Rapport GC

REPUBLIQUE TUNISIENNE
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR,

DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE ET DE LA TECHNOLOGIE
UNIVERSITE DE MONASTIR
INSTITUT SUPERIEUR DE BIOTECHNOLOGIE
Mémoire
Présenté pour l'obtention du diplôme de Mastère en
Aquaculture et Biotechnologie Marine
Etude en photobioréacteur torique de la microalgue eucaryote

Chlamydomonas reinhardtii en conditions de limitation
par la source d’azote et l’impact sur les réserves carbonées
Réalisé par Mohamed BEN ROMDHANE
Soutenu publiquement le
Devant la commission d’examen composée de :
Président :
Examinateur :
Encadreur : M. Hatem BEN OUADA
Membre invité :
Année Universitaire 2008/2009
Laboratoire : GEnie des Procédés, Environnements, Agroalimentaire_ UMR CNRS 6114, Boulevard
de l’Université, CRTT-BP 406, 44602 Saint-Nazaire Cedex, France.
REMERCIEMENTS
La réalisation du présent travail n’aurait pas été possible sans la collaboration de

plusieurs personnes à qui je dois toute ma reconnaissance et ma gratitude.
Il m’est agréable de remercier chaleureusement Madame Sabria BARKA, Maître

Assistant à l’Institut Supérieur de Biotechnologie de Monastir, pour son aide et son
encouragement le long de mon Mastère.
Mes remerciements s’adressent aussi à Monsieur le Professeur Hatem BEN OUADA qui
a bien accepté l’encadrement de mon mastère et pour m’avoir permis d’accéder à ce
stage en France ainsi que pour la confiance dont il a fait preuve à mon égard pour le
déroulement de mastère, se manifestant entre autres par une source intarissable d’idées et
de conseils qui m’ont été bénéfiques, notamment lors de la rédaction du manuscrit.
Je tiens à remercier Monsieur le Professeur Jack LEGRAND qui m’a accueilli au sein de
laboratoire GEPEA (UMR CNRS 6144). CRTT, à l’université de Nantes pour la
réalisation de mon stage de mastère, ainsi que Monsieur Jérémy PRUVOST qui m’a
facilité les taches d’admission dans le laboratoire.
Au terme de ce travail, j’exprime ma gratitude et ma reconnaissance à Monsieur le

Professeur Guillaume CONGE pour avoir accepté de diriger mes recherches et de
m’avoir associé à un sujet nouveau au sein de l’unité. J’ai été sensible à l’intérêt que tu as
constamment porté à mon travail
J’exprime mes remerciements vifs et sincères à Monsieur Hosni TAKACHE pour l’aide,
la patience et les conseils qu’ils ont su m’apporter dans un premier temps lors de la
réalisation de mon stage de mastère puis tout au long de mon stage et aussi Moemen
DABOUSSY et Nour-Eddine SABIRI pour leur soutien au cours de stage en France.
Je voudrais aussi exprimer ma reconnaissance envers Madame Maryse CHAPLAIN-

DEROUINIOT M-P HENRY pour m’avoir fait bénéficier de son expertise technique
avec beaucoup de disponibilité.
De façon plus générale, mes remerciements s’adressent à toutes les personnes du

laboratoire qui m’ont apporté leur aide et leur bonne humeur tout au long de ces trois
mois ces parmi lesquelles Fadoua pour son indéfectible soutien, Sébastien JUBEAU pour
sa bonne humeur lors de l’expérimentation de plein champ mais aussi Khaled
ALMAKSOUR, Safwan SAKER, Abdulkader SANKARI, et Hamid pour leur
inébranlable humour.
Mes remercîments s’adressent également à tous mes collègues à l’Institut Supérieur de

Biotechnologie de Monastir.
i
LISTE DES ABREVIATIONS ET DES NOTATIONS
ρ : Absorption en nutriment (mol.cell-1.j-1),

<µ> : Taux de croissance moyen dans l’enceinte de culture (en j-1),
3 APG : 3 Acide Phosphoglycérate
ACL : ATP Lyase du Citrate
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ADP : Adénosine Diphosphate
AMPc : Adénosine-mono-phosphate cyclique
AMT : Transporteur d’Ammonium
Amt1 : Gènes codé pour des transporteurs d’Ammonium
ARN : Acide Ribonucléique
ATP : Triphosphate Adénosine
BSA : Albumine de sérum de bovin
CAB : Polypeptide de fixation de chlorophylle a et b
Chla : Chlorophylle a
Chlb : Chlorophylle b
Cyt b6/f : Cytochrome b6/f.
D : Taux de renouvellement ou de dilution (en j-1)
DGTS : Diacylglyceryltrimethylhomoserine
DHAP : Dihydroxyacétone Phosphate
Fdox : Ferrédoxine
G6P : Glucose-6-phosphates
G6PDH : Glucose-6-Phosphates Déshydrogénase
GAP : Glycéraldéhydephosphate
GC : Point de compensation
GOGAT : Glutamine-2-Oxo-Glutarate Amino-Transferase
GS : Glutamate synthétase
LHCI : Light Harvesting Complex I
LHCII : Light Harvesting Complex II
MGDG : Monogalactosyldiacylglycerol
Milieu TAP : Milieu Tris-Acétate-Phosphate
NAD : Dinucleotide de l'Adénine du Nicotinamide
NADPH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide phosphate (reduced form)
Nar1 : Gènes codé pour les composants des transporteurs de Nitrate /Nitrite
Nia : Gènes codé pour le Nitrate réductase
Nii : Gènes codé pour le Nitrite réductase
NiR : Nitrite réductase
NL : Limitation d’Azote
NR : Enzymes de Nitrate réductase
Nrt : Gènes codé pour les composants des transporteurs de Nitrate/ Nitrite
P680 : Centre réactionnel
P700 : Centre réactionnel
PC : Plastocyanine
PG : Phosphatidylglycérol
ii
Pheo : Phéophytine-quinones
PK : Pyruvate kinase
Pmax : Productivité maximale
PMMA : Polyméthyle méthacrylate
PPC : Photoprotective Carotenoids
PQ : Plastoquinones
PsaA : Protéines membranaire de photosystème II
PsbA : Protéines membranaire de photosystème II
PSI : Photosystème I
PSII : Photosystème II
PUFA : Polyunsaturated fatty acid.
QA : Quinone A
QB : Quinone B
rNH4 : Vitesse d’utilisation de l’ammonium
Rubisco : Ribulose 1,5 bisphosphate carboxylase/oxygénase
RuBP : Ribuose 1,5 Biphosphate
rx : Vitesse de production de biomasse
S (I-VI) : Systèmes de transport de Nitrites/Nitrates
Si : Substrat en entrée et Sr le substrat résiduel (mol.L-1).
TAG : Triglycérole
TIC : Carbone Inorganique Totale
YNH4-X : Rendement d’assimilation de l’azote par apport à la production de la
biomasse.
iii
TABLE DES MATIERES
Remerciements i
Liste des abréviations et des notations ii
Table des matières iv
Liste des figures viii
Liste des tableaux x
Introduction
PARTIE : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Valorisation des microalgues dans le monde 3

1.1. Les microalgues en alimentation humaine 3
1.2. Intérêt énergétique des microalgues 4
1.2.1. Production de l’hydrogène 4
1.2.2. Production de biodiesel 5
1.2.3. Application environnementale 5
2. La microalgue Chlamydomonas reinhardtii 6

2.1. Morphologie de la cellule Chlamydomonas reinhardtii 6
2.1.1. Vue générale 6
2.1.2. Chloroplaste 7
2.1.3. Mitochondrie 8
2.2. Mode de reproduction 9
2.3. Chlamydomonas reinhardtii: un organisme modèle 11
3. Mécanisme de photosynthèse 12
2.4.1. Transfert d’électrons dans la phase claire 12
2.4.2. Réactions indépendantes de la lumière 14
4. L’azote chez les microalgues 16

4.1. Utilisation de l’azote par les microalgues 16
4.2. Voies de transport de l’azote 17
4.3. Conversion de l’azote 18
4.4. Voies enzymatiques d’assimilation 19
4.5. Mécanismes d’adaptation aux conditions de limitation d’azote 19
iv
4.5.1. Régulation de l’assimilation de l’azote sous sa forme minérale 20
4.5.2. Régulation de l’assimilation de l’azote sous sa forme organique 21
4.5.3. Effet sur la division cellulaire 21
4.5.4. Effet sur la photosynthèse et les pigments chlorophylliens 22
4.5.5. Effet sur l’activité non photochimique 24
4.5.6. Effet sur la respiration 24
4.5.7. Effet sur les réserves carbonées 25
4.5.8. Effet sur la gamétogenèse 27
5. Système de culture des microalgues 28
5.1. Système de culture ouvert 28
5.2. Système de culture clos 30
5.2.1. Le photobioréacteur 30
5.2.2. Technologie de photobioréacteur 30
5.2.3. Différents forme géométrique de photobioréacteur 30
5.2.4. La lumière et le photobioréacteur 32
6. Cinétiques de croissance 32
6.1.Cinétique de croissance en mode batch 32
6.2. Cinétique de croissance en mode continue 33
6.2.1. Mode chémostat 34
6.2.2.Mode Turbidostat 35
6.3. Relation entre la cinétique en mode continue
36
et les conditions de transfert de lumière
PARTIE EXPERIMENTALE : MATERIELS ET METHODES
1. Maquette d’étude : le photobioréacteur torique 38

1.1. Description générale 38
1.2. Composantes du photobioréacteur 38
1.2.1. Système d’éclairage 40
1.2.2. Système d’agitation 41
1.2.3. Sondes de mesure 42
1.2.4. Réseaux fluides /gaz 45
2. Matériel biologique 45
2.1. La souche de microalgues utilisée 45
v
2.2. Conservation de la souche et préparation d’inoculum standard 46
2.3. Milieux de culture 46
3. Méthode de culture 46
3.1. Préparation du réacteur 46
3.2. Culture en batch 47
3.3. Cultures expérimentales 47
3.4. Paramètres de la culture 48
4. Analyses biologiques 49
4.1. Estimation de la biomasse sèche 49
4.2. Dénombrement cellulaire 49
4.3. Détermination de la taille cellulaire 49
4.4. Dosage des pigments 49
4.5. Dosage des protéines totales 50
4.6. Dosage de sucres totaux 50
4.7. Dosage de l’amidon 51
5. Analyses physicochimiques 51
5.1. Dosage du carbone inorganique 51
5.2. Dosage de l’ammonium 52
6. Analyses mathématiques des données 52
RESULTATS 53
53
1. Etude de la croissance dans des conditions sans limitation d’azote
1.1. La croissance 53
1.2. Paramètres abiotiques 55
1.3. Pigments photosynthétiques 56
1.4. Réserves carbonées 57
1.5. Composition biochimique globale de la cellule 57
2. Etude de la croissance sous conditions de limitation d’azote 59

2.1. la croissance 59
2.2. Paramètres abiotiques 60
2.3. Pigments photosynthétiques 61
2.4. Réserves carbonées 63
vi
2.4.1. Protéines 63
2.4.2. Sucres totaux 63
2.4.3. Amidon 64
2.4.4. Sucres totaux et Amidon 65
2.5. Evolution de la composition biochimique globale de la cellule 66
2.6. Variation du nombre cellulaire au cours de la culture 67
3. Etude de la réversibilité de la réponse aux conditions de limitation d’azote 68
3.1. Paramètres d’azote 68
3.2. Réserves carbonées et pigments photosynthétiques 68
DISCUSSION 70
CONCLUSION 73
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 74
ANNEXES 82
vii
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Schéma représentative de la morphologie
de la microalgue Chlamydomonas reinhardtii. 7
Figure 2 : Schéma représentative de l’ultra structure de chloroplaste. 8
Figure 3 : Schéma d’une représentation de la structure de mitochondrie. 9
Figure 4 : Cycle de vie de la microalgue Chlamydomonas reinhardtii. 10
Figure 5 : Composants du photosystème II. 13
Figure 6 : Voie de transfert des électrons au sein de la membrane

thylakoïdienne et principales réactions régissant le
processus de la photosynthèse. 14
Figure 7 : Réactions dépendantes de la lumière et réactions de Calvin. 15
Figure 8 : Processus générale de l’utilisation de l’azote par les microalgues

(sans tenir compte de la compartimentation cellulaire). 17
Figure 9 : Schéma des composants de voie de l’assimilation

de l’ammonium et de nitrate chez la Chlamydomonas. 18
Figure 10 : Accumulation de l’amidon et le lipide dans la cellule de

Chlamydomonas reinhardtii : (A) dans les conditions
normale (B) en limitation d’azote. 26
Figure 11 : Bassin en ˝Raceways˝ pour la production de spiruline

dans la ferme de spiruline à "El Alia", Tunisie. 29
Figure 12 : Photobioréacteurs de type colonne Scobalit utilisé en écloserie. 32
Figure 13 : Différentes phases de croissance chez des microorganismes. 34
Figure 14 : Relation entre la productivité du système en mode continu

et la disponibilité de la lumière dans un photobioréacteur. 37
Figure 15 : Photobioréacteur torique. 39
viii
Figure 16 : Panneau de diodes utilisé comme sources de lumière
pour le photobioréacteur torique 40
Figure 17 : Mobile d’agitation sous forme d’hélice marine à trois pales 41
Figure 18 : Système de régulation du pH dans un photobioréacteur torique

pour la culture en turbidostat 43
Figure 19 : Système de régulation de biomasse dans un photobioréacteur

torique pour la culture en turbidostat 44
Figure 20 : Schéma générale de l’expérimentation 48
Figure 21 : Evolution de Poids sec (Cx) de Chlamydomonas et

du taux de dilution (D) du système en fonction du temps 54
Figure 22 : Image d’une observation microscopique d’un échantillon de

microalgues fixé sur une cellule de malassez. 54
Figure 23 : Composition biochimique globale de la Chlamydomonas

reinhardtii. 58
Figure 24 : Evolution de la productivité (P) et le taux de dilution (D)

dans le photobioréacteur en mode Turbidostat. 59
Figure 25 : Visualisation de changements pigmentaire de la cellule. 62
Figure 26 : Composition biochimique de la Chlamydomonas reinhardtii

en conditions de limitation d’azote. 66
Figure 27 : Composition biochimique de la Chlamydomonas reinhardtii au

cours de l’étude de la réversibilité des effets de limitation
d’azote. 68
ix
LISTE DES TABLEAUX
Tableau I : Récapitulatif des données obtenues sur le teneur en azote. 55
Tableau II : Récapitulatif des données obtenues sur le teneur en pigments. 56
Tableau III : Récapitulatif des données obtenues sur le teneur en pigments. 57
Tableau IV : Récapitulatif des données obtenues sur le teneur en azote. 60
Tableau V : Récapitulatif des données obtenues sur les protéines 61
Tableau VI : Récapitulatif des données obtenues sur les sucres totaux 63
Tableau VII : Récapitulatif des données obtenues sur l’amidon 63
Tableau IX : Récapitulatif des données obtenues sur les pigments 64

photosynthétiques
Tableau VIII : Récapitulatif des données obtenues sur l’amidon et les sucres 65
totaux
Tableau X : Evolution de la taille cellulaire au cours de la limitation d’azote 67
x
INTRODUCTION
Introduction
La continuité de la vie sur terre est liée à la présence d’énergie sous ces
différentes formes. La possibilité d’avoir une énergie flexible selon les besoins en
contrôlant la quantité produite et avec un rendement acceptable est un défit pour tous les
chercheurs dans le domaine énergétique. En outre, le développement industriel et
l’utilisation abusive de l’énergie sous ces différentes formes ont provoqué des problèmes
environnementaux auxquels est confrontée notre planète. A cette préoccupation
environnementale viennent s’ajouter d’autres préoccupations économiques telles que la
hausse de prix du baril de pétrole. Dans ce contexte, l’esprit mondial est dirigé vers
l’exploitation des ressources renouvelables non polluantes. Dans la situation actuelle
aucune de ces ressources n’a prouvé sa capacité de succéder aux formes d’énergie fossile,
soit en termes de rendement ou d’efficacité d’utilisation.
Durant ces dernières années, les microalgues sont mises en exergue comme une
véritable source de composants actifs exploitables dans différents domaines d’application
critiques de notre vie comme la santé et l’énergie. Les microorganismes sont considérés
comme une micro-usine naturelle qui fonctionne avec les éléments les plus abondants
dans notre planète (CO2 et lumière) pour une production renouvelable d’énergie, tout en
respectant la nature et en assurant ainsi une continuité équilibrée de notre développement.
Par un simple processus photosynthétique, ces espèces peuvent convertir l’énergie
lumineuse en des formes métaboliques diverses qui peuvent être exploitées pour produire
plusieurs types de produits intéressant aussi bien sur le plan nutritionnel, pharmaceutique,
environnemental que sur le plan énergétique (biodiesel, hydrogène, méthanol et autres
formes). La vulgarisation de ces formes d’énergie à partir des microalgues nécessite,
cependant, l’optimisation de leur production par des études plus détaillées des conditions
de culture. En particulier, la modélisation des facteurs abiotiques permet de contrôler les
mécanismes métaboliques cellulaires intervenant dans la production de différents
composants d’intérêt. En effet, la croissance et la production des métabolites par les
microalgues sont affectées par plusieurs facteurs tels que la température, le pH, l’intensité
lumineuse et la composition du milieu de culture. Ce dernier paramètre est en fait un
facteur déterminant dans la mobilisation des réactions métaboliques vers la synthèse des
1
Introduction
certaines formes distinctes de réserves carbonées, selon la nature de l’élément nutritif et

le degré de stress appliqué. Un tel mécanisme d’adaptation au stress nutritif peut ainsi
être exploité pour contrôler la synthèse et l’accumulation d’un produit fini
énergétiquement exploitable.
Notre travail s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche ayant pour
objectif la valorisation énergétique des microalgues. Il vise plus particulièrement l’étude
de l’effet de limitation d’azote sur les différentes réserves carbonées chez la souche
sauvage de la microalgue Chlamydomonas reinhardtii en utilisant un potobioréacteur
torique en mode continu. Nous avons expérimenté deux cultures: une culture témoin sans
limitation d’azote et une culture en limitation d’azote. Au cours de ces expériences nous
avons quantifié l’évolution de différentes réserves carbonées et des pigments
photosynthétiques.
Ce manuscrit décrit les différentes étapes et les principaux résultats de notre

travail. Il est organisé en trois parties :
Une revue bibliographique consacrée aux différents domaines d’application

énergétique des microlagues, l’aspect biologique de la Chlamydomonas reinhardtii, la
technologie de photobioréacteur et l’aspect cinétique de la croissance des
microorganismes.
Une partie expérimentale qui décrit le matériel biologique ainsi que les différentes
techniques et méthodes utilisées dans cette étude.
Une troisième partie, consacrée à la présentation, l’analyse et la discussion des

résultats obtenus.
Le manuscrit se termine par une conclusion et quelques perspectives.
2
REVUE
BIBLIOGRAPHIQUE
Revue bibliographique
1. Valorisation des microalgues dans le monde

L’utilisation des microalgues dans plusieurs domaines d’application a été bien
développée pendant ces décennies. Les recherches dans ce domaine ont permis
d’exploiter les constituants des microalgues dans l’industrie pharmaceutique et
pharmacologiques (Apt et Behrens, 1999). Beaucoup de molécules bioactives de haute
valeur, comme les vitamines, les acides gras et les antibiotiques peuvent être extraites de
quelques espèces de microalgues (Metzger et Largeau, 2005 ; Singh et al., 2005). De
plus, ces microorganismes ont prouvé leur utilité comme une alternative pour le
traitement des eaux usées (Tang et al., 2002 ; Kalin et al., 2005) et les applications de
phytoremédiation (Mallick, 2002; Suresh et Ravishankar, 2004; Muñoz et Guieysse,
2006) par leur capacité de fixer l’azote dans le milieu naturel (Vaishampayan et al.,
2001). Malgré ces diverses applications, l’industrie d’aquaculture reste le domaine où
l’utilisation des microalgues est la plus abondante (Cahu et Infante, 2001).
1.1. Les microalgues en alimentation humaine
Plusieurs espèces de microalgues ont révélé une composition biochimique

intéressante sur le plan nutritionnel. Pour l’alimentation humaine directe, une espèce de
cyanobactérie est particulièrement connue; la spiruline. C’est une espèce consommée
depuis des siècles par certaines populations d’Amérique centrale et d’Afrique. Elle est
exceptionnellement riche en protéines, en vitamines et renferme des lipides essentiels
rares. Cette espèce présente une composition très équilibrée. Contrairement aux autres
aliments qui ont des problèmes liés à la mauvaise digestibilité, la spiruline constitue un
complément alimentaire de qualité pour plusieurs pays comme le Japon, l’inde et le
Mexique. Parmi les espèces présentant des compositions équilibrées comme la Spiruline,
on peut citer les Chlorella ou Scendesmus. On trouve plusieurs installations
industrielles de production à but alimentaire comme la société américaine Earthrise
Nutritionals (www.earthrise.com) qui cultive de la spiruline à des fins alimentaires dans
des bassins en "Raceways" occupant une surface de 440,000 m² (Spolaore et al., 2006).
3
1.2. Intérêt énergétique des microalgues
L’idée de l’utilisation des microalgues comme une source de carburant n’est pas
originale. Mais, elle est sérieusement prise en considération ces dernières années à cause
de l’augmentation du prix de pétrole et la prise de conscience récente des problèmes liés
à l’impact de la combustion des réserves fossiles sur l’environnement et l’épuisement de
ces réserves (Gavrilescu et Chisti, 2005).
Les microalgues sont des usines cellulaires capables de transformer le dioxyde de

carbone en matière organique par l’énergie de la lumière solaire. Les recherches dans le
domaine bioénergétique ont permis d’exploiter la totalité des réserves carboniques dans
la cellule algale ; les lipides, les sucres et les protéines. Selon la nature et la quantité de
matière organique intracellulaire, ces usines peuvent fournir différents types de
bioénergie renouvelable. Ceci inclue plusieurs produits énergétiques comme la
production de méthane par la procédure de dégradation anaérobique de la biomasse algale
(Spolaore et al., 2006), le biodiesel dérivé de l’huile algale (Banerjee et al., 2002;
Gavrilescu et Chisti, 2005) et le bio-hydrogène par photobiologie (Akkerman et al., 2002;
Melis, 2002; David et al., 2004 ; Fedorov et al., 2005; Kapdan et Kargi, 2006).
1.2.1. Production de l’hydrogène
Au début des années 70, Graffron et ces collaborateurs ont découvert la capacité
des microalgues à produire l’oxygène et l’hydrogène de façon alternative (Gaffron et
Rubin, 1942). Plusieurs espèces algales isolées du milieu marin, des eaux douces et des
environnements terrestres sont capable de produire l’hydrogène dans des conditions
anaérobiques et en carence de soufre. La voie métabolique de production de
biohydrogène nécessite la présence de l’enzyme hydrogénase (Wykoff et al., 1998). La
microalgue verte Chlamydomonas reinhardtii est l’espèce la plus étudiée pour la
production de biohydrogène. Elle est capable de produire le biohydrogène en photo-
autotrophie et dans un milieu carencé en soufre. L’amélioration génétique de la souche à
augmenté sa productivité volumique cinq fois plus que la souche sauvage avec un gaz
produit contenant 99,5% d’hydrogène (Torzillo et al., 2009).
4
1.2.2. Production de biodiesel

Dans le sens général, le biodiesel est toute biomasse alternative qui peut produire
du fuel. Cependant aujourd'hui, cette définition est restreinte à une modification chimique
très spécifique d'huiles naturelles (Sheehan et al., 1998). Le biodiesel est le produit d’une
réaction de trans-estérification entre les triglycérides, qui constituent les huiles végétales,
et les molécules d’alcool. Il est constitué de monoesters méthyliques ou d’esters
éthyliques selon le catalyseur de la réaction de trans-estérification. Il a été testé en
remplaçant à 100% le gazole et aucun problème n'a été relevé.
La production de biodiesel par les microalgues est plus avantageuse par apport
aux autres sources végétales d’huile. D’une part, les microalgues peuvent produire 30 fois
plus de matière organique par unité de surface que les organismes terrestres et la
biomasse des microalgues peut être doublée généralement en moins de 24 h. D’autre part,
la quantité d’huile produite peut dépasser 80 % de la masse de la matière sèche (Spolaore
et al., 2006). Des taux de production d’huile entre 20 et 50 % sont fréquents.
1.2.3. Application environnementale

En 1960, Oswald et Golueke proposaient de traiter les eaux usées en y cultivant
en "Raceways" des microalgues. La biomasse produite peut être ensuite fermentée par
des microorganismes anaérobies afin de produire du biogaz (méthane), convertible en
énergie (Oswald et Golueke, 1960). Les systèmes d’épuration des eaux usées par
lagunage sont considérés comme les milieux le plus productifs sans conteste. Cette
technique est connue, dans les stations d’épuration des eaux usées, par le chenal algal.
Elle est utilisée dans les Etats-Unis et d’autres pays, à l’échelle pilote. La production
varie, suivant la latitude, de quelques tonnes à 150 tonnes (poids sec) /ha /an, ce qui
correspond à des densité de plusieurs millions de cellules par ml (Barnabé et al., 1989).
5
2. La microalgue Chlamydomonas reinhardtii
Chlamydomonas reinhardtii est un organisme eucaryote unicellulaire appartenant au

phylum des Chlorophytes (algues vertes). Plus de 600 espèces de genre Chlamydomonas
ont été décrites, la plus part appartiennent à la classe des chlorophyceae, mais seulement
quelques espèces ont fait l’objet de recherches scientifiques. Le nom de l’espèce à été
traduit du russe en plusieurs formes : reinhardi, reinhardii et reinhardtii, mais toutes
réfèrent à la même espèce ; reinhardtii . C’est une microalgue motile, phototrophe et
capable de pousser en obscurité totale et en présence d’une source alternative de carbone.
Avec une forte capacité d’adaptation et une grande flexibilité, cette algue verte est
répandue dans tout le monde et dans différents environnements ; elle est souvent trouvée
dans le sol et l’eau douce, mais également dans les océans, et même dans la neige et les
hautes montagnes.
2.1. Morphologie de la cellule Chlamydomonas reinhardtii

2.1.1. Vue générale
L’algue Chlamydomonas est caractérisée par une structure cellulaire simple

(figue 1). La motilité de la cellule est assurée par deux flagelles antérieurs isocontés :
apicaux et égaux. L’algue est de forme ovale à sphérique et d’environ 6 à 10 µm de
diamètre. La cellule est entourée d’une paroi souvent accolée à la membrane plasmique.
L’algue possède des hématochromes qui lui permettent de détecter la lumière et de
déclencher des réponses photo-tactiques. Le noyau est situé dans le centre de la cellule et
le chloroplaste unique basal est en forme de cloche. Ce dernier contient un ou plusieurs
pyrénoïdes qui enveloppent des grains d’amidon. Les pigments photosynthétiques
majeurs sont les chlorophylles a et b, à l’origine de la couleur verte de la cellule, et
quelques caroténoïdes.
6
L’ultrastructre de la cellule de
Chlamydomonas présente le noyau
central (N) avec le nucleus (Nu) entourés
par le chloroplaste sous forme de cloche
(C) contenant les membranes
thylacoïdales (T), les grains d’amidon
(S) et les pyrenoides (P) dans le stroma
(St). Des yeux primitifs (ES) sont
positionnés contre l’enveloppe de
membrane du chloroplaste. Deux
flagelles (F) sont projetés de la région
apicale de la cellule. La vacuole (V) peut
être visible dans le cytoplasme.
Figure 1: Schéma représentatif de la morphologie

de la microalgue Chlamydomonas reinhardtii
2.1.2. Chloroplaste
Le chloroplaste (figure 2) est un organite semi-autonome typique des cellules

eucaryotes photo-autotrophes. Il est de forme en cloche et représente prés de 40 % de
volume de la cellule de Chlamydomonas (Harris, 1989). Il est enveloppé par deux
membranes qui permettent l’échange des molécules spécifiques avec le milieu
cytoplasmique par l’intermédiaire des transporteurs transmembranaires. La matrice
chloroplastique ou stroma renferme un système membranaire de structure laminaire
constitué de thylacoïdes et appelé granum. Ces structures renferment des complexes
pigmentaires de couleur verte capable de capter l’énergie de la lumière. De plus, il
contient la plus part de protéines impliquées dans la photosynthèse.
Il possède également son propre ADN circulaire qui permet la traduction de
différentes protéines intervenant dans les réactions photochimiques de la photosynthèse et
la synthèse de la plus part des acides aminés, vitamines, lipides, pigments et autres
composés secondaires.
7
Figure 2: Schéma représentative de l’ultra structure de chloroplaste
1. Membrane externes, 2. Espace intermembranaire, 3. Membrane interne (1+2+3: enveloppe), 4.

Stroma (fluide aqueux), 5. Lumen du thylakoïde, 6. Membrane du thylakoïde, 7. Granum
(thylakoïdes accolés), 8. Thylakoïde inter-granaire
inter granaire (lamelle), 9. Grain d'amidon, 10. Ribosome 11
ADN plastidial 12 Plastoglobule (gouttelette lipidique).
2.1.3. Mitochondrie
La mitochondrie est un organite vital trouvé dans la plus part des cellules
eucaryotes. Elle est de forme
forme allongé (0,2 à 0,3 µm) occupe enivrent 2 à 4% du volume
cellulaire. Elle est composée de deux membranes phospholipidiques, une externe et une
interne, qui délimitent 3 milieux : le milieu extra-mitochondrial
mitochondrial (cytoplasme de la
cellule), l’espace inter-mem
membranaire et la matrice (Figure 3).
La membrane interne se replie en divers points à l'intérieur même de la

mitochondrie. Ces replis constituent des cloisons appelées "crêtes mitochondriales" et
constituent un moyen efficace pour augmenter la surface de la membrane interne sans
changer le volume total de la mitochondrie.
La première fonction de mitochondrie est de produire l’énergie chimique sous

forme d’ATP pour la cellule via la chaine respiratoire aérobie. Elle assure le métabolisme
des acides aminé, des lipides et des vitamines et catalyse les réactions chimiques qui
permettent de libérer progressivement et de façon contrôlée l'énergie contenue dans les
8
molécules combustibles. Elle intervient lors des dernières étapes du cycle respiratoire
(cycle de Krebs et phosphorylation oxydative). Les molécules énergétiques,
indispensable à la survie cellulaire, seront diffusées dans le cytoplasme vers touts les
compartiments cellulaire. Elle possède également son propre ADN mitochondrial linéaire
de 15.8 Kpb (Grant et Chaing, 1980) lui permettant de se diviser et d’augmenter ces
capacités respiratoires selon les besoins énergétiques de la cellule.
Figure 3: Schéma d’une représentation de structure de mitochondrie
2.2. Mode de reproduction
Les cellules végétatives de C. reinhardtii sont haploïdes et composées de 17 petits

chromosomes. Le mode de reproduction le plus courant chez cette espèce est la division
mitotique asexuelle des cellules haploïdes (Figure 4). Ce mode permet une croissance
rapide avec un temps de dédoublement de la population moins de 10 heures.
Sous conditions de croissance optimale, les cellules peuvent subir deux ou trois
tours de mitose avant que la cellule fille soit libérée de la paroi cellulaire maternelle
(Pickett-Heaps, 1975). Les cellules filles sont retenues dans la paroi de la cellule mère
commune et libérées simultanément par la sécrétion d’une enzyme végétative lytique qui
agit spécifiquement sur la paroi de la cellule mère (Matsuda et al., 1995). Donc, une seule
9
étape de croissance peut libérer 4 ou 8 cellules filles par cellule mère. Le cycle cellulaire
de cette algue peut être synchronisé en alternant des périodes sombres et éclairées ; la
phase de croissance dépendant de la lumière, alors que, après un certain point de
transition, les processus sont indépendants de la lumière (Donnan et John, 1983).
Cette microalgue possède également un cycle de vie sexué. Dans des conditions
de carence en azote, des gamètes haploïdes se développent. La reproduction implique la
fusion de deux gamètes de types sexuels différents (mt+ et mt–), malgré qu’elles soient
morphologiquement identiques. La fusion de deux gamètes forme un zygote diploïde sans
flagelle. Il sert comme une forme endormie de l’espèce. En présence de la lumière, le
zygote subit la méiose et libère quatre cellules haploïdes flagellées qui reprennent le
cycle de la vie végétative (fig. 4).
(http://io.uwinnipeg.ca/~simmons/2152web
/2152/lb3pg1.htm , cached 060322)
Figure 4: Cycle de vie de microalgue Chlamydomonas reinhardtii
10
2.3. Chlamydomonas reinhardtii: un organisme modèle
Un organisme modèle est un système simplifié qui permet d'extrapoler les résultats à
d’autres organismes qui sont plus difficiles a étudier ou, dû à des obstacles éthiques (par
exemple utiliser le modèle de la souris pour étudier les êtres humains).
Chlamydomonas reinhardtii est considérée comme un organisme modèle

expérimental de laboratoire depuis les années 1940 et 1950. Les souches C. reinhardtii de
laboratoire étaient le sujet d'études novatrices sur la différenciation sexuelle, la cellule, la
motilité (Silflow et al., 1995), la régulation du cycle cellulaire (Harris, 1989), les études
sur la photosynthèse et la détermination du transport des électrons photosynthétiques
(Bennoun et Delepelaire, 1982).
Le séquençage du génome nucléaire de C. reinhardtii est complètement achevé

depuis 2007 (Merchant et al., 2007). En plus, la transformation du génome est possible
(Shimogawara et al., 1998 ; Remacle et al., 2006) et une grande collection de mutants,
principalement obtenue par le Centre Chlamy, (http://www.chlamy.org), est accessible.
C. reinhardtii peut être cultivée facilement soit en photo-autotrophie, mixotrophie

(avec lumière et acide organique) ou hétérotrophie (acides organiques seulement). Sa
reproduction asexuée et sexuée peut être contrôlée par une synchronisation de la privation
en nitrate (Harris, 1989). Le taux de dédoublement de l’algue verte peut être de 5 à 6 h
sous les conditions de laboratoire (Smith et al., 1990) et de 24 h sous les conditions
ambiantes de la culture en masse (Ben-Amotz et Avron, 1990). Les cultures Photo-
autotrophes peuvent atteindre facilement une densité de plus de 10 million de cellules par
millilitre.
Ces avantages font de cette microalgue un parfait candidat pour l'étude des
systèmes biologiques afin d'améliorer leurs critères biotechnologiques. Pour plus de 60
ans, C. reinhardtii existe comme un échantillon de laboratoire établie (Gutman et Niyogi,
2004; Harris, 2001; Pröschold et al., 2005)
11
3. Mécanisme de photosynthèse
La photosynthèse est un ensemble de processus bioénergétiques qui permet aux
organismes de fixer l’énergie lumineuse par des pigments photorécepteurs. La conversion
de l’énergie lumineuse en énergie chimique permet la transformation de carbone minéral
assimilé en matière organique. Ces réactions de transformation sont séparées en réactions
dépendantes de la lumière et réactions indépendantes de la lumière.
3.1. Transfert d’électrons dans la phase claire

Les réactions photochimiques de la phase claire permettent la transformation de
l’énergie lumineuse, captée par les pigments photosynthétiques, en énergie chimique
conservée dans l’ATP et le NADPH. Ces réactions sont assurées par un réseau
protéinique complexe qui constitue la chaine photosynthétique au niveau de la membrane
interne de thylakoïdes.
L’énergie lumineuse est capturée par deux systèmes protéiques

complexes localisés dans les thylacoïdes : le photosystème I et II notés PSI et PSII.
Chaque photosystème est composé d’une antenne collectrice de lumière et d’un centre
réactionnel (Figure 5). Les antennes collectrices, appelées encore LHCI et LHCII
respectivement pour le PSI et le PSII, captent la lumière par des pigments chlorophylliens
liées à des protéines de structure CAB (protéines liés à la chlorophylle a et b). Des
pigmentes accessoires, autres que les chlorophylles, participent également à la collecte de
l’énergie lumineuse à des longueurs d'ondes différentes. Cette énergie, sous forme de
quanta, est orientée vers le centre réactionnel P680 et P700, localisés respectivement dans le
Photosystème PII et PI. Le transfert d’électrons dans la chaîne photosynthétique se fait
par un réseau d’accepteurs et de donneurs d’électrons via un mécanisme
d’oxydoréduction (Figure 6). Ce transfert s’applique au deux photosystèmes, seule la
nature du donneur et de l’accepteur d’électrons est différente.
Au niveau de PII, les sous unités : D1 et D2 ainsi que le centre réactionnel P680
(contenant la phéophytine et la quinone) acceptent le quantum et deviennent en un état
excité. La pheophytine est réduite par la suite par le P680 et cède un électron à une
quinone A (QA) située sur la protéine D2 puis à une quinone B (QB) située sur la protéine
12
D1. Après la réduction de la pheophytine, le P680 accepte des électrons du résidu de

tyrosine (Yz) dans la sous unité D1. Cet électron est cédé par la réaction d’oxydation de
deux molécules d’eau catalysée par un complexe enzymatique générateur d’oxygène
nommé complexe Z, sur le côté lumen de la membrane thylakoidale. Cette réaction induit
la libération de quatre protons et une molécule diatomique d’oxygène. Ainsi, les quinones
réduites provoquent un transfert d’électrons dans la chaîne photosynthétique par une série
de réactions d’oxydoréductions suivant les potentiels croissants des différents accepteurs
et donneurs (phéophytine, QA, QB, PQ, Cyt b6/f, PC).
La plastocyanine joue le rôle de donneur pour le P700 dont l’excitation par

l’énergie de lumière captée par les chlorophylles réduit le P700 oxydé. L’électron excité
du P700 réduit la molécule de ferrédoxine; qui à son tour produit NADPH du NADP+ et du
H+ sur le stroma de la membrane thylacoïdale (Figure 6). Pendant que ces deux
réductions successives se produisent, un gradient électrochimique de protons, crée entre
le stroma et le lumen, génère l’énergie nécessaire à la synthèse d’ATP à partir de l’ADP
et Pi par ATP synthétases localisées dans la membrane thylacoïdale (Buchanan et al.,
2000).
Centre réactionnel
Antenne collectrices
Complexe producteur
d’oxygène
Figure 5: Composants du photosystème II.

L’association entre les protéines D1 et D2 forme le noyau du centre réactionnel et porte les
éléments fonctionnels P680 Pheo : phéophytine-quinones QA et QB.
13
Figure 6: Voie de transfert des électrons au sein de la membrane thylakoïdienne et

principales réactions réagissant le processus de la photosynthèse.
3.2. Réactions indépendantes de la lumière
Le cycle de Calvin (Figure 7) est un cycle métabolique prenant place dans le

stroma du chloroplaste. Il assure l’assimilation du CO2 en matière organique par
l’intermédiaire de l’énergie chimique produite durant la phase claire. Ce cycle comprend
treize réactions enzymatiques catalysées par 11 enzymes en présence de neuf ATP,
générés par ATP synthétase, et six NADPH, produits par le potentiel réducteur du
photosystème. L’enzyme clé du cycle est appelée Rubisco (Ribulose 1,5 bisphosphate
carboxylase/oxygénase) codée par le génome nucléaire et chloroplastique. Elle assure la
fixation du CO2 sous forme de 3-phosphoglycérate par une réaction de carboxylation en
présence de ribose 1,5 biphosphate (RuBP). L’enzyme Rubisco est de faible affinité au
CO2, et par suite la vitesse de réaction de carboxylation est très lente, environ trois fois
par seconde. Par contre, elle est connue comme la protéine la plus abondante dans le
chloroplaste et considérée la plus abondante sur la planète.
14
RUBISCO
CO2 + RuBP 2 glycérates 3-P
La conversion du CO2 en sucre est appelée le cycle de 3C (Buchanan et al., 2000).

C’est un cycle surgénérateur de RuBP. Les réactions de conversion aboutissent à la
formation de deux trios phosphate; le dihydroxyacétonephosphate (DHAP) et le
glycéraldéhydephosphate (GAP). Ces trios phosphate sont utilisés pour le renouvellement
du stock de RuBP et la synthèse de sucres dans le cytoplasme et l’amidon dans le
chloroplaste.
Figure 7: Réactions dépendantes de lumière et réactions de Calvin
15
4. L’azote chez les microalgues
Chez les microalgues, l’azote représente un élément nutritif d’une importance

vitale au niveau cellulaire, il entre dans la composition des molécules de structure,
enzymes, pigments photosynthétiques, acides nucléiques et molécules nécessaires à
l’expression génétique. Il intervient dans le maintien, la viabilité et la croissance de la
cellule phytoplanctonique. L’azote peut représenter un douzième de la masse de la cellule
(Charpin et Devaux, 1998).
4.1. Utilisation de l’azote par les microalgues

L’azote disponible dans le milieu passe par plusieurs étapes présentées dans la
figure 8, avant d’être assimilé par la cellule microalgale. La première étape est
l’absorption; c’est le passage des éléments nutritifs azotés du milieu extracellulaire au
milieu intracellulaire. Ce passage implique plusieurs systèmes de transport selon
l’élément nutritif azoté disponible et les besoins cellulaires. Au niveau intracellulaire, un
système de conversion de l’azote absorbé est activé afin de fournir la forme de l’azote
nécessaire à la biosynthèse des métabolites. L’ammonium est la seule forme d’azote
directement assimilable dans le pool d’acides aminés. La troisième étape consiste à
assimiler l’azote par la conversion en petits métabolites organiques. Et finalement, l’azote
est incorporé, de ces métabolites, au sein des macromolécules; protéines, pigments…
Ces étapes contribuent à la formation d’un flux unidimensionnel, dés l’absorption

initiale jusqu'à la synthèse des macromolécules. Mais, un autre processus du métabolisme
d’azote est impliqué, il s’agit du catabolisme intracellulaire qui permet la dégradation des
molécules biologiques contenant de l’azote (Charpin et Devaux, 1998).
16
Figure 8: Processus générale de l’utilisation de l’azote par les microalgues sans tenir
compte de la compartimentation cellulaire (Charpin et Devaux, 1998).
4.2. Voies de transport de l’azote
Malgré la complexité du système d’absorption de l’azote et sa régulation, des

études effectuées sur l’algue Chlamydomonas ont permit de déterminer les acteurs de ce
système. Chlamydomonas a développé plusieurs systèmes de transport qui sont
spécifiquement impliqués dans l’acquisition de l’azote sous ses formes minérales
(Grossman et Takahashi, 2001). Le génome de Chlamydomonas contient huit gènes de
transport d’ammonium (Amt1) (Gonzalez-Ballester et al., 2004) et 13 transporteurs de
nitrate/nitrite (un Nrt1, six Nrt2 et six Nar1) (Galván et al., 2002; Mariscal et al., 2006).
Ces systèmes de transport sont localisés au niveau de la membrane cytoplasmique et
chloroplastique de la cellule.
Le mécanisme général de transport de l’azote est rapporté dans la figure 9.

L’absorption de l’ammonium est assurée par une famille de transporteurs d’ammonium
AMT1 localisée dans les deux membranes cytoplasmique et chloroplastique (Gonzalez-
Ballester et al., 2004). Quatre systèmes de transport (SI-SVI), codés par Nrt2, ont été
identifiés comme étant des transporteurs de nitrate/nitrites dans la cellule avec une haute
affinité mais une spécificité et une régulation différente entre les ions. Une troisième
17
famille de gènes de transporteurs, Nar1, code pour des protéines de transport de nitrite et
de bicarbonate, quelques-uns sont des transporteurs plastidiques régulés par le flux du
carbone et d’azote (Rexach et al., 2000; Galván et Fernandez, 2001; Galván et al., 2002;
Mariscal et al., 2006).
Figure 9: Schéma des composants de voie de l’assimilation de l’ammonium et de

nitrate chez la Chlamydomonas.
4.3. Conversion de l’azote
L’ammonium est la seule forme d’azote capable d’être incorporée dans le

squelette carbonique au niveau du chloroplaste. L’assimilation de nitrate et de nitrite
nécessite une étape de conversion et le processus inclue deux étapes de réduction
(Fernández et Galván, 2008). La première est localisée dans le cytoplasme est assure la
réduction de nitrate en nitrite, réaction catalysée par le nitrate réductase et nécessite une
molécule de pouvoir réducteur. La deuxième réaction réduit le nitrite en ammonium dans
le chloroplaste en présence de nitrite réductase et couplée avec le transfert d’électrons de
la ferrédoxine. Par contre, l’ammonium est directement assimilé dans le pool de synthèse
des protéines.
18
NADPH + H+ NADP+
NO3- NO2- + H2O

Nitrate réductase
6 Fdred 6 Fdox
NO2- NH4+ + 2 H2O

Nitrite réductase
4.4. Voies enzymatiques d’assimilation

L’ammonium, soit transporté directement dans la cellule ou généré par l’action de
la réduction de nitrite/ nitrate, entre dans le métabolite par la voie de glutamate synthétase
(GS)/ glutamine-2-oxoglutarate aminotransferase (GOGAT) (Crawford, 1995; Daniel-
Vedele et al., 1998). Le fonctionnement de ces enzymes est assuré par les formes réduites
de coenzymes spécifiques et de l’énergie sous forme d’ATP. La glutamine est le produit
final de ces réactions enzymatiques et aussi la base des autres formes d’acides aminés
synthétisés par la réaction de transamination. Deux isoformes de GS sont connues, GS1
et GS2, localisées respectivement dans le compartiment cytosolique et chloroplastique.
Cependant, plusieurs espèces de microalgues ne contiennent que l’un des deux enzymes.
4.5. Mécanismes d’adaptation aux conditions de limitation d’azote

Malgré que la microalgue Chlamydomonas n’ait pas une structure complexe
comme les plantes, elle a une flexibilité remarquable lui permettant de s’adapter aux
conditions extrêmes de l'environnement. Beaucoup de réponses de Chlamydomonas aux
conditions limitantes des éléments nutritifs, comme l’azote, sont semblables à celles
connues chez les autres microorganismes du sol et les plantes vasculaires. Tous les
organismes exigent une source abondante d'azote pour la synthèse de protéines et
d’acides nucléiques. L'azote souvent limite la croissance de l’organisme dans des
différents écosystèmes; c'est particulièrement vrai pour certains environnements marins
(Flynn, 1991). Quelques organismes, tel que les cyanobactéries, ont développé la capacité
de réduire l'azote atmosphérique sous conditions où l'azote de milieu est limité (Golden et
19
Yoon, 1998; Wolk, 1996). Les plantes légumineuses peuvent former une association avec
les bactéries Rhizobium qui permet la différenciation de racines en nodules; des
structures spécialisées pour la fixation de l'azote atmosphérique (Oke et Long, 1999). Par
contre, Chlamydomonas ne peut pas fixer l’azote atmosphérique. Ainsi, elle a développé
plusieurs mécanismes qui lui permettent d’assimiler plusieurs sources d'azote, bien que sa
source d’azote préférée soit l'ammonium (Florencio et Vega, 1983).
4.5.1. Régulation de l’assimilation de l’azote sous sa forme minérale
• Régulation du transport de l’ammonium

La Chlamydomonas paraît avoir deux systèmes de transporteurs d'ammonium
(Franco et al., 1988) ; le premier système se caractérise par une faible affinité pour
l’ammonium avec un taux maximum de transport. Par contre le deuxième se caractérise
par une haute affinité pour l’ammonium avec une faible activité de transport. Le
fonctionnement des deux systèmes est régulé selon la disponibilité de l’ammonium dans
le milieu extracellulaire. Le système de faible affinité fonctionne sous des conditions de
suffisance d’azote pendant que le fonctionnement du système de haute affinité devient
important quand la concentration d'ammonium dans l'environnement devient limitée.
• Régulation du transport de nitrate et de nitrite

L’ammonium est le régulateur clé qui contrôle l’expression des gènes codant pour
le nitrate/nitrite transport; NR et NiR. Cependant, il existe d’autres événements de
régulation post-transcription qui contrôle aussi l’assimilation de nitrate/nitrite. La
présence de l’ammonium réprime rapidement l’absorption de nitrate et de nitrite par la
cellule Chlamydomonas (Florencio et Vega 1982; Galván et al., 1996). Elle provoque la
diminution rapide de l’activité de l’enzyme NR (Florencio et Vega, 1982) et une
inhibition de la synthèse in novo (Fernández et Cárdenas, 1989).
20
4.5.2. Régulation de l’assimilation des formes organiques de l’azote
Outre l’assimilation facile de l’ammonium, nitrate et nitrite, la Chlamydomonas

synthétise des systèmes de transport qui facilite l’importation efficace des besoins
cellulaires en nutriments et l’induction des enzymes hydrolytiques permettant l'accès de
la cellule à des sources alternatives de l’élément nutritif limitant. Quelques enzymes
hydrolytiques, induites pendant la limitation de l’élément nutritif, sont exportés à travers
la membrane du plasma et associés avec la paroi cellulaire. Ces enzymes facilitent la
génération des molécules d’azote assimilable par la cellule, à partir des grandes
macromolécules organique qui ne sont pas métabolisés facilement comme l’urée, les
acides aminés et quelques bases azotées. Les purines (l'adénine et la guanine),
l’hypoxanthine, la xanthine et l’urate peuvent maintenir la croissance de Chlamydomonas
en absence d’autres sources d’azote (Pineda et Cárdenas, 1996). Les systèmes impliqués
dans le transport de ces bases azotées dans les cellules sont réprimés en présence
d'ammonium (Pineda et Cárdenas, 1996). La Chlamydomonas possède aussi des
transporteurs spécifiques pour l’urée et l’arginine. Le transport de l’arginine est induit
quand les cellules sont privées d'azote et réprimées par la présence d’ammonium (Kirk et
Kirk; 1978). Chlamydomonas synthétise également une L-acide aminée oxydase
extracellulaire comme une réponse à la limitation de l'azote (Vallon et al., 1993), cette
enzyme catalyse le déamination d'acides aminés et la libération de l’ammoniac.
4.5.3. Effet sur la division cellulaire
La mobilisation des réserves interne et externe d’un élément nutritif essentiel et

l’adaptation de la machinerie métabolique de la cellule aux conditions de la limitation ne
permet pas la cellule de croitre pendant une longue période. Cependant, les modifications
métaboliques de la cellule peuvent être essentielles pour préparer la cellule à atteindre un
état où la croissance et la division cellulaire est bloqué (Davies et al., 1996) et
l’organisme entre en une phase dormant ou semi dormant qui étend sa capacité à survivre
dans des conditions défavorables.
La limitation en nutriment est connue comme un facteur qui empêche la

progression de cycle cellulaire. Le mécanisme qui contrôle le cycle cellulaire est
21
fortement conservé. Il ya deux processus distinct qui contrôle la progression de cycle

cellulaire en réponse de niveau de carbone, azote et sulfure dans l’environnement. Un de
ces processus est la voie de AMPc dépendent protéine Kinase et l’autre c’est la protéine
kinase d’activation de mitogène. De plus, le cycle cellulaire peut être contrôlé par des
régulateurs spécifiques impliqué dans l’acclimatation de cellule à la limitation de
phosphore.
Dans une condition de suffisance de nutriment, le niveau d’AMPc est fort et la

division cellulaire est normale. Quand le niveau de nutriment diminue, la concentration
cellulaire de l’AMPc chute et la division cellulaire s’arrête (Eraso et Gancedo, 1985). La
synthèse de l’AMPc dépend de l’enzyme adenylate cyclase, quant aux
phosphodiesterases est responsable à sa dégradation. Les mutations au niveau de voie de
AMPc-dépendent protéine, où le phosphodiesterases ne peut pas réguler le taux de
AMPc, induit une division cellulaire durant la limitation de l’azote jusqu'à la mort par
épuisement (Wilson et Tatchell, 1988).
4.5.4. Effet sur la photosynthèse et pigments chlorophylliens
La diminution de l’activité photosynthétique est un effet caractéristique de la

réponse générale de limitation de nutriment chez les Chlamydomonas (Peltier et Schmidt,
1991; Wykoff et al., 1998, Davies et al., 1996). Chez les microalgues, la limitation en
azote affecte la photosynthèse par la réduction de l'efficacité de collection d'énergie,
causé par la perte de Chlorophylle a et l'augmentation l'activation non photochimique de
pigments caroténoïdes (Herzig et Falkowski, 1989). Elle affecte aussi directement la
conversion de l'énergie photochimique à cause de la diminution de la synthèse de
protéines qui semble avoir un grand effet sur les protéines de chloroplaste (comme les
protéines de centre réactionnelle PSII et PSI) que sur les protéines de cytoplasme (Herzig
et Falkowski, 1989).
22
• Perte de chlorophylle
La limitation en azote cause des changements considérables dans la composition

chlorophyllienne et l’activité photosynthétique de Chlamydomonas (Plumley et Schmidt,
1989). Elle provoque la diminution des composants photosynthétique dans les
thylakoïdes, comme le LCHI, le LCHII et le complexe cytochrome b6/f. La réduction des
pigments chlorophylliens est fréquemment accompagnée par une altération dans la
capacité photosynthétique et l’énergie de transduction des cellules. Un des effets néfaste
de limitation de l'azote est la décoloration apparente des cellules associées à la perte des
pigments et des protéines collecteurs de la lumière (Plumley et Schmidt, 1989).
• Perte de photosystème PSI et PSII
Le transport de l’électron photosynthétique décline quand le Chlamydomonas est

privée d'azote. De plus, l’exposition prolongé à ce stress azoté diminue le taux
d’évolution de dioxygène (Peltier et Schmidt 1991), bien que la plus part de cette
réduction est due à la perte du complexe cytochrome b6f. En outre, les cellules de
Chlamydomonas en limitation d’azote ont tendance à être dans l’état 2, ce qui provoque
la réduction de taux du rapport entre l’activité de photosystème PII et celle du
photosystème PI aux niveaux de sursaturation de lumière (Berges et al. 1996). Durant la
limitation en azote, les algues se caractérisent par une chute de nombre de centre
réactionnel de photosystème II de 50 à 60% par cellules (Herzig et Falkowski, 1989;
Plumley et Schmidt, 1989; Berges et al., 1996). C’est une réduction élevé par apport à
celle observé chez les Chlamydomonas en limitation de soufre ou de phosphate.
Généralement, la limitation en azote affecte les deux photosystèmes de façon

différents (Kolber et al., 1988). Mais, les PSII semblent être fortement affecté par
l’épuisement de l’azote, mais pas des effets apparents sur le PSI. Une perte de centre
réaction PSII durant une limitation en azote en mode chemostat traduit une dégradation
sélective de PSII chez les cyanobactérie (Kolber et al., 1988). Par contre, Rhiel et ces
collaborateurs (1986) ont trouvés une perte de PSI chez le Cryptonzonas maculata, et
Plumley et ces collaborateurs (1989) n’ont pas trouvé de changement de protéine associé
23
à la PSI chez la Chlamydomonas sp en limitation d’azote, mais une diminution de 65%

dans certain protéines de PSII. La raison pour laquelle les effets de limitation de l’azote
est fortement sélectif sur le PSII est probablement due à la rapidité de l’utilisation de D1
et D2, comparé à la stabilité des protéines de PSI (Plumley et al., 1989).
4.5.5. Effet sur l’activité non photochimique
L’appareil photosynthétique chez les cellules en limitation d’azote est saturé à des
intensités de lumière inférieure par apport aux cellules non-limité en azote. Si le niveau
de lumière est en excès à la capacité photosynthétique des cellules en limitation d’azote,
il est, par contre, faible pour la cellule en suffisance nutritionnelle. De ce fait, les cellules
en NL doit dissiper beaucoup d'énergie sous forme de chaleur. Cette dissipation est
assurée par un processus mesuré comme le non-photochimique Quenching de
fluorescence de chlorophylle (NPQ) et par l’intermédiaire de caroténoïde, Zeaxanthine et
l'antheraxanthine (Dermmig-Adams et Adams, 1992). Ainsi, ces pigments
photosynthétiques, en outre leur rôle dans la collection de l’énergie de lumière, elles
participent dans les réactions redox (Tracewell et al., 2001; Frank et Brudvig, 2004), la
protection de l’organisme de photodomage (Formaggio et al., 2001; Baroli et al., 2003),
et la dissipation de l’excès de l’énergie lumineuse par l’interaction avec des molécules de
chlorophylle excités.
4.5.6. Effet sur la respiration
Les cellules en limitation d’azote montrent une diminution significative de taux

de respiration. Cette diminution semble être due au faible niveau de ADP; un substrat
nécessaire pour la glycolyse et la phosphorylation oxydative. Cette accumulation d’ADP
est due au blocage de processus anaérobie, l’arrêt de la division cellulaire, et le recyclage
lent de l’ATP accumulé (Gauthier et Trupin, 1994). La réduction de la concentration
d’ADP provoque la diminution de taux de glycolyse et de la phosphorylation oxydative,
car les réactions catalysé par le pyruvate kinase PK (Theodorus et al., 1991) et l’ATP
synthétases sont inhibées.
24
4.5.7. Effet de limitation de l’azote sur les réserves carbonées

• Protéines
En présence d’un stress nutritif, les voies métaboliques des protéines sont régulées
afin de maintenir les processus vital de la cellule. Généralement, la carence en azote
provoque une diminution de taux de protéines dans la cellule. Cette diminution est due à
l’augmentation de la dégradation de protéines et la diminution de taux de synthèse.
Les cellules en limitation d’azote dégradent la plus part de ses protéines les plus
abondant comme le Rubisco (Plumley et Schmidt, 1989), les protéines ribosomale
(Siersma et Chiang, 1971) et les apoprotéines de LHC dans le thylakoides. La
dégradation de ces protéines abondantes permet la cellule de recycler les acides aminés
en protéines plus approprié pour survivre dans la condition d'épuisement d'azote. Les
acides aminés recyclés peuvent être incorporé dans des enzymes et des transporteurs qui
permettent la cellule d'utiliser d'autre source alternative d’azote dans l'environnement.
De plus, dans ces conditions de carence en azote, la synthèse des protéines est régulée de
façon qualitative et quantitative. Bien que le taux absolu de synthèse de protéines est
réduit chez les cellules en limitation d’azote, la présence des protéines solubles de façon
plus abondantes par apport aux cellules témoin (en suffisance d’azote) indique une
orientation vers la synthèse des protéines membranaire comme PsbA, PsaA de façon
abondant. Par contre, la synthèse des protéines de LHCI et LHCII (Mans et Novelli,
1961) et les polypeptides est réduit. Expérimentalement, un effet visible de limitation
d’azote chez le Chlamydomonas est la réduction de 80% dans apoprotéines LHCII,
pendant que les protéines telles que RbuPCase et ATP synthétase sont réduit à 40%
seulement (Plumley et Schmidt, 1989). Ces données supportent le concept que l'appareil
photosynthétique est flexible et que l’azote fonctionne comme un stimulateur de
régulation pour l'accumulation de protéines chloroplastique.
• Sucres totaux (Carbohydrate) et amidon

La croissance dans un milieu en limitation d’azote accumule chez la
Chlamydomonas un polysaccharide de fort ressemblance structurelle à l’amidon du
25
stockage de l'endosperme du maïs (Maddelein et al., 1994). L’accumulation des sucres

sous forme d’amidon est une réponse de stress nutritif induit par la limitation d’azote
(Ball, 1998).
Chez le Chlamydomonas reinhardtii, l’amidon temporaire comme les

polysaccharides est synthétisé pendant la phase logarithmique (Libessart et al., 1995),
tant que la synthèse des réserves d’amidon nécessite le blocage de la division cellulaire
comme celle rencontré sous la limitation d’azote (Figure 11). L’amidon des plantes est
stocké soit dans le chloroplaste durant la photosynthèse (amidon photosynthétique) ou
dans l’amyloplaste des organites de stockage non photosynthétique (amidon de réserve)
(Preiss et Sivak 1996). Par contre, l’accumulation de l’amidon photosynthétique est
considérablement différente de celle de l’amidon de réserve. De plus, la synthèse de
réserve d’amidon nécessite une fonction additionnelle codé par le produit des gènes
spécifiques, qui ne sont pas impliqué dans la synthèse de l’amidon au cours de croissance
(Libessart et al., 1995). Les études de Van den Koornhuyse et al, (1996) ont monté que,
contrairement aux autres polymères biologiques comme les protéines ou les acides
nucléiques, les réserves de polysaccharides ont une large variation dans la structure à
travers le contrôle de substrat la provision.
Figure 10 : Accumulation de l’amidon et le lipide dans la cellule de Chlamydomonas

reinhardtii dans une condition de limitation d’azote. (A) dans les conditions normale (B)
en limitation d’azote. (Libessart et al., 1995).
26
• Lipides
Généralement, l’épuisement des nutriments dans le milieu, comme l’azote, induit

l’accumulation de lipide chez les microalgues. Malgré la carence en éléments nutritif, un
excès de carbone (sous de forme de glucose) est toujours assimilable par la cellule et
converti en triglycérole (TAG), pendant que le lipide est synthétisé pendant la phase de
balance de croissance à presque le même taux (Meng et al., 2009). Le taux
d’accumulation de lipide est différent selon l’espèce et le degré de limitation en azote.
La limitation en azote provoque une diminution de la croissance cellulaire et

l’arrêt de la division cellulaire, et par conséquence le lipide formé est stocké et accumulé
dans les cellules existantes qui ne peuvent plus se diviser. Des enzymes critiques de
régulation, y compris l’enzyme du malate et l’ATP lyase du citrate (ACL), ont des effets
de suraccumulation de lipide. Il y a une forte corrélation entre la présence d'activité ACL
et la capacité d’accumulation du lipide chez les microorganismes oléagineux (Ratledge,
2002).
La composition lipidique chez le Chlamydomonas est unique par apport aux
plantes supérieures. La membrane lipidique majeure de cette algue et les lipides betaines
diacylglyceryltrimethylhomoserine (DGTS). Les effets de limitation de nutriment sur la
composition de lipides et les acides gras ont montré qu'ils provoquent une altération dans
la composition des acides gras de lipides chloroplastiques PG et MGDG. De plus, le
caractère de croissance a montré un impacte significatif sur les profile des acides gras de
Chlamydomonas. Par exemple, lorsque cette dernière est cultivé à 20°C, la concentration
de PUFA diminue progressivement si les conditions de la culture change de
photoautotrophe via mixotrophe au hétérotrophe.
4.5.8. Effet sur la gamétogenèse
Dans un milieu épuisé d’azote, la croissance cellulaire de microalgues

Chlamydomonas s’annule et s’accompagne d’une adaptation métabolique à la faible
quantité de l’azote et une différentiation à un gamète (Quarmby, 1994). L’initiation de la
différenciation est traduite par la synthèse des composants spécifiques de paroi cellulaire
27
comme une réponse à la limitation d’azote (Rodriguez et al. 1999). Il paraît qu’un ou plus
des changements qui facilitent la survie pendant la carence de l'azote, est adopté comme
un signal pour le programme de différenciation gamétique. La différentiation en gamète
provoque un changement dans le comportement cellulaire ainsi que son état
physiologique. L’activité gamétique se caractérise par une motilité rapide de la cellule,
une agglutination et une diminution de la taille cellulaire.
Les gamètes mûrs peuvent revenir à l'état végétatif par l’addition d'azote. Le
faible taux d’azote entraine la formation des pré-gamètes, des cellules compétentes
capables de répondre à la lumière bleue comme une seconde signal indépendant et
extérieur pour la transition à des gamètes mûres. La capacité à répondre au signal de la
lumière bleu est atteinte seulement après cinq heures de limitation continu d’azote. Si les
cellules sont exposées à la lumière, la gamétogenèse est habituellement terminée dix
heures après le transfert à un milieu d’azote libre.
Les gamètes sont métaboliquement adaptée à survivre pendant des périodes
prolongées en carence d'azote et ils sont des cellules sexuellement compétentes pour
former des zygotes spécialisé pour subir des conditions de l'environnement sévères.
Quand les conditions deviennent plus favorables pour la croissance, les zygotes germent
en cellules végétatives haploïde.
5. Systèmes de culture des microalgues

Les microalgues peuvent croitre dans un système de culture ouvert ou fermé. Les
premiers essais de production de micraolgues ont été en Allemagne pendant la deuxième
guerre mondiale à des fins alimentaires. La production commerciale a commencé en 1970
en Europe, l’Amérique et le Japon. Elle a permis de développer ce secteur au niveau des
systèmes de culture et la nature des produits finaux.
5.1. Système de culture ouvert

La production de microalgues dans des systèmes ouverts a été largement étudiée
ces dernières années (Boussiba et al., 1988; Tredici et Materassi, 1992; Hase et al.,
2000). Elle peut être effectuée dans des milieux naturels, comme les lacs et les étangs, ou
28
dans des bassins artificiels. Les systèmes les plus employés incluent les grands étangs de
faible profondeur, les réservoirs et les bassins en ˝Raceways˝ (Figures 12).
Ce système de culture est considéré le moins coûteux par apport aux autres
systèmes soit dans la construction ou la gestion. Mais malgré que leur coûts soient
compétitifs, des obstacles majeurs limitent leur développement. La productivité de
système est très faible ce qui nécessite une grande surface de culture et un grand volume
d’eau afin de récompenser la perte d’eau par évaporation. De plus, les risques de
contamination par des prédateurs et d’autres organismes hétérotrophes limitent la
production commerciale à des organismes qui résistent aux conditions extrêmes de
culture.
Figure 11: Bassin en ˝Raceways˝ pour la production de spiruline dans la ferme de

spiruline à El Alia, Tunisie.
29
5.2. Système de culture clos
Les photobioréacteurs clos ont attiré beaucoup d’attention car ils permettent un
meilleur contrôle des conditions de culture que les systèmes ouverts. Plusieurs réacteurs
de forme géométrique et de volume variables ont été développés soit à l’échelle de
laboratoire ou industrielle. Ce nouveau concept a permis d’augmenter la productivité en
biomasse et éviter les risques de contamination.
5.2.1. Photobioréacteurs
Le photobioréacteur est un système clos qui permet de contrôler les interactions

biologiques en maîtrisant les conditions de culture. Ce système assure la production de la
biomasse végétative par le mécanisme photosynthétique de l’organisme cultivé en
utilisant la lumière comme source d’énergie. Les différents paramètres de croissance
dans le réacteur sont contrôlés et le substrat nécessaire pour la croissance de l’organisme
est fourni en quantité suffisante. Ces systèmes clos sont apparus depuis les années 40, et
dés les années 80, plusieurs études ont été réalisées sur des photobioréacteurs de forme
géométrique diverses comme les réacteurs plats en verre (Zou et Richmond, 1999), les
photobioréacteurs cylindriques clos en verre ou en tuyauterie acrylique, (Molina-Grima et
al., 1999 ; Molina-Grima et al., 2000).
5.2.2. Technologie de photobioréacteur
Plusieurs prototypes de photbioréacteur sont récemment développés pour

satisfaire les besoins industriels et surmonter les complications de culture. La plus part
des solutions sont dirigées vers le système d’agitation et la forme du réacteur.
30
• Différents formes géométriques de photobioréacteur
On peut identifier deux formes majeures de photobioréacteur ; les formes plates et

les formes cylindriques. La forme du réacteur a une relation étroite avec la conception de
la distribution de lumière et le taux de productivité à atteindre.
Les photobioréacteurs plats sont composés de deux panneaux parallèles et

transparents de surface variable qui dépasse rarement le mètre carré. La distance entre les
deux panneaux détermine l’épaisseur de la culture qui n’excède pas quelques centimètres.
Généralement, ce réacteur est de faible volume et destiné pour un usage de laboratoire
(Richmond et Cheng-Wu 2001; Ogbonna, 2003). Cependant des volumes plus importants
peuvent être composés de plusieurs unités de culture rangées verticalement et connectées
entre elles par un réseau de conduites équipé de pompes (Tredici et Materassi, 1992). A
l’échelle industrielle, ce réacteur utilise efficacement l’énergie de lumière mais nécessite
un espace très important. Par exemple, il existe un réacteur commercialisé par la société
B. Braun Biotech Int. (Tredici, 1999) et composé de 46 unités, de 6 m3 de volume et
occupe une surface de 100 m² (avec un rapport de surface sur volume de 60 m-1).
Les photobioréateurs cylindriques sont constitués de tubes transparents (en verre
ou en plastique), droits et alignés. La conception de ce réacteur est facile à
redimensionner vers des volumes de l’ordre de quelques litres, employés dans les
laboratoires (Sahle Demessie et al., 2003), à plusieurs centaines de litres (Tsygankov,
2001). Par contre, le diamètre des tubes reste limité pour permettre une pénétration
optimale de la lumière dans tout le volume de culture. La disposition et le diamètre des
tubes varient selon l’usage. Pour l’écloserie, on utilise généralement des colonnes de type
Scobalit de 2 m d’hauteur pour 30 à 50 cm de diamètre (Figure 13). D’autres
photobioréacteurs se composent d’une succession de rangées des tubes, disposés de
manière horizontale, verticale ou enroulés en hélice.
31
Figure 12: Photobioréacteurs de type colonne Scobalit utilisé en écloserie.
• La lumière et le photobioréacteur
Le système de culture algale peut être éclairé par une lumière artificielle ou par la lumière
du soleil. Généralement, les réacteurs à l’échelle de laboratoire utilisent la lumière
artificielle comme les lampes fluorescentes ou autres distributeurs de lumière. Par contre,
à l’échelle industrielle, on exploite la lumière naturelle pour des systèmes de grande
surface, comme les bassins ouverts et les réacteurs de forme plate ou tubulaire.
La disponibilité de la lumière dépend de la concentration de la culture et

représente le facteur le plus limitant dans la croissance cellulaire. Au sein d’un
photobioréacteur il faut distinguer entre; d’une part, la quantité et la qualité de lumière
émises par le dispositif d’éclairage, et d’autre part, la quantité et la qualité de la lumière
réellement disponible pour les cellules après les pertes par l’absorption et la diffusion qui
ont lieu en traversant la paroi du réacteur.L’intensité de la lumière incidente en surface du
réacteur est estimée par une valeur moyenne sur toute la surface. Cette valeur nous
permet d’avoir une idée sur l’état de la culture en corrélant la lumière reçue à la réponse
photosynthétique de l’espèce cultivée. Elle donne une estimation sur la productivité du
système, et la présence de phénomène de photo-limitation ou photo-inhibition.
32
6. Cinétique de croissance
La cinétique de croissance permet de suivre la population (densité de population

N) ou la biomasse en fonction de temps. Les premières études sur la croissance des
microorganismes sont effectuées par le bactériologiste anglais Ward en 1895. Elles ont
permis de déterminer le concept de temps de génération; c’est le temps mis par la
population pour doubler sa biomasse. Il a éventuellement identifié les deux groupes de
facteurs qui influent sur le temps de génération; les facteurs interne (âge, viabilité,
pouvoir de germination...) et les facteurs externes (température, luminosité, éléments
nutritifs…).
6.1. croissance en batch des algues; ou encore culture en bloom
Dans le sens général, c’es un système de culture clos où les cellules croient dans
un volume de milieu de culture et de nutriments fixé dans des conditions
environnementale spécifiques. C’est le système le plus utilisé dans l’industrie. Il est facile
à mettre en œuvre et limite les risques de contamination, puisque le système reste isolé
pendant la période de production. Au dessus d’une certaine densité le système est arrêté
et récolté avant l’épuisement de tout le nutriment dans le milieu.
Dans un système de production en batch, la cinétique de croissance des microalgues suit

une courbe en S, scindée en quatre phase distinctes (Figure 15):
- Phase de latence : c’est la phase d’adaptation aux nouvelles conditions de culture,

pendant laquelle il n’y a pas de croissance cellulaire. Plusieurs paramètres
peuvent influencer sur la duré de cette phase ce qui la rend la phase la plus lourde
aux niveaux industriel. L’état physiologique de la cellule, la concentration de
l’inoculum et les différences entre les conditions d’incubation et celle du réacteur
sont les plus importants facteurs qui conditionnent cette phase. De plus, dans le
cas des microorganismes photosynthétiques, l’inoculation d’une culture
concentrée dans un milieu très dilué provoque l’augmentation brusque de la
quantité de la lumière dans le milieu. Cela peut provoquer des dommages au
niveau de l’appareil photosynthétique de la cellule.
33
- Phase de croissance : c’est la phase de la division cellulaire active après

l’adaptation aux nouvelles conditions de culture. Cette phase est composée de
deux parties. La première partie correspond à une croissance exponentielle
pendant laquelle le temps de génération est minimal et constant. La deuxième
partie se caractérise par une diminution progressive de la croissance cellulaire due
à une limitation par un des facteurs de croissance dans le milieu. Pendant cette
phase, la vitesse de croissance chute progressivement.
- La phase stationnaire: pendant cette phase la croissance cellulaire est nulle et se
traduit par une concentration cellulaire constante. Cette stabilité est le résultat
d’un équilibre entre la division cellulaire et la mortalité des cellules. La duré de
cette phase est liée à la nature du microorganisme, mais dans un système continu,
elle est maintenue théoriquement indéfiniment.
- Phase de mortalité cellulaire : l’épuisement du milieu de culture en nutriments

entraine la mort des cellules ce qui provoque une dégradation des condition du
milieu jusqu'à la mort totale de la population.
A l’échelle industrielle, les deux dernières phases de croissance ne sont jamais atteints,
car elles diminuent la productivité du système et la qualité du produit final.
Figure 13: Différentes phases de croissance chez les microorganismes
34
6.2. Dynamique de croissance en mode de culture continu
C’est un système de culture qui consiste à maintenir les cellules dans un

environnement stable, où la concentration du substrat limitant et la biomasse sont
maintenues constantes par l’ajustement d’un débit d’alimentation. L’excès de milieu
réactionnel (biomasse) est soutiré à travers un système de trop plein. Notamment, ce
système permet une productivité en biomasse plus élevée qu’en discontinu ou semi
continu. De plus, il réduit la main d’œuvre nécessaire pour la culture et assure un contrôle
pertinent de la cinétique de production dans le réacteur.
Les bilans de biomasse (X), de nutriment (S) et de produit (P) s’écrivent :
< > =
=< > −
Dans un régime stationnaire: = ( − )

=− + ( − )
=
= +
Avec,
• <µ> Le taux de croissance moyen dans l’enceinte de culture (en j-1),

• D Le taux de renouvellement ou de dilution (en j-1)
• ρ L’absorption en nutriment (mol.cel-1.j-1),
• Si Le substrat en entrée (mol.l-1).
• Sr Le substrat résiduel (mol.l-1).
Deux modes de culture en continu peuvent être appliqués :
6.2.1. Mode Chemostat

Le mode chemostat est un mode particulier de fonctionnement continue. Le taux
de renouvellement de milieu est imposé par l’opérateur en jouant sur le débit
d’alimentation par une pompe. Une fois l’équilibre de la culture est atteint, la
concentration de la biomasse dans le réacteur reste stable. La fixation des autres
paramètres expérimentaux de culture (la température, le pH, l’irradiation...) maintient la
35
stabilité de la culture. Par contre, un risque de lessivage peut survenu si le taux de

dilution est très élevé par apport au temps de division cellulaire. La biomasse chute
progressivement jusqu’elle s’annule dans le réacteur.
6.2.2. Mode Turbidostat

Dans ce mode de culture, le débit d’alimentation est modifié jusqu'à atteindre une
valeur de concentration cellulaire préalablement choisie. Un capteur de turbidité
(photodiode) sensible à la longueur d’onde de 680 nm (maximum d’absorption de la
chlorophylle a) permet de déterminer la turbidité et d’envoyer le signale à un automate
pour réguler le débit d’alimentation de milieu de culture. Dés que le signal dépasse la
consigne fixé, la culture est diluée ; le taux de dilution est ainsi ajusté. Par contre, les
autres paramètres de culture restent invariables. Il faut noter qu’un risque de lessivage
peut apparaitre si on fixe une concentration à atteindre trop faible.
Dans les deux modes de culture, si l’état stationnaire est atteint, le taux de
croissance spécifique de la culture est égal aux taux de renouvellement. Ainsi, le taux de
croissance spécifique moyen peut être déterminé par le volume total du photobioréacteur
et le débit de la récolte :
Vrecolté/∆t récolté
< >=
Vphotobioréacteur
6.3. Régime de fonctionnement de système en mode continue fixés par les conditions de
la lumière
Un système de culture en continue permet d’avoir une productivité stable au cours

de temps. La productivité maximale est obtenue lorsque le taux de dilution de système est
de même ordre du vitesse de croissance cellulaire. De part et d’autre de cette valeur, la
productivité diminue. Or, chez les organismes photosynthétiques, la croissance cellulaire
est fortement liée à la quantité de lumière disponible pour la cellule dans le réacteur.
Pourtant, la distribution de la lumière en photobioréacteur n’est pas homogène en
fonction de la profondeur due à la perte par absorption et diffusion. De ce fait,
36
l’irradiation
’irradiation disponible dans le réacteur est atténuée de façon exponentielle
exponentielle en fonction de
la profondeur de culture créant ainsi une couche de culture fortement exposé à la lumière,
ce qui provoque le phénomène de photo
photo-inhibition,
inhibition, et un compartiment de culture
faiblement éclairé produit un phénomène de photo-limitation
photo n en lumière. La limite entre
ces deux couches correspond à la fraction volumique éclairé de photobioréacteur est
notée par le terme γ. Selon l’intensité de lumière dans le réacteur, on peut distinguer trois
cas. Pour une intensité de lumière faible, la totalité
totalité de flux lumineux est absorbé au
surface de réacteur par les pigments cellulaire, ce qui correspond à une limitation
physique de la lumière (γ<1).
<1). Par contre, une forte intensité de lumière induit un excès de
lumière dans le réacteur qui sera transmis
transmi ; c’est le régime cinétique (γ>1).
γ>1). Entre ce deux
cas, un troisième cas est plus spécifique, il correspond à un réacteur entièrement éclairé
par une quantité de lumière optimale et correspond à la croissance photosynthétique
maximale (Cornet, 2007). Génér
Généralement,
alement, c’est le cas qui correspond à la productivité
maximum de système (γ=1).
=1).
Figure 14 : Relation entre la productivité de système continu et la disponibilité de lumière

dans un photobioréacteur torique.
37
MATERIELS
&
METHODES
Matériels et méthodes
1. Maquette d’étude : le photobioréacteur torique
Les expérimentations sont réalisées dans un photobioréacteur torique développé

au laboratoire GEPEA (Fouchard, 2006; Fouchard et al., 2008). Ce photobioréacteur
permet de mieux contrôler les paramètres de croissance et facilite le suivi de la culture au
cours de temps. Il est équipé de sondes de détection des paramètres physicochimiques
(température, pH, …) avec un système de régulation automatique piloté par ordinateurs.
1.1. Description générale
Le réacteur est fabriqué en polyméthyle méthacrylate (PMMA). Ce matériau

présente l’avantage d’être transparent et non toxique pour les microorganismes. Le
volume de culture dans le réacteur est de 1,3 litre. L’épaisseur des parois est de 3 cm. La
faible épaisseur réduit le phénomène de photolimitation, et permet de maitriser la
distribution de la lumière au sein de photobioréacteur.
1.2. Composantes du photobioréacteur
La maquette est constituée de plusieurs composantes représentées dans la figure 17.
38
C
B
Figure 15 : le photobioréacteur torique. A : vue en trois dimensions. B : vue face avant.

D : vue face arrière.
(1) moteur d’agitation, (2). Sonde de pH, (3). Sonde de température, (4). Corps du
réacteur torique, (5). Hélice marine à trois pales, (6). La culture, (7). Injection de gaz,
(8). Vidange, (9). Regard, (10). Vis de fixation(11). Socle, (12). Ventilateur, (1 3).
Capot, (14). Plaque métallique, (15). Ailette en aluminium. (Dessins : Raouf
Boukachatta, Technicien Supérieur en Génie Mécanique)
39
1.2.1. Système d’éclairage
La source lumineuse du système est composée d’une série de diodes fluorescentes

assemblées sur un support mobile et parallèle au photobioréacteur (figure 18). Les diodes
émettent une lumière blanche à des longueurs d’ondes comprises entre 400 et 700 nm,
correspondant à la gamme de radiation active (PAR ou photosyntetically active radiation)
pour la photosynthèse des microalgues. L’intensité de la lumière incidente est régulée par
la tension électrique d’un générateur, de type IT 6832 32 V 6A, délivrant une puissance
maximale de 192W, et par la distance entre la source de lumière et le photobioréacteur.
Une série d’expériences est réalisée avant la culture pour déterminer l’équation de
régression entre ces paramètres (Annexe A).
Figure 16 : Panneau de diodes utilisé comme source de lumière pour le photobioréacteur

torique
40
1.2.2. Système d’agitation
Le photobioréacteur torique a été le sujet de plusieurs études hydrodynamiques

dans le laboratoire de GEPEA. Ces études ont montré que le couplage entre la géométrie
torique du réacteur et l’agitation engendrée par l’hélice (Figure 19) permet une efficacité
de mélange hydrodynamique en diminuant les zones mortes et en augmentant
l’homogénéité de la culture (Pruvost et al., 2004a; Pruvost et al., 2004b; Pruvost et al.,
2006). La vitesse de l’hélice est réglée de façon à diminuer les contraintes de
cisaillements et à générer un écoulement tourbillonnaire. Ce dispositif, assure une bonne
homogénéisation de milieu de culture et favorise l’accès de la lumière pour la croissance
des cellules en maximisant le déplacement des cellules entre zones sombres et éclairées.
De plus, la vitesse d’écoulement prés de la paroi limite la formation de biofilme qui
diminue considérablement l’accès de la lumière au sein de réacteur.
Figure 17: Mobile d’agitation sous forme d’hélice à trois pales
41
1.2.3. Sondes de mesure
Le photobioréacteur est équipé de différents capteurs qui permettent de suivre

directement différentes grandeurs physiques. Les différents capteurs de mesure sont reliés
à une carte d’acquisition à double sens (PCI 6023E National Instrument) et contrôlés via
un logiciel d’acquisition/ régulation (Exploralgue, développé sous l’environnement
LABVIEW VI par le laboratoire PBA),( Annexe B).
• Sonde de pH
Le pH est mesuré par une électrode pHmétrique InPro 3200 (METTLER

TOLEDO). Afin de maintenir ce paramètre constant au cours de la culture, un système de
régulation est mis en place dans le réacteur (Figure 20).
La régulation du pH permet de contrôler les apports en carbone inorganique selon

le besoin de la culture. Elle se base sur l’équilibre chimique des formes carbonatées dans
le milieu. L’injection de CO2 dans le milieu modifie cet équilibre dans le sens de
formation d’ions carbonate et un proton, ce qui provoque l’acidification de milieu. Par
contre, la consommation de carbone par l’activité photosynthétique provoque une
alcalinisation de milieu. L’injection du CO2 est réalisée automatiquement par un système
de régulation lorsque le pH dépasse la valeur de la consigne imposée par l’opérateur. Le
système de régulation maintien le pH constant avec une précision de ± 0,05.
CO2 + H2O HCO3- + H+ CO32- + H+
42
Figure 18: Système de regulation du pH dans un photobioréacteur torique pour la culture

en turbidostat
• Sonde de température
Une sonde de température intégrée (modèle LM35) est installée à l’intérieur du

réacteur. Un ventilateur fixé à l’extérieur du réacteur assure le refroidissement du milieu,
selon la consigne fixée, par l’intermédiaire de la paroi métallique du réacteur.
• Sonde de lumière
La lumière est considérée comme le facteur le plus limitant pour la culture des
microalgues. Dans le photobioréacteur, un capteur quantique plan branché à un
calculateur (DataLogger) de type LI-COR 1400 (Li-COR, Lincoln USA) permet la
mesure des radiations photo-synthétiquement actives (entre 400 et 700 nm). Ce capteur
permet de mesurer le flux incident sur une surface plane (angle solide 2π) et d’obtenir
une densité de flux hémisphérique photonique (µE.m-2.s-1). L’erreur relative liée à ce
capteur est de ±5 %. La sonde est fixée dans un orifice transparent juste derrière la
43
culture et parallèle à la source lumineuse. Elle mesure l’intensité de lumière transmise de

la culture au sein du réacteur.
Le réacteur fonctionne en mode turbidostat. Au cours de l’expérimentation, la

concentration de la culture cellulaire est maintenue constante. La régulation de la
concentration cellulaire peut être réalisé par deux méthodes ; par la régulation de la
turbidité de la culture ou par la quantité de la lumière résiduelle du réacteur. La deuxième
méthode consiste à fixer la quantité de la lumière résiduelle du réacteur mesurée par la
sonde de la lumière au niveau de l’orifice (Figure 21).
Si la culture est homogène la quantité de la lumière absorbée par les cellules reste
constante. Une consigne de la lumière transmise est fixée, elle est ajustée de façon que la
productivité du réacteur soit maximale et que la lumière n’a pas d’effet limitant sur la
croissance cellulaire. Si l’intensité de lumière mesurée est inférieure à la consigne, le
système régule l’apport de milieu de culture par une pompe d’injection. La dilution de la
culture provoque l’augmentation de la quantité de la lumière mesurée.
Figure 19: Système de régulation de la biomasse dans un photobioréacteur torique pour

la culture en turbidostat.
44
1.2.4. Réseaux fluides et gaz
L’injection de gaz de CO2 et de l’air dans le réacteur est assurée par deux
électrovannes contrôlées par le système de pilotage. Des clapets anti-retour sont
également mis en place pour éviter le passage du liquide dans le système gazeux. De
plus, des filtres d’air-air de diamètre 0,22µm maintiennent les conditions axéniques du
milieu.
L’injection des milieux de culture est assurée par deux pompes doseuses
(Stepdos): la première pompe pour le milieu de culture sans azote et la deuxième pour le
milieu riche en azote. La circulation est guidée par des tuyaux (Maseterflex) stérilisés par
autoclavage à 120°C pendant 20 minutes. Ces tuyaux assurent le mélange des deux
milieux par une jonction et les pompes contrôlent le pourcentage d’injection des deux
milieux. Des clapets anti-retour sont également placés avant la jonction pour éviter la
contamination de l’un des deux milieux par l’autre.
Le soutirage de la récolte se fait par trop-plein à l’aide d’une pompe péristaltique et

maintien le système de culture en continu.
2. Matériel biologique
2.1. La souche de microalgue utilisée
L’étude a été effectuée sur la souche Chlamydomonas reinhardtii wt 137c du

centre génétique de Chlamydomonas, de l’université de Duke, Durham, USA. Le choix
de cette microalgue est basé sur plusieurs critères. D’une part, c’est un organisme modèle
de laboratoire ; son cycle de vie est court et sa croissance est parfaitement contrôlée en
laboratoire. De plus, la totalité de son matériel génétique est séquencé. Il a été le sujet de
plusieurs études physiologique, génétique, de biologie moléculaire et de plusieurs études
métaboliques pour la production de biohydrogène.
45
2.2. Conservation de la souche et préparation d’inoculum standard
La souche est maintenue dans le laboratoire sur milieu hétérotrophe TAP en

érlenmeyers de 500 ml. Des précultures sont préalablement préparées et placées dans un
incubateur thermostatisé à 25°C et soumises à un éclairement artificiel d’environ 100
µE.m-2.s-1. Afin de maintenir les précultures en bon état physiologique, un repiquage est
effectué chaque deux semaines.
2.3. Milieux de culture
Différents milieux de cultures sont utilisés pour la croissance de Chlamydomonas

reinhardtii. Dans notre travail on a utilisé le milieu de culture standardisée TAP (Tris-
Acétate-Phosphate) pour le repiquage des précultures. C’est un milieu hétérotrophe dont
l’acétate est la source de carbone organique.
Un milieu autotrophe est utilisé pour la culture au sein de réacteur. Ce milieu est
dépourvu de carbone organique et préparé entièrement à partir de l’eau déminéralisée et
d’éléments minéraux. L’ajout de bicarbonate (NaHCO3) dans le milieu autotrophe est
effectué après la stérilisation pour éviter sa précipitation. La composition chimique des
différents milieux de culture est rapportée dans l’annexe C.
3. Méthode de culture
3.1. Préparation du réacteur
La première étape de préparation de la culture consiste à stériliser le réacteur. De

ce fait, après la calibration des sondes, le réacteur est nettoyé et assemblé. Les différents
éléments du réacteur sont mise en place. L’intérieur du réacteur, les sorties et les entrés
sont stérilisées par voie chimique en utilisant l’acide peroxyacétique à 1‰ pendant 20
minutes. Tout le volume du réacteur est rempli par l’acide et rincé au moins trois fois par
de l’eau déminéralisée et autoclavée. Les différents éléments nécessaires au raccordement
du réacteur aux pompes, et les vanne d’injection de gaz et du milieu de culture, sont
46
autoclavées et raccordées en présence de flamme pour éviter les contaminations

bactériennes.
La deuxième étape consiste à injecter l’inoculum et le milieu de culture à l’aide

d’une pompe péristaltique dans le réacteur. Finalement, les paramètres de culture et les
consignes de régulation sont fixés dans le programme de pilotage.
3.2. Culture en batch
Dans une première étape, la concentration de la culture est très faible dans le
réacteur. Le système est mis en batch et les microalgues croissent sans avoir un paramètre
limitant de croissance dans le milieu. L’intensité de la lumière est régulée selon
l’évolution de la concentration cellulaire dans le réacteur. Lorsque la culture atteint une
concentration élevée de biomasse, le réacteur est mis en système continu et les consignes
de régulation de pH et de la lumière sont fixées.
3.3. Cultures expérimentales
Deux cultures expérimentales de Chlamydomonas en mode turbidostat ont été

réalisées. La première culture est une culture témoin qui nous permet de déterminer le
point (γ=1) (la quantité de la lumière qui correspond à la productivité maximale du
système) et de décrire l’état physiologique des microalgues dans les conditions standards
non limitantes. Pour la deuxième culture, nous avons imposé une limitation progressive
de l’azote.
47
Figure 20: schéma général de l’expérimentation
3.4. Paramètres de la culture

Afin de visualiser l’effet de limitation de l’azote, on a gardé dans les deux
expériences les mêmes consignes des paramètres de culture. La consigne de la
température est de 25°C et le pH est de 7. Au cours de la culture en batch, l’intensité de
la lumière est régulée à 150 µE.m-2.s-1 et puis ajustée à 200 µE.m-2.s-1 en mode continu.
La distance entre la source de la lumière et la surface de réacteur est fixée à 10 cm. La
vitesse d’hélice d’agitation est maintenu constante au cours de l’expérience.
48
4. Analyses biologiques
4.1. Estimation de la biomasse sèche
Des filtres GF/C (whatman), préalablement séchés à l’étuve pendant 24 h à
110°C, sont refroidis pendant 10 minutes dans un dessiccateur puis pesés. Les
échantillons de la culture de volume 5 et 20 ml sont filtrés sous vide séchés et pesés dans
les mêmes conditions que celles des filtres. La concentration de la culture est calculée par
la différence entre les deux mesures.
4.2. Dénombrement cellulaire

Le nombre des cellules est déterminé par un comptage sur une cellule de
Malassez au microscope optique (objectif 40). Selon la densité de la culture, l’échantillon
est dilué à l’eau physiologique. Pour fixer les cellules, on a ajouté de l’alcool à raison de
1/3 du volume de l’échantillon On a calculé la moyenne du nombre de cellules de
microalgues compté au moins dans 10 rectangles sur l’hématimètre de Malassez.
4.3. Détermination de la taille des cellules des microalgales

La taille des cellules est déterminée par la mesure de leur longueur. Au cours du
comptage cellulaire sur la cellule de Malassez, une microphotographie est prise. La
dimension de 200 à 300 cellules sélectionnées de façon arbitraire est déterminée sur les
microphotographies. La taille réelle des cellules est déterminée en tenant compte du
rapport entre la dimension réelle déterminée par des rectangles sur l’hématimètre de
Malassez et celle mesurée sur les microphotographies.
4.4. Dosage des pigments

Les teneurs en pigments sont mesurés par spectrophotométrie. L’extraction des
pigments s’effectue par agitation dans l’acétone à 90% pendant 24 heures à 4°C et dans
l’obscurité. Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation. Le surnageant est
ensuite analysé par spectrophotométrie. Les teneurs en chlorophylle a (Chla),
chlorophylle b (Chlb) et caroténoïdes (PPC pour photoprotective carotenoids) sont
déterminées en utilisant les relations suivantes, développées pour les chlorophycées
(Strickland et Pearsons, 1968) :
49
Cchl-a = 100×[11,6(DO665-DO750)-1,31(DO645-DO750)-0,14(DO630-DO750)]
CChl-b= 100×[20,7(DO645-DO750)-4,34(DO665-DO750)-4,42(DO630-DO750)]
Cppc= 100×[4,0(DO480-DO750)]
La densité optique des extraits est mesurée dans une cuve en quartz à différentes
longueurs d’ondes, et la ligne de base est réalisé avec de l’acétone pur. Connaissant la
concentration massique de la culture, on peut en déduire une teneur en pigments en
gramme de pigments par gramme de biomasse.
4.5. Dosage des protéines totales
Après centrifugation d’un volume de culture, le culot subit une hydrolyse alcaline
par la soude (2M) au bain marie à 95°C pendant 15 minutes. L’hydrolysat est
partiellement neutralisé à température ambiante par l’acide chlorhydrique (1.6 M) et les
débris cellulaires sont éliminés par centrifugation.
Le dosage proprement dit est réalisé selon la méthode de Lowry et al., (1951) modifié.
Cette méthode consiste à établir des liaisons entre les protéines et les ions de cuivre en
milieu basique par réaction de biuret. Ainsi la réduction d’un composé
phosphomolybdique-phosphotungstique du réactif de Folin-Ciocalteu par les acides
aminés aromatiques donne la coloration bleu vert finale.
La densité optique des échantillons est lue à 500 nm. La concentration en protéines est
calculée en se rapportant à une gamme étalon préparée avec de l’albumine de sérum de
bovin (BSA) et de concentration entre 0 et 1g.L-1 ayant subi le même traitement que les
échantillons.
4.6. Dosage de sucres totaux

La préparation des échantillons consiste à récupérer le culot de la biomasse algale
après une centrifugation et lavage par l’eau osmosée (3 ‰ NaCl). La méthode
colorimétrique de Dubois et al., (1956) est adoptée pour le dosage des sucres totaux. Les
sucres sont déshydratés en dérivés du furfural en milieu acide sulfurique et à chaud. La
liaison entre le dérivé du furfural et le phénol donne une coloration rose-saumon.
50
L'absorbance est lue à la longueur d'onde de 483 nm et la coloration obtenue est stable
pendant plusieurs heures. Cette méthode est très sensible puisqu'elle permet de détecter
des quantités de glucides pouvant atteindre 1 µg. La quantité des sucres totaux est
exprimée en pourcentage par apport à la matière sèche.
4.7. Dosage de l’amidon

Le dosage de l’amidon est effectué par la méthode Klein et Betz modifiée (Klein
et Betz, 1978). La préparation des échantillons consiste à éliminer les pigments
photosynthétiques par extraction au méthanol et ensuite mettre en suspension l’amidon
par autoclavage pendant 20 minutes à 135 °C. La détermination de la quantité de
l’amidon est réalisée par voie enzymatique à l’aide d’un kit commercial (Starch HK
Assay Kit, Sigma Aldrich) (Annexe D). L’hydrolyse de l’amidon en glucose est catalysée
par l’amyloglucosidase. Le glucose est ensuite phosphoré en triphosphate adenosine
(ATP) par l’enzyme hexokinase. Le glucose-6-phosphates (G6P) est oxydé en 6-
phosphogluconate avec la présence de dinucleotide de l'adenine et du nicotinamide
(NAD) dans une réaction catalysée par le glucose-6-phosphate déshydrogénase de
(G6PDH). Pendant cette oxydation, un taux équimolaire de NAD est réduit en NADH.
Ainsi, l'augmentation de l’absorbance à 340 nm est directement proportionnelle à la
concentration du glucose.
5. Analyses physicochimiques
5.1. Dosage du carbone inorganique (Degrémont, 1978)
Le dosage du carbone inorganique total dans la phase liquide est effectué par
titration acide /base avec une solution d’acide chlorhydrique 1N. En présence de
phénolphtaléine, l’ajout de l’acide chlorhydrique transforme les ions carbonate en ions
hydrogénocarbonate. Le volume versé au virage de l’indicateur coloré (pH=8,3)
correspond au titre alcalimétrique TA. Le dosage est par la suite poursuivi en présence
de bleu de bromothymol pour transformer les ions hydrogénocarbonates en acide
carbonique. Le titre alcalimétrique complet TAC est obtenu à pH=4,6 quant l’indicateur
coloré vire du bleu au jaune.
51
La concentration en carbonate et hydrogénocarbonate est donnée par la relation suivante :
CTIC =CHCO¯ 3 + CCO32- = (TAC-TIC) N/V

Tel que
• N : la normalité de la solution d’acide chlorhydrique servant au titrage

• V : le volume d’échantillons sur lequel on effectue le dosage
5.2. Dosage de l’ammonium
Le dosage de l’ammonium est effectué selon la méthode colorimétrique au bleu

d’indophénol (Aminot et al., 1997). Un volume de 10 ml de la culture est filtré via un
filtre Wathman GF/F et le filtrat est récupéré pour faire le dosage. Deux solutions de
phénol de nitroprussiate et de javel sont mélangées rapidement au filtrat. Dans un milieu
basique, l’ammonium réagit d’abord avec l'hypochlorite pour former une
monochloramine, puis successivement avec 2 molécules de phénol pour former le bleu
d'indophénol par la réaction de Berthelot. Le spectrophotomètre est réglé sur une
longueur d’onde de 630 nm.
6. Analyses mathématiques des données
Les données de l’expérience ont été traitées selon le test ANOVA/MANOVA.

Cette analyse (ANOVA) permet de donner des renseignements d’une part sur l’effet
simple, mais également sur l’effet d’interaction entre les facteurs.
Le programme STATISTICA version 5.5 et Microsoft Excel 2007 ont permis de

faire les différents traitements statistiques. La statistique descriptive a été utilisée pour
caractériser les variations des données d’analyses. Les concentrations des réserves
carbonées déterminées au cours de l’expérience ont été comparées par une analyse des
variances (ANOVA/MANOVA) avec un niveau de signification α égale à 0.05, et selon
le test HSD (Honest Significant Différence) de Tukey. Les résultats sont présentés sous
forme de moyenne plus écart type.
52
RESULTATS
Résultats
1. Etude de la croissance et de la production des métabolites

dans les conditions sans limitation d’azote
Cette partie étudie la croissance et la composition des réserves carbonées dans une
culture de Chlamydomonas reinhardtii. La culture est réalisée dans un photobioréacteur
torique en mode turbidostat. L’objectif de cette partie est de déterminer les paramètres de
la productivité du système et la concentration en réserves carbonées correspondantes sous
deux conditions d’équilibre.
1.1. La croissance
Nous avons fixé deux points d’équilibre du système. L’équilibre est réalisé en
introduisant au système une consigne de luminosité à la sortie du réacteur. La luminosité
à la sortie du réacteur est une mesure indirecte de la concentration cellulaire dans la
culture. Le système maintient l’équilibre en diluant la culture chaque fois que la
concentration dépasse le point consigne.
Nous avons testé deux points consignes : 25 µE.m-2.s-1, un peu supérieur de celle
notée à la fin de la culture en Batch et 15 µE.m-2.s-1. Pour la consigne 25 µE.m-2.s-1, la
productivité moyenne atteinte par le réacteur est stable pour six jours de culture continue
est de 0,00566 kgm-3h-1 et qui correspond à une concentration de microalgues de 0,247
g.L-1. Cette valeur de concentration cellulaire est faible si l’on se réfère à la concentration
trouvée sur le même réacteur par Takache (communication personnelle) et qui est de 0,4
gL-1, correspond à une productivité maximale du système.
La deuxième consigne de lumière choisie, correspond à 15 µE.m-2.s-1, a provoqué

une augmentation de la concentration cellulaire moyenne ainsi que la productivité de
système. L’évolution de la concentration de microalgues de Chlamydomonas reinhardtii
et le taux de dilution (D) du réacteur en fonction du temps pour la consigne de lumière de
15 µE.m-2.s-1 est rapporté dans le figure 23. Le système est stabilisé à une concentration
moyenne de biomasse de 0,343 gL-1 et qui correspond à un taux de dilution de 0,032 h-1.
La productivité moyenne de système est égale à 0,011 kgm-3h-1. Cette productivité est
maintenue constante pendant six jours.
53
Résultats
Biomasse Biomasse moyenne

Taux de dilution Taux de dilution moyenne
Cx kg. m-3 D (h-1)
0,4 0,12
0,35
0,1
0,3
0,08
0,25
0,2 0,06
0,15
0,04
0,1
0,02
0,05
0 0
8 9 10 11 12 13 14 15
Temps (jours)
Figure 21:: Evolution de Poids sec de Chlamydomonas et du taux de

dilution (D) du système en fonction de temps.
Les conditions de la consigne 15 µE.m-2.s-1 sont adoptés pour le reste du travail comme
point d’équilibre du réacteur. Dans ces conditions nous avons vérifié que la culture est
dans des conditions d’axénie. L’observation microscopique des prélèvements algaux
alg du
réacteur au cours de l’expérience n’a pas révélé de contamination bactérienne dans la
culture (Figure 24).
Figure 22:: Image d’une observation microscopique d’un échantillon de microalgues du

photobioréacteur torique, fixé sur une cellule de malassez par l’éthanol.
54
Résultats
1.2. Paramètres abiotiques
La détermination des paramètres abiotique dans le réacteur est effectuée au cours

de la phase d’équilibre de la culture. La première analyse abiotique consiste à déterminer
la concentration en carbone inorganique total dans le réacteur. Le dosage colorimétrique
a révélé une concentration molaire de 0,022 mol.L-1 de carbone inorganique total (TIC).
Cette concentration indique qu’il n y’a pas eux de carence en carbone dans le réacteur au
cours de l’expérience. Le deuxième paramètre abiotique est celui de l’azote résiduel dans
le réacteur.
Tableau I : Récapitulatif des données obtenues sur l’azote
rx [NH4+]e [NH4+]s rNH4

X YNH4-X C/N
(kg.m-3) (kg.m-3.h-1) (gL-1) (g.L-1) (kg m-3h-1 ×10-3)
0.343 0.011 0.486 0.476 0.32 0.034 0.564
Le tableau (I) présente un récapitulatif des résultats trouvés. La productivité (rX)

du réacteur au cours de la phase stationnaire est de l’ordre de 0.011 kg.m-3.h-1 correspond
à une biomasse algale (X) égale à 0.343 g.L-1. La seule source d’azote dans le réacteur est
le milieu de culture sous forme d’ammonium (NH4+). La concentration de l’ammonium
dans le milieu de culture initial ([NH4+]e) est de 0,486 g.L-1. Ainsi la différence entre la
quantité d’azote injecté et d’azote résiduelle ([NH4+]s) dans le réacteur nous permet de
déterminer la quantité d’azote assimilée par la culture. La vitesse d’assimilation de
l’azote par la culture est de 0.0003 kg.m-3.h-1. Le rendement de la production de la
biomasse par apport à la quantité de l’azote assimilé dans le réacteur (YNH4-X) est de
à 0,034.
55
Résultats
La détermination du ratio carbone/azote est effectuée à partir de la quantité de

carbone présente dans le milieu de culture et la quantité d’azote injecté dans le réacteur.
Ce paramètre nous permet de savoir le degré de limitation d’azote impliqué sur la culture.
Le ratio carbone/azote déterminé dans le réacteur est de 0.564. La concentration de
l’azote résiduelle dans le réacteur est de l’ordre de 0.478 g.L-1, ce qui indique que le
milieu de culture dans le réacteur n’est pas sous limitation d’azote ou de carbone
inorganique au cours de l’expérience.
1.3. Pigments photosynthétiques
Tableau II : Récapitulatif des données obtenues sur le teneur en pigments.
Pigments Concentration (mg.L-1) % Biomasse

Chlorophylle a 7,151 (±0,145) 2.087 (±0,042)
Chlorophylle b 2,705 (±0,043) 0.789 (±0,012)
Caroténoïde de protection 1,894 (±0,016) 0.553 (±0,004)
Le tableau (II) présente la concentration et la teneur des pigments cellulaire de

microalgues Chlamydomonas par apport à la biomasse de la culture.
La concentration des pigments chlorophylliens Chla+b et des caroténoïdes est

respectivement de l’ordre de 9,856 mgL-1 et 1,894 mgL-1 représentant respectivement
2,873% et 0,552% du poids sec cellulaire. A titre de comparaison, les expériences
effectués par Degrenne (2009) ont révélé une teneur massique en pigments de 1.39±0.4%
en Chlorophylle a, 0.63±0.3% en chlorophylle b et 0,45±0,17% en caroténoïdes de
protection. Ainsi, le rapport entre la concentration de chla et le chlb est de l’ordre de 2,643
dans notre expérience et celle trouvé par Degrenne (2009) est de 2,206.
56
Résultats
1.4. Réserves carbonées
Tableau III : Récapitulatif des données obtenues sur les teneurs en réserves.
Réserves carbonés Concentration (g.L-1) % Biomasse

Protéines Totales 0,166 (±0,011) 48,747 (±3,385)
Sucres totaux 0,044 (±0,040) 13,114 (±2.50)
Lipides totaux 0,137 (±0,011) 36,153 (±3,385)
Le tableau (III) présente la concentration en protéines totales, en lipides et en sucres

totaux de la cellule Chlamydomonas. La concentration en lipides est déterminée comme
le reste de poids cellulaire.
La concentration en protéines totales et en sucres totaux dans la culture est

respectivement de 0,166 ±0,011 g.L-1 et 0,044 ± 0,040 g.L-1. Ces concentrations
rapportées à la biomasse sèche représentent respectivement 48,7% et 13,1% On remarque
que la concentration de protéines est trois fois plus forte que celle des sures totaux et
présente presque la moitié de la biomasse algale, ce qui explique l’importance
nutritionnelle des cette microalgue comme une source de protéines soit pour l’utilisation
humaine ou dans les fermes d’aquaculture. A titre de comparaison, les résultats trouvé
par Degrenne (2009) au cours des ces études sur la croissance de Chlamydomonas dans
un milieu autotrophe et en mode en batch sont en accord avec nos résultats. Il a déterminé
des teneurs en sucres totaux et en protéines totales respectivement égales à 16% et 56%.
1.5. Composition biochimique globale de la cellule

La composition biochimique globale de la cellule Chlamydomonas reinhardtii est
rapportée dans la figure 25. La teneur de divers composant hors que les réserves carbonés
mesuré est estimée à 2% par apport à la biomasse sèche totale. La teneur en lipides est
estimée à 32% de la masse celluliare.
57
Résultats
0,55%
2,86% 2%
Proteines Totales
Sucres Totaux
Lipides
32,74% 48,74%
Chla+b
PPC
Divers
13,11%
Figure 23:: Composition biochimi

biochimique globale de microalgue Chlamydomonas reinhardtii
58
Résultats
2. Etude de la croissance et de la production métabolites

sous les conditions de limitation d’azote
Cette partie étudie l’effet de limitation de l’azote sur la croissance de microlagues

Chlamydomonas reinhardtii, et sur l’évolution des réserves au cours de limitation sur le
même photobioréacteur et dans les mêmes conditions de culture.
Nous avons imposé trois niveaux de limitation d’azote au cours de

l’expérience selon le rapport C/N ; faible (3,609), moyenne (16,016) et fort (33,917).
Selon la vitesse de l’utilisation de l’ammonium par la culture, il fallait attendre deux jours
pour que les microalgues utilisent la totalité de l’ammonium dans le réacteur. Par contre,
la diminution de la concentration d’azote est progressive, car il est ralenti par la quantité
d’azote injecté dans le milieu de culture. L’évolution du rapport C/N au cours de
l’expérience de limitation d’azote indique que la culture n’a pas eux une limitation de
carbone inorganique, de plus la concentration de carbone inorganique mesuré dans le
réacteur est de l’ordre de 0,024 mol.L-1, et par conséquence les modifications
physiologique ainsi métabolique est due seulement au facteur de l’azote.
2.1. La croissance
Biomasse (X) Taux de dilution (D)

Cx (kg.m-3) D (h-1)
0,6 0,05
0,5 0,04
0,4
0,03
0,3
0,02
0,2
0,1 0,01
A B C
0 0
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
Temps (jours)
Figure 24: Evolution de la Biomasse (Cx) et le taux de dilution (D) dans le

photobioréacteur en mode Turbidostat. A : Niveau de limitation d’azote Faible (C/N=
3,6), B : Niveau de limitation Moyenne (C/N=16,01), C : Niveau de limitation Fort
(C/N=33,91).
59
Résultats
Au cours de la phase stationnaire sans limitation d’azote, le taux de dilution (D)

reste quasiment stable et la productivité de système correspond est de 0,011 kg.m-1.h-1,
avec une concentration algale de 0,379 g.L-1. Après l’établissement de la phase
stationnaire nous avons mis le système en limitation d’azote. Le taux de dilution est
restée quasi constant jusqu’à J25 (les légères variations de la productivité sont attribuées à
l’inertie du système), c.a .d, après 5 jours de déficit en azote. Ce taux s’annule à J28
traduisant un arrêt de la division cellulaire.
La biomasse reste quasi constante autour de la concentration initiale, ce qui explique une
stabilité de la concentration algale dans le réacteur au cours de l’expérience.
2.2. Paramètres abiotiques
Tableau IV : Récapitulatif des données obtenues

Niveau de rNH4
[NH4] e [NH4] s rx
limitation en C/N (kg m-3h-1
(mg.L-1) (mg.L-1) (kgm-3h-1×10-3)
Azote ×10-3)
Pas de limitation 0,571 480,27 469,57 0,258 9,159

Faible 3,609 76,067 434,69 1,528 13,408
Moyenne 16,016 17,142 1,11 0,618 12,484
forte 33,917 8,095 0,44 0,142 8,384
Le tableau (IV) présente les niveaux de limitations d’azote dans le réacteur selon
le rapport Carbone/Azote (C/N), la productivité du système (rx) et la vitesse de la
consommation de substrat d’azote avant et après la limitation (rNH4).
Selon la concentration de l’azote injecté dans le réacteur, on observe une

diminution de la quantité d’azote résiduelle au cours de limitation d’azote jusqu'à un
épuisement total d’azote pendant la phase de forte limitation. La vitesse de
consommation de substrat est variable selon le niveau de limitation d’azote. Au cours de
60
Résultats
la phase de limitation d’azote faible, la vitesse de consommation d’azote par la culture a

augmenté de façon significative pour atteindre un maximum égal à 1,528 mg.L-1.h-1
contre 0,252 mg.L-1.h-1 pour le témoin. Au fur est à mesure qu’on augmente le taux de
limitation d’azote, on note une diminution de la vitesse de consommation d’azote jusqu’à
atteindre 0,142 mg.L-1.h-1.
Une diminution progressive de la productivité est également observée au cours de

la phase de faible limitation d’azote et poursuit jusqu'à la phase de forte limitation
d’azote pour atteindre 8,09 ×10-3kgm-3h-1, et s’annule à la fin de l’expérience.
2.3. Pigments photosynthétiques
Tableau V: Récapitulatif des données obtenues sur les pigments photosynthétique
Niveau de % chla+b de
Chla+b PPC % PPC de Chla+b/PP
limitation en C/N
(g.L-1×10-3) Biomasse (g.L-1×10-3) Biomasse C
Azote
Sans limitation 0,572 10,569 (±0,713) 2,728 (±0,184) 2,147 (±0,136) 0,556 (±0,035) 4,903
Faible 3,609 13,483 (±0,427) 3,395 (±0,107) 2,694 (±0,089) 0,678 (±0,022) 5,004
Moyenne 16,016 11,933 (±0,305) 3,690 (±0,094) 2,510 (±0,070) 0,776 (±0,021) 4,753
fort 33,917 5,645 (±0,380) 1,254 (±0,084) 2,080 (±0,147) 0,462 (±0,032) 2,713
Le tableau (IX) présente l’évolution de la concentration des chla+b , les

caroténoïdes et le rapport chla+b /PPC dans une culture de Chlamydomonas sous condition
de limitation d’azote.
La proportion de la concentration en pigments par apport à la biomasse cellulaire

au début de l’expérience se stabilise à 2,728% (±0,184), 0,556% (±0,035) respectivement
pour Chla+b et caroténoïdes et correspond à une concentration de 10,569 (±0,713) mg.L-1
et 2.147 (±0.136) mg.L-1.
Au début, de la phase de limitation d’azote, on observe une augmentation

progressive de la proportion des pigments cellulaires par apport à la biomasse cellulaire
61
Résultats
jusqu'à un maximum atteint dans la phase de limitation d’azote moyenne. Cette

augmentation est observée chez les différents pigments étudiés dans notre expérience.
Par contre, la phase de limitation forte d’azote à provoqué une diminution brusque
de la teneur en pigments de 54% et 16,9%, respectivement pour les Chla+b et le PPC et
par apport à la phase sans limitation d’azote. De même, le rapport entre la concentration
de Chla+b et le PPC diminue progressivement au cours de limitation en azote, ce qui a
provoqué une décoloration de la culture (voir figure 27).
Figure 25: Visualisation de la couleur de la culture. Jaunissement de la culture sous

l’effet de la limitation en Azote.
62
Résultats
2.4. Réserves carbonées

2.4.1. Protéines
Tableau VI : Récapitulatif des données obtenues sur les protéines

Niveau de limitation Protéines rprot
C/N -1
% en Biomasse
d’azote (g.L ) (kg m h ×10-3)
-3 -1
Pas de limitation 0,572 0,187 (±0,003) 51,440 (±0,834) 4,808

Faible 3,609 0,180 (±0,006) 48,321 (±1,709) 4,897
moyenne 16,016 0,108 (±0,005) 33,527 (±1,681) 4,185
fort 33,917 0,129 (±0,002) 28,807 (±0,646) 2,415
Le tableau (V) présente l’évolution de la concentration et la teneur de protéines en

fonction de la biomasse et la vitesse de synthèse de protéines (rprot).
Avant la limitation en azote, la teneur en protéines reste presque stable à 51,440%

(±0,834) de la biomasse sèche correspondante, avec une concentration de 0,187 (±0,003)
g.L-1. La limitation progressive d’azote au cours de l’expérience a provoqué une
diminution significative de la proportion de protéines jusqu’à 28,807% (±0,646) de la
biomasse cellulaire pour une concentration de 0,108 g.L-1; ce qui représente une
diminution de 44% en moyenne par rapport au témoin. De plus, la vitesse de production
des protéines a diminué de 50% par apport au témoin pour atteindre 2,415 mg.L-1h-1 a la
fin de l’expérience.
2.4.2. Sucres totaux
Tableau VII : Récapitulatif des données obtenues sur les Sucres Totaux
Niveau de
Sucres totaux rsucres
limitation C/N % en Biomasse
(g.L-1) (kg m-3h-1 ×10-3)
d’azote
Sans
0,571 0,061 (±0,006) 17,636 (±1,937) 1,582
limitation
Faible 3,609 0,093 (±0,001) 26,091 (±0,508) 2,538
Moyenne 16,016 0,098 (±0,002) 31,818 (±0,848) 3,812
fort 33,917 0,221 (±0,001) 51,381 (±0,433) 4,134
63
Résultats
Le tableau (VII) représente l’évolution de la concentration intracellulaire en sucres

totaux. On observe que la concentration en sucres totaux augmente au cours de la
limitation d’azote, en corrélation avec le niveau de limitation imposé, pour atteindre un
maximum égal à 51,381% (±0,433) par apport à la biomasse cellulaire, correspondant à
une concentration de 0,221 (±0,001) g.L-1, contre 17,636 % (±1,937) pour le témoin.
Ainsi, la limitation d’azote a provoqué une augmentation significative en sucres totaux
d’un facteur 3 par apport au témoin.
2.4.3. Amidon
Tableau VIII : Récapitulatif des données obtenues sur l’Amidon

Niveau de Amidon ramidon
limitation en C/N % Biomasse
-1 -6
Azote (g.L ×10 ) (kg m-3h-1 ×10-3)
Pas de
0,571 4,313 (±0,006) 1,180 (±0,001) 0,052
limitation
Faible 3,609 19,283 (±0,173) 5,150 (±0,046) 0,521
Moyenne 16,016 34,612 (±0,360) 10,705 (±0,111) 1,385
fort 33,917 58,302 (±0,862) 12,953 (±0,191) 1,085
Le tableau (VIII) présente l’évolution de la concentration en amidon, la teneur de

l’amidon par apport à la biomasse cellulaire et la vitesse de production de l‘amidon
(ramidon) selon les différents niveaux de limitation imposés.
Durant la phase sans limitation azoté, la teneur en amidon reste stable à 1,18%
(±0,001) correspondant à une concentration d’amidon égale à 4,313 (±0,006) ×10-6 g.L-1.
Au cours de la phase de limitation d’azote, on note une augmentation significative et
progressive de la teneur en amidon pour atteindre 12,95% (±0.19) à la fin de
l’expérience. Ainsi, on note une augmentation rapide de la vitesse de production
d’amidon jusqu’à la phase de la limitation moyenne d’azote pour atteindre un maximum
de 1,385 ×10-3 kg.m-3h-1 suivie par une faible diminution. Cette augmentation est de
facteur de 11 pour la proportion de biomasse en amidon et de 20 pour la vitesse de
synthèse d’amidon.
64
Résultats
2.4.4. Les sucres totaux et l’amidon
Tableau IX: Récapitulatif des données obtenues sur l’Amidon et les Sucres Totaux
Niveau de
Sucres Amidon % Amidon % Amidon
limitation en C/N % Sucres
(g.L-1×10-6) (g.L-1×10-6) Sucres
Azote
Sans limitation 0,571 61,849 (±6,795) 17,636 (±1,937) 4,313 (±0,006) 1,180 (±0,001) 6,974
Faible 3,609 93,757 (±1,826) 26,091 (±0,508) 19,283 (±0,173) 5,150 (±0,046) 20,566
Moyenne 16,016 98,730 (±2,632) 31,818 (±0,848) 34,612 (±0,360) 10,705 (±0,111) 35,057
fort 33,917 221,960 (±1,872) 51,381 (±0,433) 58,302 (±0,862) 12,953 (±0,191) 26,267
Le tableau (IX) présente l’évolution de la concentration de l’amidon et des sucres totaux

selon le niveau de limitation d’azote imposé dans le photobioréacteur torique. Il présente
aussi l’évolution de la proportion de l’amidon par apport aux sucres totaux.
Durant la phase de limitation d’azote, la proportion de l’amidon par apport aux

sucres totaux a augmenté de façon significative jusqu'à un maximum de 35,057% contre
6,974% pour le témoin. Le rapport Amidon/Sucres a augmenté d’environ 5 fois par
apport à la phase sans limitation d’azote.
65
Résultats
2.5. Evolution de la composition biochimiques globale de la cellule
Proteines Totales Sucres Totaux Lipides Chla+b ccp Divers
0,55% 0,67% 2%
2,72% 2% 3,39%
20,52%
26,32% 48,31%
51,43%
25,04%
16,92%
Sans limitation d'azote Faible limitation d'azote
3,69% 0,77% 2% 1,25% 0,46% 2%
18,16% 28,80%
33,52%
29,46%
49,31%
30,53%
Limitation d'azote moyenne Forte limitation d'azote
Figure 26:: Composition biochimique de microalgues Chlamydomonas reinhardtii au

cours de limitation d’azote.
66
Résultats
La figure 28 représente une récapitulation de l’effet de limitation d’azote sur les

différentes réserves carbonées et les pigments analysés dans notre travail. Les résultats
montrent une augmentation de la proportion en sucres totaux qui atteint un maximum
égal à 49,31% au cours de la phase de forte limitation d’azote. Par contre, la proportion
des protéines totales a diminué pour atteindre une valeur de 28,8% de la biomasse et la
proportion des lipides reste quasiconstante au cours de l’expérience.
A propos les pigments cellulaires, la figure montre une augmentation de la teneur

de Chla+b jusqu'à un maximum enregistré au cours de phase de limitation moyenne
d’azote, poursuivie par un chute brusque au cours de la phase de limitation forte d’azote.
2.6. Variation de la taille cellulaire au cours de la culture
Tableau X: Evolution de la taille cellulaire au cours de la limitation d’azote
Niveau de limitation en Azote C/N Taille en µm

Sans limitation 0,571 7,567
Faible 3,609 7,707
Moyenne 16,016 6,493
fort 33,917 6,289
Le tableau (X) présente l’évolution de la taille moyenne des cellules microalgues

sur un échantillon d’environ 300 cellules.
La taille des cellules varient peu au cours de l’expérience. De plus, le rapport

entre la biomasse et les nombres des cellules reste presque constant. Les observations
microscopiques de la culture n’ont pas révélé une modification de la forme ou de la
motilité de la cellule algale ou des traces de fusion cellulaire.
67
Résultats
3. Etude de la réversibilité de la réponsee aux conditions de limitation d’azote

3.1. Les paramètres d’azote
A la fin de l’expérience, nous avons injecté juste après la phase de limitation forte
d’azote une quantité d’azote supplémentaire de 24,618 mg.L-1 (C/N= 11,152) afin de
visualiser la réversibilité
rsibilité de la réponse à la limitation d’azote.
3.2. Réserves carbonées et pigments photosynthétique
1,19% 0,53% 2%
Proteines Totales
Sucres Totaux
23,18% 31,48%
Lipides
Chla+b
ccp
Divers
41,59%
Figure 27:: Composition biochimique de microalgues Chlamydomonas reinhardtii au

cours de l’étude de la réversibilité des effets de limitation d’azote.
On observe une faible augmentation de la teneur en protéines intracellulaires. La

teneur est de 31,42%, contre 28,807% enregistrée pendant la forte limitation d’azote.
La teneur en sucres totaux a diminué à 43,348 % par apport à 51,381 % (±0,433)

enregistrée au cours de la phase de forte limitation d’azote. En revanche, la concentration
d’amidon par apport à la biomasse cellulaire reste quasiment stable à 12,859% (±0,295)
ce qui a provoqué une augmentation de teneur de l’amidon par apport au sucres
sucre totaux.
68
Résultats
La concentration de chla+b reste presque stable à 1,199% (±0,041) par apport à la

biomasse. Par contre, la proportion de ppc enregistrée est de 0,532 (±0,024),correspond à
une augmentation de 13,15% par apport à la phase de forte limitation d’azote.
On constate par ailleurs que la taille moyenne des cellules n’a pas subit
d’augmentation significative : 7,764 µm contre 6,289µm au cours de la phase de forte
limitation.
Les résultats relatifs aux réserves carbonés ont tendance à montrer la réversibilité
de l’activité métabolique vis-à-vis de la disponibilité en Azote. La confirmation de cette
tendance nécessite plus d’expérimentation.
69
DISCUSSION
Discussion
Différents auteurs ont étudié l’effet de la limitation d’azote sur la croissance et la

composition des réserves carbonés intracellulaires (Berges et al., 1996; Peltier et
Schmidt, 1991; Wykoff et al., 1998). Ainsi, selon le degré de stress appliqué et le mode
de culture utilisé, plusieurs effets de la limitation en azote sont révélés.
Au cours de nos expérimentations la limitation en azote, entraine une diminution

du taux de dilution de la culture ce qui traduit une diminution de la croissance. Le taux de
dilution est nul pour les forts taux de limitation en azote traduisant une croissance nulle
ou négative. Flynn KJ, 1991 ; Davies et al., 1996 et Lien et Knutsen,1973 considèrent
l’azote comme les nutriments majeurs affectant la croissance des microalagues.
D’après différents travaux, la déficience en azote induit l’accumulation de lipides

dans la cellule qui peut dépasser 60% du poids sec de la biomasse (Ratledge, 2002). Dans
notre expérience, on a enregistré une faible variation de la quantité de lipides totaux
même pour de fortes limitations en azote. Cependant, la majorité des auteurs indiquent
que l’accumulation des lipides sous carence en azote exige un stress lumineux, induit par
un fort éclairement de la culture. La production de lipides serait une déviation du
métabolisme cellulaire vers l’accumulation des réserves afin de pallier à l’excès d’énergie
incidente, génératrice de radicaux libres.
Notre culture est effectuée dans des conditions de luminosité non stressante
puisque régulées initialement pour assurer une productivité maximale. Les résultats de ce
travail expriment par conséquent uniquement l’effet de la carence en azote sur la
composition biochimique de Chlamydomonas sans l’intervention d’autre stress
supplémentaire.
Les teneurs en réserves carbonées au niveau de la culture non carencée en azote sont de
49 %, 13 % respectivement pour les protéines et les sucres totaux. Ces résultats sont en
accord avec ceux trouvés par Degrenne (2009), avec des teneurs en sucres totaux et en
protéines totales respectivement égales à 16% et 56%.
70
Discussion
La limitation en Azote induit, dans ce travail, une diminution de la teneur en

protéines totales atteignant jusqu’à 57% en comparaison au témoin.
Plumley et Schmidt, 1989, signalent que dans les conditions de déficience en azote, la
biosynthèse des protéines est réduite. Le métabolisme de dégradation de protéines
intracellulaires s’intensifie afin d’assurer la disponibilité en ammonium. Cette
dégradation est souvent orientée vers les protéines les plus abondants dans la cellule
comme les Rubisco (Plumley et Schmidt, 1989), les protéines ribosomales (Siersma et
Chiang, 1971) et les apoprotéines antennaires des photosystèmes.
Par contre, les teneurs en sucres totaux triplent sous l’effet de la limitation en
azote. Cette augmentation confirme l’effet inducteur de la limitation en azote sur la
biosynthèse de sucres totaux (Ball, 1998). Nos résultats indiquent également une
augmentation d’un facteur 5 de la proportion d’amidon dans la composition en sucres. Ce
fait confirme que dans le cas d’absence de stress lumineux, la carence en azote oriente le
métabolisme vers la mise en réserve du carbone excédentaire sous forme d’amidon plutôt
que sous forme de lipides.
L’analyse du rapport Chlorophylles-caroténoïdes (Chl a+b/ppc) montre une
stabilité pendent les phases de faible et de moyenne limitations en azote. Ce rapport chute
de moitié à la fin de la phase de forte limitation en azote. Cette chute est due
essentiellement à la dégradation des chlorophylles plutôt qu’à l’augmentation de celle des
ppc. . Le taux de caroténoïdes n’ayant pas augmenté sous l’effet de la limitation en azote
on peut supposer, que dans nos conditions expérimentales, les mécanismes de dissipation
de l’excès d’énergie faisant intervenir les caroténoïdes sont assez peu exprimés. Ceci à
l’encontre des conditions ou la carence en azote est accompagnés d’un excès de lumière
et ou on constate généralement une augmentation conséquente des teneurs en
caroténoïdes.
Le changement dans la composition pigmentaire semble entrainer des erreurs dans

l’estimation de la concentration cellulaire dans le réacteur expérimental. En effet les
valeurs de biomasse estimées, pendant la fin de l’expérience, par séchage d’échantillons
de la culture, présentent des valeurs 20% supérieures à celles de la consigne du réacteur.
La régulation de la biomasse dans le réacteur est effectuée par un capteur quantique qui
permet de détecter la quantité de lumière transmise à l’extérieur du bioréacteur. La plus
71
Discussion
part de la quantité de la lumière absorbée par la culture provient de l’absorption des

chlorophylles. La chute en ce pigment provoque une augmentation de la lumière
transmise sans pour autant affecter la croissance cellulaire.
Par ailleurs, le rapport entre la biomasse et le nombre cellulaire reste stable malgré
la modification de la composition des réserves intracellulaires. Il semble que la cellule
récupère la perte de la masse d’un composant par un autre de même masse. De même ces
modifications ne semblent pas modifier la taille cellulaire puisque cette dernière reste
également constante pendent toutes les phases de l’expérimentation.
72
CONCLUSION
&
PERSPECTIVES
Conclusion et Persepctives
L’expérience nous a permis de révéler les effets de la limitation d’azote menée

dans une culture en mode continue. Au niveau de réserves carbonées intracellulaires, les
résultats montrent que la limitation d’azote, en absence d’un stress lumineuse, provoque
une diminution de la proportion de protéines et une accumulation des sucres sous formes
d’amidon. Par contre, la teneur de lipides estimé reste quasiment stable au cours de
l’expérience. Au niveau des pigments photosynthétique, la limitation d’azote provoque
une dégradation des pigments chlorophylliens mais sans induire le mécanisme de
protection photochimique exprimé généralement par l’augmentation de proportion de
caroténoïdes, et par conséquence, une décoloration de la culture est enregistrée. De plus,
à la fin de l’expérience, le photobioréacteur torique a exprimé quelques erreurs
expérimentales relatives à l’évolution de la composition pigmentaire des microalgues.
En perspectives à ce travail, on peut citer qu’à terme, le travail de l’effet de stress

nutritif devra être avancé pour d’autres éléments nutritifs afin de caractériser l’influence
de chaque élément sur l’évolution de la quantité de réserves carbonées intracellulaire. De
plus, on peut effectuer des études moléculaires plus approfondie sur la mobilisation de
pool métabolique induite par la limitation nutritif. Ainsi, la perspective d’utiliser des
souches mutantes dédiées à l’adaptation des conditions stressant de nutriment est à
envisagé.
Un travail de modélisation de l’effet de limitation d’azote sur les réserves

carbonées peut être mis en place et comparer avec les informations obtenues sur l’effet de
carence d’autre éléments nutritifs.
73
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80
ANNEXES
Annexes
Annexe A : Détermination de l’équation de régression entre la tension de générateur et l’intensité de

la lumière incidente à l’intérieur de réacteur.
Avant de lancé la culture, le photobioréacteur est démonté et placé parallèlement à la plaque

de lumière et sur des rails afin de maîtriser la distance entre la surface du réacteur et les diodes
fluorescents. Le flux incident est mesuré en son sein juste derrière la paroi de plexiglace par un capteur
quantique plan et dans huit positions différentes. Une moyenne est calculée à partir de ces points de
mesure pour une position repérés sur les rails. Et finalement, une équation de régression entre la
tension de générateur et l’intensité de la lumière incidente est établit.
• Position des points de mesure de la lumière incidente au sein de

réacteur.
L’équation de régression est : V= 0,0453 I + 4,6949 (R²= 0,9979)
voltage Linear (voltage)
30
25
y = 0,045x + 4,694
R² = 0,997
20
voltage en (V)
15
10
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Intensité lumineuse (µE s-1 m-2)
Courbe de régression entre le voltage et l’intensité lumineuse incidents.
82
Annexes
Annexe B : Interface graphique Labview / Mesure en ligne Quadstar
Interface graphique de contrôle/commande du procédé de culture de Chlamydomonas

programmée sous Labview Virtual Instruments (National Instruments).
83
Annexes
Annexe C : Composition des milieux de culture
Composition de milieu de culture autotrophe pour la microalgue Chlamydomonas
Constituants g.L-1
NH4Cl 1.45
MgSO4.7H2O 0.28
CaCl2 .H2O 0.05
KH2PO4 0.61
NaHCO3 1.68
Solution Hunter 1 mL
Composition de milieu de culture TAP par litre de milieu
Constituants g.L-1
NH4Cl 0.4
MgSO4.7H2O 0.1
CaCl2 .2H2O 0.05
KH2PO4 0.108
K2HPO4 0.056
Tris 2.42
Acide acétique glaciale 1 mL
Solution Hunter 1 mL
Composition de solution Hutner
Constituants g.L-1
Na2 EDTA 50
ZnSO4, 7H2O 22
H3BO3 11.4
MnCl2, 4H2O 5.06
FeSO4, 7H2O 4.99
CoCl2, 6H2O 1.61
CuSO4, 5H2O 1.57
Mo7O24(NH4)6, 4H2O 1.1
KOH 16
84
Annexes
Assemblage et composition du milieu de culture TAP (Tris-Acétate-Phosphate)
Solution de Beijerinck’s Solution phosphate buffer

Constituants g/L Constituants g/L
NH4Cl 8 KH2PO4 108
MgSO4.7H2O 2 K2HPO4 54
CaCl2 .2H2O 1
Solution Hutner
Eléments trace
Constituants Quantité
Solution Beijerinck’s 50 mL
Solution phosphate buffer 1 mL
Solution hunter 1 mL
Tris-base 2.42 g/L
Acide acétique (99-100%) 1 mL
85
Annexes
Annexe D : Protocole de dosage de l’amidon par le produit "STARCH ASSAY KIT" de SIGMA
STARCH ASSAY KIT
Product Code SA-20
TECHNICAL BULLETIN
Product Description 2. Glucose (HK) Assay Reagent
Enzymes, as analytical tools, have found widespread (Product Code G 3293)
use in the food, biochemical, and pharmaceutical Reconstitute the vial contents with 20 ml of water.
industry. Enzymatic methods are specific, reproducible, After addition of water, stopper the vial and
sensitive, rapid, and therefore, ideal for analytical immediately mix several times by inversion.
purposes. Due to the high specificity and sensitivity of DO NOT SHAKE.
enzymes, quantitative assays may be done on crude
materials with little or no sample preparation. This kit is Each vial when reconstituted with 20 ml of water
for the quantitative, enzymatic determination of native contains 1.5 mM NAD, 1.0 mM ATP, 1.0 unit/ml of
starch in food and other materials. hexokinase, and 1.0 unit/ml of glucose-6-phosphate
dehydrogenase with sodium benzoate and
potassium sorbate as preservatives.
Amyloglucosidase
Starch + (n-1) H2O (n) Glucose
The dry reagent is stored at 2–8 ° C. The reagent
Hexokinase should be discarded if the vial contents exhibit
Glucose + ATP Glucose-6-Phosphate + ADP caking due to possible moisture penetration, if the
vial contents do not dissolve completely upon
G6PDH
G6P + NAD NADH + 6-Phosphogluconate reconstitution, or if the reconstituted solut ion appears
turbid.
The hydrolysis of starch to glucose is catalyzed by The reconstituted reagent is stable, in the absence
amyloglucosidase. Glucose is phosphorylated by of visible microbial growth for 7 days at 18–26 ° C
adenosine triphosphate (ATP) in the reaction catalyzed and for at least 4 weeks at 2–8 ° C. The reagent is
by hexokinase. Glucose-6-phosphate (G6P) is then not suitable for use if the absorbance of the freshly
oxidized to 6-phosphogluconate in the presence of reconstituted solution measured at 340 nm versus
nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) in a reaction water as the reference is greater than 0.350.
catalyzed by glucose-6-phosphate dehydrogenase
(G6PDH). During this oxidation, an equimolar amount of 2. Starch Assay Standard
NAD is reduced to NADH. The consequent increase in (Product Code S 5296)
absorbance at 340 nm is directly proportional to the Used as a control to ensure assay reliability. Dry
glucose concentration. reagent is stable for at least 2 years stored
desiccated at room temperature. Moisture content
Reagents will vary depending on storage conditions.
1. Starch Assay Reagent
(Product Code S 9144) Equipment Required but Not Provided
Reconstitute vial with 20 ml of deionized water. Aft er 1. Spectrophotometer suitable for measuring
addition of deionized water, stopper vial and absorbance at 340 nm.
immediately mix several times by inversion. 2. Cuvettes
DO NOT SHAKE. Each vial when reconstituted with 3. Test Tubes, 13 mm X 100 mm
20 ml of deionized water contains 50 U/ml of 4. Pipettes capable of accurately dispensing 10 l to
amyloglucosidase (Aspergillus niger) and buffer 2 ml.
salts. The reconstituted reagent is stable for 7 days 5. Water bath capable of maintaining temperature at
at 18-26 ° C and for 4 weeks at 2-8 °C. 60± 1 ° C
86
Annexes
Precautions Starch Assay

This product is for R&D use only, not for drug,
household, or other uses. Please consult the Material 1. Pipette the following solutions into the appropriately
Safety Data Sheet for information regarding hazards marked test tubes.
and safe handling practices.
Tube Starch Assay Sample Deionized
Procedure Reagent (ml) (ml) Water (ml)
Sample Preparation
Starch Assay 1.0 ---- 1.0
Reagent Blank
Liquids: Use without additional preparation.
Sample Blank ----- 1.0 1.0
Solids: Grind sample to <0.5 mm (No. 40 mesh). ----- ----- 2.0
Glucose Assay
Weigh a 0.1 - 1 gram sample to 0.1 mg Reagent Blank
accuracy.
Test 1.0 1.0 ----
Use one of the methods detailed below to solubilize the
sample:
2. Mix tubes and incubate for 15 minutes at 60 ° C in a
#
Method 1 DMSO/HCl shaking water bath.
3. Remove tubes from water bath and cool to room
1. Transfer sample into a flask (100-250 ml) and add temperature.
20 ml of DMSO and 5 ml of 8 M HCl.
2. Incubate covered flask for 30 minutes at 60 ° C in a Glucose Assay
shaking water bath. Sample volume for this assay will vary depending on the
3. Add 50 ml of deionized water to flask and then adjust starch content and weight of the original sample. Pipette
pH to pH 4-5 with 5 N NaOH. a volume of solution corresponding to a glucose content
4. Cool solution to room temperature and dilute to of approximately 0.5-50 g. Repeat the assay and vary
100 ml with deionized water. the sample volume if necessary to give a ∆ A340 between
0.03 and 1.6.
Method #2 Autoclave
1. Transfer sample into a flask (100-150 ml). 1. Pipette the following solutions into the appropriately
2. With stirring, add 25 ml of deionized water. marked test tubes.
3. Check pH and adjust, if necessary, to pH 5-7.
4. Boil with gentle stirring for 3 minutes.
Tube Glucose Assay Sample Volume in l
5. Autoclave for 1 hour at 135 ° C. Reagent (ml) (Solutions from Starch Assay)
6. Remove solution from autoclave after the cycle is
complete and temperature has fallen to about 60 °C. Starch Assay 1.0 Same as for Test
Reagent Blank
7. Add deionized water to a total volume of 100 ml.
Sample Blank 1.0 Same as for Test
Glucose Assay 1.0 Same as for Test

Reagent Blank
Test 1.0 10 - 200
2. Mix tubes and incubate for 15 minutes at room

temperature (18-35 ° C).
3. Measure the absorbance at 340 nm.
87
Annexes
Calculations References
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Total Blank Bergmeyer, H.U., ed., New York, Academic Press,
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The total blank must take into account the contribution 2. MacRae, J.C., J. Sci. Fd. Agric., 25, 1465 -1469
to the absorbance of the sample, the glucose assay (1974).
reagent and the starch assay reagent. The absorbance 3. Methods of Analysis of the AOAC, 16th Edition
of the glucose assay reagent is subtracted from the (1995) section 32.2.05.
sample blank so that the absorbance of the glucose 4. Southgate, D.A.T., Determination of Food
assay reagent is only counted once in the total Carbohyrates, Applied Science Publishers, London
absorbance since it is in both the sample blank and the (1976).
starch assay reagent blank. 5. Thivend, P., et al., Methods in Carbohydrate
Chemistry, 6, 100-105 (1972).
ATotal Blank = (ASample Blank - A Glucose Assay Reagent Blank) + AStarch Assay Reagent Blank
CMH/MAM 02/05
Starch concentration
Starch concentration in mg/ml = SC
SC = (∆A) (TVSA/SVSA) (TVGA/SVGA) (Starch MW) (F)

(ε) (d) (1,000)
∆A = ATest - ATotal Blank

TVSA = Total Assay Volume from Starch Assay in ml
SVSA = Sample Volume from Starch Assay in ml
TVGA = Total Assay Volume from Glucose Assay in ml
SVGA = Sample Volume from Glucose Assay in ml
Starch MW = 162.1 g/mole or equivalently
162.1µg/ µmoles
F = Dilution Factor from Sample Preparation
= Millimolar Extinction Coefficient for NADH at 340 nm
-1 –1
Millimolar cm or equivalently (ml/ µmoles)(1/cm)
d = Light path (cm) = 1 cm
1,000 = Conversion Factor for g to mg
SC (mg/ml) = ( A) (2) (TVGA/SVGA) (162.1) (F)

(6.22) (1) (1,000)
SC (mg/ml) = ( A) (TVGA/SVGA) (F) (0.052)
Sigma brand products are sold through Sigma -Aldrich, Inc.

Sigma-Aldrich, Inc. warrants that its products conform to the information contained in this and other Sigma-Aldrich publications. Purchaser
must determine the suitability of the product(s) for their particular use. 88
Additional terms and conditions may apply. Please see reverse side of
the invoice or packing slip.
Etude en photobioréacteur torique de la microalgue eucaryote Chlamydomonas reinhardtii
en conditions de limitation par la source d’azote et l’impact sur les réserves carbonées
Résumé :
La production des métabolites par des microalgues apparaît comme intéressante dans l’optique de
la production de multiple vecteurs énergétiques capables de succéder les formes d’énergie fossiles. En
effet, la microalgue verte Chlamydomonas reinhardtii est capable de produire des réserves carbonées à
partir d’eau. Plusieurs méthodes ont été étudiées pour induire la production d’un métabolite en faveur
d’un autre, mais reste les protocoles de carence en macronutriments les plus adéquat. Le protocole de
limitation d’azote a ainsi été développé. L’objectif de ce travaille est d’étudié l’effet de limitation
d’azote sur les réserves carbonés de microalgues Chlamydomonas dans un photobioréacteur torique en
mode continue.
Les résultats montrent globalement un effet significatif de limitation d’azote qui se manifeste par
un arrêt de la croissance, une augmentation des réserves en carbohydrates sous forme d’amidon et une
baisse de la teneur en protéines. Ces effets sont réversibles, car l’augmentation de l’azote dans le milieu
induit la reprise de la croissance et la réduction des réserves carbonées. Ces modifications métaboliques
et physiologiques démontrent une versatilité et flexibilité de l’espèce qui peut modeler son activité
métabolique soit vers la croissance ou vers les mécanismes de d’adaptation aux stress azoté.
Cette capacité est intéressante sur le plan biotechnologique car on peut par des conduites adaptées de
bioprocédés favoriser la production de la biomasse riche en une réserve carbonée spécifique selon nos
besoins : protéines, carbohydrates...
Mots clés : Chlamydomonas reinhardtii, Photobioréacteur torique, limitation azoté, réserves

carbonés.
Survey in torus-shaped photobioreactor of the microalgae eukaryote Chlamydomonas reinhardtii

in conditions of limitation by the source of nitrogen and the impact on the carbon reserves
Abstract:
The production of the metabolic by microalgae appears as interesting in the optics of the production of
multiple vectors of energy capable to follow the fossil shapes of energy. Indeed, the green microalgae
Chlamydomonas reinhardtii is capable to produce some carbon reserves from water. Several methods
have been studied to induce the production of a metabolic in favor of another, but the macronutrients
starvation protocols remain the most adequate. Thus, the protocol of nitrogen limitation has been
developed. The objective of this work is to study the effect of nitrogen limitation on the carbon reserves
of Chlamydomonas microalgae in a torus-shaped photobioreactor in continuous system.
The results show a significant effect of nitrogen limitation that appears by a stop of the cell
growth globally, an increase of the reserves in carbohydrates under shape of starch and a decrease of the
content in proteins. These effects are reversible, because the increase of nitrogen in the middle induces
the resumption of the growth and the reduction of the carbon reserves. These metabolic and
physiological modifications demonstrate a flexibility of the species that can model its metabolic activity
in toward the growth or the mechanisms of adaptation to nitrogenous stress.
This capacity is interesting on the biotechnical plan because we can by adapted bioprocesses technique
to induce the production of biomass rich of a specific carbon reserves according to our needs: proteins
or carbohydrates biomass...
Key words: Chlamydomonas reinhardtii, photobioreactor, nitrogen limitation, carbon reserves.

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Rapport GC

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REPUBLIQUE TUNISIENNE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR,

Etude en photobioréacteur torique de la microalgue eucaryote

Réalisé par Mohamed BEN ROMDHANE

Devant la commission d’examen composée de :

Année Universitaire 2008/2009

La réalisation du présent travail n’aurait pas été possible sans la collaboration de

Il m’est agréable de remercier chaleureusement Madame Sabria BARKA, Maître

Au terme de ce travail, j’exprime ma gratitude et ma reconnaissance à Monsieur le

Je voudrais aussi exprimer ma reconnaissance envers Madame Maryse CHAPLAIN-

De façon plus générale, mes remerciements s’adressent à toutes les personnes du

Mes remercîments s’adressent également à tous mes collègues à l’Institut Supérieur de

ρ : Absorption en nutriment (mol.cell-1.j-1),

PARTIE : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

1. Valorisation des microalgues dans le monde 3

2. La microalgue Chlamydomonas reinhardtii 6

4. L’azote chez les microalgues 16

5.1. Système de culture ouvert 28

5.2. Système de culture clos 30

PARTIE EXPERIMENTALE : MATERIELS ET METHODES

1. Maquette d’étude : le photobioréacteur torique 38

2. Etude de la croissance sous conditions de limitation d’azote 59

Figure 2 : Schéma représentative de l’ultra structure de chloroplaste. 8

Figure 3 : Schéma d’une représentation de la structure de mitochondrie. 9

Figure 4 : Cycle de vie de la microalgue Chlamydomonas reinhardtii. 10

Figure 5 : Composants du photosystème II. 13

Figure 6 : Voie de transfert des électrons au sein de la membrane

Figure 7 : Réactions dépendantes de la lumière et réactions de Calvin. 15

Figure 8 : Processus générale de l’utilisation de l’azote par les microalgues

Figure 9 : Schéma des composants de voie de l’assimilation

Figure 10 : Accumulation de l’amidon et le lipide dans la cellule de

Figure 11 : Bassin en ˝Raceways˝ pour la production de spiruline

Figure 12 : Photobioréacteurs de type colonne Scobalit utilisé en écloserie. 32

Figure 13 : Différentes phases de croissance chez des microorganismes. 34

Figure 14 : Relation entre la productivité du système en mode continu

Figure 15 : Photobioréacteur torique. 39

Figure 17 : Mobile d’agitation sous forme d’hélice marine à trois pales 41

Figure 18 : Système de régulation du pH dans un photobioréacteur torique

Figure 19 : Système de régulation de biomasse dans un photobioréacteur

Figure 20 : Schéma générale de l’expérimentation 48

Figure 21 : Evolution de Poids sec (Cx) de Chlamydomonas et

Figure 22 : Image d’une observation microscopique d’un échantillon de

Figure 23 : Composition biochimique globale de la Chlamydomonas

Figure 24 : Evolution de la productivité (P) et le taux de dilution (D)

Figure 25 : Visualisation de changements pigmentaire de la cellule. 62

Figure 26 : Composition biochimique de la Chlamydomonas reinhardtii

Figure 27 : Composition biochimique de la Chlamydomonas reinhardtii au

Tableau I : Récapitulatif des données obtenues sur le teneur en azote. 55

Tableau II : Récapitulatif des données obtenues sur le teneur en pigments. 56

Tableau III : Récapitulatif des données obtenues sur le teneur en pigments. 57

Tableau IV : Récapitulatif des données obtenues sur le teneur en azote. 60

Tableau V : Récapitulatif des données obtenues sur les protéines 61

Tableau VI : Récapitulatif des données obtenues sur les sucres totaux 63

Tableau VII : Récapitulatif des données obtenues sur l’amidon 63

Tableau IX : Récapitulatif des données obtenues sur les pigments 64

certaines formes distinctes de réserves carbonées, selon la nature de l’élément nutritif et

Ce manuscrit décrit les différentes étapes et les principaux résultats de notre

Une revue bibliographique consacrée aux différents domaines d’application

Une troisième partie, consacrée à la présentation, l’analyse et la discussion des

Le manuscrit se termine par une conclusion et quelques perspectives.

1. Valorisation des microalgues dans le monde

1.1. Les microalgues en alimentation humaine

Plusieurs espèces de microalgues ont révélé une composition biochimique

1.2. Intérêt énergétique des microalgues