REGULATION DE LA FIXATION SYMBIOTIQUE D’AZOTE

1. ETABLISSEMENT DE LA SYMBIOSE LEGUMINEUSE‒RHIZOBIA (NODULE)

Les nodules constituent de petites boursouflures se formant sur les racines de nombreuses
légumineuses sous l'action des rhizobia selon les étapes suivantes (Figure 1) :
i) Les racines sécrètent des substances chimiques de type flavonoïde et isoflavanoïde, qui attirent les
rhizobia du voisinage.
ii) En réponse, les bactéries synthétisent et émettent des facteurs de nodulation, dits facteurs nod.
iii) Sous leur action, les poils absorbants changent leur direction de croissance et forment une structure en
crosse de berger, qui enferme les rhizobia.
iv) Les bactéries peuvent ainsi pénétrer dans l'écorce (parenchyme cortical), via un filament d’infection.
v) Au même moment, la racine commence à répondre à l'infection par une division des cellules de l'écorce et
du péricycle du cylindre central.
iv) Les vésicules contenant les bactéries bourgeonnent dans les cellules de l'écorce à partir de l'extrémité du
filet infectieux ramifié.

Figure 1. Les différentes étapes de formation du nodule racinaire

2. LES NODULES SONT DES VRAIS PUITS POUR LE SACCHAROSE

Les nodules racinaires, qui sont capables de fixer l’azote, sont de véritables « usines » pour le
métabolisme carboné et azoté. Bien que ces organes ne représentent généralement que 5 % de la biomasse
totale d’une légumineuse, ils peuvent catalyser la réduction de plus de 100 Kg N/ha chaque année, et
consomment 13-28% de la totalité des photoassimilats. Cette utilisation accrue de C est due au fait que la
réduction de N2 en ammonium nécessite un apport énergétique considérable (Equation ci-dessous). En se
basant sur la moyenne de plus de 30 études, une légumineuse peut dépenser 6 à 7 g de carbone par g d’azote
réduit.

N2 + 16 ATP + 8e- + 10 H+ → 2NH4+ + H2 + 16 ADP + 16 Pi

La puissance du puits nodulaire est vraisemblablement plus importante par comparaison avec celle
des méristèmes, siège de forte activité de croissance. Ainsi, au stade floraison, lorsque l’activité de fixation
1
d’azote est élevée, la croissance végétative est ralentie (malgré une activité photosynthétique importante) à
cause de l’importation des assimilats par les nodules. Les essais de transport du 14C-saccharose fournissent
une autre preuve de la forte priorité des nodules par rapport aux autres organes végétatifs pour le saccharose.
Ainsi, lorsqu’il est appliqué à la surface des feuilles sources, le 14C-saccharose est importé plus rapidement
par les nodules alors que les autres organes végétatifs en croissance tels que les feuilles jeunes et les
extrémités des racines ne manifestent aucune variation durant les 3 premières heures après l’application du
14
C-saccharose.

En condition de salinité, le manque de l’approvisionnement des nodules en photoassimilats ne serait

pas la cause de la réduction de l’activité fixatrice d’azote puisque la réduction de ce processus était beaucoup
plus prononcée par comparaison avec celle de l’assimilation photosynthétique (réduction de 90% contre
20%). Cependant, il a été suggéré que la réduction de l’activité photosynthétique chez les deux plantes
modèles Medicago truncatula et Lotus japonicus serait à l’origine d’une réduction du flux du saccharose vers
les nodules.

3. MÉTABOLISME CARBONÉ NODULAIRE

La détermination des sucres au niveau des nodules après exposition des plantes au 14CO2 montre que
le saccharose qui dérive de la photosynthèse est toujours le sucre le plus abondant dans les nodules. Il a été
supposé dans le temps que l’utilisation du saccharose se faisait essentiellement grâce à l’invertase
neutre/alcaline (IN/A) bien que l’activité de l’invertase acide était présente. C’est après qu’on a mis en
évidence l’activité de la saccharose synthase (SS) dont l’augmentation coïncide avec le début de la FSN.
Durant la FSN, ces deux enzymes, notamment la SS, jouent un rôle important dans le clivage du saccharose.
Ces deux enzymes ont une faible affinité pour le saccharose (10-30 mM). La première enzyme hydrolyse le
saccharose en glucose et en fructose alors que la SS catalyse le clivage du saccharose en fructose et UDP-
glucose.

Photosynthèse

SS Saccharose IN

UDP-Glucose
Fructose Glucose
Glucose-1PO4 Glucose-6PO4

Glucose-6PO4 Fructose-6-PO4

Glycolyse

PYR PEP + CO2

PEPC

Cycle Oxaloacétate AAT

MDH
TCA
Malate Aspartate Asparagine

Bactéroïdes
N2 NH3

Figure 2. Le métabolisme carboné nodulaire est fortement lié à la fixation d’azote par les
bactéroïdes et l’assimilation de N fixé en acides aminés (Vance, 2008).

2
 Bien que cette enzyme soit capable de synthétiser le saccharose dans des conditions appropriées in
vitro, elle est principalement impliquée in vivo dans la réaction de sa dégradation. La majorité des plantes ont
au moins deux isoformes qui présentent une forte homologie de séquence et des propriétés biochimiques
similaires. La SS est localisée dans le cytoplasme et est, selon son état de phosphorylation, soluble ou
attachée aux membranes (par exemple au complexe cellulose synthase au niveau de la membrane plasmique)
ou aux filaments d’actines (Figure 3)

L’invertase clive le saccharose en deux monosaccharides (glucose et fructose). Trois isoformes

d’invertase sont reconnues chez les plantes : l’IN/A, l’invertase vacuolaire (IV) et l’invertase pariétale (IP).
L’IN/A a un pH optimum neutre ou alcalin (6.8 – 8.0) et réside dans le cytoplasme. L’IV et l’IP sont des
invertases acides qui ont les mêmes propriétés enzymatiques et biochimiques et présentent une importante
homologie de séquence. L’IV, appelée aussi invertase acide soluble, a un pH optimum acide (pH 5.0 – 5.5) et
est localisée dans la vacuole. Elle détermine le niveau du saccharose emmagasiné dans la vacuole et sa
remobilisation pour les processus métaboliques et est impliquée dans la division et la croissance
cellulaire. L’IP, aussi appelée invertase extracellulaire ou apoplasmique, a un pH optimum faible (pH 3.5 –
5.0) et est associée à la paroi cellulaire. L’IP clive le saccharose déchargé du phloème dans l’apoplasme et
les hexoses qui en résultent sont transportées dans les cellules puits via des transporteurs d’hexoses (Figure
4). Les différentes invertases contrôlent divers aspects de la croissance et du développement (osmo-
régulation, ajustement osmotique, expansion cellulaire) depuis l’expression des gènes jusqu’à l’allocation à
longue distance du saccharose.

Figure 3. Localisation sub-cellulaire de la

saccharose synthase. A) SS peut s’associer
avec le complexe cellulose au niveau de la
membrane plasmique. B) cette caractéristique
biochimique facilite le transfert direct de
l’UDP-glucose formé par la réaction de la SS
pour la biosynthèse de la cellulose. C) la SS
peut aussi s’associer avec d’autres membranes
et /ou l’actine. Les rôles de cette enzyme sont
la biosynthèse de la paroi cellulaire (au niveau
de la membrane plasmique et l’appareil de
Golgi), la biosynthèse de l’amidon (au niveau
des plastes) et probablement dans la
compartimentation de saccharose et/ou sa
mobilisation (au niveau du tonoplaste ou du
phloème).

3
 Figure 4. Voie de décharge de phloème et sites de clivage du saccharose. Selon la voie d’entrée
du saccharose dans la cellule puits (voie apoplasmique ou symplasmique), le saccharose peut être
clivé par l’inverase pariétale (IP), invertase cytoplasmique (IA/N), saccharose synthase (SS) ou
l’invertase vacuolaire (IV). F, fructose ; G, glucose.

Les hexoses sont métabolisées via la glycolyse en phosphoénolpyruvate (PEP) qui peut soit être
converti en pyruvate pour intégrer le cycle TCA ou alternativement en oxaloacétate par la PEP carboxylase.
L’oxaloacétate joue un rôle central au niveau des nodules. Il peut i) être réduit en malate par la malate
déshydrogénase pour fournir le carbone pour les bactéroïdes et ii) fournir le squelette carboné pour la
biosynthèse de l’aspartate à travers l’aspartate aminotransférase.

Sous contrainte saline, l’inhibition de l’activité de la nitrogénase est expliquée par un manque de
l’approvisionnement des bactéroïdes en substrats énergétiques probablement suite à la réduction des activités
des enzymes sucrolytiques nodulaires particulièrement celle de la SS. La tolérance du processus de la FSN
semble généralement associée au maintien d’une activité importante de cette enzyme permettant un bon
approvisionnement des nodules en acides organiques.

4. Les métabolismes carboné et azoté constituent deux unités inséparables dans une véritable usine
pour la fixation de N2

Les acides organiques qui sont synthétisés au cours du catabolisme du saccharose importé des parties
aériennes fournissent, en plus de l’énergie et du pouvoir réducteur nécessaires aux bactéroïdes pour la
fixation de N2, le squelette carboné pour l’assimilation de l’azote fixé. Ainsi, le marquage des racines
nodulées soit avec 15N2 ou 14CO2 montre le schéma d’incorporation dans la figure 5. Le 15N2 ou 14CO2 est
rapidement incorporé en NH4+ et après en acides aminés particulièrement la glutamine, le glutamate,
l’aspartate, l’asparagine et l’alanine (Figure 6)

15N 15NH +
2 4
14C15N acide aminé
14CO 14C-acide organique
2

Figure 5. Schéma d’incorporation de 14CO2 et 15N2 dans les acides aminés au niveau des nodules

Les études indiquent que chez les espèces tempérées, telle que Medicago et le petit pois, les premiers
produits contenant l’azote fixé et qui sont exportés en dehors des nodules dans le flux de xylème sont les
amides asparagine et glutamine. Cependant, chez les espèces tropicales comme le soja et l’haricot, l’azote
fixé est d’abord incorporé en asparagine, aspartate, glutamine et glutamate, mais qui sont par la suite

4
métabolisés au niveau des nodules en uréides, allantoine et acide allantoique, qui sont après transportés dans
le flux xylémique (Figure 7).

La glutamine synthétase (GS, EC 6.3.1.2) et la glutamate synthase (NADH-GOGAT, EC 1.4.1.14) se

rapportent généralement au cycle GS/NADH-GOGAT (Figure 8) et catalysent la synthèse de glutamine et de
glutamate, respectivement. Une autre incorporation de l’azote fixé en aspartate et asparagine se fait via
l’aspartate aminotransférase (AAT, EC 2.6.1.1) et l’asparagine synthétase (AS, EC 6.3.5.4). Le squelette
carboné nécesssaire pour l’assimilation de NH 4+ en aspartate et asparagine dérive en partie du clivage du
saccharose via la SS et la glycolyse des hexoses en phosphoénolpyruvate (PEP) suivie par la synthèse de
malate à travers la PEPC et la MDH. Le squelette carboné pour la synthèse du glutamate et de la glutamine
dérive de α-ketoglutarate à travers le cycle TCA (Figure 8). Les amyloplastes des cellules infectées semblent
jouer un rôle majeur dans la synthèse de glutamate, aspartate et la synthèse de novo des purines (xanthine).
Chez les légumineuses transporteuses d’ureides, la xanthine est métabolisée en acide urique dans la cellule
infectée. Ce dernier est transporté dans les cellules non infectées et métabolisé en allontoine et en acide
allontoique qui sont exportés vers les parties aériennes. Les cellules non infectées sont aussi le site de
métabolisme carboné, mais les voies et les enzymes impliquées restent à établir.

Saccharose

UDP-glucose D-fructose

D-glucose-6-P Fructose-6-P

Fructose-1,6-P

DHAP Glycéraldéhyde-3-P

Glycérate-1,3-P
Glycine
L-Sérine Glycérate-3-P
L-Cystéine
Glycérate-2-P
L,L-Cystathionine

L-Homocystéine Phosphoénolpyruvate
Erythrose-4-P L-Leucine
L-Méthionine Pyruvate L-Valine
Shikimate L-Isoleucine
Panthoténate
L-Tryptophane Acetyl-CoA
L-Thréonine
L-phenylalanine L-Alanine
L-Méthionine
Citrate
L-Méthionine Oxaloacétate L-Homosérine
L-Lysine
Aconitate
L-Asparagine
L-Malate Isocitrate L-Aspartate β-Alanine
TCA
2-Ketoglutarate L-Histidine
Fumarate Oxaloacétate
ATP
Succinyl-CoA L-Glutamate L-Glutamine
N2 N2ase Succinate
L-Proline
Ornithine L-Arginine
NH3 NH4+
Symbiosome Urée
4-Aminobutyrate Citruline

Figure 6. Schéma de la principale voie métabolique de la biosynthèse des acides aminés se déroulant
dans le cytosol, les symbiosomes et les plastides des cellules infectées nodulaires

5
 Uréides Amides

O
H H2 N NH2
H2 N C N
H2 N H2 N
C O O C COOH C O H H
O C
C N C CH2 C COOH C CH2 CH2 C COOH
HN C NH
N N H O O
H NH2 NH2
H

L’allontoïne L’acide allantoïque L’asparagine La glutamine

Exemples: soja, haricot

Morphologie des nodules: déterminé (sphétrique) Exemples: medic, le trèfle, le petit pois, le lupin
Morphologie des nodules: indéterminé (cylindrique allongé)

Figure 7. Les produits azotés primaires synthétisés et exportés en dehors des nodules. Les ureides sont les produits
de transport au niveau des nodules à croissance déterminée de soja et de l’haricot alors que les amides sont les
produits de transport au niveau des nodules à croissance indéterminée de Lupin, Medicago, Trifolium et Pisum
(notez que les nodules de Lotus qui sont à croissance déterminée synthétisent et exportent les amides).

Figure 8. Schéma général des métabolismes carboné et azoté au niveau des nodules.

Il est généralement admis que le stress salin inhibe les activités de la GS, NADH-GOGAT et AAT
au niveau des nodules de petit pois, la fève et l’haricot bien qu’il a été récemment montré une stimulation de
l’activité de la GS (même aux fortes concentrations de sel) et de celle de la NADH-GOGAT (en présence de
concentrations modérées de sel). Tout ces travaux suggèrent que l’activité de la NADH-GOGAT est plus
sensible au sel que celle de la GS ce qui suggérerait que c’est la première enzyme qui limite l’assimilation de
NH4+ en condition de salinité. Les données récentes montrent que le contrôle de ces deux enzymes par le sel
se fait au niveau transcriptionnel. L’activité de la GDH semble plutôt insensible au sel et elle est même
stimulée en présence de faibles doses. Selon la même étude, l’activité de cette enzyme pourrait remplacer la
voie GS/NADH-GOGAT dans l’assimilation de NH4+.

6
1.4. Le métabolisme carboné contrôle le fonctionnement de la barrière à la diffusion d’O 2

La FSN, tout comme la réduction des nitrates, est un processus énergétique ayant un produit final
toxique qui est le NH4+. A cause de ce fait, la plante doit bien contrôler ce processus. Dans le cas de la
réduction des nitrates, ce contrôle est assuré au niveau de l’expression des gènes codant pour la nitrate
réductase. Cependant, dans le cas de la fixation de N 2, il serait impossible pour la plante de contrôler
l’expression des gènes codant pour la nitrogénase, qui sont plutôt sous le contrôle de la bactérie, ou
d’évacuer l’air des tissus nodulaires. La plante a une autre alternative à travers le contrôle du flux d’O 2 vers
la zone fixatrice d’azote.

Ainsi, le nodule se présente comme une structure complexe avec différents types cellulaires et
différentes zones physiologiques et fonctionnelles (Figure 9). La concentration d’O 2 joue un rôle dans
l’établissement de ces zones-là et, par conséquent, leurs activités métaboliques. La concentration d’O 2 au
niveau du cortex externe se trouve à des concentrations normales pour les tissus de la plante. Autour de la
zone infectée, au niveau du cortex, il y a une couche endodermique ayant des parois subérifiées. En plus de
l’hémoglobine (agissant en tant qu’un tampon d’O2, maintenant ainsi une faible pression partielle d’O 2), cette
couche agit en tant qu’une barrière à la diffusion d’O 2 et réduit la pression de l’O2 à l’intérieur de la région
infectée du nodule aux alentours de 10 nM O2 permettant ainsi un bon fonctionnement de la nitrogénase.

(A) (B)

IZ
Co Co nodule
SZ endodermis
CI CI

Figure 9. Représentation schématique d’une coupe longitudinale au niveau d’un nodule à croissance
indéterminée (A) et à croissance déterminée (B). La zone infectée (IZ) et la zone sénéscente (SZ) sont
entourées par un endoderme séparant le cortex externe (Co) et le cortex interne (Ci). Les tissus vasculaires
sont localisés entre les deux cortex. Le tissu méristématique (M) permet une croissance continue du nodule.

La présence d’enzymes telles que l’anhydrase carbonique, la PEPC, la SS au niveau du cortex

interne a amené plusieurs auteurs à suggérer que, certaines, ou la totalité de ces enzymes sont impliquées
dans le fonctionnement de la barrière à la diffusion d’O 2. Ainsi dans le cas de l’anhydrase carbonique, des
chercheurs ont détecté une activité importante de l’anhydrase carbonique au niveau des nodules de plusieurs
légumineuses telles que le soja, Vigna ainsi que le lupin. Ces mêmes auteurs ont aussi localisé la protéine
codée par Msca1 au niveau de la zone infectée et du cortex interne des deux types de nodules (déterminé et
indéterminé). Ainsi, il a été suggéré que les cellules du cortex interne peuvent se comporter comme les
cellules stomatiques et dépendent ainsi de la synthèse du malate à travers la PEPC. Ils ont par la suite
envisagé un rôle de l’anhydrase carbonique dans i) l’accélération de l’hydratation du CO 2 pour assurer un
approvisionnement rapide de la PEPC en HCO 3- ou bien dans ii) le renforcement du flux entrant des gaz vers
la zone infectée agissant ainsi plus directement sur la barrière à la diffusion d’O 2 elle-même.

1.5. Importance du métabolisme carboné dans la réponse au stress oxydatif

La voie principale de la biosynthèse de l’ascorbate chez les plantes implique une série de réactions
enzymatiques ayant comme précurseurs le D-mannose et L-galactose. Il a été récemment proposé que les

7
nodules matures sont incapables de synthétiser l’ascorbate et ont besoin de l’importer des feuilles et des
racines. Les deux observations qui supportent ce fait-là sont les suivantes : i) l’alimentation de nodules
excisés de petit pois avec le substrat L-galactono-1,4-lactone (GalLDH) montre qu’ils ont une capacité très
limitée à synthétiser l’ascorbate par comparaison avec les feuilles et les racines et ii) l’analyse par western
blott utilisant des anticorps anti-GalLDH montre la présence de cette dernière protéine au niveau des feuilles
et des racines et pas dans les nodules.