SDS : sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE: électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS
Ser: sérine
TEA: triéthylamine
TEMED: tétraméthyléthylène diamine
Thr : thréonine
Tris: Tris-(hydroxyméthyl)-amino méthane
Tyr : tyrosine
Val: valine
VSC : volume cellulaire sédimenté
S01VI:IVIA..IRE
SOMMAIRE 1
INTRODUCTION 1
1- LE COCOTIER 5
1- HISTOIRE DU COCOTIER 5
2- CARACTERISTIQUES BOTANIQUES 7
2.1- Le système racina ire 7
2.2- Le système aérien 7
2.3- Les inflorescences 9
2.4- Le fruit. 9
2.5- Ecologie du cocotier 9
3- MALADIES DU COCOTIER 12
4- UTILISATIONS DU COCOTIER 12
4.1- Utilisations à l'échelle industrielle 14
4.1.1- Le coprah 14
4.1.2- L'eau de coco 14
4.1.3- Le lait de coco 15
4.1.4- La noix de coco rapée 15
4.2- Petites industries et usages en milieu villageois 15
5- SELECllON DU COCOTIER 17
2- PROCEDE DE REGENERATION PAR EMBRYOGENESE SOMATIQUE 19

1- INTRODUCTION: CONCEPT D'EMBRYOGENESE SOMATIQUE 19
2- ETAT DES CONNAISSANCES SUR L'INITIATION DE L'EMBRYOGENESE SOMATIQUE 21
2.1- Hypothèses sur l'origine des cellules embryogènes 21
2.2- Rôle des composés du milieu et des facteurs de l'environnement des tissus dans
l'initiation de l'embryogenèse somatique 23
2.3- Changements structuraux et métaboliques précoces lors de l'embryogenèse somatique .. 26
2.4- Marqueurs génétiques et moléculaires de l'initiation de l'embryogenèse 27
3- EMBRYOGENESE SOMATIQUE CHEZ LE COCOTIER 29

1- DIFFICULTES RENCONTREES LORS DE L'EMBRYOGENESE SOMATIQUE
DU COCOTIER ET STRATEGIES DE RECHERCHE 29
2- DESCRIPTION DU PROCEDE D'EMBRYOGENESE SOMATIQUE
EN MILIEU SOLIDE DEVELOPPE PAR L'ORSTOM ET LE CIRAD-CP 32
3- LIMITES ACTUELLES DU PROCEDE 34
4- OB..IECTI FS 35
MATERIEL & METHODES 37

1- MATERIEL VEGETAL UTILISE 37
1.1- Cals d'origine inflorescentielle 37
1.2- Cals d'origine foliaire 37
2- TECHNIQUES DE CULTURE IN VITRO 39
2.1- Milieux et conditions de culture 39
2.1.1-Techniques en milieu solide 39
2.1.2- Suspensions 39
2.1.3- Essais de maturation des suspensions 41
2.2- Modalités de croissance 42
2.2.1- Cals en milieu solide 42
2.2.2- Suspensions 42
3- ETUDE HISTOCYTOLOGIQUE 43
3.1- Microscopie photonique 43
3.1.1- Observations sur matériel vivant : 43
3.1.2- Observations sur matériel fixé 46
3.2- Microscopie électronique à transmission 46
4- ANALYSE DES SUCRES, DES PRINCIPAUX ELEMENTS MINERAUX
ET DU 2,4-D L1BREDANS LES MILIEUX SOLIDES 46
4.1- Préparation des échantillons de milieu en vue des dosages 46
4.2- Dosage du saccharose, du glucose et du fructose 46
4.2.1- La technique enzymatique de Bergmeyer et Bernt (1974) : 46
4.2.2- La technique colorimétrique de Fisher et Khotes (1951) : 49
4.3- Dosage des principaux anions et cations 49
4.4- Analyse du 2,4-0 non adsorbé par le charbon actif du milieu 49
5- ANALYSE DE LA TENEUR EN SUCRES SOLUBLES AU SEIN DES CALS 52
6- DETECTION ET QUANTIFICATION DES ACIDES AMINES AU SEIN DES CALS 52
7- ANALYSE QUANTITATIVE ET QUALITATIVE DES PROTEINES SOLUBLES
AU SEIN DES CALS 55
7.1- Etude quantitative 55
7.2- Etude qualitative 55
8- RECHERCHE DE MARQUEURS PROTEIQUES AU SEIN DES TISSUS
PAR « IMMUNODETECTION » 56
8.1- Extraction 56
8.2- Electrophorèse SDS-PAGE 56
8.3- Western blot 56
8.4- Immunodétection avec l'anticorps monoclonal 7C5 59
9- EXPLOITATION STATISTIQUE DES RESULTATS 59
9.1- Analyse de variance et comparaison de moyennes 59
9.2- Analyses de covariance intragroupe, test de parallélisme et régression multiple 62
9.3- Classification ascendante hiérarchique et analyse discriminante 62
RESULTATS 63
PARTIE 1- ETUDE DES FACTEURS NUTRITIFS IMPLIQUES LORS DE L'INITIATION

DE L'EMBRYOGENESE SOMATIQUE EN MILIEU SOLIDE 64
INTRODUCllON: DEFINITIONS 64
CHAPITRE 1- CARACTERISATION MORPHOLOGIQUE ET STRUCTURALE DES LIGNEES DE CALS 66

1- ETUDE MORPHOLOGIQUE DES LIGNEES DE CALS 66
2- DESCRIPTION HISTOLOGIQUE DE LA STRUCTURE DES CALS 66
2.1- Cals sur milieu de multiplication 66
2.1.1- Cals de type 1 67
2.1.2- Cals de type Il 67
2.2- Cals sur milieu d'initiation de l'embryogenèse 68
2.2.1- Etude histologique au microscope optique 68
2.2.2- Etude ultrastructurale '" 69
3- CONCLUSiON 70
CHAPITRE Il - ETUDE DES BESOINS NUTRITIFS SPECIFIQUES AU COURS

DE L'INITIATION DE L'EMBRYOGENESE 73
INTRODUCTION 73
1- ETUDE DE LA CROISSANCE DES CALS 74
1.1- Lignée L82 (<< type Il ») 74
1.2- Lignée L7 (<< type 1 ») 74
1.3- Conclusion 74
2- TENEUR EN EAU DES CALS 76
3- ETUDE CINETIQUE DE L'EVOLUTION DES COMPOSES DU MILIEU 76
3.1- Etude cinétique de l'absorption en sucre exogène 78
3.1.1- Lignee L82 (<< type Il ») 78
3.1.2- Lignee L7 (<< type 1 ») 78
3.2- Etude cinétique de l'absorption des principaux éléments minéraux 80
3.2.1- Lignee L82 (<< type Il ») 80
3.2.2- Lignee L7 (<< type 1 ») 80
3.3- Evolution du pH des milieux 81
3.4- Corrélations entre l'évolution des paramètres du milieu 81
3.5- Discussion '" 84
4- ETUDE DE LA COMPOSITION EN SUCRES SOLUBLES, EN ACIDES AMINES LIBRES
ET EN PROTEINES SOLUBLES DES CALS 89
4.1- Etude cinétique de la teneur en sucres solubles 89
4.1.1- Lignée L82 (<< type Il ») 89
4.1.2- Lignée L7 (<< type 1 ») 89
4.1.3- Conclusion 89
4.2- Etude cinétique de la teneur en acides aminés 91
4.2.1- Analyse des données 91
4.2.2- Lignée L82 (<< type Il ») 97
4.2.3- Lignée L7 (<< type 1 ») 104
4.3- Etude quantitative et qualitative des protéines solubles 110
4.3.1- Lignée L82 (<< type Il ») 110
4.3.2- Lignée L7 (<< type 1 ») 111
5- CONCLUSiON 114
CHAPITRE III -INFLUENCE D'UNE AUGMENTATION DE LA CONCENTRATION EN SUCRE

EXOGENE SUR L'INITIATION DE L'EMBRYOGENESE 118
INTRODUCTION 118
1-INFLUENCE DE DIFFERENTES CONCENTRATIONS EN SUCRE SUR L'INITIATION
DE L'EMBRYOGENESE 118
2- COMPARAISON HISTOCYTOLOGIQUE DE L'INITIATION DE L'EMBRYOGENESE
SUR MILIEU ENRICHI EN SACCHAROSE ET MILIEU ENRICHI EN 2,4-D 119
2.1- Etude histologique 119
2.2- Etude ultrastructurale en microscopie électronique 120
2.3- Conclusion 121
3- L'AUGMENTATION DE LA CONCENTRATION EN SACCHAROSE
MODIFIE T-ELLE L'EQUILIBRE D'ADSORPTION DU 2,4-D SUR LE CHARBON ACTIF ? 121
4- EVOLUTION DES AUTRES PARAMETRES DU MILIEU 123
4.1- Sucres 123
4.2- Pression osmotique 124
4.3- pH 124
4.4- Conclusion 124
5- EVOLUTION DES CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES DES CALS
ET DES PARAMETRES DES MILIEUX APRES LA MISE EN CULTURE 126
5.1- Modalités de croissance 126
5.2- Teneur en eau 126
5.3- pH des milieux après la mise en culture 126
5.4- Pression osmotique des milieux après la mise en culture 127
5.5- Sucres des milieux après la mise en culture 127
5.6- Composition en sucres solubles des cals 127
5.7- Conclusion 130
6- CONCLUSiON 130
CHAPITRE IV - RECHERCHE DE MARQUEURS PROTEIQUES PRECOCES DE L'EMBRYOGENESE

SOMATIQUE EN MILIEU SOLIDE 132
INTRODUCTION: INTERET DE RECHERCHER DES MARQUEURS PROTEIQUES
PRECOCES DE L'EMBRYOGENESE 132
1- DESCRIPTION DU MARQUEUR SELECTIONNE 133
2- RECHERCHE DE CE MARQUEUR DANS LES TISSUS DE COCOTIER 135
2.1- Etude du pattern protéique en électrophorèse monodimensionnelle 135
2.2- Westernblott et application de l'anticorps monoclonal. 135
3- Conclusion 135
DISCUSSION 137
PARllE Il - MISE AU POINT DES TECHNIQUES DE SUSPENSIONS EMBRYOGÈNES 151
INTRODUCTION 151
CHAPITRE 1- COMPORTEMENT DE DIFFÉRENTES LIGNÉES DE CALS EN MILIEU LIQUIDE 154

INTRODUCTION 154
1- TRANSFERT EN MILIEU LIQUIDE DE CALS EN CONDITION DE MULTIPLICATION 155
1.1- Cals dont la multiplication est assurée par une assise pseudocambiale «( type 1 ») 155
1.1.1- Etude morphologique des cals en milieu liquide 155
1.1.2- Description histologique de la structure des cals 158
1.1.3- Suivi de la croissance des cals 159
1.2- Cals dont la multiplication est assurée par une assise protodermique (<< type Il ») 161
1.2.1- Etude morphologique et histologique 161
1.2.2- Suivi de la croissance des cals 161
1.3- Conclusion 164
2- ESSAIS AVEC DES CALS PREALABLEMENT INDUITS EN EMBRYOGENESE
EN MILIEU SOLIDE 164
3- TRANSFERT EN MILIEU LIQUIDE EN ABSENCE DE CHARBON ACTIF 165
3.1- Ajustement de la concentration en 2,4-D libre 165
3.2- Etude morphologique et structurale 168
3.3.1- Observations sur matériel vivant.. 168
3.3.2- Observations sur matériel fixé 170
3.4- Suivi de la croissance des cals 171
3.5- Conclusion 171
4- CONCENTRATION EN 2,4-D LIBRE DES MILIEUX DE PROLIFERATION SELECTIONNES 171
5- CONCLUSiON 173
CHAPITRE Il - PROLIFÉRATION DES SUSPENSIONS 175

INTRODUCTION 175
1- ETUDE MORPHOLOGIQUE ET STRUCTURALE DES SUSPENSiONS 175
1.1.1- Observations sur matériel vivant.. 175
1.1.2- Observations sur du matériel fixé 176
1.2- Etude en microscopie électronique 177
1.3- Discussion 177
2- MODALITES DE CROISSANCE DES SUSPENSiONS 179
2.1- Suivi de la croissance des suspensions 179
2.2- Numération des différents catégories cellulaires 181
2.3- Etude de la viabilité cellulaire au sein des suspensions 181
2.4- Discussion 181
3-INFLUENCE DE DIFFERENTES CONCENTRATIONS EN GLUCOSE
SUR L'ETAT DES SUSPENSiONS 184
3.1- Mesures de la pression osmotique des milieux et du poids sec des cals 184
3.3- Conclusion 186
4- CONCLUSiON 186
CHAPITRE III - ETUDE DE L'EXPRESSION DES POTENTIALrrÉS EMBRYOGÈNES

DES SUSPENSIONS 188
INTRODUCTION 188
1- ETAPE D'EXPRESSION EN MILIEU LIQUIDE SANS HORMONE 188
2- ETAPE D'EXPRESSION DE L'EMBRYOGENESE EN MILIEU SOLlDE. 189
2.1- Etude morphologique et structurale 190
2.2- Fréquence des différentes structures observées 191
2.2.1- Effet d'un étalement direct.. 191
2.2.2- Effet d'un lavage en milieu liquide sans hormones 191
3- EFFET DU RENOUVELLEMENT COMPLET DU MILIEU ET D'UN REPIQUAGE
QUOTIDIEN EN MILIEU LIQUIDE SANS HORMONE. 194
4- CONCLUSiON 195
DISCUSSION 197
CONCLUSION GENERALE 205
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 207
ANNEXES 220
INTRO:DUCTION"
INTRODUCTION
INTR.O:DUCTION
e cocotier, surnommé « arbre aux mille usages» est une plante oléagineuse qui
L représente une ressource économique essentielle pour tous les pays de la zone
intertropicale humide. Dans les cocoteraies industrielles, l'albumen déshydraté constitue le
coprah dont on extrait l'huile. La production annuelle actuelle est estimée à 4,9 millions de
tonnes de coprah et 3 millions de tonnes d'huile (DE TAFFIN, 1993). L'Asie et le Pacifique sont
les premières régions exportatrices (plus de 85% de la production mondiale en 1991), en
particulier les Philippines, l'Indonésie, l'Inde, la Papouasie-Nouvelle-Guinée et le Sri-Lanka
(tableau 1). L'économie des micro-Etats du Pacifique repose sur cette monoindustrie. Mais
cette plante constitue aussi une culture villageoise. Dans l'économie domestique, 360 types
d'utilisation liés à la culture du cocotier ont été dénombrés, ce qui l'a fait aussi surnommer
« arbre de vie ».
L'huile de coprah, leader sur le marché des oléagineux jusqu'en 1960, n'occupe plus
qu'une place marginale parmi les huiles végétales, et si son marché est encore important, des
jours sombres sont à prévoir. Depuis une trentaine d'années, l'industrie des corps gras
d'origine végétale doit faire face à une demande mondiale de plus en plus exigeante, suivant
les progrès économiques et techniques des pays développés et leur consommation, et suivant
la croissance démographique des pays en voie de développement. Les échanges commerciaux
internationaux se sont trouvés modifiés au profit des pays asiatiques devenus les premiers
exportateurs mondiaux d'oléagineux et au détriment de l'Afrique, autrefois l'une des
premières régions exportatrices.
L'industrie du coprah a du mal à faire face à la demande internationale car elle se heurte
à un certain nombre de problèmes économiques et techniques, malgré les progrès réalisés par
les programmes de sélection agronomique dans l'obtention d'hybrides plus performants
(meilleur rendement et résistance à certaines maladies). Le premier problème résulte du
rythme insuffisant des plantations ou replantations, en particulier aux Philippines, principal
exportateur mondial. Le cocotier, généralement allogame, est essentiellement propagé par
graine. Son taux de production est faible. De plus, comme le souligne SASSON (1986), la
reproduction sexuée engendre des variations importantes dans la descendance pour la
productivité de l'arbre, la rusticité et la résistance aux maladies. Ensuite, la collecte des noix,
le séchage de l'albumen pour obtenir le coprah et l'élaboration de l'huile demandent une
main-d'oeuvre importante dont le coût ne cesse d'augmenter. Enfin, les méthodes d'extraction
de l'huile sont, dans de nombreuses régions, restées artisanales et à faible productivité
(HARRIES, 1994).
1
INTRODUCTION
TABLEAU 1 : Pays producteurs de coprah et d'huile de coco
Pays producteurs Production Production

(milliers de tonnes) (milliers de
tonnes)
1969-71 1979-81 1985 (1) 1991 (2) 1991 (2)
Coprah Huile
Asie-Pacifique
Philippines 1582 1897 1700 1883 1246
Indonésie 753 1049 1160 1392 755
Inde 359 374 380 465 231
Sri lanka 209 137 180 61 77
Thaïlande 31 38 35 61 37
Papouasie-Nouvelle 131 145 160 91 35
Guinée
Total 2965 3640 3615 3953 2381
Afrique 150 177 198 257
Amérique latine 231 224 194 276
TOTAL 3346 4041 4007 4486 2381
(1) source: FAO Production Yearbooks 1980 (vol. 34) et 1985 (vol. 39)
(2) source: de Taffin, 1993
2
INTRODUCTION
Les pays de la zone tropicale ont désonnais tendance à lui préférer d'autres oléagineux
locaux: en particulier, le palmier à huile qui gagne du terrain sur le marché international.
Face au déclin du marché du cocotier, les solutions passent en fait par l'amélioration des
techniques traditionnelles d'extraction de l'huile (COCOMUNITY, 1994) et par l'amélioration
de la productivité du matériel végétal. Dans le dernier cas, les biotechnologies pourraient
jouer un rôle primordial.
Depuis plus d'une décennie, des programmes, qui ont pour but la propagation à grande
échelle des meilleurs hybrides issus des programmes de sélection classique, ont vu le jour. La
seule voie possible est le clonage des individus les plus perfonnants (hautement producteurs
ou résistants à certaines maladies) par embryogenèse somatique in vitro.
La multiplication végétative des individus d'élite pourrait générer un matériel de choix
pour les futurs programmes de replantation. Elle pennettrait d'augmenter la productivité et de
faire face aux principales maladies qui déciment actuellement les cocoteraies. Enfin, les
techniques de culture in vitro ouvrent la voie à d'autres techniques, en particulier, la
transfonnation génétique ou encore la cryoconservation des génotypes intéressants.
Sur le cocotier, plusieurs équipes travaillent sur l'embryogenèse somatique. Mais,
comme nous le verrons, le cocotier est une plante extrêmement récalcitrante à la régénération
in vitro.
Dans les pages qui suivent, nous rappellerons les données botaniques concernant la
plante, son mode de reproduction et son importance économique. Il sera fait état des
connaissances sur le concept d'embryogenèse somatique en général et chez le cocotier en
particulier. Enfin, nous situerons les objectifs de cette thèse dans le cadre des recherches
actuelles.
3
INTRODUCTION
"Cette espèce de palmier est la crème de

tous les arbres des Indes et mérite que les
curieux l'admirent. Je crois que cet arbre est
demeuré du paradis terrestre. "
Louis TEMPOREL, d'après DE KERCHOVE, 1878
"Ceuxi, disent les Indous, fut immolé par

son père Ixora dans un accès de jalousie. De son
sang répandu sur la terre naquit le cocotier, cet
arbre qui seul peut suffire à tous les besoins de
l'homme."
Légende Indou, d'après DE KERCHOVE, 1878
4
INTRODUCTION
1- LE COCOTIER.
e cocotier appartient à un ordre de Monocotylédones, les Palmales, comprenant une

L seule famille : les Palmae ou Arécacées, au sein du genre Cocos qui ne comprend
qu'une seule espèce actuelle: Cocos nucifera L. Il existe plus de 80 écotypes répartis en zone
côtière mais aussi jusqu'à 1000 m d'altitude. L'Indonésie, les Philippines et l'Inde représentent
75% de la superficie totale mondiale estimée, en 1993, à II millions d'hectares (DE TAFFIN,
1993).
Avant de présenter les caractéristiques botaniques et les principaux usages du cocotier,
nous rappellerons brièvement son origine et son histoire.
1- HISTOIRE DU COCOTIER
Le cocotier existe vraisemblablement depuis des millions d'années. Des stipes fossilisés
semblables à ceux du cocotier ont été découverts dans différentes strates géologiques; ils ont
été décrits par Brongniart sous le terme de «Palmacites » (DE KERCHovE, 1878). Des noix de
coco fossiles ont été découvertes en Nouvelle-Zélande et en Inde (DE TAFFIN, 1993). D'après
DE CANDOLLE (1883) : « sa présence en Asie, il y a trois ou quatre mille ans, est constatée par
plusieurs noms sanscrits ».
Cependant, l'origine géographique de l'espèce n'est pas connue avec certitude : « à partir
du Pacifique ou de l'Extrême Orient, le cocotier s'est disséminé dans l'Océan Indien jusqu'en
Afrique. Sa présence en Amérique latine est due à une double introduction par l'Est et
l'Ouest» (DE TAFFIN, 1993).
Au VIe Siècle de l'ère chrétienne, le moine égyptien Cosmos Indicopleustes est le
premier à décrire le cocotier après un voyage aux Indes (DE KERCHovE, 1878; MONOD, 1946).
Au XVIe siècle, Christophe Colomb et Vasco de Gama découvrent le cocotier et les autres
palmiers sur les Côtes du Nouveau Monde. Le bolonais Loys de Barthème proclame le
cocotier: « l'arbre le plus fruitier qui fut au Monde ». Au XVIIe siècle, Dampier et Vancouver
le trouvent dans les îles près de Panama, et sur l'île des Cocos (DE CANDOLLE, 1883). Cette
plante n'était jusqu'alors connue que par son fruit que l'on attribuait à une plante marine
gigantesque, car les noix étaient recueillies dans les océans sans en connaître l'origine. En
effet, les noix, capables de flotter, sont disséminées par les courants marins et ont colonisé
ainsi les Iles et les Continents. Elles suivirent ensuite les migrations humaines). Les
missionnaires l'introduisirent en Guyane, les Portugais sur la côte de Guinée.
1 Pourune présentation détaillée de l'histoire du cocotier, nous renvoyons aux ouvrages de DE KERCHOVE (1878),
de MENOND et PANDALAI (1958), de PURSEGLOVE (1981), et de DETAFFIN (1993).
5
A Folioles
Palme
Rachis
m
e a Inflorescence
~L- ---I'1ï~,stipe avec les cicatrices foliaires
Plateau racinaire
PA~~~E~i~~~~~:- Racines fasciculées
~
-
.... . .:.::
D
.-
Figure 1 : LE COCOTIER, Cocos nucifera L. : A et B, Fruit en gennination en coupe

longitudinale (A : ep=épiderme, m=mésocarpe, e=endocarpe, a=albumen);
C, Fruit en germination sans le mésocarpe; D, Feuille adulte; E, Fleur mâle;
F, Fleur femelle; G, Inflorescence; H, Inflorescence avec des fruits
(d'après PURSEGLOVE, 1972 et DE TAFFIN, 1993)
INTRODUCTION
Pour tenter de déterminer si les noix de coco présentes au Panama avaient à l'origine flotté
jusqu'au Panama à partir des îles du Pacifique ou bien si elles avaient été introduites par
l'homme, WARD et BROOKFIELD (1992) ont testé l'hypothèse d'une dérive maritime trans-
pacifique des noix par un modèle de simulation stochastique faisant intervenir les îles du
Pacifique, la direction des vents et des courants marins. L'hypothèse d'une introduction par
l'homme est la plus plausible.
Le terme de cocotier dériverait du portugais koko qui signifie masque (DE VILMORIN, 1991).
2- CARACTERISTIQUES BOTANIQUES
Nous rappelerons les principales caractéristiques botaniques du cocotier (2n = 32) 2.

On distingue deux groupes principaux: les Grands et les Nains, à partir desquels les
méthodes de sélection ont permis la création de différents hybrides.
2.1- Le système racinaire

Le stipe se termine par un plateau radiculaire, en forme de cône renversé, composé de
3000 à 5000 racines primaires d'environ 1 cm de diamètre (Fig. 1). Ces racines peuvent
atteindre 7 à 8 m. Elles portent des racines d'ordre II, qui se ramifient en racines d'ordre III et
IV; ces dernières sont les organes absorbants; les échanges gazeux sont assurés par les
pneumatophores (racines modifiées à géotropisme négatif), situés à la surface des racines
d'ordre 1 et II.
2.2- Le système aérien

Le stipe ou « faux tronc », est constitué de faisceaux libéro-ligneux primaires. Il est
renflé à la base (Fig. 1). A ce niveau, son diamètre dépasse rarement 30 à 40 cm. Mais il peut
atteindre 1 m à 1,50 m. Sa croissance en hauteur dépend de l'âge, de l'écotype et des
conditions de milieu. Vers l'âge de dix ans, elle est de 15 à 30 cm par an pour les Nains, de 70
à 100 cm pour les Grands. La croissance du cocotier est de type monoaxial (HALLE et al.,
1978).
Le stipe est surmonté d'une couronne comportant une trentaine de feuilles composées de
4 à 7 m de long et de 1 m à l,50 m de largeur maximale. La couronne foliaire protège l'unique
bourgeon terminal dont la mort entraîne celle de la plante. Une feuille adulte comporte le
pétiole prolongé par le rachis sur lequel s'insèrent 200 à 300 folioles. Entre la formation des
ébauches foliaires et la mort des feuilles, cinq ans environ s'écoulent. Le rythme d'émission
foliaire et la longueur des feuilles dépendent de l'origine génétique des plantes et des
2 Pour une description morphologique détaillée du cocotier, nous renvoyons aux ouvrages de : MENON et
PANDALAI (1958) et DE TAFFIN (1993)
7
INTRODUCTION
TABLEAU 2 : Composition chimique moyenne de noix de coco matures

(d'après Jochse et al., 1961)
Parties de la noix Proportion pour une noix mature

Albumen 400 g
Coprah 200 g
Huile 125 g. (Valeur calorique: 1170 cal.g-1)
Tourteaux 75 g
Protéines 12 g
Sucres 6,4 g
Vitamines BI 46 VI
Vitamines B2 0,0006 g
Vitamine C 0,023 g
TABLEAU 3 : Caractéristiques écologiques du cocotier (d'après de Taffin, 1993)

(Nous donnons ici des valeurs optimales pour les cultures)
Température: 27°C de moyenne annuelle (1)

Ensoleillement: 2000 à 2200 h. par an
Pluviosité: 150 mm par mois
Hygrométrie: 80 à 90% (en bord de mer) (2)
Topographie: 5% d'idéal de pente (3)
1,5% à 2% de matières organiques (dans les 20 premiers
centimètres) soit: C : 10%0 et N : 1 %0 (4)
Propriétés physiques des sols : 4,5<pH<8
Eléments minéraux essentiels :
K+ : 0,15 à 0,20 meq pour 100 g
Mg 2+ : 0,5 à 1 meq pour 100 g
cr : surtout apporté par les vents marins
(1) Pour une altitude inférieure à 400 m
(2) Ailleurs une pluviosité bien répartie ou la proximité de nappes phréatiques doivent compenser le manque
d'humidité
(3) Au-dessus de 10%, les cultures sont en terrasses ou suivent les courbes de niveau. Dans les régions à
pluviosité élevée et bien répartie, le sol doit être bien drainé; Dans les zones à pluviosité déficitaire. des réserves
d'eau ou une nappe phréatique sont indispensables
(4) C : composés carbonés du sol; N : composés azotés organiques
(5) K+ : potassium; Mg2+: magnésium, cr : chlore
8
INTRODUCTION
conditions de milieu (en moyenne 16 à 17 feuilles émises par an chez les Nains; 13 à 14 chez
les Grands). L'insertion en spirale des feuilles suit une phyllotaxie de 2/5e (HALLE et al. 1978;
DE T AFFIN, 1993).
2.3- Les inflorescences

La floraison commence deux à sept ans après la plantation selon les écotypes. Une
inflorescence monoïque se développe à l'aisselle de chaque feuille (Fig. 1). Deux pièces
oblongues de 50 cm à 1 m de long protègent l'inflorescence: les spathes interne et externe. A
maturité, les spathes se fendent longitudinalement et l'inflorescence s'épanouit. Celle-ci est un
spadice composé, formé d'un rachis sur lequel s'insèrent les épillets qui portent de nombreuses
fleurs mâles et quelques fleurs femelles à la base.
Les fleurs femelles (25 mm de diamètre), de forme globuleuse, comportent trois sépales,
trois pétales et trois carpelles soudés dont un seul est fertile en général. Les fleurs mâles (8
mm de long) comportent six étamines insérées en deux verticilles et un ovaire rudimentaire
stérile. Trois ans s'écoulent entre l'initiation de l'ébauche florale et l'ouverture de la spathe. Le
nombre d'inflorescences formées par an dépend des conditions de milieu. Le nombre de fleurs
femelles est en moyenne de 25 par inflorescence. Le rapport entre le nombre de fruits mûrs et
le nombre de fleurs femelles, ou taux de nouaison, dépend des conditions de milieu. Il est
d'environ 40% sur des individus fertilisés.
2.4- Le fruit
Le fruit, improprement appelé noix, est une drupe monosperme (Fig. 1). La graine ne
subit pas de dormance ni de déshydratation. Sous l'épiderme cireux, se trouvent le mésocarpe
fibreux puis l'endocarpe ligneux qui protège la graine. La graine est constituée d'un tégument
séminal adhérant à l'endocarpe et d'un albumen blanchâtre de 10 à 15 mm d'épaisseur; une
cavité centrale contient un liquide opalescent riche en sucres et en substances de croissance :
l'eau de coco (partie liquide de l'albumen). Les fruits arrivent à maturité environ 16 à 18 mois
après la pollinisation. Au cours de la germination, la partie intermédiaire entre le limbe et le
pétiole cotylédonaire s'allonge et entraîne l'axe embryonnaire hors de la graine. La racine
apparaît la première à l'opposé du renflement gemmulaire. Pendant ce temps, le limbe
cotylédonaire (haustorium ou suçoir) grossit et occupe la cavité de la graine en digérant
l'albumen qui s'est solidifié pendant la maturation. On reconnait la maturité de la noix à la
solidification complète de l'albumen, à la décoloration de l'épiderme et à l'abscission de la
noix du régime. Le taux de reproduction est faible : 100 à 200 noix par arbre et par an. Le
tableau 2 présente la composition chimique de noix matures selon JOCHSE et al. (1961).
9
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Figure 2 Schéma représentant les différentes utilisations du cocotier

TABLEAU 4 : Principaux ravageurs et maladies importantes du cocotier
Agent Symptomes Localisation Traitement

Chenilles de Défoliation Asie Insecticides
Lépidoptères Amérique latine Baeil/us thuringensis
Chenille Scarification des Pacifique Insecticides
Agonoxena argaula folioles Absorption par les
racines de
monocrotophos
Oryctes sp. Galeries dans les jeunes Afrique Lutte préventive ou
feuilles Asie chimique
Nouvelle Guinée
Iles Salomon
Strategus sp. - Certains : Attaque du Asie Lutte préventive
plateau radiculaire Amérique latine Insecticides
- D'autres : stries Madagascar
brunâtres sur feuilles
Puceron: Développement d'un Universelle Lutte biologique
Cerataphis lataniae champignon noir
(fumagine) à partir
d'excrétions d'insectes
sur les feuilles
Viroïde: Maladie dégénérative Philippines Pas de méthode
Cadang-Cadang lente:
- noix avec
scarifications
équatoriales
-diminution de la taille
des inflorescences
Phytophtora sp. - Pourriture du coeur Universelle Insecticides
(Mort de l'arbre) Matériel végétal
- Chute des noix: le tolérant
champignon pénètre Absorption racinaire
dans la graine,
l'albumen devient mou,
le fruit pourrit
(Mort de l'arbre)
Anneau rouge Jaunissement de Amérique latine Feu pour éliminer les
nématode: l'extrêmité des feuilles cocotiers malades
Rhadinaphelenchus Anneau brun puis
rouge dans le stipe
(Mort de l'arbre)
Dépérissement Chute des feuilles Vanuatu Variétés tolérantes
foliaire (Mort de l'arbre)
(Virus à ADN)
Jaunissement mortel Chute prématurée des Amérique Centrale Abattage des arbres
Mycoplasme transmis noix Afrique Variétés tolérantes
par une cyxiide : (Mort de l'arbre)
Myndus crudes
INTRODUCTION
2.5- Ecologie du cocotier

La culture du cocotier nécessite de l'humidité, une température relativement élevée et un
fort ensoleillement. Les caractéristiques écologiques sont présentées dans le tableau 3.
Ce tableau présente également les propriétés physiques des sols. «Les exportations
minérales du cocotier sont dominées par le potassium, le chlore et l'azote», (DE TAFFIN,
1993).
Les déficiences en potassium et en azote affectent la croissance du cocotier, qui peut
être atteint de nanisme avec un stipe aminci et des feuilles peu nombreuses et courtes. Le
chlore, apporté par les embruns marins, est abondant dans l'habitat naturel et les déficiences
sont généralement limitées 3.
3- MALADIES DU COCOTIER
De nombreux ravageurs affectent le cocotier. Parmi eux :
• des insectes défoliateurs ou piqueurs détruisent le feuillage, ce qui réduit la photosynthèse;
• des insectes piqueurs de fleurs et de fruits sont responsables de la chute prématurée des noix
ou de leur déformation qui réduisent la quantité de coprah ;
• des insectes foreurs creusent des galeries dans le stipe ou la flèche.
Certains insectes sont vecteurs de maladies. Les maladies du cocotier sont nombreuses
et peuvent être d'origine fongique ou virale, ou causées par des nématodes, trypanosomes,
mycoplasmes et viroïdes. Ces maladies entraînent la mort de la plante. Le tableau 4 présente
quelques maladies.
4- UTILISATIONS DU COCOTIER
Il existe de très nombreux usages du cocotier (Fig. 2). Il représente l' « arbre de vie»
pour les populations de la zone intertropicale. L'importance de cette plante est représentée
dans l'histoire et les traditions de ces populations. DE KERCHOVE (1878) présente toute une
symbolique intéressante du cocotier. Pour les asiatiques, il a une origine divine. Les Indous
font figurer le cocotier dans toutes les cérémonies religieuses : Brahma désigna la caste des
Chanas pour la culture de cette plante.
Le cocotier, et les palmiers en général, ont inspiré l'art sous toutes ses formes. Ils sont
un emblème pour de nombreux pays. Le cocotier est d'ailleurs représenté sur la pièce de deux
Piso en République des Philippines.
3 Pour une étude détaillée de la nutrition du cocotier, nous renvoyens à l'article de BUCHANAN (1966) et de
nouveau à l'ouvrage de OETAFFIN (1993)
12
INTRODUCTION
TABLEAU 5: Composition de l'eau de coco
Constituants Unité Moyenne Source
Proportion comestible CICAL-CNEVA, 1993

Energie KJ/lOOg 23,0
Eau g/100g 94,0
Protéines g/IOOg 0,3
Lipides totaux g/100g 0,3
Glucides disponibles g/100g 5,0 CICAL-CNEVA,1993
Saccharose g/lOOg tr Dupaigne, 1971
Glucose g/100g 2,1 Dupaigne, 1971
Lévulose g/100g 3,9 Dupaigne, 1971
Fibre alimentaire g/100g tr CICAL-CNEVA, 1993
Sodium mg/l00g 77,0 CICAL-CNEVA, 1993
Potassium mg/l00g 280,0
Calcium mg/l00g 24,0
Magnésium mg/l00g 23,0
Fer mg/l00g 0,1
Cuivre mg/l00g 0,04
Zinc mg/l00g 0,1
Phosphore mg/l00g 25,0
Eq, l3carotène mg/l00g 0,0 CICAL-CNEVA,1993
Vitamine E mg/l00g 0,0
Vitamine C mg/l00g 2,0
Thiamine mg/l00g 0,03
Riboflavine mg/l00g 0,07
Niacine mg/l00g 0,1
Acide panthoténique mg/l00g 0,05
Vitamine B6 mg/l00g 0,03
I
Auxine mg.r 0,07 Tulecke, 1961
Gibbérellines mg. rI tr
l
1,3diphénylurée mg.r 5,8 Tulecke, 1961
Sorbitol mg. rI 15,0
Myoinositol mg. rI 0,01
Acides aminés (1) mg/fruit 131,5 Tulecke, 1961
Alanine J-lg/I00mg 177,1
Arginine J-lg/I00mg 663
Sérine J-lg/I00mg 166
Ac. glutamique J-lg/IOOmg 890
Leucine J-lg/I00mg 246
Proline J-lg/I00mg 478
Thréonine J-lg/I00mg 62
Lysine J.lg/I00mg 398
(1) Ne sont indiqués que les acides aminés les plus représentatifs
13
INTRODUCTION
4.1- Utilisations à l'échelle industrielle
La figure 2 présente les différentes utilisations du cocotier.
4.1.1- LE COPRAH
Le coprah correspond à l'albumen deshydraté et est utilisé pour extraire l'huile de coco.
La teneur en lipides du coprah est proche de 65%. Les lipides sont constitués par des
glycérides d'acides gras à chaîne courte (C8 à CI8:1).
JOCHSE et al. (1961) donnent les chiffres suivants: un million de tonnes de coprah
correspond à 5500 noix et un million de tonnes d'huile à 8960 noix. L'huile de coco contient
50% d'acide laurique (BERGER et ONG, 1985). Elle se solidifie entre 18 et 20°C en formant
une masse concrète blanche inodore.
L'huile est utilisée en pharmacie après hydrogénation (BRUNETON, 1993). Elle sert dans
la fabrication des glycérides semi-synthétiques. Par saponification, elle fournit un savon très
moussant. Elle est utilisée en cosmétologie (POUSSET, 1992).
Elle sert aussi de matière première dans l'industrie des détergents (obtention de lauryl
sulfates) (BRUNETON, 1993). L'huile de coco pourrait être aussi utilisée dans les moteurs
diesel (POUSSET, 1992).
Dans l'industrie alimentaire, elle est consommée sous forme de Végétaline ®, et sous
forme de margarines. Le taux élevé en protéines, sucres et vitamines du coprah permet son
utilisation dans l'alimentation du bétail sous forme de tourteaux (qui correspondent aux
résidus d'extraction de 1'huile).
4.1.2- L'EAU DE COCO

Différentes études ont permis l'analyse de l'eau de coco (TULECKE et al., 1961,
DUPAIGNE, 1971; GRIMWOOD, 1976; JAYALEKSHMY et al., 1988; voir aussi revue du
CICALfCNEVA, 1993). L'eau de coco permet en partie la nutrition de l'embryon zygotique au
cours de son développement. Ce liquide est présent 7 à 9 mois après la pollinisation. Le
tableau 5 donne à titre indicatif la composition de l'eau de coco.
Liquide isotonique absolument stérile dans la noix intacte, l'eau de coco est riche en
potassium, protéines et acides aminés; elle contient peu de lipides (ACHARA y A; d'après
POUSSET, 1992). Parmi les acides aminés, l'alanine, l'arginine, et la sérine sont en plus grande
quantité que dans le lait animal. L'eau de coco des noix tendres (ou immatures)
(PUNCHIHEWA, 1994), est commercialisée en tant que boisson rafraîchissante. POUSSET (1992)
propose son utilisation dans la réhydratation des malades atteints de choléra et dans les
infections des nourrissons. En cas d'urgence, elle peut remplacer le liquide physiologique par
voie intraveineuse. L'eau de coco contient des hormones végétales (TULECKE et al., 1961) et a
souvent été utilisée en culture in vitro en tant que source d'hormones végétales.
14
INTRODUCTION
4.1.3- LE LAIT DE COCO

Il est obtenu par pressage et broyage de l'albumen frais (DE TAFFIN, 1993). Il est riche
en sucres (oses et sorbitol) en acide malique et en acides aminés et contient une aminopurine
(POUSSET, 1992). Il peut être stérilisé en bouteilles ou commercialisé sous fonne de poudre
après addition de dextrines (BAKAR et al., 1988). Par concentration, on obtient aussi une
crème de coco commercialisable (DE TAFFIN, 1993).
4.1.4- LA NOIX DE COCO RAPEE

L'albumen rapé (au nom courant de « noix de coco rapée ») est le produit qui apporte le
plus de valeur ajoutée. Il est employé exclusivement dans l'alimentaire (pâtisserie, confiserie).
Seules les noix mûres non fendues sont utilisées. L'albumen est extrait de la noix débourrée.
Broyé et pulvérisé, il est ensuite séché jusqu'à obtenir un taux d'humidité de 2 à 3%. La
production mondiale est de 150000 tonnes par an environ (DE TAFFIN, 1993).
4.2- Petites industries et usages en milieu villageois

Toutes les parties de la noix et de la plante sont utilisées (Fig. 2) : c'est « l'arbre aux
mille usages».
Les bourres, fibres situées sur la coque de la noix de coco, servent de combustibles dans
les petites plantations pour le séchage du coprah ou les besoins domestiques. Elles servent
aussi de fertilisants : laissées dans les champs, elles apportent sels et matières organiques.
Elles sont utilisées pour le paillage des jeunes plants. Elles sont la base de l'industrie de la
coir (MATHEW, 1994). Elles sont utilisées en sparterie, corderie et tissage. 1000 coques
donnent en moyenne 90 kg de coiro La coir représente 30% de l'utilisation de la coque. L'Inde
en produit en moyenne 229000 tonnes par an, et cette industrie se développe actuellement vers
les états voisins.
Les coques pennettent la fabrication d'objets utilitaires ou décoratifs. Ils servent de
combustibles pour le séchage du coprah et fournissent du charbon végétal (une tonne de
charbon pour 20 à 25000 coques). Dans ce dernier cas, on peut récupérer les coproduits : gaz
pauvre, acide pyroligneux et goudrons. Il peut être activé par oxydation contrôlée à haute
température, circulation de vapeur d'eau surchauffée et d'oxygène.
En Extrême Orient, on obtient un jus sucré ou toddy par saignée des inflorescences. Il
fournit du sucre et différents produits de fennentation (boissons alcoolisées et vinaigre). On
obtient environ 51 de ce jus sucré par jour et par spathe (DE TAFFIN, 1993) et le sucre de
cocotier peut être préparé de différentes sortes (LEDESMA, 1993).
Aux Philippines, le stipe sert pour la fabrication de poteaux, charpentes, mobiliers,
bardeaux de toiture. Quelques petites scieries existent.
Le bourgeon sert à l'industrie locale pour la commercialisation de « coeurs de cocotier ».
15
INTRODUCTION
TABLEAU 6 : Caractéristiques des différents écotypes et hybrides de cocotier
Grands Nains Hybrides

généralement allogames généralement autogames variable
----------------------~-----------------------------------------
peu précoces précoces
----------------------~-----------------------------------------
- croissance en hauteur rapide - croissance faible
- stipe puissant - stipe mince
Classés en deux groupes Classés suivant la couleur de Sélection sur les
morphologiquement différents: l'inflorescence et du/ruit: caractères suivants:
1) - nombre élevé de noix nombre élevé de régimes - meilleur rendement en coprah
taille moyenne par an - résistance à certaines maladies
faible teneur en coprah - adaptabilité aux conditions
édaphoclimatiques
------------------------------------------~---------------------
ex: Grand Ouest Africain, ex : Nain Vert, Jaune, Rouge Schéma de sélection:
Grand du Vanuatu ou Brun - sélection récurrente réciproque
- pollinisation assistée
------------------------------------------~---------------------
2) - nombre moyen de grosses Hybrides obtenus :
nOIX - 1ère étape : de type
teneur élevée en coprah Nain x Grand et
Grand x Grand
- 2ème étape: croisement entre
hybrides et un écotype
- 3ème étape: création hybrides-
4 voies
----------------------~-------------------~---------------------
ex: Grand Rennell, Grand de ex : PB}}} (Nain Rouge
Thaïlande, Grand de Polynésie Cameroun x Grand Ouest
Africain) 4,} t de coprah/ha/an
PB}2} (Nain Jaune Malais x
Grand Ouest Africain) 3,7 t de
coprah/ha/an
16
INTRODUCTION
L' « arbre aux mille usages» pennet aussi la fabrication de palissades, nattes, éventails,
chapeaux, etc ...
Enfin, il est aussi une plante médicinale. Aux Bahamas, l'huile est utilisée comme
antigrippal; en République dominicaine, le coprah et l'huile sont utilisés en cataplasme pour
soulager les brûlures (WENIGER et ROBINEAU, 1986). L'huile est riche en triglycérides qui
peuvent être utilisés pour activer les fonctions métaboliques et immunitaires chez les malades
même à forts traumatismes et activer l'absorption de la vitamine E qui joue un rôle essentiel
dans la reproduction et les fonctions nerveuses et musculaires (KAMEN, 1993). Les racines
fournissent aussi des médicaments (DE TAFFIN, 1993).
Les industries du cocotier restent essentiellement l'apanage de petites unités
villageoises. Certaines études présentent des possibilités de développement intéressantes pour
la valorisation de certains produits de cette plante comme les produits frais tirés de l'amande
(lait de coco, eau de coco, produits glacés, ...) et qui pourraient être réalisées à l'échelle
industrielle (DUPAIGNE, 1971; BERGER et ONG, 1985; BAKAR et al., 1988; POUSSET, 1992).
5- SELECTION DU COCOTIER
Le tableau 6 donne les particularités des deux groupes d'écotype de cocotiers, les Nains
et les Grands, et de certains hybrides créés par l'équipe IRHO/CIRAD. Le schéma de sélection
repose sur la sélection récurrente réciproque (GASCOND et DE NUCE DE LAMOTHE, 1976) et fait
appel à la pollinisation assistée. Les caractères recherchés sont essentiellement l'augmentation
de la production de coprah à l'hectare, mais aussi la résistance à certaines maladies et
l'adaptabilité aux conditions édapho-climatiques.
Les premiers hybrides ont été obtenus par croisement Grand x Grand et Nain x Grand.
Le PB121 (Nain Jaune Malais x Grand Ouest Africain) est l'un des hybrides le plus planté
dans le monde (DE NUCE DE LAMOTHE et BENARD, 1985). La sélection des meilleurs hybrides
est réalisée sur le terrain, sur une durée minimale de 12 ans, en observant le développement
végétatif et en caractérisant la production. Puis les hybrides sélectionnés sont reproduits à
grande échelle. Dans une seconde étape, de nombreux croisements entre les hybrides et l'un
ou l'autre écotype ont été réalisés. Actuellement, la création d'hybrides-4 voies, qui
correspond au croisement entre 2 hybrides, est étudiée.
17
INTRODUCTION
Cependant, les progranunes de sélection se heurtent à différents problèmes inhérents au

cocotier:
• une allogamie fréquente, responsable d'une grande variabilité au sein de l'espèce;
• un taux faible de reproduction;
• une phase juvénile de plusieurs années avant que la production puisse être évaluée (pas
avant l'âge de dix ans) ;
• pas de multiplication végétative sur une plante ne possédant qu'un seul bourgeon terminal et
sur laquelle il n'y a pas de rejets.
De plus, les cocoteraies connaissent un vieillissement qui diminue la production. La
multiplication végétative in vitro pourrait offrir une grande quantité de matériel végétal
amélioré et productif par clonage des individus hybrides les plus performants. Enfin, elle
permettrait de gagner 10 à 20 ans pour sélectionner de nouvelles variétés de cocotier (SASSON,
1986).
La seule voie actuelle est la multiplication végétative par embryogenèse somatique. Le
principal objectif des progranunes développés est la recherche d'une méthode présentant un
maximum de garanties quant à la conformité du matériel végétal néoformé.
18
INTRODUCTION
2- PR.OCEI»E I»E R.EGENE~TION
P A R El.VIBR.YOGENESE S01VXATIQUE
1- INTRODUCTION: CONCEPT D'EMBRYOGENESE SOMATIQUE
"D'une façon générale, tout véritable développement est

un retour en arrière qui nous fait aller vers nos origines
[··r
(KIERKEGAARD, d'après J. ROSTAND

"Confidences d'un biologiste").
La multiplication végétative par embryogenèse somatique utilise la totipotence des

cellules végétales. La totipotence est le processus par lequel une cellule sporophytique peut se
dédifférencier en conservant son potentiel génétique. Sous certaines conditions, cette cellule
peut se redifférencier en exprimant un nouveau programme morphogénétique. Par ce
processus, des cellules, isolées ou en groupes, peuvent donner naissance à un embryon, appelé
embryon somatique. La plante régénérée est, en principe, génétiquement identique à la plante
mère (en l'absence de perturbations de l'expression génomique).
Depuis les premiers travaux réalisés chez Daucus carota (RElNERT, 1958; STEWARD et
al., 1958), l'embryogenèse somatique a été observée in vitro chez un grand nombre d'espèces
cultivées: chez les dicotylédones herbacées et ligneuses et chez certaines monocotylédones,
comme les graminées (AMMIRATO, 1987; HALPERIN, 1995) ou encore le palmier à huile (DE
TOUCHET et al., 1991).
L'embryogenèse somatique peut être obtenue:

• par voie directe sur expIant sans formation de cal. Dans ce cas, l'expIant initial est en général
un embryon zygotique ou de jeunes plantules;
• par voie indirecte après formation et prolifération d'un cal sur l'expIant initial, constitué de
tissus végétatifs de plantes adultes ou de structures tels que le nucelle ou les embryons
zygotiques.
HALPERlN (1995) suggère que l'embryogenèse directe est caractéristique d'explants

dans lesquels certaines cellules sont « prédéterminées» pour la compétence à l'embryogenèse,
donc en général des explants immatures. Ces cellules ont gardé les propriétés des cellules
méristématiques dont elles dérivent. En revanche, l'embryogenèse indirecte est caractéristique
d'organes matures et implique une redétermination des cellules somatiques qui sont alors
19
INTRODUCTION
entraînées dans plusieurs cycles cellulaires avant de devenir embryogènes; ces cellules ne sont
pas de type embryogènes au départ.
Comme le soulignent MICHAUX-FERRIERE et SCHWENDIMAN (1992), l'embryogenèse

peut être d'origine unicellulaire, à partir d'une cellule isolée, ou pluricellulaire, à partir d'un
groupe de cellules au développement synchronisé. L'embryogenèse d'origine unicellulaire est
caractérisée par la formation de cellules embryogènes isolées du reste du cal par une
modification des parois pectocellulosiques. Ces cellules contiennent, en général, un
cytoplasme dense avec des réserves amylacées et/ou protéiques qui entourent un noyau au
nucléole unique; le rapport nucléo-cytoplasmique de ces cellules est élevé. Au cours de
l'embryogenèse d'origine pluricellulaire, un amas cellulaire méristématique s'organise en
structures embryogènes dont les cellules sont dépourvues de réserves; les parois de ces
cellules ne sont pas épaissies.
Dans le cas de l'embryogenèse directe, WILLIAMS et MAHESWARAN (1986) suggèrent
que la seule différence entre les deux types d'embryogenèse résiderait dans le nombre de
cellules, regroupées dans une région tissulaire donnée, plus ou moins synchrones dans les
divisions cellulaires et au même stade de différenciation (ou de dédifférenciation) capables de
s'associer pour s'orienter vers une morphogenèse déterminée.
L'embryogenèse somatique est le plus souvent comparable à l'embryogenèse zygotique
dans son développement (MICHAUX-FERRIERE et SCHWENDIMAN, 1992). Quelques études ont
permis la comparaison des processus morphogénétiques (DE JONG et al., 1993; TIMMERS,
1993; DODEMAN, 1995), mais elles restent très limitées.
L'ontogenèse de l'embryon somatique nécessite deux étapes (TIMMERS, 1993; VERDEIL,
1993) :
• l'initiation de la proembryogenèse par formation de cellules de type embryogène puis de
proembryons ;
• la morphogenèse embryonnaire avec la formation et la maturation des embryons à partir des
proembryons. Au cours de cette deuxième étape, l'acquisition d'une symétrie bilatérale
permet la formation du pôle gemmulaire et du pôle racinaire (VERDEIL, 1993).
Pour la majorité des espèces, seuls certains tissus ou cellules sont capables de répondre
positivement au stimulus inducteur de l'embryogenèse. C'est ce que CARMAN (1990) définit
comme la compétence à l'embryogenèse. La nature intrinsèque du tissu en culture et son
environnement jouent un rôle primordial dans la capacité des cellules à régénérer des
embryons. Cette capacité dépend également du génotype, du type d'expIant et de son âge
(WERNICKE et BRETELL, 1980). De plus, toute perturbation physiologique ou biochimique
peut conduire à la formation de copies non conformes à la plante mère ou de structures
tératogènes. Enfin, le potentiel embryogène, très variable d'un cal à l'autre, peut se modifier
20
INTRODUCTION
au cours du temps, en particulier par des modifications fonctionnelles du génome : mutation

ponctuelle ou modification globale du génome par polyploïdisation (CouTos-THEVENOT,
1990).
2- ETAT DES CONNAISSANCES SUR L'INITIATION DE L'EMBRYOGENESE

SOMATIQUE
Au cours de ces années de thèse, nous nous sommes essentiellement intéressée à l'étape
d'initiation de l'embryogenèse: de la formation des cellules embryogènes à l'obtention de
proembryons. Des études récentes ont permis de mieux caractériser les changements
ultrastructuraux et certains facteurs physiologiques et biochimiques impliqués au cours de
l'initiation de l'embryogenèse. Elles ont ainsi permis d'améliorer les conditions de son
apparition.
Dans cette partie, nous tenterons tout d'abord de faire un bilan des hypothèses émises
sur l'origine des cellules embryogènes. Ensuite, nous tenterons de dresser un état des
connaissances sur le rôle des éléments du milieu dans l'acquisition et l'amélioration du
potentiel embryogène, sur les changements ultrastructuraux et métaboliques qui la
caractérisent, et enfin sur la recherche de marqueurs moléculaires des premiers stades de
l'embryogenèse.
2.1- Hypothèses sur l'origine des cellules embryogènes

S'il est maintenant possible d'induire l'embryogenèse somatique chez de nombreuses
espèces, grâce à des stimuli exogènes appropriés, le mécanisme de cette initiation reste encore
mal connu. Cependant, certaines hypothèses ont été suggérées pour tenter de caractériser les
premiers signes de l'embryogenèse.
NUTI RONCHI et al. (1992 a et b) ont montré l'existence de divisions réductionnelles au
moment de la formation de cellules de type embryogène au sein de suspensions cellulaires de
carotte ainsi que la présence d'un faible pourcentage de cellules haploïdes. Ces auteurs
qualifient de « méiose somatique» ces évènements qui pourraient être à l'origine des cellules
embryogènes. Les auxines du milieu pourraient jouer un rôle régulateur sur ces évènements
(NUTI RONCHI et GIORGETTI, 1995).
D'autres auteurs ont montré que, lors du processus d'embryogenèse somatique directe,
les facteurs de croissance pourraient altérer la polarité cellulaire et favoriser l'activation de
divisions asymétriques ultérieures, comme dans les premiers stades du développement de
l'embryon zygotique (DODEMAN, 1995). Si des embryons zygotiques de trèfle sont cultivés en
présence de cytokinines, des embryons somatiques peuvent être produits directement sur
l'épiderme de l'hypocotyle. Le premier signe d'initiation est le remplacement des divisions
21
INTRODUCTION
anticlines au sein de l'épiderme par des divisions en plans irréguliers (MAHESWARAN et

WILLIAMS, 1985). Les cytokinines pourraient directement altérer le plan normal des divisions
cellulaires.
Chez Medicago, des divisions asymétriques sont souvent observées au sein des cultures
embryogènes, induites après stimulation par une auxine et chez la carotte, la première division
cellulaire d'une cellule somatique apte à évoluer en cellule embryogène est asymétrique (DE
JONG et al., 1993). Cette division entraîne la formation d'une masse proembryogène dans
laquelle seules quelques cellules sont capables de donner des embryons somatiques; en
revanche, cette division ne conduit pas à la formation directe d'embryons (NUTI RONCHI et
GIORGEITI, 1995). Cependant, comme le soulignent ces auteurs, une question reste posée :
est-ce cette division asymétrique, liée à l'existence d'une polarité cellulaire préalable, qui
confère à la cellule la compétence à l'embryogenèse ou ce processus n'intervient-il que si la
cellule est génétiquement prédéterminée ? On ne sait pas encore si la cellule capable de se
dédifférencier puis de donner une cellule embryogène est génétiquement prédéterminée
(NOMURA et KOMAMINE, 1985; CARMAN, 1990).
L'observation de divisions asymétriques est souvent associée à des changements dans
l'orientation des microtubules (DIJAK et SIMMONDS, 1988; ZAKI et DICKINSON, 1991; DE
JONG et al., 1993), qui sont d'ailleurs sous le contrôle des hormones lors du développement
chez la plante entière (SHIBOAOKA, 1994). Chez Brassica, l'induction de la formation
d'embryons à partir de microspores est précédée d'un changement d'orientation à 90° du plan
mitotique ou d'une migration du noyau de sa position excentrée à une position centrale (DE
JONG et al., 1993).
Tous ces auteurs soulignent que le contrôle de l'expansion de la paroi cellulaire doit
jouer un rôle non négligeable dans la transition cellule somatique - cellule embryogène. Au
sein des suspensions de carotte, les premières cellules qui se libèrent et prolifèrent à partir des
explants transférés en milieu liquide, sont de grosses cellules vacuolisées. Ces cellules
donneraient naissance par division asymétrique, à des petites cellules au cytoplasme dense et
possédant des réserves amylacées, qui seraient les cellules embryogènes proprement dites.
Après plusieurs divisions en plans irréguliers, ces cellules forment les masses
proembryogènes qui, en absence d'auxines dans le milieu, évolueront en embryons. Ces
phénomènes impliquent des modifications au niveau pariétal, et donc un contrôle étroit de
l'expansion cellulaire. Ces études sont corrélées avec la mise en évidence de certaines
protéines extracellulaires qui ne sont exprimées qu'au moment de l'initiation de
l'embryogenèse (DE JONG et al., 1993; DODEMAN, 1995). Ces protéines seraient des composés
constitutifs des parois et/ou de la membrane plasmique et interviendraient dans le contrôle de
l'expansion cellulaire. Ce sont en particulier des arabinoprotéines (KNOX et al., 1991;
PENNELL et al., 1991).
22
INTRODUCTION
Certaines études suggèrent que la polarité cellulaire joue un rôle important. Elle est
matérialisée par l'existence de divisions asymétriques, mais aussi par une distribution inégale
des composants cytoplasmiques et une synthèse de certains constituants comme les auxines
endogènes, l'ADN et l'ARN qui serait localisée seulement à un pôle de la future cellule
embryogène (MERKLE et al., 1995; YEUNG, 1995). Cette polarité serait comparable à celle
observée au cours de l'embryogenèse zygotique : la polarité de la cellule-oeuf va détenniner
la polarité puis la symétrie bilatérale de l'axe embryonnaire. Lors du développement de la
plante entière, certains processus de différenciation, mais aussi de redifférenciation, sont
associés à des divisions inégales conditionnées par une polarisation cellulaire préalable. Celle-
ci est matérialisée par un gradient marqué de densité cytoplasmique et de répartition des
organites dont l'origine reste encore inconnue (STANGE, 1984; CHAMPAGNAT, 1987).
L'existence de cellules inductrices au sein des cultures est également discutée. On sait
que chez l'animal, les plans de migration et de segmentation cellulaires sont prédétenninés et
sont sous le contrôle de cellules inductrices, dans certaines régions tissulaires (DE JONG et al.,
1993). Chez la plante, les méristèmes pourraient s'engager vers une voie de différenciation
grâce à des réseaux de corrélations contrôlés par les tissus ou organes voisins. CHAMPAGNAT
(1987) suggère que la réexpression de la totipotence cellulaire puis la fonnation de cellules de
type embryogène pourraient également correspondre à un tel influx inducteur. En revanche,
d'autres données suggèrent l'hypothèse inverse : l'isolement progressif de la cellule
embryogène (par épaississement des parois cellulaires et disparition des plasmodesmes)
correspondrait plutôt à une rupture des communications intercellulaires, la cellule puis le
proembryon devenant autonome par rapport à leur environnement. On ne sait pas encore si cet
isolement est prérequis pour l'aptitude à l'embryogenèse. MAHESWARAN et WILLIAMS (1985)
suggèrent qu'il pennet l'induction au sein d'un groupe de cellules d'une nouvelle séquence
morphogénétique, en l'occurence l'embryogenèse, en évitant l'interférence des tissus
adjacents souvent en dégénérescence ou entraînés vers d'autres voies. Cependant, le
mécanisme d'échanges entre les cellules reste encore mal connu pour corroborer ces
hypothèses (STANGE, 1984, CHAMPAGNAT, 1987).
2.2- Rôle des composés du milieu et des facteurs de l'environnement des tissus dans
l'initiation de l'embryogenèse somatique
L'optimisation de la composition des milieux est primordiale pour mener à bien tout
processus de croissance ou de différenciation, en particulier chez une plante récalcitrante
comme le cocotier. De plus, la nature du tissu cultivé in vitro et son état physiologique
peuvent être reliés à des besoins nutritifs spécifiques. Depuis l'avènement des techniques de
culture in vitro, de nombreux milieux synthétiques ont été mis au point pour pennettre la
croissance des tissus et l'initiation des évènements morphogénétiques telle que
23
INTRODUCTION
l'embryogenèse somatique. Différents ouvrages répertorient la composition des milieux, qui

ont été adaptés à chaque espèce étudiée (AMMIRATO, 1983; GEORGE et SHERRINGTON, 1984).
Le stimulus chimique le plus important est l'apport d'auxines dans les milieux (DE VRIES
et al., 1988 b; VAJRABHAYA, 1988). Leur présence permet l'induction de la callogenèse puis
l'acquisition de la compétence de certaines cellules à l'embryogenèse. Chez certaines espèces,
le maintien ou l'augmentation de la concentration en auxine exogène peuvent permettre la
prolifération indéfinie des masses proembryogènes (MERKLE et al., 1995). C'est en général,
une diminution de leur concentration puis leur élimination qui permettent l'expression des
stades ultérieurs de l'embryogenèse. Le rôle des auxines exogènes sur l'initiation de
l'embryogenèse dépend de la nature de l'expIant (ZIMMERMAN, 1993) et reste encore mal
connu (CARMAN, 1990; VERDEIL, 1993). Actuellement, ce sont surtout des auxines de
synthèses, tel que le 2,4-0, qui sont le plus souvent utilisées. Certains auteurs leur attribuent
un rôle similaire à celui des auxines au cours du développement de la plante entière (DUDITS,
1991). Elles ont un rôle métabolique important en contrôlant la synthèse des macromolécules
de la paroi telle que la cellulose (HALL et ORDIN, 1968; RAYet ABDUL-BAKI, 1968; YOSHIDA
et KOMAE, 1995) et la synthèse de certaines protéines (WIGHTMAN et SETTERFIELD, 1968;
DUDITS et al., 1991); elles régulent aussi la synthèse de l'ADN et de l'ARN (KEY et INGLE,
1968). Les auxines agissent aussi au niveau des pompes à protons membranaires et contrôlent
ainsi étroitement le pH extra et intracellulaire (ROSSIGNOL et al., 1990; BARBIER-BRYGOO et
al. 1995). TAIZ et ZEIGER (1991) suggèrent que les auxines pénétreraient dans la cellule au
niveau de récepteurs membranaires spécifiques, interagiraient avec certains gènes, en
particulier les gènes du développement, bloquant ou activant leur expression, peut-être par
méthylation de certaines régions. Certains récepteurs ont été récemment mis en évidence
(PALME, 1993; JONES, 1994; FILIPPINI et al., 1995).
Comme le suggèrait STREET (1969), les autres éléments du milieu pourraient agir en
synergie avec les hormones sur la croissance des tissus en culture, mais aussi sur
l'embryogenèse. Chez le soja, LAZZERRI et al. (1988) ont montré que l'interaction
auxine/saccharose permet l'initiation de l'embrogenèse. D'autres études montrent que certains
éléments peuvent influer sur la stabilité de l'auxine dans les milieux, en particulier la
concentration en sels (DUNLAP et al., 1986). Certains micronutriments, en particulier le zinc et
le bore des milieux, pourraient interagir avec les substances de croissance pour permettre la
différenciation cellulaire et la morphogenèse (GEORGE et SHERRINGTON, 1984).
D'autres études ont montré des besoins spécifiques au cours de l'initiation de

l'embryogenèse. Il est maintenant établi que l'initiation de l'embryogenèse requiert des
besoins importants en carbohydrates (THORPE, 1983; AMMlRATO, 1987; EAPEN et GEORGE,
1990). D'autres montrent que la présence d'une concentration minimale en composés azotés
24
INTRODUCTION
est nécessaire, essentiellement l'ammonium, source d'azote réduit (HALPERIN et WETHERELL,

1965; WHETERELL et DOUGALL, 1976; GEORGE et SHERRINGTON, 1984; AMMIRATO, 1987;
VAJRABAHYA, 1988). L'apport d'hydrolysat de caséine et/ou de certains acides aminés peuvent
également améliorer les conditions d'apparition de l'embryogenèse (WETHERELL et DOUGALL,
1976; EEUWENS, 1976 et 1978; GEORGE et SHERRINGTON, 1984; MUKHOPADHYAY et
DESJARDINS, 1994; PAUL et al., 1994).
Enfin, il faut souligner que l'environnement physique du tissu en culture joue un rôle
important dans la compétence à l'embryogenèse : la présence ou l'absence de lumière, une
trop forte production d'éthylène, qui peut inhiber l'embryogenèse, la réduction de l'apport
d'oxygène qui peut au contraire améliorer les conditions de son apparition. Cependant ces
paramètres sont encore très peu étudiés.
Les différentes études citées précédemment ont permis de préciser les besoins nutritifs
des cals en condition de croissance et en condition d'initiation de l'embryogenèse, et
d'améliorer la composition des milieux de culture. Cependant, ces études sont essentiellement
basées sur l'approche classique qui consiste à tester l'effet de la concentration des éléments du
milieu sur le taux de production de structures embryogènes. Pour chaque génotype considéré,
le choix de la composition des milieux reste plus ou moins empirique.
En revanche, l'étude analytique des besoins nutritifs spécifiques, consistant à relier de
façon précise la consommation d'un composé à une étape de croissance ou à une phase
morphogénétique d'un tissu in vitro a été très peu étudiée. Cette étude concerne surtout la
nutrition des cals en condition de prolifération : chez le platane (YOUNG, 1973), le riz
(SCHMITZ et LÔRZ, 1990), Actinidia (MEZZETTI et al., 1991); mais rarement en condition
d'initiation de l'embryogenèse somatique: chez le cocotier (DUSSERT, 1991), la luzerne
(DENCHEV et al., 1993).
C'est cette dernière démarche qui a été adoptée chez le cocotier. En comparant des cals
à l'état méristématique et des cals ayant initié l'embryogenèse, une absorption plus importante
des trois cations, ammonium, calcium et magnésium, a été notée en condition d'embryogenèse
pour certaines lignées de cals (VERDEIL, 1993; DUSSERT, 1991). Ces études étaient les
premières à mettre en évidence une implication possible du magnésium au cours de
l'embryogenèse. Ces auteurs soulignent que ce type d'études analytiques permettrait de
déterminer plus précisément les besoins nutritifs spécifiques de l'orientation vers
l'embryogenèse, et ainsi de mieux contrôler la composition du milieu de culture à chaque
étape du processus in vitro.
25
INTRODUCTION
2.3- Changements structuraux et métaboliques précoces lors de l'embryogenèse

somatique
Parallèlement à la détennination de besoins nutritifs spécifiques au cours de l'initiation de
l'embryogenèse, certaines études s'attachent à la mise en évidence des changements
ultrastructuraux, mais aussi de marqueurs physiologiques et métaboliques qui pourraient
caractériser les étapes très précoces de l'embryogenèse. Ce dernier type d'étude est récent et a
été peu développé et concerne essentiellement l'embryogenèse dont l'origine est de type
unicellulaire ou le développement de l'embryon zygotique (GOLDBERG et al., 1994).
Une augmentation du taux de ribosomes, une modification du nombre d'organites

(réticulum endoplasmique, appareil de Golgi et mitochondries), et un changement dans
l'orientation des microtubules ont été observés au cours des changements ultrastructuraux qui
accompagnent l'embryogenèse somatique (STREET et WITHERS, 1974; STANGE, 1984;
VAJRABHA YA, 1988; MICHAUX-FERRIERE et SCHWENDIMAN, 1992; TIMMERS, 1993; VERDEIL,
1993). Chez de nombreuses plantes, l'initiation de l'embryogenèse s'accompagne d'une
restructuration des parois pectocellulosiques autour de la cellule embryogène (MICHAUX-
FERRIERE et SCHWENDIMAN, 1992; VERDEIL et al., 1994). Cette restructuration peut
s'accompagner de dépôts de macromolécules pendant l'isolement de la cellule embryogène,
telle que de la callose (YEUNG, 1995).
Une augmentation de la teneur en calcium endogène a été montrée chez la carotte

(TIMMERS et SCHEL, 1991; ZIMMERMAN, 1993). L'embryogenèse peut aussi s'accompagner
d'une activation de la protéosynthèse (KOMAMINE et al., 1990) et d'une accumulation de
réserves protéiques et amylacées (Mc WILLIAM et al., 1974; VERDEIL et al., 1994). Les
changements au niveau du métabolisme dans la cellule embryogène ont été mis en relation
avec les besoins en composés carbonés et azotés plus importants montrés en condition
d'embryogenèse. En particulier, les besoins préférentiels en ion ammonium pourraient
correspondre à la nécessité de maintenir une concentration intracellulaire minimale en azote
réduit qui serait essentielle pour l'acquisition de l'embryogenèse. Peu d'auteurs ont étudié le
devenir des composés intennédiaires du métabolisme azoté : les acides aminés endogènes
(MEROT, 1988; CLAPOROLS et al., 1993; MAGNAVAL et al., 1995; MONTORO et al., 1995).
CLAPOROLS et al. (1993) suggèrent que l'accumulation de proline, au sein de cals de maïs placés
sur des milieux contenant une source d'acides aminés (en particulier de la proline), favoriserait
la fonnation de cals embryogènes. Chez la canne à sucre, MEROT (1988) a montré que des cals
embryogènes comportent des teneurs plus élevées en acide aspartique, acide glutamique et en
alanine que des cals non embryogènes. Au cours de ces études, le niveau en acides aminés
endogènes pourrait être relié avec l'orientation vers l'embryogenèse.
26
INTRODUCTION
Les polyamines pourraient également jouer un rôle au cours de l'embryogenèse.

ROUSTAN et al. (1993) ont montré une relation entre l'inhibition de la synthèse des
polyamines et la diminution du potentiel embryogène.
Au sein des cultures embryogènes, certains composés peuvent être sécrétés dans le
milieu de culture par les tissus. Ces composés pourraient jouer un rôle fondamental dans
l'initiation et l'expression de l'embryogenèse somatique (VAN ENGELEN et DE VRIES, 1992).
Ils peuvent être des polysaccharides, des protéoglycanes et certaines enzymes :
oxydoréductases et hydrolases.
2.4- Marqueurs génétiques et moléculaires de l'initiation de l'embryogenèse

La détermination de marqueurs précoces, telles que des protéines, spécifiques de
l'initiation de l'embryogenèse, a permis la caractérisation et l'optimisation des conditions
d'initiation et d'expression de l'embryogenèse chez de nombreuses espèces (VAN ENGELEN et
DE VRIES, 1992). Elle permet d'« étiqueter» les cals les plus aptes à l'embryogenèse et de
déterminer la compétence à l'embryogenèse avant même l'initiation du processus
morphogénétique. Cette approche serait particulièrement intéressante pour la régénération des
plantes récalcitrantes, tel que le cocotier.
Des études récentes portant sur le contrôle génétique du développement embryonnaire

zygotique (MEINKE, 1991) mais aussi somatique (KIELLY et BOWLEY, 1992; DUDITS et al.,
1991; et voir pour références : NOMURA et KOMAMINE, 1995; KA WAHARA et KOMAMINE,
1995; Lo SCHIAVO, 1995) suggèrent que l'embryogenèse pourrait être contrôlée par environ
3500 gènes (DODEMAN, 1995). Certains gènes ont ainsi été mis en évidence, chez certaines
espèces modèles telles que Arabidopsis (voir pour références: ZIMMERMAN, 1993; GOLDBERG
et al., 1994), ou la carotte (DAYTON WILDE et al., 1988). Selon certains auteurs, l'initiation et
l'expression des différents stades morphogénétiques conduisant à l'embryogenèse seraient
régulées par une expression génique. Les auxines pourraient contrôler cette expression par
méthylation de certaines séquences d'ADN.
L'étude du déterminisme de l'embryogenèse somatique a montré l'existence de gènes
homologues chez plusieurs espèces (MEINKE, 1991). Selon l'hypothèse de «méiose
somatique» (NUTI RONCHI et al., 1992 a et b; NUTI RONCHI et GIORGEITI, 1995), un
processus de reprogrammation génétique similaire à celui qui permet la formation des
gamètes, pourrait être à l'origine de la compétence à l'embryogenèse somatique.
Des anticorps mono ou polyclonaux dirigés contre des extraits bruts de protéines ont
permis de déceler des polypeptides associés spécifiquement aux stades précoces de
l'embryogenèse et communs à plusieurs espèces (STIRN et JACOBSEN, 1987, 1990;
27
INTRODUCTION
DUDITS et al., 1991; ALTHERR et al., 1993). Des marqueurs protéiques intracellulaires ont
ainsi été mis en évidence (SUNG et OKIMOTO, 1981; KIYOSUE et al., 1991; HILBERT et al.,
1992; KIYOSUE et al. 1992) souvent au niveau interne des membranes plasmiques des cellules
embryogènes (KAWAHARA et KOMAMINE, 1995). Certaines isoenzymes semblent également
jouer un rôle telles que des estérases, glutamate déshydrogénases, malate déshydrogénases,
péroxydases, phosphatase acides (WOCHOCK et BURLESON, 1974; EVERETT et al., 1985;
COPPENS et GILLIS, 1987; CHIBBAR et al., 1988; COPPENS et DEWITTE, 1990; RAo et al.,
1990). Différentes glycoprotéines ont aussi été détectées au niveau de l'espace extracellulaire
(DE VRIES et al., 1988 a; KNox et al., 1991; PENNELL et al., 1991; COUTos-THEVENOT et al.,
1992 b; NIELSEN et HANSEN, 1992; KREUGER et VAN HOLST, 1993), mais aussi une protéine
impliquée dans le transfert des lipides (EP2) (STERK et al., 1991). Toutes ces protéines
semblent essentielles dans l'acquisition du potentiel embryogène de type somatique chez la
carotte (Nun RONCHI, 1991). Certaines protéines et enzymes extracellulaires auraient pour
substrats des polysaccharides contenus dans les parois et la lamelle moyenne (VAN ENGELEN
et DE VRIES, 1992), ces polysaccharides étant peut-être impliqués dans le contrôle de
l'expansion de la paroi cellulaire au moment de la formation des cellules embryogènes et dans
les restructurations pariétales observées lors des stades ultérieurs de l'embryogenèse.
L'expression de certaines de ces protéines est contrôlée par les hormones, en particulier
les auxines (DE VRIES et al., 1988 a). Des «Auxin Binding Proteins» (ou ABP) seraient
impliquées dans la compétence à l'embryogenèse (Lo SCHIAVO, 1995).
28
INTRODUCTION
3-El.VIBR.YOGENESE S01VIATIQUE
C"H"EZ L E COCOTIER.
1- DIFFICULTES RENCONTREES LORS DE L'EMBRYOGENESE SOMATIQUE

DU COCOTIER ET STRATEGIES DE RECHERCHE
Depuis 1981, différentes équipes travaillent sur la mise au point des techniques
d'embryogenèse somatique chez le cocotier. Elle permettrait une amélioration sensible de la
productivité et de l'homogénéité des plantations, par clonage d'individus d'élite issus des
programmes de sélection classique. Les travaux ont été menés à partir de tissus d'origine
diverse: sur embryons zygotiques (DE GUZMAN et al., 1978; BHALLA-SARIN et al., 1986), sur
explants foliaires (PANNETIER et BUFFARD-MoREL, 1986; BUFFARD-MoREL et al., 1992), sur
explants inflorescentiels (EEUWENS, 1978; BRANTON ET BLAKE 1984; VERDEIL et al., 1989;
EBERT et al., 1991; VERDEIL et al., 1992; VERDEIL et al., 1994). Cependant, le cocotier est une
plante extrêment récalcitrante à la culture in vitro (BLAKE, 1989; KRIKORIAN, 1989; VERDEIL
et BUFFARD-MoREL, 1995).
Des difficultés de plusieurs ordres ont été rencontrées :
• un brunissement intense des tissus dû à l'oxydation causée par des composés
polyphénoliques ;
• une grande hétérogénéité dans le comportement des explants ;
• une forte capacité rhizogène et une faible compétence à l'embryogenèse et à la caulogenèse ;
• un temps de réponse in vitro très long.
Le brunissement des tissus causé par les polyphénols est essentiellement lié à la haute
sensibilité des tissus à la présence d'auxines chlorées dans le milieu, tel que le 2,4-D, utilisé le
plus souvent dans la callogenèse. Ce problème a été résolu par l'utilisation de charbon actif. Il
a la propriété d'adsorber certains inhibiteurs de croissance tels que les composés
polyphénoliques ou présents dans le milieu tels que les composés furfuraux isssus de la
dégradation des sucres lors de l'autoclavage (DRUART et DE WULF, 1993). Il adsorbe
également les hormones végétales, telles que les auxines, les cytokinines ou l'éthylène
(GEORGE et SHERRINGTON, 1984; EBERT et TAYLOR, 1990; NISSEN et SUTTER, 1990; BÜTER et
al., 1993; EBERT et al., 1993; MENSUALI-SODI et al., 1993; VERDEIL, 1993).
La réponse des tissus en culture est très hétérogène et dépend de l'âge des milieux
utilisés et des variations dans la concentration en 2,4-D qui y sont associées. La forte
hétérogénéité dans la performance des tissus envers la callogenèse et la non reproductibilité
des résultats pourrait être attribuée au charbon actif. L'emploi de charbon actif pose un
problème important car il ne permet pas un contrôle précis de la concentration des facteurs de
29
INTRODUCTION
croissance dans les milieux (VERDEIL et BUFFARD-MoREL, 1995); il constitue donc une source
de variabilité supplémentaire au sein des cultures.
Le cocotier possède un faible potentiel embryogène. L'embryogenèse est souvent
bloquée ou déviée, elle peut conduire à la formation de formes polyembryoniques ou
d'embryons incomplets. Comme d'autres espèces de monocotylédones, ce matériel a une forte
capacité à former des racines (PANNETIER et BUFFARD-MoREL, 1986).
Le cocotier est caractérisé par la lenteur des différents évènements morphogénétiques.
En effet, 4 à 6 mois peuvent s'écouler entre la mise en culture de l'expIant et l'obtention de la
callogenèse, et il faut attendre 2 ou 3 ans pour l'obtention des premiers embryons.
EEUWENS (1976) a cherché à améliorer la callogenèse en optimisant la composition
minérale des milieux. Le milieu, riche en potassium, chlorure et en iode, a été très largement
utilisé sur cocotier. Cependant, les résultats obtenus après plusieurs années d'expérimentation
montrent qu'il existe d'autres facteurs limitants pour la régénération. L'hypothèse d'un
déséquilibre hormonal a été avancée et justifierait la formation fréquente de structures
tératogènes (BRANTON et BLAKE, 1984; BLAKE, 1989). TISSERAT (1988) suggère que les
problèmes rencontrés sont inhérents aux tissus plus qu'aux milieux de culture. La composante
tissulaire est hétérogène au sein d'un lot de cals et elle peut entraîner une forte hétérogénéité
de comportement vis-à-vis de l'aptitude à l'embryogenèse entre les cals (VERDEIL, 1993).
L'existence d'une composante tissulaire fortement déterminée complique la recherche des
facteurs du milieu essentiels pour l'initiation et l'expression de l'embryogenèse.
Dans le but de contourner les problèmes rencontrés, une collection de lignées de cals
homogènes a été établie par l'équipe mixte CIRAD-CP/ORSTOM. Ces cals constituent des
lignées tissulaires établies par la multiplication et le « clonage» des cals primaires obtenus sur
l'expIant. Elles représentent un matériel de choix pour mieux caractériser le comportement
des tissus in vitro vis-à vis des facteurs trophiques et environnementaux (composition du
milieu, phytohormones, conditions de culture). De plus, elles sont composées d'un tissu plus
homogène et plus synchrone dans les évènements embryogènes. Ce qui a permis de
développer une approche analytique des problèmes rencontrés lors de l'embryogenèse:
• une étude histologique systématique a permis de suivre les différentes étapes de
l'embryogenèse, celle-ci peut posséder deux origines: uni ou pluricellulaire (VERDEIL et al.,
1992) ;
• une étude des facteurs nutritifs et hormonaux (dosage des éléments du milieu et analyse
phyto-hormonale) impliqués au cours de l'initiation de l'embryogenèse, a été réalisée sur les
premières lignées de cals obtenues (DusSERT, 1991; VERDEIL, 1993).
30
INTRODUCTION
EXPLANTS EXPLANTS
FOLIAIRES INFLORESCENTIELS
Multiplication des cals

/
W 1 CALS NODULAIRES 1
~
COLLECTION DE LIGNEES
TISSULAIRES HOMOGENES
Multiplication
par bourgeonnement
adventif
(multiplication
STRUCTURES
EMBRYOGENES
Formation globulaire
W des e"!bryons possible
maIs non encore
maTtrisée)
blanc nacré (1 à 10%)
EMBRYONS
Diminution du niveau de 2,4-0
~
EMBRYONS MUNIS
DE LEUR POUSSE FEUILLEE 1
1
VITROPLANTS
\..~---- -------------------------~)
Figure 3 Schéma général du protocole de régénération du cocotier par embryogenèse

somatique à partir d'explants foliaires et inflorescentiels.
31
INTRODUCTION
Cette approche permet non seulement de mIeux caractériser structuralement et

physiologiquement les cals mais aussi de mieux contrôler la composition des milieux à
chaque étape de la ~ulturein vitro. Depuis 1991, cette approche a permis l'amélioration du
procédé et l'obtention de façon reproductible de vitroplants sur plusieurs clones (VERDEIL et
al., 1992).
2- DESCRIPTION DU PROCEDE D'EMBRYOGENESE SOMATIQUE EN MILIEU

SOLIDE DEVELOPPE PAR L'ORSTOM ET LE CIRAD-CP
Le procédé de mise en culture, d'obtention de la callogenèse, de l'initiation de

l'embryogenèse et de la régénération, selon le protocole développé par l'équipe
ORSTOM/ClRAD de Montpellier, est présenté sur la figure 3.
• Mise en culture:
Explants foliaires :
Les jeunes feuilles utilisées sont protégées par la base du pétiole des feuilles plus âgées
et sont donc stériles. La surface de la feuille la plus externe est désinfectée avec une solution
d'hypochlorite de sodium à 6% de chlore actif. Chaque feuille est ensuite fragmentée en
portions de 1 cm de long (Planche l, photo 1). Les fragments foliaires sont placés dans une
solution antioxydante (saccharose: 30 g.r l , ascorbate de sodium: 100 mg.r l , acide citrique:
150 mg.r l ) et disséqués dans la solution. Chaque foliole est placé côté abaxial sur le milieu de
culture.
Explants inflorescentiels :
La spathe externe des inflorescences est désinfectée dans une solution d'eau de Javel
diluée 16 fois. Les spathes sont retirées en condition stérile et les épillets sont placés dans la
solution antioxydante qui évite le brunissement des tissus. La partie basale qui porte les fleurs
femelles sur chaque épillet est éliminée; la partie distale qui porte les fleurs mâles est
sectionnée en fragments de 1 à 1,5 mm d'épaisseur dans la solution antioxydante. Les explants
inflorescentiels sont alors mis en culture (Planche l, photo 4). Les tubes sont scellés de deux
tours de parafilm, randomisés et placés en chambre de culture à 27°C.
• Callogenèse:
Les cals apparaissent après six mois de culture. Ils peuvent avoir deux origines :
• une origine interne; les cals sont formés à partir de cellules périvasculaires indifférenciées
au sein des explants foliaires et au niveau du rachis des fragments inflorescentiels (VERDEIL
et al. 1992) (Planche l, photo 2 et 3) ;
32
PLANCHE 1
Mise en culture des explants foliaires et inflorescentiels
1. Obtention d'explants foliaires par séparation de chaque foliole (barre: 4 mm)

2. Cals néoformés sur un expIant foliaire sur la face abaxiale du limbe foliaire (barre: 3 mm)
3. Section transversale d'un expIant foliaire porteur de cals nodulaires méristématiques
prenant naissance au niveau des cellules périvasculaires (barre: 40 J.1m)
4. Obtention d'explants inflorescentie1s par fragmentation de la partie mâle d'un épillet
(barre: 4 mm)
5. Cals néoformés sur un expIant inflorescentiel au niveau des territoires floraux
(barre: 2 mm)
6. Section transversale d'un expIant inflorescentiel porteur de cals d'origine externe prenant
naissance au niveau du méristème floral (barre: 20 J.1m)
B : bractée; e : cal; eN : cal nodulaire; F : foliole; Fc : faisceau cibrovasculaire du rachillae; Fv :

faisceau vasculaire; P : pétale; r : rachillae; Tf: territoire floral
3 -
INTRODUCTION
• une ongme superficielle; les cals sont fonnés à la superficie des territoires floraux et
dérivent de méristèmes floraux mâles préexistants (Planche 1, photo 5 et 6).
Les deux types de cals donnent naissance à des cals compacts granuleux à croissance
lente qui prolifèrent à partir d'une assise cellulaire méristématique de type cambial située en
périphérie du cal et protégée par un protodenne (BUFFARD-MoREL et al., 1992; VERDEIL,
1993). La fonnation et la prolifération des cals ont pu être améliorées grâce à différents essais
portant sur l'étude des conditions de culture (composition des milieux, fréquence de
repiquage,...) ou l'étude de la balance auxine/charbon actif (VERDEIL, 1993).
Pour l'obtention des lignées de cals constituant la collection établie au laboratoire, les
cals primaires après leur isolement sont placés sur un milieu renfennant des concentrations en
2,4-D et en charbon actif optimales. Après multiplication du cal et plusieurs repiquages,
différentes lignées de cals de type granuleux peuvent se fonner. Elles sont ensuite maintenues
et multipliées sur milieu de multiplication approprié (Planche II, photo 1).
• Initiation de l'embryogenèse:
Pour pennettre l'initiation de l'embryogenèse, les cals sont placés dans les conditions
d'embryogenèse dès leur isolement de l'expIant sur des milieux contenant du charbon actifet
enrichis en 2,4-D (par comparaison aux milieux de callogenèse). Dans ces conditions, des
structures embryogènes blanches et épidennisées apparaissent (Planche II, photos 2 et 3) entre
2 à 24 mois après l'isolement des cals de l'expIant d'origine.
• Expression des potentialités embryogènes et régénération:

La diminution progressive de la concentration en 2,4-D des milieux conduit à
l'évolution des structures embryogènes en structures embryonnaires qui se polarisent (Planche
II, photo 4). L'expression des potentialités embryogènes de ces structures est réalisée sur un
milieu dépourvu de 2,4-D et de charbon mais contenant de la BAP. Des coupes histologiques
d'embryons somatiques ont pennis de mettre en évidence un apex caulinaire parfaitement
structuré (Planche II, photo 4) et la présence de réserves d'amidon dans le tissu haustorial à
l'opposé du méristème de tige. Après l'émission de la première pousse feuillée, les embryons
sont transférés sur un milieu dépourvu de cytokinine (Planche II, photo 5). L'enracinement se
fait en présence de ANA et les vitroplants (Planche II, photo 6) peuvent être transférés en sol
après acclimatation (Planche II, photo 7).
33
PLANCHE II
Morphogenèse embryonnaire et régénération
1. Cal en multiplication (barre: 2 mm)

2. Cal embryogène induit (barre: 1 mm)
3. Structures embryogènes fonnées sur le cal (barre: 1 mm)
4. Coupe transversale d'un embryon (barre: 40 J1m)
5. Embryon isolé (barre: 2 mm)
6. Lot de vitroplants régénérés (barre: 20 J1m)
7. Vitroplant après acclimatation et transfert au sol (barre: 15 mm)
C: cal; EF : première feuille en écaille; FC : fente cotylédonaire; H : haustorium; MC : méristème

caulinaire; P : procambium; PE : proembryon (critère défini en association avec une étude
histologique); R : pôle racinaire; SE : structures embryogènes; Zm : zone M à vocation racinaire
INTRODUCTION
3- LIMITES ACTUELLES DU PROCEDE
Malgré l'amélioration sensible dans l'obtention de vitroplants régénérés, le procédé

développé comporte encore des limites de différents ordres:
e la formation des cals obtenus directement sur expIant est très lente et la réponse des cals
envers l'embryogenèse est très hétérogène;
el'embryogenèse n'est pas synchrone puisqu'elle apparaît entre 2 et 24 mois après
l'isolement des cals et est induite sur moins de 10 % des cals. De plus, elle est souvent
bloquée ou déviée;
e le nombre de vitroplants régénérés reste faible, en raison de l'absence d'une phase
d'amplification des cultures: moins de 20 vitroplants peuvent être obtenus par clones.
L'objectif final poursuivi étant l'obtention d'un matériel disponible à grande échelle
pour les sélectionneurs et les producteurs de matériel végétal, une phase d'amplification des
cultures est actuellement recherchée. Le procédé étudié est la multiplication adventive. Elle
consiste dans le bourgeonnement d'embryons secondaires à la base des premiers embryons
somatiques obtenus. Ce procécé est une des voies adoptées chez certains ligneux et d'autres
Palmacées, comme le palmier à huile, et permet une multiplication végétative à grande
échelle.
34
INTRODUCTION
4 - OBJECTIFS
algré l'amélioration sensible du procédé par embryogenèse somatique mis au point

M sur le cocotier, de nombreuses difficultés sont rencontrées chez cette plante
récalcitrante à la régénération: en particulier des déviations ou blocages de l'embryogenèse et
une absence de phase de multiplication des embryons qui limitent encore la propagation en
masse de vitroplants. Dans ce contexte, notre travail a porté sur deux aspects:
1°) Dans le but de mieux maîtriser les conditions d'apparition de l'embryogenèse en milieu
gélosé, nous avons réalisé :
• une étude descriptive des facteurs nutritifs impliqués au cours de l'initiation de

l'embryogenèse par:
• une analyse des besoins nutritifs spécifiques alliée à l'étude des changements
ultrastructuraux et physiologiques qui pourraient accompagner l'initiation de
l'embryogenèse. Une étude histologique et cytologique a été effectuée. Des dosages de la
source carbonée (glucose ou saccharose), des éléments minéraux et du pH dans les milieux
ont été réalisés. Parallèlement, la composition en sucres et protéines solubles, et acides
aminés libres a été analysée au sein des cals. Ces études ont été effectuées en comparant
des cals en condition de multiplication et en condition d'initiation de l'embryogenèse;
• la recherche de facteurs nutritifs inducteurs de l'embryogenèse en faisant varier la

composition des milieux. L'initiation de l'embryogenèse est obtenue essentiellement après
une augmentation de la concentration en 2,4-D, en présence de charbon actif. Cependant,
l'emploi de cette auxine entraîne différents problèmes. En particulier, il est maintenant
établi que les auxines peuvent entraîner à long tenne des risques de variation au sein des
cultures lorsqu'elles sont utilisées à de trop fortes concentrations. Pour répondre à
l'objectif d'une multiplication confonne recherchée lors du procédé de régénération, il
serait intéressant de posséder un stimulus qui pennette l'initiation de l'embryogenèse sans
faire varier la concentration en 2,4-D utilisée pour la callogenèse.
Nous avons étudié l'effet d'une augmentation de la concentration en sucre des milieux sur
le devenir des cals ;
35
INTRODUCTION
• la recherche de marqueurs protéiques précoces qui seraient spécifiques du processus

embryogène
Cette recherche a été abordée au travers d'essais consistant à vérifier la présence dans des
cals embryogènes d'un marqueur de 50 kDa préalablement mis en évidence chez plusieurs
espèces Mono et Dicotylédones. Ce type de marqueur permettrait de caractériser les tissus
les plus aptes à l'embryogenèse. Ce qui faciliterait la recherche des facteurs impliqués dans
l'expression de l'embryogenèse chez une plante pour laquelle les les évènements qui
conduisent à la régénération sont particulièrement longs à se mettre en place (un an au
moins est nécessaire pour l'obtention d'embryons complets).
Ces études font l'objet de la première partie de ce mémoire
2°) Dans le but de faciliter la propagation en masse du cocotier, nous avons recherché
une alternative à l'absence de phase de multiplication des embryons. Notre choix s'est porté
sur la mise au point des suspensions embryogènes. Ces techniques possèdent de nombreux
avantages par rapport aux techniques en milieu solide. Elles permettent une plus forte
prolifération des structures embryogènes; celles-ci sont plus homogènes; les embryons sont
plus isolés et peuvent être obtenus avec un développement relativement synchrone. Elles ont
été adoptées en tant que procédé de régénération chez de nombreuses espèces, en particulier
des palmiers: le palmier à huile (DE TOUCHET et al., 1991) et le palmier dattier (DAGUIN ET
LETOUZE, 1988).
Ces études font l'objet de la seconde partie de ce mémoire. Dans un premier temps,
différentes études ont été réalisées afin de sélectionner le matériel compétent en milieu liquide
au sein de la collection de lignées de cals. Dans un deuxième temps, les conditions
d'obtention et de culture de suspensions embryogènes à partir de ce matériel et la
caractérisation de leurs potentialités embryogènes ont été recherchées.
Pour l'ensemble de ces études, il était important de posséder en amont un matériel

homogène et contrôlable quant à l'initiation des évènements embryogènes. L'hétérogénéité du
matériel en culture dans sa réponse vis-à-vis de l'embryogenèse est le problème majeur
rencontré lors du procédé de régénération. La collection de lignées de cals établie au
laboratoire constitue actuellement le matériel le plus homogène. Nous rappelons que ces
lignées proviennent de la multiplication des cals primaires obtenus sur l'expiant.
Nous avons donc choisi de focaliser nos études sur ce matériel en sélectionnant
différentes lignées de cals appartenant à la collection.
36
l..VIATEB.IEL & :I.VIET~OI>ES
MATERIEL & METHODES
lVIATERIEL & lVIET:HO:DE8
1- MATERIEL VEGETAL UTILISE
Le matériel végétal est fourni par la station Marc Delonne en Côte d'Ivoire. Il a été
prélevé sur des individus âgés de 20 à 25 ans et provient de l'hybride Grand Ouest Africain x
Nain Jaune Malais (DE NueE de LAMOTHE et BENARD, 1985) (hybride PB 121 créé par
l'IRHO-CIRAD). Nos travaux ont été réalisés à partir de cals d'origine inflorescentielle et
foliaire.
1.1- Cals d'origine inflorescentielle

La lignée L7 a été isolée à partir d'une inflorescence immature (spathe de 28 cm) d'un
hybride adulte âgé de 20 ans. Les cals ont été obtenus selon le protocole de VERDEIL et al.
l
(1989), en présence de 55 mg.r de 2,4-D. Après isolement et prolifération des cals primaires
(Juillet 89, 6 mois après la mise en culture), différentes lignées de cals « secondaires» de type
granuleux, dont la lignée L7, ont été obtenues.
La lignée L7 est multipliée et entretenue sur un milieu de multiplication noté M : M60
l
(60 mg.r l de 2,4-D, 2 g.r de charbon actif, 7,5 mg.r l d'agar) (tableau 7 et annexe 1) par des
repiquages successifs en milieu solide, tous les 2 mois. L'embryogenèse somatique, d'origine
l
unicellulaire, est initiée en augmentant la concentration en 2,4-D (milieu MIlO: 110 mg.r de
l
2,4-D,2 g.r de charbon actif, 7,5 mg.r l d'agar).
La lignée L82 dérive, elle aussi, d'explants inflorescentiels du même type d'hybride que
l
L7. Son milieu de multiplication, noté G, est différent du milieu M : il comporte 100 mg.r de
l l
2,4-D,3 g.r l de charbon actif, 7,5 mg.r d'agar, 20 g.r de glucose, 30 mg.r l d'adénine sulfate
(milieu G100) (tableau 7 et annexe 1). L'embryogenèse somatique, d'origine unicellulaire, est
l
initiée en augmentant la concentration en 2,4-D, à raison de 130 et 140 mg.r , en présence de
l l
3 g.r de charbon actif, et en doublant la concentration des macroéléments (100 ml.r au lieu
l
de 50 ml.r de la solution mère définie en annexe 1) (milieux G130 et G140).
1.2- Cals d'origine foliaire

Les lignées PBC23, PBC25 et PBC26 dérivent d'explants foliaires de l'hybride PB121.
Leur milieu de multiplication est le milieu M80 (tableau 7 et annexe 1). Ces lignées
« secondaires» de type granuleux ont été obtenues après repiquage des cals primaires de la
même façon que celles dérivant d'explants inflorescentiels.
37
MA TER/EL & METHODES
TABLEAU 7 : Tableau des milieux utilisés (*)
(*) Ne sont pas représentés les milieux de maturation des suspensions (Cf. tableau III)
Milieu Liquide Utilisation Sucre utilisé Macroéléments 2,4-D Charbon

(1) l
(L) concentration (mU -Ide (mg.r ) actif
l l
Solide (g.r ) milieu) (g.r )
(2)
(S)
M60 S Multiplication saccharose SO 60 2
des cals 30
MSO S Multiplication saccharose SO SO 2
des cals 30
M110 S Induction de saccharose SO 110 2
l'E. somatique 30
d'ori.
unicellulaire
M60/120 S Induction de saccharose SO 60 2
l'E. somatique 120
d'ori.
unicellulaire
M40 L Suspensions saccharose SO 40,60, 1 et 2
à (L7) 30 SO, 100,
M110 110
0100 S Multiplication glucose SO 100 3
des cals 20
0130 S Induction de glucose 100 130 3
l'E. somatique 20
d'ori.
unicellulaire
0140 S Induction de glucose 100 140 3
l'E. somatique 20
d'ori.
unicellulaire
L Etablissement glucose 100 60, SO, 1,2,3
et prolifération (3)
060 20 110,
à des suspensions 120,
01S0 130,
(L82)
140,
ISO
(1) Selon la lignée de cals, l'embryogenèse (E.) a deux origines (ori) possibles: unicellulaire ou
pluricellulaire
(2) La composition des macroéléments est donnée en annexe
(3) Cultures en absence de charbon actif. Milieux préparés en présence de charbon actif pour
permettre la réalisation de l'équilibre 2,4-D libre/2,4-D adsorbé par le charbon actif. Au bout de huit
jours, le charbon est éliminé.
38
2- TECHNIQUES DE CULTURE IN VITRO
2.1- Milieux et conditions de culture
2.1.1-TECHNIQUES EN MILIEU SOLIDE

• Composition des milieux de culture :
Les conditions de culture ont été décrites par VERDEIL et al. (1989). Le tableau 7
récapitule les différents milieux utilisés lors des expérimentations. La composition des milieux
de base est donnée en annexe 1.
La source en sucre est soit du saccharose (30 g.r') pour les lignées L7, PBC23, PBC 25
et PBC26 soit du glucose (20 g.r') pour la lignée L82. Pour chaque lignée, les milieux ont été
sélectionnés pour une croissance optimale des cals (VERDEIL, 1993).
Pour l'essai d'initiation de l'embryogenèse en présence d'une concentration élevée en
sucre, différentes concentrations en saccharose et glucose ont été testées: 60, 90, 120 g.r' de
saccharose; et 20, 40, 60, 90 g.r' de glucose (tableau 7).
Le pH des milieux est ajusté à 5 avec une solution de soude ou d'acide sulfurique.
Les milieux sont solidifiés par adjonction de 7,5 g.r' d'agar (Sigma A-7002). Ils sont
répartis dans des tubes Pyrex (24 mm x 160 mm) à raison de 20 ml par tube et stérilisés par
autoc1avage à 110°C pendant 20 min. Les milieux sont fabriqués 10 à 15 jours avant leur
utilisation, ce délai est nécessaire pour permettre la réalisation de l'équilibre 2,4-D libre/2,4-D
adsorbé par le charbon actif en milieu solide (VERDEIL, 1993).
• Conduite des cultures :

Les cals sont repiqués tous les deux mois en condition de multiplication ou d'initiation
de l'embryogenèse.
Les 3 lignées cultivées en milieu solide sont : L7, L82 et PBC26. Chaque lignée est
respectivement inoculée sur son milieu de multiplication (M60, G100 et M80) et sur son
milieu d'initiation (MIlO et M60/120 pour L7 et PBC26, et G130 et G140 pour L82)
(tableau 7).
Les tubes contenant les cals sont parafilmés et placés à l'obscurité en chambre de culture
ventilée, thermostatée à 27°C +/- 1°C et régulée à 55% +/- 1% de degré hygrométrique.
2.1.2- SUSPENSIONS
Les milieux de base utilisés sont les mêmes que les milieux solides.
Pour la mise en culture des lignées L7, PBC23 et 25, 10 variantes de milieu sont
utilisées; elles contiennent respectivement 40, 60, 80, 100, 110 mg.r' de 2,4-D en présence de
39
MATERIEL & METHODES
1 et 2 g.r l de charbon actif (milieux M40 à MIlO). Les milieux sont distribués dans des
erlenmeyers de 125 ml à raison de 20 ml par erlenmeyer. Les erlenmeyers sont bouchés avec
des capuchons en mousse synthétique, recouverts de papier aluminium et autoclavés. Les
lignées prolifèrent en milieu liquide en présence de charbon actif.
Pour la mise en culture de la lignée L82, les milieux utilisés sont les milieux G80 à
l l
G150, contenant de 80 à 150 mg.r de 2,4-D en présence de 1 à 3 g.r de charbon actif
(annexe 1). L82 prolifère sur un milieu dont on a éliminé le charbon actif. Pour cela, les
milieux sont préparés en présence de charbon actif, dans des bocaux au fond desquels le
charbon se dépose. Le surnageant est utilisé huit jours après la fabrication des milieux. Ce
délai est nécessaire pour la réalisation de l'équilibre 2,4-D libre/2,4-D adsorbé par le charbon
actif en milieu liquide (VERDEIL, 1993; ABERLENC-BERTOSSI, communication personnelle).
Quelle que soit la lignée considérée, le pH des milieux est ajusté à 5, avant l'ajout de
charbon actif. Les milieux sont autoclavés à 110°C.

o Mise en en culture :
Au moment de la mise en culture, des erlenmeyers vides sont stérilisés par autoclavage
et 20 ml de surnageant y sont distribués. Les cals sont divisés en fragments à l'aide de pinces
stériles, 500 mg de matière fraîche sont pesés dans une boîte de Pétri stérile préalablement
tarée, puis placés dans l'erlenmeyer avec une spatule. Pour effriter les cals sans les léser, on
utilise une pince et un scalpel qui sert à séparer les fragments. Les erlenmeyers sont obturés
par un bouchon synthétique et un film plastique. Ils sont ensuite placés en chambre de culture
sur table d'agitation (90 tours par minute) à l'obscurité.
o Repiquages:
Deux types d'essais ont été pratiqués:
• des essais en milieu liquide en présence de charbon. Les cals sont prélevés à la spatule. Ils
sont déposés dans une boîte de Pétri en verre, contenant 4 à 5 feuilles de papier filtre
stériles pour éliminer l'excès du milieu. Tout le milieu est renouvelé à l'aide d'une pipette
stérile de 20 ml et les cals sont déposés dans les erlenmeyers ;
• des essais en milieu liquide en absence de charbon. Dans ce cas, seule la moitié du milieu
est renouvelée (lO ml) à l'aide d'une pipette stérile. 10 ml de surnageant contenu dans les
bocaux sont prélevés à l'aide d'une pipette stérile et introduits dans les erlenmeyers qui
contiennent les cultures. Les erlenmeyers sont conservés pendant plusieurs cycles de
repIquage.
40
2.1.3- ESSAIS D'EXPRESSION DES POTENTIALITES EMBRYOGENES DES SUSPENSIONS

Les essais ont été pratiqués à partir des cals de la lignée L82.

Le milieu de base utilisé est le milieu G (annexe 1). La composition des milieux
d'étalement est basée sur celle des milieux de maturation utilisés lors du procédé de
régénération en milieu solide (VERDEIL et al., 1994.). La composition des milieux est
présentée dans le tableau 8.
TABLEAU 8 : Composition des milieux d'expression des potentialités embryogènes

des suspensions
Tous les milieux sont préparés en présence de 8 g.r! d'agar
I
Notation Caséine (mg) BAP (mg.r ) charbon actif (g.r I )
CB 250 1,125
CBx2 500 1,125
CA 2
Cas 250
Casx2 500
0
BAP 1,125
BAPx2 2,25
CC 250 2
300/1 ou 2 300 10u2
100/1 ou 2 100 1 ou 2

Au moment du sevrage en auxine, les suspensions sont pesées dans une boîte de Pétri
stérile préalablement tarée et transférées dans des erlenmeyers contenant le milieu de sevrage.
Pour les étalements (( plating »), elles sont transférées en boîtes de Pétri (diamètre : 5 cm,
hauteur 2 cm) sur un papier Whatman (diamètre: 4 cm) recouvrant le milieu solide de
maturation (l0 ml par boîte). La présence de papier filtre Whatman permet de limiter le taux
d'humidité au sein des boîtes.
41
2.2- Modalités de croissance

2.2.1- CALS EN MILIEU SOLIDE
• Mesure du poids de matière fraîche :
Dans tous les essais, des cals en fin de cycle de culture (deux mois après le dernier
repiquage) sont utilisés. Ils sont répartis au hasard sur leur rang d'utilisation, pesés et
ensemencés sur les différentes variantes de milieu, elles aussi réparties au hasard sur les
portoirs. 200 mg ± 10 mg de cals sont inoculés. Les tubes sont parafilmés puis placés en
chambre de culture. A chaque date de prélèvement définie, le contenu des tubes est pesé afin
d'en déterminer le poids de matière fraîche (MF).
• Mesure du poids sec :

Chaque échantillon est placé dans une cupule en verre dans une étuve à 110c C jusqu'à
ce que leur poids ne diminue plus (4gh.). Le poids de matière sèche (MS) est alors déterminé.
• Evaluation de la teneur en eau :

La teneur en eau (TE) des échantillons est calculée par la formule:
TE = MF - MS x 100
MF
2.2.2- SUSPENSIONS
• Evaluation du volume cellulaire et numération cellulaire
o Mesure du Volume Cellulaire sédimenté (VCS) :
Le contenu de l'erlenmeyer (biomasse et milieu) est versé dans un tube à
centrifuger en polystyrène (FALCON) de 15 ml, stérile et gradué. On laisse sédimenter
les suspensions 5 min. au fond du tube. Le volume de suspensions sédimenté est estimé
en fonction des graduations du tube. En cas de mesure en cours de culture, le tube est
agité puis l'intégralité de son contenu est replacé dans l'erlenmeyer initial.
o Dénombrement des constituants cellulaires :
Dans un même erlenmeyer, les différents groupes cellulaires constituant les
suspensions sont comptés sur cellule Nageotte. Quatre catégories ont été considérées:
• les cellules isolées;
• les massifs cellulaires contenant moins de 10 cellules ;
• les massifs cellulaires de 10 à 50 cellules;
• les massifs cellulaires supérieurs à 50 cellules.
Le nombre de cellules par massif est estimé par comptage visuel sur chaque massif
considéré.
Dans chaque erlenmeyer, 1 ml de suspensions est prélevé et déposé sur la cellule
Nageotte. Chaque résultat est la moyenne d'un comptage de 20 colonnes.
42
Le nombre de massifs de 1 à 50 cellules par ml de milieu a été déterminé par la formule

suivante:
Nombre de massifs: 800 (indice de la cellule) x dilution (1) x quantité de milieu (20
ml).
Le nombre de massifs comportant plus de 50 cellules a été déterminé visuellement sur la
cellule Nageotte.
• Etude de la viabilité des suspensions par le test FDA (diacétate de fluorescéine)

La viabilité des cellules isolées et des massifs cellulaires est estimée régulièrement en
cours de culture par le test FDA (WIDHOLM, 1972). Le FDA est une molécule non polaire qui
est décomposée par les estérases cellulaires en acide acétique et en fluorescéine, marqueur des
protéines qui deviennent fluorescentes en lumière ultraviolette. Le FDA est spécifique des
cellules vivantes. Quelques gouttes de suspensions sont mises en présence de la solution FDA
(annexe 2) entre lame et lamelle et le nombre de cellules ou massifs cellulaires vivants sont
comptés au microscope optique muni d'un spectre UV. Pour chaque massif considéré, le
pourcentage de viabilité est déterminé par la relation suivante:
% de viabilité = Nombre de cellules viVantes visualisés sur un massif x 100

Nombre total de cellules sur le massif
Une échelle de comptage, définie en annexe, permet l'estimation de ce pourcentage.

Pour chaque catégorie décrite précédemment, les comptages sont effectués sur 30
cellules isolées ou 30 massifs.
3- ETUDE HISTOCYTOLOGIQUE
3.1- Microscopie photonique

3.1.1- ÛBSERVATlONS SUR MATERIEL VIVANT:
En milieu liquide, deux séries de contrôle ont été effectuées:
• observations directes de la suspension au microscope inversé;
• à partir de gouttes de suspensions placées entre lame et lamelles, colorées au carmin
acétique (visualisation du noyau des cellules vivantes) et observées au microscope
photonique.
43
Echantillon
placé dans Echantillon placé
le fixateur dans le premier bain
d'éthanol (30°C) en vue Déshydratation en bains d'éthanol successifs
de la déshydratation (système automatisé)
==
== =
> > == =
Passage de l'échantillon Echantillon conservé
en imprégnation (LKB) : dans la solution Inclusion dans la résine
résine de base 100 ml d'imprégnation solution d'imprégnation 15 ml
benzoyl-peroxy 50% 1 g à 4°C 48h. min. 1 ml de durcisseur LKB
> ~ >
~
Les coupes sont déposées sur une surface Les coupes sont
d'eau bidistillée et récupérées transférées
Réalisation des coupes à l'aide d'un poil de pinceau sur une lame.
au microtome (3,5 /lm) monté sur une pipette Pasteur Les lames sont séchées à 20°C.
8
Coloration des coupes:
les lames sont
--~>
2 lavages
à l'eau
bidistillée
acidifiée avec
de l'HCI(pH<4,5)
--> Séchage complet
des coupes
-->
Coloration
au réactif de Schiff
tout d'abord placées (20 min.)
dans de l'acide périodique
(5 min.)
Lavage ",,--/ ~7
2 lavages sous l'eau du robinet
à l'eau bidistillée :> et lavage
pH<4,5 à l'eau bidistillée
Coloration Montage des lames
au Naphtol Blue Black
(5 min. à 60°C)
1 MICROSCOPIE PHOTONIQUE 1
- Pour la composition des différentes solutions utilisées, Cf. annexe.

_FI Pour la deshydratation, les échantillons sont placés dans des cupules
6 dont le fond est obturé par un morceau de gaze
-Figure 4-
3 rinçages successifs
-~ -~
de 30 min. dans
Fixation sous vide de l'eau bidistillée
3 lavages Postfixation dans
dans un mélange dans un bain
Glutaraldéhyde- l'acide osmique à 1%
de cacodylate
Tp. Cacodylate-
Eau bidistillée
( 2h.)
Imprégnation Inclusion dans

Deshydratation en bains d'éthanol successifs 3 bains de 30 min. progressive la résine Spurr
(système automatisé) dans l'oxyde de propylène par la résine Spurr : à 70°C
oxyde de propylène/résine Spurr
4V/IV, 2V/IV, IV/IV, IV/2V
30 min. chacun
-~>
Immersion des grilles

Réalisation des coupes
Dépôt de la coupe dans de l'acétate d'uranyle
à l'uItramicrotome équipé sur une grille de cuivre 30 min. à l'obscurité
d'un couteau de diamant
(2,1 mm de large)
Les coupes se déposent
sur une surface
d'eau bidistillée
Rinçage 30 min. Rinçage abondant

dans de l'eau -~ -~ pour éviter
bidistillée que le plomb ne précipite
Immersion des grilles
dans du citrate de Plomb
30 min. à l'obscurité
dans un dess icateur
(technique de Reynolds)
1 MICROSCOPIE ELECTRONIQUE A TRANSMISSION 1.
- Pour la composition des différentes solutions utilisées, Cf. annexe.
-Figure 5-
3.1.2- OBSERVATIONS SUR MATERIEL FIXE

Les échantillons sont fixés, deshydratés, imprégnés puis inclus dans la résine LKB
(Fig. 4). Le protocole est précisé en annexe 3. Les coupes (3 !lm) sont colorées par la double
coloration suivante:
• la réaction au PAS (Periodic Acid Schiff) :
L'acide périodique hydrolyse les groupements alcool des polysaccharides en aldéhydes
Le réactif de Schiff décoloré, une fois associé aux aldéhydes, forme un composé coloré en
rose. Les parois pectocellulosiques et les réserves amylacées sont colorées en rose-rouge.
• le naphthol blue black :
Le naphthol blue black est un colorant spécifique des protéines. Il colore les réserves de
nature protéique et les nucléoles (riboprotéines et nucléoprotéines) en bleu foncé, et les
noyaux (histones) en bleu moyen (FISHER, 1968).
3.2- Microscopie électronique à transmission

Les échantillons sont fixés, deshydratés, imprégnés puis inclus dans la résine Spurr
(Fig. 5). Les protocoles sont précisés en annexe 4. L'observation des coupes ultrafines a été
réalisée à l'Université de Sciences et Techniques de Montpellier, au microscope électronique
JeollOO C.
4- ANALYSE DES SUCRES, DES PRINCIPAUX ELEMENTS MINERAUX ET DU

2,4-D LIBRE DANS LES MILIEUX SOLIDES
4.1- Préparation des échantillons de milieu en vue des dosages

Une congélation rapide des tubes de milieu à -20°C permet de désorganiser la structure
de la gélose. Afin d'éliminer la gélose et le charbon actif des milieux, les échantillons sont
centrifugés pendant 15 min. à 15000 g à 4°C. Les dosages sont réalisés sur le surnageant filtré
sur filtre de nitrocellulose MILLIPORE (0,45 !lm) (Fig. 6).
4.2- Dosage du saccharose, du glucose et du fructose

Deux méthodes ont été utilisées suivant les essais.
4.2.1- LA TECHNIQUE ENZYMATIQUE DE BERGMEYER ET BERNT (1974):

Le saccharose, le glucose, et le fructose, contenus dans les milieux, ont été quantifiés en
mesurant l'absorbance à 340 nm au moyen d'un spectrophotomètre Beckman DU-70
(Beckman Instruments Inc., Fullerton, USA) avec les kits de dosages BOEHRINGER.
Le principe du dosage est présenté dans la figure 7. Quatre répétitions sont réalisées par
traitement (cal x variante de milieu x date de prélèvement). Les résultats sont exprimés en mg
par litre de milieu.
46
Prélèvement
des milieux
de culture
pour dosage
t
Congélation des tubes à -20°C
t
Décongélation
t
15000g
et-t 15 min.
4°C
<:-- Surnageant récupéré

Culot
/(Agar - charbon actif)
Jt éliminé
t
Surnageant
t
Filtration sur 0,45 um
/ t
Dosage des
Dosage des sucres éléments Dosage du 2,4-D libre
minéraux
PREPARATION DES MILIEUX EN VUE DES DOSAGES
-Figure 6-
n Détermination du D-glucose avant inversion:
Hexokinase (HK)
D-glucose + ATP ~ G-6-P + ADP
(L'enzyme agit à pH 7,6)
Glucose-6-phosphate deshydrogénase
(G6P-DH)
G-6-P + NADP ~ Gluconate-6-phosphate
+NADPH+H+
=> Le NADPH est détenniné à 340 nm

Le NAD PH est stoechiométrique avec la quantité de D- glucose
2) Détermination du D-fructose :
HK
D-fructose + ATP ---~ F-6-P + ADP
Phospho-glucose isomerase
(PGI)
F-6-P -------:> G-6-P
=> Fructose détenniné
3) Inversion enzymatique:
fJ-fructosidase
Sucrose + mû ~ D-glucose + D-fructose
=> Glucose détenniné après J'inversion
La quantitié de saccharose est calculée

par la différence des concentrations
de D-glucose avant et après l'inversion
DOSAGEDES SUCRES SOLUBLES PAR LA

METHODE ENZYMATIQUE BOEHRINGER
(principe du dosage)
-Figure 7-
4.2.2- LA TECHNIQUE CaLORIMETRIQUE DE FISHER ET KHOTES (1951) :

Après hydrolyse acide du saccharose, la quantité globale de glucose et de fructose est
déterminée par colorimétrie en utilisant du Dinitrosalycilate ou acide hydroxy-2 dinitro-3,5
benzoïque (DNS) (annexe 5). A température élevée, le DNS est réduit par les sucres
réducteurs en un composé de couleur jaune orangée. Les étapes du protocole sont décrites
dans la figure 8. Le surnageant des milieux est dilué de façon à obtenir une teneur en
l
équivalent glucose inférieure à 2 mg.r . Les résultats sont exprimés en mg par litre de milieu.
4.3- Dosage des principaux anions et cations

Après prélèvement du cal, le pH du milieu est mesuré en plongeant directement
l'électrode du pHmètre dans le surnageant du milieu. Celui-ci est ensuite dilué au centième.
Le dosage des macroéléments est réalisé par chromatographie ionique (HPLC Dionex
4500i, Dionex Corporation, Sunnyvale, USA) (Fig. 9).
Pour les anions (NO]-, sot, cr et H2P04), on utilise une méthode d'élution isocratique
(éluant: 3,9 mM de NaHCO] et 3,1 mM de Na2CO]). La colonne analytique utilisée est une
colonne IONPAC AS5A protégée en amont par une colonne de garde IONPAC AG5A.
Les cations ( NH/, K+, Na+, Ca/ et Mg/) sont séparés par chromatographie sur
colonne analytique IONPAC CS3 protégée en amont par une colonne de garde IONPAC CG3.
Ils sont élués par une méthode « step-gradient »; le changement d'éluant (passage de l'éluant 1
à l'éluant 2) s'effectue trois minutes après l'injection (l'éluant 1 contient: 12 mM d'Hel et 0,5
mM de monochlorydrate d'acide 2,3-diaminopropionique; l'éluant 2 est composé de 48 mM
d'HCl et 8 mM de monochlorydrate d'acide 2,3-diaminopropionique).
Cations et anions sont détectés en sortie de colonne par conductimétrie et quantifiés par
rapport à des gammes étalons. Trois répétitions par traitement (cal x variante de milieu x date
de prélèvement) sont effectuées. Les résultats sont exprimés en mg par litre de milieu.
4.4- Analyse du 2,4-D non adsorbé par le charbon actif du milieu

Le 2,4-D libre des milieux de culture a été dosé par la méthode mise au point par
l.L. Verdeil au laboratoire (VERDEIL, 1993) (Fig. 10).
Le surnageant est fractionné par HPLC sur colonne C18 (phase inverse) (Lichrospher
100 RP-18, MERCK) protégée par une précolonne de même phase. Le volume de la boucle
d'injection utilisée est de 500 Jll. La colonne est préalablement équilibrée par une solution
d'acide formique (53 mM) et de triéthylamine (TEA à 5 mM) dont l'adjonction permet une
meilleure séparation des régulateurs de croissance étudiés. Les différents composés du milieu
sont élués par un gradient acide formique à 0,2%/méthanol (Fig. 10).
49
1) Hydrolyse
1 ml de Surnageant + 1 ml d'HCl3N
t
L
Vortex 15 secondes
t
Bain-marie 15 minutes à 100 oC
t
~~
+ 0,4 ml de NaOH 6,5N
LJ
Vortex 10 secondes
1
y
2) Réaction colorimétrique
1,2 ml de mélange hydrolysé

+ 1 ml de DNS
~
L
Vortex 10 secondes
~
Bain-marie 10 minutes à 100 oC
~
3) Mesure de la densité optique
0,5 ml d'extrait + 1,5 ml d'eau
~
lecture à 510 nm
DOSAGE DES SUCRES SOLUBLES

DANS LE MILIEU DE CULTURE
(selon la technique de Fisher et Khotes)
-Figure 8-
-
-~
Cations • ~
(NH4+, K+, Na+, --~ Elution en"Step gradient"
Détection
Ca2+, Mg2+) Passage en 3 min. de l'éluant 1 à l'éluant 2
Surnageant (HCI: 12 mM; monochl d'ac 2,3-diaminopropionique: 0,5 mM
en conductimétrie
HCI : 48 mM; monochl d'ac 2,3-diaminopropionique : 8 mM) et
Dilué 100 fois

Calibration
(gamme étalon)
Anions
(N03-, 5042-,
--> -~.
CI-, H2P04-) Elution isocratique
(NaHC03 : 3,9 mM; Na2C03: 3,1 mM)
DOSAGE DES ELEMENTS MINERAUX
-Figure 9-
Le 2,4-D est détecté dans l'ultra-violet par un détecteur à programmation de longueur

d'onde (PHILIPS). Ce détecteur pennet de faire varier la longueur d'onde de détection en
fonction du temps de façon à détecter chaque composé à la longueur d'onde pour laquelle
l'absorption est maximale. Le 2,4-D est détecté à 230 nm.
La quantification du 2,4-D est réalisée par rapport à l'injection de solutions de 2,4-D
témoins de concentrations connues. Les données sont traitées sur logiciel d'intégration
PU6000 (PHILIPS).
Quatre répétitions par traitement (cal x variante de milieu x date de prélèvement) sont
réalisées. Les résultats sont exprimés en mg par litre de milieu.
5- ANALYSE DE LA TENEUR EN SUCRES SOLUBLES AU SEIN DES CALS
Les cals sont congelés dans l'azote liquide et conservés à -30°C. Lors de l'analyse, 100
mg de matière fraîche sont broyés dans un mortier en présence d'azote liquide. Les sucres
solubles, saccharose, glucose et fructose, sont extraits dans une solution éthanolique à 80%
sous reflux (2 fois Ih.), évaporés au Rotavapor à 40°C et filtrés (0.45J.lm).
Les sucres sont séparés par chromatographie ionique (HPLC DIüNEX) et détectés par
ampérométrie pulsée. Le gradient d'élution est réalisé pendant 40 min. par un passage de 0 à
0.2 mM de soude. Le flux est de 1 ml.min.- I . La nature des glucides et leur concentration sont
détenninées par rapport à des témoins de concentrations connues. Le protocole est décrit dans
la figure II.
Les dosages sont effectués sur une fraction de chaque cal. L'autre fraction sert à la
détennination du poids de matière sèche. Les résultats sont exprimés en mg par g de matière
sèche. Ces analyses ont été réalisées au CIRAD-GERDAT à Montpellier par Mr. Piombo.
6- DETECTION ET QUANTIFICATION DES ACIDES AMINES AU SEIN DES

CALS
Les étapes du dosage sont résumées dans la figure 12 a et b. Certaines caractéristiques

de la méthode sont données en annexe 6.
Les dosages sont effectués sur 100 mg de cals. Les acides aminés sont extraits par un
mélange eau acide (pH3.9)/chlorofonne. La phase aqueuse est récupérée par centrifugation,
filtrée et conservée au froid.
52
Surnageant
Colonne C18 Phase invme
Eluants: Chromatogramme:
- éluant A : 0,7 ml de triéthylamine Programmation de longueur d'onde:
2 ml d'acide formique o à 12,5 min. : 270 nm
dans 11 d'eau bidistillée, 12,5 à 15 min. : 230 nm
- éluant B: méthanol 15 à 20 min. : 270 nm
Sensibilité ABS Range: 0,32
Boucle d'injection de 500 ~I (Détecteur Phillips)
Pression: 20 Bar
Débit: 1 ml.min-l
Gradient:
- 4 min. dans 50% d'éluant B
- 10 min. de séparation par passage de 50 à 100% de B
- 2 min. de séparation dans 100% de B
- 4 min. de passage de 100 à 50% de B 1
- 2 min. de rééquilibrage dans 50% de B

'"
Calibration (étalons externes)
Traitement des données

sur logiciel d'intégration Philips
DOSAGE DU 2,4-D LIBRE

DANS LES MILIEUX
EN PRESENCE DE CHARBON ACTIF
-Figure 10-
o
Cal conservé à -30°C
~
Fractionnement du
cal en deux parties
de même poids
c
Détermination
de la matière sèche
c
Dosage des sucres
~
Broyage des cals
dans l'azote liquide
~
Extraction des sucres
dans une solution
d'éthanol 80%
sous reflux (2 fois 1h.)
sous agitation
Evaporation au Rotavapor à 40°C
Filtration sur 0,451lm
--~.
Chromatographie ionique
Détection par ampérométrie pulsée
Gradient NaOH de 0 à 0,2 mM
Flux 1 ml.min.-l
DOSAGE DES SUCRES SOLUBLES

AU SEIN DES CALS
-Figure 11-
MATERIEL & METHODES
Les acides aminés ne sont pas détectables par les UV : une étape de dérivation est
nécessaire. Celle-ci consiste à fixer aux acides aminés une molécule, le phénylisothiocarbamyl
(PITC) qui absorbe dans l'UV à 254 nm. Un étalon interne, la norleucine (acide aminé de
synthèse) est ajouté dans les échantillons. Il sert de référence pour déterminer l'ordre de sortie
des acides aminés. Il permet aussi d'éliminer la disparité possible entre les différentes
réactions de dérivation et leur influence éventuelle sur les mesures.
Pour la méthode de calcul, l'intégration de la surface des pics peut être faite directement
par le logiciel PU6000 (PHILIPS) par référence avec la surface des pics d'une gamme étalon.
Cependant pour les acides aminés, la proximité de certains pics, en particulier, ceux de la
glycine, de l'arginine et de l'histidine, rend difficile leur intégration individuelle. Il peut en
résulter des erreurs sur l'estimation des temps de rétention, donc sur l'identification des acides
aminés. Nous avons donc préféré une procédure manuelle d'exploitation des aires de pics
déterminées par le logiciel PU6000.
3 répétitions par traitement (cal x variante de milieu x date de prélèvement) ont été
réalisées. Les résultats sont exprimés en mg par gramme de matière sèche.
7- ANALYSE QUANTITATIVE ET QUALITATIVE DES PROTEINES SOLUBLES

AU SEIN DES CALS
7.1~ Etude quantitative

100 mg de cals sont broyés dans de l'azote liquide et récupérés par un tampon
d'extraction. Le surnageant est récupéré par centrifugation et conservé à -20°C (annexe 7).
Les protéines sont dosées par la méthode mise au point par BRADFORD (1976). Les kits
BIüRAD sont utilisés (figure 13). Une solution de serum albumine bovine (BSA) est utilisée
pour la gamme étalon. 3 répétitions sont effectuées par traitement (cal x variante de milieu x
date de prélèvement). Les résultats sont exprimés en mg par gramme de matière sèche.
7.2- Etude qualitative

Après la détermination de la concentration en protéines des échantillons, les
électrophorèses monodimensionnelles sont réalisées en condition dénaturante. La séparation
s'effectue sur gel de polyacrylamide à 15% (Fig. 13). Le gel de concentration est à 4%. La
composition des tampons et des gels est donnée en annexe 7.
Un tampon de charge est ajouté à chaque échantillon pour marquer le front de
migration. Les échantillons sont dénaturés 10 min. à 100°C. Le volume déposé dépend de la
concentration en protéines de l'échantillon. Parallèlement aux échantillons, un marqueur
protéique de faible poids moléculaire (66-14.2 kDa, SIGMA, 5~1 par puits) est déposé sur
55
MATERIEL & METHODES
chaque gel. Après migration, les protéines sont fixées par un tampon de fixation (annexe 7) et
révélées au nitrate d'argent. Les gels sont ensuite séchés.
3 répétitions par traitement (cal x variante de milieu x date de prélèvement) ont été
réalisées.
8- RECHERCHE DE MARQUEURS PROTEIQUES AU SEIN DES TISSUS PAR

« IMMUNODETECTION »
8.1- Extraction
200 mg de matière fraîche de cals sont broyés en présence de 200 III de tampon
d'extraction Tris (annexe 8) et l'ensemble est transféré en tube Eppendorf. Le broyat est
centrifugé à 50000 g à 4°C pendant 30 min. Le surnageant contenant les protéines solubles est
récupéré et placé à -20°C jusqu'à son utilisation. Le contenu en protéines est évalué par le test
ESEN: 2 III d'extrait sont placés sur un carré de papier filtre Whatman; après séchage pendant
10 min., le carré de papier filtre est déposé dans un bain de réactif ESEN (1 g de bleu de
Coomassie G-250, 250 ml d'isopropanol, 100 ml d'acide acétique glacial, , 650 ml d'eau
distillée) pendant 5 min. Il est ensuite rincé avec de l'eau. L'intensité de la coloration de
chaque dépôt est comparée avec celle correspondant à des témoins de quantité connue.
8.2- Electrophorèse SDS-PAGE

Les protéines sont séparées en électrophorèse monodimensionnelle SDS-PAGE sur mini
gel discontinu constitué d'un gradient de 10-15% de polyacrylamide. La composition des
tampons et des gels est donnée en annexe 8. Après polymérisation des gels, une
préelectrophorèse sans protéine est réalisée pendant 15 min. à 10 mA/gel. Elle permet
d'éliminer les composés non polymérisés. Le dépôt des échantillons se fait dans les mêmes
conditions que précèdemment.
L'électrophorèse est pratiquée pendant 15 min. à 12 mA puis à 15 mA pendant 90 à 120
mm.
8.3- Western blot

Les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose (0.2J,!m) (Fig. 14). Après
le transfert des protéines sur membrane, les gels sont transférés dans une solution de
coloration au bleu de Coomassie (annexe 8), et sont conservés pour l'analyse du profil
protéique.
Après coloration et marquage des bandes polypeptidiques, la membrane de
nitrocellulose est transférée dans une solution qui permet de saturer les sites de fixation des
protéines.
56
o
Cal conservé à -30°C
t
Fractionnement du
cal en deux parties
de même poids Ajouter à 10 III d'extrait :
- 10 III de norleucine à 221 Ilg.ml-I
~ ~
(étalon interne)
C\ CI
- 10 III de solution de séchage
(eau 215, éthanol 2/5, triéthylamine 1/5)
(dans les tubes servant à la séparation
des acides aminés en HPLC)
Dosage des sucres
t ~
Broyage des cals
dans l'azote liquide
Evaporer sous vide au Speedvack 5 min.
t
Extraction des acides aminés
en présence de :
- 2,5 ml de chloroforme pur
- 2,5 ml d'eau "acide"
(pH 3.9 à 4 avec HCI)
t
Transfert des extraits
dans des ft acons Ajouter la solution de dérivation contenant
en verre bouchés le phénylisothiocyanate (PITe)
(phénylisothiocyanate 1/10, éthanol 7/10,
y triéthylamine 1/10, eau 1/10)
1 nuit à 4°C et à l'obscurité
4-y
4500 trs; 10 min.
4°C en tubes
Corex 15 ml Laisser les tubes 30 min. à température ambiante
y
Fj~
f:= 'J/
Evaporer au Speedvack une nuit
Phase aqueuse récupérée
et filtrée sur Millipore
0.45 !lm puis 0.2 !lm
Conserver à -20°C Conserver à -20°C

jusqu'à l'étape jusqu'au passage
de dérivation sur la colonne d'HPLC
EXTRACTION DES ACIDES AMINES DERIVATION
DOSAGE DES ACIDES AMINES 1

L...--- PAR HPLC _
1
-Figure 12 a)-
Echantillons d'acides aminés dérivés
~
Reprendre dans 100 ~I de l'éluant A d'HPLC
D
Vortex 10 secondes
~ %éluanlB
loo"j-~
,oa/.
Colonne C18 Phase inverse
10%
'------;\"'""0-·20.-----::<30:------:t4Ô:--~:>
Eluants: temps (min.)
- éluant A: 119 g d'acétate de Na,
500 ~I de triéthylamine
dans II d'eau bidistillée, Gradient:
pH 6.4 avec de l'acide acétique - 10 min. de rinçage dans 10% d'éluant B
- éluant B : 600 ml d'acétonitrile, - 25 min. de séparation par passage de 10 à 49% de B
400 ml d'eau - 2 min. de passage de 49% à 100% de B
- 6 min. de rinçage dans 100% de B
Boucle d'injection de 20 ~I - 2 min. de passage de 100% à 10% de B
Four: 38°C - 10 min. de rééquilibrage à 10% de B
Pression: 250 Bar
Débit: 1 mI.min-1
Passeur d'échantillon automatique thermostaté à 4°C
Chromatogramme:
Détection UV à 254 nm
Sensibilité ABS Range: 0,32
(Détecteur Philips)
o
Calibration (étalons externes)
~
Traitement des données
sur logiciel d'intégration PU 6000 Philips
SEPARAnON DES PTC-AMINOACIDES PAR OPLe
DOSAGE DES ACIDES AMINES

PAR HPLC
1
-Figure 12 b)-
MATERIEL & METHODES
8.4- Immunodétection avec l'anticorps monoclonal 7CS

L'anticorps monoclonal utilisé est spécifique d'une protéine de 50 kDa présent dans les
tissus à potentialités embryogènes de pois (STIRN ET JACOBSEN, 1990; ALTHERR et al., 1993).
Après l'étape de fixation, la membrane de nitrocellulose est incubée, avec l'anticorps
dirigé contre la protéine de 50 kDa (Fig. 14). La fixation d'un deuxième anticorps sur
l'anticorps monoclonal permet d'amplifier la réaction. Un marquage enzymatique du
complexe antigène-anticorps est réalisé par la fixation d'un troisième anticorps couplé à la
phosphatase alcaline. Ce qui permet de révéler la réaction immunologique par réaction
enzymatique. La réaction enzymatique se déroule en 10 à 15 min. et est stoppée en remplaçant
le substrat par de l'eau milli-Q.
9- EXPLOITATION STATISTIQUE DES RESULTATS
Les données ont été analysées par différentes méthodes statistiques:
9.1- Analyse de variance et comparaison de moyennes

Une analyse de variance (NEwMAN, 1939; KEULS, 1952) et une comparaison de
moyennes (Test de Newman et Keuls) (au seuil de 5%) des résultats a été réalisée à l'aide des
logiciels NDMS et STATISTICA afin de détenniner les différences significatives entre
traitements.
L'influence de deux facteurs significatifs A et B sur la variable mesurée est estimée ainsi
que les variances:
2 2 2 2
SA =~l et SB =l&j
p-l q-l
ai représente les écarts dûs au facteur A, p le nombre de modalités du facteur A, bj les

écarts dûs au facteur B, q le nombre de modalités pour le facteur B.
Cette estimation a été réalisée d'après les espérances mathématiques des carrés moyens
donnés par l'analyse de variance (DAGNELIE, 1975). L'influence relative du facteur A sur la
2 2 2
variable mesurée est exprimée par le quotient S A /(SA +SB ), l'influence relative du facteur b
2 2 2
est donnée par le rapport S B /(SA +SB ).
Les courbes représentent l'évolution des données mesurées. Les points représentés
correspondent aux valeurs moyennes de chaque condition.
59
o Cal conservé à -30°C
Fractionnement du cal
Dénaturation 10 min. à 100°C
en deux parties de même poids
(100 mg)
J::' ~
50 111 d'extrait protéique
CI
Détermination
C\ + 50 111 de solution de charge
contenant du Bleu de Bromophénol
Dosage des protéines

de la matière sèche
Broyage des cals

en présence
d'azote liquide Tampon de migrBlion Q
~ /V Dépôt des échantillons
t '" )-----(/'-7"-:-7" sur les gels d'électrophorèse
à raison de 50 I1g par puits
Extraction des protéines
dans un tampon
(TrisHCI. NaCI, CaCI2,2H20, OTT)
~
~4500 rpm Migration de l'électrophorèse
en condition dénaturante
15 min. Ih. à 150 mV
4°C
ou 12 min. mA puis 90 à 120 min. à 15 mA
[l 1
-
sumagean' récupéré
(extrait protéique)
Culo' éliminé
Fixation des gels
en présence
d'éthanol et d'ac. acétique
pendant 1h. sous agitation
50 III d'extrait protéique Coloration 15 min.

+ 750 III de tampon d'extraction en présence
200 III de réactifBIORAD de nitrate d'Argent
::::::~
~ -------
/ - - - - - - 7'
ou de bleu de Coomassie
(lors de la recherche
10 min. à température ambiante ;'" V d'un marqueur protéique
t par immunodétection)
Mesure de la DO à 595 nm
t
Détermination Révélation des gels en présence
de la concentration d'acide citrique et de formaldéhyde
par référence
à une gamme étalon de BSA
DOSAGE DES PROTEINES SOLUBLES ELECTROPHORESE MONODIMENTIONNELLE
ETUDE QUANTITATIVE ET QUALITATIVE DES

PROTEINES AU SEIN DES CALS
-Figure 13-
3 couches de papier filtre Whatman (7 x 10 cm) r--------,.L-----' t
1 membrane de nitrocellulose 0,2 I1m (6,5 x 9 cm)
le gel
f7L-:~~~1
1 feuille de papier Whatrnan ------~
3 feuilles de papier Whatrnan
WESTERN BLOT
Transfert des protéines
Préparation pour le WESTERN BLOT
sur la membrane de nitrocellulose
30 à 45 min. à 5,5 mA/cm
/;----/.--
- -- - --
------
------
- -- - --
Coloration de la membrane de nitrocellulose SATURATION DES SITES LIBRES DES PROTEINES
avec une solution de Ponceau Décoloration avec de l'eau bidistillée
(0,2% dans 0,3% de TCA) Fixation dans une solution:
et marquage des bandes polypeptidiques PBS pH 7,4, BSA (w/v) 1%,
serum d'agneau (v/v) 1%
lh. à température ambiante ou toute la nuit
2 lavages d'Ih. dans une solution

de PBS, pH 7,4, Tween 20 (v/v) 0,05%,
INCUBATION AVEC L'ANTICORPS MONOCLONAL BSA (w/v) 0,1%,
spécifique de la protéine recherchée 2h. à température ambiante serum d'agneau (v/v) 1%
Solution d'anticorps diluée 1000 fois
dans la solution diluante :
PBS, pH 7,4, Tween 20 (v/v) 0,05%, serum d'agneau (v/v) 5%
2 lavages d' 1h.

dans la solution précédente
AMPLIFICATION DE LA REACTION
ANTIGENE-ANTICORPS
Incubation avec un deuxième anticorps
(spécifique du premier anticorps)
dilué 8000 fois dans la solution diluante
2 lavages d'lh.
dans la solution précédente
MARQUAGE PAR UNE ENZYME
Incubation avec un troisième anticorps
couplé à la phosphatase alcaline,
dilué 1000 fois dans la solution diluante
Incubation 5 min. dans un tampon TRIS: Réaction enzymatique 15 min. avec le substrat:
Tris 0,2 M pH 8,2, CaCI2 2mM Naphtol ASMxP 6 mg dans 15 ml d'eau,
Fast Red 90 mg dans 15 ml d'eau
(Solution de substrat préparée extemporanément)
Réaction stoppée avec de l'eau bidistillée
WESTERN BLOT ET IMMUNODETECTION D'UN MARQUEUR PROTEIQUE
-Figure 14-
MATERIEL & METHODES
9.2- Analyses de covariance intragroupe, test de parallélisme et régression multiple

Des relations significatives entre l'évolution des différents paramètres analysés sont
recherchées à l'intérieur des milieux par une analyse de covariance à effet fixe (milieu) entre
une variable dépendante et une variable indépendante (covariable). La comparaison des pentes
2
de la relation est effectuée par un test de parallélisme. Le coefficient de détermination (R ) est
estimé. Les paramètres analysés ont été comparés en fonction de la moyenne de l'interaction
« milieu x date de prélèvement ».
9.3- Classification ascendante hiérarchique et analyse discriminante

Une classification ascendante hiérarchique (CAH) a été réalisée à partir des données sur
les teneurs en acides aminés au sein des cals. La distance statistique choisie pour estimer la
différence entre deux individus i et k est la distance Euclidienne:
pondérée pour chaque variablej par l'écart-type cri et où Xij et Xkj sont les valeurs observées de
la variable j respectivement sur les individus i et k.
Le critère d'agrégation retenu est celui de WARD (1963). La méthode permet d'obtenir
un dendrogramme, dont le découpage conduit à des groupes d'individus. Les cals sont ainsi
classés, non pas par rapport au traitement qu'ils ont subi, mais pour leur ressemblance dans
leur composition en acides aminés endogènes.
Le découpage du dendrogramme étant arbitraire, d'une part, et la méthode étant destinée

à faire des groupes d'autre part, il est impératif de s'assurer de la cohérence du résultat. Une
première étape consiste à vérifier les groupes que nous définissons. L'analyse discriminante
(ROMEDER, 1973) en nous fournissant le taux d'individus bien classés de chaque groupe
répond à cette question. Cette analyse nous permet aussi de rechercher quel(s) composé(s)
différenci(ent) au mieux ces groupes. Une deuxième étape consiste à comparer les groupes
pour chaque composé en utilisant l'analyse de la variance d'un modèle fixe à un critère de
classification (effet inter-groupes), suivie du test de NEWMAN (1939) et KEULS (1952).
Cet ensemble de méthodes statistiques a permis de dresser une typologie des cals: l, II,
etc. Ainsi, on peut dire que le traitement X à la date T donne par exemple 30% de cals de type
l, 40% de cals de type II et 30% de cals de type IV.
62
:RE8U"LT.A.T8
D es études préliminaires, consistant à étudier le comportement de différentes lignées de
cals en milieu liquide, nous ont permis de montrer que seuls des cals granuleux de type
friable étaient capables de se maintenir en milieu liquide. La notion de friabilité impliquait
que les cals pouvaient facilement s'affranchir de la cohésion cellulaire caractéristique de cals
maintenus en tube sur milieu gélosé et se fractionner spontanément en unités de plus petite
taille dans un environnement liquide. Plusieurs lignées à fort potentiel embryogène présentant
ce caractère friable, ont alors été sélectionnées au sein de la collection.
Avant la mise au point des techniques de suspensions, notre premier objectif a été de
mieux caractériser ces lignées dans leur mode de multiplication et dans le déroulement de
l'initiation de l'embryogenèse somatique. Cette étude a été réalisée en milieu solide.
63
ETUDE DES FACTEURS NUTRITIFS
-PAR.TIEI-
ETUDE DES FACTEURS NUTRITIFS IMPLIQUES
LORS DE L'INITIATION DE L'EMBRYOGENESE SOMATIQUE
EN MILIEU SOLIDE
INTRODUCTION: DEFINITIONS
Le terme d'initiation de l'embryogenèse sera préféré au terme d'induction généralement

utilisé.
On entend généralement par induction le déclenchement de l'embryogenèse, sous l'effet
d'un stimulus, à partir de cellules ou groupes de cellules encore à l'état méristématique mais
potentiellement embryogènes. Comme le souligne CARMAN (1990), les cellules totipotentes,
très « plastiques », peuvent s'orienter vers différentes voies de différenciation selon la nature
du stimulus appliqué et selon leur environnement. Nous dirons que ce stimulus induit les
cellules vers la différenciation dont une voie possible est l'embryogenèse mais ces cellules,
une fois induites, expriment un nouveau processus de développement en initiant la formation
de cellules ou structures embryogènes. Nous préfèrerons d'initiation de
parler
l'embryogenèse, terme qui, selon nous, rend mieux compte de l'engagement des cultures vers
cette nouvelle voie.
C'est l'étude histologique systématique des différentes étapes morphogénétiques qui a

permis de mieux caractériser l'embryogenèse somatique chez le cocotier. Cellules
embryogènes, proembryons et parfois formations embryonnaires peuvent coexister. Trois
conditions peuvent être distinguées (VERDEIL, 1993) :
• Condition de multiplication. Les cals, considérés en condition de multiplication, sont des

cals qui n'ont pas encore initié la formation de structures de type embryogène selon un
critère histologique;
• Condition d'initiation de l'embryogenèse. Elle comporte deux évènements structuraux:
tout d'abord, la formation de cellules ou groupes de cellules embryogènes à partir des
cellules méristématiques; ensuite, la proembryogenèse l'étape qui conduit à la formation de
proembryons globulaires, à partir des cellules embryogènes. Cette étape peut s'étaler sur
plusieurs mois. A un temps donné, des proembryons à· tous les stades peuvent être
observés;
64
ETUDE DES FACTEURS NUTRITIFS
• Condition d'ontogenèse embryonnaire, l'étape pendant laquelle une hétérogénéité

territoriale s'installe au sein du proembryon et conduit à la formation du cotylédon et de
l'axe embryonnaire.
Dans le présent mémoire, nous nous sommes intéressée aux deux premières étapes, en
comparant systématiquement cals en condition de multiplication et cals en condition
d'initiation de l'embryogenèse somatique. Nous qualifierons de milieu de multiplication, le
milieu gélosé d'entretien des cals, et de milieu d'initiation, le milieu d'initiation de
l'embryogenèse.
65
PLANCHE III
Structure des cals en condition de multiplication
1. Vue macroscopique d'un cal en multiplication (barre: 2 mm)

2. Coupe histologique d'un cal appartenant à une lignée de type 1 (barre: 65 J.lm)
Mp : mitoses périclines; Pa : parenchyme; Pc : pseudocambium; P : protoderme.

CARACTERISA TION MORPHOLOGIQUE ET STRUCTURALE
-C~ITR.EI
CARACTERISATION MORPHOLOGIQUE ET STRUCTURALE

DES LIGNEES DE CALS
Au cours de ce chapitre, nous décrirons l'aspect morphologique et la structure des cals

en condition de multiplication et en condition d'initiation de l'embryogenèse.
1- ETUDE MORPHOLOGIQUE DES LIGNEES DE CALS
Qu'elles soient d'origine foliaire ou inflorescentielle, les lignées de cals ont une texture
granuleuse. Macroscopiquement, ces cals sont composés de nodules d'aspect homogène et de
couleur beige-jaune (Planche III, photo 1). Chaque nodule forme une masse assez compacte.
Par contre, ils peuvent se séparer les uns des autres, une fois libérés du tube.
Certaines lignées, dont la texture granuleuse est moins marquée, se caractérisent par une
friabilité plus importante. Ces cals peuvent se fragmenter facilement en unités nodulaires plus
petites que chez le type de cals précédent.
Quelle que soit la lignée embryogène considérée, l'embryogenèse est initiée par passage
des cals sur un milieu comportant une concentration en 2,4-D plus élevée que celle des
milieux de multiplication. Le critère qui permet d'observer que l'embryogenèse est initiée est
la présence de globules blanc-nacrés qui s'individualisent du cal vers le 60e jour de culture
(Planche V, photo 1). Ces globules constituent les structures embryogènes, qui après
diminution de la concentration en 2,4-D, évolueront ensuite en structures embryonnaires puis
en embryons (Cf. Introduction).
2- DESCRIPTION HISTOLOGIQUE DE LA STRUCTURE DES CALS
Une étude histologique a permis de décrire la structure de ces cals en condition de

multiplication et en condition d'initiation de l'embryogenèse.
2.1- Cals sur milieu de multiplication

Les différentes lignées de cals étudiées diffèrent par les modalités qui permettent
d'assurer leur multiplication. Nous distinguerons deux types de cals (VERDEIL, 1993) :
66
PLANCHE IV
Structure des cals en condition de multiplication

1. Activation et division des cellules du protoderme d'un cal de type l, à l'origine des cals de
type II (barre : 10 Ilm)
2. Détail de la structure d'un cal appartenant à une lignée de type II (barre: 150 Ilm)
Pc: pseudocambium; P: protoderme.

1
-
e.
CARACTERISA TION MORPHOLOGIQUE ET STRUCTURALE
Q les cals de « type 1 » dont la prolifération est assurée par une assise méristématique de type
pseudocambial ;
Q les cals de « type II » dont la prolifération est assurée par une assise méristématique de type
protodermique.
2.1.1- CALS DE TYPE 1

Les cals de type 1 montrent, au sein de chaque nodule qui les compose, une structure
organisée en trois zones tissulaires distinctes dont l'importance respective varie d'un cal à
l'autre (planche III, photo 2) :
• une assise périphérique de type protodermique ;
• une assise méristématique organisée en un pseudocambium assurant la croissance en
épaisseur des cals par mitoses essentiellement périclines. Les cellules de ces assises
possèdent une forme plus ou moins rectangulaire et un noyau lenticulaire ; elles sont
empilées en couches régulières. Des mitoses anticlines permettent l'augmentation du
diamètre des nodules. Des digitations de la zone méristématique pseudocambiale
entraînent la formation de nouveaux nodules ;
• une zone centrale composée de cellules qui ont tendance à se différencier en cellules
parenchymenteuses et en éléments vasculaires; ces cellules proviennent de mitoses
périclines des cellules composant la zone pseudocambiale.
2.1.2- CALS DE TYPE II

Les cals de type Il dérivent d'une sous-culture des cals du même type que ceux décrits
précèdemment, par l'intermédiaire d'une réactivation de l'activité mitotique des cellules
constituant la zone protodermique. Cette réactivation peut être obtenue sous certaines
conditions (VERDEIL, 1993) :
• soit, une augmentation de la concentration en 2,4-D dans le milieu;
• soit, une augmentation de la fréquence des repiquages (un repiquage tous les 15 jours
au lieu d'un repiquage tous les 60 jours).
L'activité mitotique au niveau du protoderme devient plus importante que celle des
cellules pseudocambiales. Elle entraîne alors une désorganisation de la structure des cals
(Planche IV, photo 1). Après plusieurs repiquages, les tissus superficiels constitués des
cellules de l'assise protodermique peuvent être séparés du cal initial. La prolifération de ce
type de tissu est assurée par des mitoses essentiellement anticlines qui conduisent à
l'obtention de cals, tels que ceux constituant la lignée L82. Ces cals sont essentiellement
constitués de deux assises cellulaires en forme de «rubans» (Planche IV, photo 2). Ils
peuvent également être constitués de groupes de cellules de diamètre plus important sous
67
PLANCHE V
Structure des cals en condition d'initiation de l'embryogenèse
1. Vue macroscopique d'un cal embryogène en condition d'initiation de l'embryogenèse

(barre : 1 mm)
e
2. Cal de type 1 sur milieu d'initiation de l'embryogenèse (l5 jour de culture)
(barre: 130 ~m)
3. Détail du pseudocambium destructuré d'un cal de type 1 (barre: 30 ~m)
e
4. Cals de type II sur milieu d'initiation de l'embryogenèse (l5 jour de culture)
(barre: 50 Ilm)
5. Nodule de cals de type II (barre: 50 Ilm)
CE : cellule embryogène; Pa : parenchyme; Pc : pseudocambium destructuré; Pm : paroi modifiée;

Ra : réserves amylacées; Rp : réserves protéiques; Zd : zone en dégénérescence.
PLANCHE VI
Caractéristiques cytologiques des cellules embryogènes et des proembryons
1. Cellule embryogène isolée (barre: 10 J.lm)

2. Cellules embryogènes et proembryons isolés par des parois pectocellulosiques modifiées
(barre : 10 J.lm)
3. Complexe proembryogène (barre: 30 J.lm)
e
4. Cals de type II après dégénérescence de certaines zones du cal (42 jour de culture)
(barre: 20 J.lm)
CE : cellule embryogène; CPE : complexe proembryogène; Fg : fragmentation du complexe en

plusieurs sous-unités proembryogènes; N : noyau; n : nucléole; PE : proembryon; Pm : paroi
modifiée; Ra : réserves amylacées; Rlp : réserves lipoprotéiques; Rp :réserves protéiques; Zd : zone
en dégénérescence.
forme de petits nodules méristématiques. Cependant, ces nodules ont tendance à dégénérer.
Cette structure donne un caractère hautement friable aux cals.
2.2- Cals sur milieu d'initiation de l'embryogenèse
2.2.1- ETUDE HISTOLOGIQUE AU MICROSCOPE OPTIQUE

Chez les lignées embryogènes de type l, le transfert des cals sur milieu enrichi en 2,4-D
entraîne une destructuration de la zone pseudocambiale (Planche V, photo 2) par modification
du plan des divisions cellulaires, en particulier, les divisions périclines disparaissent. Cette
destructuration conduit souvent à un aspect en « rubans» des cals qui ne laisse qu'une zone
périphérique active. Des éléments de type trachéide peuvent se différencier en nombre plus
important dans la zone centrale parenchymenteuse du cal.
Sur les deux types de cals étudiés, des cellules, présentant un plan d'organisation assez
différent des cellules méristématiques typiques, se forment entre le 8e et le 14e jour de culture
sur milieu d'initiation. Elles s'individualisent au sein de la zone pseudocambiale destructurée
chez les cals de type 1 (Planche V, photo 3), au sein des deux assises cellulaires
protodermiques ou des nodules méristématiques chez les cals de type Il (Planche V, photos 4
et 5). Quelle que soit la lignée considérée, ces cellules présentent un plan d'organisation
équivalent. Elles sont composées d'un noyau central possédant le plus souvent un nucléole
unique, d'un cytoplasme dense au sein duquel s'accumulent des réserves protéiques et
amylacées, souvent localisées autour du noyau (Planche VI, photos 1 et 2). Une modification
des parois pectocellulosiques, colorées en rose par le réactif de Schiff, apparaît sous forme
d'un épaississement plus ou moins régulier.
Ces cellules ont toutes les caractéristiques des cellules de type embryogène décrites
auparavant dans la littérature chez de nombreuses espèces (SCHWENDIMAN et al., 1990;
MICHAUX-FERRIERE et SCHWENDIMAN, 1992) et chez d'autres lignées de cals de cocotier
(VERDEIL et al., 1994). La présence de ces cellules embryogènes isolées par des parois
modifiées permet de qualifier l'origine de l'embryogenèse somatique d'unicellulaire.
Au cours de leur individualisation, les cellules embryogènes ne montrent pas de mitose
mais c'est pendant cette période qu'elles accumulent les réserves protéiques et amylacées. Au
voisinage du 28e jour de culture, ces cellules se segmentent et donnent des proembryons de 2
à 8 cellules (Planche VI, photo 2). Ces proembryons sont toujours isolés du reste du cal par
des parois pectocellulosiques qui ont un aspect épais. Entre les cellules proembryogènes, qui
résultent de la segmentation d'une unique cellule embryogène, les parois sont plus fines.
Au-delà du 28e jour, une dégénérescence d'une ou deux cellules peut être observée au
sein des proembryons. Elle est suivie de l'individualisation de nouvelles sous-unités par
épaississement des parois; ces sous-unités sont assimilables à des complexes proembryogènes
(Planche VI, photo 3).
68
PLANCHE VII
Caractéristiques ultrastructurales des cellules embryogènes
1. Noyau d'une cellule embryogène montrant des lobes nucléaires

2. Dépôt de matériel gélifié sur la paroi pectocellulosique
3. Modifications de la paroi pectocellulosique avec digestion partielle de la lamelle moyenne
lors de l'isolement de la cellule embryogène
4. Emission de micronucléoles au sein du noyau
5. Emission de micronucléoles vers la périphérie du noyau
A : amyloplaste; Fvg : fusion de vésicule golgiennes avec le plasmalemme; G : Appareil de Golgi;

Il: inclusion lipidique; Lm : lamelle moyenne; Ln : lobe nucléaire; Mn : membrane nucléaire; mn :
micronucléoles; N : noyau; n : nucléole; PI : plasmalemme; Pm : paroi modifiée; Vg vésicules
golgiennes.
Pour les cals de type l, la zone parenchymenteuse apparaît peu à peu dégénérée et/ou
vascularisée. Pour les cals de type II, l'initiation de l'embryogenèse s'accompagne d'une
dégénérescence de certaines parties des nodules méristématiques. Il n'est pas rare d'observer
un proembryon isolé au sein d'un nodule dont toutes les autres cellules ont dégénéré (Planche
VI, photo 4).
Quel que soit le type de cals, cellules embryogènes isolées et proembryons peuvent
coexister. A un temps donné, le degré d'orientation vers l'embryogenèse est très variable entre
les nodules.
2.2.2- ETUDE ULTRASTRUCTURALE

Une étude en microscopie électronique a permis de suivre les remaniements
ultrastructuraux qui conduisent à la formation des cellules embryogènes et des proembryons
lors de l'embryogenèse d'origine unicellulaire. Ils confirment les résultats obtenus lors d'une
étude précédente (VERDEIL, 1993).
Les études ont été réalisées en confrontant systématiquement l'échantillon à observer -
cals en condition d'initiation de l'embryogenèse - à un témoin donné - cals maintenus sur
milieu de multiplication. L'interprétation des remaniements de l'ultrastructure cellulaire est
faite par rapport à ce témoin. Cependant, elle se heurte à des difficultés majeures inhérentes
aux techniques de cytologie. Ces techniques impliquent le prélèvement et la fixation d'une
petite quantité de matériel. Il y a incompatibilité entre l'application des techniques
cytologiques et le suivi de l'échantillon et malgré la mise en place de témoins il y a toujours
une part d'incertitude dans l'interprétation. Face à ces difficultés, il était important de
posséder un matériel homogène telles que les lignées de cals étudiées dont on contrôle
l'initiation de l'embryogenèse.
A. Formation des cellules embryogènes :

La formation des cellules embryogènes à partir des cellules méristématiques est
caractérisée par les modifications ultrastructurales suivantes:
- au niveau du noyau, des digitations de l'enveloppe nucléaire conduisent à la
formation de lobes nucléaires entre lesquels s'engagent les organites (plastes,
mitochondries) (Planche VII, photo 1) ;
- les parois pectocellulosiques, ainsi que la lamelle moyenne sont le siège d'une
restructuration importante qui leur donne un aspect plus épais; cette modification est
observée parallèlement à une émission de vésicules de type sécrétoire vers le
plasmalemme (Planche VII, photo 2); la lamelle moyenne est partiellement digérée
lors de l'isolement de la cellule embryogène (Planche VII, photo 3) ;
-les communications cellulaires (plasmodesmes) se ferment;
69
PLANCHE VIII
Caractéristiques ultrastructurales des cellules embryogènes
1. Mitochondries
2. Réticulum endoplasmique granulaire
3. Polysomes et réserves lipoprotéiques
4. Amyloplastes autour du noyau
5. Inclusions denses aux électrons de nature lipidique (L) autour du noyau (N)
dans la cellule embryogène entouré par une paroi modifiée (Pm)
A : amyloplastes; Lm : lamelle moyenne; LP : réserves lipoprotéiques; m : mitochondries; N : noyau;

n : nucléole; P : plastes; Pm : paroi modifiée; PR : polysomes; REG : réticulum endoplasmique
granulaire.
•
CARACTERISA TlON MORPHOLOGIQUE ET STRUCTURALE
• le nucléole émet des micronucléoles pouvant migrer vers la périphérie du noyau

(Planche VII, photos 4 et 5) ;
• le nombre de mitochondries et de profils réticulaires devient plus important (Planche
VIII, photos 1 et 2) ;
.Ie nombre de ribosomes augmente (Planche VIII, photo 3) ;
• le nombre de plastes augmente, en particulier le nombre de plastes amylifères
(Planche VIII, photo 4) ;
• des réserves lipo-protéiques s'accumulent (Planche VIII, photo 5).
B. Formation et évolution des proembryons :

Au cours de leur formation à partir des cellules embryogènes, les proembryons sont
encore entourés d'une paroi pectocellulosique complexe sans plasmodesme. Au fur et à
mesure des segmentations, les cellules proembryonnaires acquièrent les caractères suivants:
• le contour de l'enveloppe nucléaire se régularise (Planche IX, photo 1) ;
• le nombre de mitochondries augmente et les crêtes mitochondriales apparaissent plus
développées (Planche IX, photo 2) ;
• l'amidon des plastes amylifères est en partie hydrolysé;
• les parois entre cellules proembryogènes ne subissent pas de remaniements
contrairement à la paroi qui entoure le proembryon (Planche IX, photo 3) ;
• des plasmodesmes, au niveau de ces parois internes, permettent les échanges entre
les cellules issues de la division d'une même cellule embryogène (Planche IX,
photo 3).
3- CONCLUSION
Cette étude a permis de mieux caractériser les deux lignées de cals en précisant leurs
différences structurales.
Les cals de type 1 sont constitués d'un ensemble de nodules qui possèdent une structure
en trois types tissulaires différents. La formation de ces tissus résulte du fonctionnement
hautement régulé d'une assise méristématique de type cambial. Des divisions anticlines et
périclines permettent la croissance du cal. Le fonctionnement de cette assise est centripète:
les cellules plus au centre des cals se différencient en cellules parenchymenteuses et/ou en
éléments de type trachéide et/ou en fibres de soutien (DUSSERT, 1991). Comme le souligne
VERDEIL (1993), cette assise présente des similitudes avec les méristèmes d'élargissement
secondaires qui assurent l'augmentation du diamètre caulinaire chez de nombreuses
Monocotylédones.
70
PLANCHE IX
Caractéristiques ultrastructurales des proembryons
1. Proembryons isolés par des parois externes modifiées

2. Mitochondries au sein de la cellule proembryogène
3. Etablissement de plasmodesmes au niveau des parois des cellules proembryogènes
m : mitochondrie; N : noyau; P : paroi; Pd : plasmodesme; Pm : paroi modifiée; V : vacuole.

En revanche, les cals de type II possèdent une structure constituée d'un seul tissu, siège
d'un plan de divisions essentiellement anticlines responsables du maintien et de la
prolifération du tissu de nature protodermique (VERDEIL, 1993).
Il faut insister sur le fait que ces lignées peuvent être considérées comme des clones de
cals dont on peut obtenir la multiplication sans changer la structure.
Cette étude a permis de caractériser les modifications structurales après le passage des
cals sur milieu d'initiation de l'embryogenèse.
Des modifications structurales différentes chez les deux types de lignée, traduisent la
mise en place des cellules embryogènes. Chez les cals de type l, la destructuration de la zone
pseudocambiale est nécessaire pour permettre l'orientation vers l'embryogenèse au sein de
cette zone essentiellement histogène. Selon certains auteurs (MAHESWARAN et WILLIAMS,
1985; DE JONG et al., 1993; Lo SCHIAVO, 1995), ce sont les auxines, tel que le 2,4-D, qui
pourraient être responsables des modifications du plan de divisions à l'origine de cette
destructuration. Cette destructuration conduit souvent à une friabilité plus importante des cals
(YOSHIDA et KOMAE, 1995). Chez les cals de type II, le plan de division n'est pas modifié,
seule une dégénérescence d'une partie du cal est observée.
Une fois le processus embryogène initié, celui-ci se déroule de façon équivalente quelle
que soit la lignée considérée.
L'initiation de l'embryogenèse s'accompagne de modifications au niveau des parois
pectocellulosiques et de la lamelle moyenne. Ces modifications et la disparition des
communications intercellulaires montrent que la fonnation des cellules embryogènes
s'accompagne d'un isolement physique par rapport au cal environnant. Cet isolement est une
caractéristique de l'embryogenèse dont l'origine est de type unicellulaire et se retrouve chez
de nombreuses espèces (WILLIAMS et MAHESWARAN, 1986; MICHAUX-FERRIERE et
SCHWENDIMAN, 1992; YEUNG, 1995). Il favoriserait la reprogrammation génétique conduisant
à l'embryogenèse. Cet isolement est à mettre en parallèle avec l'isolement du zygote, qui est
entouré par des parois modifiées; chez certaines espèces, celles-ci peuvent être caractérisées
par un dépôt de callose (MERKLE et al., 1995). Un tel dépôt a été observé autour de la cellule
embryogène somatique au moment de son isolement chez certaines espèces (DUBOIS et al.,
1990), et récemment chez le cocotier (VERDEIL, communication personnelle). Ces
caractéristiques pennettent de suggérer que l'initiation de l'embryogenèse somatique
d'origine unicellulaire est très proche, au cours des premiers stades, de l'embryogenèse
sexuée.
71
La fonnation des cellules embryogènes et des proembryons s'accompagne de

modifications intracellulaires au sein des cellules méristématiques. Ces modifications
pourraient dénoter une augmentation de l'activité métabolique et physiologique au sein des
cals:
(1) l'émission de micronucléoles est à mettre en relation avec l'augmentation du nombre de

ribosomes et témoigne d'une forte synthèse d'ARN (VERDEIL et BUFFARD-MoREL, 1995) ;
(2) les invaginations nucléaires au sein de la cellule embryogène pourraient favoriser les
échanges entre le noyau et le cytoplasme; il est intéressant de noter qu'elles rappellent
fortement celles observées lors de la maturation des cellules gamétiques femelles
(VERDEIL, 1993) ;
(3) l'augmentation du nompre de ribosomes pourrait correspondre à une activation de la
protéosynthèse (YEUNG, 1995) conduisant ensuite à l'accumulation de réserves de type
protéique; il est à noter que ce sont à plus proprement parler des réserves lipo-protéiques,
elles fonnent des dépôts plus ou moins denses qui montrent une forte affinité pour
l'osmium, ce qui laisse soupçonner leur nature lipidique, seules des études faisant par
exemple appel à une digestion enzymatique des protéines pourrait donner une indication
plus précise de la nature des dépôts observés ;
(4) l'accumulation de réserves amylacées pourrait témoigner de modifications importantes au
niveau du métabolisme carboné;
(5) l'augmentation du nombre de mitochondries et l'accroissement des crêtes mitochondriales
dénote une activation du métabolisme énergétique.
Ces modifications ont déjà été observées chez d'autres espèces et certaines études
suggèrent que toutes ces modifications pourraient être sous le contrôle direct du 2,4-D
(YEUNG, 1995). Pour YEUNG (1995), elles seraient essentielles pour exprimer le processus
embryogène.
Face à ces données expérimentales, nous avons examiné si l'initiation de

l'embryogenèse s'accompagne ou non de besoins nutritifs spécifiques.
72
ETUDE DES BESOINS NUTRITIFS
- C~IT:R.E II-
ETUDE DES BESOINS NUTRITIFS SPECIFIQUES
AU COURS DE L'INITIATION DE L'EMBRYOGENESE
INTRODUCTION
Cette étude a été réalisée dans le but de définir les besoins nutritifs et les changements
physiologiques qui pourraient accompagner l'initiation de l'embryogenèse après transfert sur
un milieu enrichi en 2,4-D.
En comparant des cals en condition de multiplication et en condition d'initiation de
l'embryogenèse, nous avons suivi la croissance des cals et détenniné leur teneur en eau; nous
avons étudié l'évolution des principaux paramètres et composés du milieu (pH, éléments
minéraux et sucre), et analysé la composition en sucres solubles, en acides aminés libres et en
protéines au sein des cals.
Deux lignées de cals ont été considérées : une lignée de cals de type 1 (L7) et une lignée
de cals de type II (L82).
Les deux lignées ont été maintenues dans les conditions standard de multiplication
suivantes:
l
• pour L7, la source carbonée est le saccharose: 30 g.r , et les concentrations en 2,4-D et en
l l
charbon actif sont: 60 mg.r de 2,4-D et 2 g.r de charbon;
l
• pour L82, la source carbonée est le glucose : 20 g.r , et les concentrations en 2,4-D et en
l l
charbon actif sont: 100 mg.r de 2,4-D et 3 g.r de charbon.
Le choix du sucre et sa concentration, ainsi que des concentrations en 2,4-D et en

charbon actif a été fait lors d'études précédentes, ils ont été définis afin de pennettre le
maintien des cals et une croissance optimale (VERDEIL, 1993). Ils ont dûs être adaptés
spécifiquement à chaque lignée de cals.
Les conditions favorables à l'initiation de l'embryogenèse sont:

l
• pour L7, augmentation de la concentration de 2,4-D : 110 mg.r ;
l
• pour L82, augmentation de la concentration de 2,4-D : 130 et 140 mg.r et doublement de
la concentration en macroéléments (respectivement milieux G130 et GI40). Ces deux
milieux sont usuellement utilisés pour initier l'embryogenèse chez les cals de la lignée
L82. L'étude histologique montre que l'initiation de l'embryogenèse se déroule de façon
équivalente sur les deux milieux. Cependant, nous avons décidé de les conserver lors de
73
notre étude, car nous souhaitions vérifier si des différences existaient au niveau nutritionnel
entre les deux milieux.
Les données acquises lors de nos études ont été analysées grâce à des méthodes
statistiques telles que l'analyse de variance et le test de comparaison de moyennes.
L'ensemble des données statistiques est présenté en annexe 9 et nous nous y reporterons
chaque fois qu'il sera nécessaire.
1- ETUDE DE LA CROISSANCE DES CALS
A chaque date de prélèvement, la croissance a été évaluée par le gain (ou la perte) de
matière sèche: différence entre le poids de matière sèche et le poids à la date initiale TO (soit
20 +/- 1 mg)..
1.1- Lignée L82 (<< type II »)

L'allure de la courbe d'évolution du gain de matière sèche apparaît équivalente sur tous
les milieux (Fig. 15).
La croissance est faible entre TO et T8. Entre T8 et T15, le gain de matière sèche
n'apparaît pas significatif (annexe 9 : tableau 1).
Entre Tl5 et T60, le gain de matière sèche augmente. Elle devient 2 fois moins
importante sur le milieu d'initiation contenant la concentration en 2,4-D la plus élevée G140
(gain de matière sèche: 20 mg).
1.2- Lignée L 7 (<< type 1 »)

L'allure de la courbe d'évolution du gain de matière sèche est équivalente sur les deux
milieux (Fig. 16).
Entre TO et T28, le gain de matière sèche augmente de façon importante pour atteindre
un gain de matière sèche d'environ 50 mg.
Entre T15 et T60, la croissance devient plus faible. A la fin du cycle de culture, le gain
de matière sèche est d'environ 60 mg.
1.3- Conclusion
Aux dates de prélèvement considérées, la croissance des cals ne ressemble pas aux
courbes de croissance théoriques en trois phases - phase de latence, phase exponentielle de
croissance, phase stationnaire - classiquement décrites (GEORGE et SHERRINGTON, 1984).
L82 montre une croissance en deux phases:
• la première phase, entre TO et T15, pendant laquelle la croissance est faible. Cette phase
pourrait correspondre à une phase de latence et d'adaptation aux conditions de culture;
74
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b
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15 30 45 60 0 15 30 45 60
TempsG) TempsG)
Figure 15 : Croissance en matière sèche Figure 16 : Croissance en matière sèche

des cals de la lignée L82 des cals de la lignée L7
• milieu de multiplication G100 • milieu de multiplication M60
• milieu d'initiation G 130 • milieu d'initiation MIlO
• milieu d'initiation G 140
Chaque point représente la moyenne de 3 mesures indépendantes. Les points suivis par la même lettre ne sont pas
significativement différents au seuil de 5% selon le test de Newman et Keuls.
-
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:l ~l GArn
c d -
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'-'
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œ
·C
œ -7
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45 60
> > 0 30
Tempsü) TempsG)
Figure 17 : Gain ou perte de teneur en eau Figure 18 : Gain ou perte de teneur en eau
des cals de la lignée L82 des cals de la lignée L7
• milieu de multiplication G100 • milieu de multiplication M60
• milieu d'initiation G 130 • milieu d'initiation MIlO
75
• la deuxième phase, entre T15 et T60, correspond à la phase de croissance proprement dite,
phase pendant laquelle des différences apparaissent entre condition de multiplication et
condition d'initiation de l'embryogenèse. La croissance est moins importante sur le niveau
l
d'auxine le plus élevé (140 mg.r ).
L7 montre également une croissance en deux phases:

• la première phase, entre TO et T15, qui pourrait correspondre à la phase de croissance
proprement dite ;
• la deuxième phase, entre T28 et T60, pendant laquelle l'infléchissement de la courbe de
croissance pourrait correspondre à une phase stationnaire. Elle est indépendante de la
l l
concentration en 2,4-D (60 mg.r sur milieu de multiplication et 110 mg.r sur milieu
d'initiation).
2- TENEUR EN EAU DES CALS
Nous avons considéré, à chaque date, le gain ou la perte en eau par rapport à la date
initiale TO, en effectuant la différence entre la teneur en eau à cette date et celle à TO.
L'évolution de la teneur en eau est équivalente chez les deux lignées de cals. Une
diminution significative est observée à T8 (Fig. 17 et 18). Ensuite, la teneur en eau augmente
jusqu'à T60. Aucune différence significative existe entre les milieux, comme le confirme
l'analyse de variance (annexe 9 : tableau 1 et 2).
CONCLUSION:
Quelle que soit la lignée, la diminution observée entre TO et T8 pourrait correspondre à
une adaptation à la nouvelle mise en culture. De plus, quelle que soit la concentration en 2,4-
D et en macroéléments, la teneur en eau des cals est équivalente.
3- ETUDE CINETIQUE DE L'EVOLUTION DES COMPOSES DU MILIEU
Pour chaque composé analysé (sucres, sels minéraux) et pour chaque milieu considéré,
la concentration moyenne du composé au sein des trois tubes de milieu prélevés à TO a tout
d'abord été déterminée. Aux dates de prélèvement suivantes, sur chaque milieu, nous avons
considéré la différence entre la concentration dans un tube de milieu et la moyenne à TO.
76
e
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-
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a
15 30 45 60 30 45 60
TempsG) TempsG)
Figure 19 : Absorption du glucose par les Figure 20 : Absorption du saccharose par

cals de la lignée L82 les cals de la lignée L7
• milieu de multiplication G 100 • milieu de multiplication
Â milieu d'initiation G 130 M60
• milieu d'initiation G140 • milieu d'initiation MIlO
77
Cette différence sera considérée comme étant l'absorption du composé par les cals,
même si l'absorption intracellulaire proprement dite des différents composés n'est pas vérifiée
dans notre étude. Sur chaque milieu, nous avons alors suivi, entre les dates de prélèvements,
les changements observés au niveau de l'absorption moyenne du composé (effectif: n=3).
Pour des raisons pratiques liées à la lourdeur des expérimentations, nous avons dû
limiter les dates de prélèvement. Nous avons considéré quatre étapes importantes de
l'initiation de l'embryogenèse :
• TO, qui correspond à la mise en culture sur milieu d'initiation;
• T15, qui correspond à la présence des premières cellules embryogènes observables après
une étude histologique;
• T28, qui correspond à la présence des premiers proembryons ;
• T60, qui correspond à la date où les premières structures embryogènes sont
macroscopiquement visibles. Cette date correspond également à la fin d'un cycle de
culture.
3.1- Etude cinétique de l'absorption en sucre exogène
3.1.1- LIGNEEL82 (<< TYPE II »)

L'absorption en glucose exogène n'est pas régulière au cours du temps (Fig. 19).
Entre TO et T15, elle apparaît faible (inférieure à 5 mg.r l ). Il n'y a pas de différence
entre les milieux.
Entre T15 et T60, elle devient significative et augmente régulièrement. Elle est plus
élevée sur les milieux d'initiation. De plus, elle dépend de la concentration en 2,4-D : à T28,
elle est plus élevée sur le milieu comprenant la plus forte concentration en auxine (G140 : 10
l l
mg.r ) que sur l'autre milieu (G 130 : 7 mg.r ); à T60, elle devient au contraire plus élevée sur
l
le deuxième milieu G130 (G130 : 20 mg.r ; G140 : 15 mg.r\
3.1.2- LIGNEE L7 (<< TYPE 1 »)

L'absorption en saccharose exogène apparaît régulière au cours du temps (Fig. 20).
Entre TO et T15, elle n'est pas significativement différente entre les deux milieux
(environ 10 mg.r\
Entre T15 et T60, elle devient plus importante sur milieu de multiplication (30 mg.r l )
l
que sur milieu d'initiation (25 mg.r ).
78
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15 30 45 60
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a
-20 +-----1-------+----+-------1
o 15 30 45 60
Tempsü)
Figure 21 : Absorption du chlore (a), du nitrate (b), du phosphate (c) et du sulfate (d) par les
cals de la lignée L82
• milieu de multiplication G100
Â milieu d'initiation G 130
79
3.2- Etude cinétique de l'absorption des principaux éléments minéraux
3.2.1- LIGNEE L82 (<< TYPE II »)

L'absorption du chlore à chaque date de prélèvement ne dépasse pas 2 mg.r l par rapport
à la date initiale TO : l'absorption de cet anion apparaît négligeable (Fig. 21 a), quel que soit le
milieu considéré. L'analyse de variance ne montre pas de différence significative entre les
date de prélèvement et entre les milieux (annexe 9: tableau 1).
Des résultats équivalents sont observés pour l'absorption de l'ammonium, du calcium,
du magnésium et du potassium et leur évolution n'a pas été représentée.
Le niveau d'absorption du nitrate est plus important que celui du phosphate mais l'allure
des courbes d'absorption montrent une évolution très voisine (Fig. 21 b et c). L'absorption de
ces deux anions n'est pas régulière au cours du temps:
• entre TO et T15, elle apparaît négligeable;
• entre T15 et T60, une absorption significative est observée sur tous les milieux et elle est
l
plus importante sur les milieux d'initiation (1100 mg.r pour le nitrate et 150 mg.r l pour le
l
phosphate à T60) que sur milieu de multiplication (environ 300 mg.r pour le nitrate et
50 mg.r l pour le phosphate à T60).
Pour le sulfate, l'allure de la courbe d'absorption est équivalente entre les milieux
(Fig. 21 d). Entre TO et T15, l'absorption est faible (inférieur à 10 mg.r l ). Entre T15 et T60,
elle devient plus importante et elle est deux fois plus élevée sur milieu de multiplication (40
mg.r l à T60).
3.2.2- LIGNEE L7 (<< TYPE 1 »)

Les teneurs en calcium, magnésium et potassium montrent la même évolution que pour
L82, avec un niveau d'absorption qui apparaît négligeable, aussi, leur évolution n'a pas été
représentée.
L'absorption de l'ammonium est régulière au cours du temps sur les deux milieux
(Fig. 22 a). Entre TO et T15, elle augmente sans différence entre les milieux (100 mg.r l ). En
revanche, entre T15 et T60, elle devient environ deux fois plus élevée sur milieu de
l
multiplication (200 mg.r à T60) que sur milieu d'initiation.
L'absorption du chlore ne montre pas la même évolution entre les milieux (Fig. 22 b) :
• sur milieu de multiplication, les valeurs négatives observées pourraient témoigner d'un
relargage de l'ion chlorure par les cals;
• sur milieu d'initiation, l'absorption du chlore augmente significativement sur milieu
l
d'initiation à T15 (35 mg.r ) puis diminue jusqu'à T28. Elle devient alors négligeable.
80
Les mveaux d'absorption du nitrate, du phosphate et du sulfate sont différents,

cependant l'allure des courbes d'absorption montre une évolution équivalente (Fig. 22 c, d, e).
Entre TO et T15, l'absorption des trois anions augmente sur les deux milieux; cependant,
elle est plus élevée sur milieu d'initiation (500 mg.I" pour le nitrate, 120 mg.l" pour le
phosphate, 50 mg.I" pour le sulfate) que sur milieu de' multiplication (100 mg.l" pour le
nitrate, 40 mg.I" pour le phosphate, 20 mg.l" pour le sulfate).
A T28, l'absorption des 3 anions diminue. L'absorption du nitrate et du sulfate devient
équivalente entre les deux milieux (respectivement 400 et 60 mg.I"), L'absorption du
phosphate devient plus importante sur milieu de multiplication (180 mg.I") que sur milieu
I
d'initiation (120 mg.r ) (Fig. 22 d).
3.3- Evolution du pH des milieux

Le pH montre une évolution équivalente entre les deux lignées de cals (Fig. 23 et 24).
A TO, le pH est de 5.5 alors qu'il est ajusté à 5 avant l'ajout de l'agar, du charbon actif
et avant l'autoclavage.
Sur tous les milieux, il diminue au cours du temps. Cependant, il devient plus acide sur
les milieux d'initiation à partir de T28.
3.4- Corrélations entre l'évolution des paramètres du milieu

L'absorption de certains composés montrent une évolution équivalente au cours du
temps. C'est le cas du nitrate et phosphate chez L82 (Fig; 21 b et c) ou du chlore, nitrate,
phosphate et sulfate chez L7 (Fig. 22 c, d, e). La nutrition des cals in vitro, comme chez la
plante entière, correspond à un processus d'échanges de composés entre le milieu et le tissu en
culture (RICHTER, 1993). Ces échanges sont dépendants du pH extra ou intracellulaire.
Afin de compléter notre étude, nous avons étudié le degré de corrélation qui peut exister
entre l'évolution des différents composés du milieu. Il nous a également paru intéressant de
rechercher le degré de corrélation entre l'évolution du pH et l'évolution des différents
composés.
Une analyse qui permet de rechercher ce type de corrélations est l'analyse de
covariance. Elle permet de déterminer le degré des relations qui existent dans l'évolution des
variables deux à deux. Si la relation entre les variables est significative, cela peut vouloir dire
que l'évolution de la teneur d'un composé peut dépendre de l'évolution d'un autre composé.
Afin de déterminer des différences éventuelles entre les milieux, cette analyse a été réalisée
sur chaque milieu. Lorsqu'une relation significative a été mise en évidence, le carré du
coefficient de corrélation R2 a été déterminé: il traduit l'importance de la relation entre les
variables.
81
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0 15 30 45 60
Temps (j)
Figure 22 : Absorption de l'ammonium (a), du chlore (b), du nitrate (c), du phosphate (d) et du
sulfate (e) par les cals de la lignée L7
• milieu de multiplication M6ü
• milieu d'initiation MIlO
82
6-,---------------------, 6,------------------.,
b b
4 a 5 b
a
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Cl. =
Cl.
b
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0+----+---1----+------1 3+----+-----+---+------1
o 15 30 45 60 o 15 30 45 60
Temps (j) Temps (j)
Figure 23 : Evolution du pH dans les

milieux de la lignée L82 Figure 24 : Evolution du pH dans les milieux
de la lignée L7
• milieu de multiplication M60
• milieu d'initiation G130
• milieu d'initiation G140
83
Enfin, si une corrélation mise en évidence est significative, nous avons vérifié si elle
différait entre les milieux. Une corrélation significative peut être représentée,
mathématiquement, par une droite de régression autour de laquelle se distribuent les données
de deux variables analysées, ceci sur chaque milieu. Un test, dit de parallélisme, est effectué
afin de comparer les deux droites; si la nature de la relation ne change pas entre les milieux,
les pentes des deux droites de régression sont parallèles. Le test de parallèlisme est non
significatif.
Nous ne présentons que les corrélations qui apparaissent les plus significatives (tableau
9). L'ensemble des analyses statistiques sont présentées en annexe (annexe 9 : tableaux 3 et
4).
Les taux d'absorption des trois anions nitrate, phosphate et sulfate sont très corrélés
entre eux (R2>94%)
L'évolution du pH est fortement corrélée à l'évolution des teneurs des quatre ions:
ammonium (L7), nitrate, phosphate et sulfate (environ 70%) et de la teneur du sucre du
milieu: glucose (77%) chez L82 et saccharose (92%) chez L7.
Les corrélations mises en évidence dans l'évolution des paramètres analysés ne sont pas
différentes entre les milieux.
3.5- Discussion
A. Besoins nutritifs pour la croissance des cals en condition de multiplication

Pour la lignée L82, l'analyse de l'absorption des composés du milieu confinne
l'existence des deux phases d'évolution des cals mises en évidence par le suivi de la
croissance. Pendant la phase de latence (TO-TI5), l'absorption des composés des milieux est
négligeable. Les cals pourraient utiliser des réserves nutritives endogènes peut-être établies à
la fin du cycle de culture précédent. Pendant la phase de croissance (TI5-T60), l'absorption en
composés exogènes pourrait correspondre à un besoin de renouvellement de la source
nutritive (RICHTER, 1993).
Pour la lignée L7, l'absorption en composés exogènes est régulière pendant les deux
phases de croissance.
Malgré leur différence fondamentale dans leur structure et malgré une composition des
milieux différente, en particulier au niveau de la nature de la source carbonée, les deux lignées
de cals apparaissent proches dans leurs besoins en composés azotés et minéraux. Les besoins
nutritifs les plus importants sont les besoins en composés carbonés et azotés.
84
TABLEAU 9 : Degré de corrélation dans l'évolution des teneurs en composés du milieu et du pH
Le carré du coefficient de corrélation R est présenté·
Groupes de Variable dépendante Variable R2

relations Independante
L82 pH Na.+ NS
pH NO)- 69%
pH H2P042- 61%
pH SO/ 62%
pH Glucose 77%
Na.+ NO)- NS
Na.+ H2P042- NS
NO)- H2P042- 94%
L7 pH Na.+ 75%
pH NO)- 67%
pH H2P042- 67%
pH S042- 82%
pH Saccharose 92%
Na.+ NO)- 78%
Na.+ H2P042- 86%
NO)- H2P042- 96%
• Analyse réalisée par une analyse de covariance entre une des variables mesurées et une variable indépendante (ou
covariante), entre les milieux, une détermination du coefficient de corrélation et un test de parallélisme entre les milieux
permet de déterminer si le degré de la corrélation mise en évidence est le même pour chaque milieu (Cf. annexe).
85
Ce résultat confinne celui obtenu lors d'une étude précédente portant sur la
détennination des besoins nutritifs de cals de cocotier en condition de multiplication mais
réalisée à partir de lignées différentes de celles utilisées ici (VERDEIL, 1993; DUSSERT, 1991).
Comme le suggérait cette étude, les composés azotés, carbonés et minéraux absorbés
auraient essentiellement pour rôle de maintenir le pool métabolique et énergétique au sein des
cals et d'assurer la réalisation des divisions cellulaires, d'où la forte corrélation mise en
évidence dans l'évolution de ces composés (tableau 9).
Le potassium et le chlore sont absorbés en quantité négligeable pour les deux lignées.
Pour L7, le chlore pourrait même être désorbé. De façon générale, ces deux ions sont
impliqués dans le maintien de la pression osmotique et l'équilibre des charges ioniques. Chez
de nombreuses espèces (GEORGE et SHERRINGTON, 1984), le chlore est généralement
nécessaire en très faible quantité, ce qui est à mettre en relation avec le taux d'absorption
négligeable de cet ion, mis en évidence par notre étude. Contrairement à ce qui est observé
dans la plante entière qui nécessite des quantités non négligeables de potassium (RICHTER,
1993), cet ion n'a pas d'influence sur la croissance des cals chez différentes espèces telles que
Daucus carota, Ipomea ou Tagetes et son absorption apparaît négligeable (VELIKY et ROSE,
1973; KETEL, 1986), ce qui rejoint nos observations.
Le calcium et le magnésium ne semblent pas absorbés par les cals des deux lignées
étudiées, contrairement à ce qui était observé chez les autres lignées de cals. Ces deux cations
jouent un rôle dans la protection des membranes et des parois cellulaires (RICHTER, 1993;
GEORGE et SHERRINGTON, 1984). L'absorption négligeable de ces deux ions pourrait être ici
tout simplement liée à l'existence d'un « pool)} endogène suffisant.
Quelle que soit la lignée, de fortes corrélations existent dans l'évolution des différents
composés et celle du pH.
2
Les évolutions du nitrate et du phosphate montrent une forte corrélation (R > 95%).
2
Elles sont aussi fortement corrélées au pH (R >60%). Il est maintenant admis qu'un pH trop
alcalin inhibe leur absorption (GEORGE et SHERRINGTON, 1984). L'absorption de ces deux
éléments n'est effective qu'au voisinage du ISe jour de culture quand le pH atteint un niveau
suffisamment acide: il est de 5 à T15. La corrélation mise en évidence entre le nitrate et le
phosphate pourrait correspondre au fait que l'absorption de ces deux composés est
conditionnée par le niveau de pH.
On a remarqué également que pour la lignée L7, l'absorption en ammonium est corrélée
à l'évolution du pH. Chez d'autres lignées de cals de cocotier, DUSSERT (1991) suggère que la
baisse de pH dans les 15 premiers jours pourrait être due à l'absorption d'ammonium car il a
été montré que celle-ci acidifie le milieu. Elle pourrait ainsi favoriser l'absorption du nitrate
après le ISe jour de culture (DusSERT, 1991). Ceci est plausible dans le cas de la lignée L7
mais pas dans le cas de la lignée L82 pour laquelle l'absorption en ammonium apparaît
86
négligeable. On peut alors se demander si les différences observées entre les lignées
pourraient dépendre de l'activité de la nitrate réductase, qui régit l'assimilation du nitrate, et il
serait intéressant de comparer son activité entre les différentes lignées de cals.
B. Absorption des composés du milieu en condition d'initiation de l'embryogenèse

Sur milieu d'initiation, une absorption plus importante de certains composés carbonés,
azotés et minéraux a été déterminée, essentiellement entre le 15e jour et le 28e jour de culture.
Quel est le bilan nutritif en condition d'initiation de l'embryogenèse?
o Absorption du sucre :
L82 montre une absorption plus importante du glucose au 28e jour de culture (Fig. 19),
ce résultat est en accord avec ceux obtenus sur d'autres lignées (Dus SERT, 1991) qui
montraient, de leur côté, une absorption plus importante du saccharose à la même période. Il
est intéressant de montrer que des différences existent entre les deux milieux d'initiation:
l'absorption du glucose est plus précoce sur le milieu contenant la plus forte concentration en
2,4-D (140 mg.r l ) (T28) que sur l'autre milieu (130 mg.r l ) (T60).
L7 montre au contraire une absorption du saccharose plus importante en condition de
multiplication (Fig. 20).
o Absorption des éléments minéraux :

Les deux lignées de cals montrent une absorption plus importante du nitrate et du
phosphate (Fig. 21 et 22 c et d) dont l'évolution est fortement corrélée (R2>95%). Elle est
équivalente pour les deux lignées. Elle montre seulement un décalage dans le temps: au 15e
jour de culture chez L7 et au 28e jour chez L82.
L7 montre une absorption plus importante en chlore et en sulfate au 15e jour de culture.
o pH:
Le pH des milieux d'initiation est significativement plus acide à partir du 15e jour de
culture.
Les différences observées entre les lignées peuvent être dues à de nombreux facteurs:
concentration différente en 2,4-D, en macroéléments ou bien encore la nature du sucre.
Quelle que soit la lignée considérée, l'absorption plus importante en composés des
milieux est observée essentiellement à partir du 15e jour de culture au moment de la formation
des cellules embryogènes.
Afin de compléter cette étude, nous nous sommes intéressée à la composition en
composés carbonés et azotés solubles au sein des cals: sucres, acides aminés et protéines.
87
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Figure 25: Evolution des teneurs en sucres solubles - glucose (a), fructose (b) et saccharose (c)
- au sein des cals de la lignée L82, en pourcentage du poids de matière sèche.
Â milieu d'initiation G 130
BB
ETUDE DES BESOINS NUTRfTfFS
4- ETUDE DE LA COMPOSITION EN SUCRES SOLUBLES, EN ACIDES AMINES

LIBRES ET EN PROTEINES SOLUBLES DES CALS
4.1- Etude cinétique de la teneur en sucres solubles
La technique utilisée pour l'analyse de la composition en sucres (chromatographie

ionique couplée à l' ampérométrie pulsée) permet de détecter les mono et disaccharides et les
polyols solubles tels que : glucose, fructose, saccharose, xylose, raffinose, galactose,
mannose. Le seuil de détection se situe autour de quelques dizaines de pico-moles injectées.
Nous avons pu détecter trois sucres au-dessus de ce seuil: glucose, fructose et saccharose.

Les teneurs en glucose et fructose montrent une évolution équivalente entre les milieux
et au cours du temps (Fig. 25 a et b). Cependant, les changements observés au cours du temps
ne sont pas significatifs selon l'analyse de variance et le test de Newman et Keuls (Annexe 9 :
tableau 1) et les teneurs des deux sucres seront donc considérées comme stables.
La teneur en saccharose la plus élevée est observée à TO (160,1 mg.g- l de matière
sèche). Ensuite, elle présente une évolution différente entre les milieux (Fig. 25 c) :
ol
• sur milieu de multiplication, elle augmente significativement entre T15 (40 mg.g de
ol
matière sèche) et T28 (140 mg.g de matière sèche) puis diminue ensuite jusqu'à T60 (60
ol
mg.g de matière sèche) ;
ol
• sur les deux milieux d'initiation, elle diminue régulièrement au cours du temps (60 mg.g
de matière sèche à T60). Entre TO et T15, plus la concentration en 2,4-D exogène est
élevée, plus la teneur en saccharose est importante. Entre T15 et T60, elle est au contraire
d'autant plus faible que la concentration en 2,4-D est élevée.
4.1.2- LIGNEEL7 (<< TYPEI »)

Les teneurs en glucose et fructose restent stables au cours du temps et aucune différence
n'est observée entre les milieux (20 mg.g- l de matière sèche) (Fig. 26 a et b).
La teneur en saccharose montre la même évolution sur les deux milieux : elle augmente
ol ol
entre TO et T28 (60 mg.g de matière sèche) pour diminuer ensuite jusqu'à T60 (40 mg.g de
matière sèche) (Fig. 26 c).
4.1.3- CONCLUSION
A. Evolutions des teneurs en sucres solubles en condition de multiplication:

Quelle que soit la lignée étudiée, les teneurs en glucose et fructose montrent peu, ou pas,
de différences au cours du temps.
89
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0 15 30
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45 60
Figure 26 : Evolution des teneurs en sucres solubles - glucose (a), fructose (b) et saccharose (c)
- au sein des cals de la lignée L7, en pourcentage du poids de matière sèche.
90
Ces résultats pourraient correspondre en partie au fait que ces deux sucres sont en
équilibre constant entre la synthèse et la dégradation du saccharose selon les besoins
métaboliques des cals (WENDLER et al., 1990; SINGH et al., 1991; RICHTER, 1993; WANG et
al., 1993; BARNES et al., 1994).
En condition de multiplication, la teneur en saccharose augmente entre T15 et T28. Elle

est à mettre en parallèle avec l'absorption en sucre des milieux. Comme le suggèrent VERDEIL
(1993) et DUSSERT (1991), l'augmentation de la concentration intracellulaire en composés
métaboliques et énergétiques, observée entre le 15e et le 28e jour de culture chez les deux
lignées, pourrait participer à l'entrée des cellules en mitose pendant la phase de croissance des
cals.
En condition d'initiation de l'embryogenèse chez la lignée de cals de type II L82, des

changements significatifs, dépendant de la concentration en 2,4-D exogène, sont observés. La
teneur en saccharose diminue régulièrement au cours du temps. Entre TO et T15, elle est plus
importante que pour des cals en multiplication. Entre T15 et T60 elle devient moins
importante. Des différences existent au sein des cals maintenus sur les deux milieux
d'initiation: entre TO et T15, plus la concentration en 2,4-D est élevée, plus la concentration
en saccharose est élevée; cette relation s'inverse entre T15 et T60.
Tous ces changements sont à mettre en parallèle avec l'absorption en glucose plus
importante sur milieu d'initiation, avec l'accumulation des réserves protéiques et amylacées et
avec les modifications observées au niveau des parois pectocellulosiques et de la lamelle
moyenne qui accompagnent l'isolement physique des cellules embryogènes.
Chez L7, aucun changement n'est observé entre condition de multiplication et condition
d'initiation de l'embryogenèse.
4.2- Etude cinétique de la teneur en acides aminés
4.2.1- ANALYSE DES DONNEES

Dans un premier temps, nous avons analysé les résultats des dosages d'acides aminés
par une analyse de variance et une comparaison de moyennes. Cependant, il est apparu que les
données montraient une très forte hétérogénéité pour les trois répétitions représentant chaque
niveau de traitement « milieu x date». Nous avons donc augmenté le nombre de dates de
prélèvement par rapport à ceux étudiés dans le paragraphe précédent.
Nous avons vérifié que l'hétérogénéité observée n'était pas due à la méthode de dosage.
91
Le dosage d'extraits non dérivés a permis de vérifier l'absence d'interférence de

composés éventuels, détectables à 354 nm., présents au sein des cals ou même dans le tampon
d'extraction, et qui seraient dosés aux mêmes temps de rétention que certains acides aminés.
L'utilisation d'un système d'injection automatique limite les sources d'erreur liées à
l'injection car il permet un contrôle strict du volume injecté.
Les échantillons à doser sont placés dans un distributeur automatique réfrigéré; ce qui
limite le développement de bactéries dans la solution d'acides aminés et minimise les risques
de dégradation de ces molécules (MOULINEAU, 1994).
Ces différents contrôles nous ont permis de vérifier que cette hétérogénéité n'était pas
due à la méthode de dosage. Le même type d'hétérogénéité a été observé avec d'autres
échantillons de cals. Nous avons conclu qu'elle pourrait correspondre à une variabilité
physiologique entre les cals.
La figure 27 présente à titre d'exemple l'évolution au cours du temps et sur chaque

milieu, de la teneur moyenne en sérine et en proline, deux des acides aminés détectés au sein
des cals de la lignée L82.
Pour la sérine, la figure 27 montre que la teneur de cet acide aminé évolue différemment
entre les milieux à chaque date de prélèvement, cependant, par l'analyse de variance des
données, on conclut que seule l'évolution au cours du temps est significative et qu'aucune
différence existe entre les milieux. En statistique, on conclut donc que seul le « facteur date
de prélèvement est significatif».
Pour la valine, la figure montre moins de différence entre les milieux, excepté à T28,
cependant, par l'analyse de variance, on conclut que des différences significatives importantes
existent entre les milieux et en fonction du temps. En statistique, on conclut que le «facteur
interaction « milieu x date» est significatif ».
Le coefficient de variation (écart-type divisé par la moyenne générale) est un paramètre
qui permet, en statistiques, de déterminer le degré d'homogénéité au sein des données. Pour la
sérine et la proline, il est respectivement de 76,1% et 16,6%. Il est particulièrement élevé pour
la sérine. Ils montrent donc une forte hétérogénéité au sein des données en acides aminés.
La figure 28 représente l'évolution de la teneur en sérine et en proline en fonction du

temps et sur chaque milieu en tenant compte des trois répétitions ou cals à chaque niveau de
traitement. L'hétérogénéité observée est en fait due à l'existence de valeurs « aberrantes ».
92
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Figure 27: Evolution de la teneur en sérine (a) et en proline (b) en mg par g de matière sèche
des cals de la lignée L82.
• : milieu de multiplication G100
• : milieu d'initiation G 130
• : milieu d'initiation G 140.
Chaque point représente la moyenne de trois mesures indépendantes.
93
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Temps (j)
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o 8 15 28 42 60
Temps (j)
Figure 28 : Evolution de la teneur en sérine (a) et en proline (b) en mg par g de matière sèche
des cals de la lignée L82, en tenant compte des trois répétitions à chaque date de
prélèvement et sur chaque milieu.
• : milieu de multiplication G 100
Â : milieu d'initiation G 130
• : milieu d'initiation G 140
94
Selon l'acide aminé, ces valeurs ne sont pas forcément observées pour un même cal:
par exemple à T8, la variabilité observée dans les teneurs en sérine pour des cals placés sur
milieu de multiplication est due à une teneur très élevée au sein d'un cal, environ 0.55, alors
que les deux autres cals montre une teneur voisine de 0.2 mg par gramme de matière sèche,
teneur observée pour des cals placés sur les deux autres milieux; en revanche à cette date la
teneur en proline montre une forte homogénéité au sein des données. L'hétérogénéité
observée ne provient pas des mêmes individus.
Ces résultats existent pour l'ensemble des acides aminés analysés, quelle que soit la
lignée de cals considérée.
Suivre l'évolution de la teneur moyenne de chaque acide aminé en fonction du temps et

sur chaque milieu n'a aucune signification biologique car on prend alors en compte des
valeurs très hétérogènes et « aberrantes »; l'analyse de variance peut amener à des conclusions
erronées.
Nous avons alors choisi une autre méthode statistique qui permettait de classer les cals
selon leur composition en acides aminés quels que soient le milieu et la date de prélèvement.
Nous considérons alors l'ensemble des acides aminés, non pas la moyenne à chaque
traitement des teneurs de chaque acide aminé pris indépendamment.
Les méthodes de classification ont pour but de classer les individus en nombre restreint
de groupes homogènes. Ici, chaque cal est considéré comme un individu indépendant et
l'ensemble des cals a été réparti en groupes différents selon le degré de ressemblance (ou
dissemblance) dans la composition en acides aminés. La méthode choisie est la classification
ascendante hiérarchique.
La classification ascendante hiérarchique, ou CAH, implique que chaque groupe est
inclus dans un groupe de la partition suivante. La suite des partitions obtenues est représentée
par un arbre ou dendrogramme. Les groupes formés sont plus ou moins différents les uns des
autres dans leur composition en acides aminés. L'importance de cette différence est
représentée en statistiques par une distance. La méthode de Ward utilise la distance dite
euclidienne. Sur l'arbre, cette distance est représentée par la profondeur des branches de
l'arbre entre chaque niveau de jonction. Globalement, on obtient un nombre restreint de
groupes. La CAH donne la moyenne des teneurs de chaque acide aminé au sein de chaque
groupe.
Cependant, il convient de s'assurer que les groupes formés ont réellement une
signification. Pour cela, on réalise, dans un premier temps, une analyse discriminante qui a
pour principe d'estimer le taux de mauvais classement. A chaque analyse, les groupes sont
comparés deux à deux. De plus, ils sont constitués en utilisant plusieurs éléments, ici un
ensemble d'acides aminés.
95
011
lI/2
lII3
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GROUPE 1
lI/2
lII3 Individu aberrant
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.1/1
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4ZI3
4ZI2
2813
If
42It
42It
28It
fiS
2812 GROUPE V
2812
2813
8012
4ZI3
8013
8012
8013
Fig. 29 : Dendrogramme représentant la classification des cals de la lignée L82 selon leur
composition en acides aminés (1) (Analyse réalisée par une classification ascendante
hiérarchique sur les 54 individus de l'expérience)
- Groupe 1 : TO
- Groupe II : T8 et Tl5 sur les deux milieux d'initiation
- Groupe III : T8 et Tl5 sur le milieu de multiplication
- Groupe IV : T28, T42, T60 sur les trois milieux
- Groupe V: T28, T42, T60 sur les deux milieux d'initiation
- Individu aberrant: variabilité non déterminée.
* 60/2 : individu mal classé dans le groupe IV mais bien classé dans le groupe V
-E--7
~
représente la distance (euclidienne) qui sépare les cals ou les groupes de cals
et indique le degré de resssemblance ou de disssemblance entre les cals dans la
composition en acides aminés
-E--7
(1) Acides aminés détectés: alanine, leucine, proline, sérine, thréonine, valine.
La composition moyenne en acides aminés dans chaque groupe est donnée dans le tableau 10
Les cals sont notés selon les dates de prélèvement et le milieu:

0, 8, 15,28,42, ou 60/ 1,2 ou 3
0, 8, 15,28,42 et 60 sont les 6 dates de prélèvement
1,2,3 sont les milieux: l, milieu de multiplication; 2 et 3, milieux d'initiation
ex: 0/1 date de prélèvement TO et milieu de multiplication noté 1
L'analyse discriminante permet de déterminer combien d'acides aminés suffisent à

différentier les groupes. Ces acides aminés sont alors les éléments qui permettent le mieux de
décrire l'hétérogénéité entre les deux groupes considérés.
Dans un deuxième temps, après avoir déterminé des groupes significativement
différents, une analyse de variance permet de déterminer si les teneurs de chaque acide aminé
sont significativement différentes entre les groupes. Comme pour l'analyse discriminante, les
groupes sont comparés deux à deux.
Nous avons alors réalisé ces analyses sur la composition en acides aminés des lignées
L82 et L7.
A. Caractérisation de différents groupes de cals

Six acides aminés ont été détectés: alanine, leucine, proline, sérine, thréonine, et valine.
Les cals ont pu être classés en cinq groupes selon leur niveau en acides aminés, comme le
montre la figure 29 (représentant le dendrogramme donné par la classification ascendante
hiérarchique) et le tableau 10 (donnant la teneur moyenne de chaque acide aminé au sein des
groupes) :
• le groupe 1comprenant les cals prélevés à TO ;
• le groupe II comprenant les cals prélevés à T8 et T15 sur les deux milieux d'initiation de
l'embryogenèse somatique;
• le groupe III comprenant les cals prélevés à T8 et T15 sur milieu de multiplication;
• le groupe IV comprenant les cals prélevés à T28, T42, et T60 sur tous les milieux ;
• le groupe V comprenant les cals prélevés à T28, T42, et T60 sur les milieux d'initiation.
B. Description des différents groupes de cals

Les groupes ont été comparés deux à deux par une analyse discriminante, cependant
nous ne présentons que les résultats qui permettent de rendre compte des différences
observées.
Les groupes II et III correspondent aux cals prélevés entre TO et T15, mais appartiennent
aux différents types de milieu: milieux d'initiation YS milieu de multiplication. Le contenu en
acides aminés endogènes ne révèle pas de différence entre les deux milieux d'initiation. Les
cals des deux groupes sont classés sans risque d'erreur (100% d'individus bien classés)
d'après leur contenu en acides aminés (tableau Il).
97
TABLEAU 10 : Moyenne des teneurs en acides aminés pour les cinq groupes de la
classification hiérarchique chez la lignée L82
Les résultats sont exprimés en mg par gramme de matière sèche
Acides aminés groupe 1 groupe II groupe III groupe IV groupe V

alanine 5,960 3,400 2,590 1,840 3,320
leucine 1,420 2,190 1,520 2,810 4,290
proline 2,570 1,030 1,510 1,520 2,210
sérine 5,450 10,880 25,860 3,880 6,320
thréonine 83,570 33,320 20,010 18,840 23,040
valine 7,990 1,630 II,510 7,050 10,860
9 13 5 16 10
(1) n : nombre d'individus par groupe, L'analyse comprend 54 individus, Le 54e, individu aberrant n'a pas été
pris en compte. Les résultats sont exprimés en mg par gramme de matière sèche.
TABLEAU 11 : Analyse discriminante des groupes 2 à 2 chez la lignée L82

Groupes II III IV V II V
% bien classés 100% 96,3% (1) 100%
Acide aminé (2) val pro val
Moyenne (3) 1,630 11,510 1,520 2,210 1,630 10,860
M'In. (4) 0,220 9,070 1,120 1,500 0,220 8,920
Max. (4) 2,630 13,110 1,860 2,760 2,630 12,950
(1) un individu est mal classé dans le groupe IV mais bien classé dans le groupe V
(premier individu 60/2 du dendrogramme de la figure 1)
=
(2) Acide aminé permettant une distinction entre les cals: Pro proline, Val valine =
(3) Moyenne des teneurs en acides aminés entre les groupes (Cf, tableau 1)
(4) Valeurs minimale (min,) and maximale (max,) pour la proline ou la valine au sein des groupes
TABLEAU 12 : Analyse de variance sur les teneurs en acides aminés en fonction des
groupes pris deux à deux chez la lignée L82
Groupes II etIII (1) IV et V(I) II et V (1)
alanine 36,0 NS 49,95 *** 0,000 NS

leucine ~ 3,54 NS 27,73 *** ~ 100,33 ***
proline ~ 24,57 ** 79,40 *** ~ 222,44 ***
sérine j Il,54 ** 2,14 NS ~ 2,64 NS
thréonine j 3,11 NS 2,09 NS ! 3,25 NS
valine ~255,37 *** 22,48 ** ~ 471,27 ***
=
(1) Test Fisher-Snedecor; niveau de signification: NS non significatif; * =significatif (5%); ** =hautement
=
significatif( 1%); *** très hautement significatif (1 %0)
Trois acides aminés ont une teneur significativement plus faible au sein du groupe II
(tableaux Il et 12) :
• la valine, 10 fois plus faible;
• la proline, 1,5 fois plus faible;
• la sérine, 2 fois plus faible.
L'analyse discriminante montre que la valine permet à elle seule de différentier les
groupes (tableau 11).
Les groupes IV et V correspondent à des cals prélevés entre T28 et T60. Le groupe V
contient seulement les cals placés sur les milieux d'initiation, tandis que le groupe IV contient
les cals placés sur milieux de multiplication et d'initiation. Les cals des deux groupes sont
classés avec un risque d'erreur de 3,7% (tableau Il). Quatre acides aminés ont une teneur
significativement supérieure au sein du groupe V (tableaux Il et 12) :
• la proline et la leucine, 2 fois plus élevée;
• la valine et l'alanine, 1,5 fois plus élevée.
L'analyse discriminante montre que la proline permet à elle seule de différentier les
groupes (tableau Il).
Une troisième analyse discriminante a été réalisée sur les cals des groupes II et V placés
sur milieu d'initiation et correspondant respectivement aux cals prélevés entre TO et T15 et
entre T28 et T60. La composition en acides aminés permet de classer les cals sans risque
d'erreur (100% d'individus bien classés) (tableau Il).
Trois acides aminés ont des teneurs significativement supérieures après T28 au sein du
groupe V (tableaux Il et 12) :
• la valine, 10 fois plus élevée;
• la proline et la leucine, 2 fois plus élevée.
L'analyse discriminante montre que la proline permet à elle seule de différentier les
groupes (tableau Il).
CONCLUSION:
Les groupes mis en évidence correspondent en partie à une évolution de la teneur en

acides aminés au cours du temps. En effet, deux phases principales peuvent être distinguées:
• une première phase, entre TO et T15 (groupes l, II et III) ;
• une seconde phase, entre T15 et T60 (groupes IV et V).
99
Ces phases correspondent aux deux phases décrites au cours du suivi de la croissance
des cals et des besoins en composés des milieux de culture: phase de latence, entre TO et T15,
et phase de croissance, entre T 15 et T60.
Deux groupes existent au sein des cals placés sur milieu de multiplication (groupes III et
IV), ils correspondent à l'évolution de la teneur en acides aminés au cours du temps. La
composition en acides aminés des cals placés sur milieu de multiplication est homogène. Cette
homogénéité est caractéristique des cals constituant les lignées, telle que L82, composées d'un
seul type de tissu.
Les groupes mis en évidence correspondent également à une évolution différente des
teneurs en acides aminés entre les cals placés sur les milieux d'initiation (groupes II et V) et sur
milieu de multiplication (groupes III et IV).
En revanche, la composition en acides aminés des cals placés sur milieu d'initiation est
hétérogène entre T28 et T60. Les milieux d'initiation donnent deux groupes de cals avec des
compositions en acides aminés différentes : les cals du groupe V et ceux appartenant au groupe
IV, qui ont une composition en acides aminés équivalente à celle des cals en multiplication.
L'hétérogénéité mise en évidence pourrait donc correspondre à une variabilité
physiologique des cals sur milieu d'initiation. Il est intéressant de noter que les cals placés sur
les deux milieux d'initiation montrent la même hétérogénéité.
Chez les cals de cocotier, l'étude histologique a permis de montrer une hétérogénéité du
degré d'orientation des cals envers l'embryogenèse. En effet, l'embryogenèse somatique n'est
pas synchrone : des cellules méristématiques, des cellules embryogènes et des proembryons à
différents stades de formation peuvent coexister; de plus, il peut arriver que des cals ne soient
pas encore différenciés au moment où les cellules embryogènes et les premiers proembryons
sont normalement observés (entre T15 et T28). L'hétérogénéité de la composition en acides
aminés mise en évidence pourrait correspondre à une hétérogénéité physiologique liée à la
variabilité au niveau de l'orientation des cals vers l'embryogenèse.
Par l'étude histologique et l'analyse de la composition en acides aminés, on peut alors
effectivement considérer deux types de cals sur milieu d'initiation entre T28 et T60 :
• des cals qu'on peut considérer comme bien orientés vers l'embryogenèse caractérisés par la
présence de nombreuses cellules embryogènes et surtout de proembryons, avec une
composition en acides aminés distincte;
• des cals qu'on peut considérer comme étant retournés vers l'état méristématique, avec une
composition en acides aminés équivalente à celle des cals en multiplication.
100
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V
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0Al
IV
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IV IV =..
~ =
~c.
III III
CIl 0Al
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'-' S 0+---+---+-----+-----1
o 15 30 45 60 o 15 30 45 60
~
oC
~
Temps(j)
3-,--------------------, -
~
~
Temps (j)
30 -,---1-11-1-11----------,
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CIl 5 ~ 101
~ =
Il Il ~g,
~c. 0Al
CIl
,! 0 S 0 +---!-------=--+--'--'+-----'I
o 15 30 45 60 o 15 30
Temps G>
-
Temps (j)
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~ 100,--------------------, ~ 12 - , - - - - - - - : : - - = - - - - - - - - - - - ,
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1: : 80 V
Q .. :Ë ~ 9
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~ c.
CIl
III III IV IV
~ =
c.
0Al
,! 0 S
o 15 30 45 60 15 30 45 60
Temps (j) Temps G>
Figure 30 : Evolution des teneurs en acides aminés des cals de la lignée L82 en fonction des
cinq groupes (*) (enmg.g-l de matière sèche).
• cals sur milieu de multiplication
• cals sur milieu d'initiation non orientés vers l'embryogenèse
o cals sur milieu d'initiation bien orientés vers l'embryogenèse
1 à V : groupe auquel appartiennent les cals à chaque temps considéré
(*) groupes défmis par une classification ascendante hiérarchique
101
Après avoir décrit les groupes de cals et déterminé une hétérogénéité dans leur degré
d'orientation envers l'embryogenèse, nous avons pu suivre l'évolution au cours du temps des
teneurs en acides aminés entre les différents groupes en prenant en compte le degré d'orientation
des cals.
C. Evolution des teneurs en acides aminés au cours du temps

Nous avons représenté, sur la figure 30, l'évolution des teneurs moyennes en acides
aminés en fonction des cinq groupes mis en évidence précédemment. A chaque date, chaque
point correspond à la moyenne des teneurs d'un acide aminé au sein du groupe auquel
appartiennent les cals prélevés à ce temps et non pas à la moyenne de la teneur du composé en
fonction des trois répétitions selon le facteur « date x milieu». Nous avons représenté au-
dessus de chaque point le groupe concerné.
Q Entre TD et T15:
La mise en culture entraîne une modification dans le contenu en acides aminés quel que
soit le type de milieu. Seul le contenu en thréonine, l'acide aminé majoritaire des cals, est
équivalent quels que soient le milieu et la date.
Le stade méristématique sur milieu de multiplication est caractérisé par une forte
augmentation dans le contenu en sérine et valine, et une faible baisse en proline. Sur milieu
d'initiation, l'initiation de l'embryogenèse est caractérisée par une forte baisse des teneurs
en proline et valine; la teneur en sérine augmente mais de façon significativement moins
importante qu'au sein des cals en multiplication. A ce stade, les cals sur milieu d'initiation
sont homogènes.
Q Entre T28 et T6D:
Pour les cals en multiplication, les teneurs en acides aminés restent stables (pour les
acides aminés détectés).
Les cals sur milieu d'initiation révèlent deux tendances. Au sein des cals non
induits, la teneur de chaque acide aminé devient équivalente à celle de cals en
multiplication. Les autres cals s'orientent vers l'embryogenèse et sont caractérisés par une
augmentation des teneurs en proline, valine et leucine. La teneur en alanine n'est pas modifiée
par rapport à la première phase décrite. Au sein des deux types de cals, la teneur en sérine
diminue de façon importante par rapport à la première phase (entre T15 et T28) pour devenir
équivalente à celle des cals en multiplication.
CONCLUSION:
Pour les cals en condition de multiplication, le passage de la phase de latence entre TO et

T15 à la phase de croissance entre T15 et T60 est caractérisé par le maintien des teneurs en
acides aminés.
102
011
012
011
012
011
012
15/1
15/1
812
812
4211
-8011
~:~ =:::Jh
2812 - _...
8011
4212
:~~ : Y t - -...
8012
4211
8011
4212
4212
811
811
812
4211
15/1 _ 1..........
-2812
811
2812
2811
-1--'"
2811
1812
1812
Fig_ 31 : Dendrogramme représentant la classification des cals de la lignée L7 selon leur

composition en acides aminés (1) (Analyse réalisée par une classification ascendante
hiérarchique sur les 54 individus de l'expérience)
- Groupe 1 : tous les cals à 1'0, cals prélevés à IlS, 1'42 et T60 sur milieu de
multiplication et 2/3 des cals prélevés à T8 sur milieu d'initiation;
- Groupe II : deux cals prélevés chacun à 1'28 et T60 sur milieu de multiplication et
cals prélevés à IlS, 1'28 et I60 sur milieu d'initiation;
- Groupe III : 1'42 et I60 sur les deux milieux;
- Groupe IV: 1'8, Il5, 128 et T42 sur milieu de multiplication, T8 et 1'28 sur
milieu d'initiation;
- Groupe V : un cal prélevé à 1'28 sur milieu de multiplication et 2/3 des cals
prélevés à I15 sur milieu d'initiation
* 60/1 : individu mal classé dans le groupe 1 mais bien classé dans le groupe II
28/2 : individu mal classé dans le groupe IV mais bien classé dans le groupe 1
représente la distance (euclidienne) qui sépare les cals ou les groupes de cals
et indique le degré de resssemblance ou de disssemblance entre les cals dans la
composition en acides aminés
(1) Acides aminés détectés: alanine, arginine, asparagine, glutamine, leucine, phénylalanine, proline,
sérine, thréonine, tyrosine, valine.
La composition moyenne en acides aminés dans chaque groupe est donnée dans le tableau 13
Les cals sont notés selon les dates de prélèvement et le milieu:

0, 8, 15, 28, 42, ou 60 / 1, 2 ou 3
0,8, 15,28,42 et 60 sont les 6 dates de prélèvement
l, 2 sont les milieux: 1, milieu de multiplication; 2, milieu d'initiation
ex: 0/1 date de prélèvement TO et milieu de multiplication noté 1
Sur milieu d'initiation, entre TO et T15, la diminution de la teneur en proline, sérine et

valine est concomitante avec l'individualisation des premières cellules embryogènes et avec les
changements physiologiques et infrastructuraux qui l'accompagnent pendant cette phase. Les
phases très précoces de l'initiation de l'embryogenèse ne semblent pas s'accompagner d'une
variabilité au sein du métabolisme azoté.
Entre T28 et T60, pour les cals qui pourraient maintenir un état proche de l'état
méristématique en n'évoluant pas vers les stades plus avancés de l'embryogenèse, un des signes
physiologiques serait la diminution de la teneur en acides aminés libres qui devient équivalente à
celle de cals en multiplication.
En revanche, un des signes physiologiques qui caractériserait les cals bien orientés est
l'augmentation de la teneur en proline, valine et leucine, et le maintien de la teneur en alanine.
Toutes ces modifications sont concomitantes avec l'absorption plus importante en composés
carbonés, azotés et minéraux et avec les changements infrastructuraux au sein des cellules
embryogènes et des premiers proembryons après le 28e jour de culture.
4.2.3- LIGNEE L 7 (<< TYPE 1 »)
A. Caractérisation de différents groupes de cals

Onze acides aminés ont été détectés au sein des cals de la lignée L7. Six acides aminés
communs à la lignée L82 : alanine, leucine, proline, sérine, thréonine, et valine, et en plus,
l'asparagine, l'arginine, la glutamine, la phénylalanine et la tyrosine.
Cinq groupes ont été mis en évidence (Fig. 31, tableau 13) :
• le groupe 1 correspond aux cals prélevés à TO sur les deux milieux, à T15, T42, T60 sur
milieu de multiplication et à deux cals sur trois prélevés à T8 sur milieu d'initiation;
• le groupe II comprend les trois cals prélevés à T60 sur milieu d'initiation, à un cal prélevé à
TI5 et un cal prélevé à T28 sur ce milieu, à un cal prélevé à T28 et un cal prélevé à T60 sur
milieu de multiplication;
• le groupe III comprend des cals prélevés à T42 et T60 sur les deux milieux ;
• le groupe IV comprend des cals prélevés à T8 et T28 sur milieu d'initiation et à T8, Tl5 et
T28 sur milieu de multiplication et un seul cal prélevé à T42 sur milieu de multiplication;
• le groupe V comprend deux cals prélevés à TI5 sur milieu d'initiation et un seul cal prélevé à
T28 sur milieu de multiplication.
B. Description des groupes de cals

Une forte hétérogénéité existe dans la composition en acides aminés des cals, sur milieu
de multiplication ou sur milieu d'initiation, et quelle que soit la date de prélèvement. En effet,
chaque groupe comprend des cals placés sur les deux types de milieu - milieu de
multiplication et milieu d'initiation - et prélevés à différentes dates.
1a4
TABLEAU 13 : Moyenne des teneurs en acides aminés pour les cinq groupes de la classification
hiérarchique chez la lignée L 7
Acides aminés groupe 1 groupe II groupe III groupe IV groupe V

alanine 29,540 22,970 30,380 15,140 19,500
arginine 3,300 5,320 4,400 1,120 11,300
asparagine 9,890 4,740 17,230 2,380 40,000
glutamine 15,430 40,100 22,300 5,270 9,230
leucine 3,650 Il,640 8,450 8,060 10,630
phénylalanine 9,180 9,180 9,250 11,570 0,970
proline 3,940 8,550 8,450 4,230 7,070
sérine 32,880 44,020 38,170 21,020 21,470
thréonine 176,230 185,690 286,280 104,650 22,870
tyrosine 2,370 3,920 4,280 2,820 6,300
valine 11,940 36,640 34,780 21,830 15,270
n (1) 12 8 4 9 3
(1) n : nombre d'individus par groupe. L'analyse comprend 36 individus
TABLEAU 14: Analyse discriminante des groupes 2 à 2 chez la lignée L7.

Les résultats sont exprimés en mg par gramme de matière sèche.
Groupes II III IV V 1 IV 1 V 1 II 1 III

% de bien 100% 100% ,
952% (1) 100% 95%(1) 100%
classés
Acide aminé Thr Thr Thr Thr Pro Thr
(2)
Moyenne (3) 185,690 286,280 104,650 22,870 !176,230 104,650 176,230 22,870: 3,940 8,550 176,230 286,280
M'm. (4) i 155,000 269,100. 65,700 19,100 i 169,500 65,700 169,500 19,I00i 2,900 7,400 i 169,500 269,100
! i ! ! ! i
Max. (4) i 224 ,7oo 302,600 ! 143,600 26,800! 181,700 143,600 i 181,700 26,8OO i 6,700 11,500 j 181,700 302,600
(1) un individu est mal classé dans le groupe IV mais bien classé dans le groupe 1(deuxième individu 28/2 du dendrogramme de la figure
et un individu est mal classé dans le groupe 1mais bien classé dans le groupe Il (l'individu 60/1 du dendrogramme de la figure)
(2) Acide aminé pennettant une distinction entre les cals: Pro = proline, Thr = thréonine
(3) Moyenne des teneurs en acides aminés entre les groupes (Cf. tableau 1)
(4) Valeurs minimale (min.) and maximale (max.) pour la thréonine au sein des groupes
TABLEAU 15 : Analyse de variance sur les teneurs en acides aminés en fonction des
groupes pris deux à deux chez la lignée L7
Groupes II et III (1) IV et V (1) 1et IV (1) 1 et V (1) 1 et II (1) 1 et III (1)
alanine 2,14 NS 1,37 NS 17,93 ... 3,37 NS 2,43 NS 0,03 NS
arginine 0,05 NS 0,00 NS 4,40 • 1,83 NS 0,74 NS 0,49 NS
asparagine 4,86 NS 0,29 NS 10,47 2,65 NS 2,36 NS 3,66 NS
glutamine 2,11 NS 2,04 NS 24,63 3,98 NS 13,44 •• 3,12 NS
leucine 0,54 NS 1,59 NS 6,85 • 8,27 • i 9,03 •• 3,68 NS
!phénylalanine! 0,37 NS 3,41 NS 0,61 NS 12,03 ..! 1,14 NS 0,00 NS
! proline ! 0,01 NS 9,38· 0,25 NS 20,43 ••• j 57,86 ••• 28,59 •••
i sérine l 0,13 NS 0,00 NS 19,20 ••• 4,12 NS! 2,09 NS l 0,48 NS
. thréonine j 63,40 ••• 35,14 ••• 112,88 ... 3471,58 ••• 2,23 NS i441,35 •••
tyrosine j 0,04 NS 5,69· 0,30 NS 22,29 ••• 3,01 NS! 2,91 NS
valine i 0,12 NS. 0,53 NS 3,74 NS 0,25 NS l33,01 ••• ! 16,79 ••
(1) Test Fisher-Snedecor; Test : niveau de signification: NS = non significatif; * = significatif (5%); ** = hautement
=
significatif (1%); *** très hautement significatif (1%0)
Cependant, trois principaux types de cals peuvent être distingués :

• le groupe 1 montre que certains cals prélevés à T8 sur milieu d'initiation ou à T15, T42 et
T60 sur milieu de multiplication ont une composition en acides aminés équivalente à celle
des cals prélevés à TO ;
• les groupes II et III contiennent essentiellement des cals prélevés à T42 et T60 ;
• les groupes IV et V contiennent essentiellement des cals prélevés entre T8 et TI8.
Afin de déterminer si les groupes II et III étaient significativement différents, une

analyse discriminante a été réalisée. Elle montre que la composition en acides aminés pennet
de classer les deux groupes sans risque d'erreur (100% de bien classés) (tableau 14).
Les groupes II et III ne diffèrent que par la teneur en thréonine qui est 1,5 fois plus
élevée dans le groupe III (tableaux 14 et 15).
Une autre analyse a été réalisée entre les deux groupes IV et V. Elle montre que les cals
sont classés sans risque d'erreur (tableau 14). Les deux groupes diffèrent par un nombre
restreint en acides aminés. Deux acides aminés montrent une teneur plus élevée dans le
groupe V (tableaux 14 et 15) :
• la tyrosine avec une teneur 3 fois plus élevée ;
• la proline avec une teneur 2 fois plus élevée.
Un acide aminé montre une teneur moins élevée dans le groupe V : la thréonine avec
une teneur 5 fois moins élevée. La thréonine suffit à différentier les groupes (tableau 14).
Les autres analyses ont consisté à comparer le groupe 1 avec les autres groupes.
Le groupe IV comprend des cals essentiellement prélevés à T8, T15 et T28 sur les deux
milieux. L'analyse discriminante entre les groupes 1 et IV montre que les cals peuvent être
classés avec un risque d'erreur limité à 5% (tableau 14). Six acides aminés ont une teneur
significativement plus élevée dans le groupe 1 (tableaux 14 et 15) :
• la thréonine et la sérine avec une teneur 1,5 fois plus élevée;
• l'alanine avec une teneur 2 fois plus élevée;
• l'arginine et la glutamine avec une teneur 3 fois plus élevée;
• l'asparagine avec une teneur 4 fois plus élevée.
Un seul acide aminé, la leucine, a une teneur 2 fois moins élevée.
La thréonine seule pennet de différentier les groupes (tableau 14).
Le groupe V comprend des cals prélevés à T15 et T28. L'analyse discriminante entre les
deux groupes montre que les cals sont classés sans risque d'erreur (100% de bien classés)
(tableau 14).
106
Deux acides aminés ont une teneur plus élevée dans le groupe 1 (tableaux 14 et 15):
• la phénylalanine avec une teneur 10 plus élevée;
• la thréonine avec une teneur 8 fois plus élevée.
Trois acides aminés ont une teneur moins élevée dans le groupe 1 :
• la leucine avec une teneur 3 fois moins élevée ;
• la tyrosine avec une teneur 2,5 fois moins élevée;
• la proline avec une teneur 1,5 fois moins élevée.
La thréonine seule suffit à différentier les groupes (tableau 14).

Le groupe II comprend des cals prélevés essentiellement à T28, T42 et T60 sur les deux
milieux. L'analyse discriminante entre les groupes 1 et II montre que les cals peuvent être
classés avec un risque d'erreur limité à 5% (tableau 14).
Quatre acides aminés montrent une teneur moins élevée dans le groupe 1 (tableau 14 et
15) :
• la glutamine et la leucine avec une teneur 4 fois moins élevée;
• la valine avec une teneur 3 fois moins élevée ;
• la proline avec une teneur 2 fois moins élevée.
La proline suffit à différentier les groupes (tableau 14).
Le groupe III comprend des cals prélevés à T42 et T60 sur les deux milieux. L'analyse
discriminante entre les groupes 1 et III montre que les cals peuvent être classés sans risque
d'erreur (100% de bien classés). Trois acides aminés montrent une teneur 3 fois moins élevée
dans le groupe 1 (tableau 14 et 15) : la thréonine, la proline et la valine. La thréonine suffit à
différentier les groupes (tableau 14).
CONCLUSION:
Contrairement à la lignée L82, l'hétérogénéité de la composition en acides aminés ne

peut pas être reliée directement à une hétérogénéité des cals dans leur orientation vers
l'embryogenèse.
On ne peut pas non plus discriminer les cals placés sur milieu d'initiation des cals placés
sur milieu de multiplication.
Les groupes mis en évidence correspondent en partie à une évolution de la teneur en

acides aminés au cours du temps. En effet, deux phases principales peuvent être distinguées:
• une première phase de T8 à T28, groupes IV et V ;
• une seconde phase de T28 à T60, groupes II et III.
107
Ces phases correspondent aux deux phases décrites au cours du suivi de la croissance
des cals : phase de croissance, entre T8 et T28, et phase stationnaire de croissance, entre T28
et T60.
Cependant, cette distinction de deux phases différentes n'est pas si évidente. En

particulier, le groupe II contient un cal prélevé à T 15 sur milieu d'initiation et le groupe IV
comprend un cal prélevé à T42 sur milieu de multiplication. De plus, au sein de ces deux
phases, une hétérogénéité existe dans le niveau de certains acides aminés. Enfin, certains cals
montrent un statut physiologique proche des cals prélevés avant la nouvelle mise en culture
(TO), leur composition en acides aminés reste inchangée.
Comme nous l'avons suggéré pour la lignée L82, l'hétérogénéité dans la composition en
acides aminés pourrait correspondre à l'hétérogénéité du comportement physiologique et
métabolique des cals. Cependant, chez les lignées de type l, elle pourrait être liée à leur
structure.
En histologie, les cals sont composés d'une zone tissulaire méristématique périphérique de
type cambial. Cette zone hautement régulée peut présenter une forte hétérogénéité du niveau
d'activité mitotique car elle est en équilibre entre le maintien de l'état méristématique et
l'orientation vers un état différencié au centre des cals. Sur milieu d'initiation, elle peut présenter
différents degrés d'orientation vers l'embryogenèse. Cela revient à dire que les cals présentent
une hétérogénéité dans leur degré de différenciation dont une voie possible est l'embryogenèse.
Une variabilité au sein du processus de différenciation peut donc entraîner une variabilité
au niveau du processus métabolique, dont un des signaux pourrait être la teneur en acides
aminés.
Cette hypothèse est à mettre en parallèle avec une étude de la nutrition minérale réalisée à
partir de cals de carotte en milieu solide. Les auteurs (WETHERELL et DOUGALL, 1976)
soulignaient que la variabilité du statut physiologique des cals, qui dépend de l'importance des
parties différenciées et/ou en dégénérescence et des parties en activité des cals telles que les
lignées de type l, entraîne une variabilité dans le métabolisme et la translocation des composés
azotés.
C. Evolution des teneurs en acides aminés au cours du temps

Etant donnée la forte hétérogénéité de la composition en acides aminés, il apparaît
impossible de représenter graphiquement révolution de la teneur de chaque acide aminé au
cours du temps. Nous pouvons toutefois décrire une tendance des changements observés entre
les deux phases d'évolution mises en évidence précèdemment.
Les deux acides aminés qui permettent le mieux de différentier les groupes sont la
thréonine, acide aminé majoritaire des cals de cocotier, et la proline. Des modifications de la
teneur de ces deux acides aminés peuvent être mises en évidence entre les cinq groupes de cals.
108
La teneur en thréonine diminue pendant la phase T8-T28 (teneur 2 fois moins importante
dans les groupes IV et V que dans le groupe 1); elle augmente ensuite pendant la période T42-
T60 (teneur 1,5 à 8 fois plus élevée dans les groupes II et III que dans le groupe 1). La teneur en
proline augmente au cours du temps (teneur 2 fois plus élevée dans les groupes IV et V et 3
fois plus élevée dans les groupes II et III).
Le même type de résultats est observé pour les autres acides aminés:
• la phase T8-T28 est caractérisée, au sein des cals, par une teneur plus importante en : leucine
(groupe IV et V), tyrosine (groupe V) et une teneur moins importante en alanine, asparagine,
arginine, glutamine, serine (groupe IV) et en phénylalanine (groupe V) ;
• la phase T28-T60 est caractérisée, au sein des cals, par une teneur plus importante en
glutamine et leucine (groupe II) et en valine (groupe III).
CONCLUSION:
Pendant les deux phases, les changements observés au niveau des acides aminés sont à
mettre en parallèle avec l'absorption régulière en composés exogènes mise en évidence
précédemment. La nature des acides aminés est représentative de la diversité des voies
métaboliques dont ils proviennent et dans lesquelles ils sont impliqués (RICHTER, 1993).
4.2.4- CONCLUSION
Cette étude a permis de caractériser une hétérogénéité du statut physiologique des cals
au sein de chaque lignée. Cette hétérogénéité correspond à une variabilité de la composition
en acides aminés entre des cals prélevés à une même date de prélèvement et sur le même type
de milieu (de multiplication et/ou d'initiation).
Cette hétérogénéité pourrait être liée au degré de différenciation des cals chez L7, et à une
bonne ou mauvaise orientation vers l'embryogenèse chez L82. Chez L7, il n'est pas possible de
discriminer les cals sur milieu de multiplication et sur milieu d'initiation. Cela pourrait signifier
que l'hétérogénéité observée serait plus généralement liée à des changements métaboliques
associés au processus de différenciation dont une voie possible est l'embryogenèse.
L'étude d'un seul acide aminé pourrait permettre de caractériser l'hétérogénéité observée.
En effet, un seul acide aminé (proline ou valine pour L82; thréonine ou proline pour L7)
seulement suffit à discriminer les cals entre deux groupes, en particulier, la proline, acide aminé
commun aux deux lignées.
Seule l'étude réalisée sur la lignée L82 permet d'associer les changements dans la
composition en acides aminés avec l'orientation des cals vers l'embryogenèse. Cette étude
s'avère intéressante car, à notre connaissance, très peu d'études (MEROT, 1988; CLAPOROLS et
al., 1993; MONTORO et al., 1995) ont permis de mettre en relation des changements au niveau
des teneurs en acides aminés avec l'initiation de l'embryogenèse somatique.
109
Cette étude a permis la démonstration de l'inefficacité des méthodes classiques d'analyse

de variance pour comparer les traitements face à l'hétérogénéité mise en évidence. Par exemple,
chez L82, la moyenne effectuée sur le traitement « milieu d'initiation », i.e. la moyenne sur les
deux profils en acides aminés, n'a pas de signification biologique dans le cas présent puisque les
cals ne montrent pas le même état de différenciation.
Au contraire, nous proposons une méthodologie statistique basée sur une typologie des
cals avant la comparaison proprement dite de l'évolution des teneurs des composés étudiés entre
les milieux.
4.3- Etude quantitative et qualitative des protéines solubles
Dans un premier temps, nous avons suivi l'évolution de la teneur en protéines solubles.
Ensuite, nous avons analysé le profil protéique des cals par électrophorèse
monodimensionnelle. Cette étude qualitative a été réalisée dans le but de vérifier si une
différence pouvait exister entre les deux lignées de cals étudiées dans leur profil protéique.
Nous avons conservé les mêmes dates de prélèvement que lors de l'analyse de la
composition en acides aminés.
4.3.1- LIGNEEL82 (<< TYPE II »)
A. Etude quantitative
La teneur en protéines évolue différemment entre les milieux (Fig. 32). Entre TO et TS,
la teneur en protéines augmente sur tous les milieux; cependant, elle est significativement plus
élevée sur le milieu d'initiation qui comporte la moins forte concentration en 2,4-D (G130 :
60 mg.g- l de matière sèche; G140 : 40 mg.g- l de matière sèche; GIOO : 30 mg.g- l de matière
sèche). A T42, une augmentation significative est observée seulement sur le milieu
d'initiation comportant la plus forte concentration en 2,4-D (G140 : 60 mg.g- l de matière
sèche).
110
B. Etude qualitative
L'étude en électrophorèse monodimensionnelle du profil en protéines solubles chez
L82, montre l'existence d'environ 8 bandes polypeptiques majoritaires (Fig. 34). Pour des
cals placés sur les milieux d'initiation, une bande correspondant à un polypeptide de 14 kDa
montre des changements d'intensité entre les dates de prélèvement. Son intensité est faible au
8e et 15e jour de culture, elle augmente au 28e jour de culture puis cette bande disparaît à
partir du 42e jour de culture sur ces milieux. Pour des cals placés sur milieu de multiplication,
l'intensité de cette bande reste stable quel que soit la date considérée. Le même résultat a été
observé pour les trois gels réalisés pour chacun des trois cals représentant les répétitions de
chaque condition étudiée: date de prélèvement et milieu.
4.3.2- LIGNEE L7 «( TYPE 1 »)

A. Etude quantitative
Pour la lignée L7, une augmentation de la teneur en protéines est observée. Elle est
significativement plus élevée sur milieu d'initiation (300 mg.g·( de matière sèche) que sur
o
milieu de multiplication (200 mg.g de matière sèche) à partir de T28 (Fig. 33).
)
B. Etude qualitative
L'étude en électrophorèse monodimensionnelle montre exactement le même profil
protéique que celui de la lignée L82. Cependant, la bande correspondant au polypeptide de 14
kDa ne montre aucune différence entre condition de multiplication et condition d'initiation de
l'embryogenèse.
4.3.3- CONCLUSION
L'augmentation de la teneur en protéines en condition d'embryogenèse, observée chez
les deux lignées, est concomitante avec (1) les besoins plus importants en composés nutritifs
au 28e jour de culture, (2) les modifications de la teneur en certains acides aminés (chez les
cals de type II), (3) l'augmentation du nombre de ribosomes observée au microscope
électronique, (4) l'accumulation de réserves protéiques au sein des cellules embryogènes. Ces
faits, confirmant ceux observés au cours des études antérieures réalisées sur d'autres lignées,
traduisent selon toute vraisemblance une augmentation de la protéosynthèse durant l'initiation
de l'embryogenèse.
111
80 "'.-.. 400
"'GI .......
GI GI GI
-.c
:C'5 C
"§ b b
=~
='" =~ 300
c.l
,
60
'"
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.-~E"
GI
'- c.
'" GI
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'-
GI-G.I
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40 a a
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GI
c..'C a
~ ~ ~ ~ 100 .
..=c.." 20
GlCJl
'-
= "
c..
GI CJl
a
~ E ~ E 0 1 1 1 1 1
~- 15 30 45 60 ~- 0 15 30 45 60
Tempsü) Temps ü)
Figure 32 : Evolution de la teneur en Figure 33 Evolution de la teneur en

protéines solubles au sein des protéines solubles au sein des
cals de la lignée L82, en mg cals de la lignée L7, en mg
par g de matière sèche par g de matière sèche
• milieu de multiplication • milieu de multiplication
GlOO M60
• milieu d'initiation G130 • milieu d'initiation MIlO
112
- -45
- -31
- -21
- ~-14KDa
8 15 28 42 8 15 28 42j M
< multiplication >
< initiation ùe
>
l'embryogenèse
Figure 34 : Profil (a) et schéma (b) d'électrophorèse monodimensionnelle des protéines solubles
totales des cals de la lignée de type 1 L82 en condition de multiplication et en
condition d'initiation de l'embryogenèse.
Variabilité d'une bande correspondant à un polypeptide de 14 KDa en condition
d'initiation.
8, 15,28,42 : temps d'analyse
M : marqueur de bande (BSA)
GI00: milieu de multiplication; G130: milieu d'initiation de l'embryogenèse
En condition de multiplication, le profil protéique ne montre pas d'hétérogénéité entre

les deux lignées de cals. En condition d'initiation de l'embryogenèse, la disparition d'une
bande correspondant à un polypeptide de 14 kDa a été montrée pour L82 sur milieu
d'initiation. Pour L7, aucune différence n'a été mise en évidence au niveau de la bande
correspondant à ce polypeptide en condition d'embryogenèse.
Cette étude doit être étendue à d'autres lignées de cals appartenant aux deux types de
lignées étudiées (cals de type 1 et II) pour confinner si ce polypeptide correspond
effectivement à une variabilité physiologique au sein de la composition en protéines entre les
deux types de cals étudiés.
De plus, la bande de ce polypeptide ne montre une variabilité qu'en condition
d'embryogenèse. Il serait alors intéressant de détenniner s'il pourrait correspondre à un
marqueur protéique lié aux étapes précoces de l'embryogenèse.
5- CONCLUSION
Nousferons tout d'abord une récapitulation des résultats obtenus.
Sur milieu d'initiation, deux phases d'évolution des cals peuvent être distinguées:
• une première phase, entre TO et T15, qui sera dénommée <pl; elle correspond à la mise en
place des premières cellules embryogènes ;
• une deuxième phase, entre T15 et T60, qui sera dénommée <p2; elle correspond à la
réalisation des remaniements infrastructuraux aux sein des cellules embryogènes et la
fonnation des premiers proembryons.
Elles correspondent à des changements spécifiques au niveau nutritionnel et
physiologique.
Lignée L7 (( type 1 »):

L'initiation de l'embryogenèse est réalisée après augmentation de la concentration en 2,4-
l l
D (110 mg.r au lieu de 60 mg.r en présence de 2 g.r l de charbon actif).
Nous avons observé:
• Pendant la phase <pl :
une absorption plus importante en chlore, nitrate, phosphate et sulfate, et un pH plus
acide.
• Pendant la phase <p2 :
une activation de la protéosynthèse.
114
Lignée LB2 (( type II ») :

L'initiation de l'embryogenèse est réalisée après augmentation du niveau de deux
paramètres: le 2,4-D et les macroéléments. Pendant les deux phases <p 1 et <p2, chez les cals de
type II, en conservant deux milieux d'initiation de l'embryogenèse (G130 : 130 mg.r l
I
et G140: 140 mg.r l , au lieu de 100 mg.r , en présence de 3 g.r l de charbon actif), nous avons
observé que certains changements pourraient être liés à l'effet du 2,4-D plus qu'à celui du
doublement de la concentration en macroéléments.
Nous avons observé:
• Pendant la phase <pl :
• le maintien d'une teneur importante en saccharose, elle est d'autant plus importante que
la concentration en 2,4-D exogène est élevée;
• une diminution de la teneur en trois acides aminés : valine, sérine et proline sur les deux
milieux;
• une activation de la protéosynthèse qui est plus importante en présence de la moins forte
concentration en 2,4-D (G130).
• Pendant la phase <p2 :

• une croissance significativement moins importante sur milieu d'initiation contenant la
plus forte concentration en 2,4-D (G 140) ;
• une absorption plus importante en glucose, elle est observée à T15 sur le milieu
contenant la plus forte concentration en 2,4-D (G 140) et à T28 sur l'autre milieu
(G130) ;
• une diminution de la teneur en saccharose, elle est d'autant moms forte que la
concentration en 2,4-D des milieux est élevée;
• des modifications dans la teneur en valine, proline, leucine et alanine qui dépendent du
degré d'orientation des cals vers l'embryogenèse;
• une activation de la protéosynthèse en présence de la plus forte concentration en 2,4-D
(GI40) ;
• la disparition d'un polypeptide de 14 kDa.
Pour L82, en conservant deux milieux d'initiation contenant deux concentrations en 2,4-
l l
D différentes (130 mg.r et 140 mg.r en présence de 2 g.r l de charbon actif), nous avons pu
relier certains changements observés sur milieu d'initiation à l'effet éventuel du 2,4-D :
croissance des cals, modifications observées au niveau des teneurs en composés carbonés et en
protéines, qui dépendent de la concentration en 2,4-D des milieux.
Cependant, quel est le lien entre les changements au niveau nutritionnel observés et
l'effet inducteur du 2,4-D ?
115
Le rôle des auxines au cours de l'initiation de l'embryogenèse est encore très mal
connu. Leur rôle pourrait être proche du rôle très complexe de régulation joué par les
honnones au cours du développement de la plante entière. Certaines études ont pennis de
mettre en évidence l'effet régulateur des auxines sur la synthèse des polysaccharides pariétaux
tels que la cellulose (HALL et GROIN, 1968; RAYet ABDUL-BAKI, 1968; WHIGHTMAN et
SETTERFIELD, 1968;ANDERSEN, 1972) et de certaines protéines (WHIGHTMAN et SETTERFIELD,
1968; DUDITS et al., 1991). Ce qui pourrait être en relation avec les changements observés au
niveau de la teneur en saccharose et en protéines.
Certains auteurs suggèrent que les auxines pourraient modifier les voies de transport
métabolique inter et intracellulaires et entraîner les cellules ou tissus vers la différenciation
dont une voie possible est l'embryogenèse (STANGE, 1984; CHAMPAGNAT, 1987; DUDITS et
al., 1991; TAIZ et ZEIGER, 1991). Elles agiraient en modifiant le niveau de pH extra et
intracellulaire (TAIZ et ZEIGER, 1991; DELBARRE et al., 1994). Ce qui pourrait être mis en
parallèle avec l'existence d'un pH plus acide des milieux d'initiation.
Malgré les différences observées entre les deux milieux d'initiation, l'initiation de
l'embryogenèse se déroule de façon équivalente. De plus, les cals placés sur les deux milieux
ne montrent pas de différence dans leur profil en acides aminés. Ils présentent donc le même
degré d'hétérogénéité vis à vis de l'orientation vers l'embryogenèse. Ce qui pennettrait de
confinner que les deux milieux ont un effet équivalent sur le processus embryogène.
A quoi correspondent les changements observés en terme nutritionnel et physiologique?
Quelle que soit la lignée de cals, les résultats obtenus pourraient correspondre à des
besoins spécifiques en composés carbonés, azotés et/ou minéraux plus importants et à des
changements physiologiques au moment de l'initiation de l'embryogenèse. Cette hypothèse
semble confinner celle d'une augmentation de l'activité métabolique au moment de
l'initiation de l'embryogenèse, suggérée par l'étude histocytologique. Elles seraient également
en accord avec d'autres études. Certains auteurs ont montré qu'un niveau minimum en azote
réduit et en composés carbonés est nécessaire pour initier l'embryogenèse (HALPERIN et
WETHERELL, 1965, WHETERELL et DOUGALL, 1976, THORPE, 1983; AMMIRATO, 1987; EAPEN
et GEORGE, 1990).
L'analyse de la composition en acides aminés a pennis d'apporter des infonnations

supplémentaires sur le statut physiologique des cals de cocotier. En effet, elle a pennis de
relier une hétérogénéité au niveau physiologique au sein des cals de chaque lignée, à
l'hétérogénéité de leur degré de différenciation, qui était jusqu'à maintenant montrée par la
seule observation histologique. La même approche statistique (CAH, analyse discriminante et
116
analyse de variance), réalisée sur les données concernant les sucres et les protéines endogènes,
n'a pas permis de discriminer les cals étudiés.
Chez les cals de type l, l'hétérogénéité mise en évidence serait associée à
l'hétérogénéité structurale et infrastructurale des cals, c'est à dire au degré de différenciation
des cellules de la zone pseudocambiale vers (l) le type parenchymenteux et/ou (2) la
formation d'éléments de type trachéide et/ou (3) l'embryogenèse sur milieu d'initiation. Chez
les cals de type II, elle serait associée à l'hétérogénéité du degré d'orientation des cals vers
l'embryogenèse, seule voie de différenciation que montrent les cals de cette lignée. L'étude
histologique montre que le même fait doit exister chez les cals de type 1 mais il n'a pas été
explicitement montré. Comme nous l'avons suggéré, la forte hétérogénéité structurale des cals
entraînerait une forte hétérogénéité du statut métabolique, ce qui ne permettrait pas de faire la
différence entre condition de multiplication et condition d'initiation de l'embryogenèse.
L'augmentation de la concentration en 2,4-D est jusqu'à maintenant le stimulus

essentiel de l'embryogenèse. A la suite de cette étude, nous avons souhaité déterminer si
d'autres composés que le 2,4-D (et les macroéléments) pouvaient influer sur le devenir des
cals des deux types de lignées de cals étudiés. Nous nous sommes alors orientée vers l'étude
de l'effet d'une augmentation de la concentration en sucre des milieux sur le devenir des cals.
117
EFFET DE LA CONCENTRA TIaN EN SACCHAROSE
- C~ITRE III-
INFLUENCE D'UNE AUGMENTATION DE LA CONCENTRATION EN SUCRE
EXOGENE SUR L'INITIATION DE L'EMBRYOGENESE
INTRODUCTION
L'augmentation de la concentration en 2,4-D dans les milieux représente le stimulus

essentiel de l'initiation de l'embryogenèse. Cependant, lorsque le 2,4-D et les auxines en
général sont utilisés à de trop fortes concentrations, ils peuvent entraîner une augmentation du
taux de variants somaclonaux dans les cultures (Ev ANS et al., 1986). Notre objectif étant la
réalisation d'une multiplication conforme, nous avons étudié la possibilité d'initier
l'embryogenèse en présence d'une concentration en 2,4-D équivalente à celle utilisée pour la
multiplication des cals mais en jouant sur d'autres facteurs du milieu, en particulier la
concentration en sucre.
Il est maintenant établi que l'initiation de l'embryogenèse somatique requiert des
besoins supplémentaires en composés carbonés exogènes et endogènes, nécessaires pour
permettre les modifications structurales et physiologiques mises en évidence dans le chapitre
précédent. Nous avons testé l'effet d'une augmentation de la concentration en sucre des
milieux sur l'initiation de l'embryogenèse.
Les premiers essais réalisés ont rapidement montré que l'augmentation de la
concentration en glucose des milieux des cals de type II, dont la prolifération est assurée par
une assise protodermique, n'a aucun effet sur le devenir des cals, ceci quelle que soit la
concentration en sucre testée. Nos études se sont donc focalisées sur l'effet de la concentration
en saccharose sur les cals de type J, dont la prolifération est assurée par une assise
pseudocambiale.
1- INFLUENCE DE DIFFERENTES CONCENTRATIONS EN SUCRE SUR

L'INITIATION DE L'EMBRYOGENESE
Deux lignées de cals de « type J » (L7 et PBC26) ont été considérées. Elles prolifèrent
en présence de saccharose (30 g.r 1). Trois concentrations en saccharose différentes ont été
testées dans les milieux de multiplication: 60, 90, 120 g.r 1• Nous avons suivi l'évolution de
l'état des cals, placés sur ces milieux, par une étude histologique.
Sur une concentration augmentée en saccharose, le degré de différenciation en éléments

de type trachéide de la partie centrale des cals apparaît plus élevé.
118
PLANCHE X
l
Structure histologique des cals sur milieu enrichi en saccharose (120 g.r )
1. Cals entourés d'un mucilage de nature vraisemblablement polysaccharidique

(barre: 10 ~m)
2. Zone lignifiée d'un cal de type 1 sur milieu enrichi en saccharose (barre: 80 ~m)
3. Détail d'une zone lignifiée et d'une zone embryogène périphérique (barre: 80 ~m)
CE : cellule embryogène; Et : éléments de type trachéide; Mu : mucilage; Pa : parenchyme;

Rlp : réserves lipo-protéiques; Zd : zone en dégénérescence
1
-
~Mu
EFFET DE LA CONCENTRA TlON EN SACCHAROSE
D'autre part, avec une concentration quadruplée en saccharose (120 g.r l ), des cellules
de type embryogène sont observées au ISe jour de culture. Elles se divisent pour donner des
proembryons vers le 28e jour de culture. Cellules embryogènes et proembryons montrent des
caractéristiques identiques à celles observées précédemment.
CONCLUSION
Une initiation de l'embryogenèse somatique a été observée en quadruplant la
concentration en saccharose sans augmenter la concentration en 2,4-0. Il est important de
noter que ce résultat a été obtenu sur des milieux dont la concentration en 2,4-0 correspond à
celle des milieux de multiplication.
Ces données expérimentales nous ont conduit à réaliser une étude comparative du
déroulement des évènements précoces de l'embryogenèse sur milieu enrichi en saccharose et
sur milieu enrichi en 2,4-0.
2- COMPARAISON HISTOCYTOLOGIQUE DE L'INITIATION DE

L'EMBRYOGENESE SUR MILIEU ENRICHI EN SACCHAROSE ET MILIEU
ENRICHI EN 2,4-D
Une étude en histologie et une étude ultrastructurale au microscope électronique à

transmission ont permis de comparer les modifications structurales conduisant à
l'embryogenèse pour des cals placés sur les deux types de milieu d'initiation: milieu enrichi
en 2,4-0 (MIlO) et milieu enrichi en saccharose (M60/120).
2.1- Etude histologique

L'étude histologique de la structure des cals montre que les étapes conduisant à
l'initiation de l'embryogenèse se déroulent de façon équivalente sur les deux milieux
d'initiation.
Sur les deux milieux, l'embryogenèse s'avère hétérogène et non synchrone. Cellules
embryogènes et proembryons coexistent alors que certaines parties du cal sont encore
méristématiques.
Cependant, sur l'ensemble des observations réalisées, des différences structurales

existent entre les cals placés sur les deux milieux. Sur milieu enrichi en saccharose, les cals
sont fréquemment entourés d'une matrice gélifiée, colorée en rose par le réactif de Schiff,
semblant indiquer la nature polysaccharidique de ce mucilage (Planche X, photo 1). Le centre
des cals montre la présence d'un nombre important d'éléments xylémiques. La périphérie des
cals est composée de nombreuses cellules embryogènes (Planche X, photos 2 et 3).
119
PLANCHE XI
Caractéristiques ultrastructurales des cals sur milieu enrichi en saccharose (120 g.r 1)
1 et 2. Dépôt de matériel dense aux électrons de nature lipo-protéique
3. Amyloplastes volumineux dans la cellule embryogène
4. Appareil de Golgi près d'un noyau
5. Détail de microfibrilles de nature cellulosique au niveau des parois
6. Présence d'un matériel dense au niveau de la lamelle moyenne en destructuration entre
deux cellules embryogènes
7. Détail du matériel dense au niveau de la lamelle moyenne
A : grain d'amidon; F : microfibrille; Lm : lamelle moyenne; N : noyau; P : paroi; Sc : saccule

golgien épais de la face de formation; Sm : saccule golgien de la face de maturation; Vg : vésicule
golgienne.
EFFET DE LA CONCENTRA TION EN SACCHAROSE
L'initiation de l'embryogenèse est concomitante avec la destructuration de la zone

pseudocambiale et la dégénérescence progressive de la zone centrale du cal.
2.2- Etude ultrastructurale en microscopie électronique

L'étude réalisée au microscope électronique à transmission, montre que les
remaniements infrastructuraux qui conduisent à la formation des cellules de type embryogène
et des proembryons sont équivalents sur les deux milieux.
Dans la zone méristématique périphérique des cals sur milieu enrichi en saccharose, les
vacuoles de certaines cellules montrent la présence d'un matériel très dense aux électrons sous
forme de nombreux cristaux qui doivent être probablement de nature lipo-protéique (Planche
XI, photo 1); d'autres sont emplies d'un matériel moins dense et plus granuleux (Planche XI,
photo 2). Des inclusions vraisemblablement de nature lipo-protéique et des amyloplastes
s'accumulent au sein de certaines cellules autour du noyau au voisinage du ISe jour de culture
(Planche XI, photos 3). Dans le cytoplasme, de nombreux ribosomes, de nombreux profils
réticulaires en activité sont observés. Un nombre élevé de vésicules est produit au niveau des
dictyosomes (Planche XI, photo 4).
Cependant, des différences infrastructurales existent entre les cals maintenus sur les
deux milieux. Sur milieu enrichi en sucre, en périphérie de certaines cellules embryogènes et
proembryons, on peut observer la présence d'un matériel extracellulaire associé à la paroi
pectocellulosique. Ce matériel est de deux types: un dépôt de fibrilles (Planche XI, photo 5)
et un matériel plus dense et « globulaire» au niveau de la lamelle moyenne (Planche XI,
photos 6 et 7). Ce dernier pourrait correspondre à une digestion et une destructuration de la
lamelle moyenne. Certaines cellules, avec une structure particulière, sont observées : un
appareil réticulaire très développé (Planche XII, photo 1) qui montre une activité intense
(Planche XII, photo 2). Certaines de ces cellules montrent la présence de figures de type
myéloïde concentriques souvent associée à la membrane cytoplasmique (Planche XII, photo
3).Ce réticulum est proche de la périphérie des cellules et associé à la membrane
cytoplasmique (Planche XII, photo 4). Ces cellules contiennent de nombreuses mitochondries
et des amyloplastes (Planche XII, photo 4). De nombreuses invaginations du plasmalemme
déposant du matériel extracellulaire au niveau de la paroi pectocellulosique sont observées
(Planche XII, photo 5).
Exceptées ces caractéristiques ultrastructurales, après le 28e jour, lorsque les
proembryons évoluent en massifs méristématiques, aucune différence n'est observée entre les
deux milieux dans la poursuite de l'embryogenèse.
120
PLANCHE XII
Caractéristiques ultrastructurales des cals sur milieu enrichi en saccharose (120 g.r l )
1. Cellules comportant un appareil réticulaire développé
2. Détail de l'appareil réticulaire proche de polyribosomes
3. Figure de type myéloïde proche de la paroi
4. Réticulum endoplasmique en connection avec un plasmodesmme. Présence d'amyloplastes
et de mitochondries
5. Dépôt de matériel au niveau de la paroi
A : amyloplaste; 1 : invagination du plasmalemme; p : profil de réticulum endoplasmique; m :

mitochondrie; P : paroi; Pd : plasmodesme; PR : polysomes; REG : réticulum endoplasmique
granulaire; V : vacuole.
2.3- Conclusion
Les figures de type myéloïde et le réticulum endoplasmique granulaire très vésiculé sont
des figures typiques souvent observées lors d'un stress (LOPEZ-CARBONELL et al., 1994). Une
hypothèse plausible pourrait être que l'enrichissement en sucre dans le milieu provoque un
stress osmotique sur le cal.
Cependant, malgré ces caractéristiques structurales, il apparaît que le saccharose mime
l'action du 2,4-D :
• l'initiation de l'embryogenèse se déroule de façon équivalente sur les milieux
d'initiation;
• l'augmentation de la concentration en sucre ou en auxine entraînent toutes deux une
élévation du degré de différenciation des cellules en éléments xylémiques.
Il est important de noter que les milieux contiennent du charbon actif. Or, il est
maintenant établi que le charbon adsorbe le 2,4-D (EBERT et TAYLOR, 1990). D'autres
composés du milieu peuvent interagir avec l'auxine et modifier son adsorption. On peut donc
se demander si l'augmentation de la concentration en saccharose ne modifierait pas cette
adsorption, l'effet observé sur l'initiation de l'embryogenèse serait alors indirect et dû à une
augmentation de la concentration en 2,4-D libre.
Dans un premier temps, nous avons étudié l'influence du saccharose sur le devenir du
2,4-D libre en présence de charbon actif.
3- L'AUGMENTATION DE LA CONCENTRATION EN SACCHAROSE

MODIFIE-T-ELLE L'EQUILIBRE D'ADSORPTION DU 2,4-D SUR LE
CHARBON ACTIF?
Afin de répondre à cette question, nous avons suivi l'évolution de l'équilibre 2,4-D
libre/2,4-D adsorbé par le charbon actif par des dosages du 2,4-D libre avant la mise en
culture, dés le premier jour de la fabrication des milieux après l'autoclavage jusqu'au ISe jour
après la fabrication des milieux, date à laquelle les milieux sont normalement utilisés pour la
mise en culture. Cette période de 15 jours correspond au temps nécessaire à la réalisation de
l'équilibre 2,4-D libre/2,4-D adsorbé par le charbon (VERDEIL, 1993).
Cette étude a été poursuivie, après mise en culture des cals, en comparant des cals placés
sur milieu enrichi en saccharose, sur milieu enrichi en 2,4-D et sur milieu de multiplication
standard.
121
TABLEAU 16 : Evolution de la concentration en 2,4-D exogène
les dosages ont été réalisés entre le jour de la fabrication des milieux après autoclavage et le 15e jour, date à
laquelle les milieux sont normalement utilisés pour la mise en culture. les résultats sont exprimés en mg.r'
Milieux (1) Temps Gours)

0 1 7 14 15
M60 0,0528 ab 0,0375 a 0,0792 ab 0,0899 ab 0,0540 ab
M60/120 0,0518 ab 0,0490 ab 0,0882 ab 0,1470 b 0,0620 ab
MIlO 0,0438 a 0,1430 b 0,0557 ab 0,0360 a 1,0900 c
(1) Les concentration initiales en 2,4-0 en présence de 2 g.r' de charbon actif dans les milieux sont les suivantes:
- M6D, milieu de multiplication et M6D/120, milieu d'initiation enrichi en saccharose: 60 mg.r' de 2,4-0
- M11 0, milieu d'initiation enrichi en 2,4-0 : 110 mg.r' de 2,4-0
Les lettres, à côté des valeurs, représentent les groupes des moyennes significativement différents au seuil de 5%
selon le test de Newman et Keuls.
TABLEAU 17 : Evolution de la concentration en sucres, de la pression osmotique

et du pH des milieux
les dosages ont été réalisés entre le jour de la fabrication des milieux après autoclavage et le 15e jour, date à
laquelle les milieux sont normalement utilisés pour la mise en culture
Milieux (1) Temps Gours)

TO TO Tl Tl5
avant autoclavage après autoclavage
l
Evolution de la concentration en glucose (g.r )
M60 0 1,306 a 1,340 a 1,398 a

M60/120 0 3,630 b 3,046 c 5,033 d
MIlO 0 1,280 a 1,280 a 1,305 a
l
Evolution de la concentration en fructose (g.r )
M60 0 1,385 a 1,288 a 1,381 a

M60/120 0 3,133 b 3,039 b 4,756 b
MIlO 0 1,259 a 1,239 a 1,285 a
l
Evolution de la concentration en saccharose (g.r )
M60 30 28,340 a 28,570 a 28,490 a

M60/120 120 72,110 b 68,900 b 73,580 b
MIlO 30 28,210 a 28,580 a 29,060 a
I
Evolution de la PO (mmosm.kg- )
M60 184 181,75 a 188,25 a 183,50 a

M60/120 355 359,25 b 347,75 b 519,00 c
MIlO 184 185,75 a 199,75 a 183,00 a
Evolution du pH
M60 5.00 5,40 a 5,48 a 5,57 a
M60/120 5.00 5,33 a 5,46 a 4,94 b
MIlO 5.00 5,48 a 5,54 a 5,60 a
(1) Les concentration initiales en 2,4-0 en présence de 2 g.r' de charbon actif dans les milieux sont les suivantes:
- M60, milieu de multiplication et M60/120, milieu d'initiation enrichi en saccharose: 60 mg.r' de 2,4-0
-:M110, milieu d'initiation enrichi en 2,4-0 : 110 mg.r' de 2,4-0
Les lettres, à côté des valeurs, représentent les groupes des moyennes significativement différents au seuil de 5%
selon le test de Newman et Keuls.
l
La concentration en 2,4-D après autoclavage est en moyenne de 0,05 mg.r alors qu'elle
l l
est initialement de: 60 mg.r (M60 et M60/120) ou 110 mg.r (MIlO) (tableau 16).
La concentration en auxine n'évolue pas de façon significative jusqu'à T14. Sur milieu
l
enrichi en 2,4-D, elle augmente fortement entre T14 et T15 en passant de 0,05 mg.r à
1 mg.l- I . Sur milieu de multiplication et sur milieu enrichi en saccharose, le niveau de 2,4-D
est équivalent; aucune différence significative n'est observée au cours du temps.
CONCLUSION:
Presque la totalité du 2,4-D est adsorbée par le charbon actif. De plus, l'augmentation de la
concentration en saccharose ne modifie ni le taux d'adsorption du 2,4-D sur le charbon ni
l'équilibre d'adsorption au cours du temps. On ne peut donc pas conclure qu'elle entraîne une
augmentation de la concentration en 2,4-D libre à l'origine de l'initiation de l'embryogenèse.
4- EVOLUTION DES AUTRES PARAMETRES DU MILIEU
Pendant le temps nécessaire à la réalisation de l'équilibre d'adsorption, nous avons

vérifié si des modifications étaient observées au niveau de la concentration en saccharose des
milieux.
Nous avons également effectué des mesures de la pression osmotique et du pH du
milieu, deux paramètres dont l'évolution est étroitement liée à celle du niveau en sucre et de
l'auxine (GEORGE et SHERRINGTON, 1984).
Nous avons considéré trois dates de prélèvement : 0, 1 et 15 jours après la fabrication
des milieux.
4.1- Sucres
A TO, date de fabrication des milieux mais après autoclavage, les milieux M60 et MIlO
l
ont une teneur en saccharose pratiquement égale à la concentration initiale de 30 g.r .
l l
Cependant, on ne retrouve pas les 120 g.r initiaux du milieu M60/120, mais environ 73 g.r
(tableau 17). Ensuite, la concentration du sucre n'est pas modifiée.
Nous avons vérifié si la moins forte concentration en saccharose mise en évidence après
autoclavage n'est pas due à la technique de dosage utilisée (méthode colorimétrique de FISHER
et KHOTES (1951)) qui aurait pu montrer des limites de détection. Cependant, ce résultat a été
confirmé en utilisant une technique de dosage différente, la technique enzymatique de
BERGMEYER et BERNT (1974).
Cette technique permet de doser le saccharose et ses deux produits d'hydrolyse le
glucose et le fructose. Or, en utilisant cette technique, nous avons détecté la présence des deux
sucres réducteurs dans le milieu après autoclavage. Les concentrations en glucose et fructose
123
EFFET DE LA CONCENTRA T/ON EN SACCHAROSE
l
sont équivalentes, elles sont d'environ 1.3 g.r sur M60 et MIlO et 3.6 g.r l sur M60/120.
Cette teneur n'est pas différente entre les dates de prélèvement sur M60 et MilO, en revanche
elle augmente légèrement entre Tl et T15 sur M60/120 (tableau 17).
4.2- Pression osmotique

Sur milieu de multiplication et milieu enrichi en 2,4-D, la pression osmotique reste
stable entre TO et T15 (tableau 17).
Du fait de la plus forte concentration initiale en sucres sur milieu M60/120, la pression
osmotique est environ 2 fois plus élevée que sur les deux autres milieux (où elle est en
moyenne de 180 mg.r l ). A T15, elle devient 3 fois plus élevée du fait de l'augmentation de la
concentration en sucres exogènes (glucose et fructose) à la même date.
4.3- pH
Le pH des milieux M60 et MIlO montre une évolution équivalente sans différence
significative entre les trois dates de prélèvement (tableau 17).
Sur milieu M60/120, le pH est stable entre TO et Tl puis diminue fortement à T15. Il est
significativement moins élevé que sur les deux autres milieux.
4.4- Conclusion
La moins forte concentration en saccharose mise en évidence après autoclavage n'est
pas due à la technique de dosage car ce résultat est confirmé par deux techniques différentes.
Certaines études suggèrent que le saccharose pourrait être adsorbé sur le charbon actif.
Cependant, si une telle hypothèse était possible, il paraît étonnant qu'on ne retrouve pas le
même résultat sur les deux autres milieux dont la concentration en saccharose n'apparaît pas
modifiée.
Une partie du saccharose est hydrolysée en glucose et fructose, comme le montre la
présence de glucose et fructose à TO après autoclavage (environ 3 g.r l de chaque sucre, soit
environ 5% de la concentration initiale en saccharose). Il est maintenant établi qu'après
autoclavage, le saccharose des milieux est partiellement hydrolysé (GEORGE et SHERRINGTON,
1984). La présence de charbon actif augmente le taux d'hydrolyse pendant l'autoclavage, ce
taux augmente également avec la concentration en saccharose dans les milieux (BÜTER et al.,
1993; DRUART et DE WULF, 1993). L'hydrolyse peut représenter jusqu'à 10% de la
concentration initiale en saccharose. Cependant, les très faibles concentrations des deux sucres
réducteurs ne permettent d'expliquer qu'en partie la diminution observée. Les mêmes études
suggèrent que le saccharose pourrait être dégradé en d'autres composés, tels que les composés
furfuraux, pendant l'autoclavage (DRUART et DE WULF, 1993). Comme l'hydrolyse, le taux de
dégradation augmente avec la concentration du sucre dans les milieux.
124
EFFET DE LA CONCENTRATION EN SACCHAROSE
...... 4
100, 0~
~ '-' GAIN
E :s
'-'
80 =
CI
a a a
CI
2
.c
~
-CI .. c:
CI
..
!Il
60 :s
-
CI CI
c:
~
:; cd CI 0
=
E 40 .!
CI cd cd CI
~ b b
~
c:
c: -2
's 20
:! J b
PER~
t.:l
°5 -4 1 1 1 1 1 1
14 21 28 35 42 49 56 ;> 0 7 14 21 28 35 42 49 56
TempsG) Temps G)
Figure 36 : Gain ou perte de teneur en eau

Figure 35 : Croissance en matière sèche
des cals
des cals
... milieu d'initiation MIlO
... milieu d'initiation MilO
o milieu d'initiation M60/120 o milieu d'initiation M60/120
Chaque point représente la moyenne de 4 mesures indépendantes. Les points suivis de la même lettre ne sont pas
600
61
bc
c
5.5 c
b 1=~E 400
Q: b !Il
C. 5 b Q
a
b E a
'-' a
4.5
4J 1 1 1
1~ 2~1 ----: ~ 1
0 14 28 42 56 0 14 28 42 56
Temps (j) TempsG)
Figure 37 Evolution du pH dans les Figure 38 Evolution de la pression

milieux osmotique dans les milieux
• milieu de multiplication • milieu de multiplication
M60 M60
.Â milieu d'initiation MilO .Â milieu d'initiation MIlO
o milieu d'initiation o milieu d'initiation
M60/120 M60/120
125
Cette dernière hypothèse pennettrait d'expliquer les différences observées à TO.

Cependant, elle ne pourrait être vérifiée que par l'utilisation d'éléments marqués en suivant
leur évolution au cours du temps ou par dosage des composés furfuraux après autoclavage en
présence et en absence de charbon actif.
Même si une partie du saccharose est hydrolysée et dégradée, l'initiation de
l'embryogenèse est bien due à une augmentation de la concentration en saccharose. Nous
avons vu que cette augmentation n'agissait pas en modifiant la teneur en 2,4-D exogène avant
la mise en culture.
Quel peut alors être son effet? Pourrait-il agir par un effet osmotique comme pourrait le
suggérer la présence de figures de stress observées en microscopie électronique? Afin de
compléter nos études, nous avons suivi le comportement des cals et des paramètres du milieu
sous l'effet de l'enrichissement en saccharose exogène.
5- EVOLUTION DES CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES DES CALS ET

DES PARAMETRES DES MILIEUX APRES LA MISE EN CULTURE
L'étude a été réalisée avec la lignée de cals de type l, L7. La croissance des cals a été
étudiée et leur teneur en eau analysée. En parallèle, l'évolution des paramètres du milieu, pH,
pression osmotique et sucres, a été suivie après la mise en culture. Enfin, la composition en
sucres solubles des cals a été analysée.
5.1- Modalités de croissance

La croissance devient significativement supérieure à partir de T7 sur milieu enrichi en
sucre (Fig. 35).
5.2- Teneur en eau

La teneur en eau est équivalente sur milieu de multiplication et milieu d'initiation
enrichi en 2,4-D. En revanche, une diminution significative est observée sur milieu d'initiation
enrichi en saccharose (Fig. 36).
5.3- pH des milieux après la mise en culture

Entre TO et T28, le pH est équivalent sur milieu de multiplication et milieu d'initiation
enrichi en 2,4-D (env. de 5.5 à TO). Il devient plus acide à partir de T28 sur ce dernier.
Il est significativement moins élevé à TO sur milieu enrichi en saccharose (env. de 4.9 à
TO). Il augmente entre TO et Tl4 pour devenir équivalent à celui du milieu M60 (Fig. 37).
126
5.4- Pression osmotique des milieux après la mise en culture

La pression osmotique est deux fois plus importante sur milieu enrichi en saccharose
(env. 500 mosm.kg- 1) que sur milieu de multiplication et milieu d'initiation enrichi en 2,4-D.
Elle reste stable pendant toute l'analyse (Fig. 38).
5.5- Sucres des milieux après la mise en culture

Sur chaque milieu, nous avons considéré la différence entre la concentration en sucre
sur chaque répétition représentant chaque niveau de traitement « milieu x date de
prélèvement» (n=4) et la concentration moyenne à TO. Comme dans le chapitre précédent,
cette différence sera définie comme étant l'absorption de chaque composé par les cals.
L'absorption en glucose et fructose apparaît négligeable sur les trois milieux et les
valeurs négatives observées pourraient même témoigner d'un relargage par les cals (Fig. 39 a
et b).
L'absorption en saccharose est équivalente sur les trois milieux entre TO et T14, ensuite
elle devient plus importante sur milieu enrichi en sucre. A T60, le taux de saccharose absorbé
est environ 3 fois plus élevé sur ce milieu (Fig. 39 c).
CONCLUSION:
La présence de glucose et fructose est due en partie à 1'hydrolyse du saccharose après
autoclavage, comme nous l'avons vu précédemment. Cependant, elle pourrait être due à une
hydrolyse extracellulaire du saccharose en début de culture comme le suggèrent d'autres
études (GEORGE ET SHERRINGTON, 1984).
Le saccharose pourrait être préférentiellement utilisé par les cals à l'inverse des deux sucres
réducteurs qui ne semblent pas absorbés par les cals. En particulier, les fortes valeurs
négatives observées pour les deux sucres sur milieu enrichi en saccharose pourraient
correspondre à un relargage par les cals, mais aussi à une hydrolyse extracellulaire plus
importante du saccharose que sur les deux autres milieux, et qui pourrait être due à un excés
de sucre exogène.
5.6- Composition en sucres solubles des cals

Trois sucres ont été détectés: saccharose, glucose, et fructose.
Les teneurs de chacun des trois sucres sont équivalentes sur milieu de multiplication et
milieu d'initiation enrichi en 2,4-D.
Sur milieu enrichi en sucre, les teneurs en glucose et fructose deviennent environ 7 fois
plus élevées à T14. Stables jusqu'à T28, elles diminuent fortement pour devenir équivalentes
à celle observée au sein des cals placés sur les deux autres milieux à T60 (Fig. 40 a et b). La
teneur en saccharose reste stable; à T28, elle est 3 fois plus faible que pour les cals placés sur
les deux autres milieux, pour lesquels une forte augmentation est observée (Fig. 40 c).
127
EFFET DE LA CONCENTRA T/ON EN SACCHAROSE
2
ŒJ- - -
-1
-
..!.
DJl
0
-2
- - - - - - - a- - - - - - - --
~ E a a a
E -2 '-"
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w
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fil -4
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c C c;
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(:3 "'" c
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'*' -8
c
c
-8 -10
0 14 28 42 56 0 14 28 42 56
Temps G) TempsG)
60 ~
-.
~ 40
b
E
'-"
W
fil
=
"'"
~
d
-=
c;
c; 20 ~d
~
ri)
14 28 42 56
TempsG)
Figure 39 : Absorption du glucose (a), du fructose (b) et du saccharose(c) par les cals
.Â milieu d'initiation MIlO
o milieu d'initiation M60/120
128
EFFET DE LA CONCENTRATION EN SACCHAROSE
250...,-------------------, _ 250-,---------;=;---------------,
'Û' ŒJ ~U ŒJ b
U
-= 200
~ ~ ,~ 200
rIl
o
U
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U
..
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f- Co 50 f- Co 50
-
a 011
011
E a a
g
0+1---+1---+1---+1----11 0+1---+1----+------+1----11
o 14 28 42 56 0 14 28 42 56
Temps 0> Temps 0>
600
'Û' @J b
~'5
O-u
.. rIl
d bd
-= ,;U
(t
U ._ 400
u-
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E
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; 011 200
U ..
C (t ac
U Co
f-OII
-
E
0
0 14
c
28 42 56
Temps (j)
Figure 40: Evolution des teneurs en sucres solubles - glucose (a), fructose (b) et saccharose(c)-
au sein des cals, en pourcentages de matière sèche.
.... milieu d'initiation MIlO
o milieu d'initiation M60/120
129
5.7- Conclusion
Sur milieu enrichi en saccharose, une forte absorption en saccharose a été mise en
évidence à partir du 7e jour de culture. L'apport supplémentaire de saccharose entraîne
également des modifications dans les teneurs en sucres endogènes : une forte augmentation de la
teneur en glucose et fructose entre TO et T14 reliée à une diminution régulière de la teneur en
saccharose. Ces modifications pourraient être en relation avec la croissance significativement
plus importante des cals observée sur ce milieu. En effet, l'enrichissement en sucres
correspond à l'apport de substrats métaboliques et énergétiques supplémentaires favorables à
la croissance des tissus (GEORGE et SHERRINGTON, 1984). En revanche, la teneur en eau
diminue. De façon générale, il est maintenant établi que l'enrichissement en sucre exogène
peut entraîner une augmentation du taux de déshydratation des cals ou des tissus en culture; ce
qui pourrait correspondre à un stress hydrique et osmotique.
6- CONCLUSION
L'augmentation de la concentration en saccharose permet l'initiation de l'embryogenèse

en présence d'une concentration en 2,4-D qui est normalement utilisée pour la multiplication
des cals. Dans le cas du cocotier, ce résultat est d'autant plus intéressant car il pourrait
permettre d'améliorer le procédé de régénération en limitant les risques liés à l'utilisation de
fortes concentrations en 2,4-D connues pour favoriser l'apparition de vitrovariations.
L'effet du saccharose n'est pas un effet indirect qui consisterait à modifier l'adsorption
du 2,4-D sur le charbon actif, ce qui aurait entraîné une augmentation de la concentration en
auxine libre à l'origine de l'initiation de l'embryogenèse.
Différentes observations pourraient permettre de conclure que l'enrichissement en
saccharose agit, par effet osmorégulateur et/ou en tant que substrat énergétique.
La première observation est la pression osmotique élevée des milieux, la diminution
significative de la teneur en eau et l'observation cytologique. Cette dernière montre la
présence de structures cellulaires particulières sur milieu enrichi en saccharose : figures
myéloïdes et réticulum endoplasmique granulaire développé. Ces structures sont typiques
d'un stress (DAVIS et BREZEANU, 1979; LOPEZ-CARBONELL et al., 1994). On peut se demander
si un tel phénomène de stress, en particulier un stress osmotique qui serait provoqué par
l'augmentation de la concentration en sucre, est en relation directe avec l'initiation de
l'embryogenèse. C'est ce que nous verrons dans la discussion.
La seconde observation est la forte absorption en saccharose et les modifications au
niveau de la teneur en sucres endogènes. Elles sont à mettre en parallèle avec (l)
l'accumulation des réserves amylacées et protéiques au sein des cellules embryogènes,
130
(2) l'épaississement des parois pectocellulosiques et (3) le dépôt important de composés

polysaccharidiques fonnant un mucilage en périphérie des cals. Toutes ces modifications
tendent à indiquer que le saccharose favorise également l'embryogenèse en pourvoyant aux
besoins plus importants en composés métaboliques (et énergétiques) montrés au cours du
chapitre précédent en condition d'embryogenèse. Il pourrait agir comme substrat métabolique
et énergétique.
La suite de nos études a portée sur la recherche de marqueurs dits qualitatifs, tels que les
marqueurs moléculaires ou protéiques, qui seraient spécifiques du processus embryogène. La
recherche d'un marqueur protéique précoce de 50 kDa fait l'objet de l'étude présentée dans le
chapitre IV.
131
MARQUEURS PROTEIQUES PRECOCES
- C~IT:RE I"V"-
RECHERCHE DE MARQUEURS PROTEIQUES PRECOCES DE
L'EMBRYOGENESE SOMATIQUE EN MILIEU SOLIDE
INTRODUCTION: INTERET DE RECHERCHER DES MARQUEURS

PROTEIQUES PRECOCES DE L'EMBRYOGENESE
La détermination de marqueurs précoces, telles que des protéines spécifiques de

l'embryogenèse, a permis la caractérisation et l'optimisation des conditions d'initiation de
l'embryogenèse chez de nombreuses espèces (SUNG et OKIMOTO, 1981; STIRN ET JACOBSEN,
1987, 1990; HILBERT et al., 1992; KIYOSUE et al., 1992; ALTHERR et al., 1993). Cette
approche serait particulièrement intéressante pour la régénération des plantes récalcitrantes,
tel que le cocotier. Deux types de marqueurs seraient intéressants:
• des marqueurs qui permettent de déterminer la compétence des explants envers

l'embryogenèse avant l'initiation du processus morphogénétique.
Ce qui permettrait tout d'abord de contourner les problèmes de la lenteur des évènements
morphogénétiques qui caractérise l'embryogenèse chez cette plante. Nous rappelons qu'il
faut attendre 4 mois environ entre la mise en culture de l'expIant et l'apparition des
premiers cals, 6 mois pour l'obtention d'embryons somatiques et deux ans pour la
formation de plantules.
Ensuite, l'existence de marqueurs à caractère prédictif permettrait également de choisir
rapidement les tissus les plus aptes à l'embryogenèse. En effet, la recherche de lignées de
cals à potentialités embryogènes pour les espèces récalcitrantes nécessite de tester un grand
nombre de conditions de culture différentes et d'explants de tissus d'origine variée.
• des marqueurs spécifiquement exprimés au cours des premiers stades de l'initiation de

l'embryogenèse. Nous avons vu dans les chapitres précédents que les cals, s'ils ont de
fortes potentialités embryogènes, présentent une hétérogénéité dans leur orientation vers
l'embryogenèse. Certains cals restent à l'état méristématique même lorsque le stimulus
nécessaire à son initiation a été appliqué (augmentation de la concentration en 2,4-D ou en
saccharose). Il serait donc intéressant de rechercher des marqueurs qui pennettent
d'« étiqueter» les cals bien orientés vers l'embryogenèse quel que soit le type de lignée
considéré
132
Ces études pennettraient le développement d'un système de régénération basé sur le tri,
1'« étiquetage» et la sélection d'un matériel végétal ne répondant qu'aux marqueurs
considérés. Cette étude a été initiée dans le cadre du programme européen STD3 et nous
présentons ici les premiers essais réalisés dans le laboratoire du Professeur Jacobsen à
Hanovre.
1- DESCRIPTION DU MARQUEUR SELECTIONNE
Au laboratoire du Professeur Jacobsen de l'Université d'Hanovre, une protéine de 50

kDa, spécifique des stades précoces de l'embryogenèse somatique, a été recherchée en
utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre une protéine cytosolique spécifique de
l'embryogenèse chez le pois (STIRN ET JACOBSEN, 1987, 1990; ALTHERR et al., 1993). Après
vérification avec l'anticorps monoclonal qui lui est spécifique, la protéine de 50 kDa s'avère
présente chez d'autres espèces dicotylédones, comme la carotte, le tabac ou le soja et
monocotylédones, essentiellement les graminées comme le blé ou le maïs (ALTHERR et al.,
1993).
Ce marqueur est présent dans les tissus à potentialités embryogènes et peut être détecté
avant l'expression du processus morphogénétique. De plus, il est spécifique des stades
précoces de l'embryogenèse somatique: en effet, sa teneur augmente au cours de l'initiation
de l'embryogenèse puis il n'est plus détecté dans les stades ultérieurs. Ce n'est pas un simple
marqueur de l'état méristématique car il n'est pas détecté au sein des tissus non embryogènes,
en particulier au sein de suspensions cellulaires non embryogènes à fort potentiel mitotique.
Ce marqueur serait une protéine localisée dans le noyau et pourrait appartenir aux protéines
non-histones. La fonction de cette protéine est encore inconnue. Cependant, ALTHERR et al.
(1993), suggère qu'elle pourrait être impliquée dans la régulation d'un gène spécifique de
l'embryogenèse. Cette protéine présente deux caractéristiques intéressantes :
• son expression pourrait dépendre de la concentration eu auxine exogène. Sa teneur
augmente fortement au sein de protoplastes de pois cultivés pendant 6h. en présence
de 0,5 IlM de 2,4-D ou 10 IlM de Picloram ;
• sa teneur augmente après un choc de température (45°C pendant 2 à 4 h.) appliqué
sur les tissus de pois en culture.
Dans la mesure où ce marqueur présente peu de spécificité envers les espèces végétales,
d'une part, et où il est spécifique de la compétence à l'embryogenèse, d'autre part, nous avons
décidé de le rechercher au sein des tissus de cocotier.
133
66
50 KDa
45
31
24
21
234 567 8 9 P M
- <--
M 123456789
Figure 41 : Profil d'électrophorèse monodimensionnelle des protéines solubles totales

des cals de cocotier (a) et recherche d'un polypeptide de 50 KDa par
immunodétection (anticorps monoclonal) (b)
1 à 4 : lignées de cals embryogènes en condition de multiplication (l et 3)
et en condition d'initiation de l'embryogenèse (2 et 4); 1 et 2 : lignée de
type II; 3 et 4 : lignée de type 1
5 à 8 : lignées de cals non embryogènes placées en condition de
multiplication (5 et 7) et en condition qui normalement correspond à
l'initiation de l'embryogenèse pour des lignées de cals embryogènes (6 et
8); 5 et 6 : lignée de type II; 7 et 8 : lignée de type 1
9 : Cal primaire
P : témoin, extrait protéique de pois
M : marqueur de bandes (BSA)
2- RECHERCHE DE CE MARQUEUR DANS LES TISSUS DE COCOTIER
Nous présentons ici les résultats préliminaires obtenus au cours d'un stage effectué au
laboratoire du Professeur Jacobsen, afin de rechercher la présence éventuelle du marqueur de
50 kDa au sein des tissus de cocotier.
Différents types de tissus ont été comparés:

• des cals d'une lignée de type l (L7) et d'une lignée de type II (L82) placées soit sur milieu
de multiplication soit sur milieu inducteur de l'embryogenèse;
• des cals de lignées « non embryogènes » L2 et L83. Ces deux lignées ont été choisies car
elles sont du même type tissulaire que respectivement L7 et L82; cependant, l'initiation de
l'embryogenèse n'a jamais été observée sur ces deux lignées même sur milieu enrichi en
2,4-D;
• un cal primaire peu après son isolement sur expIant inflorescentiel.
2.1- Etude du profil protéique en électrophorèse monodimensionnelle

Trois gels représentant trois répétitions de chaque type de cals testé ont été réalisés. Le
profil protéique montre la présence de différentes bandes polypeptidiques majoritaires, dont
une bande correspondant à un poids de 50 kDA. Les résultats sont présentés dans la figure 41.
2.2- Westemblott et application de l'anticorps monoclonal

Après transfert des polypeptides sur membrane de nitrocellulose, l'anticorps spécifique
du polypeptide de 50 kDa de pois a été appliqué. Une très faible reconnaissance de deux
bandes électrophorétiques a été détectée. Ces bandes correspondent à deux polypeptides, celui
de 50 kDa et un deuxième de poids plus faible 24 kDa. Ces bandes correspondent aux
protéines extraites des cals de la lignée L7 en condition de multiplication et en condition
d'initiation de l'embryogenèse.
3- CONCLUSION
Les essais réalisés ne permettent pas de conclure à la détection effective de la protéine de

50 kDa et montrent l'importance de comparer un plus grand nombre de tissus et de cals
in vitro. La non détection du marqueur est-elle liée au caractère récalcitrant du cocotier?
Différentes hypothèses peuvent être émises quant à l'absence de détection du marqueur
recherché.
135
La première possibilité est que ce marqueur est présent et exprimé mais que la structure
de la protéine ou de son gène présente une très faible homologie avec celle de la protéine de
pois. Il faut noter qu'un anticorps monoclonal reconnait un site très restreint d'une protéine
(ou épitope) et qu'un seul site d'acide aminé modifié peut entraîner l'absence de fixation de
l'anticorps. Cette hypothèse d'une structure modifiée de la protéine pourrait expliquer, chez
L7, la très faible reconnaissance de la bande de 50 kDa mais aussi celle d'une bande de
24 kDa, qui pourrait correspondre à une autre forme de la protéine; en revanche, elle
n'explique pas l'absence totale de reconnaissance chez L82.
La deuxième hypothèse est que le marqueur est trop faiblement exprimé pour être
détecté. Le marqueur, dont le niveau d'expression dépend de la concentration en auxine
exogène chez le pois, n'est détecté ni sur milieu de multiplication ni sur milieu d'initiation de
l'embryogenèse qui possède une plus forte concentration en 2,4-D. Cette absence
d'expression pourrait alors être liée au caractère très récalcitrant du cocotier envers
l'embryogenèse et la régénération. Les lignées testées sont compétentes pour l'embryogenèse,
cependant, nous avons suggéré qu'au sein d'une même lignée, certains cals retournent à l'état
méristématique au stade de la proembryogenèse après avoir initié le processus embryogène.
Ce qui laisse suggérer l'implication de processus biochimiques complexes. Il est établi que
l'expression des gènes ou des protéines spécifiques de l'embryogenèse dépend d'une
reprogrammation génétique adéquate plus ou moins sous le contrôle des hormones ou autres
facteurs exogènes, qui amène les cellules totipotentes vers la différenciation.
La troisième hypothèse est que le gène de ce marqueur n'est tout simplement pas
présent chez le cocotier. Cependant, l'expression de ce marqueur étant spécifique du
processus embryogène, il paraît étonnant que la protéine ou son gène soit totalement absent
chez le cocotier qui montre des capacités évidentes à l'embryogenèse même en faible
pourcentage.
Les deux premières hypothèses semblent les plus probables. Dans les deux cas, il
apparaît nécessaire, d'une part de vérifier à nouveau la présence du marqueur de 50 kDA en
comparant un plus plus large éventail de tissus ou cals à potentialités embryogènes, et d'autre
part de rechercher des marqueurs protéiques précoces, mais qui soient dans un premier temps
spécifiques du processus embryogène chez le cocotier.
136
PARTIE /- DISCUSSION
PARTIE 1 - DISCUSSION
L e but de l'approche analytique développée dans cette première partie était de mieux
comprendre les conditions d'initiation de l'embryogenèse somatique chez le cocotier.
Nos études ont porté sur la mise en évidence des facteurs nutritifs impliqués lors de ce
phénomène.
1- BESOINS NUTRITIFS ET CHANGEMENTS PHYSIOLOGIQUES SPECIFIQUES

LORS DE L'INITIATION DE L'EMBRYOGENESE SOMATIQUE
Par l'étude histocytologique, nous avons distingué deux phases dans l'évolution des
cals:
Q une phase pendant laquelle les cellules méristématiques effectuent d'importants remaniements
structuraux et infrastructuraux qui les conduisent à la formation des cellules embryogènes
(entre TO et T15 sur milieu d'initiation) ;
Q une phase pendant laquelle les cellules embryogènes accumulent des réserves protéiques et
amylacées, et se divisent pour donner des proembryons (entre T15 et T60).
Des besoins nutritifs différents ont été associés à ces deux phases à que nous exposerons.
Se pose le problème de la spécificité de ces facteurs et de leur signification physiologique.
La phase de différenciation des cellules embryogènes est tout d'abord caractérisée par
une activation de la protéosynthèse. En effet, une augmentation de la teneur en protéines
solubles a été observée au sein des cals. Ce résultat est à mettre en relation avec certains
changements infrastructuraux mis en évidence au microscope électronique très précocement
au cours de la différenciation des cellules embryogènes : émission de micronucléoles au sein
du noyau et augmentation du nombre de ribosomes qui laissaient présager une synthèse active
de protéines. Ce résultat confirme les résultats obtenus sur d'autres lignées de cals de cocotier
(VERDEIL, 1993). Il confirme également les résultats de nombreux auteurs qui ont étudié les
phénomènes biochimiques reliés à l'embryogenèse somatique. Ainsi, chez le tabac (THORPE,
1980) et chez la carotte (FUJIMARA et KOMAMINE, 1982; KAMADA et HARADA, 1982), il a été
observé une augmentation de la teneur en protéines au sein des cals en phase d'initiation de
l'embryogenèse.
137
PARTIE 1- DISCUSSION
La phase de différenciation des cellules embryogènes est aussi caractérisée par une
teneur en sacharose plus importante au sein des cals en condition d'initiation de
l'embryogenèse qu'en condition de multiplication. Ces données expérimentales pourraient
être mises en relation avec l'isolement des premières cellules embryogènes, caractérisé par une
gélification de la lamelle moyenne et par des modifications au niveau des parois
pectocellulosiques : fermeture des plasmodesmes et dépôt de matériel golgien sur la paroi
après fusion des vésicules avec le plasmalemme. Certains auteurs ont montré que ces
modifications requièrent la synthèse de composés polysaccharidiques extracellulaires
supplémentaires (YEUNG, 1995). L'augmentation de la teneur en saccharose pourrait
également être en relation avec la synthèse des premières réserves amylacées au 15e jour de
culture. Le maintien d'un certain niveau en composés carbonés solubles au sein des tissus
pourraient permettre de les synthétiser.
La phase de formation des proembryons est caractérisée par des besoins en glucose,
nitrate et phosphate dans les milieux plus importants et très corrélés. Ces besoins sont
concomitants avec l'augmentation de la protéosynthèse, qui continue pendant cette phase,
alors que la teneur en saccharose diminue. Ces changements ont été mis en évidence
essentiellement entre le 15e et 28e jour de culture, période pendant laquelle les cellules
embryogènes ne se divisent pas mais accumulent des réserves protéiques et amylacées.
Cependant, le facteur sans doute le plus marquant est que les deux phases, mises en
évidence par l'étude histologique, sont caractérisées par des différences dans la nature et les
teneurs en acides aminés au sein des cals. L'analyse de la composition en acides aminés a
permis la révélation d'une hétérogénéité du comportement des cals envers le stimulus
initiateur de l'embryogenèse (augmentation de la concentration en 2,4-D). Si les cals
apparaissent homogènes pendant la phase de formation des cellules embryogènes, deux types
de comportement des cals existent au moment de l'orientation vers la proembryogenèse :
• augmentation des teneurs en acides aminés pour les cals qui s'orienteraient vers la
proembryogenèse ;
• diminution globale des teneurs en acides aminés des cals qui retourneraient à l'état
méristématique. Ces derniers montrent alors des niveaux équivalents à ceux des cals en
multiplication.
Ce résultat est d'autant plus important qu'il a été obtenu sur une lignée dont les cals sont
très homogènes de par leur structure et leur croissance : les cals de type II. En condition de
multiplication, ces cals sont également homogènes dans la consommation des principaux
nutriments et dans leur composition en acides aminés.
138
2- LES TENEURS EN ACIDES AMINES ENDOGENES PEUVENT-ELLES

CONSTITUER DES MARQUEURS DE L'ORIENTATION VERS
L'EMBRYOGENESE ?
La notion de marqueur recouvre deux aspects : ce marqueur doit être spécifique de

l'initiation du processus embryogène et doit pouvoir discriminer les cals qui s'orientent vers
l'embryogenèse des cals non embryogènes. De façon générale, les acides aminés sont
considérés comme des marqueurs physiologiques des processus d'organogenèse et de
différenciation. En effet, THORPE (1983) a montré une accumulation de proline, sérine et
thréonine au moment de la formation de bourgeons sur des cals de tabac. De même, la sérine
disparaît au sein des tissus de ricin au cours de la différenciation des fleurs (HALEVY, 1985).
Ce sont en partie les acides aminés qui permettent de discriminer les cals étudiés lors de nos
analyses. Ces variations dans le contenu en acides aminés ont été interprétés comme des
signaux métaboliques de changements morphogénétiques.
Chez la plante entière, MIFLIN et LEA (d'après MOULINEAU, 1994) soulignent que le
dosage des acides aminés à l'intérieur d'un organe donne une vision instantanée de l'état de
cet organe, siège de modifications de synthèses, dégradations et transports vers les autres
parties de la plante.
Qu'en est-il des acides aminés au sein des cals de cocotier?
* Au cours de laformation des cellules embryogènes :

La phase de fonnation des cellules embryogènes est caractérisée par une diminution des
teneurs en proline, valine et sérine.
Si de nombreux auteurs ont montré que l'apport de ces trois acides aminés dans les
milieux pouvaient favoriser l'embryogenèse en tant que source d'azote réduit (GEORGE et
SHERRINGTON, 1984), à notre connaissance, il semble que ce soit la première étude qui pennet
de mettre en relation l'évolution des teneurs de ces trois acides aminés in situ avec les phases
très précoces de l'embryogenèse.
La baisse de la teneur des trois acides aminés est observée parallèlement à
l'augmentation de la teneur en protéines solubles. Celle-ci a été interprétée comme une
augmentation de la protéosynthèse. Parallèlement à ces résultats, l'absorption en composés
azotés exogènes (ammonium et nitrate) est négligeable. Une hypothèse plausible est que la
baisse du niveau en acides aminés pourraient en partie correspondre à des besoins en azote
réduit pour la synthèse de protéines.
139
PARTIe 1- DISCUSSION
La modification de la teneur en sérine pourrait être un signal métabolique très précoce. En

effet, elle caractérise les cals sur milieu d'initiation pendant la première phase et la teneur de
l'acide aminé devient équivalente à celle observée au sein des cals sur milieu de multiplication
pendant la phase de proembryogenèse. Il est intéressant de noter que la sérine pourrait entrer
dans la synthèse du tryptophane qui est un des précurseurs des auxines endogènes (WAREING et
PHILLlPS, 1973; RICHTER, 1993) dont l'implication dans les phases précoces de l'embryogenèse
est encore mal comprise.
* Formation des proembryons :
o orientation vers la Droembryogenèse
Les cals bien orientés vers l'embryogenèse sont caractérisés par une augmentation des
teneurs en proline, valine, et leucine, et le maintien de la teneur en alanine par rapport à la
première phase décrite.
L'augmentation de la teneur en proline est un des signaux les plus importants de l'initiation
de l'embryogenèse somatique. Elle permet à elle seule de discriminer les deux groupes de cals
mis en évidence. Le rôle de la proline au cours de l'embryogenèse est surtout décrit en tant que
source d'azote réduit pour favoriser l'embryogenèse chez de nombreuses espèces (GEORGE et
SHERRINGTON, 1984) et en particulier chez le maïs (CLAPOROLS et al., 1993; VAIN, 1992). Une
augmentation de la teneur en proline a été notée au sein de cals de maïs pendant l'initiation de
l'embryogenèse (CLAPOROLS et al., 1993), mais elle était en relation directe avec la présence de
proline dans les milieux. Ainsi, à notre connaissance, notre étude est la première à relier
spécifiquement une augmentation de la teneur en proline endogène avec l'orientation des cals
vers la proembryogenèse.
CLAPOROLS et al. (1993) suggèrent que cet acide aminé pourrait avoir un rôle très proche
de celui qu'il joue au cours des phénomènes de stress. Cet acide aminé serait utilisé en tant
qu'osmoticum et protecteur des parois cellulaires et des membranes cytoplasmiques (HANDA et
al., 1986; PULICH, 1986; MOULINEAU, 1993) et favoriserait la lutte des cellules contre le stress.
Dans le cas présent, l'augmentation de la teneur en proline pourrait constituer une réponse envers
le stress provoqué par l'augmentation de la concentration en 2,4-D nécessaire pour initier
l'embryogenèse. Cette observation souligne le fait que les auxines pourraient entraîner un
processus très proche des mécanismes de stress, ce qui permettrait l'initiation de l'embryogenèse,
comme le suggère YEUNG (1995). L'initiation de l'embryogenèse s'accompagne d'une
dégénérescence importante d'une partie des cals; seules certaines cellules peuvent lutter contre
ce stress en s'isolant physiquement du reste du cal. Ce qui les conduit à exprimer un nouveau
programme morphogénétique : l'embryogenèse.
140
Nous pourrions interpréter l'isolement des cellules embryogènes puis des proembryons
comme une réaction de défense, et la proline pourrait constituer un marqueur physiologique
particulièrement intéressant de ce phénomène.
L'augmentation des teneurs en proline, valine, leucine, et le maintien de la teneur en
alanine sont concomitants avec l'absorption plus élevée en nitrate. Cette dernière est aussi à
mettre en parallèle avec l'accumulation de réserves protéiques observées au sein des cellules
embryogènes puis des proembryons. Ces observations pourraient permettre d'interpréter
l'augmentation de la teneur en acides aminés comme une synthèse et une accumulation de ces
composés. Celle-ci serait nécessaire pour renouveler la source en azote réduit et permettre la
synthèse de réserves, en particulier de réserves protéiques, au sein des cellules embryogènes puis
des proembryons. L'alanine, la leucine et la valine sont synthétisés à partir du pyruvate, produit
de la glycolyse et la proline provient du métabolisme du cycle citrique. Ils sont donc étroitement
associés au métabolisme respiratoire. On pourrait associer ces résultats à certaines modifications
infrastructurales au sein de la cellule embryogène puis des proembryons : l'augmentation du
nombre de mitochondries et de crêtes mitochondriales observée au voisinage du 28e jour de
culture laisse présager une activation du métabolisme respiratoire, comme cela est aussi suggéré
par certains auteurs (YEUNG, 1995).
Les acides aminés pourraient donc possèder un double rôle :

• un rôle physiologique: indicateur de la réponse des tissus au stress provoqué par le 2,4-D
pour initier l'embryogenèse ;
• un rôle nutritif: synthèse de protéines solubles puis de protéines de réserves.
Les résultats obtenus pourraient être mis en parallèle de ceux obtenus très récemment
chez l'Hévéa par MONTORO et al. (1995). Ces auteurs ont tout d'abord montré que des cals
considérés comme hautement embryogènes possédaient des teneurs plus importantes en
acides aminés libres que des cals modérément embryogènes. De plus, ils ont noté que les
teneurs en acides aminés continuent à augmenter pendant la proembryogenèse jusqu'à la
formation des embryons; ensuite, les teneurs en acides aminés libres diminuent. Ces auteurs
suggèrent que l'enrichissement en acides aminés des cals hautement embryogènes permet de
créer un environnement nutritionnel propice au développement du proembryon puis à
l'embryon par l'accumulation de réserves protéiques.
Au sein des cals de cocotier, selon l'hypothèse que nous avons émise, ce sont la proline,
la valine, la leucine et l'alanine qui seraient majoritairement requis pour la synthèse de
protéines. Il est intéressant de noter que, durant l'embryogenèse zygotique d'autres espèces, les
protéines de réserve des graines contiennent une quantité non négligeable de ces quatre acides
aminés (MOSSE et BAUDET, 1983). De même, l'eau de coco, source nutritive pour l'embryon
zygotique dans la noix, en est également riche, en particulier l'alanine (TULECKE et al., 1961).
141
PARTIE' - DISCUSSION
o retour à l'état méristématigue

Au cours de la différenciation des cellules embryogènes, les cals sont homogènes dans
leurs teneurs en acides aminés. Ils sont également homogènes entre le ISe et 28e jour de
culture dans leurs besoins nutritifs. L'initiation de l'embryogenèse est donc réalisée au sein de
l'ensemble des cals. C'est entre le 28e et le 60e jour de culture que certains cals sont
caractérisés par un retour à l'état méristématique des cellules qui les composent.
C'est la phase de formation des proembryons et des complexes proembryogènes. Deux
hypothèses possibles peuvent être formulées:
• les cellules embryogènes retournent à l'état méristématique sans donner de proembryon ;
• les cellules embryogènes se segmentent pour donner des proembryons (de 2 à 8 cellules)
qui n'évoluent pas mais dont les cellules retournent ensuite à l'état méristématique et/ou
dégénèrent.
En histologie, les indicateurs de la réversibilité des cellules et des proembryons est la
disparition des réserves amylacées et protéiques, une vacuolisation des cellules et l'apparition
de connections cellulaires au niveau des parois pectocellulosiques. Un nouvel indicateur serait
la diminution des teneurs en acides aminés qui deviennent équivalentes à celles des cals en
condition de multiplication. Une hypothèse probable est que cette diminution correspond à
une absence de synthèse des acides aminés malgré l'absorption plus importante en nitrate
mise en évidence à partir du 28e jour de culture. Sur un plan nutritionnel, les cals, qui
retournent à l'état méristématique, pourraient être des cals dont les cellules ne sont pas
capables d'utiliser les ressources nutritives accumulées entre le ISe et 28e jour de culture,
pourtant favorables à la proembryogenèse.
Toutes les hypothèses émises montrent que l'analyse des teneurs en acides aminés est
un bon indicateur de l'état physiologique des cals au moment de l'embryogenèse somatique
chez les lignées de cals de type II. Elle pourrait permettre de dégager à un stade très précoce
leurs potentialités d'orientation vers l'embryogenèse.
Cependant, pour pouvoir considérer les acides aminés comme des marqueurs
physiologiques fiables de l'orientation vers l'embryogenèse, il est nécessaire de généraliser
les études réalisées à d'autres lignées de cals.
Qu'en est-il avec d'autres lignées de cals?

L'analyse réalisée sur les cals de type 1 a montré une forte hétérogénéité de la
composition en acides aminés des cals, à une même date de prélèvement, que ce soit en
condition de multiplication ou en condition d'initiation de l'embryogenèse. Nous avons été
dans l'impossibilité de discriminer les cals placés dans les deux types de condition.
L'hétérogénéité mise en évidence serait reliée à l'hétérogénéité structurale de ces cals qui est
due à la présence de la zone méristématique pseudocambiale. Les cellules de cette zone
142
peuvent posséder deux états : un état méristématique en périphérie et un état différencié au

centre du cal : tissu parenchymenteux et/ou formation de trachéides. D'un cal à l'autre, les
tissus ne présentent pas le même degré de différenciation et nous avons suggéré que cette
variabilité pourrait entraîner une forte hétérogénéité du statut physiologique et métabolique
dont l'un des indicateurs serait les teneurs en acides aminés des cals.
Dans le cas des lignées de type l, les acides aminés pourraient être considérés comme
des marqueurs physiologiques du degré de différenciation des cals. Cependant, ils n'ont pas
permis de « marquer» spécifiquement leur degré d'orientation vers l'embryogenèse. Une idée
intéressante serait que ces composés pourraient être des marqueurs spécifiques de l'initiation
de l'embryogenèse à partir des cellules protodermiques.
Dans tous les cas, il y a nécessité d'étendre les études réalisées à un plus grand nombre
de lignées de cals mais aussi aux cals isolés directement sur l'expIant. Ce qui implique
d'effectuer un grand nombre de dosages.
D'un point de vue pratique, l'analyse des acides aminés est-elle aisée?
L'analyse des acides aminés par la méthode chromatographique présente l'avantage
d'analyser pratiquement l'ensemble des acides aminés libres. Et l'analyse réalisée est assez
fine. Cependant, l'application de cette technique fiable et précise exige des moyens techniques
importants. Nous avons vu que la proline pourrait constituer le marqueur le plus important de
l'orientation vers l'embryogenèse chez les cals de type II. De plus, c'est l'un des acides
aminés qui permet le mieux de « marquer» le degré de différenciation très variable que
montrent les cals de type 1. La proline peut être dosée par une méthode colorimétrique (dosage
à la nynhidrine) qui serait une méthode plus simple à mettre en oeuvre en vue d'un dosage
systématique au sein des cals.
Qu'apporte l'étude des acides aminés?

La question de savoir si l'on peut considérer les acides aminés comme des marqueurs
fiables peut être discutée. Ce sont des marqueurs quantitatifs : on étudie seulement le niveau de
leurs teneurs à un temps donné. L'expression de ces composés est fortement dépendante des
fluctuations métaboliques et de l'état physiologique des tissus. Pour certains auteurs, seuls les
marqueurs dits qualitatifs tels que les marqueurs moléculaires ou protéiques sont réellement
fiables. A la différence des acides aminés, leur recherche est basée sur la loi du « tout ou rien» :
ils ne sont détectés qu'au sein de tissus ou cals compétents pour l'embryogenèse et/ou bien
orientés vers l'embryogenèse et ne sont pas synthétisés au sein des tissus ou cals non
embryogènes ou orientés vers d'autres voies de différenciation.
Cette critique n'en doit pas faire pour autant amoindrir l'importance des résultats obtenus.
En prenant comme modèle des lignées de cals très homogènes telles que les lignées de type II,
l'étude de la composition en acides aminés des cals laisse suggérer un rôle physiologique et
143
nutritif important des acides aminés au cours de l'initiation et de l'expression de

l'embryogenèse. L'étude réalisée ouvre la voie à d'autres études. Sur un plan fondamental, il
serait intéressant de mieux préciser le rôle des acides aminés mis en évidence et du métabolisme
azoté en suivant par exemple l'incorporation d'azote marqué au sein des cals et des cellules.
D'un point de vue pratique, l'étude du métabolisme azoté pourrait nous permettre d'optimiser
les conditions de culture en agissant sur la source en azote et sa concentration dans les milieux :
modification des concentrations en ammonium et en nitrate, ajout d'acides aminés.
En particulier, il pourrait être intéressant de tester l'application de proline. Parmi
l'ensemble des acides aminés, la proline s'avère en effet le marqueur le plus important de la
proembryogenèse. L'utilisation de proline en tant que source d'azote réduit dans les milieux peut
favoriser et même stimuler l'initiation de l'embryogenèse chez de nombreuses plantes, comme la
carotte (NUTI RONCHI et al., 1984) ou les Graminées: le maïs (ARMSTRONG et GREEN, 1985), le
riz (CHOWDHRY et al., 1993) et la luzerne (SHETTY et MCKERSIE, 1993).
3- HYPOTHESES SUR LE MODE D'ACTION D'UNE AUGMENTATION DE LA

CONCENTRATION EN SACCHAROSE DES MILIEUX EN TANT QUE
STIMULUS INITIATEUR DE L'EMBRYOGENESE
Dans le but d'étudier si d'autres composés du milieu intervenaient sur l'initiation de

l'embryogenèse, nous nous sommes orientée sur l'étude d'une augmentation de la
concentration en saccharose chez les cals de type l, dont la prolifération est assurée par une
assise méristématique pseudocambiale. Nous avons montré qu'une concentration quadruplée
en saccharose par rapport au milieu standard (120 g.r) au lieu de 30 g.r) permet l'initiation
de l'embryogenèse sur milieu de multiplication sans modifier la concentration en 2,4-D.
L'augmentation de la concentration en sucre mime l'action de l'augmentation de la

concentration en 2,4-D. Les évènements cytohistologiques qui caractérisent l'initiation de
l'embryogenèse se déroule selon la même séquence. De plus, la structure des cals montre la
même organisation : pourtour actif avec apparition des cellules embryogènes dans la zone
pseudocambiale destructurée, réactivation de la zone protodermique en certains endroits du
cal, centre en dégénérescence et/ou fortement vascularisé.
Différentes hypothèses ont été émises quant au rôle possible du saccharose sur les
processus morphogénétiques au sein des cals.
144
PARTIE 1- D,SCUSS,ON
Hypothèses formulées
La première hypothèse est que le saccharose pourrait agir indirectement en modifiant
l'équilibre d'adsorption du 2,4-D sur le charbon actif présent dans les milieux. Il est
maintenant établi que le charbon actif adsorbe les hormones présentes dans le milieu mais
aussi d'autres composés, tels que l'adénine sulfate ou encore les vitamines (DRUART et DE
WULF, 1993; EBERT et al., 1993; VERDEIL, 1993). Le saccharose pourrait interagir avec le 2,4-
D pour l'adsorption sur le charbon actif. Ce qui entraînerait une augmentation de la teneur en
auxine libre, celle-ci provoquerait alors l'initiation de l'embryogenèse. Cependant, nous avons
montré que le saccharose ne modifie pas l'adsorption du 2,4-D sur le charbon actif ni
l'équilibre d'adsorption.
La seconde hypothèse que nous pouvons formuler est que l'augmentation de la

concentration en saccharose pourrait permettre d'initier l'embryogenèse somatique par un
effet osmotique, indépendamment du 2,4-D. La pression osmotique plus importante dans les
milieux, la diminution significative de la teneur en eau des cals et la présence de figures de
stress ont permis de formuler cette hypothèse.
Evidence d'un stress sur les cals?

Comme en témoignent certaines données de la littérature, la présence de figures de type
myéloïde et d'un appareil réticulaire développé au sein de certaines cellules seraient signe
d'un stress. Ces éléments sont observés lors de stress provoqués après application de
polyéthylèneglycol (LOPEZ-CARBONELL et al., 1994) ou d'un herbicide (DAVIS et BREZEANU,
1979). Ils sont contenus dans des cellules à structure très particulière de type sécrétoire, dont
l'aspect est très proche de celui observé en microscopie électronique chez le cocotier. Ces
cellules sont aussi caractérisées par :
• la présence de nombreux amyloplastes, dictyosomes et mitochondries. La forte fréquence
de toutes ces figures entraîne le fait que l'appareil réticulaire se retrouve à la fois très
proche de la membrane cytoplasmique et de plasmodesmes et des plastes et
mitochondries;
• l'émission de vésicules golgiennes dont certaines sont plus ou moins associées à la paroi.
La fréquente proximité des différents éléments cytoplasmiques et l'émission de
vésicules golgiennes qui caractérisent ces cellules ont été mises en relation avec la sécrétion
de composés de défense qui vont protéger les tissus envers l'environnement. Cette structure
est également typique des cellules sécrétrices de tissus tels que les trichomes (FIGUEIREDO et
PAIS, 1994) ou le tapetum, impliqué dans la maturation pollinique (POLOWICK et SAWHNEY,
1993). L'existence de telles cellules sur milieu enrichi en saccharose pourrait être en relation
avec la production de mucilage tel que ceux observés en histologie. Dans le cas présent, les
composés extracellulaires, présents en périphérie des cals sous forme de mucilage,
145
interviennent-ils dans l'initiation de l'embryogenèse? On peut également se demander quelle

pourrait être la relation entre la présence de cellules de type sécrétoire et le processus
embryogène. Les composés que pourraient produire ces cellules participent-ils à l'isolement
des cellules embryogènes, indépendamment des composés sécrétés par les cellules
embryogènes elles-même ? Ces questions sont basées essentiellement sur l'observation
histocytologique. Nous sommes consciente des limites d'interprétation de telles études malgré
la présence de témoins. De plus, une telle hypothèse impliquerait la synthèse de composés par
les cellules de type sécrétoire, qui seraient utilisés pour permettre l'isolement des cellules
embryogènes, ce que nous n'avons pas vérifié.
Ce stress est-il en relation avec l'initiation de l'embryogenèse?

Nous avons suggéré que le stress mis en évidence pourrait être en relation avec
l'initiation de l'embryogenèse. Différentes études ont permis de montrer que de tels stress
peuvent être directement à l'origine de l'embryogenèse sans modification de la concentration
en auxine. CARMAN (1990), MERKLE et al. (1995) rapportent que l'application d'un
osmoticum, de sels ou de métaux lourds peut permettre l'initiation de l'embryogenèse à partir
d'explants de carotte cultivés sur un milieu sans hormone. GEORGE et SHERRINGTON (1984)
rapporte qu'une faible application d'une tension en oxygène exogène peut favoriser
l'apparition de l'embryogenèse en présence d'une concentration en auxine non modifiée par
rapport à celle utilisée pour la callogenèse. Il souligne également l'importance de la
température sur le processus embryogène.
Le mécanisme impliqué lors de ces phénomènes est encore très mal compris. Selon
YEUNG (1995), de tels stress pourraient agir en tant que signaux chimiques ou physiologiques
qui modifieraient les échanges entre les cellules totipotentes et leur environnement en les
induisant à exprimer un nouveau programme génétique, les conduisant vers la différenciation,
dont une voie possible est l'embryogenèse. Des études réalisées chez la carotte suggèrent
qu'un stress pourrait activer l'expression de différents composés extracellulaires telles que des
glycoprotéines (DE VRIES et al., 1988 a), des polysaccharides ou des enzymes (V AN ENGELEN
et DE VRIES, 1992) impliqués dans la régulation des évènements morphogénétiques.
La troisième hypothèse formulée est que le saccharose pourrait agir en tant que substrat
métabolique et énergétique. Une forte absorption en saccharose est observée, elle est
concomitante avec une diminution de la teneur en saccharose au sein des cals. Parallèlement, les
teneurs en glucose et fructose augmentent d'abord fortement pendant la formation des cellules
embryogènes entre TO et T15. Puis, elles diminuent pendant la formation des proembryons entre
T15 et T60. Ces changements sont à mettre en relation avec les modifications infrastructurales
au sein des cellules embryogènes et des proembryons : accumulation de réserves amylacées et
lipo-protéiques, remaniement des parois pectocellulosiques et avec la sécrétion de composés
146
extracellulaires, comme suggéré précédemment. Le saccharose pourrait agir, de façon

indépendante du 2,4-D, en palliant aux besoins nutritifs des cals, nécessaires pour initier
l'embryogenèse, par apport de composés métaboliques et énergétiques supplémentaires. Il est
maintenant établi que l'initiation de l'embryogenèse requiert des besoins en composés carbonés
importants (AMMlRATO, 1983).
Face aux faits expérimentaux, les deux dernières hypothèses formulées semblent les plus
probables. Nos résultats sont à rapprocher de ceux obtenus lors d'autres études. En particulier,
1
chez la fétuque, l'augmentation du niveau en saccharose (20 à 45 g.r ) des milieux peut
permettre de restaurer le potentiel de régénération des cultures (ZAGHMOUT et TORELLO,
1
1992). Chez le palmier dattier, ZAID (1989) note que l'élévation de 30 à 60 g.r de saccharose
peut améliorer les conditions d'initiation de l'embryogenèse. BRONNER et al. (1994) ont
1
montré que l'application de 120 g.r de saccharose chez le tournesol pouvait permettre
l'initiation de l'embryogenèse directe alors qu'une application de 30 g.r 1 induisait
l'organogenèse. Dans tous les cas, les auteurs n'ont pu réellement conclure quant à l'effet
possible du saccharose sur l'embryogenèse entre un effet purement osmotique et un effet
nutritionnel.
Dans le cas du cocotier, les deux hypothèses sont complémentaires : (1) l'apport
important de sucre pallie aux besoins nutritifs des cals, cependant, (2) les composés carbonés
se retrouvent en excès comme en témoigne le relargage important de glucose et fructose dans
les milieux montré en cours de culture; cet excès de sucres pourrait entraîner un stress
osmotique sur les cals. Le comportement des cellules au niveau physiologique et nutritionnel est
modifié et elles s'orientent vers l'embryogenèse. Quelle que soit l'hypothèse formulée, elle
implique des changements fondamentaux au niveau du métabolisme carboné au sein des cals.
Il serait particulièrement intéressant de suivre de façon précise la translocation du
saccharose entre les milieux et les tissus en faisant par exemple appel à du carbone marqué.
De telles études permettraient de mieux comprendre l'implication du métabolisme carboné
dans les phénomènes observés.
Le saccharose agit-il sur la destructuration de la zone pseudocambiale ?

Chez les cals de type 1, une destructuration de la zone pseudocambiale est nécessaire
pour l'initiation et l'orientation vers l'embryogenèse.
En microscopie électronique, nous avons observé des dépôts particuliers au niveau de la
lamelle moyenne des cellules de la zone pseudocambiale en destructuration. Ce dépôt est de
deux types : des fibrilles de nature vraisemblablement de type cellulosique et/ou pectique
mais aussi des dépôts plus denses et « globulaires ». Le premier type de dépôts correspond au
mucilage mis en évidence autour des cals. Le deuxième type de dépôt pourrait correspondre à
une digestion de la lamelle moyenne entre certaines cellules. Celle-ci a été mise en relation
avec une dissociation des cellules au moment de la destructuration de la zone pseudocambiale.
147
Chez l'hévéa, MONTORD et al. (1993) ont montré que l'augmentation de la concentration en
saccharose peut permettre la friabilisation de cals compacts. Ce qui serait en accord avec ce
qui est observé chez le cocotier. Cependant, cette idée est contradictoire avec ce qui est
observé chez le maïs (FRANSZ, 1988). C'est une diminution de la concentration en saccharose
qui est requise pour la formation des cals de type friable. Selon FRANSZ (1988), le saccharose
pourrait être en relation avec la destructuration des cals de maïs en induisant des processus
biochimiques et enzymatiques responsables de la dissociation cellulaire, en particulier par le
dépôt de composés polysaccharidiques au niveau de la lamelle moyenne et qui permettraient
sa digestion. Chez le cocotier, on pourrait envisager la même hypothèse pour l'effet de
l'augmentation de la concentration en saccharose. Dans ce cas, il serait alors particulièrement
intéressant d'étudier la nature des composés extracellulaires observés au niveau des parois et
de la lamelle moyenne au sein des cals de cocotier.
Etude comparative du saccharose et du 2,4-D en tant qu'effets inducteurs de

l'embryogenèse chez le cocotier
Le saccharose et le 2,4-D entraînent deux effets communs : l'initiation de
l'embryogenèse et la différenciation d'élements xylémiques qui apparaissent sur le même cal.
Ce sont deux processus de différenciation. Les deux composés initient donc les cals vers la
différenciation, une voie possible étant l'embryogenèse.
Il a été montré que si les cals de cocotier sont placés sur de fortes concentrations en 2,4-
D, plus élevées que celles utilisées pour l'initiation de l'embryogenèse, ils s'orientent
totalement vers la lignification (Dus SERT, 1991). Chez la carotte, il est également maintenant
établi que l'enrichissement en saccharose des milieux peut entraîner l'activation de la
différenciation des éléments trachéides chez la plante entière comme au sein de cals en culture
(STEWARD, 1969).
Sur milieu d'initiation de l'embryogenèse, seule la destructuration du cal, qui équivaut à
un isolement des cellules méristématiques, permet l'initiation et l'expression des évènements
morphogénétiques spécifiques de l'embryogenèse. Chez les cals de type l, l'orientation vers
l'embryogenèse correspond à deux processus d'isolement sous le contrôle du 2,4-D ou du
saccharose (1) un isolement tissulaire de la zone méristématique et (2) un isolement physique
de la cellule embryogène.
Dans les deux cas, la différenciation est une réponse à un stress :
• stress provoqué par une hormone: le 2,4-D. Dans ce cas, un des indicateurs physiologiques
de l'orientation vers la différenciation serait l'augmentation de la teneur en proline ;
• stress osmotique provoqué par un composé nutritif: le saccharose.
Des études récentes réalisées sur la carotte suggèrent que les effets inducteurs d'une
hormone ou d'un stress impliquent les mêmes processus physiologiques et biochimiques pour
amener la cellule méristématique vers la différenciation, quelle qu'elle soit (YEUNG, 1995). Au
148
PARTIE 1 - DISCUSSION
niveau génomique, ils agiraient indirectement sur la reprogrammation génétique des cellules
méristématiques par des mécanismes de méthylation de l'ADN (MERKLE et al., 1995).
D'autres études ont montré que l'un ou l'autre composé pourrait agir sur l'initiation des
évènements morphogénétiques en interaction avec les hormones endogènes. YEUNG (1995)
rapporte que récemment, il a été montré que le 2,4-D influence le métabolisme de l'AIA au
sein des cellules de carotte. De même, d'autres études suggèrent également que le rôle
morphogénétique de l'augmentation de la concentration en saccharose exogène pourrait être
dû à une interaction entre le saccharose et la production d'hormones endogènes. Au sein de
racines en culture in vitro, le niveau en saccharose ou autres carbohydrates peut affecter la
synthèse d'auxines endogènes (STREET, 1969). L'augmentation de la concentration en
saccharose, pourrait influencer la production d'autres phytohormones. Lors de la tubérisation
chez la pomme de terre, l'augmentation de la concentration en saccharose peut entraîner une
diminution de la teneur en gibberellines et favoriser la production d'éthylène (SIMKO, 1994).
Lors d'une étude de la nutrition carbonée de bourgeons de pomme cultivés in vitro, CHONG et
PUA (1985) ont montré que l'application d'une seule concentration de saccharose (30 g.r l )
était optimale pour la croissance et la production de bourgeons normaux. Ils suggèrent que la
capacité d'utiliser le saccharose à cette concentration indiquerait que le saccharose induit des
changements au niveau des phytohormones endogènes conduisant à la formation de
bourgeons normaux. Lors de ces études, les auteurs attribuent au saccharose un rôle
équivalent à celui d'une hormone.
Cependant, une question peut être posée les deux composés agissent-ils
indépendamment ou par un effet synergique?
L'initiation de l'embryogenèse sur milieu enrichi en sucre est obtenue en présence de
2,4-D. La présence de l'hormone est nécessaire pour le maintien de l'état méristématique des
cals. Une autre hypothèse pourrait être qu'il existe un certain degré d'interaction entre
l'hormone et le sucre pour initier l'embryogenèse et permettre la formation d'éléments de type
trachéide.
Chez le soja, LAZZERRI et al. (1988) ont montré que le bon déroulement de
l'embryogenèse somatique dépendait d'une balance optimale saccharose/AIA des milieux, du
fait d'une action synergique sur les processus morphogénétiques. Chez la plante entière, les
deux types de composés interagissent dans le contrôle de l'initiation du tissu cambial et la
différenciation du tissu vasculaire (STEWARD, 1969). Les auxines dirigent le flux de
saccharose vers son site d'action et d'accumulation.
149
Toutes ces hypothèses pourraient suggérer chez les cals de type 1, une interaction
complexe entre les facteurs nutritifs exogènes et les facteurs hormonaux exogènes et
endogènes qui vont conditionner les cellules de la zone méristématique pseudocambiale dans
leur compétence à l'embryogenèse.
Cependant, nous n'avons pas de preuve expérimentale d'une interaction entre le

saccharose et le 2,4-D et encore moins avec les hormones endogènes. Il serait alors intéressant
d'étudier le niveau en hormones endogènes en relation avec les modifications observées sur
milieu enrichi en saccharose. Il serait également intéressant de compléter l'étude de
l'initiation de l'embryogenèse sur milieu enrichi en saccharose par d'autres essais, en
particulier la détermination des besoins nutritifs spécifiques et de la composition en acides
aminés et protéines, telle qu'elle a été pratiquée sur milieu enrichi en 2,4-D. Ces essais
permettraient de mieux faire la comparaison entre les deux systèmes en étudiant les
changements au niveau nutritionnel et physiologique qui se déroulent au cours de l'initiation
de l'embryogenèse.
150
TECHNIQUES DE SUSPENSIONS EMBRYOGENES
-P.A.R.TIE I I -
MISE AU POINT DES SUSPENSIONS EMBRYOGENES
INTRODUCTION
L'établissement de suspensions embryogènes sur cocotier pourrait représenter une

alternative intéressante dans la perspective d'obtenir une phase d'amplification des cultures et
la production en masse de vitroplants.
• INTERET DES SUSPENSIONS POUR LA MICROPROPAGATION PAR EMBRYOGENESE
SOMATIQUE
Les premières suspensions cellulaires ont été obtenues chez la carotte (REINERT, 1958;
STEWARD et al., 1958) en même temps que la mise au point du procédé d'embryogenèse
somatique. Les techniques de suspensions ont ensuite été appliquées à de nombreuses espèces
Di ou Monocotylédones. Chez les Monocotylédones, on peut citer les graminées : le panicum
(Lu et VASIL, 1981), la canne à sucre (Ho et VASIL, 1983), la fétuque (ZAGHMOUT et
TORELLO, 1989), le blé (YANG et al., 1991), et chez d'autres palmacées : le palmier dattier
(DAGUIN et LETOUZE, 1988) et le palmier à huile (DE TOUCHET et al., 1990; TEIXERA et al.,
1995).
Les suspensions cellulaires présentent de nombreux avantages comparés aux cultures en
milieu solide. Elles pennettent une amplification des cultures par une prolifération plus
importante des structures embryogènes. Elles pennettent l'obtention d'embryons isolés avec
un développement plus ou moins synchrone.
La possibilité de rendements élevés pennet la production à grande échelle de plantes
difficiles à reproduire par voie sexuée (LUTZ et al., 1985; NOUAILLE et PETIARD, 1988), d'où
l'intérêt des suspensions pour des plantes récalcitrantes telles que le cocotier.
D'un point de vue plus fondamental, les suspensions constituent un modèle de choix
pour les études portant sur la nutrition et le métabolisme des cellules et des tissus in vitro.
C'est également à partir de suspensions que les principales études portant sur les facteurs
génétiques, moléculaires et physiologiques de l'embryogenèse somatique ont été réalisées.
Enfin, elles représentent le matériel de base des techniques de transfonnation.
151
• STRATEGIE ADOPTEE CHEZ LE COCOTIER:
Pour la mise au point des techniques de suspensions sur cocotier, s'est posé en amont le
problème du choix des cals compétents. Les cals devaient tout d'abord posséder un certain
degré de friabilité qui leur permette de s'affranchir de la cohésion cellulaire caractéristique de
cals maintenus sur milieu gélosé et se fractionner spontanément en unités de plus petite taille
en milieu liquide. De plus, il était important de posséder un matériel homogène et contrôlable
quant à l'initiation des évènements embryogènes.
Nous avons alors focalisé nos études sur les lignées de cals composant la collection
établie au laboratoire. Nous rappelons que ces lignées ont été établies par la multiplication et
le « clonage» des cals primaires. Après multiplication du cal et plusieurs repiquages,
différentes lignées de cals de type granuleux peuvent apparaître. Elles sont ensuite maintenues
et multipliées sur un milieu de multiplication approprié.
Un « screening» des lignées de cals basé sur leur degré de friabilité et leurs potentialités
embryogènes a été réalisé. Des lignées granuleuses, qualifiées de type friable, ont été
sélectionnées. Ces lignées appartiennent aux deux types tissulaires étudiés au cours de la
première partie de ce mémoire. Elles diffèrent par leur structure tissulaire :
• la prolifération des cals de « type 1 » est assurée par une assise méristématique de type
cambial;
• la prolifération des cals de « type II » est assurée par une assise méristématique de type
protodermique.
L'embryogenèse somatique est d'origine unicellulaire.
Les études réalisées ont consisté en une démarche analytique comportant trois étapes :
1) une étude du comportement des différentes lignées de cals sélectionnées après leur transfert
en milieu liquide.
Cette étude a été réalisée afin (1) de mieux définir les conditions de maintien et de
prolifération des cals (2) de sélectionner le matériel compétent pour l'établissement des
suspensions (3) de déterminer les conditions du maintien du potentiel embryogène en milieu
liquide. Nous avons réalisé une étude morphologique et structurale des cals et suivi leur
croissance au cours du temps. Pour réaliser cette étude, nous avons fait varier différentes
caractéristiques des milieux et des conditions de culture, telles que les concentrations en 2,4-D
et en charbon actif, la fréquence de repiquages ou le poids d'inoculum.
152
Deux voies d'évolution des cals ont été considérées au moment du transfert en milieu
liquide:
• des cals préalablement en condition de multiplication. Les conditions d'initiation
de l'embryogenèse en milieu liquide sont recherchées;
• des cals préalablement induits en embryogenèse sur milieu solide.
Dans les deux cas, les conditions de prolifération des structures proembryogènes sont
recherchées.
2) une fois les suspensions établies, une étude morphologique et structurale des massifs
cellulaires en suspension a été réalisée et leurs modalités de prolifération ont été étudiées.
3) enfin, une phase d'expression des potentialités embryogènes des suspensions a été
recherchée.
153
LiGNEES DE CALS EN MILIEU LIQUIDE
-C~ITR.EI
COMPORTEMENT DE DIFFERENTES LIGNEES DE CALS

EN MILIEU LIQUIDE
INTRODUCTION
Le principal objectif de ces études était de sélectionner le type de cals compétent en

milieu liquide et de définir les conditions de leur prolifération et le maintien du potentiel
embryogène.
Plus d'une dizaine de lignées de cals ont été étudiées. Cependant, la majorité des lignées
a rapidement dégénéré une fois transférée en milieu liquide. Seules les lignées qui ont montré
un début de prolifération sont présentées.
Différentes lignées de cals ont été transférés en milieu liquide :

• des lignées dont la prolifération est assurée par une assise peudocambiale (cals de type 1),
lignées PBC23 et PBC25 (d'origine foliaire) et L7 (d'origine inflorescentielle),
• une lignée dont la prolifération est assurée par une assise protodermique (cals de type II),
lignée L82.
Les études effectuées à partir de ces lignées sont les suivantes:

• Effet de différentes variantes de milieu :
Comme lors du procédé en milieu solide, les cultures ont été placées en milieu liquide en
présence de charbon actif. Nous avons fait varier la concentration en 2,4-D et en charbon
actif des milieux afin de déterminer la concentration en 2,4-D libre optimale pour la
prolifération des cals. Le milieu de base est le même que celui du milieu de multiplication
solide de chaque lignée.
Pour faciliter la lecture des résultats, la dénomination suivante est donnée à chaque milieu:
type de milieu M (cals de type 1) ou G (cals de type II) suivi des concentrations en 2,4-D et
en charbon actif (2,4-D/CA) exprimées respectivement en mg.r l et en g.r l .
• Effet de la fréquence de repiQua~e :

Trois fréquences de repiquages ont été étudiées : un premier lot de cals a été repiqué tous
les 15 jours, un deuxième lot tous les 30 jours, un troisième lot tous les 60 jours.
154
• Etude mOI:pholo~ique et structurale:

Une étude morphologique et histologique a permis de suivre le comportement des cals,
grâce à des prélèvements effectués tous les 15 jours.
• Suivi de la croiSSance des cals :

La croissance des cals a été suivie en mesurant le poids de matière fraîche de chaque cal
tous les 15 jours. Une analyse de variance a été réalisée à une date unique, au 30e jour de
culture (T30), pour déterminer si les différences à chaque niveau de traitement « variante
de milieu x date x fréquence de repiquage» étaient significatives. T30 est une date
commune aux deux types de repiquage.
Des essais préliminaires ont montré que le poids d'inoculum initial n'a pas d'effet sur la
prolifération des cals en milieu liquide entre les deux valeurs limites 200 mg et 1000 mg.
Au-delà de ces valeurs, les cals sont en quantité trop faible ou trop élevée pour proliférer.
Nous avons donc fixé arbitrairement un poids de matière fraîche initial compris entre 300
et 400 mg.
1- TRANSFERT EN MILIEU LIQUIDE DE CALS EN CONDITION DE

MULTIPLICATION
Dans un premier temps, nos études ont porté sur le transfert en milieu liquide de cals
préalablement en condition de multiplication. Les essais ont consisté à définir les conditions
de prolifération des cals mais aussi les conditions d'initiation de l'embryogenèse en milieu
liquide.
Dans les tableaux 18 à 21, nous avons récapitulé les résultats obtenus après transfert en
milieu liquide des lignées de cals de type 1 en fonction de l'effet de la concentration en 2,4-D
et de la concentration en charbon actif ainsi que de la fréquence de repiquage. Ces tableaux
nous aideront pour la description des différents résultats obtenus.
1.1- Cals dont la multiplication est assurée par une assise pseudocambiale (<< type 1 »)
1.1.1- ETUDE MORPHOLOGIQUE DES CALS EN MILIEU LIQUIDE

Au moment du passage en milieu liquide, les cals sont constitués de nodules granuleux
beige-jaune qui se séparent spontanément les uns des autres en milieu liquide par groupes
dont le diamètre varie de 4 à 8 mm. Le milieu liquide change la couleur et l'aspect des cals.
Les cals ont tendance à blanchir en milieu liquide.
155
TABLEAU 18 : Essai de transfert en milieu liquide de lignées de cals de type 1 d'origine inflorescentielle :
Effet de la concentration en 2,4-D, de la concentration en charbon actif et de la fréquence de repiquage
Lignée Milieu solide Milieux Initiation de Embryogenèse Croissance du matériel Etat des cultures Etat des cultures
d'origine de liquides l'embryogenèse somatique après 30 j. frais après 30 j. après 60 j. après 90 j.
inflores- multiplication somatique
centielle
2,4-0/CA après 15 j. Repiquage Repiquage
l
(mg.r'/g.r ) 15 j. 30j. 15 j. 30j.
M60 40/2 - -
.
- +++ ++ multiplication mort
60/2 - - +++ ++ multiplication mort
L7 (60 mg.r
l
l
SO/2 - - - +++ ++ multiplication mort
12 g.r ) 110/2 ++++ ++ + +++ ++ perte PE, croissance mort
2,4-0 40/1 ++++ ++ + ++ + perte PE, croissance mort
ICA 60/1 +++ + - ++ + mort mort
SO/l + + - ++ + mort mort
110/1 + + - ++ + mort mort
* Observations réalisées à partir de 3 erlenmeyers par niveau de traitement « concentration en 2,4-0 x concentration en charbon actif x fréquence de repiquage»,
* Milieux: CA: concentration en charbon actif; 2,4-0 : concentration en 2,4-0.
* Repiquage: repiquages effectués tous les 15 jours ou tous les 30 jours. nt: non testé.
* Initiation de l'embryogenèse somatique en milieu liquide après le 15e jour de culture :
- : pas d'initiation (absence de cellules embryogènes et de proembryons), stade de multiplication maintenu
+ : le nombre de croix exprime une estimation du degré d'initiation de l'embryogenèse en fonction de "observation histologique des cals.
* Croissance du matériel frais:
- poids d'inoculum initial: en moyenne 350 mg dans 20 ml de milieu.
- estimation réalisée au 60e jour de culture par mesure du poids de matière fraîche: + : croissance inférieure à 700 mg; ++ : croissance comprise entre 700 mg et 1500 mg;
+++ : croissance comprise entre 1500 et 2000 mg.
* Etat des cultures après 60 jours et 90 jours: observations effectuées en fonction de la croissance du matériel végétal en milieu liquide et de ('observation histologique:
Perte PE : perte du potentiel embryogène; mort: dégénérescence puis mort des cultures.
TABLEAU 19 : Essai de transfert en milieu liquide de lignées de cals de type 1 d'origine foliaire:
Effet de la concentration en 2,4-D et de la fréquence de repiquage
Lignées de Milieu solide Milieux Initiation de Croissance du Etat des cultures après Etat des cultures après
type 1 de liquides l'embryogenèse matériel frais après 30 j. 60j. 90 j.
d'origine multiplication somatique après 15 j.
foliaire
l
2,4-D (mg.r ) Repiquage Repiquage Repiquage Repiquage
l
(CA: 2 g.r ) 15 j. 30 j. 15 j. 30j. 15 j. 30j. 15 j.
PBC23 MSO 130 + - + + perte PE mort mort
l l
(SO mg.r /2 g.r ) 140 + - + + perte PE mort mort
2,4-D/CA 150 + - + + perte PE mort mort
160 + - + + perte PE mort mort
PBC25 MSO 110 + - + + perte PE mort mort
l l
(SO mg.r /2 g.r ) 120 + - + + perte PE mort mort
2,4-D/CA 130 + - + + perte PE mort mort
* Observations réalisées à partir de 3 erlenmeyers par niveau de traitement « concentration en 2,4-0 x fréquence de repiquage », nt: non testé.
* Milieux: CA : concentration en charbon actif; 2,4-0 : concentration en 2,4-0.
* Repiquage: repiquages effectués tous les 15 jours ou tous les 30 jours.
* Initiation de l'embryogenèse somatique en milieu liquide après le 15e jour de culture:
+ : le nombre de croix exprime une estimation du degré d'initiation de l'embryogenèse en fonction de l'observation histologique des cals.
- estimation réalisée au 60e jour de culture par mesure du poids de matière fraîche: + : croissance inférieure à 700 mg.
* Etat des cultures après 60 jours et 90 jours: observations effectuées en fonction de la croissance du matériel végétal en milieu liquide et de l'observation histologique:
LIGNEES DE CALS EN MILIEU LIQUIDE
Pour L7, les groupes de nodules gardent leur aspect granuleux. Une fragmentation des
cals en éléments plus petits est observée mais elle est très limitée. Pour PBC23 et 25, aucune
libération de structures de dimension réduite n'est observée. En revanche, les cals ont
tendance à croître en épaisseur et prennent au cours du temps un aspect très dur et compact.
Les cals montrent un aspect assez homogène entre les erlenmeyers d'un même niveau de
traitement «concentration en 2,4-D x concentration en charbon actif x fréquence de
repiquage» (n=3).
1.1.2- DESCRIPTION HISTOLOGIQUE DE LA STRUCTURE DES CALS

Dans un premier temps, nous pouvons rappeler la structure des cals de type 1 décrite au
cours de la première partie de ce mémoire. Les cals de type 1 sont composés de nodules plus
ou moins individualisés. Ces nodules sont constitués de trois zones tissulaires : une assise
périphérique de type protodermique, une assise méristématique pseudocambiale qui assure la
croissance des cals et une zone centrale différenciée en tissus parenchymenteux, en fibres de
soutien et en éléments de type trachéide. La formation de nouveaux nodules est réalisée grâce
à des digitations de la zone méristématique pseudocambiale.
En milieu liquide, les cals de type 1 gardent une structure comparable à celle observée
en milieu solide. Cependant, des nodules s'isolent en périphérie de nodules préexistants. Sur
certains de ces nodules, une réactivation de la zone périphérique protodermique peut être
observée (Planche XIII, photo 1). Leur séparation pourrait être due à la dégénérescence de la
zone cellulaire à laquelle ils sont attachés sur le cal d'origine (Planche XIII, photo 2). On peut
penser que ces groupes pourraient être libérés spontanément dans le milieu, sous l'effet de
l'agitation des erlenmeyers. Ils pourraient correspondre aux éléments de dimension plus
réduite observés à l'oeil nu dans l'erlenmeyer. Cependant, les nodules forment eux-même une
unité assez compacte. Ils ne semblent pas pouvoir se fragmenter en unités plus réduites, ce qui
limite la friabilisation des cals.
Au 15e jour de culture en milieu liquide, la présence de cellules de type embryogène est
obserbée au sein des cals qui étaient au départ en condition de multiplication. L'initiation de
l'embryogenèse se déroule de façon analogue à celle observée en milieu solide. Les cals en
suspension sont alors composés de nodules qui s'isolent en périphérie et et de zones
destructurées contenant des cellules embryogènes (Planche XIII, photo 3). Dans un même
erlenmeyer, les nodules, qui contiennent les cellules de type embryogène, voisinent avec des
cals qui proliférent en restant à l'état méristématique.
Au 28e jour de culture, les nodules en suspension ont tendance à croître en épaisseur et
deviennent très compacts. En histologie, on observe un degré important de différenciation des
cals en tissu parenchymenteux et en trachéides. Les cellules de la zone protodermique ont
accumulé de l'amidon et ont tendance à dégénérer (Planche XIII, photo 4).
158
PLANCHE XIII
Structure histologique des cals en milieu liquide:
1. Cals de type 1 en milieu liquide (ISe jour de culture) (barre: 100 Ilm)
Nodule en périphérie d'un cal avec réactivation de la zone protodermique
2. Nodule qui s'isole par dégénérescence de la zone de rattachement au cal (barre: 70 Ilm)
3. Initiation de l'embryogenèse en milieu liquide (barre: 130 Ilm)
4. Nodule isolé entouré de particules de charbon actif (barre: 260 Ilm)
5. Cals de type II en milieu liquide (ISe jour de culture) (barre: 100 Ilm)
A : accumulation d'amidon; CA : particules de charbon actif; Et : élément de type trachéide; Pa :

parenchyme; Pc : pseudocambium; Pr : protoderme; Zd : zone dégénérée.
Quelle que soit la variante en 2,4-D et la fréquence de repiquage, on observe

fréquemment la présence de charbon actif autour des cals en suspension, il a tendance à
adhérer aux tissus (Planche XIII, photo 4). Au cours de leur prolifération, les cals peuvent
même emprisonner les particules de charbon.
En comparant les différents traitements effectués « variante de milieu x date x fréquence

de repiquage », nous avons pu estimer l'importance du degré d'initiation vers l'embryogenèse
sur un critère histologique.
Pour les cals d'origine inflorescentielle, l'initiation de l'embryogenèse est observée sur
1
des milieux contenant 110 mg.r l de 2,4-D et 2 g.r de charbon actif (milieu M11012), et sur
l
des milieux contenant 40 à 110 mg.r et 1 g.r l de charbon (milieux M40/1 à Ml 10/1) (tableau
18). Pour les cals d'origine foliaire, elle est peu fréquente et restreinte à quelques erlenmeyers,
quelle que soit la concentration en 2,4-D testée (tableau 19). L'ensemble des observations
réalisées montre que la fréquence des repiquages influe sur le degré d'initiation des cals vers
l'embryogenèse: pour des cals repiqués tous les mois, on observe, en effet, beaucoup moins
de cellules de type embryogène que pour des cals repiqués tous les 15 jours (tableaux 18 et
19).
Quelle que soit la lignée de cals considérée, les cellules embryogènes et les
proembryons formés au sein des nodules dégénérent au bout de 60 jours de culture. Les cals
retrouvent une structure de cals en multiplication puis continuent à se multiplier à l'état
méristématique. Dans nos conditions de culture, il ne nous a pas été possible d'obtenir une
réinitiation de l'embryogenèse avec ce matériel. Les nodules isolés dans le milieu croissent en
épaisseur et deviennent très compacts. Aucune libération d'éléments de taille réduite est alors
observée. Ensuite, les cellules de la zone centrale des cals montrent peu à peu une
différenciation importante en trachéides. Cette structure gagne l'ensemble des cals et conduit
à leur dégénérescence après 90 jours de culture (tableaux 18 et 19).
1.1.3- SUIVI DE LA CROISSANCE DES CALS

Le suivi de la croissance des cals de la lignée d'origine inflorescentielle (L7) montre des
différences significatives en fonction des concentrations en 2,4-D et en charbon actif testées et
des fréquences de repiquage
La figure 42 représente l'effet de différentes concentrations en 2,4-D et en charbon actif
sur la croissance des cals de la lignée L7 pour des repiquages effectués tous les 15 jours. La
croissance est, en général, inversement proportionnelle à la concentration en 2,4-D dans le
milieu de culture. Le même type de résultats a été observé pour les cals repiqués tous les mois,
cependant, la croissance est globalement moins importante (tableau 18).
159
2500
CD
s:
~ 2000
,g
.. -
CI)
1:ra E
Cl
1500
E- Temps (j)
CI) 1000
'C
li)
'C
'0 500
C.
Milieux
Figure 42 : Evolution du poids de matière fraîche des cals repiqués tous les 15 jours en milieu
liquide contenant différentes concentrations en 2,4-D :
er
M40/1; M60/1; M80/1; MIIO/1; M60/2; MIIO/2 : le 1 chiffre indique la
e
concentration en 2,4-D en mg.l" et le 2 chiffre, la concentration en charbon actif
-1
en g.1.
* Les parties de courbes en pointillés (----) indiquent que les cals ont dégénéré sur les milieux
correspondants; le dernier poids relevé est donné arbitrairement jusqu'au 60e jour de culture.
* Les valeurs représentent la moyenne de 3 répétitions par niveau de traitement ("concentration
en 2,4-D x concentration en charbon actif x repiquage").
* ANOVA au 30' jour de culture: 2,4-D : F(3 .3~) = 10,74 (**) ; Charbon Actif: F(1 .3~) = 29,09 (**);
Repiquage : F(I.3~) = 60,50 (*..); Effet du 2,4-D en fonction du repiquage : F(3,3~) = 4,5 (*); Effet
du charbon actif en fonction du repiquage : F(I ,3~) = 7,5 (*)
(F = test Fisher-Snedecor; niveau de signification: *** = très hautement significatif (1%0); ** =
hautement significatif (1%); * = significatif (5%» .
160
La figure 43 représente l'effet de la concentration en charbon actif en fonction de la

l
fréquence de repiquage, en présence de 110 mg.r en 2,4-D. Les résultats présentés montrent
l
que la croissance la plus importante est observée pour des doses de 2 g.r de charbon et un
repiquage effectué tous les 15 jours. Les cals repiqués tous les 30 jours dégénèrent au cours du
deuxième repiquage (tableau 18). Des résultats équivalents sont observés sur les autres
milieux.
Les cals repiqués tous les 60 jours dégénèrent entre le 30e jour et le 60e jour de culture,
avant même le premier repiquage et l'évolution de la croissance n'a pas été représentée.
Pour les lignées de cals d'origine foliaire, la croissance apparaît très lente: elle double
en moyenne après deux mois en milieu liquide (700 mg) (tableau 19). Aucune différence entre
les milieux et entre les fréquences de repiquages (tous les 15 ou 30 jours) n'a été observée.
Comme pour L7, les cals choisis pour être repiqués tous les deux mois, dégénèrent
rapidement.
1.2- Cals dont la multiplication est assurée par une assise protodermique (<< type II »)
1.2.1- ETUDE MORPHOLOGIQUE ET HISTOLOGIQUE

Les cals apparaissent très friables en milieu liquide. En histologie, l'aspect des cals est
très proche de celui observé en milieu solide : structure en « rubans» composés de deux
assises cellulaires de type protodermique. De nombreux plans de fragmentation sont observés,
ce qui permet la libération de massifs de petite taille (Planche XIII, photo 5). Les cals ont une
couleur plus blanche qu'en milieu solide. De plus, la présence de cellules embryogènes et de
proembryons est observée au bout de 15 jours en milieu liquide, en particulier sur les milieux
l l
contenant 130 et 140 mg.r de 2,4-D en présence de 3 g.r de charbon actif (tableau 20).
L'initiation de l'embryogenèse se déroule de façon équivalente à celle observée en milieu
solide. Cependant, comme chez L7, les massifs sont entourés de charbon actif qui semble
adhérer aux tissus.
L'initiation de l'embryogenèse somatique est rapidement suivie d'une baisse puis d'une
perte du potentiel embryogène après 60 jours de culture. Ensuite, les cals dégénèrent (tableau
20).
1.2.2- SUIVI DE LA CROISSANCE DES CALS

La croissance double au bout d'un mois de culture pour des cals repiqués tous les 15
jours (700 mg) (tableau 20). Les cals de type II ont un comportement homogène entre les
erlenmeyers d'un même niveau de traitement. Par ailleurs, il n'y a pas de différence
significative entre les différentes concentrations en 2,4-D (tableau 20).
161
1600
1400
CIl
.c: 1200
-.. -
~
~
CIl
:S!
~E
Cl
1000
800
E- 600
CIl
oc
CIl 400
oc 60 Temps (j)
ë5 200
D.
CA /Ropiq .
(g .~l1 ~)
2130
Milieux
(2,4-0: 110 mg.l-1)
Figure 43 : Evolution du poids frais moyen des cals en milieu liquide en présence de
110 mg.l' de 2,4-D, en fonction de la concentration en charbon actif et de la
l
fréquence de repiquage. 2 g.r 1 de charbon actif 1 g.r de charbon actif
*Charbon actif (CA)/Repiquage (Repiq.) : le lor chiffre indique la concentration en charbon actif
en g.l" ; le 2" chiffre, la fréquence de repiquage en jours U)
* Les parties de courbes en pointillés (_._-) indiquent que les cals ont dégénéré sur les milieux
correspondants; le dernier poids relevé est donné arbitrairement jusqu'au 60e jour de culture.
* Les valeurs représentent la moyenne de 3 répétitions par niveau de traitement ("concentration en
2,4-D x concentration en charbon actifx repiquage").
0
* ANGY A au 30 jour de culture: 2,4-D : F(J.3S) = 10,74 (**); Charbon Actif: F(1.3S) = 29,09 (**) ;
Repiquage: F(1 .3S) = 60,50 (***)j Effet du 2,4-D en fonction du repiquage: F(J,3S) = 4,5 (*); Effet
du charbon actif en fonction du repiquage: F(I .3S) = 7,5 (*) (F = test Fisher-Snedecor; niveau de
signification: *** = très hautement significatif (1%0); ** = hautement significatif (1%); * =
significatif (5%)).
162
TABLEAU 20 : Essai de transfert en milieu liquide de lignées de cals de type II :
Effet de la concentration en 2,4-D et de la concentration en charbon actif
Initiation de
Lignée Milieu solide Milieux l' embryogenèse Croissance du Etat des cultures Etat des cultures
de liquides somatique après 15 j. matériel frais après 30 j. après 60 j. après 90 j.
multiplication
2,4-D CA (g.r ) CA (g.r) CA (g.r) CA (g.r)

l
(mg.r ) 1 2 3 1 2 3 1 2 3 3
GIOO 100 - - ++ - - ++ mort mort perte PE mort
L82 110 - - ++ - - ++ mort mort perte PE mort
(100 m~.rl 120 - - ++ - - ++ mort mort perte PE mort
13 g.r) 130 - - +++ - - ++ mort mort perte PE mort
2,4-D 140 - - +++ - - ++ mort mort perte PE mort
ICA 150 - - ++ - - ++ mort mort perte PE mort
* Observations réalisées à partir de 3 erlenmeyers par niveau de traitement « concentration en 2,4-0 x concentration en charbon actif ».
* Repiquage: repiquages effectués tous les 15 jours.
* Initiation de l'embryogenèse somatique en milieu liquide après le 15e jour de culture :
- estimation réalisée au 60e jour de culture par mesure du poids de matière fraîche: - : pas de croissance; + : croissance inférieure à 700 mg; ++ : croissance comprise
entre 700 mg et 1500 mg.
Les cals repiqués tous les 30 (ou 60 jours), en présence de 1 ou 2 g.r l de charbon,
dégénèrent rapidement.
1.3- Conclusion
Ces essais préliminaires ont montré des résultats encourageants :
• les cals peuvent se maintenir et se multiplier en milieu liquide en présence de certaines
concentrations en 2,4-D et en charbon actif et d'une fréquence de repiquage optimale de 15
jours;
• une libération d'éléments de dimension assez réduite a pu être obtenue chez les deux types
de cals testés. Cependant, pour les cals de type J, les groupes de cellules qui s'isolent sont
très cohésifs et ne se fragmentent pas eux-même en éléments de taille plus réduite. Ils
deviennent au contraire très compacts, par une différenciation des tissus en trachéides.
Seuls les cals de type Il montrent une forte friabilité par la libération de massifs cellulaires
de taille réduite;
• une initiation de l'embryogenèse d'origine unicellulaire est observée après le passage en
milieu liquide à partir des cals qui sont au départ en condition de multiplication.
Quelle que soit la lignée de cals testée, une dégénérescence des cellules embryogènes
est observée au 60e jour de culture. Les cals retournent à l'état méristématique puis
dégénèrent plus ou moins rapidement. Ces données nous ont conduit à étudier le transfert en
milieu liquide, de cals préalablement induits en embryogenèse en milieu solide.
2- ESSAIS AVEC DES CALS PREALABLEMENT INDUITS EN EMBRYOGENESE

EN MILIEU SOLIDE
Des cals dont l'embryogenèse a été initiée en milieu solide enrichi en 2,4-D, mais aussi
sur milieu enrichi en saccharose, ont été transférés en milieu liquide. Une perte du potentiel
embryogène, une absence de prolifération, suivie d'une dégénérescence rapide des cals, sont
observées quel que soit le degré d'évolution des structures embryogènes transférées et quelle
que soit la lignée de cals.
CONCLUSION : La perte du potentiel embryogène et la dégénérescence des cals pourrait être

liée à la haute sensibilité des cals de cocotier au 2,4-D et à la présence de charbon actif dans
les milieux. Au cours du procédé en milieu gélosé, il est maintenant établi que l'un des
facteurs essentiels des capacités des tissus de cocotier pour la callogenèse et la compétence à
l'embryogenèse est un facteur double 2,4-D/charbon actif, lié aux capacités d'adsorption du
charbon (VERDEIL, 1993). Le manque de contrôle de cet équilibre est une des principales
164
causes d'hétérogénéité des tissus envers la callogenèse. Il pourrait être aussi en partie relié aux
déviations de l'embryogenèse souvent observées chez le cocotier. En milieu solide, les cals
sont adaptés à un équilibre dynamique 2,4-D libre/2,4-D adsorbé soumis à la désorption
possible du 2,4-D en cours de culture et l'adsorption des composés polyphénoliques produits
par les tissus. Le passage en milieu liquide conduit, d'une part, à modifier cet équilibre et,
d'autre part, à modifier les échanges entre les tissus et le milieu. La pellicule de charbon qui
recouvre de façon très hétérogène les tissus en milieu liquide peut entraîner une forte
variabilité dans la disponibilité du 2,4-D pour les tissus.
Il est à noter que chez le palmier à huile, la prolifération des suspensions nécessite la
présence de charbon actif. Cependant, DE TOUCHET et al. (1991) soulignent que son emploi
est un point négatif pour la maîtrise des paramètres du milieu et ces auteurs ont pour objectif
de s'en affranchir.
Toutes ces données nous ont conduit à tester l'influence du retrait du charbon actif sur le
maintien des cals en milieu liquide.
3- TRANSFERT EN MILIEU LIQUIDE EN ABSENCE DE CHARBON ACTIF
3.1- Ajustement de la concentration en 2,4-D libre

Pour travailler en milieu liquide sans charbon actif, il était important d'apporter aux
cultures une concentration en 2,4-D équivalente à celle utilisée normalement après la
réalisation de l'équilibre d'adsorption 2,4-D libre/2,4-D adsorbé. La concentration en 2,4-D
est alors inférieure à celle qui est ajoutée au moment de la fabrication des milieux.
Deux approches ont été étudiées :
• la première a été de préparer les milieux sans charbon actif mais en ajustant la
concentration en 2,4-D ;
• la seconde a été de préparer les milieux en présence de charbon actif sans modifier la
concentration en 2,4-D, de laisser l'équilibre d'adsorption se réaliser pendant les 8 jours
nécessaires, et d'éliminer le charbon au moment de la mise en culture. Pour cela, les
milieux sont préparés dans des bocaux au fond desquels le charbon actif décante. Le
surnageant contenant le milieu est alors prélevé.
Les lignées de cals de type 1 dégénèrent au bout de deux jours en milieu liquide en
absence de charbon actif par brunissement intense des tissus, ceci quelle que soit l'approche
envisagée. De même, les cals préalablement induits en embryogenèse en milieu solide,
dégénèrent une fois placés en milieu liquide. Nos études se sont donc focalisées sur les cals de
type II en condition de multiplication avant le transfert en milieu liquide.
165
Pour la première approche, nous avons tout d'abord déterminé (par HPLC) la
concentration en 2,4-D libre qui existe dans les milieux liquides, après la réalisation de
l'équilibre d'adsorption. Nous avons sélectionné deux milieux dans lesquels les cals de type II
avaient montré une bonne prolifération et une initiation de l'embryogenèse au cours des essais
l l
précédents (tableau 20) : 110 mg.r et 130 mg.r de 2,4-D en présence de 3 g.r l de charbon
actif.
Le dosage du 2,4-D libre par HPLC dans ces milieux montre respectivement une
l
concentration de 1,25 et 1,5 mg.r .
Nous avons placé les cals dans des milieux de base additionnés de 2,4-D à ces deux
concentrations. Cependant les cals brunissent et dégénèrent rapidement.
Pour la deuxième approche, les cals ont été placés dans des milieux préparés en
l l
présence de 110 mg.r l et 130 mg.r de 2,4-D et de 3 g.r de charbon actif, mais pour lesquels
le charbon actif a été éliminé au moment de la mise en culture. Dans ces conditions, les cals
montrent un début de prolifération.
Aux vues de ces résultats, de nouveaux essais ont été réalisés selon la seconde approche.
Une gamme plus large de concentrations en 2,4-D et en charbon actif a été testée: entre 60 et
150 mg.r l de 2,4-D et 1,2 et 3 g.r l de charbon actif (tableau 21).
Deux fréquences de repiquages ont été testées : tous les 15 ou 30 jours. Seuls les cals
repiqués tous les 15 jours se maintiennent et proliférent.
Cependant, nous avons dû rapidement changer la façon de repiquer. Le renouvellement
complet du milieu ne permet pas une bonne évolution des cals qui ont tendance à jaunir et
e
dégénérer au bout du 3e ou 4 repiquage. Nous avons donc testé l'effet d'un renouvellement de
moitié du milieu de culture à chaque repiquage, le reste étant composé de l'ancien milieu
laissé dans l'erlenmeyer.
Dans ces conditions, les cals prolifèrent et montrent un début de fragmentation en unités
de taille plus réduite. Ce procédé a donc été retenu dans la suite de nos études.
CONCLUSION : Ces essais ont montré la nécessité de préparer les milieux en présence de
charbon actif, même s'il est éliminé au moment de la mise en culture.
Le charbon adsorbe l'excès d'auxine mais il peut aussi adsorber d'autres composés du
milieu, comme par exemple, les vitamines, l'acide ascorbique (DRUART et DE WULF, 1993),
l'adénine sulfate et la BAP (VERDEIL, 1993). L'équilibre 2,4-D libre/2,4-D adsorbé est un
équilibre dynamique et il est difficile de déterminer de façon précise la concentration en
auxine libre.
166
TABLEAU 21 : Essai de transfert en milieu liquide de lignées de cals de type II en absence de charbon actif:
Effet de la concentration en 2,4-D
Lignée Milieu solide Milieux Initiation de Libération de Croissance Etat des cultures après 60 j. Etat des cultures
de liquides l'embryogenèse cellules du matériel après 6 mois
multiplication filtrés après 15 j. après 15j. après 30 j.
CA (g.r) CA (g.r) quelque soit CA (g.r') CA (g.r)

2,4-0 éliminé au moment éliminé au moment la éliminé au moment éliminé au moment
mise en culture mise en culture concentration mise en culture mise en culture
l
(mg.r ) 1 2 3 1 2 3 en CA 1 2 3 2 3
60 + +++ ++ - + + ++ mort maintien PE maintien PE suspensions suspensions
80 + +++ ++ + - ++ ++ mort maintien PE maintien PE suspensions suspensions
GI00 100 + ++ ++ - + +++ ++ mort maintien PE maintien PE mort suspensions
L82 110 + ++ ++ - - ++ ++ mort maintien PE maintien PE mort suspensions
(lOO m~.rl 120 + + ++ + + - ++ mort perte PE maintien PE mort suspensions
13 g.r ) \30 + + +++ - - - ++ mort perte PE maintien PE mort suspensions
2,4-0 140 - - +++ - - - ++ mort perte PE maintien PE mort mort
ICA 150 - - ++ - - - ++ mort perte PE maintien PE mort mort
* Observations réalisées à partir de 3 erlenmeyers par niveau de traitement « concentration en 2,4-0 x concentration en charbon actif ».
* Repiquage: repiquages effectués tous les 15 jours.
* Initiation de l'embryogenèse somatique en milieu liquide après le 15e jour de culture:
* Libération de cellules isolées après le 15e jour de culture:
Comptage du nombre de cellules isolées sur Cellule Nageotte.
Pour 20 ml de milieu: - pas de libération de cellules isolées; + : nombre de cellules inférieur à 35000; ++ : nombre de cellules inférieur à 350000;
+++ : nombre de cellules inférieur à 500000.
- estimation réalisée au aOe jour de culture par mesure du volume cellulaire: ++ : croissance doublée en moyenne
Mainitien PE : maintien du potentiel embryogène; Perte PE : perte du potentiel embryogène; mort: dégénérescence puis mort des cultures.
Les milieux sont utilisés 8 jours après leur fabrication. Il a été montré par une étude
cinétique d'adsorption en 2,4-0 que l'adsorption est progressive pendant les 8 jours qui
suivent la fabrication des milieux. Elle est maximale et ne varie plus après cette période
(EBERT et TAYLOR, 1990). Ce résultat a été confirmé au laboratoire (ABERLENC-BERTOSSI,
communication personnelle).
3.2- Etude morphologique et structurale

L'absence de charbon actif a permis une étude plus détaillée de la morphologie et de la
structure des cals en milieu liquide. Nous avons pris en compte la couleur et l'aspect des cals,
l'aspect des milieux de culture et estimé la taille des agrégats en suspension (tableau 22).
Oans les conditions de culture retenues, les nodules qui composent les cals de type II se
séparent spontanément dans le milieu. Ils ont un diamètre inférieur à S mm. Ils commencent
par grossir, leur diamètre est alors compris entre S et 10 mm. Au ISe jour de culture en milieu
liquide, ces nodules libèrent rapidement des agrégats de diamètre plus réduit compris entre 1
et S mm (tableau 22). Sur les plus basses concentrations en 2,4-0, les cals ont une couleur
plus blanche que les cals en milieu solide. Sur de plus fortes concentrations en auxine, ils ont
au contraire tendance à jaunir. Certains milieux deviennent rapidement troubles.

Une étude de la structure des cals a été réalisée au cours du premier mois qui suit la
mise en culture en milieu liquide afin de suivre l'évolution des nodules en suspension.
3.3.1- OBSERVATIONS SUR MATERIEL VIVANT

Oes observations ont été faites au microscope inversé directement à partir d'un
erlenmeyer contenant une culture ou au microscope optique à partir d'une goutte de
suspension entre lame et lamelle. Les nodules qui constituent les cals mis en culture se
séparent spontanément du reste du cal sous l'effet de l'agitation des erlenmeyers. Les agrégats
de taille réduite, libérés par les nodules après le ISe jour de culture en présence de certaines
concentrations en 2,4-0 (tableau 21), sont composés de 2 à SO cellules (Planche XIV,
photo 1). Ces agrégats voisinent avec des cellules isolées. Ces cellules sont parfois arrondies,
souvent plus ou moins allongées (Planche XIV, photo 2). L'aspect trouble des milieux
observé à certaines concentrations en 2,4-0 est dû à la présence de massifs cellulaires de très
petite taille et de cellules isolées (tableau 22 et Planche XIV, photos 1 et 2).
Pendant 6 mois, le matériel en suspension prolifère essentiellement sous forme de cals

volumineux de diamètre supérieur à 2 mm et la libération de massifs de taille plus réduite est
très limitée. La taille de ces cals est supérieure à celle des massifs en suspension
classiquement décrite dans la littérature.
168
PLANCHE XIV
Structure histologique des cals en milieu liquide
Observation sur matériel vivant (coloration au carmin acétique)
1. Massifs cellulaires en suspension (barre: 80 J,lm)

2. Détail d'un massif composé de cellules méristématiques (barre: 40 J,lm)
Ca : cellule allongée; Cm : cellule méristématique; Mc : massif cellulaire; N : noyau.

1
-
Ca
Cm
2
-
TABLEAU 22 : Caractéristiques morphologiques des cals et aspect des milieux
après 15 jours de culture en milieu liquide en fonction de la
concentration en 2,4-D et en charbon actif
(charbon actif éliminé au moment de la mise en culture)
Milieu: Couleur des Diamètre des Aspect du

2,4-D/CA suspensions massifs milieu
(mg.rl/g.r l) cellulaires libérés
par les cals (mm)
60/1 Jaune 5 limpide jaune
80/1 jaune/blanc 5 trouble
100/1 jaune/orange 5 limpide
110/1 jaune/orange 3 limpide
60/2 jaune 3 trouble
100/2 jaune/blanc 1 limpide
110/2 Jaune 3 limpide
120/2 Jaune 3 trouble
130/2 jaune/blanc 5 limpide
140/2 jaune 2 limpide
60/3 blanc 5 trouble
140/3 orange 2 limpide
150/3 orange 2 limpide
Cependant, les cultures s'enrichissent peu à peu d'une population d'agrégats de très
petite taille et de cellules isolées. Lorsque ces agrégats et ces cellules constituent une
biomasse suffisante (entre 400 et 500 mg en poids de matière fraîche), ils sont capables de
proliférer indépendamment des cals qui leur ont donné naissance. Ces massifs donnent, au
bout de 6 mois, au matériel en milieu liquide l'aspect typique de suspensions. Les suspensions
de cocotier ont alors été considérées comme stabilisées.
3.3.2- OBSERVATIONS SUR MATERIEL FIXE

Avant le transfert en milieu liquide, les cals, qui sont en condition de multiplication,
sont essentiellement constitués de deux assises protodermiques en « rubans ».
Quelques jours après le transfert en milieu liquide sans charbon actif, les cals prolifèrent
sous forme de gros agrégats de nodules composés de cellules de type méristématique au
noyau volumineux et au cytoplasme dense (Planche XV, photo 1). Au bout de 15 jours de
culture, la présence de cellules de type embryogène au sein de certains nodules permet de
montrer qu'une initiation de l'embryogenèse est obtenue en milieu liquide. L'initiation de
l'embryogenèse est d'origine unicellulaire. Elle se déroule de façon équivalente à celle
observée en milieu solide. (Planche XV, photo 2). Parallèlement, les nodules montrent des
plans de fragmentation constitués d'une matrice gélifiée, colorée en rose par le réactif de
Schiff. Ces plans de fragmentation sont observés entre les massifs en dissociation et/ou des
plages en dégénérescence (Planche XV, photo 2). L'agitation constante des erlenmeyers est
l'agent mécanique qui permet la séparation des nodules.
Entre le 15e et le 28e jour de culture, à côté des cellules embryogènes, des proembryons
sont observés au sein de certains nodules. Ils se forment au sein d'une zone très gélifiée, qui
est colorée en rose par le réactif de Schiff et donc de nature vraisemblablement
polysaccharidique. Une partie importante du nodule dégénère et les cellules embryogènes et
proembryons côtoient alors des cellules hautement vacuolisées ou en voie de dégénérescence
(Planche XV, photo 3). Une libération d'agrégats de très petite dimension et de cellules
isolées est ensuite observée (Planche XV, photo 4). Ces agrégats sont composés de cellules
méristématiques, de cellules embryogènes mais aussi de proembryons plus ou moins isolés.
Cependant, cette catégorie cellulaire compose une population cellulaire assez réduite et
le matériel en suspension est essentiellement constitué des nodules qui continuent à proliférer.
Par divisions cellulaires actives, les massifs redonnent des agrégats de nodules assez
volumineux tels que ceux représentés sur la photo 1, Planche XV.
Après 60 jours de culture, le potentiel embryogène est maintenu sur plusieurs milieux
(tableau 21). Le renouvellement du milieu tous les 15 jours permet de réinitier la formation de
cellules embryogènes et de proembryons et les cals continuent à proliférer et à libérer des
unités de taille très réduite et des cellules isolées (tableau 21).
170
PLANCHE XV
Structure histologique des cals en milieu liquide
1. Nodules méristématiques de cals de type TI isolés (barre: 100 ~m)

2. Détail d'un nodule en suspension. Initiation de l'embryogenèse somatique d'origine
unicellulaire en milieu liquide (barre: 100 ~m)
3. Cellules embryogènes et proembryons au sein d'un nodule (barre: 100 ~m)
4. Libération de massifs cellulaires et de cellules isolées (barre: 100 ~m)
CE : cellule embryogène; Mg : matrice gélifiée; PE : proembryon; zr: zone de fragmentation.

3.4- Suivi de la croissance des cals

Après 15 jours en milieu liquide, les cals forment une masse très hétérogène composée
en partie des cals volumineux de départ et en partie des structures de très petite dimension
libérées en cours de culture. Il s'est alors avéré difficile de la prélever afin d'en déterminer le
poids de matière fraîche en vue d'un suivi de la croissance. Seule une estimation grossière a
pu être réalisée: la croissance double en moyenne entre deux repiquages (tous les mois)
(tableau 21). Les cals continuent à proliférer après 90 jours de culture. Ils ont un
comportement homogène entre les erlenmeyers.
3.5- Conclusion
A partir de ces résultats, nous avons choisi de nous focaliser sur l'étude des lignées de
cals de type II. Ce sont les seules lignées ayant montré un maintien du potentiel embryogène,
une prolifération et enfin une libération d'agrégats cellulaires, en absence de charbon actif.
Cinq concentrations différentes ont permis d'obtenir la prolifération des cals: 60, 80,
I I
110, 130 mg.r I de 2,4-D avec 3 g.r l de charbon et 80 mg.r de 2,4-D avec 2 g.r de charbon.
Sur ces milieux, les cals puis les suspensions ont une couleur blanche ou jaune clair, qui peut
être considérée comme un critère visuel permettant d'apprécier rapidement la prolifération de
I
la suspension. Pour de trop fortes concentrations en 2,4-D libre (150 mg.r de 2,4-D en
présence de 1 à 2 g.r I de charbon), les cultures brunissent puis dégénèrent sans doute sous
_l'effet d'une grande sensibilité à l'auxine et par accumulation de composés polyphénoliques.
La concentration en 2,4-D libre des cinq milieux retenus semble donc bien ajustée pour
assurer la libération et la prolifération des nodules mais aussi l'initiation de l'embryogenèse et
le maintien du potentiel embryogène. En raison de la présence de charbon actif dans les
milieux avant la mise en culture, une certaine proportion de 2,4-D a été adsorbée. De plus, en
renouvelant seulement la moitié du milieu à chaque repiquage, on diminue la quantité de
2,4-D disponible. Ces observations nous ont amené à contrôler la quantité en 2,4-D libre
présente dans les milieux au moment du repiquage.
4- CONCENTRATION EN 2,4-D LIBRE DES MILIEUX DE PROLIFERATION

SELECTIONNES
Trois types de dosage ont été réalisés:

• un dosage de la quantité en 2,4-D restant dans le milieu liquide à la fin d'un cycle culture
de 15 jours du repiquage;
171
2.5 - , - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
2+--------------------
~1
~ 1.5+----------------
N.-
c -1
~
§ oiJ- 1- j - - - - - - - - - - -
.- e
-
~
1.
C
~
CJ
C
Q
0.5+ - - - - - - -
U
G60/3 G80/3 GlIO/3 G130/3 G80/2
Milieux
Figure 44 : Concentration en 2,4-D libre dans les milieux liquides de prolifération:

: milieu prélevé en fin de cycle de culture (I5e jour de culture)
• : milieu prélevé 8 jours après sa fabrication et n'ayant pas reçu de culture *
• : milieu prélevé le premier jour du repiquage d'un cycle de culture
G60/3, G80/3, G 110/3, G80/2 : milieux de prolifération contenant respectivement 60, 80, 110,
l
130 mg.l" de 2,4-D/ et préparés en présence de 2 ou 3 g.r de charbon actif; le charbon actif est
éiminé au moment du repiquage.
Chaque barre d'histogramme représente la moyenne de 3 répétitions
* Les milieux ont été prélevés 8 jours après leur fabrication; cette période est nécessaire à la
réalisation de l'équilibre 2,4-D libre/ 2,4-D adsorbé par le charbon actif.
172
• le dosage de la quantité de 2,4-D libre présente dans les milieux, 8 jours après leur
fabrication, au moment où le charbon est éliminé et les milieu utilisés pour le repiquage;
• un dosage de la quantité de 2,4-D présente dans le milieu le premier jour du cycle de
culture une fois le repiquage réalisé (renouvellement de moitié du milieu).
A la fin d'un cycle de culture, la quantité d'auxine présente dans le milieu est comprise
entre 0,01 et 0,25 mg.r l .
La quantité en 2,4-D libre des milieux neufs est comprise entre 0,3 et 2,25 mg.r l selon
la concentration en 2,4-D initiale.
La quantité de 2,4-D après repiquage est comprise entre 0,25 et 1,25 mg.rl(Fig. 44).
5- CONCLUSION
Ces essais ont permis de sélectionner les cals compétents en milieu liquide. Il faut
souligner ici l'importance d'un contrôle histologique systématique de l'état des cultures. Il
constitue notre principal critère d'étude et le seul moyen pour vérifier que le potentiel
embryogène est maintenu en milieu liquide.
Les nodules qui composent les cals de type 1 possèdent un niveau d'organisation
structural important difficile à dissocier et qui est dû au fonctionnement hautement régulé de
la zone méristématique de type cambial qui caractérise ces cals (VERDEIL, 1993). Elle pourrait
en partie empêcher la friabilisation des cals.
La structure des cals de type II, constitué d'un seul type de tissus de nature
protodermique, est beaucoup plus friable; une fois libérés dans le milieu liquide, ces cals se
séparent facilement. Ils forment tout d'abord une suspension très grossière. Les nodules qui
les composent ont alors une structure très proche de celle des nodules décrits chez le palmier à
huile (DE TOUCHET, 1991). Chez le palmier, les nodules sont capables de proliférer
indéfiniment en présence de 2,4-D. Chez le cocotier, il s'opère une sélection et une
stabilisation d'agrégats de petite dimension constitués en majorité de cellules méristématiques
et structures proembryogènes d'origine unicellulaire. C'est cette catégorie cellulaire qui forme
une suspension considérée comme établie.
173
L'initiation de l'embryogenèse doit se dérouler en milieu liquide. En effet, seuls des cals
initialement au stade de multiplication montrent une évolution. Tout se passe comme si les
cals préalablement induits en embryogenèse en milieu solide sont engagés vers un processus
déterminé adapté à l'environnement solide. En fait, cet engagement est lié à la haute
sensibilité des tissus envers le 2,4-D. En présence ou en absence de charbon actif, le passage
en milieu liquide conduit à modifier les échanges entre les tissus et le milieu, en particulier au
niveau de la concentration en 2,4-D. Il semble alors qu'il faut initier le processus
morphogénétique entièrement dans ce nouvel environnement.
Les cals à l'origine des suspensions ne peuvent proliférer qu'en absence de charbon actif
et en renouvelant seulement la moitié du milieu à chaque repiquage. Ces résultats sont
contradictoires avec ceux observés en milieu solide. En effet, les cals de type II ne prolifèrent
qu'en présence de charbon actif en milieu gélosé. Il semble que le procédé utilisé permet un
ajustement optimal de la concentration en auxine.
Après transfert en milieu liquide, six mois sont nécessaires pour considérer les
suspensions comme établies. Au bout de six mois, les massifs cellulaires forment une
suspension stable dont les conditions de culture doivent être étudiées. Les essais en absence de
charbon s'avèrent particulièrement intéressants : ils permettent de faciliter les étapes de mise
en culture et de repiquage. Ils vont nous permettre d'étudier, plus commodément le mode de
prolifération des suspensions. De plus, celles-ci forment une masse hétérogène composée de
différentes catégories cellulaires. Par exemple, les cellules isolées prennent-elles naissance à
partir des plus gros massifs par fragmentation ou bourgeonnement, sont-elles capables de se
diviser? Ces études font l'objet du second chapître.
174
PLANCHE XVI
Suspensions embryogènes, observations sur matériel vivant
(coloration au carmin acétique)
1 à 3. Massifs cellulaires en suspension. Certains massifs montrent des divisions cellulaires

(barre: 40 Ilm)
4 à 6. Libération possible d'une cellule isolée à partir d'un massif cellulaire (barre: 40 Ilm
saufpour n04 : 80 J-lm)
7. Massif de deux cellules (barre: 100 Ilm)
8. Unité de cellules arrondies méristématiques côtoyant deux cellules allongées
(barre : 100 Ilm)
9. Groupe de cellules plus ou moins allongées (barre: 100 J-lm)
10. Cellule allongée isolée dans le milieu (barre: 100 J-lm)
D : divisions cellulaires.
1
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PROLIFERA TlON DES SUSPENSIONS
- C~ITR.E II-
PROLIFERATION DES SUSPENSIONS
INTRODUCTION
Après transfert en milieu liquide, SIX mois sont nécessaires pour considérer les
suspensions comme établies. Le critère retenu est que les cellules isolées ou les groupes de
cellules en suspension sont capables de proliférer indépendamment des cals qui leur ont donné
naIssance.
Après six mois de culture, les suspensions montrant le plus d'homogénéité dans leur
aspect (couleur blanche/jaune) et dans leur mode de prolifération sont celles maintenues sur
un milieu préparé avec 60 mg.r) de 2,4-0. Ce milieu a alors été privilégié. Les cultures sur les
quatre autres milieux qui avaient été sélectionnés (G80/3, G11 0/3, G130/3 et G80/2) ont été
limitées à quelques erlenmeyers.
Toutes les études qui vont suivre ont été réalisées à partir du milieu G60/3.
Après leur établissement, les modalités de croissance des suspensions ont été
déterminées; de plus, leur taux de viabilité et le nombre des différentes catégories cellulaires
existantes a été estimé. Enfin, une étude histocytologique a été réalisée.
1- ETUDE MORPHOLOGIQUE ET STRUCTURALE DES SUSPENSIONS
1.1.1- ÛBSERVATIONS SUR MATERIEL VIVANT

Des observations réalisées au microscope inversé directement dans un erlenmeyer, ou
sur lame et après coloration au carmin acétique, montrent que les suspensions sont constituées
de massifs de dimension très variable. Quelques agrégats de 1 mm à 2 mm (plus de 50
cellules) voisinent avec de nombreux agrégats de diamètre inférieur à 1 mm (généralement de
2 à 50 cellules) et des cellules isolées. Les agrégats libèrent des agrégats de dimension plus
réduite et/ou des cellules par fragmentation sous l'effet de l'agitation des erlenmeyers. Les
agrégats de dimension inférieure à 1 mm et cellules isolées constituent la population
majoritaire au sein des suspensions.
175
PLANCHE XVII
Structure des suspensions embryogènes
1. Suspensions en erlenmeyer (barre: 7 mm)

2. Ensemble de massifs cellulaires en suspension (barre: 130 ~m)
3. Complexes proembryogènes et cellules isolées entourés par des parois pectocellulosiques
modifiées (barre: 20 Jlm)
4. Complexe proembryogène isolé près de cellules vacuolisées et/ou en dégénérescence
(barre : 40 Jlm)
5. Cellules isolées (barre: 80 Jlm)
CPE : complexe proembryogène; Cv : cellule volumineuse vacuolisée; PE : proembryon; Pm : paroi

modifiée; V : vacuoles; Zd : zone en dégénérescence.
Les agrégats sont eux-même composé d'un ensemble d'unités cellulaires aux parois
bien délimitées (Planche XVI, photo 1). Ces unités sont constituées majoritairement de 1 à 2
cellules, mais elles peuvent en contenir plus (Planche XVI, photos 1 et 2). Certaines peuvent
contenir jusqu'à 10 cellules. Elles peuvent se fragmenter en groupe ou isolées dans le milieu
(Planche XVI, photos 2 et 3). Les cellules au sein de chaque unité sont capables de se
dissocier.
Certains agrégats peuvent libérer des files de cellules qui peuvent elles-même s'isoler
dans le milieu (Planche XVI, photos 4 à 6). Les cellules isolées peuvent se diviser, comme en
témoigne la présence de groupes de deux cellules arrondies dont les noyaux sont excentrés et
qui proviennent de la division initiale d'une cellule isolée (Planche XVI, photo 7).
Les agrégats de cellules arrondies côtoient des cellules plus ou moins allongées (Planche
XVI, photo 8). Celles-ci peuvent être en groupe ou isolées dans le milieu (Planche XVI,
photos 9 et 10). L'ensemble du matériel en suspension forme une structure hétérogène au sein
des suspensions (Planche XVII, photo 1).
La prolifération des suspensions est assurée par des divisions cellulaires au sein de
chaque unité qui composent les agrégats en suspension et au sein des cellules isolées
arrondies. Nous n'avons pas observé de division au sein des cellules allongées isolées.
1.1.2- OBSERVATlüNS SUR DU MATERIEL FIXE

Sur matériel fixé, l'ensemble des agrégats de petite dimension, qui composent la
population cellulaire majoritaire des suspensions, forme une structure en « chapelets
cellulaires» composés de files de cellules isolées ou de très petits massifs de 1 à 10 cellules
(Planche XVII, photo 2).
Les agrégats plus volumineux sont constitués de cellules entourées de parois
pectocellulosiques à l'aspect épaissi et qui sont situées en périphérie d'une zone centrale en
dégénérescence. Ces cellules peuvent côtoyer des groupes de cellules de taille plus ou moins
importante qui ont un aspect équivalent aux complexes proembryogènes décrits en milieu
solide (Planche XVII, photo 3). Ayant établi que l'initiation de l'embryogenèse est d'origine
unicellulaire, il est fort probable que les complexes observés proviennent de la segmentation
d'une cellule unique. Les unités proembryogènes sont composées de 2 à 3 cellules. Les
cellules sont dépourvues de réserves et montrent un vacuome développé (Planche XVII,
photos 3 et 4).
Les agrégats possèdent une structure peu cohésive, ce qui permet la libération des
complexes proembryogènes et des cellules isolées sous forme d'agrégats de différentes
dimensions. Les complexes proembryogènes sont également capables de proliférer et de se
fragmenter. Ils donnent alors naissance à des agrégats d'unités proembryogènes. Tous ces
agrégats sont les agrégats de petite dimension observés au sein de l'erlenmeyer.
176
PLANCHE XVIII
Caractéristiques ultrastructurales des suspensions
1. Massif proembryogène entouré de parois pectocellulosiques dépourvues de plasmodesmes

dont les cellules sont caractérisées par un vacuome développé
2. Détail d'une cellule de massif cellulaire en suspension; dépôt d'un matériel dense aux
électrons de nature lipo-protéique au sein des vacuoles
3. Mitochondries et plastes proches des parois modifiées et d'une vacuole au sein des cellules
en suspension
4. Réticulum endoplasmique granulaire développé en périphérie de certaines cellules
5. Structures de type myéloïde très développées dans l'appareil vacuolaire
LP : dépôt de nature lipo-protéique; My : figure de type myéloïde; N : noyau; n : nucléole; P : paroi

pectocellulosique; Pt : plaste; REG : réticulum endoplasmique granulaire; T : tonoplaste; V : vacuole.
•
t-
,.
f
... "
1·
,
5
La fragmentation des agrégats est assurée par l'existence de zones gélifiées, au sein des
tissus, fortement colorées en rose. Ces zones sont le plus souvent situées entre le complexe
proembryogène ou cellule à libérer et les plages de cellules en dégénérescence et/ou
hautement vacuolisées (Planche XVII, photos 3 et 4).
Les cellules isolées dans le milieu sont capables de se diviser (Planche XVII, photo 5).
Elles sont entourées d'une paroi pectocellulosique épaissie.
1.2- Etude en microscopie électronique

Des observations au microscope électronique ont été réalisées sur les agrégats et cellules
en suspension. Les cellules isolées ou les cellules formant les unités proembryogènes sont
entourées de parois externes dépourvues de plasmodesmes. En revanche, les parois entre les
cellules des unités proembryogènes sont minces et pourvues de plasmodesmes. Les cellules
montrent la présence d'un vacuome très développé autour du noyau (Planche XVIII, photo 1).
Au sein de certaines vacuoles, un dépôt de composés de nature vraisemblablement lipo-
protéique est visible (Planche XVIII, photo 2). Le cytoplasme occupe une faible partie de la
cellule. Sur l'ensemble des observations réalisées, on note la présence de nombreuses
mitochondries. Des proplastes peuvent être présents (Planche XVIII, photo 3). Cependant,
leur nombre est très faible.
Au sein d'autres cellules, on note la présence de profils réticulaires développés (Planche
XVIII, photo 4) et de figures de type myéloïde (Planche XVIII, photo 5).
Certaines cellules sont en voie de se séparer du massif-mère (Planche XIX, photo 1). La
lamelle moyenne autour de ces cellules est très complexe et souvent vésiculée. On peut
observer, entre certaines cellules, des plans de fragmentation à des stades plus ou moins
avancés qui proviennent d'une digestion de la lamelle moyenne (Planche XIX, photos 2 et 3).
La présence de figures myéloïdes et d'un réticulum très développé est signe d'un stress
et d'un certain degré de sénescence (DA VIS et BREZEANU, 1979). Les plages cellulaires qui
montrent ces figures pourraient correspondre aux plages de cellules vacuolisées en
dégénérescence visibles en histologie autour des unités et complexes proembryogènes.
1.3- Discussion
Terminolo~ie utilisée :
Les suspensions de cocotier sont des suspensions cellulaires embryogènes qUI
prolifèrent sous forme de cellules isolées, d'unités et de complexes qualifiés de
proembryogènes par l'analogie que ces structures montrent avec les unités et les complexes
proembryogènes, d'origine unicellulaire, observés en milieu solide.
177
PLANCHE XIX
Caractéristiques ultrastructurales des suspensions
1. Cellule entourée par une paroi épaissie et d'une lamelle moyenne très complexe et
vésiculée; cellule en voie de séparation du massif-mère
2. Détail d'une lamelle moyenne comportant des zones de fragmentation
3. Zone de fragmentation au sein d'un massif
Lm : lamelle moyenne; P : paroi pectocellulosique; V : vacuole.

PROLIFERA TION DES SUSPENSIONS
d
d
3
c-
-e
00
U
2
b
> a
1 1
OJ
0 5 10 15 20 25 30 35
Temps ü)
Figure 45 : Evolution du volume cellulaire sédimenté (VCS) des suspensions.

Les mesures ont été réalisées en tubes gradués
Chaque point représente la moyenne de 3 répétitions. Les points suivis de la même lettre ne sont
pas significatifs au seuil de 5% selon le test de Newman et Keuls.
ANOVA : T15 : F(7,JI) = 46,99 (***) (F = test Fisher-Snedecor; niveau de signification: *** =
très hautement significatif (1%0».
178
Lors du procédé en milieu solide, les complexes proembryogènes, qui proviennent de la

segmentation d'une cellule embryogène unique, sont capables de donner naissance, après
croissance suffisante, à des nodules méristématiques volumineux. Après diminution de la
concentration en 2,4-0 et élimination de l'auxine, ceux-ci peuvent former un protoderme et se
polariser. Ces nodules sont à l'origine des embryons (VEROEIL, 1993). En milieu liquide, les
complexes sont capables de se fragmenter et de donner des agrégats qui seront définis comme
des massifs d'unités proembryogènes capables de proliférer en suspension.
2- MODALITES DE CROISSANCE DES SUSPENSIONS
2.1- Suivi de la croissance des suspensions

La croissance des suspensions a été suivie en mesurant le volume cellulaire sédimenté
(VCS). Cette méthode a l'avantage d'une perte de matériel limitée par rapport à la mesure du
poids frais puisque les suspensions sont versées directement de l'erlenmeyer dans un tube
gradué, dans laquelle elles décantent. De plus, elle a l'avantage d'éviter les prélèvements
successifs du matériel hors du milieu réalisés lors des pesées, pour lesquelles le matériel est
préalablement séché sur papier filtre. Ces différentes manipulations ont tendance à abimer les
suspensions et apportent un biais lors de l'étude des courbes de croissance. La méthode du
volume cellulaire a été adoptée chez d'autres plantes, tel que le palmier à huile. Chez le pin,
LULSOORF et al. (1992) soulignent que l'évolution du VCS est hautement corrélée à celle du
poids sec de suspensions et propose son utilisation pour le suivi de la croissance.
Des études préliminaires ont permis de montrer, que pour un VCS compris entre 0,5 et 4
ml, le poids initial d'inoculum n'a pas d'effet sur la prolifération des suspensions. Au-delà de
ces deux valeurs, les suspensions sont en quantité trop faible, ou trop élevée pour montrer une
bonne prolifération. Nous avons donc fixé au départ un VCS égal à 1 ml qui correspond à
environ 500 mg de matière fraîche.
Une courbe de croissance a été réalisée sur milieu 060/3 en prélevant des lots différents
de cals tous les 5 jours pendant 35 jours et sans repiquage intermédiaire. A TO, chaque
erlenmeyer a reçu un volume cellulaire égal à 1. Le milieu est constitué de moitié de l'ancien
milieu et de moitié d'un nouveau milieu.
Entre TO et T5, la croissance n'apparaît pas significative (Fig. 45). Entre T5 et T20, elle
augmente fortement pour atteindre un VCS proche de 2,5 ml. Entre T25 et T35, elle se
stabilise jusqu'à un VCS égal à 3.
179
350000 0 Massifs de 2 à 10 cellules

.-
.--1=3
~
250000
~
"C
ë 150000
=
N
a.. Cellules isolées
=
-.-
Q
Cloo
r Ij
f
50000
o •
---------
_ ~ _ ~ _ ~ _ ~ ] Massifs de 10 à 50 cellules
= L
-
"Si
~
y
-50000
o 5 10 15 20 25 30 35
.-
~
r Ij
rIj
400--,--------------------,
[li]
=
e 300
~
"C
f
,.Q
200
e
Q
Z 100
Massifs de plus de 50 cellules
0-"-----------------------'
o 5 10 15 20 25 30 35
Temps (j)
Figure 46 : Estimation du nombre de massifs cellulaires au cours du temps.
Chaque point est la moyenne de trois répétitions.
180
2.2- Numération des différents catégories cellulaires

Afin d'estimer au cours du temps la fréquence des différentes catégories de massifs au
sein d'une suspension, une numération cellulaire a été réalisée sur cellule Nageotte après six
mois de prolifération en milieu liquide.
Pour cela, nous avons arbitrairement distingué quatre catégories cellulaires qui
composent les suspensions :
• cellules isolées;
• massifs de 2 à 10 cellules;
• massifs de 10 à 50 cellules;
• massifs de plus de 50 cellules.
Les résultats sont présentés sur la figure 46. A TO, les massifs de 2 à 10 cellules
4
constituent la catégorie cellulaire majoritaire (l 0.1 0 dans les 20 ml de milieu) alors que les
gros massifs sont représentés avec une fréquence faible (inférieure à 200 amas dans les 20 ml
de milieu).
Le taux des différentes catégories cellulaires diminue entre TO et T15. Il augmente entre
T15 et T25. En particulier, le nombre de massifs composés de 2 à 10 cellules (Fig. 46a) et de
4
plus de 50 cellules (Fig. 46b) triple après le 20e jour de culture (respectivement 30.10 et 300
pour 20 ml de milieu). Après T25, le nombre de massifs de petite dimension a tendance à se
stabiliser. Le nombre de massifs de plus de 50 cellules diminue.
2.3- Etude de la viabilité cellulaire au sein des suspensions

Sur les mêmes lots de cals, nous avons réalisé un test de viabilité des suspensions à
chaque date de prélèvement en considérant les différentes catégories cellulaires définies
précédemment. Les résultats obtenus montrent que la viabilité des suspensions est proche de
90% (tableau 23).
2.4- Discussion
L'évolution des différentes catégories cellulaires au sein des suspensions suit
l'évolution en trois phases de la croissance. Les tissus en suspension ne subissent pas de perte
de viabilité au cours de ces trois phases.
On peut rapprocher la courbe de croissance des suspensions des courbes de type
sigmoïdal décrits chez d'autres espèces (STREET, 1969) et en particulier, l'épicéa
(LULSDORf et al., 1992) et le riz (KOBA y ASHI et al., 1992). Elle diffère de la courbe de
croissance très régulière décrite chez le palmier à huile (DE TOUCHET, 1991).
181
TABLEAU 23 : Taux de viabilité des différentes catégories cellulaires constituant

les suspensions
Etudes réalisées à l'aide du FDA (f1uorodiacétate), colorant permettant de déceler la viabilité cellulaire
(fluorescence détectée au microscope optique muni d'un spectre UV).
Les résultats sont exprimés en pourcentage * et sont donnés selon les classes définies en annexe
Temps Cellules Massifs Massifs Massifs

Gours) isolées de 2 à 10 de 10 à 50 de plus de 50
cellules cellules cellules
o 90-100 80-90 80-90 80-90

5 90-100 80-90 90-100 80-90
10 90-100 80-90 50-80 80-90
15 90-100 80-90 80-90 80-90
20 90-100 80-90 90-100 80-90
25 90-100 80-90 90-100 80-90
30 90-100 80-90 80-100 80-90
35 90-100 80-90 80-100 80-90
* Moyenne estimée du comptage de 30 massifs
182
On peut distinguer trois phases au cours de la croissance :

Q la première phase entre TO et T5 pourrait être une phase de latence envers la croissance. La
diminution du taux de massifs pendant cette phase est en accord avec cette hypothèse.
Cette phase pourrait correspondre à une phase d'adaptation à la mise en culture;
Q la seconde phase entre T5 et T20 pourrait être une phase exponentielle de croissance qui
correspond à la croissance proprement dite du matériel. La croissance double, ce qui
pourrait montrer que la phase de croissance optimale se déroule juste avant la période de
repiquage nécessaire pour la prolifération des suspensions. Dans d'autres systèmes de
suspensions, la phase exponentielle de croissance est caractérisée par une augmentation
globale de la taille des agrégats qui, sous l'effet de l'agitation constante des erlenmeyers, se
fragmentent rapidement en unités de taille plus réduite (GEORGE et SHERRINGTON, 1984).
Cet argument pourrait être mis en relation avec la forte augmentation du taux de massifs de
2 à 10 cellules entre T25 et T35, qui pourraient provenir de la fragmentation des massifs de
plus grosse taille ;
Q la troisième phase entre T20 et T35 pourrait être une phase stationnaire qui correspond à un
épuisement des milieux dû à une évaporation importante (environ 5 ml de milieu). Pendant
cette dernière phase, le taux de massifs se stabilise dénotant une baisse dans la prolifération
cellulaire.
Les suspensions montrent une prolifération importante et un taux de viabilité proche de

90%. Cependant, au cours de l'étude histocytologique, nous avions observé l'existence d'un
appareil vacuolaire très développé au sein des unités proembryogènes.
D'autre part, certaines cellules montraient la présence d'un appareil réticulaire et de

figures myéloïdes très développés. Ces derniers éléments sont signe d'un stress et d'un certain
degré de sénescence (DAVIS et BREZEANU, 1979).
Ces observations pourraient correspondre à une pression osmotique non optimale des
milieux de culture. Dans le but d'améliorer l'ajustement osmotique des cultures, nous avons
testé l'effet de différentes concentrations en glucose exogène sur la structure et l'évolution des
suspenSlOns.
183
PLANCHE XX
l
Structure histologique des suspensions embryogènes sur milieu enrichi en glucose (40 g.r )
1. Agrégats cellulaires en suspension (barre: 60 Jlm)

2. Agrégats composés de cellules embryogènes comportant des réserves amylacées
(barre: 50 Jlm)
3. Libération d'agrégats de petite dimension (barre: 130 Jlm)
CE : cellule embryogène; Zf: zone de fragmentation

3- INFLUENCE DE DIFFERENTES CONCENTRATIONS EN GLUCOSE SUR

L'ETAT DES SUSPENSIONS
Les suspensions ont été transférées de leur milieu de prolifération habituel (60 mg.r l de
l l
2,4-D dans un milieu préparé en présence de 3 g.r de charbon actif; 20 g.r de glucose) dans
le même milieu mais comportant quatre concentrations différentes en glucose: 10, 20, 40,
60 g.r l . Au cours de ce transfert, la totalité du milieu a dû être renouvelée; en revanche, au
cours du repiquage suivant, seule la moitié du milieu a été renouvelée, comme lors d'un
repiquage classique. Le poids de matière sèche et la teneur en eau des cals ont été déterminés,
en parallèle, des mesures de la pression osmotique des milieux ont été effectuées. Une étude
histo-cytologique a été réalisée afin de contrôler l'état des suspensions. Ces études ont été
réalisées à TO, puis au 15e jour de culture au moment du premier repiquage dans les 4
variantes différentes de milieu liquide.
3.1- Mesures de la pression osmotique des milieux et du poids sec des cals
Les résultats présentés dans le tableau 24 ne montrent pas de différence significative au
niveau de la pression osmotique, excepté sur le milieu contenant la plus forte concentration en
glucose. Le poids de matière sèche est d'autant plus élevé que la concentration en glucose
dans les milieux est importante. En revanche, la teneur en eau diminue lorsque les milieux
contiennent 40 ou 60 g.r l de glucose.

En présence de 10 g.r l ou 60 g.r l , les cultures dégénèrent après 15 jours.
En présence de 40 g.r l , les massifs cellulaires en suspension sont plus volumineux
qu'en présence de 20 g.r l (Planche:XX, photo 1). Les cellules qui les composent possèdent un
appareil vacuolaire moins développé. De plus, les plages de cellules hautement vacuolisées
ont régressé. Les massifs sont délimités par des zones fortement colorées en rose qui
corespondent à des zones de fragmentation. Après le 15e jour de culture, les massifs se
fragmentent en libérant des « chapelets» cellulaires formés d'un ensemble de cellules en file
de une à deux assises de type protodermique (Planche :XX, photo 2) ou des massifs de plus
petite dimension (Planche :XX, photo 3). Chaque cellule est entourée d'une paroi à l'aspect
épais, le cytoplasme, fortement coloré en bleu, est riche en protéines solubles. Certaines de
ces cellules ont accumulé des réserves amylacées qui se localisent autour du noyau
(Planche :XX, photo 2).
184
TABLEAU 24 : Influence de la concentration en glucose des milieux sur

la pression osmotique des milieux, le poids de matière sèche
et la teneur en eau des cals *
l
Glucose (g.r ) POàTO PO à Tl5
(mmosm.kg- 1 ) (mmosm.kg- 1)
10 197 a 271 ab
20 251 a 197 a
40 376 b 372 b
60 490 c 781 d
Poids sec à Tl5 (1) Teneur en eau
(pour 500 mg de matière fraîche) (% de matière fraîche)
10 27,1 a 94,58 e
20 32,0 ab 93,61 e
40 42,6 c 91,47 f
60 62,4 d 87,51 g
• les valeurs représente la moyenne de 3 répétitions
(1) A Ta. le PCV inoculé est de 1, ce qui correspond à 500 mg de suspensions. le poids de matière
sèche est alors de 30 mg en moyenne (94% de teneur en eau).
ANOVA: F (3,16) = 12,89 (.....) (F : test Fisher-Snedecor; niveau de signification: ..... : très hautement
significatif (1 %0).
185
L'ensemble des observations réalisées, tant au microscope photonique qu'au microscope

électronique, montre que les cellules et unités proembryogènes sont capables d'accumuler des
réserves protéiques et amylacées.
Les massifs se friabilisent de plus en plus et fonnent à nouveau une suspension de plus
petite dimension.
3.3- Conclusion
l
Le doublement de la concentration en glucose des milieux (40 g.r ) pennet :
• une régression des figures de stress;
• une diminution du volume du vacuome au sein des cellules.
On assiste à une réinitialisation des cultures. En effet, après le ISe jour de culture, la
structure des massifs en suspension est très proche de celle des nodules embryogènes à
l'origine des suspensions. Ensuite, les nodules se friabilisent et donnent à nouveau une
suspension de petite taille, constituée de massifs d'unités proembryogènes dont les cellules
possèdent un vacuome très réduit et possèdent des réserves.
Il doit être développé à plus grande échelle de façon à pennettre une optimisation des
conditions de culture.
4- CONCLUSION
L'ensemble de ces études a pennis de préciser la structure et le mode de prolifération
des suspensions.
Les suspensions de cocotier prolifèrent sous fonne de cellules isolées et de massifs
d'unités et de complexes proembryogènes. Leur prolifération est assurée par les divisions
cellulaires au niveau des massifs et la fragmentation spontanée des agrégats les plus
importants, sous l'effet de l'agitation des erlenmeyers et l'existence de zones en
dégénérescence au centre des agrégats. Les massifs de 2 à 10 cellules représentent la catégorie
majoritaire.
Des cellules isolées sont observées. Les cellules isolées peuvent être de deux types :
arrondies ou plus ou moins allongées. Les cellules méristématiques isolées proviennent des
massifs par fragmentation. Certaines sont capables de se diviser. On peut penser qu'elles
peuvent redonner des massifs de taille plus importante. Chez la carotte, COUTOS-THEVENOT
(1990) suggère que les cellules arrondies correspondent aux cellules méristématiques
potentiellement embryogènes. Les cellules plus allongées seraient de type parenchymateux.
Elles pourraient provenir des premières par élongation cellulaire.
Nous devons préciser que des essais de tamisage ont été pratiqués afin d'isoler et
d'homogénéiser les différentes catégories cellulaires selon leur taille. Cependant, dans nos
186
conditions de culture, chaque catégorie une fois isolée ne se maintient pas. Tout se passe
comme si une coopération cellulaire existait en milieu liquide. Cette hypothèse a été suggérée
chez la carotte (CouTos-THEVENOT, 1990). Il est maintenant établi que les milieux de culture
contiennent des molécules extracellulaires excrétées par les cellules ou massifs cellulaires en
suspension : polysaccharides, protéoglycanes et polypeptides (V AN ENGELEN et DE VRIES,
1992). Ces molécules pourraient avoir un rôle de contrôle sur la prolifération cellulaire mais
aussi sur l'initiation et l'expression de l'embryogenèse. Elles pourraient être sécrétées par les
cellules embryogènes et massifs proembryogènes mais aussi par des cellules non
embryogènes présentes au sein des cultures.
Les suspensions sont potentiellement embryogènes. Cependant, nous devions vérifier si

elles pouvaient évoluer en structures plus organisées pUIS s'orienter vers la formation
d'embryons. Ces études font l'objet du chapître III.
187
SUSPENSIONS: POTENTIALITES EMBRYOGENES
- C .....A..PITB.E III -
ETUDE DE L'EXPRESSION DES POTENTIALITES EMBRYOGENES
DES SUSPENSIONS
INTRODUCTION
Afin de détenniner le potentiel embryogène et organogène des suspensions, des essais

dits d' « expression de l'embryogenèse» ont été réalisés.
Principe:
Nous qualifierons de « d'étape d'expression de l'embryogenèse» l'étape qui consiste à
transférer les suspensions de leur milieu de prolifération contenant une auxine à un milieu
sans auxine sur lequel le matériel en suspension pourra donner naissance à un embryon. Ce
qui est recherché, dans un premier temps, est une étape qui pennette l'arrêt de la prolifération
et de la fragmentation des complexes proembryogènes, présents dans les suspensions, de telle
sorte qu'ils soient capables de s'organiser en structures embryogènes plus évoluées, en
l'occurrence des nodules méristématiques en voie d'épidennisation. Dans un deuxième temps,
on recherche la polarisation de ces nodules, l'acquisition du méristème apical et la formation
des embryons somatiques.
Le passage d'un milieu liquide à un milieu solide d'expression de l'embryogenèse, qui
sera qualifié de « milieu d'expression », consiste en un étalement des structures embryogènes.
Nous utiliserons ces tennes lors de la description des résultats.
Les essais ont été effectués à partir des lots de suspensions obtenues sur milieu de
prolifération contenant 20 g.r' de glucose. De plus, ces essais ont été réalisés un an après le
transfert des cals en milieu liquide.
1- ETAPE D'EXPRESSION EN MILIEU LIQUIDE SANS HORMONE
Dans un premier temps, nous avons testé le protocole de régénération mis au point sur le
palmier à huile (DE TOUCHET, 1991).
• Description du procédé utilisé sur le palmier à huile :
Ce procédé comprend deux étapes successives:
o la première étape consiste à transférer pendant un mois les suspensions embryogènes
de leur milieu de prolifération contenant du 2,4-D (et du charbon actif, dans le cas du
188
palmier à huile, sans charbon actif dans le cas du cocotier) à un milieu liquide sans
hormone (et sans charbon). Cette étape permet l'orientation des massifs embryogènes
en suspension vers l'étape d'expression de l'embryogenèse, après arrêt de leur
prolifération. Ils forment des nodules méristématiques en voie d'épidermisation ;
o la deuxième étape consiste en un transfert des nodules méristématiques, sur milieu
d'expression gélosé en boîte de Pétri. Sur ces derniers milieux, les nodules
méristématiques se polarisent et forment des embryons.
• Essai du procédé sur cocotier :

Les suspensions de cocotier ont été placées pendant un ou deux mois en milieu liquide sans
hormone. Pendant une phase de latence de 15 jours, les massifs d'unités proembryogènes
prolifèrent peu et deviennent plus volumineux. Cependant, après cette première phase, les
massifs montrent de nouveau une forte prolifération et se fragmentent pour donner une
suspension de massifs de dimension réduite. Une fois étalés en milieu gélosé d'expression,
les massifs continuent à proliférer sous forme de cals.
CONCLUSION:
Les résultats observés correspondent à un retour à l'état méristématique des unités
proembryogènes. On peut penser que le temps de passage en milieu liquide sans hormone est
trop long. Dans le cas du palmier à huile, DE TOUCHET (1991) observe une perte du potentiel
embryogène ou des déviations de l'embryogenèse vers la formation de structures haustoriales
(structure qui dérive du limbe cotylédonaire) lorsque ce temps dépasse un mois.
Ces premiers essais nous ont montré la nécessité de mettre au point un procédé
spécifique du cocotier. Nous nous sommes alors orientée vers des temps très courts de passage
en milieu liquide et sur l'étude d'étalement direct en milieu solide d'expression.
2- ETAPE D'EXPRESSION DE L'EMBRYOGENÈSE EN MILIEU SOLIDE
Deux types d'études ont été réalisés en parallèle :

• l'effet d'un étalement direct des suspensions sur milieu gélosé ;
• l'effet d'un « lavage» préalable en milieu liquide sans hormone.
Trois poids d'inoculum ont été testés pour l'étalement en milieu gélosé : 50 mg, 100 mg
et 250 mg. Les essais ont été réalisés à partir des suspensions entretenues sur les cinq milieux
de prolifération: G60/3, GSO/3, G11O/3, G130/3 (respectivement 60, SO, 110, 130 mg.r l de
l
2,4-D /dans un milieu préparé en présence de 3 g.r de charbon actif) et GSO/2
189
PLANCHE XXI
Expression des potentialités embryogènes des suspensions

Evolution de la proembryogenèse en milieu solide
1. Structure des massifs cellulaires après étalement (2 mois de culture) (barre: 410 j.lm)
2. Complexes proembryogènes entourés par une paroi pectocellulosique et une lamelle
moyenne complexes (barre: 40 j.lm)
3. Ensemble de complexes proembryogènes isolés en périphérie des massifs étalés
(barre: 210 j.lm)
4. Complexe proembryogène (4 mois de culture) (barre: 50 j.lm)
5. Nodule méristématique en voie d'épidennisation (barre: 210 j.lm)
6. Ensemble de nodules méristématiques isolés (barre: 410 j.lm)
CPE : complexe proembryogène; Lm : lamelle moyenne; Pm : paroi modifiée; PE : proembryon;

Pr : protoderme.
l
(respectivement 80 mg.r l de 2,4-D /dans un milieu préparé en présence de 2 g.r de charbon
actif). Chaque niveau de traitement « milieu de prolifération x milieu d'expression x poids
d'inoculum» comporte 4 répétitions. 8 erlenmeyers de suspensions ont été utilisés par niveau
de traitement.
Le matériel sur boîte de Pétri a été observé régulièrement sous loupe binoculaire. Une
étude histologique a été réalisée afin de suivre l'évolution des structures embryogènes.
2.1- Etude morphologique et structurale

Au cours de nos essais, nous avons pu définir les conditions de formation de nodules
méristématiques en voie d'épidermisation.
Le passage par une étape de « lavage» ne modifie pas l'aspect et la structure des
suspensions. En revanche, une fois les massifs étalés sur milieu solide d'expression, une
dégénérescence importante est observée. Cependant, certains massifs se sont maintenus et
montrent différentes évolutions.
Pendant une période de 15 à 30 jours sur milieu gélosé, les massifs prolifèrent très peu.
Ensuite, sur la majorité des boîtes de Pétri, les massifs prolifèrent sous forme de cals qui
finissent par recouvrir la surface des boîtes. Dans certains cas, les massifs prolifèrent peu, leur
couleur est modifiée et passe du blanc au beige-jaune pâle. Après quatre mois de culture, des
petits globules de couleur jaune pâle s'individualisent sur ces massifs et grossissent. Le reste
des massifs étalés ne prolifèrent plus et ont tendance à dégénérer.
Les massifs, qui prolifèrent peu et formeront des structures globulaires, sont composés
d'un ensemble de complexes proembryogènes à différents stades isolés les uns des autres
(Planche XXI, photo 1). Ces complexes peuvent correspondre :
• aux complexes qui étaient déjà présents au sein des suspensions en prolifération.
Cependant, ils ne se fragmentent plus et grossissent;
• aux unités proembryogènes isolées en suspension mais qui pourraient être capables de
s'organiser en complexes proembryogènes une fois étalées en milieu solide.
Ils peuvent se situer au sein d'un massif en dégénérescence (Planche XXI, photo 2) ou
en périphérie (Planche XXI, photo 3). Dans les deux cas, ils sont isolés du reste des massifs
étalés par une lamelle moyenne hautement gélifiée, et côtoient des plages de cellules en
dégénérescence. Cet isolement pourrait être responsable de l'arrêt de la prolifération et de la
fragmentation des complexes proembryogènes provenant du milieu liquide. Les complexes,
une fois isolés, deviennent plus volumineux.
Au bout de 4 mois de culture, la majorité des complexes proembryogènes ont dégénéré.
Cependant, quelques complexes ont grossi et montrent un certain degré de polarisation avec
un pôle composé de proembryons dont les cellules sont vacuolisées et un pôle composé de
proembryons dont les cellules méristématiques ont un cytoplasme dense
190
(Planche XXI, photo 4). Ces complexes dérivent ensuite en nodules méristématiques
globulaires, en voie d'épidermisation (Planche XXI, photo 5).
La fréquence de ces nodules est très faible. Il est très rare d'observer plus d'un nodule,
qui a un diamètre de 2 à 5 mm, sur une boîte de Pétri. Sur l'ensemble des essais réalisés, une
seule boîte de Pétri contenant un milieu préparé avec de la BAP (1,125 mg.r\ a montré la
présence de 3 nodules regroupés sur le même massif (Planche XXI, photo 6). Ces nodules
sont bien isolés les uns des autres et sont rattachés au reste des structures étalées par une zone
cellulaire assez mince et peu active.
2.2- Fréquence des différentes structures observées

Nous avons déterminé le taux des différentes structures observées après étalement afin
de comparer les différents traitements effectués. Le critère pour le comptage des formations
observées est un critère morphologique et histologique de la structure des nodules considérés.
Après 4 mois de culture sur milieu gélosé en boîte de Pétri, le nombre de nodules
méristématiques observés ne dépassant pas 1 par boîte, nous avons simplement comptabilisé
le nombre de boîtes de Pétri sur lesquelles sont observés ces nodules sur les 4 boîtes
constituant chaque niveau de traitement « milieu de prolifération x milieu d'expression x poids
d'inoculum ».
2.2.1- EFFET D'UN ÉTALEMENT DIRECT

Au cours de ce traitement, les suspensions sont transférées directement de leur milieu de
prolifération sur le milieu d'expression solide en boîte de Pétri.
Aucune différence de comportement n'est observée entre les suspensions maintenues
sur les cinq milieux de prolifération. La présence de nodules n'a été observée que sur deux
boîtes de Pétri contenant un milieu de base préparé en présence de charbon actif seul (milieu
l
CA : 2.g.r de charbon) et ayant reçu un poids d'inoculum de 100 mg.
2.2.2- EFFET D'UN LAVAGE EN MILIEU LIQUIDE SANS HORMONES

Différents temps de lavage ont été testés. Panni les essais réalisés, seuls ceux consistant
en une baisse progressive de la concentration en 2,4-0 ont montré un maintien des structures
embryogènes et/ou une évolution de la proembryogenèse sur milieu d'expression.
Tous les essais réalisés ont montré la nécessité d'appliquer des temps de lavage très
courts et à diminuer progressivement la concentration en 2,4-0. Dans un premier temps, nous
avons continué à repiquer les cals en ne renouvelant que la moitié du milieu de culture. Le
traitement retenu comporte les étapes suivantes:
191
• un repiquage pendant deux jours en milieu liquide comportant 10 ml de l'ancien milieu de

prolifération et 10 ml de nouveau milieu contenant une concentration en 2,4-D diminuée de
moitié par rappport à celle du milieu de prolifération;
• un second repiquage pendant deux jours dans 10 ml de cet ancien milieu et 10 ml de milieu
liquide sans 2,4-D ;
• un troisième repiquage pendant deux jours en milieu liquide sans honnone ;
• un étalement sur boîte de Pétri contenant les milieux d'expression.
Le passage par un milieu liquide contenant une concentration en 2,4-D de plus en plus
faible pennet d'augmenter sensiblement le taux de nodules. La fréquence la plus élevée est
observée sur les milieux d'expression contenant le milieu de base seul (milieu 0) : 2 nodules
pour les suspensions provenant du milieu de prolifération 060/3 et un poids d'inoculum de
100 mg. 1 nodule sur l'ensemble des 4 boîtes constituant chaque niveau de traitement a été
obtenu dans les conditions suivantes:
Suspensions provenant des milieux de prolifération 0 Il 0/3 et 0130/3 et placées chacune sur
les milieux d'expression contenant soit seulement du milieu de base soit de la caséine et/ou de
laBAP.
Les suspensions étalées avec un poids d'inoculum de 50 ou 250 mg prolifèrent d'abord
sous fonne de cals indifférenciés puis dégénèrent.
2.2.3- CONCLUSION
Un rinçage court en milieu liquide contenant une concentration en 2,4-D de plus en plus
faible pennet d'augmenter la fréquence de nodules. Cependant, le nombre de structures
donnant naissance aux nodules après 4 mois de culture, sont en très faible nombre, de plus une
dégénérescence importante est observée. Le renouvellement d'une moitié seulement du
milieu, tel qu'il est pratiqué à chaque repiquage, a pour effet de diluer le 2,4-D. Celui-ci
pourrait être à une concentration trop élevée dans le milieu de « lavage », ce qui pourrait gêner
l'expression des potentialités embryogènes après l'étalement en milieu gélosé.
Ces résultats nous ont amené à tester l'effet d'un renouvellement complet du milieu de
« lavage» à chaque repiquage toujours en conservant le principe de la baisse progressive en
2,4-D, mais aussi d'un repiquage quotidien en milieu liquide sans honnones.
L'essai de ce dernier procédé repose sur les observations faites chez la vigne.
COUTOS-THÉVENOT el al. (1992 a) suggèrent que des repiquages quotidiens évitent
l'accumulation de composés inhibiteurs extracellulaires. Chez la vigne, ils ont pennis une
réinitiation du potentiel embryogène des cultures. Nous avons testé ce procédé sur cocotier.
192
TABLEAU 25: Effet d'un renouvellement complet du milieu de« lavage» vis-à-vis
du 2,4-D sur l'étape d'expression des potentialités embryogènes
des suspensions
=
- Nombre de structures globulaires nombre de boites sur les 4 boites de Pétri à chaque niveau de
traitement montrant la présence de structures globulaires, à raison d'une structure par boite
1
- Suspensions provenant d'un milieu de prolifération contenant 60 mg.r de 2,4-0 et préparé avec
1
3 g.r de charbon actif. Le charbon est éliminé au moment des repiquages. _
- Poids d'inoculum : 100 mg
Milieu Nombre de structures globulaires observées

de Sans repiquage Repiquage Repiquage
maturation (1) quotidien quotidien pendant quotidien pendant
lOj. 20 j.
Après 2 mois de culture
CB 3 3 2
CAS 4 3 1
o 3 1 2
CA 3 o o
BAP 3 + 3 (2) 3 2
CC 2 1 2
Après 4 mois de culture
CB 2 3 1
CAS 2 o 2
o 3 o o
CA 3 o o
BAP 4 1 o
CC 4 1 2
1
(1) CS : milieu de base additionné de caséine (250 mg.r') et de SAP (1,125 mg.r );
CAS: milieu de base additionné de caséine (250 mg.r\
o: milieu de base;
CA : milieu de base additionné de charbon actif (2 g.r\
SAP: milieu de base additionné de SAP (1,125 mg.r\
1
CC : milieu de base additionné de caséine (250 mg.r ).
Les autres milieux d'expression des potentialités embryogènes testés: CASx2 (caséine: 500 mg.r\ CSx2
(caséine: 500, mg.r' et SAP: 2,25 mg.r\ SAPx2 (SAP: 2,25 mg.r') ne montrent jamais la présence de
structures de type globulaire.
(2) 3 nodules obtenus sur une seule boite de Pétri
193
3- EFFET DU RENOUVELLEMENT COMPLET DU MILIEU ET D'UN

REPIQUAGE QUOTIDIEN EN MILIEU LIQUIDE SANS HORMONE
Cette étude comporte les étapes suivantes:

• un premier passage des suspensions en milieu liquide contenant une concentration en 2,4-D
diminuée de moitié pendant deux jours;
• un second passage en milieu liquide sans hormone pendant deux jours avec ou non un
repiquage quotidien pendant 10 ou 20 jours en milieu liquide sans hormones;
• un étalement en milieu solide d'expression.
Ces essais ont été réalisés avec la variante de prolifération G60/3. Nous avons retenu un
poids d'inoculum de 100 mg.
Chaque niveau de traitement comprend 4 répétitions.
Dans tous les cas, le nombre de nodules n'excède pas 1 par boîte, excepté, une boîte de
Pétri contenant de la BAP (1,125 mg.r I ) sur laquelle les 3 nodules isolés, décrits
précédemment, ont été observés. Leur nombre reste très faible. Cependant, le renouvellement
complet du milieu permet d'augmenter leur taux d'obtention sur l'ensemble des boîtes de
l'essai (tableau 25). Le repiquage quotidien en milieu liquide sans hormones ne permet pas
d'améliorer les résultats et au bout de 4 mois, le nombre de boîtes montrant la présence de
nodules a diminué.
CONCLUSION: Le renouvellement complet du milieu permet d'améliorer de façon conséquente

l'obtention de structures de type globulaire. Il pourrait permettre une élimination plus rapide
du 2,4-D même si les essais ont montré la nécessité d'appliquer une baisse progressive du
niveau de 2,4-D.
Les milieux d'expression qui montrent les meilleurs résultats sont ceux contenant de la
BAP. Sur les autres milieux d'expression, en particulier ceux additionnés de caséine, les
nodules dégénèrent rapidement ou réversent vers le stade cal.
A long terme, les nodules obtenus en présence de BAP ont tendance à jaunir et même
parfois à brunir. Nous précisons que nous avons testé l'effet d'une combinaison BAP/charbon
actif qui permettrait d'éviter le brunissement des structures embryogènes grâce aux propriétés
I
d'adsorption du charbon. Aux concentrations testées (100 à 300 mg.r de BAP en présence de
1 et 2 g.r' de charbon actif), aucune formation de type globulaire n'est observée. En revanche,
les massifs étalés réversent vers le stade cal ou dégénèrent. Ces résultats sont dûs à la
difficulté de contrôler le taux de cytokinine réellement adsorbé par le charbon actif, en
présence d'autres composés tels que les composés phénoliques.
194
4- CONCLUSION
Les nodules méristématiques, observés au 4e mois après étalement sur milieu gélosé dit
d'« expression », dérivent selon toute vraisemblance des complexes proembryogènes
préexistants proliférant en suspension. L'évolution de la proembryogenèse est très proche de
celle observée en milieu solide. Les complexes montrent une polarisation structurale : avec un
pôle de cellules plus actives et un pôle de cellules montrant un appareil vacuolaire plus
développé. Cette polarisation pourrait être un premier signe de la polarisation proprement dite
du nodule méristématique qui conduira à la formation de l'embryon.
Le lavage pendant 4 jours des nodules embryogènes dans des milieux contenant une
concentration en 2,4-D de plus en plus faible permet d'obtenir le plus fort taux de structures
globulaires. Le renouvellement complet du milieu à chaque étape pourrait avoir pour effet de
limiter le « carry-over » hormonal, comme le définit DE TOUCHET (1991). Celui-ci serait dû à
une désorption importante du 2,4-D par les tissus, comme il a été montré chez la carotte
(CouTos-THÉVENOT, 1990). Un rinçage des cultures permet l'élimination de l'hormone et un
bon développement des embryons. Cependant, chez le cocotier, il semble qu'il faut créer un
processus d'adaptation des suspensions à l'absence d'hormone par une diminution progressive
du niveau de 2,4-D. Ce qui pourrait correspondre à établir un équilibre d'échanges entre le
2,4-D désorbé et le 2,4-D apporté par les milieux.
Ce résultat est à mettre en parallèle de ce qui est observé au cours du procédé en milieu
solide. En milieu solide, l'évolution de la proembryogenèse puis l'orientation vers la
maturation des structures embryogènes polarisées se déroule après passage successif de ces
structures sur milieu solide comportant une concentration en 2,4-D de plus en plus faible.
Cependant le passage d'une concentration donnée en 2,4-D à une concentration plus faible se
l
fait dans un intervalle de 2 mois (10 mg.r tous les deux mois en présence de charbon actif).
Il serait intéressant de tester l'effet d'une baisse progressive en 2,4-D sur un intervalle
de temps équivalent à partir des suspensions. Réalisé en milieu liquide, ce procédé pourrait
éventuellement permettre de développer un système d'expression des potentialités
embryogènes en milieu liquide.
L'utilisation de BAP permet l'obtention de la plus forte fréquence de structures de type

globulaire. Cette cytokinine est très souvent utilisée au cours des étapes tardives de
l'embryogenèse pour permettre l'obtention de la polarisation et la formation du méristème
caulinaire sur l'embryon néoformé. Chez le cocotier, sa présence est indispensable pour le
développement des structures embryogènes en structures embryonnaires lors du procédé en
milieu solide (VERDEIL et BUFFARD-MoREL, 1995). Utilisée à de fortes concentrations, elle a
pour effet d'entraîner un jaunissement puis un brunissement des tissus, comme il a été observé
lors de nos essais. L'utilisation de charbon actif en testant différentes balances BAP/charbon
195
actif n'a pas pennis l'obtention de nodules méristématiques. Une alternative serait de tester
l'utilisation d'antioxydants tels que la cystéine ou le PVP qui pennettent d'améliorer les
potentialités embryogènes chez certaines espèces (GEORGE et SHERRINGTON, 1984).
Dans le temps qui nous était imparti, nous n'avons pas pu étudier les conditions
d'obtention de la polarisation des structures de type globulaire et de la fonnation d'embryons
complets. Nos essais ne constituent qu'une étape préliminaire d'un protocole de régénération
éventuel. Cependant, l'observation de nodules en voie d'épidermisation est encourageante.
Les études réalisées soulignent encore les difficultés rencontrées chez le cocotier et le
caractère hautement récalcitrant de cette plante. Cependant, les premiers essais montrent que
cette voie reste encourageante.
196
PARTIE Il - DISCUSSION
- P.A.R.TIE I I - DISCUSSION
es études présentées au cours de cette deuxième partie ont permis d'obtenir pour la
L première fois des suspensions embryogènes chez le cocotier. Des premiers essais
consistant à étudier les conditions d'expression des potentialités embryogènes des suspensions
ont permis d'obtenir l'évolution de la proembryogenèse vers la formation de nodules
méristématiques en voie d'épidermisation. Cependant, peu d'essais consistant à obtenir un
procédé de régénération à partir de ce matériel ont pu être effectués au cours de la thèse.
Nous devons insister sur la lenteur des évènements : il a fallu plus de deux années
d'expérimentation pour déterminer les conditions de maintien et de prolifération de
suspensions. De plus, six mois sont nécessaires pour l'établissement de suspensions après le
transfert des cals en milieu liquide. Ce laps de temps est relativement long par rapport à ceux
décrits chez d'autres espèces. Chez le palmier à huile, il est d'environ 3 mois. Il est à noter
qu'il n'est pas le plus long: on peut citer l'exemple du caféier, pour lequel il faut 8 à 9 mois
depuis le transfert des cals en milieu liquide jusqu'à l'obtention de suspensions (ZAMARRIPA
et a/., 1991).
Enfin, chez le cocotier, la formation de nodules épidermisés a été observé 4 mois après
le transfert des suspensions sur milieu d'expression de l'embryogenèse.
Les problèmes rencontrés chez le cocotier sont caractéristiques de la famille des

Arécacées. Ce n'est que récemment que des suspensions ont été obtenues sur le palmier à
huile (DE TOUCHET et a/., 1991).
Dans cette partie, nous discuterons du type de cals compétents en milieu liquide, du
mode de prolifération et des potentialités embryogènes des suspensions obtenues en
comparant le système développé sur cocotier avec les systèmes auparavant décrits dans la
littérature chez les autres palmiers mais également chez d'autres plantes.
1- NOTION DE COMPETENCE DES CALS POUR L'ETABLISSEMENT DE

SUSPENSIONS CHEZ LES ARECACEES
L'obtention de suspensions est conditionnée par l'obtention de cals friables. Cependant,

chez les Arécacées, il est très difficile d'obtenir des cals friables. Ceci est dû à l'existence
d'une zone méristématique organogène : l'assise pseudocambiale.
197
PARTIE JI - DISCUSSION
Cette assise, au fonctionnement histogène (plan des mitoses), possède une structure très
cohésive avec différents états de différenciation. Le fonctionnement de cette assise est
centripète. En périphérie des cals, les cellules méristématiques assurent la croissance des cals
par des plans de divisions très régulés périclines et anticlines. Plus au centre des cals, les
cellules se différencient en éléments de type trachéide, en fibres de soutien ou en cellules
parenchymenteuses. De plus, l'assise méristématique n'est pas en contact direct avec le milieu
mais entourée d'un protoderme régulier. Ce type de structure est un obstacle majeur pour la
friabilisation des cals. Le fonctionnement de cette assise rappelle les méristèmes
d'élargissement secondaire qui assurent l'augmentation du diamètre caulinaire chez de
nombreuses Monocotylédones (CHOUARD, 1936). Les lignées de type l, que nous avons
utilisées au cours de nos essais, sont assez friables dans la mesure où une libération de nodules
de petite taille a pu être observée en milieu liquide. Cependant, nous avons pu observer que
chaque nodule libéré retrouve un diamètre important et une structure très cohésive. Le
fonctionnement de l'assise pseudocambiale est hautement déterminé.
La seule possibilité pour obtenir des cals friables est de faire subir un traitement aux cals
décrits précédemment :
• chez le cocotier, une réactivation de la zone protodermique des cals de type 1 peut
conduire à la formation de cals friables de type II qui sont à l'origine des
suspensions.
Cette zone est normalement mitotiquement très peu active et c'est une augmentation
de la concentration en 2,4-D ou de la fréquence de repiquage qui permet leur
obtention (Cf. 1ère partie, chapitre 1) ;
• chez le palmier à huile, une destructuration complète de la zone pseudocambiale des
cals compacts, par augmentation de la concentration en 2,4-D dans les milieux, peut
entraîner la formation de cals friables composés de nodules embryogènes isolés.
Cependant, ce traitement peut entraîner l'apparition de cals qualifiés de «cals à
croissance rapide », très friables mais responsables d'une anomalie révélée en champ
(anomalie florale) (BESSE, 1992). Des formations de nodules embryogènes friables
peuvent aussi s'isoler spontanément par foyers en périphérie de cals compacts,
qualifiés de cals compacts nodulaires, fortement embryogènes et qui contiennent déjà
des structures embryogènes développées. Ce sont ces cals qui sont utilisés pour
l'établissement de suspensions (DE TOUCHET, 1991). L'obtention de ces cals formés
spontanément sur les cals compacts embryogènes n'est pas maîtrisée, ce qui est un
problème majeur pour le renouvellement des cultures en milieu liquide;
• chez le palmier dattier, on peut obtenir des cals qualifiés de cals embryogènes
granulaires constitués de nodules sphériques et d'un tissu matriciel lâche (DAGUIN et
LETOUZE, 1988). Pour cela, les explants sont placés sur un milieu de callogenèse à
198
PARnE 1/ - DISCUSSION
forte teneur en auxine qui peuvent fonner des organes différenciés et des cals qui
peuvent être isolés. Les nodules qui composent ces cals sont très compacts et
volumineux. Ce sont des proembryons plus ou moins bipolarisés très connectés entre
eux. Seul le passage en milieu liquide entraîne un processus de friabilisation en
pennettant l'individualisation et la prolifération des proembryons, puis des embryons
somatiques qu'ils fonnent, en présence de faible teneur en auxine. Les suspensions
de palmier dattier sont des suspensions embryonnaires. Elles ne représentent qu'une
étape temporaire recherchée pour l'individualisation des embryons. A notre
connaissance, l'entretien de matériel embryogène à l'état indifférencié sous fonne de
suspensions stables n'a pas encore été étudié.
Chez le cocotier, les cals friables de type II rappellent la structure des cals friables
obtenus chez le maïs (FRANSZ, 1988; VAIN, 1992). Chez cette Monocotylédone, ils
proviennent de la multiplication des cellules des régions épidennique et sous-épidennique du
scutellum de l'embryon zygotique utilisé comme expIant. Chez le maïs, trois traitements
peuvent pennettre leur apparition : une augmentation de la concentration en 2,4-D, une
diminution de la concentration en saccharose ou une application de proline dans les milieux
(ARMSTRONG et GREEN, 1985; FRANSZ, 1988).
Que ce soit chez le cocotier ou chez le maïs, ces cals sont considérés comme fortement
embryogènes. Alors que les cals compacts, d'origine interne sur l'expIant, comportent une
forte capacité à régénérer des racines, les cals friables montrent une seule voie réelle de
différenciation : l'embryogenèse. La prolifération des cals est assurée par des divisions
anticlines au sein de l'assise protodennique qui les compose. Cette assise est essentiellement
constituée de deux feuillets de cellules méristématiques fonnant des « rubans» séparés par un
espace intercellulaire important, provenant sans doute d'une dégénérescence de cellules plus
au centre. Ces rubans peuvent cotoyer des zones cellulaires plus vacuolisées. Chez le cocotier,
certaines zones peuvent fonner des agrégats ayant l'aspect de nodules plus ou moins
sphériques. Cependant, les nodules prolifèrent peu en milieu solide; le centre des nodules
dégénère rapidement ne laissant actives que les deux assises cellulaires périphériques et
redonnant aux cals leur aspect de « rubans ». En milieu liquide, les nodules peuvent au
contraire proliférer, se fragmenter et libérer des éléments de taille plus réduite.
Ce type de cals est le seul moyen dans les conditions de culture actuelles d'obtenir des
suspensions.
199
2- CARACTERISTIQUES DES SUSPENSIONS DE COCOTIER
Structure des suspensions

Nous avons défini le matériel en suspension comme des massifs d'unités
proembryogènes et de complexes proembryogènes capables de proliférer et de se fragmenter.
Le complexe proembryogène devrait être l'intermédiaire stable à l'origine d'un embryon,
l'embryogenèse somatique sur les lignées de cals friables de type II étant d'origine
unicellulaire. Cependant, il est évident qu'en l'absence d'un procédé de régénération, il est
difficile de définir réellement les potentialités de régénération du matériel en suspension.
Les suspensions de cocotier diffèrent des nodules méristématiques (de 1mm) décrits
chez le palmier à huile (DE TOUCHET, 1991). Chez ce dernier, les cellules qui composent les
nodules en suspension sont délimitées par des parois qui apparaissent moins épaissies que
celles des unités et des complexes proembryogènes du cocotier. Le centre des nodules est
composé de cellules méristématiques denses et très actives. Ces cellules possèdent un noyau
volumineux, très coloré par le naphtol blue black. Elles ont une forme plus anguleuse que les
cellules de type embryogène. La périphérie des massifs est au contraire composé de cellules
plus vacuolisées. Ces nodules sont des masses compactes de cellules méristématiques qui se
multiplient à l'état indifférencié en présence de 2,4-D et leurs potentialités embryogènes sont
révélées par un transfert en milieu sans hormone. Chez le palmier, chaque nodule donne
naissance à un nodule méristématique puis à un embryon qui est à première vue d'origine
pluricellulaire. Alors que chez le cocotier, l'intermédiaire stable qui pourrait être à l'origine
d'un embryon serait le complexe proembryogène d'origine unicellulaire.
La structure des agrégats d'unités proembryogènes est assez différente de celle des
massifs très compacts qualifiés de « masses proembryogènes» (<< proembryogenic masses»
ou PEM) chez la carotte (HALPERIN, 1966). Ce sont des groupes plus importants de cellules
méristématiques très cohésives, ils sont isolés et ne forment généralement pas d'agrégats
contrairement à ce que nous avons observé. Ils prolifèrent à l'état indifférencié. Cette structure
se rapproche de ce qui est observé chez le palmier à huile (DE TOUCHET, 1991). Cependant,
comme chez le cocotier, l'embryogenèse est d'origine unicellulaire. Les masses
proembryogènes de carotte sont hétérogènes, les cellules au centre sont vacuolisées et non
embryogènes, les cellules en périphérie sont embryogènes et donne naissance à un embryon.
En milieu liquide sans hormone, les masses portent plusieurs embryons individualisés.
La structure des suspensions de cocotier est très proche de celle des agrégats qui
composent les suspensions chez Pennisetum et Panicum (KARLSSON et VASIL, 1986). Les
agrégats sont composés de plusieurs groupes isolés de 2 à 6 cellules. Ces groupes sont séparés
200
PARTIE 1/ - DISCUSSION
les uns des autres par des parois externes modifiées dépourvues de plasmodesmes des cellules
qui les composent par rapport aux parois internes. Les cellules d'un groupe sont connectées
entre elles par des plasmodesmes. Chaque groupe se sépare de l'agrégat en raison de divisions
cellulaires actives. Chez les deux graminées, les cellules embryogènes possèdent un noyau
volumineux, un nucléole unique et un cytoplasme riche en réserves protéiques et amylacées.
Les cellules isolées, méristématiques et parenchymenteuses, que nous avons décrites,

rappellent le type de cellules composant de nombreux systèmes de suspensions cellulaires en
particulier chez la carotte (DE VRIES et al., 1988 b; COUTOS-THEVENOT, 1990).
Les cellules arrondies méristématiques se séparent spontanément des massifs en
suspension souvent par files de cellules bien isolées. La plupart de ces cellules sont entourées
par une paroi modifiée et sont capables de se diviser et peuvent redonner des unités
proembryogènes puis des complexes proembryogènes de plus ou moins grosse taille.
Cependant, toutes les cellules en suspension sont-elles potentiellement embryogènes ?
Cette question est formulée à cause de l'existence des cellules allongées
parenchymenteuses. D'après NOMURA ET KOMAMINE (1985), les suspensions de carotte
seraient constituées par trois types cellulaires : les cellules de type 1 plutôt arrondies et
méristématiques compétentes pour l'embryogenèse, les cellules de type II plutôt allongées
non embryogènes, qui dériveraient du type 1 par élongation cellulaire; les cellules de type III
en dégénérescence. L'élongation cellulaire donnant naissance aux cellules allongées
correspondrait à une perte du potentiel embryogène et à une mort cellulaire programmée. Les
cellules allongées ne seraient pas embryogènes. Selon ces auteurs, seules 1% des cellules en
suspension seraient réellement compétentes pour l'embryogenèse. Cependant, STEWARD
(1969) et CouTos-THEVENOT (1990) rapportent qu'au sein des suspensions cellulaires de
carotte, certaines cellules parenchymenteuses, allongées et vacuolisées, sont capables de se
segmenter en donnant des files de cellules plus ou moins longues. Au niveau de ces cellules,
des divisions asymétriques et un bourgeonnement pourraient donner naissance à des cellules
arrondies de petite taille et compétentes pour former des masses proembryogènes. Ce schéma
pourrait correspondre à certaines figures, souvent observées au microscope inversé chez le
cocotier, qui montrent l'association de cellules allongées avec en leur pôle une petite cellule
arrondie. Chez le cocotier, aucune preuve d'un bourgeonnement ou de division asymétrique
n'a été montrée expérimentalement. Il faudrait réaliser une étude plus approfondie faisant
appel à certains colorants, tel que le DA PI (ou 4'-6'-diamidino 2 phénylindole), qui
permettent de visualiser s'il existe une continuité nucléaire et cellulaire ou non entre les
cellules.
201
Taille des suspensions

Les suspensions de cocotier (diamètre inférieur à 0,5 mm) sont plus fines que les
suspensions de palmier à huile (diamètre compris entre 0,5 et 2 mm) (DE TOUCHET, 1991), ou
des suspensions d'embryons de palmier dattier (DAGUIN et LETOUZE, 1988). La taille des
suspensions se rapproche des systèmes les plus classiquement décrits : chez la carotte, les
massifs de 10 à 20 cellules sont les intermédiaires stables générant des embryons
(BACKS-HüSEMAN et REINERT, 1970). Les agrégats cellulaires de carotte décrits par NOMURA
et KOMAMINE (1985) comprennent 3 à 10 cellules. DE TOUCHET (1991) souligne
l'inconvénient de suspensions fines: « plus on se rapproche de l'état unicellulaire pendant une
durée importante, plus le risque de variation somac1onale est grand ». Ce qui est un
inconvénient majeur pour la régénération de plants conformes.
Cependant, l'utilisation de suspensions cellulaires ou constituées de très petits agrégats
est la cible de choix pour les techniques de transformation génétique. L'obtention de
suspensions cellulaires est le critère recherché chez les graminées telle que le blé (YANG et al.,
1991) pour le transfert de gènes par les méthodes biolistiques et pour l'obtention de cultures
de protoplastes. Chez le cocotier, les techniques de transformation pourraient être une
approche intéressante de la création d'une variabilité pour des caractères tels que la résistance
aux maladies.
Les risques de dérive de la suspension ou de la perte du potentiel embryogène pourraient
être en partie contournés en réinitiant régulièrement de nouvelles suspensions à partir de
matériel frais. De même, la cryoconservation des suspensions pourrait parer aux éventuelles
modifications du génome, elle pourrait aussi entraîner une meilleure gestion des cultures et
permettre de faire face à des vagues éventuelles de contamination.
Modalités de prolifération
Les suspensions de cocotier présentent un mode de prolifération plusieurs fois décrit
dans la littérature.
Elles prolifèrent grâce à des divisions cellulaires au sein des agrégats d'unités
proembryogènes et libération spontanée de massifs de plus petite taille au niveau de
différentes zones de fragmentation au sein des agrégats. Ces zones sont très souvent observées
entre le massif à libérer et une zone de cellules en dégénérescence. Ces plages cellulaires sont
observées dés le 15e jour de culture après le transfert des cals friables à l'origine des
suspensions en milieu liquide. Nous avons montré que ce type de structure était en partie dû à
une pression osmotique non adéquate. En transférant les suspensions dans un milieu enrichi
en glucose, ces plages dégénérées régressent. Cependant, l'existence de cellules vacuolisées
en dégénérescence pourrait être une condition nécessaire pour favoriser la fragmentation des
massifs cellulaires.
202
C'est ce qui est observé chez le Panicum (KARLSSON ET VASIL, 1986). En effet, les
cellules vacuolisées et volumineuses situées au centre des agrégats favorisent la fragmentation
du massif. Chez la carotte, les amas proembryogènes présentent des cellules volumineuses et
sans amidon qui forment des lignes le long desquelles la fragmentation des amas s'effectue
(Mc WILLIAM et al., 1974).
En microscopie électronique, la lamelle moyenne montre la présence de vésicules entre
les unités proembryogènes en fragmentation. Au sein des cals friables de maïs, FRANSZ (1988)
suggère que ces vésicules permettent le dépôt de composés qui vont être responsables de la
digestion de la lamelle moyenne. Cette digestion conduit à une dissociation cellulaire. Selon
le même auteur, c'est le 2,4-D présent dans le milieu qui pourrait être responsable de cette
dissociation. GEORGE et SHERRINGTON (1984) rapportent que les auxines en général pourraient
augmenter l'activité spécifique d'enzymes impliquées dans la synthèse de tels composés. Ce
qui permettrait le maintien des cellules et des massifs cellulaires isolés en suspension.
3- PERSPECTIVES DES SUSPENSIONS DE COCOTIER
Avantages de la technique développée en milieu liquide

Par l'établissement de suspensions, nous avons pu obtenir une phase de multiplication
du matériel embryogène, sous forme d'unités et de complexes proembryogènes. L'avantage
du procédé développé est de pouvoir initier complètement le processus embryogène en milieu
liquide. Enfin, il possède un avantage primordial par rapport aux procédés utilisés de façon
standard chez les Arécacées : c'est l'absence de charbon actif au cours des cultures.
L'utilisation de charbon actif est nécessaire pour permettre le maintien et la prolifération des
cultures in vitro chez l'ensemble des Arécacées. La présence de charbon n'empêche pas la
production en masse d'embryons par embryogenèse adventive chez le palmier dattier ou le
palmier à huile. Cependant, elle gêne une meilleure maîtrise de la prolifération des tissus, de
l'initiation et de l'expression des potentialités embryogènes. Il ne permet pas un bon contrôle
de la concentration des composés du milieu, en particulier celle des hormones. Chez le
cocotier, l'utilisation de charbon actif amplifie les problèmes liés à la récalcitrance de cette
plante. Le manque de synchronisation des cultures, les problèmes de déviation et de bloquage
de l'embryogenèse sont en partie dûs à un manque de maîtrise de la balance hormonale
auxines/cytokinines en présence de charbon. L'établissement de suspensions permettrait de
contourner en partie ces problèmes.
203
Limites actuelles
Si l'établissement de suspensions embryogènes est maintenant effectif, l'absence d'un
procédé de régénération limite encore l'utilisation des suspensions embryogènes de cocotier.
En pratiquant un «lavage» des suspensions par une diminution progressive de la
concentration en 2,4-D, puis après étalement en milieu solide contenant de la BAP, nous
avons pu obtenir des nodules méristématiques globulaires en voie d'épidermisation, mais une
question peut être posée: sont-ils régénérables ? Il conviendrait de s'assurer de la conformité
du matériel en terme de capacité régénérative. Pour cela, des études du niveau de ploïdie des
cellules en culture sont en cours. Il a été montré chez d'autres espèces telle que la carotte
(CouTos-THEVENOT, 1990) que la compétence à la régénération pouvait être conditionnée par
le niveau de ploïdie des cellules, l'état polyploïde étant souvent associé à l'état non
embryogène. Néanmoins, la mise en place d'un protoderme sur les nodules observés, et qui
précède ou accompagne généralement la polarisation du proembryon globulaire, est
encourageante.
En premier lieu, il est nécessaire de multiplier les essais au nIveau de l'étape

d'expression des potentialités embryogènes et organogènes des suspensions. D'une part, le
développement d'une étape en milieu liquide serait particulièrement intéressant pour
permettre à long terme l'automatisation du procédé. D'autre part, il est envisagé de tester le
système d'immersion temporaire développé par une équipe du CIRAD-CP
(ALv ARD et al., 1993). Dans ce système, les cultures sont placées dans un récipient
comportant deux compartiments : un compartiment supérieur contenant les cultures et un
compartiment inférieur contenant le milieu nutritif. Les cultures reçoivent périodiquement une
immersion de milieu très limitée dans le temps, ensuite le milieu redescend dans le
compartiment inférieur. Un tel système a permis d'obtenir chez le Citrus un plus grand
nombre d'embryons régénérés, mieux conformés et plus synchrones à partir de suspensions
mises en condition de régénération.
En second lieu, il conviendrait de généraliser le procédé développé à d'autres lignées de
cals friables isolées à partir de génotypes différents.
204
CON"CL"U8ION" GEN"ERAT,1E
CONCLUSION GENERALE
CON"CLUSION GEN"ERALE
es travaux présentés dans ce mémoire font partie d'un ensemble de recherches sur
L l'embryogenèse somatique du cocotier menées dans le cadre d'une collaboration entre
l'ORSrOM et le CIRAD. Les objectifs de ces travaux étaient une étude des facteurs nutritifs
impliqués au cours de l'initiation de l'embryogenèse, la recherche de marqueurs protéiques
précoces spécifiques de l'embryogenèse et la mise au point des techniques de suspensions
embryogènes sur un matériel hautement récalcitrant à la régénération.
Nos études ont montré l'importance des acides aminés au cours de l'initiation de
l'embryogenèse. Sur des lignées de cals homogènes tels que les lignées friables de type II, ils
pourraient constituer des marqueurs quantitatifs physiologiques de l'orientation vers la
proembryogenèse. Ces études pourraient également pennettre de mieux contrôler les
conditions d'apparition de l'embryogenèse en adaptant les milieux de culture dans leur
composition en composés azotés: balance nitrate/ammonium, ajout d'acides aminés.
Elles ont également montré qu'un facteur nutritif pouvait être inducteur de
l'embryogenèse: l'augmentation de la concentration en saccharose des milieux. D'ors et déjà,
nous envisageons d'appliquer l'essai consistant à quadrupler la concentration en saccharose à
d'autres lignées de cals mais aussi et surtout aux cals primaires dés leur apparition sur
l'expIant. La mise en place d'un tel essai pourrait pennettre de limiter l'utilisation du 2,4-D
seulement à la concentration utilisée pour la callogenèse.
Sur un plan fondamental, il serait particulièrement intéressant de mieux préciser le rôle
des acides aminés et du saccharose, par des études plus poussées de leur métabolisme, en
particulier en utilisant des éléments marqués et en suivant leur incorporation au sein des tissus
et des cellules. A long tenne, de telles études pourraient également pennettre de mieux
appréhender le rôle et la synergie possible des différents facteurs nutritifs et honnonaux, en
relation avec la présence de charbon actif, qui interviennent lors de l'embryogenèse.
Il s'avère également primordial de rechercher des marqueurs précoces spécifiques de la

compétence à l'embryogenèse. Les marqueurs moléculaires et biochimiques représentent un
outil de choix. Comme nous l'avons souligné, le développement d'un système de régénération
basé sur le tri, 1'« étiquetage» et la sélection d'un matériel végétal ne répondant qu'aux
marqueurs considérés pourrait contourner les problèmes de la lenteur des évènements
morphogénétiques qui caractérise l'embryogenèse chez le cocotier. Cette démarche
pennettrait de définir systématiquement le degré de compétence d'un cal ou d'un expIant pour
l'embryogenèse avant d'envisager sa culture à grande échelle. Elle pennettrait de créer ainsi
des lignées de cals hautement régénératives. Cependant, les premiers essais réalisés ont de
205
CONCLUS/ON GENERALE
nouveau montré les difficultés rencontrées sur cocotier: l'absence d'un marqueur de 50 kDa,
mis en évidence chez le pois et commun à plusieurs monocotylédones comme le blé ou le
maïs et plusieurs dicotylédones tels que la carotte, le tabac ou le soja (ALTHERR et al., 1993).
De nouveaux essais sont prévus au laboratoire d'Hanovre afin de vérifier à nouveau la
présence du marqueur protéique de 50 kDa sur un plus grand nombre de cals et tissus
embryogènes et pour éventuellement rechercher d'autres marqueurs.
L'ensemble de ces études a été réalisé à partir de lignées de cals maintenues en milieu
solide. Néanmoins, à long terme, les suspensions pourraient constituer un matériel d'étude de
choix des facteurs impliqués dans l'initiation de l'embryogenèse somatique chez le cocotier.
Dans cette optique, il serait particulièrement intéressant de développer le même type d'études
que nous avons présentées dans le présent mémoire à partir du matériel en suspension. La
recherche de marqueurs précoces spécifiques de l'embryogenèse est envisagée sur ce matériel.
Il est évident que la mise au point des techniques de suspension nécessite encore de
nombreux essais. Dans le futur, la priorité sera donnée à l'étude des conditions de
régénération des suspensions. De nouvelles mises en culture sont envisagées. Il faut souligner
que l'obtention de cals friables en amont du procédé ne constitue pas un frein pour
l'établissement de suspensions car leur formation est maintenant bien maîtrisée.
Les résultats de cette thèse, comme ceux obtenus auparavant, montrent qu'il est
primordial de développer une approche analytique des problèmes rencontrés chez le cocotier,
alliant en amont les résultats de la culture in vitro et en aval une meilleure appréhension de la
biologie des cellules manipulées. Il est évident que l'intégration des facteurs impliqués dans la
réca1citrance du cocotier est difficilement appréhendable et ne pourra être abordée que par la
mobilisation de nombreux efforts. Le programme européen STD3 débuté depuis cette année
pourra, nous l'espérons, la réaliser.
206
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ANNEXES
ANNEXE 1 : COMPOSITION DES MILIEUX
COMPOSITION POUR 1 LITRE DE MILIEU:
Milieu M(1) G (1) G100

Macroéléments 50 ml 100 ml 50 ml
Microéléments 1 ml 1 ml 1 ml
Fer EDTA 1 ml 1 ml 1 ml
Vitamines 1 ml 1 ml 1 ml
Biotine 2 ml 2ml 2ml
Ac. Ascorbique 100mg 100mg 100mg
Myo-inositol 100mg 100mg 100mg
Adénine sulfate 40mg 30mg 30mg
Saccharose 30 g
Glucose 20 g 20g
Acide malique 100mg 100 mg
BAP 1 ml 1ml
pH: 5,00
Charbon actif 2g 1à 3 g 3
(Agar) 7,5 g 7,5 g 7,5 g
(1) Lors des essais d'initiation d'embryogenèse somatique par enrichissement en sucre des milieux de
multiplication, les concentrations respectives en saccharose (milieux M) et en glucose (milieux G)
1 1
testées sont les suivantes: 30, 60, 90, 120 g.r de sacharose et 20,40,60 et 90 g.r de glucose.
COMPOSITION DE LA SOLUTION DE MACRO ELEMENTS:
Macro éléments Masse pour Il (en g)

KN03 24
KH2P04 14
NH4N03 26
CaC12,2H20 7,2
MgS04,7H20 6
COMPOSITION DE LA SOLUTION DE MICRO ELEMENTS:
Micro éléments Masse pour 11
KI 830 mg
H3B03 10 g
MnS04,7H20 18,9 g
ZnS04,7H20 10 g
Na2Mo04,2H20 250 mg
CuS04,7H20 25 mg
CoC12,6H20 25 mg
ANNEXES
COMPOSITION DE LA SOLUTION DE VITAMINES:
Vitamines Masse en mg pour 100 ml

Acide nicotinique 100
Pantothénate de calcium 100
Thiamine HCI 100
Pyridoxine HCI 100
SOLUTION DE FER EDTA :
26,1 g
24,9 g
- ajouter à 26,1 g d'EDTA du KOH (IN) jusqu'à atteindre un pH = 9 (400 ml env.), ce qui
permet la dissolution de l'EDTA ;
- ajouter ensuite 24,9 g de FeS04, 7 H 20 préalablement dissous dans 300 ml d'eau environ;
- agiter et compléter à Il ;
- faire passer un courant d'air dans la solution pendant 12 h.
SOLUTION DE BIOTINE :
10 mg de biotine dans 21 d'eau

Ajouter queques gouttes de NaOH IN pour faciliter la dissolution
SOLUTION DE 2,4-D :
2 g.r' dissout dans quelques gouttes de NaOH 2N
SOLUTION DE BAP :
1 g.r' dissout dans quelques gouttes de HeL

ANNEXES
ANNEXE 2 : TEST FDA (fluorescéine diacétate)
PREPARATION DE LA SOLUTION FDA :

1 g de FDA dans 200 ml d'acétone. Cette solution est conservée à -20°C.
PROTOCOLE:
- 100 ~l de solution de FDA dans 10 ml de milieu liquide (le mélange devient trouble)
- Sur une lame, déposer quelques gouttes de suspensions et quelques gouttes du mélange
FDA/milieu
- Ajouter la lamelle
- Attendre 4 à 5 min.
- Compter le taux de viabilité dans les 15 min. qui suivent
ECHELLE UTILISEE:
o e cellules observé (partie bl~::_l~:l:es vivantes/partie noire: cellules dégénérées)
o 80%-.2.0..%
Ù 50%-~
~ 30%-~
• 10%-.3..0%
• O%-~
•
ANNEXES
ANNEXE 3 : MICROSCOPIE PHOTONIQUE
COMPOSITION DE LA SOLUTION DE FIXATION:

Solution: -Tampon Phosphate de sodium 0,2 M pH 7 50 ml
- paraformaldéhyde à 10% 20ml
- glutaraldéhyde à 25% 4ml
- caféine 1g
- Eau milli-Q 26 ml
MONTAGE:
Un support est fixé au bloc de résine.
Solution de fixation du support au bloc ou « ciment» :
Polyméthylméthacrylate (en poudre) 3g
Solution liquide de méthylméthacrylate et de diméthylparatoluidine 1,5 ml
COUPE:
Les coupes sont faites à l'aide d'un microtome LKB (Historange, modèle 2218) portant un
couteau à lames jetables. Les coupes (3,5 flm.) sont déposées sur une lame préalablement
dégraissée à l'alcool puis séchées sur une plaque chauffante à 20°C.
COLORATION :
Q Composition des réactifs :
Acide periodique:
Acide periodique 1g
Eau milli-Q 100ml
Solution préparée extemporanément
Réactifde Schiff:
Dissoudre 1 g de fuschine basique dans 200 ml d'eau milli-Q bouillante.
Laisser refroidir à 50°C, puis ajouter 20 ml d'HCI IN.
A 30°C, ajouter 2 g de métabisulfite de sodium anhydre. Laisser reposer 24 h. à l'obscurité.
Ajouter 0,5 g de charbon actif, agiter et filtrer.
Le colorant peut être utilisé tant qu'il est incolore ou jaune pâle. Il doit être conservé à l'abri de
la lumière, même pendant son utilisation.
Naphthoi Blue Black:

Acide acétique à 7% * 100 ml
Naphtol Blue Black 1g
Chauffer préalablement l'acide acétique à 60°C et ajouter le Naphtol Blue Black sous
agitation.
(* : 7 ml d'acide acétique glacial en présence de 93 ml d'eau)
ANNEXES
Q Double coloration :
- acide periodique 5 min.

- lavage à l'eau acide pH < 4,5 3 lavages
- réactif de Schiff à l'obscurité 20 min.
- lavage à l'eau acide pH < 4,5 3 lavages
- Naphtol Blue Black à 60°C 5 min.
-lavage à l'eau du robinet
L'excès de Naphthol Blue Black peut être éliminé par passage des lames dans de l'eau
distillée.
ANNEXES
ANNEXE 4 : MICROSCOPIE ELECTRONIQUE A TRANSMISSION
COMPOSITION DE LA SOLUTION DE FIXATION:

Tampon cacodylate: - Cacodylate de sodium 0,1 M pH 7,2 4g
- Eau milli-Q 250 ml
Mélange Glutaraldéhyde-tampon cacodylate-eau distillée:
Diluer au dixième la solution mère de Glutaraldéhyde à 25% dans le tampon cacodylate à pH
7,2.
COLORATION:
c> Citrate de Plomb :

Nitrate de Plomb 1,33 g
Citrate de Sodium 1,76 g
Eau milli-Q 30 ml
Agiter constamment pendant 1 min., puis par intermittence pendant 30 min. pour assurer la
conversion du nitrate de Plomb en citrate de Plomb (laiteux au début)
Ajouter 8 ml de NaOH O,IN (NaOH ION en solution dans du CO2)
Compléter à 50 ml H 2 0 milli-Q. La solution devient translucide et le pH final est de 12
Filtrer sur MILLIPORE 0,2 J.lm, ajouter quelques gouttes d'huile de parafine.
c> Acétate d'Uranyl :

Acétate d'uranyl 2g
Eau milli-Q 100 ml
Filtrer sur MILLIPORE 0,2 J.lm, recouvrir d'un papier aluminium et garder à l'obscurité
ANNEXES
ANNEXE 5 : DOSAGE DES SUCRES PAR LE DNS
PREPARATION DU REACTlFDNS: ACIDE DINOTROSALICYLIQUE
Dissoudre progressivement lOg de DNS dans 200 ml d'une solution de soude 2N. Chauffer,
puis ajouter progressivement 300 g de tartrate de potassium/sodium.
Chauffer jusqu'à dissolution complète, puis ajuster le volume à 1 litre avec de l'eau distillée.
ANNEXES
ANNEXE 6 : DOSAGE DES ACIDES AMINES PAR HPLC
Réaction de dérivation
H S R
vN=C=S + R-C-C-::?O
1
)
Il
vj-C-j-i- H
1
l "OH pH alcalin
NH2 H H C
//\
o OH
Phényllsothiocyanate Acide aminé PTC-aminoacide
Temps de rétention des différents acides aminés dosés par HPLC

suivant la méthode de dérivation au PITC
Acides aminés RT Pic *

asp 3,9 4
glu 4,5 5
asn 7,25 8
gIn 7,6 9
ser 7,8 10
gly 8,16 11
his 8,6 12
arg 9,7 13
thr 10,25 14
ala 10,76 15
pro 11 16
tyr 16,18 22
val 17,6 24
met 18,76 26
cys 20,85 29
leu 21,7 30
ile 22,11 31
norl 23 32
PITe 24 34
phe 24,4 35
lys 26,82 39
* Numéro du pic sur le chromatogramme a) de la figure.

ANNEXES
FIGURE 1 : Chromatogramme après injection d'un extrait d'acides aminés (a) et d'un extrait
non dérivé (b); Spectre d'absorption du dérivé PTC de la thréonine * (c).
(* Spectre d'après Ogden et FOldi, LC-GC Magazine of Iiquid and gas chromatography, volume 5
number 1)
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220 240 260 280 300 320 340
Longueur d'onde (nm)
ANNEXES
% éluant B
Ji....
100%
50%
10%
10 20 30 40
temps (min.)
Figure 2 : Gradient d'élution pour la séparation des PTC-aminoacides :
- 10 min. de rinçage dans 10% d'éluant

- 25 min. de séparation par passage de 10 à 49% d'éluant B
- 2 min. de passage de 49% à 100% de B
- 6 min. de rinçage dans 100% de B
- 2 min. de passage de 100% à 10% de B
- 10 min. de rééquilibrage à 10% de B
Eluant A : 119 g d'acétate de Na

500 III de triéthylamine
dans 1 1d'eau bidistillée
Eluant B : 600 III d'acétonitrile
400 III d'eau
ANNEXES
ANNEXE 7 : ETUDE QUANTITATIVE ET QUALITATIVE DES PROTEINES
EXTRACTION
Tampon d'extraction (pour 1 1):
TrisHCI 50 mM pH 7,2
NaCI 10 mM
CaC12,2H2ü 1 mM
DTT 1 mM.
ELECTROPHORESES
Préparation des gels

Laver les plaques de verre avec de l'alcool. Les monter dans les portoirs à électrophorèse.
Couler les gels.
Gel de séparation (quantité pour 2 gels) :
Eau milli-Q 1100 III
Tris HCI lM pH8,8 3750 III
SDS 10% 100 III
Acrylamidelbis (30%) 5000 III
Dégazer à la pompe à eau
Persulfate d'ammonium 10% 50 III
(préparer extemporanément)
Temed 5 III
Couler le gel de séparation jusqu'à environ 3 cm du bord.
30 min. après, couler le deuxième gel.
Gel de concentration (quantité pour 2 gels):

Tris HCI 1M pH6,8 2500 III
SDS 10% 100 III
Acrylamidelbis (30%) 1300 III
Dégazer à la pompe à eau
(préparer extemporanément)
Temed 10 III
Couler le gel jusqu'au ras des plaques et mettre les peignes en place de suite.
La polymérisation nécessite 30 min.
Préparation des échantillons:

Solution de charge:
TrisHCI 0.5M pH6.8 1000 III
Glycérol 800 III
SDS 10% 1600 III
Mercaptoéthanol 400 III
Bleu de Bromophénol 0,1% 400 III
Ajouter 50111 d'échantillon à 50 III de solution de charge.
Placer les échantillons 10 min. à 100°C.
ANNEXES
Dépôts des échantillons:

Enlever délicatement les peignes des gels.
Rincer les puits avec de l'eau distillée et les remplir avec du tampon d'électrophorèse.
Déposer les échantillons avec une pipette. La quantité déposée dépend de la concentration en
protéines de l'échantillon. Pour chaque échantillon, on dépose SOllg de protéines.
Migration:
Placer les portoirs portant les gels dans les cuves d'électrophorèse.
Remplir les cuves de tampon d'électrophorèse (pour Il) :
SDS 1g
Glycine 14,4 g
Tris base 3g
Fixation
Fixateur :
EtOH ou MeOH 400 ml
Acide acétique 100 ml
H20 SOO ml
Rincer les gels 2 fois 30 min. dans un mélange MeOH/H20 (SOISO v/v) pour éliminer les
traces d'acide acétique.
Coloration :
Mélange de coloration:
21 ml NaOH 0,36 %
4 ml N03Ag 19,4 %
Ajouter du NH40H 20% jusqu'à l'obtention d'une solution limpide (env. 4 ml)
H20 pour 100 ml.
Placer les gels dans le mélange de coloration jusqu'à révélation des bandes
Rincer les gels S fois 2 min. dans H20
Révélation :
Révélateur :
Acide citrique 1% 2,S ml
Formaldéhyde 0,27 ml
H 20 SOO ml
Après apparition des bandes, rincer 3 fois les gels avec H2 0.
Conserver les gels dans le fixateur.
ANNEXES
ANNEXE 8 : RECHERCHE DE MARQUEURS PROTEIQUES

PAR IMMUNODETECTION
EXTRACTION
Tampon d'extraction (pour 50 ml) :
TrisHClI00 mM pH 7,8 48 ml
Polyclar AT 2.5 % (w/v) 2500 mg
DIECA4rnM 2 ml
Bacitracine 10 IlM 50 III
Leupeptine 1 IlM 50 III
ELECTROPHORESES
Préparation des gels
Gel de séparation (quantité pour 1 gel) :

10% 15%
H2 0 distillée 860 III

Tris HCl lM pH8,8 635 III 635III
SDS 10% 25 III 25III
Acrylamidelbis (30%/0,8%) 845 III 1250III
Saccharose 148 III 592III
Persulfate d'ammonium 10% 6 III 6 III
Temed 5 III 5 III
Gel de concentration (quantité pour 1 gel):

H 20 distillée 2270 III
Tris HCllM pH6,8 1010 III
SDS 10% 40 III
Acrylamidelbis (30% /0,8%) 680 III
Temed 8 III
Migration
Pour Il :
TrisHCl pH 8.7 60,5 g
Glycine 288 g
SDS lOg
Eau milli-Q 1780 ml
Coloration
Pour 1 1 :
TCA 120 g
Coomassie R-250 2g
Méthanol 800 ml
Acide acétique 200 ml
ANNEXES
WESTERN BLOT SUR MEMBRANE DE NITROCELLULOSE
Les feuilles de papier sont humidifiées dans la solution de Towbin (pour Il):
TrisHC125 mM pH 8.3 3.03 g
Glycine 192 mM 14.41 g
Méthanol 20 % (v/v) 200 ml
ANNEXES
ANNEXE 9 : RESULTATS DES ANALYSES STATISTIQUES
1- ANALYSES DES RESULTATS PRESENTES DANS LE CHAPITRE II
TABLEAU 1 : ANOVA sur l'évolution des caractéristiques physiologiques des cals et des
paramètres des milieux chez la lignée L82
Paramètres Milieu Date Interaction (1)

Gain de matière sèche MS 5,43 ** 78,07 *** 2,18 *
(MS)
Teneur en eau (%TEi2) %TE 1,40NS 5,63 *** 0,72 NS
Glucose 4,26 * 1,99NS 1,44 NS
Sucres endogènes (3) Fructose 2,64 NS 4,13 * 1,13 NS
Saccharose 0,05 NS 19,2 *** 2,58 *
Protéines (4) 1,13 NS 9,38 *** 5,93 ***
Acidité des milieux (5) pH 5,52 * 88,5 *** 2,26 NS
cl+ 3,36 NS 0,81 NS 0,60NS
Mg2+ 0,95 NS 2,34 NS 1,46 NS
K+ 0,28 NS 1,69 NS 1,67 NS
Sels minéraux exogènes (5) NH4+ 0,88 NS 7,87 ** 1,80NS
cr 1,94 NS 0,66 NS 2,47NS
N0 3- 25,1 *** 69,2 *** 10,2 ***
H2 P04 - 10,5 *** 45,8 *** 6,58 ***
sot 8,16 ** 30,4 *** 4,29 **
Sucre exogène (5) Glucose 7,67 ** 287,4 *** 5,92 ***
(1) Date: dates de prélèvement de l'analyse, TO, (T8), T15, T28, (T42), T60; milieux: G100 = milieu de
multiplication; G130 et G140 = milieux d'initiation de l'embryogenèse; interaction: combinaison
« milieu x date de prélèvement »;
Test Fisher-Snedecor; niveau de signification : NS = non significatif; * = significatif (5%); ** =
hautement significatif (1%); *** = très hautement significatif (1%0)
(2) n=4, FMilieu (2,27); F Oate (2,27); Flnteraction (4,27), Dates: TO, T8, T15, T28, T42, T60
(3) n=4, FMiiieu (2,36); FOate (3,36); Flnteraction (6,36), Dates: TO, T15, T28, T60
(4) n=3, FMilieu (2,35); FOate (5,36); Flnteraction (5,36), Dates: TO, T8, T15, T28, T42, T60
(4) n=3, FMilieu (2,24); FOate (3,24); Flnteraction (6,24), Dates: TO, T15, T28, T60
ANNEXES
ANNEXE 9 (suite)
TABLEAU 2: ANOVA sur l'évolution des caractéristiques physiologiques des cals et des
paramètres des des milieux chez la lignée L7

Gain de matière sèche MS 2,46 NS 100,89··· 0,61 NS
(MS)
Teneur en eau (%TEi2) %TE l,40 NS 16,26··· 0,46 NS
Glucose 0,02 NS 2,49NS 0,16 NS
Sucres endogènes (3) Fructose 0,29 NS 0,29NS 0,21 NS
Saccharose 1,26 NS 21,88··· 0,29 NS
Protéines (4) 0,45 NS 9,85··· 3,65···
Acidité des milieux (5) pH 0,52 NS 59,94··· 5,056 •
Ca2+ 0,0023 NS 4,47 • 0,064 NS
Mg2+ 0,08 NS 0,89NS 1,94 NS
K+ 0,49NS 3,74 • 0,38 NS
NHt+ 0,55·· 36,09··· 3,55 •
Sels minéraux exogènes (5) cr 42,85··· 38,22··· 26,39···
N03- 0,08·· 95,57··· 24,64···
H2P04- 0,10 NS 77,32··· 19,80 •••
sot 5,38 • 100,82··· 12,11 •••
Sucre exogène (5) Saccharose 4,988 • 133,28··· 0,496 NS
(1) Date: dates de prélèvement de l'analyse, TO, (T8), T15, T28, (T42), T60; milieux: G100 = milieu de
multiplication; G130 et G140 = milieux d'initiation de l'embryogenèse; interaction: combinaison
« milieu x date de prélèvement »;
Test Fisher-Snedecor; niveau de signification: NS = non significatif; * = significatif (5%); - = hautement
significatif (1%); *** = très hautement significatif (1%0)
(2) n=4, FMilieu (2,18); F Oate (2,18); Flnteraction (2,18), Dates: Ta, T8, T15, T28, T42, T60
(3) n=4, FMilieu (3,24); F Oate (3,24); Flnteraction (3,24), Dates: TO, T15, T28, T60
(4) n=3, FMilieu (1,24); F Oate (5,24); Flnteraetion (5,24), Dates: Ta, T8, T15, T28, T42, T60
(4) n=3, FMilieu (1,16); F Oate (3,16); Flnteraction (3,16), Dates: Ta, T15, T28, T60
ANNEXES
ANNEXE 9 (suite)
TABLEAU 3 : Relations entre les paramètres des milieux chez la lignée L82
Rt(J)
Variable dépendante Variable Regression Parallèlisme
(2)
Independante Intramilieu
(1)
pH Na.+ 0,73 NS
pH NO J - 17,8 ** 0,93 NS 69%
pH H2P042- 12,4 ** 0,68 NS 61%
pH SO/" 13,9 ** 3,61 NS 62%
pH Glucose 28,1 *** 0,74 NS 77%
NH4+ NO J - 0,33 NS
Na.+ H2P042- 0,80NS
NH/ S042- 0,13 NS
NO- H2PO/" 150,5 *** 0,85 NS 94%
SO}- NO J - 5,89 * 15,25 ** 42%
SO/" H2PO/" 7,15 * Il,5 ** 47%
Glucose NH/ 0?06NS
Glucose NO J - 15,8 ** 2,13 NS 66%
Glucose H2P042- 10,6 * 1,14 NS 56%
Glucose SO/" 12,5 ** 0,48 NS 61%
(1) ANCOVA sur les relation à l'intérieur des milieux; milieux: G100 = milieu de multiplication; G130 et
G140 = milieux d'initiation de l'embryogenèse; interaction : combinaison « milieu x date de
prélèvement »;
La valeur est celle du test F de Fisher-Snedecor
Relations entre les paramètres analysés: F (1,8)
La détermination des relations intramilieu a été faite sur les moyennes de l'interaction « milieu x
date de prélèvement»
(2) Test de parallèlisme sur les pentes de la régression intramilieu
(3) Coefficient de détermination de la régression intramilieu
Relations entre les autres traits analysés: F (2,6)
= = =
Niveau de signification des tests: NS non significatif; * significatif (5%); ** hautement significatif
(1%); *** = très hautement significatif (10/00)
ANNEXES
ANNEXE 9 (suite)
TABLEAU 4 : Relations entre les paramètres des milieux chez la lignée L7
Parallèlisme R (3)
2
Variable dépendante Variable Regression
(2)
Independante intram ilieu
(1 )
pH N14+ 15,19 • 3,40 NS 75%

pH cr 0,20 NS
pH N0 3- 10,28 • 0,006 NS 67%
pH H2 PO/" 10,34 • 0,24 NS 67%
pH S042- 23,65··· 0,019 NS 82%
pH Saccharose 54,49··· l,58 NS 92%
N14+ cr 5,83 NS
N14+ N0 3- 19,64 ••• 5,22 NS 78%
N14+ H2P042- 29,79··· 2,07 NS 86%
NH4+ S042- 25,35 ••• 9,64 • 84%
cr N03- 1,02 NS
cr H2PO/" 1,46 NS
cr S042- 1,46 NS
N03- H2 P042- 127,41 ••• 2,80 NS 96%
N03- S042- 110,82··· 0,176 NS 96%
S042- H2PO/" 98,95 ••• 3,51 NS 95%
Saccharose NH4+ 66,5··· 5,29 NS 93%
Saccharose cr 0,37 NS
Saccharose N0 3- 13,45 • 0,69 NS 73%
Saccharose H2P042- 16,29·· 0,079 NS 77%
Saccharose S042- 26,07··· 0,83 NS 84%
(1) ANCOVA sur les relation à l'intérieur des milieux; milieux: G100 = milieu de multiplication; G130 et
G140 = milieux d'initiation de l'embryogenèse; interaction: combinaison « milieu x date de
prélèvement »;
La valeur est celle du test F de Fisher-Snedecor
Relations entre les paramètres analysés: F (1,6)
La détermination des relations intramilieu a été faite sur les moyennes de l'interaction « milieu x
date de prélèvement»
(2) Test de parallèlisme sur les pentes de la régression intramilieu
(3) Coefficient de détermination de la régression intramilieu
Relations entre les autres traits analysés: F (1,6)
Niveau de signification des tests: NS = non significatif; • = significatif (5%); •• = hautement significatif
(1%); ... = très hautement significatif (1%0)
ANNEXES
ANNEXE 9 (fin)
2- ANALYSE DES RESULTATS PRESENTES DANS LE CHAPITRE III:
TABLEAU 5 : ANOVA sur les paramètres du milieu avant la mise en culture

2 ,4-D (2) 161,80··· 125,14·" 160,71 ...
Glucose (3) 163,49 ••• 4,12 • 3,43 •
Fructose (3) 165,23 ••• 3,58 • 2,39 NS
Saccharose (3) 137.63 ••• 0.16 NS 0.14 NS
PO (3) 144.45 ... 5.91 ••• 7.13 •••
pH (3) 13.34··· 1.82 NS 5.51 ...
(1) Milieux: M60 = milieu de multiplication; M60/120 et M110 = milieux d'initiation de l'embryogenèse;
date: dates de prèlèvement; interaction: combinaison « milieu x date de prélèvement »;
F : test Fisher-Snedecor; niveau de signification: NS = non significatif; * = sjgnificatif (5%); ** =
=
hautement significatif (1%); *** très hautement significatif (1%0)
(2) n=4, F Miiieu (2,43); FOate (4,43); Flnteraction (8,43), Dates: TO, T1, T7, T14, T15
(3) n=4, FMilieu (2,27); FOate (2,27); Flnteraction (4,27), Dates: TO, T1, T15
TABLEAU 6 : ANOVA sur l'évolution des caractéristiques physiologiques des cals et des
paramètres des milieux après la mise en culture

Matière sèche (2) 111,09 ••• 138,79·" 7,94 .
Teneur en eau (2) 59,28··· 10,469··· 4,00 .
Saccharose (3) 27,43 ••• 12,94··· 70,9···
Glucose (3) 19,79··· 5,71 •• 4,38··
Fructose (3) 24,9··· 5,88·· 6,17 ...
Saccharose (4) 22.29··· 63,10··· 9,35 .
Glucose (4) 79.89··· 85,85··· 37,56 .
Fructose (4) 62.15··· 13,84··· 4,95 .
PO (4) 257,87··· 2,089 NS
3,74 •
pH (4) 1,035 NS 22,74··· 6,05···
(1) Milieux: M60 = milieu de multiplication; M60/120 et M110 = milieux d'initiation de l'embryogenèse;
date: dates de prèlèvement; interaction: combinaison « milieu x date de prélèvement »;
F : test Fisher-Snedecor; niveau de signification: NS = non significatif; * = =
significatif (5%); **
hautement significatif (1 %); *** = très hautement significatif (1%0)
(2) n=4, FMilieu (2,81); FOate (8,81); Flnteraction (16,81), Dates: TO, TI, T14, T21, T28, T35, T42, T49, T56
(3) n=4, F Miiieu (2,36); FOate (3,36); Flnteraction (6,36), Dates: TO, T14, T28, T56
(4) n=4, FMiiieu (2,44); FOate (4,44); FlnteraC1ion (8,44), Dates: TO, TI, T14, T28, T56
ABSTRACT
For coconut, propagation by in vitro somatic embryogenesis is the. only way to clone
elite individuals which should allow to ameliorate productivity and homogeneity of coconut
plantations. However, this plant is highly recalcitrant to in vitro regeneration.
An analysis of the nutritional needs has been realised in a way to master conditions for
somatic ernbryogenesis initiation, which is normally observed on media supplemented with
2,4-0. Analysis of the culture media revealed specifie needs in glucose, nitrate and
phosphate during embryogenesis initiation. These observations are closely related to a
decrease in the sucrose level of the embryogenic calli and to an activation of
proteosynthesis.
Analyses of endogenous amine acid in embryogenic calli revealed two types of
behavior: calli weil orientated through somatic embryogenesis were characterised by an
increase in proline, valine, leucine and alanine; on the other hand, calli remaining in a
meristematic way were shown to have a lower level in the total amine acid content. The
hypothesis of amine acids as physiological markers for somatic embryogenesis in coconut is
discussed.
A new induction stimulus has been found: somatic embryogenesis initiation has been
1
observed by using higher concentration in sucrose (120 g.r ,. four time the normal rate) with
no modification of the 2,4-0 concentration.
Search for a 50 kOa protein, shown to be an early embryogenesis specifie marker for
several species, has been realised on embryogenic calli Iines.
The absence of a multiplication phase in coconut regeneration is a Iimiting factor for a
high rate cloning. The obtention of embryogenic suspension could be a solution. For the first
time, coconut suspensions in Iiquid medium has been obtained from friable calli. This was
observed after 6 months of culture in agitated Iiquid medium. The modalities of the
suspension growth are described. First trials of maturation showed the formation of
meristematic globular epidermised structures by decreasing the 2,4-0 concentration on one
hand and increasing the SAP one on the other hand.
KEYS WORDS: Cocos nucifera L., somatic embryogenesis, histocytology, cel! infrastructure,
activated charcoal, 2,4-0, nitrogen nutrition, carbon nutrition, minerai nutrition, sucrose,
embryogenic suspensions.
RESUME
Chez le cocotier, la micropropagation par embryogenèse somatique in vitro est la

seule voie possible pour le clonage d'individus d'élite qui permettrait d'améliorer la
productivité et l'homogénéité des plantations. Cependant, cette plante est extrêmement
récalcitrante à la régénération.
Dans le but de mieux maîtriser les conditions d'initiation de l'embryogenèse, sur milieu
enrichi en 2,4-D, une étude descriptive des facteurs nutritifs a été réalisée. Des dosages
dans les milieux ont permis la mise en évidence de besoins spécifiques en glucose, nitrate
et phosphate. Ils sont reliés à une diminution de la teneur en saccharose des cals
embryogènes, et à une activation de la protéosynthèse.
Une analyse des acides aminés endogènes a permis de caractériser deux types de
comportement : des cals bien orientés vers l'embryogenèse, caractérisés par une
augmentation des teneurs en proline, valine, leucine et alanine; des cals qui retournent à
l'état méristématique, caractérisés par une diminution globale de la teneur en acides aminés.
L'hypothèse selon laquelle les acides aminés constitueraient des marqueurs physiologiques
de l'orientation vers l'embryogenèse est discutée.
Un nouveau stimulus inducteur de l'embryogenèse a. été caractérisé. Il consiste à
quadrupler la concentration du saccharose (120 g.r1) sans modification de la concentration
en 2,4-D. ' ' '''3'
La recherche de marqueurs protéiques précoces, spécifiques de l'embryogenèse, a

été réalisée au travers d'essais consistant à vérifier la présence dans des cals embryogènes
d'un marqueur de 50 kDa préalablement mis en évidence chez plusieurs espèces.
L'absence de phase de multiplication constitue actuellement un facteur limitant pour le
clonage à grande échelle du cocotier. L'établissement de suspensions embryogènes
représenterait une. alternative à ce problème. Dans le cadre de notre travail, des
suspensions ont été obtenues pour la première fois chez le cocotier, à partir de cals friables,
après 6 mois de culture en milieu liquide agité. Les modalités de prolifération de la
suspension sont décrites. Les premiers essais d'expression des potentialités embryogènes
des suspensions ont permis la formation de nodules méristématiques globulaires
épidermisés, par diminution de la concentration en 2,4-D et apport de BAP.
MOTS CLES : Cocos nucifera L., embryogenèse somatique, .hlstocytoloqie, infrastructure cellulaire,
charbon actif, 2,4-0, nutrition azotée, nutrition carbonée, nutrition minérale, saccharose,
suspensions embryogènes.

010004460

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Ues plus vifs remerciemellis el mo grolilude v01l1 d Ume 8t/FFA/?/J-UO/?ff el d

J'odresse mes remerciemellis d Ume HlClIAt/)'-FF/?/?/F/?F pour ses précieu)' cOllseils el

Je liells d e)'primer mo recolllloissollce d Frédûique C/?OS/JFJlAIICF pour SOIl oml/ié el

2- PROCEDE DE REGENERATION PAR EMBRYOGENESE SOMATIQUE 19

3- EMBRYOGENESE SOMATIQUE CHEZ LE COCOTIER 29

MATERIEL & METHODES 37

PARTIE 1- ETUDE DES FACTEURS NUTRITIFS IMPLIQUES LORS DE L'INITIATION

CHAPITRE 1- CARACTERISATION MORPHOLOGIQUE ET STRUCTURALE DES LIGNEES DE CALS 66

CHAPITRE Il - ETUDE DES BESOINS NUTRITIFS SPECIFIQUES AU COURS

CHAPITRE III -INFLUENCE D'UNE AUGMENTATION DE LA CONCENTRATION EN SUCRE

CHAPITRE IV - RECHERCHE DE MARQUEURS PROTEIQUES PRECOCES DE L'EMBRYOGENESE

CHAPITRE 1- COMPORTEMENT DE DIFFÉRENTES LIGNÉES DE CALS EN MILIEU LIQUIDE 154

CHAPITRE Il - PROLIFÉRATION DES SUSPENSIONS 175

CHAPITRE III - ETUDE DE L'EXPRESSION DES POTENTIALrrÉS EMBRYOGÈNES

CONCLUSION GENERALE 205

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 207

TABLEAU 1 : Pays producteurs de coprah et d'huile de coco

Pays producteurs Production Production

"Cette espèce de palmier est la crème de

Louis TEMPOREL, d'après DE KERCHOVE, 1878

"Ceuxi, disent les Indous, fut immolé par

Légende Indou, d'après DE KERCHOVE, 1878

e cocotier appartient à un ordre de Monocotylédones, les Palmales, comprenant une

~L- ---I'1ï~,stipe avec les cicatrices foliaires

PA~~~E~i~~~~~:- Racines fasciculées

Figure 1 : LE COCOTIER, Cocos nucifera L. : A et B, Fruit en gennination en coupe

Nous rappelerons les principales caractéristiques botaniques du cocotier (2n = 32) 2.

2.1- Le système racinaire

2.2- Le système aérien

TABLEAU 2 : Composition chimique moyenne de noix de coco matures

Parties de la noix Proportion pour une noix mature

TABLEAU 3 : Caractéristiques écologiques du cocotier (d'après de Taffin, 1993)

Température: 27°C de moyenne annuelle (1)

2.3- Les inflorescences

--TRUNK OUt Dl' . . coconU1 Ifunk. n.rdy .Rd

-1+-- YOUNG NUT "'- . ~ i- -".:

PHILIPPINE COCONUT AUTHORlTY

Figure 2 Schéma représentant les différentes utilisations du cocotier

Agent Symptomes Localisation Traitement

2.5- Ecologie du cocotier

TABLEAU 5: Composition de l'eau de coco

Constituants Unité Moyenne Source

Proportion comestible CICAL-CNEVA, 1993

4.1- Utilisations à l'échelle industrielle

La figure 2 présente les différentes utilisations du cocotier.

4.1.2- L'EAU DE COCO

4.1.3- LE LAIT DE COCO

4.1.4- LA NOIX DE COCO RAPEE

4.2- Petites industries et usages en milieu villageois

TABLEAU 6 : Caractéristiques des différents écotypes et hybrides de cocotier

Grands Nains Hybrides

Cependant, les progranunes de sélection se heurtent à différents problèmes inhérents au

2- PR.OCEI»E I»E R.EGENE~TION

1- INTRODUCTION: CONCEPT D'EMBRYOGENESE SOMATIQUE

"D'une façon générale, tout véritable développement est

(KIERKEGAARD, d'après J. ROSTAND

La multiplication végétative par embryogenèse somatique utilise la totipotence des

L'embryogenèse somatique peut être obtenue:

HALPERlN (1995) suggère que l'embryogenèse directe est caractéristique d'explants

Comme le soulignent MICHAUX-FERRIERE et SCHWENDIMAN (1992), l'embryogenèse

au cours du temps, en particulier par des modifications fonctionnelles du génome : mutation

2- ETAT DES CONNAISSANCES SUR L'INITIATION DE L'EMBRYOGENESE

2.1- Hypothèses sur l'origine des cellules embryogènes