Validation de méthodes

quantitatives :
application aux techniques
séparatives
Congrès SFTA 2012
Réunion des jeunes scientifiques

Antony CITTERIO-QUENTIN
18/09/2012 Sabine COHEN
Laboratoire de Pharmaco-Toxicologie, Hospices Civils de LYON
 Réforme de la Biologie Médicale
Ordonnance du 13 janvier 2010

Accréditation obligatoire pour tous les LBM

Quand ?

1er Nov 2013 : accréditation partielle

1er Nov 2016 (2018 ?) : accréditation complète

Organisme accréditeur : COFRAC

Norme de référence : NF EN ISO 15189

Dossier
Dossier ààdéposer
déposer pour
pour 31
31octobre
octobre2012
2012
(preuves
(preuvesd’entrée
d’entréedans
dansl’accréditation)
l’accréditation)
Les documents disponibles

Norme : NF EN ISO 15189

Chapitres 5.3 et 5.5

Guides : Documents COFRAC

SH GTA 04 : validation de méthodes

SH GTA 14 : incertitudes de mesure

SH FORM 43, 44 : trames à suivre

Recommandations des sociétés savantes, groupes de travails,

publications…

Aide à la validation des méthodes en Toxicologie et Suivi Thérapeutique Pharmacologique,
Ann Toxicol Anal. 2005; XVII, sup 1

Guideline on bioanalytical method validation, Committee for Medicinal Products for Human
Use (CHMP), Février 2012

Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation,FDA, May 2001

Rédiger
Rédiger une
uneprocédure
procédurede
devalidation
validationde
deméthodes
méthodes
Exigences de la Norme 15189

NF EN ISO 15189 § 5.5.2 :

« Le laboratoire doit utiliser uniquement des procédures
validées pour s’assurer qu’elles conviennent à
l’utilisation prévue »

« Les validations doivent être aussi approfondies que
nécessaire pour répondre aux besoins de l’application
ou du domaine d’application concerné »
 Constitution du dossier : 5 parties

Décrire la méthode

Définir les performances à évaluer et les limites acceptables

Recommandations des sociétés savantes, groupes de travail,
publications…

Réaliser la vérification bibliographique

Avoir les publications à dispositions

Réaliser la vérification expérimentale dans le laboratoire et
l’exploitation des résultats

Conserver l’ensemble des données brutes et enregistrements

Préciser le ou les opérateurs, la période d’évaluation

Conclure concernant l’aptitude de la méthode

Nom et signature de la personne autorisant la mise en service de la
méthode

La date de mise en service

SH
SHforme
forme43
43(techniques
(techniquesquantitatives)
quantitatives)
SH
SHforme
forme44
44(techniques
(techniquesqualitatives)
qualitatives)
Portée A ou portée B ?

Portée A = vérification d’1 méthode fournisseur

Portée B = validation d’1 méthode adaptée ou
développée

Méthodes de type quantitatif

résultat chiffré,

sur une échelle continue.

Sont également assimilés au type quantitatif,
 un résultat de type qualitatif,
 avec interprétation par rapport à un seuil.

Méthodes de type qualitatif

Pharmaco-Tox ?
 Savonettes?
Type Quantitatif
Spécificité analytique

Guide SH GTA 04

« Capacité d’un système de mesure, utilisant une
procédure de mesure spécifiée, à produire des
résultats de mesure, pour un ou plusieurs
mesurandes, qui ne dépendent ni les uns des autres
ni de toute autre grandeur dans le système soumis
au mesurage »

Propositions

A rattacher aux interférences ?

Rien au niveau de la SFTA
Interférences

Guide SH GTA 04

Rien

Difficultés

Quels interférents : produits endogènes (Hb, Bt, Lipides…), d’autres
médicaments, métabolites, produits de dégradations…

Sur quels niveaux de concentrations de l’analyte ?

Et pour quelles concentrations d’interférents ?

Propositions

FDA 2001
 interférences à tester pour une concentration en analyte proche de la LOQ

SFBC
 Effet de l’hémolyse, lactescence, ictère évalué par protocole de surcharge, décrit
dans « Recommandations pour l’accréditation des laboratoires de biologie médicale
(tome 1p 281) »

Définir la conduite à tenir en fonction de l’intensité de l’interférence
Évaluation de la répétabilité

Guide SH GTA 04

Au minimum 2 niveaux de concentration dont 1 niveau proche du seuil décisionnel

30 répétitions d’un même échantillon (si moins : justification)

Sur chaque matrice

Interprétation et conclusion en fonction des limites acceptables

Difficultés

n = 30 : monopolisation de l’instrument pendant plusieurs heures voir plusieurs
jours…

Quelles sont les limites acceptables ?

Propositions

SFTA
 n ≥ 6, 2 niveaux
 Pool de sérum, ou une matrice (pool sérum négatif (CTS), Drug Free) surchargée (+/-
CQI)

FDA 2001
 5 répétitions au minimum de 3 niveaux de concentrations (bas (3xLOQ), moyen
(milieu de gamme) et haut (proche du point le plus haut de la gamme)

EMA 2012
 5 mesures de 4 concentrations (LOQ, bas, moyen, haut) dans une même série
 Critères d’acceptation : CV< 15 % sauf pour la LOQ < 20 %
Évaluation de la fidélité intermédiaire

Guide SH GTA 04

Similaire à la répétabilité
 Sur au minimum 15 j

Difficultés

Rythme de passage des CQI
 Si une série par semaine : 15 semaines : stabilité des CQI ?

Quelles sont les limites acceptables ?

Propositions

SFTA
 n ≥ 6, 2 niveaux
 cet essai pourra éventuellement être mené après l'installation du système analytique si et seulement
si, les autres spécifications sont bien atteintes »

Pool de sérum, une matrice (pool sérum négatif (CTS), Drug Free) surchargée, CQI :
 problème de la stabilité

FDA 2001
 Critères d’acceptation CV< 15% sauf pour la LOQ < 20 %

EMA 2012
 au moins 3 mesures sur 2 jours différents de 4 concentrations (LOQ, bas, moyen, faible)
 critères d’acceptabilité : < 15% sauf pour LOQ < 20%
Évaluation de la justesse

Guide SH GTA 04

Des matériaux de référence certifiés (rarement réalisable)
Et/ou

Échantillons de contrôle titrés ou CIQ externalisés
ET/ou

EEQ (inexactitude)

Difficultés

Absence de CIQ externalisés

EEQ rares (1 à 2 enquêtes par an, 1 seul niveau), peu de participant, ou absents

Propositions

Si EEQ : inexactitude (comparaison par groupe de pairs ou toute technique ou cible
théorique ?)

Si absence d’EEQ : échanges d’échantillons inter-laboratoires (comparaison de méthodes)

FDA 2001, EMA 2012
 5 mesures d’un étalon certifié (4 concentrations : LOQ, bas, moyen, haut) dans une même série
d’une matrice chargée avec une solution indépendante de la solution utilisée pour réaliser la gamme
de calibration et comparer les résultats obtenus par rapport à la charge théorique
 Critères d’acceptabilité : écart à la valeur cible < 15% sauf pour LOQ < 20%
Intervalle de mesure : limite de
détection

Guide SH GTA 04

30 mesures répétées d’un blanc

Calcul de la moyenne + Sd

LD = m + 3 Sd
Remarque : En chromatographie, la limite de détection peut être déterminée comme étant égale au
triple de l’écart-type obtenu à partir du signal correspondant à la ligne de base mesuré 10 fois.

Difficultés

n = 30 : monopolisation de l’instrument

Techniques avec absence de signaux sur les blancs

Ne reflète pas la réalité en techniques séparatives la LOD varie d’un jour à l’autre
 mieux en fidélité intermédiaire ?

Propositions

SFTA
 « une limite de détection peut-être déterminée par excès et correspondre à la limite de
quantification »

Estimation de la LOD
 Faire plusieurs courbes d’étalonnage : calculer le sd de l’intercept et appliquer
 LD = 3.3 (sd)/pente de la courbe d’étalonnage
Intervalle de mesure : limite de
quantification

Guide SH GTA 04

Similaire à la LOD

LQ = m + 10 Sd

Ou : Par dilution d’un étalon ou CIQ

11 échantillons mesurés 10 fois dans une série unique : courbe CV en fonction des
concentrations
 LQ : CV inférieur à 10 %

Difficultés

Même que pour la LD : absence de signal, fidélité intermédiaire

Nombre d’échantillons considérable

Propositions

SFTA
 réaliser des dilutions du calibrateur ou de l'échantillon de Contrôle de Qualité Interne le plus bas
(différent de 0) avec le blanc échantillon, jusqu'à satisfaire la limite d'acceptabilité dans les mêmes
conditions que les études de fidélité (n ~ 6)
 Limite de quantification = valeur pour laquelle le CV et l'écart à la valeur théorique sont inférieurs à la
limite d'acceptabilité

EMA 2012
 par vérification d’une LQ définie a priori, avec un CV et un écart à la valeur théorique inférieurs à la
limite d’acceptabilité (ex CV< 20% et écart de +/- 20 %). Le signal de la LOQ doit être au moins 5 fois
supérieur au signal du blanc.

FDA 2001
 5 mesures dans des séries différentes d’une matrice chargée à la LOQ et CV< 20%

Estimation : LOQ = 10Sd/Pente
Limites de linéarités

Guide SH GTA 04

« Après la dilution d'un échantillon de concentration très élevée, les résultats obtenus
permettront de vérifier la linéarité entre les dilutions effectuées et les concentrations
calculées (s'assurer de l'adéquation du diluant nécessaire et des pipettes utilisées).

La limite supérieure de linéarité et la limite de quantification permettent de définir le
domaine de mesure de la méthode. »

Propositions

A partir d’un échantillon fortement concentré (ou surchargé en analyte) et diluant adéquat

Réaliser une série de dilutions selon le schéma : 100+0 - 90+10 ….0+100, définir le nombre X de dilutions
selon l’analyte

Analyser chaque dilution en triple (au minimum) dans des séries différentes

Calculs : moyenne et écart type, % valeur théorique

Tracer la courbe en abscisse dilution / en ordonnée % valeur de la valeur théorique

Définir le % théorique d’acceptation.

Ou Test de Student pour chaque pour chaque point de mesures.

Tester modèles linéaire et quadratique et voir si similaire : calcul avec analyse de la variance
 Si similaire = technique linéaire jusqu’au point le plus haut testé
Contamination inter-échantillons

Guide SH GTA 04

Après rinçage de l'appareil, un échantillon à valeur élevée est analysé 3 fois
consécutivement (H1, H2, H3, de moyenne mH) suivi d'un échantillon à valeur basse
également analysé 3 fois (B1, B2, B3).

Les séquences (H1, H2, H3, B1, B2, B3) peuvent être répétées plusieurs fois (5 fois)
 La différence statistiquement significative entre les 2 moyennes pourra être établie à l'aide
d'un test « t » de Student avant de procéder au calcul du pourcentage de contamination inter
échantillons.

Le pourcentage de contamination entre les échantillons est calculé selon la formule
suivante :

Contamination
Contaminationen
en%
%==(mB1-mB3)
(mB1-mB3)xx100/
100/(mH-mB3)
(mH-mB3)

Proposition

Séquence répétée 3 fois voir 1 seule fois pour la SFTA
 Contamination en % = (B1-B3)/mH x 100

Interprétation D < 2.8 Sr/Vn (norme ISO 5725-6)

EMA 2012
 la contamination ne doit excéder 20% de la LOQ
Stabilité des réactifs

Guide SH GTA 04

Évaluation des la stabilité des réactifs sensibles

Analyser un étalon (de stabilité connue) de concentration élevée à intervalle
régulier entre J1 et Jn (minimum 10 valeurs entre J1 et Jn)

Définir des limites de stabilité théorique adaptées à chaque analytes
 Tracer le graphe avec en abscisse les jours et en ordonnée le % de variation
 Définir le % théorique d’acceptation

Difficultés

Qu’est ce qu’un réactif sensible ?

% théorique d’acceptation ?

Proposition

Évaluer la stabilité des étalons :
 SFTA :
 en analysant, à échéance d’un délai fixé de stabilité, une nouvelle solution étalon dont
les caractéristiques analytiques sont comparées à la solution étalon arrivée à
péremption
Les critères d’acceptabilité sont fixés par le laboratoire pour chaque type d’analyte.
Stabilité des analytes

Guide SH GTA 04

Rien

Difficultés

Pb de la conservation (décanté, +4°C, -20°C…)
 Littérature : non testée ou par des surcharges

Pb du type de prélèvement (sérum, plasma…)

Pb des métabolites

Pb de volume si essais sur des patients pour refaire plusieurs analyses

Stabilité de l’analyte, de ses métabolites et de l’EI après la préparation

de l’échantillon (pour ré-analyse si besoin)

Proposition

Protocole décrit dans le FDA 2001?

Et dans l’EMA 2012 ?
Robustesse

Guide SH GTA 04

Rien

Proposition

Si nécessaire, à vérifier en faisant varier les facteurs d’influence
de la méthode afin d’évaluer leur impact sur les résultats : cela
consiste à faire varier de façon contrôlée divers paramètres du
mode opératoire (un à la fois) dans les limites normales
d’utilisation (utilisation d’un plan d’expérience pour optimiser les
essais )
Intervalles de références

Guide SH GTA 04

Les valeurs de référence (ou intervalle de référence) sont vérifiées le cas échéant et si
possible, par la bibliographie et/ou par le calcul statistique. Si la distribution de la population
est gaussienne, le calcul peut se faire de la manière suivante :

après une période d'utilisation permettant d'obtenir un nombre de valeurs significatif (n >
100),
 à partir de patients exempts de pathologie (si possible), en écartant les valeurs aberrantes,
 Ecarter toutes les valeurs > m + 2s et < m – 2s,
 Recalculer la moyenne (moyenne tronquée) mt et l'écart-type (écart-type tronqué) st à partir des
valeurs ainsi retenues,

Les valeurs de référence seront données par l'intervalle [ mt – 2st ; mt + 2st ].

Difficultés

Rarement possible au laboratoire en pharmaco-toxicologie

Propositions

Références bibliographiques : attention doivent être revues périodiquement

Lesquelles choisir ?

Source TIAFT pour la toxicologie ?
Comparaison de méthodes

Guide SH GTA 04

Cette comparaison ne peut intervenir qu'après la vérification des 2
méthodes

Au moins 30 échantillons de patients couvrant de façon homogène
l'étendue du domaine

Ces échantillons, frais de préférence, sont analysés en simple par les
2 techniques, dans un délai le plus court possible.

Les résultats sont examinés au fur et à mesure, avec vérification des
discordances

Pour chacun des couples retenus xi (méthode X) et yi (méthode Y) :

 Calculer les différences di = xi – yi
 Calculer les rapports xi = yi / xi
 Tracer graphiquement di et qi en fonction de xi
 Comparaison de méthodes

Quelles limites ?

Limites de suivi sur les di (formule issue de la
SFBC)
 LS = +/- 3V(SriA²+SriB²)

NF ISO 13528 :
 Calculer le nombre En pour chaque couple (xi;yi)
 Pas de discordance s’ils sont inférieurs ou égaux à 1
En = (xi-yi)/(V(U²xi+U²yi)
Comparaison de méthodes

Propositions

SFTA
 Analyses statistiques

EMA 2012,
 Passer en double des CQ et des patients,
 Limites acceptables : la moyenne du biais :
 +/- 15 % pour les CQ et +/- 20% pour au moins 67% des patients.

Test t sur échantillons appariés + Bland Altman

Autres performances

Guide SH GTA 04

Rien

Propositions

En fonction des méthodes et des mesurandes
 Effets matrices
 Procédure EMA 2012
 Rendements d’extraction
 Sur plusieurs niveaux de concentrations, combien de
répétitions
 Critères d’acceptabilité ?
Questions diverses

Calibrations

Sur pool neg

Sur drug free

Combien de points ?
 FDA 2001, EMA 2012, au moins 6 points incluant la LOQ
plus un blanc (matrice seule) et un zéro (matrice avec EI).

Une calibration pour chaque dosage :
 l’accepter en calculant les nouveaux points sur l’ancienne
calibration et accepter +/- 15 % de déviation sauf pour la
LOQ +/- 20 %.

Calcul sur un cumul de calibrations

Calcul avec des CR
Incertitudes de mesure

Guide SH GTA 04:

CVV
Incertitudes de mesure

Guide SH GTA 04:
4 méthodes:

Méthode « GUM »: méthode de référence
 identifier les composantes d’incertitude, les modéliser, et les
quantifier
 Calcul par des méthodes stat prenant en compte toutes les
composantes
 Inconvénients : démarche longue, toutes les composantes
sont rarement disponibles en BM
Incertitudes de mesure

Guide SH GTA 04:
4 méthodes:

Méthode « intra laboratoire (CIQ + matériaux de
référence) »
 Exploitation des caractéristiques évaluées lors de la validation
de la méthode: répétabilité, fidélité intermédiaire, justesse,
incertitude d’étalonnage => nécessité d’avoir l’incertitude de
l’étalon (donnée fournisseur)

Méthode « CIQ/EEQ »:
 Exploitation des données des CIQ et des EEQ (ou à défaut
des CIQ externalisés)

Méthode « CIQ + Etalon fournisseur »
incertitude de l’étalon = donnée fournisseur
Incertitudes de mesure

Propositions :

SFTA : méthodes

 « Intra laboratoire CIQ + matériaux de référence »

 Ou « CIQ / EEQ »

EMA 2012, FDA 2001: rien

Difficultés :

Cas où pas d’étalon de référence ni d’EEQ ou de CIQ
externalisé

Cas des dépistages immunologiques: EEQ mais pas
d’exploitation possible du signal
Norme NF ISO 15189 §5.6.2 : « Le laboratoire doit déterminer
l’incertitude des résultats dans le cas où cela est pertinent et
possible »
=> Peut on s’affranchir du calcul d’incertitude ?
Cas particulier du criblage toxicologique
par chromatographie

Problèmatique

Grand nombre de composés

2 aspects:
 Si identification seule (urines): méthode qualitative ?
 Si identification + quantification: meth. Quantitative ?

Caractère d’urgence dans certains cas en

toxicologie clinique
 Cas particulier du criblage toxicologique
par chromatographie

SH GTA 04 :
dans le cas de la validation d’une méthode qualitative en portée flexible B:
« La spécificité analytique et la sensibilité diagnostique sont les paramètres
essentiels à maîtriser. Leur surveillance passe :
- Par la comparaison des résultats obtenus avec d’autres méthodes
complémentaires ou des techniques de références mises en œuvre pour vérifier les
premiers résultats.
- Par l’étude des CIQ et EEQ (performances du laboratoire, comparaison avec les
autres méthodes) »
« Pour maîtriser une technique, l’utilisation, la gestion et le suivi de CIQ et EEQ
sont indispensables »

Pas de CIQ ni d’EEQ pour tous les composés

 Cas particulier du criblage toxicologique
par chromatographie

Annales de Biologie Clinique, Août 2012,

Recommandations pour la prescription, la réalisation et l’interprétation
des examens de biologie médicale dans le cadre des intoxications
graves
Mireille Bartoli, Claudette Berny, Vincent Danel, Arnaud Delahaye, Gérard Desch, Jérôme Guitton, Bruno
Lacarelle, Frédéric Lapostolle, Daniel Mathieu, Bruno Mégarbane, Patrick Nisse, Anton Szymanowicz,
Bernard Capolaghi
(SFTA, SFBC, STC, SRLF, SFMU, CNBH)

Réactualisation des pratiques professionnelles dans la prise en

charge des intoxications graves

=> liste de 55 composés à l’origine des principales intoxications

graves
Cas particulier du criblage toxicologique

- pas de réel intérêt pour

la prise en charge
immédiate du patient
- Sauf pour l’orientation
du patient
- Expérience => intérêt
pour le diagnostic et le
pronostic
- Quelles sont les familles
pharmacologiques
nécessitant un criblage
quantitatif ?
Cas particulier du criblage
toxicologique

En conclusion:

Peu de laboratoires de toxicologie clinique
réalisent des criblages toxicologiques

Rien d’écrit sur la validation de ces méthodes de
dépistage toxicologique (M. immuno et chromato)

Accréditeurs COFRAC : pas de référence

Ecriture d’une procédure de validation = Travail

de ce groupe ?