A C A D É M I E D’O R L É A N S –T O U R S

UNIVERSITÉ FRANÇOIS RABELAIS

UFR DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES DE TOURS « Philippe Maupas »

Année : 2010 N° 75

THESE

pour le

D I P L O M E D’E T A T D E D O C T E U R E N P H A R M A C I E

Par

Brigitte VIGOUROUX-LERBET née le 26 mars 1958 à Belfort

PRESENTEE ET SOUTENUE PUBLIQUEMENT LE 17 décembre 2010

Impact de l’hypoxie chronique sur la migration des cellules

souches mésenchymateuses

JURY

Président : Mr. le Professeur J. Domenech PU-PH Faculté de

Pharmacie
Membres :
Mr. le Professeur O. Hérault PU-PH Faculté de Médecine
Mme le Docteur V. Eder MCU-PH HDR Faculté de Médecine
Mme le Docteur V.Chabot chercheur EFS

1
2
3
 REMERCIEMENTS

Je tiens en premier lieu à remercier le Docteur V. Eder et le Professeur P. Bonnet de m’avoir très
gentiment accueillie dans le Laboratoire de Physiologie Artérielle pour y préparer ma thèse
d’exercice de pharmacie, pour leur soutien et leurs échanges durant mon travail ainsi que ceux
d’ordre plus familiaux. Sans eux, ce mémoire n’aurait jamais vu le jour.

Je tiens également à remercier les Professeurs J. Domenech et O. Hérault ainsi que le

docteur Valérie Chabot d’avoir accepté de faire partie du jury.

Cette thèse n’aurait pas été la même sans Georges, Elvis et Karim qui ont su prendre le
temps en particulier au début de mon travail pour les conseils pratiques concernant la partie
expérimentale .

Les premières expériences auraient été plus difficiles sans Georges dont la patience, le
calme et la gentillesse m’ont beaucoup aidée quand les difficultés venaient perturber notre travail,
que ce soit de petits problèmes de matériel ou d’initiatives à prendre en cours de « manips ». Mais
je n’oublierai pas non plus les moments d’échanges conviviaux… Je n’oublierai pas non plus
Marie-Astrid toujours disponible et avec un petit mot gentil à m’adresser ainsi que son aide
précieuse dans les derniers jours…

Que l’ensemble des personnes du premier étage et plus particulièrement Harris, Elfi et
Marie-Christine soient également certains de ma reconnaissance pour leurs conseils, remarques,
encouragements… et dépannages de dernière minute ! Merci à Harris pour nos échanges, ses
questions et réflexions enrichissants tout au long des expériences mais aussi pour les discussions sur
la vie.

Et puis, je n’oublierai jamais les discussions avec Valérie en particulier celles concernant
l’importance de l’atmosphère de travail sur la migration des cellules douées d’une forme de vie
sensible, discussions qui m’ont beaucoup touchée témoignant une sensibilité que je partage…

Je tiens à ne pas oublier Jean, mon époux qui n’a pas hésité à donner de son temps et de son
énergie afin de terminer ce travail.

4
SOMMAIRE

Introduction et Objectifs du travail……………………………………………………………p 11

I. Introduction bibliographique……………………………………………….………………..p 13

A. Migration des cellules souches mésenchymateuses ……………………………….………...p14

I. Les Cellules souches Mésenchymateuses……………………………...………………………p14

I.1.Notion de cellules souches
I.1.1.Définitions
I.1.2.Types de cellules souches
I.2. Caractérisation des Cellules souches mésenchymateuses.
I.2.1. Définition et identification historique.
I.2.2. Localisation.
I.2.3. Culture et Caractéristiques.

II. Migration des cellules mésenchymateuse. ……………………………………………….…..p23

II.1. Définitions et caractéristiques
II.1.1. La migration amoeboïde.
II.1.2. La migration mésenchymateuse
II.2. La migration des cellules souches mésenchymateuses.
II.2.1. Les études in vitro
II.2.2. Les études in vivo

III- Rôle des petites protéines G de la famille Rho dans la migration mésenchymateuse ….p 31
III.1. Les petites protéines G de la famille Rho
III.1.1.Présentation de la famille des protéines RhoGTPases
III.1.2.Activation des GTPases
III.2. Réorganisation du cytosquelette d’actine par les petites protéines G de la famille Rho.
III. 3 Activation de la voie Rac1, Pak1 et Lim-K1

B. Hypoxie chronique et migration mésenchymateuse ………………………………………..p 43

I. Hypoxie chronique et métabolisme cellulaire………………………………………………..p 43

I.1.Métabolisme oxydatif cellulaire
I.1.1Définition de l'hypoxie chronique
I.1.2. Métabolisme oxydatif mitochondrial
I.1.3 Hypoxie et métabolisme oxydatif mitochondrial
I.2.Adaptation du métabolisme mitochondrial à l’hypoxie.
I.2.1. Détection des variations mitochondriales de la pression intracellulaire en Oxygène (PaPO 2)
I.2.2. Régulation du facteur HIF-1

II.Hypoxie et migration des cellules souches mésenchymateuses……………………………..p 56

II.1 Les études de la migration des CSM sous hypoxie.
II.2. L’hypoxie chronique et l’activation de la NADPH oxydase.
II.2.1. La NADPHoxydase membranaire
II.2.2 Rôle de Rac dans l’activation de la NADPH oxydase.
II.2.3. NADPHoxydase et migration cellulaire

5
II. Résultats personnels…………………………………………………………………………p 71

A. Matériel et méthodes……………………………………………………………………...….p 72

I.Modèle d'hypoxie chronique chez le rat…………………………………………………...…..p72

II.Préparation des cellules……...………………………………………………………………..p 72

II.1.Isolement des cellules mésenchymateuses.
II.2.Conservation des cellules

III.Techniques utilisées……………………………………………..……………………………p 74
III.1.Expériences de migration de CSM.
III.2.Immunofluorescence.
III.3.RT-PCR (Reverse Transcription-PolyméraseChain Reaction)
III.4.Western-Blott
III .5.Test d'activation de la NADPH
III.6. Analyse statistique

B. Résultats …………………………………………..………………………………….……….p 81

I.Expression de HIF1alpha au niveau des cellules hypoxiques ………………...……………..p 81

II. Migration des CSM hypoxiques………………………………………………...………...….p 82

III. Activation de la NADPHoxydase et rôle dans la migration ……………………...……….p 84

IV. Activation de PI3kinase, RAC1 et activation de la NADPHoxydase. …………...……….p 86

V. Activation de p47 et modifications de phosphorylation de la Cofiline ……………....……p 87

VI. Modification de l’expression des LIM kinases ………………………………………...….p 88

C. Discussion ……………………………………………………………………………..………p 89

D. Conclusion ……………………………………………………………………...……………..p 93

III. Bibliographie …………………………………………………………………………...……p 94

IV. Annexes…………………………………………………………………………………..….p 114

6
Liste des Figures :
Figure I.1 : La migration : un processus en trois étapes (d’après Li, 2005)
Figure I.2 : Structure des petites GTPases Rho
Figure I.3 : Domaines Switch des GTPases.
Figure I.4 : Structure du domaine catalytique des protéines de la famille Ras (d’après Paluch et
al, 2005)
Figure I.5: Cycle d’activation des petites GTPases de la famille des protéines Rho.
Figure I.6 : Cascade des GTPases RhoA, Rac1 et Cdc42 impliquées dans l’organisation du
cytosquelette des cellules Swiss 3T3 (d’après Mackay and Hall, 1998).

Figure I.7 : Image de microscopie électronique de la migration cellulaire

Figure I.8 : Les différentes étapes de la migration cellulaire.

Figure I.9: Rôle des RhoGtPases dans la polymérisation de l’actine..

Figure I.10 : Voies de signalisation activées par Rac1 et Cdc42 et contrôlant la formation des
lamellipodes et des filopodes.

Figure I.11 : Schéma bilan de la chaîne respiratoire

Figure I.12: Représentation schématique des domaines fonctionnels de la protéine HIF-1
Figure I.13 : Le complexe E3 ubiquitine ligase (ECV.
Figure I.14 : en situation de normoxie la sous-unité Hypoxia inductible factors (HIF-1α).
Figure I.15 : Dans des conditions d’hypoxie, les espèces radicalaires en oxygène (ERO) produites
en quelques secondes inhibent l’activité des PHD ce qui empêche la dégradation de Hypoxia
inducible factors (HIF-1α)
Figure I.16 : Représentation schématique de la régulation de HIF (Carroll and Ashcroft, 2005)
Figure I.17 : Modèle d’activation de la NADPH oxydase phagocytaire.
Figure I.18 : Les membres de la famille NOx et leurs sous-unités régulatrices (d’après Brown
and Griendling, 2009).
Figure I.19 : Distribution tissulaire et fonctions des Nox/Duox (Guichard et al., 2006).

Figure I.20 : Voies de signalisation résultant du recrutement de TRADD, RPI, Rac

et Nox1 au récepteur (Brown and Griendling, 2009).

Figure I.21 : Fonctions de Nox2

7
Figure I.22: Fonctions de Nox4
Figure I.23 : Régulation de l’activité du cytochrome b558 en deux étapes (d’après Bokoch and
Diebold, 2002).
Figure I.24 : Phosphatase , protéine sensible au voltage (Murata and Okamura, 2007)
Figure I.25 : Pompe à protons.
Figure II.1 : Expression de HIF-1α.
Figure II.2 : migration différentielle des CSM hypoxiques.
Figure II.3 : activité enzymatique de la NADPHoxydase et expression de la PI3kinasE ;
Figure II.4 : expression de Rac-1 (Rac1-GTP) et de ROCK-1
Figure II.5 : expression de p47et de la forme phosphorylé de la cofiline
Figure II.6 : 6A : expression de LIM kinase-1 et de LIM kinase-2

8
Liste des abréviations :

CSM: Cellules Souches Mésenchymateuses.

NADPH : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
ROCK1: Rho Kinase 1
LIMK1: LIMKinase1
Rac1: Ras-related C3-botulinum toxin substrate
LIMK2: LIMkinase2
ESC: Embryonic Stem Cells
CSA: Cellule Souche Adulte.
MAPC: Multipotent Adult Progenitor Cells.
CFU-F: Colony Forming Unit Fibroblast.
E.G.: facteur de croissance fibroblasique,
bFGF basic Fibroblast Growth, b FGF.
Arp2/3: Actin-related proteins
N-WASP: N-Wiskott-Aldrich Syndrom Protein
RhoA: Ras homologous member
MEC: matrice extRacellulaire.
MMPs: Matrix Métallo Protéinases.
MMP1: Matrix Metalloprotéinase-1
MLCK : myosin light chain kinase
ATP: Adénosine Tri-Phosphate
HGF: hépatocyte Growth Factor
BMP-2 Bone Morphogenetic Protein-2
PDGF-BB: Platelet Derived Growth Factor BB
BMP-4: Bone Morphogenetic Protein-4
TGF-β1: Growth Factor beta 1
VEGF-A : Vascular Edothélial Growth Factor A
IGF: insulin-like Growth Factor
SDF : sodium dodécyl sulfate
CSMh: Cellules Souches Mésenchymateuses
uPAR1 : Urokinase receptors
PAF: Platelet-activating factor
GM-CSF : granulocyte-macrophage colony stimulating factor
G-CSF : granulocyte colony stimulating factor
Rab ras-related in brain
Sarl/Atf Adp ribolysation factor
Ran : Ras related in nucléar import and export
Rho : Ras homologous member
Cdc42H : Cell division cycle 42 Human
GTPase : Guanosine Triphosphatase
GDP Guanosine diphosphate / GTP Guanosine Triphosphate
GEFs GTP Exchange Factors
DH : Dbl homology
PH : Pleckstrin Homology
PIP3 : Phosphatidylinositol 3, 4, 5 triphosphate
GAPs : GTPases Activating Protein
GDIs : Guanine nucléotide Dissociation Inhibitor
PAK : p21-activated kinase
PAF : Points d’Adhérence Focaux

9
PIP2 : Phosphatidyl Inositol (4,5)-biphosphate
ADF : Actin Dépolymerizing Factor
PI3K : Phosphatidyl Inositol 3 Kinase
WASP : Wiskott-Aldrich Syndrom Protein
WAVE : WASP-like verprolin homologuous protein
PaO2 : Pression artérielle en Oxygène
EPO : Erythropoïétine
PaPO2 : Pression artérielle Partielle intracellulaire en Oxygène
RLO : Radicaux libres d l’oxygène.
ERO: Espèces radicalaires de l’oxygène ERO
SOD : SuperOxyde Dismutase
HIF : Hypoxia Inducible Factor
AP-1: Activator Protein-1 (AP-1)
Nfkb : facteur-KB nucléaire
Egr-1 : Early Growth Response-1
PAS : PER-ARNT-SIM PAS
TADs : domaines de transactivation
PHD prolyl-hydroxylases
ECV : Elongin/Cullin2/VHL
ODD : dégradation dépendant de l'oxygène (ODD),
pVHL : facteur de suppression tumorale von Hippel-Lindau
PHD : prolylhydroxylases
HO-1 : hème oxygénase-1
HGF : hepatocyte growth factor
PBS : phosphate buffer saline
CREB : CRE Binding protein
phox : phagocyte oxydase
NOX : NADPH oxydase
FCS : Fetal Calf Serum
DMSO : dimethyl sulfoxide
EDTA : acide éthylène diamine tétra acétique
RPMI : Roswell Park Memorial Institute medium
SVF : Sérum de Veau Fœtal
TBS : Tris Buffered Saline

10
 Introduction et Objectifs du travail

L'objectif de notre travail était d’étudier l’impact de l'hypoxie chronique sur la migration des
cellules souches mésenchymateuses (CSM) issues de la moelle osseuse de rats.

Dans un précédent travail nous avions montré chez des rats Wistar soumis à l’hypoxie chronique,
une augmentation spécifique de la mise en circulation de progéniteurs de cellules souches
mésenchymateuses (Rochefort et al., 2007). Dans ce même modèle des CSM injectées par voie
systémique avaient une domiciliation accrue au niveau de la moelle osseuse (Rochefortet al., 2005).
Ces travaux permettaient de suspecter soit l’existence de facteurs chimiotactiques augmentés par
l’hypoxie chronique soit des modifications des propriétés migratoires des CSM.

Le but de ce travail était d’étudier la capacité migratoire de cellules souches mésenchymateuses

issues de la moelle osseuse de rats soumis à l’hypoxie chronique avec l’hypothèse du rôle d’une
activation de la NADPHoxydase membranaire pouvant être directement responsable d’une
augmentation de cette migration.

La migration cellulaire est un processus essentiel utilisé au sein de tous les organismes
multicellulaires et elle est importante non seulement pendant le développement embryonnaire mais
aussi tout au long de la vie pour la cicatrisation. La capacité des CSM à réparer l'os, le cartilage, les
tendons, mais aussi les muscles lisses, cardiaques et squelettiques rend ces cellules particulièrement
intéressantes pour la thérapie cellulaire. Néanmoins, l'efficacité thérapeutique de telles cellules
dépend de leur capacité à migrer dans les tissus endommagés en réponse à certains signaux
chimiotactiques produits localement. Contrairement aux CSH, ces signaux ne sont pas encore bien
connus. L’étude des mécanismes fondamentaux de cette migration cellulaire est pourtant
indispensable pour mettre au point des techniques des biothérapies utilisant les cellules souches
mésenchymateuses.

La NADPHoxydase est un système annexe impliqué dans les phosphorylations oxydatives. Son
importance physiologique par rapport aux systèmes d’oxydation mitochondrial ou aux autres

11
systèmes Red/Ox tels que le cytochrome p450 annexé au réticulum sarcoplasmique reste mal
connue. La NADPH est impliquée dans la surproduction de radicaux libres oxygénés et notamment
d’H2O2 en réponse à stress environnemental exagéré et a été mise en cause dans le stress oxydant de
processus de dégénérescence. La NADPHoxydase est un système couplé à la membrane lorsque
l’enzyme est activée et certaines de ces sous-unités sont aussi couplées à des protéines contrôlant le
réarrangement du cytosquelette au cours de la migration cellulaire. Toutefois son rôle précis dans
l’activation de la migration cellulaire n’a pas été très étudié notamment au niveau des cellules
mésenchymateuses.

La première partie de ce manuscrit présente une mise au point bibliographique de l'impact de

l'hypoxie chronique sur l’activation de la NADPHoxydase et la migration cellulaire en lien avec la
régulation des protéines Rho. La deuxième partie du manuscrit rapporte nos résultats expérimentaux.
Dans un premier temps, nous avons exploré la capacité de migration in vitro de CSM médullaires
issues de rats soumis trois semaines à l’hypoxie chronique en comparaison avec des CSM de rats
normaux. Puis nous avons étudié l’activation de la NADPHoxydase et des voies Rac1/Rock1 et
LIMK1/LIMK2.

12
 Chapitre I :

Introduction

Bibliographique

13
A. Migration des cellules souches mésenchymateuses

I. Les Cellules souches Mésenchymateuses.

I.1. Notion de cellules souches.

I.1.1.définitions

Les cellules souches sont des cellules indifférenciées capables d'une part, de s' autorenouveler pour
maintenir un pool permanent de ce type cellulaire et d'autre part, de donner naissance à des cellules
différenciées.

On distingue quatre types de cellules souches en fonction de leur degré de différenciation

- Les cellules souches totipotentes : il s'agit de l'œuf fécondé (le zygote) et des cellules de
l'embryon dans les quatre premiers jours de sa croissance (morula de 2 à 8 cellules). Seules ces
cellules ont la capacité de former l'embryon entier ainsi que ses annexes (amnios et placenta) et ainsi
de conduire au développement d'un être humain.

- Les cellules souches pluripotentes : elles proviennent de la masse cellulaire interne (provenant de
feuillets ectodermique, mésodermique et endodermique) du blastocyte (au stade de 40 cellules) ;
elles ont vocation à former tous les tissus de l'organisme mais ne peuvent à elles seules aboutir à la
création d'un individu complet.

- Les cellules souches multipotentes : présentes dans l'organisme adulte, elles sont à l'origine de
plusieurs types de cellules différenciées au sein du même feuillet embryonnaire dans un nombre
limité de lignages cellulaires appropriés à leur emplacement.

- Les cellules souches unipotentes sont seulement capables de produire un seul type de cellules
différenciées. C'est le cas des précurseurs épithéliaux intestinaux, des précurseurs épithéliaux
gastriques ou des cellules de la spermatogonie testiculaire (Preston et al., 2003)

14
Ces cellules présentent des caractéristiques communes :

- Autorenouvellement: capacité de réplication permanente maintenue à long terme.

- Clonalité: capacité de générer une population cellulaire homogène à partir d’une cellule initiale.

- Potentialité: capacité de différenciation dans des différents linéages.

- Plasticité: capacité de modulation de la destinée de différenciation des cellules.

- Reconstitution cellulaire: possibilité de reconstitution d’une population cellulaire après greffe.

I.1.2.types de cellules souches

On distingue deux grands types de cellules souches :

Les cellules souches embryonnaires.

Les cellules souches embryonnaires (ESC = Embryonic Stem Cells), sont les seules cellules
pluripotentes de l'organisme. Elles sont présentes dès le stade blastocyste, soit quatre à cinq jours
après la fécondation de l'œuf et avant son implantation utérine. Ces cellules sont capables de se
multiplier indéfiniment pour donner de grandes quantités de cellules non spécialisées pluripotentes,
puisqu'elles peuvent produire tous les feuillets embryonnaires (mésoderme, endoderme et
ectoderme) et les tissus qui en dérivent.

Les cellules souches adultes.

Les souches tissulaires de l'adulte (CSA) sont présentes au cœur des organes. Elles sont connues
depuis longtemps dans les tissus à renouvellement rapide comme le sang, la peau et l'épithélium
intestinal. Les cellules souches adultes sont présentes dans plusieurs tissus et sont, pour la plupart,
déjà engagées dans un programme tissulaire spécifique, ce qui explique leur hétérogénéité. Même si
certaines d'entre elles peuvent conduire à la formation ou à la génération de tissus distincts

15
provenant du même feuillet embryonnaire (multipotence), elles ne sont pas, comme leurs
homologues embryonnaires, pluripotentes.

Chez l'adulte, les cellules souches servent à restaurer les tissus lésés, malades, ou simplement
vieillissants. Des cellules souches capables de « restaurer » les tissus ont été identifiés chez l'homme
dans les tissus suivants la moelle osseuse, la cornée et la rétine, le muscle squelettique, la pulpe
dentaire, la peau, et le tractus gastro-intestinal. Les cellules souches du sang, de la peau et de
l'intestin fonctionnent en permanence pour renouveler régulièrement l'ensemble des cellules.

Un type rare de cellules multipotentes, les MAPC (Multipotent Adult Progenitor Cells), a été
décrit comme étant l'ancêtre de toutes les populations hématopoïétiques et mésenchymateuses
présentes dans la moelle osseuse humaine. La localisation des MAPC n'est probablement pas
restreinte à la moelle osseuse (Jiang et al., 2002). Elles possèdent un grand pouvoir prolifératif, elles
peuvent se différencier en de multiples types tissulaires, émanant de feuillets embryonnaires
différents (mésoderme, endoderme et ectoderme).

Nous nous limiterons, dans ce travail, à l'une des deux principales cellules souches adultes de
la moelle osseuse: les Cellules Souches Mésenchymateuses (CSM) issues de la moelle osseuse.

I.2. Caractérisation des Cellules souches mésenchymateuses

I.2.1. Définition et identification historique.

Friedenstein fut le premier à observer des cellules adhérentes de type fibroblastique dans les
cultures de moelle osseuse, aussi appelée Colony Forming Unit Fibroblast (CFU-F) (Friedenstein et
al., 1970); (Friedenstein et al., 1974) ; (Dazzi et al., 2006). Lorsqu'elles étaient ensemencées à faible
densité en milieu liquide contenant du sérum, des cellules de moelle osseuse de lapins ou de
rongeurs formaient après quelques jours de petites colonies fibroblastiques, adhérentes, ovales et
non phagocytaires. Une fois réensemencées individuellement sous la capsule rénale d'animaux
syngéniques, chaque colonie constituait, après quelques semaines, du tissu fibreux et de l'os
contenant de la moelle osseuse. Dans les années 60, l'intérêt principal de cette fraction « stromale »,
support d'adhérence autant que pourvoyeur de cytokines, était d'offrir un environnement propice in

16
vitro à l'autorenouvellement et à la différenciation de cellules souches hématopoïétique. L'analyse de
leur potentiel était secondaire.

Au début des années 90, Arnold Caplan a définit les CSM comme des cellules produisant de
l'os et du stroma médullaire, mais également du cartilage, du tissu tendineux et du muscle ((Caplan,
1991)). Au fil du temps, plusieurs désignations et abréviations lui ont été attribuées. Maureen Owen
(Owen, 1988); (Owen and Friedenstein, 1988) a utilisé le terme de « cellule souche stromale » pour
souligner le fait que les CSM étaient produites à partir de la couche stromale médullaire de culture à
long terme. Par la suite, Darwin Prockop (Prockop, 1997) a proposé que l'abréviation CSM
convienne pour « cellule souche mésenchymateuse » et pour « cellule stromale médullaire ». Puis,
James Dennis (Dennis et al., 1999) a utilisé le terme de « cellule progénitrice mésenchymateuse »
afin d'indiquer que ces cellules pouvaient représenter des cellules progénitrices issues initialement
de cellules souches. Dans les années 2000, plusieurs chercheurs (Bianco and Gehron Robey, 2000);
(Bianco et al., 2001) ; (Kuznetsov et al., 2001) ; (Bhagavati and Xu, 2004) les ont appelées « cellule
souche squelettique » pour souligner leur spécificité à engendrer les différentes cellules des tissus
squelettiques. Enfin, Catherine Verfaillie a décrit une population de cellules qui pourrait représenter
un type cellulaire plus primitif, avec un plus grand potentiel de différenciation que celle des CSM,
qu'elle a désigné en tant que « cellules progénitrices mésodermales » (Reyes et al., 2001) et
« cellules progénitrices adultes multipotentes » (Jiang et al., 2002).

I.2.2 Localisation.

Les CSM ont pu être isolées dans de nombreuses espèces différentes. Les CSM les mieux
caractérisées proviennent de source humaine (Pittenger et al., 1999); (Zvaifler et al., 2000);
(Kuznetsov et al., 2001) ; (Covas et al., 2003); (Zhang et al., 2004); (Miao et al., 2006), de souris
(Phinney et al., 1999); (Baddoo et al., 2003); (Tropel et al., 2004) et de rats (Santa Maria et al.,
2004), mais d'autres sources provenant de cobayes ou de chats (Martin et al., 2002), de babouins
(Devine et al., 2001), de moutons (Airey et al., 2004), de chiens (Silva et al., 2005), de porcs
(Moscoso et al., 2005); (Bosch et al., 2006), de vaches (Bosnakovski et al., 2005), ou encore de
chevaux (Worster et al., 2000); (Ringe et al., 2003) sont actuellement exploitées.

Les CSM sont présentes, avec une proportion variable, dans divers tissus fœtaux et de
l'organisme adulte (Pountos and Giannoudis, 2005). Néanmoins, elles représentent une population

17
rare au sein de ces tissus. C'est en 1976 que des CSM ont été isolées à partir de la moelle osseuse
pour la première fois (Friedenstein et al., 1976). Elles peuvent être isolées à partir de divers tissus
incluant le cartilage (Alsalameh et al., 2004), le périoste (Cuevas et al., 2004), la membrane
synoviale (De Bari et al., 2001), le liquide synovial (Jones et al., 2004), les muscles (Young et al.,
2001) et les tendons (Salingcarnboriboon et al., 2003). Il a été également mise en évidence que le
tissu fœtal (Hu et al., 2003), le placenta, la veine ombilicale (Romanov et al., 2003), les tissus
adipeux (Dicker et al., 2005) et le système vasculaire (Abedin et al., 2004) contiennent des CSM.
Cependant, la source la plus riche, la plus étudiée et la plus accessible aux chercheurs et aux
cliniciens est la moelle osseuse adulte (Phinney et al., 1999); (Pittenger et al., 1999); (Howell et al.,
2003); (Tropel et al., 2004); (Tuli et al., 2003), où la fréquence a été estimée à 0,01-0,001% des
cellules nuclées humaines de moelle osseuse adulte (Zhang et al., 2004); (Miao et al., 2006).

I.2.3. Culture et Caractéristiques.

-Isolement.

Les CSM peuvent être obtenues à partir de différentes sources. Les procédures sont très
nombreuses et diffèrent selon les sources tissulaires, les espèces étudiées et les publications.
Toutefois, on retrouve certains paramètres communs concernant la culture de CSM provenant de la
moelle osseuse. Les CSM sont obtenues après aspiration du contenu médullaire de l'os du fémur,
puis lavées et cultivées sur plastique à une densité de 10 4 à 105 cellules/cm2. Entre 2 et 3 jours, le
milieu de culture est changé pour la première fois et les cellules adhérentes au plastique sont ainsi
cultivées pendant 2 à 3 semaines jusqu'à ce qu'elles atteignent un taux de confluence de 80 à 90%.

- CFU-F

Lorsque ces cellules étaient ensemencées à des densités plus élevées, les colonies fusionnent pour
former une monocouche de cellules adhérentes. Pour visualiser et énumérer les CFU-F, les cellules
sont habituellement colorées avec une solution de Giemsa, lavées et puis séchées à l'air. Les
colonies ont typiquement un diamètre de 1 à 8 mm et sont dénombrées macroscopiquement.

18
- Une Population hétérogène.

Après culture, les CSM forment des colonies de cellules adhérentes ressemblant à des
fibroblastes qui peuvent croître en présence de divers facteurs de croissance (Gronthos and
Simmons, 1995); (Kuznetsov et al., 1997), tandis que la préparation initiale présente également des
macrophages adhérents au plastique. Morphologiquement, les CSM initialement cultivées
ressemblent à de petites cellules fibroblastiques avec, en particulier dans les cultures murines, des
extensions minces de type filopodes. Les CSM semblent être une population homogène. Cependant,
l'homogénéité de la population dépend des conditions de culture.

Avant le premier détachement enzymatique par trypsine, la population initiale de CSM en

croissance est composée de cellules morphologiquement différentes (Colter et al., 2000); (Reyes et
al., 2001) une population fusiforme de type fibroblaste et une autre population polygonale de type
épithélioïde. Après le premier détachement par trypsine, la population épithélioïde disparaît
rapidement et n'est plus retrouvée ensuite, contrairement à la population fibroblastique qui continue
à proliférer, même après de nombreux passages (Miao et al., 2006). La sélection des cellules
adhérentes entre le jour 2 et le jour 4 (Pittenger et al., 1999) et les différents passages après
détachement par trypsine sont une nécessité pour se débarrasser des cellules hématopoïétiques
(habituellement 1-2 passages pour les cultures humaines et 4-6 passages pour les cultures de souris),
et peut mener à la sélection d'une population plus homogène mais pouvant présenter des
caractéristiques morphologiques et fonctionnelles différentes des CSM in situ.

Cette hétérogénéité au niveau morphologique est également retrouvée pour les capacités de
prolifération et de différenciation (Kuznetsov et al., 2001); (Phinney et al., 1999); (Pittenger, 1999 );
(Muraglia et al., 2000); (Satomura et al., 2000); (Okamoto et al., 2002), bien qu'elle ne se traduise
pas par l'absence ou la présence d'un marqueur membranaire particulier (Gronthos et al., 1999);
(Bensidhoum et al., 2004). Ainsi, les CSM constituent une population hétérogène, ce qui peut
refléter une hiérarchie au sein de ces cellules souches comme cela a été décrit pour les CSH.

En 2000, l'étude à l'échelon clonal de la capacité à proliférer a montré qu'un tiers des clones
isolés présentait la capacité de différenciation dans les trois lignages (adipocytaire, ostéogénique et
chondrocytaire). Muraglia et ses collaborateurs ont alors proposé un modèle de hiérarchie basé sur
des études clonales, où le premiers ancêtres mésenchymateux sont tripotents (adipocytaire,
ostéogénique et chondrocytaire) et présentent une perte séquentielle de leur potentiel de

19
différenciation au fil des divisions pour générer des ancêtres bipotents puis unipotents (Muraglia et
al., 2000). Néanmoins, à partir des observations, les CSM peuvent être définies comme une
population hétérogène dont le modèle hiérarchique n'est pas complètement établi.

- Phénotype.

Jusqu'à présent, aucun marqueur immuno-phénotypique particulier n'a été identifié pour
permettre l'isolement phénotypique des CSM. Néanmoins, elles expriment une grande variété
d'antigènes présentés par beaucoup d'autres types de cellules. En 2004, Pittenger et Martin ont
publié une liste des marqueurs de surface des CSM qui définissent leur phénotype (Tableau, p28).
Par conséquent, leur identification est basée sur l'expression exhaustive de marqueurs membranaires,
comprenant des marqueurs de différenciation et de lignage, des molécules d'adhérence, de la matrice
extra-cellulaire, et des récepteurs à des facteurs de croissance (Simmons and Torok-Storb,
1991); (Simmons et al., 1992); (Gronthos and Simmons, 1995). De plus, quelques molécules sont
exprimées de façon variable selon le temps passé en culture et le potentiel de différenciation des
CSM (Vogel et al., 2003); (Dazzi et al., 2006). L'ensemble de ces marqueurs de surface a été étudié
par cytométrie en flux (Haynesworth et al., 1992); (Pittenger et al., 1999); (Barry et al., 2001);
(Caceres et al., 2008); (De Ugarte et al., 2003); (Vogel et al., 2003); (Zhang et al., 2004).

-Potentiel de prolifération.

Friedenstein a rapporté la croissance de colonies fibroblastiques lorsque des suspensions de

cellules isolées de moelle osseuse totale étaient ensemencées à faible densités (10 4 à 105
cellules/cm2) permettant un isolement physique relatif des cellules adhérentes; Des colonies
adhérentes se sont formées dans ce préparations cellules, chacune étant dérivées d'un précurseur
unique que l'auteur a nommée « unité formant des colonies fibroblastiques » (colony-forming-unit
fibroblast, CFU-F) (Friedenstein et al., 1978); (Latsinik et al., 1986). In vitro, les CFU-F humaines
présentent des capacités importantes de prolifération. Elles donnent naissances à des colonies qui
peuvent atteindre plusieurs millimètres de diamètre. Toutefois, cette prolifération est restreinte par la
limite de Hayflick de 50 doublements cellulaires (Bruder et al., 1997); (Pittenger et al., 1999), avec
un raccourcissement des télomères et une perte de l'activité télomérase (Banfi et al., 2002).

20
 Une étude sur des cellules fraîchement isolées a révélé que les CFU-F n'entraient pas dans le
cycle cellulaire in vivo (Friedenstein et al., 1974), et que leur développement ultérieur en colonies et
leur entrée dans le cycle cellulaire dépendait de facteurs de croissance présents dans le sérum in
vitro (Castro-Malaspina et al., 1980). En effet, il est possible d'augmenter le nombre de divisions
cellulaires en ajoutant des facteurs de croissance au milieu de culture initial (E.G. le facteur de
croissance fibroblasique, basic Fibroblast Growth, b FGF) (Bianchi et al, 2003). L'ensemencement
cellulaire joue également un rôle critique dans la capacité d'expansion des CSM. En effet, on obtient
un profil d'expansion plus élevé (2000 fois) quand les CSM sont ensemencées à faible densité (1,5-3
10 4 cellules/cm2) tandis qu'on observe un profil d'expansion plus faible (60 fois) pour une densité
d'ensemencement plus élevée (Colter et al., 2000).

- Capacité d'auto-renouvellement.

La production de copies identiques d'elles-mêmes par la division mitotique au cours de

périodes étendues est l'une des caractéristiques définissant une cellule souche. La capacité
d’autorenouvellement de ces cellules n’a pas été démontrée in vivo. Cependant, in vitro, elle a été
mise en évidence et est transmissible jusqu'au passage 5 (Bonyadi et al., 2003).

-Multipotentialité et régénération tissulaire après lésion.

La multipotence est définie comme la capacité d'une cellule à donner naissance à différents
types de cellules. Comme nous l'avons mentionné auparavant, les CSM sont capables de produire
des descendants différenciés du tissu mésodermique. Elles sont aussi capables, dans des conditions
environnementales particulières , de se différencier en une grande variété de types cellulaires tels
que les cardiomyocytes, les myofibroblates, les péricytes, les myocytes squelettiques, et elle
permettent d'obtenir des cellules non mésodermiques ayant un phénotype de cellules rétiniennes,
neuronales, astrocytaires, gliales, hépatocytaires et pancréatiques.

La capacité des CSM de se nicher dans le cartilage, la rate, la moelle osseuse et de l'os a déjà
été montrée depuis plusieurs années (Pereira et al., 1995). Plus récemment, des CSM greffées par
voie systémique ont subi une différenciation organo-spécifique en chondrocytes, adipocytes,

21
myocytes, cardiomyocytes et cellules stromales, ce qui montre leur capacité à se nicher au sein de
microenvironnements différents (Liechty et al., 2000).

Les CSM ont aussi la capacité de modifier leur voie de différenciation selon le microenvironnement
dans lequel elles sont placées. Par exemple, les CSM différenciées en chondrocytes peuvent se
réorienter dans la voie de différenciation ostéoblastique (Bianco et al., 1999), ou alors des
adipocytes peuvent se différencier en ostéoblastes (Bennett et al., 1991); (Dennis and Charbord,
2002).

-Micro-environnement médullaire et soutien de l'hématopoïèse.

Le microenvironnement hématopoïétique de la moelle osseuse peut être subdivisé en un

compartiment cellulaire hématopoïétique et un compartiment stromal se composant principalement
de fibroblastes, d'adipocytes, et du système vasculaire de la moelle osseuse (Kopp et al., 2005);
(Dazzi et al., 2006). Toutefois, des cellules mésenchymateuses sont également retrouvées dans le
foie foetal et dans la moelle osseuse foetale dès 9 semaines de gestation, avant le début de
l'hématopoïèse définitive, chez l'homme et la souris (Klein et al., 1983); (Van den Heuvel et al.,
1987); (Charbord et al., 1996); (Mendes et al., 2005), indiquant que les CSM pourraient contribuer à
l'établissement définitif de l'hématopoïèse.

-Plasticité intra-tissulaire

La plasticité peut être définie comme la capacité des cellules à modifier leur voie de
différenciation selon le microenvironnement dans lequel elles sont placées. Par exemple, des CSM
différenciées en chodrocytes peuvent ainsi se réorienter dans la voie de différenciation
ostéoblastique (Bianco et al., 1999), ou alors des adipocytes peuvent se différencier en ostéoblastes
(Bennett et al., 1991); (Dennis and Charbord, 2002).

22
II. Migration des cellules mésenchymateuse.

II.1. Définitions et caractéristiques

On distingue deux grandes forme de migration cellulaire: la migration de type amoeboïde et la

migration de type mésenchymateux.

II.1.1. La migration amoeboïde.

La mobilité amoeboïde est caractéristique des cellules hématopoïétiques appelées les leucocytes.
Elle a été mise en évidence dans un premier temps chez l’amibe Dictyostelium discoideum (Yumura
et al., 1984). Elle dépend beaucoup moins des phénomènes d’adhérence et est indépendante des
intégrines (Friedl et al., 1998). Les cellules sont ici très déformables du fait de l’absence de points
d’adhérence focaux, ce qui leur permet de se déplacer 10 à 20 fois plus vite que lors d’une migration
mésenchymateuse. Les cellules avancent par contraction de l’actine corticale et des flux internes de
cytoplasme qui les font « rouler » sur elles-mêmes (Friedl et al., 1998). L’étude de l’expression
génique dans ce type de cellules motiles a révélé que des régulateurs liés à l’actine sont surexprimés
tels que la cofiline, Arp2/3, N-WASP, les LIM Kinases, Rock et RhoA (Friedl and Wolf, 2003).

Une étude récente a permis une meilleure compréhension des mouvements amoeboides de
Dictyostelium (Yoshida and Soldati, 2006). Deux modèles y sont présentés :

- Une mobilité de type « blebbing » est caractérisée par une rupture de l’équilibre membranaire
généré entre la membrane et le cortex d’actine. Des forces intérieures à la cellule permettent alors la
création d’un blebb dans lequel est vite régénéré le cortex d’actine.

- L’autre mode est caractérisé par la formation d’un filopode se transformant rapidement en
lamellipode sans dépolymérisation du cortex d’actine à cet endroit.

Ces cellules déforment leur corps cellulaire pour se mouvoir dans un environnement en 3D
(Friedl et al., 1998). Elles ne dégradent pas la matrice extracellulaire mais utilisent la déformation de

23
leur corps pour contourner les fibres constituant cette matrice. Des études récentes ont mis le doigt
sur les éléments provoquant une transition mésenchymato-amoeboïde dans différents types
cellulaires (Pinner and Sahai, 2008); (Sahai et al., 2007); (Wolf et al., 2003a). Ces études
démontrent que RhoA et Rock sont des protéines essentielles au passage vers un type de mobilité
amoeboïde, sans dégradation de matrice extracellulaire (MEC), contrairement aux cellules utilisant
un mode mésenchymateux durant lequel on observe une dégradation de la MEC par l’action des
MMPs (Wolf et al., 2003a); (Wolf et al., 2003b).

I.1.2. La migration mésenchymateuse

La migration mésenchymateuse est représentée par la migration des fibroblastes et les CSM
migrent selon ce type de migration. En pathologie, elle est principalement observée dans les
fibrosarcomes, les gliomes et les cancers épithéliaux (Friedl and Wolf, 2003). Les cellules adoptent
une morphologie polarisée, présentant une partie antérieure (leading edge) étalée et très dynamique
et une partie postérieure (tail) allongée. Cette morphologie est dépendante de grandes forces de
traction au niveau des pôles cellulaires ainsi que de la dynamique de l’adhérence par les intégrines.
La migration de cellules à travers des tissus riches en collagène nécessite des réactions d'adhérence
à la matrice extracellulaire et de protéolyse des composants matriciels, en même temps qu'un
cytosquelette d'actine dynamique permettant des changements de forme polarisés (Lauffenburger
and Horwitz, 1996). Si les mécanismes cellulaires et moléculaires des cellules en chaîne et en
groupe ne sont pas encore connus en détail, la migration des cellules isolées, dans différents
modèles, obéit à différents paramètres comme la taille, l'adaptabilité morphodynamique,
l'expression et la fonction des intégrines et les vitesses de renouvellement des interactions cellule-
matrice (Friedl and Wolf, 2003). Ce type de migration est caractérisé par l’activation, au niveau
des points d’ancrage de la cellule, de protéinases et métallo-protéinases qui dégradent la matrice
extracellulaire environnante (Wolf et al., 2003a). Du fait du renouvellement des PAF de 10 à 120
minutes, les cellules migrent dans un modèle en trois dimensions (3D) entre 0,1 à 2 μm par minute
(Friedl et al., 1998). Ce type de migration est dépendant des intégrines, des GTPases de la famille
Rho (RhoA, Rac1 et Cdc42), de la MLCK et des MMPs (Métalloproteinases matricielles) (Friedl,
2004); (Kaneko et al., 2002).

24
 Le cytosquelette est constitué de filaments protéiques très abondants dans les cellules
eucaryotes, dont les éléments sont très conservés au cours de l'évolution. En effet, certains
procaryotes possèdent des protéines homologues aux protéines du cytosquelette des eucaryotes
(Shih and Rothfield, 2006).

Il existe trois types de filaments dans les cellules eucaryotes. Chacun a une fonction
particulière, correspondant à une échelle d'action différente, même s'il existe des interactions entre
les différents types de filaments (Gordon-Weeks, 2004). Les microtubules, qui sont rigides,
participent à la structure et à l'organisation globale de la cellule ainsi qu'au trafic vésiculaire
(Kodama et al., 2004). L'actine, qui forme un réseau plus déformable, agit plus localement sur la
membrane de la cellule et permet sa déformation. Certains métazoaires, dont les mollusques et les
vertébrés, sont aussi constitués d'un troisième de type de filament, les filaments intermédiaires,
dont les fonctions sont moins bien connues mais qui semblent jouer un rôle dans le maintien de la
forme cellulaire et l'ancrage des organites cellulaires. Ils interviennent aussi dans l'adhérence et la
cohésion tissulaire car ils sont en relation avec les desmosomes et les hémidesmosomes (Yin and
Green, 2004).

Ces trois types de filaments ont des propriétés structurelles communes : ce sont des
polymères constitués d'un assemblage de protéines élémentaires. Ils sont très dynamiques,
principalement aux extrémités où s'effectuent l'assemblage et le désassemblage de sous-unités. Ces
événements de polymérisation et de dépolymérisation permettent au cytosquelette de se réarranger
très rapidement et de s'adapter aux signaux mécaniques et chimiques de l'environnement extérieur
(Stephens et al., 2008). Les premières observations de l’actine ont été réalisées en 1887 par W.D.
Halliburton qui a extrait une protéine de muscles qui précipitait avec la myosine. Cette protéine a été
caractérisée en 1942 par B.F. Straub qui l’a purifiée et baptisée actine. Le Dr Straub continua à
travailler sur l’actine pendant de nombreuses années découvrant que l’actine liait l’ATP.

La migration des cellules d’origine mésenchymateuse en 2 dimensions est un processus en

trois étapes finement régulées qui nécessite la perte des contacts intercellulaires, le remodelage de la
matrice extracellulaire et des changements dans l’organisation du cytosquelette avec une persistance
directionnelle. (Raftopoulou and Hall, 2004); (Friedl and Wolf, 2003) (Figure I.1) :

25
• extension des lamellipodes et des filopodes, suite à l’élongation des filaments d’actine, au niveau
du front de migration de la cellule assurant une large surface de contact vers la matrice
extracellulaire.

• formation de nouvelles adhérences au niveau du front de migration de la cellule via les intégrines

• contraction de la cellule assurée par la contraction des filaments d’actomyosine à l’arrière de la

cellule accompagnée du détachement des adhésion à l’arrière de la cellule .

Figure I.1 : La migration : un processus en trois étapes (d’après Li, 2005)

La migration cellulaire est dirigée, dans la plupart des cas, par des signaux
extracellulaires attractifs ou répulsifs. Ces signaux peuvent être des facteurs solubles qui peuvent
agir à distance ou plus généralement à partir des cellules voisines (Stephens et al., 2008). Ils
induisent une grande variété de signaux intracellulaires qui comprennent des changements dans
l’organisation du cytosquelette d’actine et microtubulaire, dans le transport vésiculaire et dans la

26
transcription (Stephens et al., 2008). Nous détaillerons cet aspect de la migration mésenchymateuse
ultérieurement.

II.2. La migration des cellules souches mésenchymateuses.

La capacité des cellules souches mésenchymateuse à réparer l'os, le cartilage et les

tendons ainsi si qu'à donner naissance à différents types cellulaires comme nous en avons parlé
précédemment les rendent particulièrement intéressantes pour la thérapie cellulaire. L'efficacité
thérapeutique de telles cellules dépend de leur capacité à migrer dans les tissus endommagés en
réponse à des signaux chimiotactiques produits localement. Il est probable que les tissus lésés
expriment des récepteurs ou des ligands spécifiques facilitant la migration, l'adhérence et
l'infiltration des CSM dans le site de la lésion. Cependant, les signaux chimiotactiques qui guident
les CSM vers un microenvironnement approprié ou qui induisent leur migration dans la circulation
générale ne sont pas encore clairement déterminés . La capacité de migration des CSM dépend de
leur aptitude de détecter des signaux chimiotactiques (cytokines, chimiokines, facteurs de
croissance) émis par le tissu lésé et d'y répondre efficacement.

II.2.1. Les études in vitro

De nombreux facteurs de croissance ont été rapportés comme induisant la migration des CSM.
Ainsi, l'hépatocyte Growth Factor (HGF) est exprimé de façon constitutive par les cellules stromales
médullaires (Takai et al., 1997) et induit une augmentation de la migration in vitro des CSM avec
une diminution de la prolifération cellulaire (Neuss et al., 2004); (Forte et al., 2006), (Son et al.,
2006). D'autres facteurs de croissance, comme le Platelet Derived Growth Factor BB (PDGF-BB),
la Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2), la Bone Morphogenetic Protein-4 (BMP-4), le
Transforming Growth Factor beta 1 (TGF-β1), le basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), le
Vascular Edothélial Growth Factor A (VEGF-A) et insulin-like Growth Factor (IGF) ont été

27
rapportés comme stimulant la migration des CSM (Fiedler et al., 2002); (Fiedler et al., 2004);
(Fiedler et al., 2005); (Fiedler et al., 2006), le PDGF et l'IGF-1 (Ponte et al., 2007). Des petites
protéines, les chimiokines, ont été rapportées comme induisant la migration des CSM (Sordi et al.,
2005); (Honczarenko et al., 2006); (Ponte et al., 2007). C'est le cas de la chimiokine de SDF-
1(CXCL12) mais aussi de Fractaline (CXC3CL1), BCA-1(CXCL13), SIC B6 (CXCL16), MIP-3β
(CCL19), 6CKine (CCL21), TECK (CCL25), MIP-1α (CCL3), et RANTES (CCL5) et moins
activement de la chimiokine MDC (CCL22). En effet, les CSM exprimeraient les récepteurs
CXCR4, CXCR5, CXCR6, CX3CR1, CCR1 ET CCR7 et CCR9 (Sordi et al., 2005); (Honczarenko
et al., 2006). Le Tumor Necrosis Factor α (TNF α) a été rapporté comme induisant une augmentation
de la sensibilité des CSM pour toute chimiokine (Ponte et al., 2007).

Des chimiokines et des molécules régulatrices représentant le modèle de la migration des

CSM et qui guident ces cellules vers un environnement approprié doivent être pleinement identifiées
(Brooke et al., 2008). Ainsi, il a été prouvé, in vitro et in vivo, que la matrice metalloprotéinase-1
(MMP1) et le récepteur PAR1 jouent un rôle dans la migration des CSM hypoxiques vers les
cellules du gliome humain (Ho et al., 2009). La nicotine agit sur la migration des CSM hypoxiques
qui expriment les sous-unités 7, 2 et 7 du récepteur acétylcholine nicotinique (Schraufstatter et
al., 2009). Le PAF (Platelet-activating factor) et oxLDL stimulent la migration des CSM hypoxiques
in vitro (Shin et al.).

II.2.2. les études in vivo

Plusieurs études in vivo reposant sur une grande variété des modèles animaux ont montré
l'utilité des CSM dans la réparation ou la régénération des tissus lésés comme l'os, le cartilage ou le
muscle cardiaque (Bianco and Gehron Robey, 2000); (Pereira et al., 1998); (Toma et al., 2002), mais
aussi dans des stratégies de thérapie génique (Bartholomew et al., 2002); (Duan et al., 2003);
(Pereira et al., 1995).

L'injection systémique de CSM est une stratégie non invasive permettant l'administration d'un
grand nombre de cellules avec un potentiel d'application clinique (Bianco et al., 2001); (Koc et al.,
2002) pour la réparation des tissus ou des organes. Les CSM peuvent migrer in vivo vers différents
organes non hématopoïétiques (comme le poumon, le foie, le rein, la peau ou le thymus) et proliférer
après irradiation létale chez des babouins (Devine et al., 2003) et des macaques (Chapel et al., 2003)

28
mais également chez des rongeurs (Anjos-Afonso et al., 2004); (Francois et al., 2006). D'autre part,
il a été montré que les CSM humaines transplantées à des brebis gestantes peuvent persister 13 mois
après leur transplantation en ayant subi une différenciation organe-spécifique en chondrocytes, en
adipocytes, en myocytes et en cardiomyocytes, ainsi qu'en cellules stromales de la moelle osseuse
(Liechty et al., 2000), comme cela a été rapporté par d'autres (Pereira et al., 1995). Nous avons dans
un précédent travail décrit la différenciation vasculaire musculaire lisse de CSM implantées sur des
patchs prothétiques au niveau de l’aorte abdominale (Mirza et al., 2008); (Bonnet et al., 2008).

Pour l'instant, il existe peu de publications décrivant les résultats de l'utilisation thérapeutique
des CSM chez l'homme. Koc et al ont montré, chez des patients atteints du cancer ayant été traités
par chimiothérapie à dose intensive, qu'une greffe autologue de CSM combinée avec une greffe de
CSH du sang périphérique, entraînait une accélération de la reprise hématopoïétique (Koc et al.,
2000). Les données les plus documentées concernent la reconstruction locale de CSM (Quarto et al.,
2001) ou le traitement des désordres génétiques comme l'osteogenesis imperfecta après leur
administration systémique (Horwitz et al., 2002).

Un autre aspect de la migration des CSM est leur capacité de mobilisation dans le sang
périphérique. Une telle propriété présenterait un intérêt évident pour permettre d'envisager
l'utilisation de CSM endogènes pour la réparation tissulaire sans passer par une étape de culture. Les
études sur ce sujet montrent des résultats contradictoires synthétisées dans le tableau suivant :

29
 D'après l'ensemble de ces résultats, il semble exister une petite population de CSM circulantes,
qui varie en fonction de la méthode d'isolement et de culture, et du modèle utilisé. L'utilisation de
tels modèles animaux a aidé à l'étude de cette population de CSM circulantes, en montrant
l'existence d'un pool circulant de CSM capables de coloniser la moelle osseuse ainsi que des
organes endommagés (Wu et al., 2003).

Un moyen spécifique de mobilisation pourrait être initié par stimulation répétée avec des
cytokines tels que le facteur de stimulation des colonies granulocytaires (granulocyte colony
stimulating factor, G-CSF), le facteur de stimulation des colonies granulocytaires-macrophagiques
(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF) (Fernandez et al., 1997); (Kucia et
al., 2004), ou récemment par plusieurs circonstances physiopathologiques comme l'infarctus du
myocarde ou l'encépholopathie (Zyuz'kov et al., 2005).

En effet, après injection de G-CSF pendant le développement de l'encéphalopathie hypoxique

chez les souris, des CSM ont été trouvées mobilisées dans la circulation sanguine, domiciliées dans
des zones endommagées et engagées vers des voies de différenciation (Zyuz'kov et al., 2005). De
même, après un infarctus du myocarde et un traitement au G-CSF chez les souris irradiées, des CSM
étaient mobilisées et exprimaient des marqueurs cardiomyogéniques (Kawada et al., 2004).
Récemment, Zhaokang et al ont confirmé que la présence de G-CSF augmentait significativement

30
la migration des CSM injectés par voie intraveineuse vers le coeur. Toutefois, la fonction cardiaque
ne s'était pas améliorée (Zhang et al., 2007). Très récemment, Vallabhaneni et al. ont suggèré un
récepteur un rôle de guide et de contrôle du récepteur uPAR sur la migration des CSM en réponse à
une blessure ou une ischémie ainsi que sur leur différentiation en VMCs fonctionnelle
(Vallabhaneni et al., 2008).

III- Rôle des petites protéines G de la famille Rho dans la migration

mésenchymateuse

La migration cellulaire nécessite l’existence d’un phénomène dynamique de réorganisation du

cytosquelette d’actine. L’étude des petites protéines G de la famille Rho, au début des années 1990,
a permis de développer la recherche sur la régulation du cytosquelette et celle concernant la
transduction du signal à partir de récepteurs membranaires.

III.1. Les petites protéines G de la famille Rho

I.1.1.Présentation de la famille des proteines RhoGTPases

Les petites protéines G constituent une super famille d’au moins une centaine de protéines
qui sont apparentées à la protéine Ras présente chez tous les eucaryotes (Rat Sarcoma). Elles
présentent entre elles d’importantes homologies de séquence qui traduisent une organisation très
similaire en domaines structuraux et fonctionnels. Selon des critères d’homologie de séquence et de
fonction, ces protéines sont regroupées en 5 familles principales composée de 8 groupes distribués
dans 4 clusters (Boureux et al., 2007).

Les protéines Ras comprend en particulier les protéines H-Ras, K-Ras et N-Ras qui sont impliquées
dans le contrôle de la prolifération cellulaire, la survie cellulaire, la différenciation, l’organisation du
cytosquelette d’actine, la transcription ou encore le trafic vésiculaire (Mitin et al., 2005). Les
protéines de la famille Rab (ras-related in brain) participent à la régulation du transport vésiculaire

31
et du trafic protéique entre les différents organelles des voies endocytaires et sécrétoire (Fukuda,
2008). Les protéines de la famille Sarl/Atf (Adp ribolysation factor) sont impliquées plus
particulièrement dans le trafic vésiculaire golgien ((Donaldson and Honda, 2005)). Les protéines de
la famille Ran (Ras related in nucléar import and export) sont impliquées dans la régulation du
transport nucléocytoplasmique et des protéines (Weis, 2003).

La famille Rho comprend 22 membres dont les plus connus sont RhoA, Rac1 et Cdc42Hs, nommée
plus communément Cdc42 (Jaffe and Hall, 2005).La fonction principale des petites protéines G de
cette famille est de contrôler l’organisation du cytosquelette d’actine (Aspenstrom et al., 2004). La
régulation du cytosquelette d'actine par trois GTPases: Rac1, Cdc 42 et RhoA est la plus connue.
Toutefois, les GTPases de la famille Rho agissent aussi au niveau de nombreuses voies de
signalisation, telles que celles de l’apoptose, la prolifération ou la différenciation (Jaffe et al, 2005;
Ridley, 2006). La localisation cellulaire très variée des GTPases Rho traduit la grande diversité des
fonctions cellulaires auxquelles elles participent. Les protéines Rac-1 et Cdc42 sont retrouvées
essentiellement au niveau de l'enveloppe nucléaire, du réticulum endoplasmique et de l'appareil de
Golgi.

Les petites protéines G partagent environ 30% à 60% d’homologie de séquence en acides
aminés sur leur domaine GTPase avec les protéines Ras et 40 à 95 % entre elles (Wennerberg and
Der, 2004). La structure de Ras est classiquement utilisée comme modèle pour tous les membres de
la super famille. Dans la partie N-terminale de ces protéines, se trouve la majorité des acides aminés
impliqués dans la liaison et l’hydrolyse du GTP.

Figure I.2 : Structure des petites GTPases Rho

32
 Elles partagent un ensemble d’éléments contenant des motifs de liaison au GDP/GTP
(Bourne et al., 1991). Des analyses de cristallographie et par résonance magnétique nucléaire de ces
petites protéines ont révélé la présence d’un domaine catalytique unique pour touts les membres de
cette superfamille. Ce domaine est constitué de cinq hélices  (A1-A5), six feuillets  (B1-B6) et de
cinq boucles peptidiques (G1-G5). Deux régions fonctionnelles y ont été mises en évidence : la
région Switch I qui correspond à la boucle G2 et la région Switch II qui est formée par la boucle G3
et une partie de l’hélice A2 (Paduch et al., 2001). La région C-terminale est une région dite
« hypervariable » car l’essentiel des différences de séquence primaire entre les protéines Rho se
trouve concentré dans cette région de 25 acides aminés, site de modifications post–traductionnelles
(Allal et al., 2002).

Figure I.3 : Domaines Switch des GTPases

La plupart des protéines de la super famille Ras agissent comme des interrupteurs moléculaires
grâce à leurs interactions au niveau de la boucle polypeptidique G5 avec des nucléotides
guanidiques. En effet, ces protéines oscillent entre une conformation inactive lorsqu’elles sont liées
au GDP (guanosine diphosphate) (figure I.4 B) et une conformation active (figure I.4 A) quand elles
sont liées au GTP. Ce domaine est commun à tous les membres de cette super famille mais aussi
aux sous-unités des  des protéines G hétéromériques.

33
Figure I.4 : Structure du domaine catalytique des protéines de la famille Ras (d’après Paluch et
al, 2005)

III.1.1.2.Activation des GTPases

L’activation des Rho-GTPases est déclenchée en réponse à divers signaux extracellulaires qui
stimulent l’échange du GDP contre le GTP. Elle nécessite aussi un ancrage à la membrane
plasmatique. Le motif CAAX situé à l’extrémité C-teminale des petites protéines G (figure I.2) est
modifié par l’adjonction d’un groupement isoprényl, soit farnésyl (15 carbones) pour les protéines
dont le résidu X est une sérine ou une méthionine, soit géranylgéranyl (20 carbones) lorsque le
résidu X est une leucine (Winter-Vann et al., 2003). Les résidus AAX sont ensuite clivés et
exposent la fonction carboxylique en C-terminal alors méthyl-estérifiée (Konstantinopoulos et al.,
2007). Ensuite, les GTPases présentant en N-terminal de la séquence CAAX un groupement de
cystéines subissent à ce niveau une palmitoylation qui augmente alors l’ancrage à des secteurs
spécifiques de la membrane plasmique (Hancock et al., 1991). Les petites protéines G présentent
une grande affinité pour les nucléotides guanidiques et une faible activité enzymatique intrinsèque

34
d’hydrolyse du GTP et d’échange du GDP/GTP (Wennerberg and Der, 2004).Trois classes de
protéines régulatrices contrôlent le passage d’un état à l’autre: les GEFs, les GAPs et les GDIs.

Les GEFs (GTP Exchange Factors) favorisent l’échange d’une molécule de GDP par une molécule
de GTP en se liant à la forme Rho-GDP. Elles déstabilisent le complexe GDP-GTPase et stabilisent
la forme intermédiaire non liée aux nucléotides. Étant donné que le rapport de la concentration
intracellulaire GTP/GDP est élevé, le GDP libéré est remplacé par un par un GTP menant ainsi à
l’activation des GTPases (Schmidt et al, 2002). La plupart des GEFs comportent un « domaine
DH » (Dbl homology), responsable de leur activité catalytique, associé en C-terminal à un
« domaine PH » (Pleckstrin Homology) pouvant moduler l’activité d’échange ou interagir avec des
phospholipides et des protéines et ainsi cibler les GEFs à la membrane (Rossman et al., 2005). Le
domaine PH est également impliqué dans l’inhibition des GEFs par son association intramoléculaire
suite à un changement de conformation comme pour la protéine Vav 3, GEF spécifique de Rac1 par
exemple. Cette inhibition peut être levée grâce à la phosphorylation des GEFs, à leur interaction
avec les sous unités  des protéines G hétérodimériques ou avec le phosphatidylinositol 3, 4, 5
triphosphate (PIP3).

Les GAPs (GTPases Activating Protein) stimulent l’activité d’hydrolyse enzymatique intrinsèque
faible des Rho GTPases ramenant la protéine à l’état inactif sous la forme Rho-GDP. Elles
présentent une région commune de 170 acides aminés nommée « domaine RhoGAP » ou « domaine
BH » correspondant à l’activité catalytique (Peck et al, 2002). Ces protéines peuvent être régulées
positivement et négativement par interactions avec d’autres protéines en induisant un changement
de conformation au niveau des sites catalytiques mais également par des modulations du niveau de
leur phosphorylation en régulant leur localisation subcellulaire, leur dégradation avec d’autres
protéines ou des phospholipides (Sordella et al., 2003); (Bernards, 2003).

Les GDIs (Guanine nucléotide Dissociation Inhibitor) jouent un rôle important dans l’adressage
des RhoGTPases à la membrane. Les GDIs jouent un rôle important dans l’adressage des
RhoGTPases à la membrane. Tout d’abord, elles inhibent l’activité d’échange de GDP contre du
GTP de la protéine. Ensuite, elles ont la capacité de se lier à la forme active des GTPases, bloquant
ainsi l’hydrolyse du GTP et empêchant leur interaction avec des effecteurs. Enfin, elles jouent un
rôle important dans la localisation cellulaire des GTPases. En masquant le résidu hydrophobe C-
terminal, les protéines GDI empêchent leur ancrage à la membrane plasmique et maintiennent un
pool de GTPases cytoplasmique. Ces GTPases monomériques sont, par conséquent, cytosolubles
sous forme inactive et membranaires sous forme active.

35
 De plus, il est intéressant de noter que certains effecteurs des GTPases peuvent réguler
l’activité des GDI et donc créer une boucle de régulation. Par exemple, PAK (p21-activated kinase),
un effecteur de Rac1, phosphoryle RhoGDI sur deux résidus sérine situés dans la poche de fixation
du groupement isoprényl de la GTPase.et provoque le relargage de Rac1. Elle permet alors une
activation de la GTPase par un GEF (DerMardirossian et al., 2004). L’ubiquitinilation de la ligase
E3 smurf1 stimulée par un effecteur Rac1 favorise l’activité de la RhoGTPase. (Lemonnier et al.,
2007)

La régulation de l’état d’activation des GTPases de la famille Rho passe donc non seulement par les
trois types de partenaires que sont les GEF, les GAP et les RhoGDI, mais semble aussi passer par
une boucle de régulation dépendante des effecteurs.

Figure I.5: Cycle d’activation des petites GTPases de la famille des protéines Rho.

Les protéines Rho activées interagissent avec de nombreux effecteurs à différents niveaux pour
permettre la transduction du signal.

36
III.2. Réorganisation du cytosquelette d’actine par les petites protéines G de la
famille Rho.

Le rôle de ces protéines dans l’organisation du cytosquelette d’actine a été démontré dans les
études sur les cellules fibroblastiques mobiles. Ces cellules fibroblastiques, les Swiss 3T3, ont été
micro-injectées avec les formes sauvages, mutantes activées ou inactivées de RhoA, Rac1 ou Cdc42.
Le marquage par immunofluorescence de l’actine, la vinculine, la taline ou encore la paxilline a
permis de déterminer l’action spécifique des trois petites protéines G de la famille Rho dans la
réorganisation du cytosquelette d’actine, en réponse à différents stimuli.

La formation de petites protrusions en épines à la périphérie de la cellule, nommées

filopodes, a été observée à la suite de la micro-injection de Cdc42G12V, la forme activée de Cdc42
(Kozma et al., 1995). Les filopodes sont des avancées de la membrane cellulaire en forme de doigt
ou de fil, mesurant jusqu'à quelques micromètres de longueur et quelques nanomètres de diamètre.
Leur architecture est structurée par des faisceaux parallèles de filaments d’actine (Block et al.,
2008); (Nagy et al., 2008). Il s’agit d’une structure dynamique formée à l’extrémité du front de
migration cellulaire où elle établit de nouveaux contacts avec le substrat. Les filopodes jouent un
rôle important dans l’établissement de la direction de migration des cellules (Nagy et al., 2008)
(Figures I.6 et I.7).

Figure I.6 : Cascade des GTPases RhoA, Rac1 et Cdc42 impliquées dans l’organisation du
cytosquelette des cellules Swiss 3T3 (d’après (Mackay and Hall, 1998).

37
Figure I.7 : image de microscopie électronique d’une cellule en migration

De plus, après stimulation par Cdc42G12V, il a été observé, dans un deuxième temps,
l’apparition de lamellipodes qui sont de larges avancées de membrane sur une faible épaisseur en
forme de lamelle, sous-tendues par un ensemble de filaments d’actine associés en réseau. Puis, dans
un délai plus long, apparait une augmentation du nombre et de la taille des fibres de stress, câbles
d’actine associés à de la myosine qui traversent de part en part la cellule.

La micro-injection de Rac1 sous forme sauvage ou dominant positif (Rac1G12V) dans les
cellules Swiss 3T3, ou la stimulation des cellules par du PDGF, de l’EGF ou de l’insuline entraîne
une accumulation d’actine filamenteuse au niveau de la membrane et la formation de replis
membranaires (Ridley and Hall, 1992); (Ridley et al., 1992). Rac1 est également responsable de la
mise en place de lamellipodes. Ces lamellipodes sont formés au front de migration cellulaire où ils
dirigent la progression des cellules mobiles. La formation des lamellipodes semble être coordonnée
avec celles des filopodes. Des replis membranaires, structuralement similaires aux lamellipodes
mais formés sur la face dorsale des cellules adhérentes ou des leucocytes, sont également induits par
Rac1 (Makino et al., 2007) (Figures I6 et I7). Enfin, dans les conditions de microinjection de
Rac1G12V, et de manière plus tardive, on observe l’apparition de fibres de stress accompagnées de
l’agrégation de la vinculine et de la taline dans des points d’adhérence focaux (PAF).

La forme activée de RhoA (RhoAG14V) micro-injectée dans les cellules Swiss 3T3
entraine la mise en place de fibres de stress et de PAF (Paterson et al., 1990); (Ridley and Hall,
1992). Ces fibres en tension interagissent avec la matrice extracellulaire au niveau des PAF. Leur
formation est corrélée avec une mobilité cellulaire moindre et un ancrage plus important à la

38
matrice. L’acide lysophosphatidique (LPA) contenu dans le sérum est capable de reproduire la
formation de fibres de stress et de PAF (Ridley and Hall, 1992) (Figures I.6 et I.7).

Ces résultats mettent en lumière une cascade d'activation entre les GTPases Cd 42, Rac1 et
Rho A induisant de manière séquentielle la formation de structures membranaires distinctes.
L’activation de Cdc42, sous sa forme GTP, permet la formation de filopodes et entraine l’activation
de Rac1. Cette activation conduit à la formation de replis membranaires et de lamellipodes. Enfin,
l’activation de Rac1 conduit à une activation de RhoA, entraînant la formation de plaques
d’adhérence et de fibres de stress. Il existe un contrôle coordonné de la mobilité cellulaire par les
petites protéines G de la famille Rho, à la fois sur le plan temporel et sur le plan spatial dans les
fibroblastes Swiss 3T3 mais également dans d’autres types cellulaires (Malliri and Collard, 2003);
(Nobes and Hall, 1999) (Figures I.6 et I.7). De nombreux effecteurs de Rac1 et Cdc42 contribuent
au réarrangement du cytosquelette d’actine en aval de l’activation de ces deux GTPases
(Raftopoulou and Hall, 2004).

Figure I.8 : Les différentes étapes de la migration cellulaire. Cdc42 régule la direction de la
migration, Rac1 induit la formation de protrusions membranaires au niveau du front de
migration de la cellule et RhoA permet la contraction des filaments d’actomyosine à l’arrière de
la cellule.(D’après (Raftopoulou and Hall, 2004))

39
Ainsi, Rho, Rac-1 et CD42 jouent un rôle essentiel dans ces processus de remodelage de la
membrane plasmique par la réorganisation du cytosquelette d'actine (Fackler and Grosse, 2008). Rac
régule directement l'allongement des filaments d'actine en démasquant leur extrémité barbée, et ce
en agissant sur la synthèse du phosphatidylinositol (4,5)-biphosphate (PIP2).

III. 3 Activation de la voie Rac1, PAK1 et LIM-K1

La dépolymérisation des filaments d’actine est régulée par ADF/cofiline (actin

dépolymerizing factor) qui dissocie les filaments d’actine à l’extrémité « minus ». Rac régule
directement l'allongement des filaments d'actine en démasquant leur extrémité barbée, et ce en
agissant sur la synthèse du phosphatidylinositol (4,5)-biphosphate (PIP2).

En fait, Rac active son effecteur PAK qui lui même stimule la LIMKinase qui va phosphoryler
et inactiver l’activité déstabilisatrice de la cofiline (Disanza et al., 2005) (figure I.9). Celle-ci
provoque ainsi la stabilisation des filaments d’actine. L’activation des LIMKinases est aussi
contrôlée par Rho via son effecteur de la Rho Kinase (Rock). Dans ce cas, le comportement
migratoire des CSM

Figure I.9: Rôle des RhoGtPases dans la polymérisation de l’actine (d’après (Ridley, 2006)).

40
 PAK1 appartient à la famille des kinases. Les PAKs (p21 Activated Kinase) ont été les
premières kinases régulées par les petites protéines G identifiées lors d’une évaluation de partenaires
des GTPases activées dans le cytosol de cerveau de rat (Manser et al., 1995). Ces protéines sont les
effecteurs directs de Rac1 et de Cdc42 mais pas de RhoA. Il existe plusieurs isoformes de PAK :
PAK1 ou αPAK, PAK2 ou γPAK et PAK3 ou βPAK, et un PAK non conventionnel appelé PAK4,
relativement proche de PAK2/γPAK. Les PAKs se lient uniquement aux formes GTP de Rac1 et
Cdc42 par leurs domaines CRIB (Cdc42/Rac1 Interactive Binding) (Burbelo et al., 1995); (Manser
et al., 1995). In vitro, les isoformes PAK1 et PAK3 se fixent de manière identique à Rac1 et Cdc42.
cependant Cdc42, sous forme GTP, stimule l’activité de PAK1 de manière plus importante par
rapport à Rac1 (Manser et al., 1995). Une fois activées par Rac1 et Cdc42, les PAKs peuvent activer
d’autres protéines via leur activité sérine/thréonine kinase (Zhao and Manser, 2005).

Parmi celles-ci, les LIMKinases, protéines activées à serine Kinase, prennent une place importante
dans la signalisation induite par Rac 1/ Cdc 42 via les PAKs (Arber et al., 1998). Les LIMkinases
sont caractérisées par la présence de deux domaines LIM suivis par un domaine PDZ ainsi qu’un
domaine Kinase C terminal. A l’heure actuelle, deux isoformes sont connues, LIMK1 et LIMK2,
dont les seuls substrats connus sont des protéines de la famille ADF (actin dépolymerizing factor)
(Scott and Olson, 2007).

La famille ADF comprend notamment la Cofiline 1 et l’ADF/destrine. Leur phosphorylation

sur la serine 3 par les LIMKinases entraine l’inhibition de la liaison à l’actine F et donc la capacité à
catalyser la dépolymérisation et la coupure de l’actine F (Bamburg and Bernstein, 2008). Leurs
fonctions apparaissent donc indispensables pour la dynamique de l’actine générant de l’actine G ou
de petits polymères n écessaires au déclenchement ultérieur de la polymérisation de nouveaux
filaments d’actine. L’action des LIMKinases et de ADF/Cofiline joue un rôle dans de nombreux
processus qui requièrent un réarrangement rapide de l’actine (Van Troys et al., 2008).

Il a été aussi décrit l’activation par Rac1 de la PI3K, dont le substrat est PIP2. Si les effets de
cette activation sur les voies de contrôle de l’apoptose représentent un élément important de cette
voie (Rioux-Bilan et al., 2008), la synthèse de PIP3 en réponse à Rac1 est également un élément très
important dans la régulation de la mobilité cellulaire (Sidani et al., 2007); (Van Troys et al., 2008).

41
 Diverses protéines favorisent la polymérisation de l’actine. La protéine WASP, absente ou
mutée chez les patients atteints du syndrome de Wiskott-Aldrich, est exclusivement exprimée dans
les cellules hématopoïétiques (Symons et al., 1996). Les cellules de ces patients présentaient une
surface cellulaire anormalement irrégulière, ce qui laissait présager un rôle de WASP sur le
cytosquelette. Les protéines de la famille WASP peuvent être séparées en deux groupes : les
protéines WASP et N-WASP et les protéines WAVE. Les protéines WAVE ne possèdent pas de site
de liaison direct aux GTPases mais une connexion fonctionnelle avec Rac1 (Miki et al., 1998). Elles
semblent jouer un rôle important dans la formation des lamellipodes induits par Rac1 (Jaffe and
Hall, 2005). En effet, il a été montré d’une part que WAVE est localisé préférentiellement au niveau
des lamellipodes et d’autre part que la surexpression d’un mutant d’un domaine C-terminal de
WAVE conduit à l’inhibition de la formation des replis membranaires induits par Rac1.

Figure I.10 : Voies de signalisation activées par Rac1 et Cdc42 et contrôlant la formation des
lamellipodes et des filopodes. Rac1 et Cdc42 interagissent avec différentes cibles, comme la
serine/thréonine kinase PAK, la lipide kinase PIP-5 kinase, les protéines de la famille
WASP/WAVE qui sont toutes impliquées dans la réorganisation du cytosquelette.

Hypothèse 1 : L’activation de Rac1 liée à l’hypoxie chronique pourrait modifier la balance

ROCK1/Rac1 à l’état basal au niveau des CSM hypoxiques et modifier leur comportement
migratoire en réponse à une stimulation par des cytokines.

42
B. Hypoxie chronique et migration mésenchymateuse

I. Hypoxie chronique et métabolisme cellulaire

I.1.1Définition de l'hypoxie chronique

On distingue habituellement deux grands types d’hypoxie, l’hypoxie aigue et l’hypoxie

chronique (Coleman, 1988). L’hypoxie aigue se caractérise par une exposition des organes, tissus ou
cellules à une faible concentration en oxygène pendant des temps relativement courts, pas plus de
quelques heures. Au-delà, s’installe une hypoxie dite chronique qui se caractérise par des temps
d’exposition à une faible concentration en oxygène beaucoup plus long. L’hypoxie chronique fait
appel à des phénomènes de réponse et d’adaptation des cellules et est donc un paramètre important
dans le processus tumorigène. Les cellules de mammifères sont capables de répondre et de s’adapter
à ces conditions d’hypoxie via des voies de signalisation très conservées qui vont aboutir à différents
phénomènes physiologiques (Papandreou et al., 2005) comme l'angiogénèse et la formation de néo-
vaisseaux.

.1.2. Métabolisme oxydatif mitochondrial

Les mitochondries fournissent, en aérobiose, l'essentiel de l'énergie nécessaire aux

différents travaux cellulaires (Harris and Das, 1991). Cette énergie, produite sous la forme de
molécules d'ATP (environ 70 kg/j pour un homme au repos) est synthétisée à partir de l'oxygène et
des nutriments. En effet, dans les mitochondries, se déroulent une partie de l'oxydation des glucides,
des acides aminés, et la totalité de celle des acides gras. Au cours de ces réactions cataboliques
(cycle de Krebs, bêtaoxydation des acides gras), l'énergie contenue dans ces molécules permet la
réduction de coenzymes (NAD+ et FAD). L'énergie intrinsèque de ces équivalents réduits,
essentiellement NADH et FADH2, est transformée en une forme d'énergie directement utilisable
pour le travail cellulaire, l'ATP. Cette transformation, qui porte le nom d'oxydation phosphorylante,
repose sur une série de réactions d'oxydoréduction au niveau de la chaîne respiratoire couplée à

43
l'ATP-synthase (Mitchell, 1961). Ces réactions sont assurées par des complexes enzymatiques
constitués de sous-unités codées à la fois par l'ADN nucléaire et par l'ADN mitochondrial.

L'ATP ainsi produit est continuellement utilisé par la cellule pour de nombreuses réactions
du métabolisme. Dans le cytosol, l'ATP représente alors le principal intermédiaire énergétique: le
couplage de l'hydrolyse de l'ATP avec une réaction endergonique permet de transférer l'énergie de
ces deux liaisons phosphate. Dans l'organisme, cette transduction d'énergie s'opère au cours des
processus biologiques comme les mouvements cellulaires, les biosynthèses ou les transports actifs.

Selon la théorie de Mitchell, la chaîne respiratoire mitochodriale (CRM) est constituée

d'une suite de réactions d'oxydoréduction associant l'oxydation du NADH et du FADH 2 à la
réduction de l'oxygène et formation d'eau ((Mitchell, 1961)). Elle est composée de quatre complexes
hétéropolymériques localisés dans la membrane interne mitochondriale. Les gènes de l'ADN
mitochondrial codent pour des sous-unités de ces complexes enzymatiques, à l'exception de celles
du complexe II codées uniquement par l'ADN nucléaire.

Le complexe I (NADH ubiquinone oxydoréductase) est le plus gros des complexes enzymatiques de
la chaîne respiratoire avec une masse d'environ 980000 daltons et 45 ou 46 sous-unités
polypeptidiques différentes. Il accepte les électrons du NADH et les transmet, par l'intermédiaire
d'une flavine et de sept ou huit centres fer-soufre, à l'ubiquinone UQ qui transfère secondairement
ses électrons au complexe III. L’hydrogène, substrat de l’enzyme, est apporté par le NADH puis est
transféré vers le coenzyme Q. Ce complexe expulse les protons de la matrice vers l'espace
intermembranaire. Plus de 60 familles différentes de composés sont identifiées comme des
inhibiteurs du complexe I, dont le plus connu est la roténone.

Le complexe II (succinate ubiquinone oxydoréductase) a une masse d'environ 200000 daltons. Il est
commun au cycle de Krebs et à la chaîne respiratoire. En effet, ce complexe réalise l'oxydation du
succinate en fumarate pour réduire le FAD en FADH 2, puis il prend en charge deux électrons du
FADH2 et les transmet au pool quinonique situé dans la membrane interne mitochondriale mais ce
transport n'est pas couplé à un transfert de protons vers l'espace intermembranaire. Il est composé de
quatre sous-unités et contient un FAD et quelques centres fer-soufre.

Le complexe III (ubiquinone cytochrome c oxydoréductase). Sa forme active est un dimère. Chaque
monomère est composé de 11 sous-unités polypeptidiques et possède une masse de 240000 daltons.
Il comprend un cytochrome b, un cytochrome c 1, appelé coenzymeQ-cytochrome c oxydoréductase

44
et une protéine fer-soufre. Il transporte les électrons de l'ubiquinol au cytochrome c qui se déplace
dans l’espace inter membranaire. Il est inhibé par l'antimycine ou le myxothiazol.

Le complexe IV (cytochrome c oxydase) a une masse de 204000 daltons et contient 13 sous-unités

polypeptidiques. Il contient les cytochromes a et a 3 et des protéines fer-cuivre. Les sous-unités I, II
et III sont codées par le génome mitochondrial et forment le site actif du complexe (cytochrome a 3-
CuB). Ce complexe transporte les électrons du cytochrome c vers l'oxygène et participe, comme les
complexes I et III, à l'expulsion de protons vers l'espace intermembranaire. Il est inhibé par le
cyanure de potassium ou l'azide de sodium.

Figure I.11 : Schéma bilan de la chaîne respiratoire

Chaque complexe de la chaîne respiratoire a une plus grande affinité pour les électrons que son
prédécesseur. La chaîne respiratoire catalyse ainsi des réactions d'oxydoréduction successives entre
des couples de potentiel redox croissant. Les électrons passent ainsi en cascade d'un complexe à
l'autre grâce à des transporteurs. Ils sont finalement transférés à l'oxygène, qui a l'affinité la plus
grande pour les électrons.

45
 Le transfert des électrons est couplé à des modifications allostériques des protéines des
complexes I, III et IV associées à l'expulsion de protons de la matrice mitochondriale vers l'espace
intermembranaire. Ce mouvement de protons a deux conséquences majeures:

- crée un gradient de pH (ΔpH) à travers la membrane mitochondriale interne avec une concentration
matricielle de protons plus faible que celle de l'espace intermembranaire :

- engendre un potentiel de membrane (ΔΨ) à travers la membrane mitochondriale interne, de -180

mV environ.

La résultante de ces deux forces constitue un gradient électrochimique de protons (ΔμH +)

qui tend à faire entrer les protons dans la matrice mitochondriale. L'énergie emmagasinée dans le
gradient électrochimique de protons est utilisée pour assurer la phosphorylation de l'ADP en ATP
(théorie de Mitchell).

L'ATP-synthase (F1-F0) ou complexe V produit l'ATP à partir de l'ADP et de Pi dans la

matrice mitochondriale, suivant une réaction couplée à l'entrée des protons. C’est un complexe
multimérique possédant une masse apparente de 600 000 daltons. Il est composé d'un secteur
catalytique (matriciel), la sous-unité F1 q qui quand il est détaché du reste de la structure, peut
hydrolyser l'ATP, d'un secteur membranaire le canal F0 et deux bras connecteurs. Les sous-unités du
secteur membranaire (F0) essentiellement de sous-unités hydrophobes, forment une voie de passage
aux protons (Fillingame, 1999).

Les mitochondries consomment 90% environ de l'oxygène cellulaire (Chance et al.,

1979). Malgré l'efficacité de la chaîne respiratoire à transférer les électrons, l'environnement
intramitochondrial hautement réducteur et la nature des réactions redox catalysées font que divers
composants contenant des flavoprotéines, des centres fer-soufre et l'ubisemiquinone sont
thermodynamiquement capables de transférer un seul électron à une molécule d'oxygène et ainsi être
des sites de production de radicaux libres de l'oxygène (RLO). Ainsi, les RLO (anion superoxyde O 2
-
, radical hydroxyle OH- et peroxyde d'hydrogène (H2 O2) sont des sous-produits toxiques de la
respiration.

Dans une cellule à l'état de repos, 1 à 2% des électrons transportés au niveau de la chaîne
respiratoire mitochondriale vont aboutir à la production d'anions superoxydes à partir des complexes
I et III (Ksenzenko et al., 1992); (Beyer, 1990). Ces anions sont, soit libérés dans le cytosol, soit
neutralisés dans la mitochondrie par une superoxyde dismutase sensible au manganèse (MnSOD).
En l'absence de stress oxydatif majeur, les systèmes antioxydants neutralisent les effets de la

46
production de RLO. En effet, les organismes sont capables de s'adapter à des augmentations de RLO
prolongées en augmentant l'expression des enzymes antioxydantes et en stimulant les différents
systèmes de défense pour lutter ou réparer les dommages cellulaires (Demple, 1999) ; (Hermes-
Lima and Zenteno-Savin, 2002)

I.1.3 Hypoxie et métabolisme oxydatif mitochondrial

L’hypoxie place la cellule face à un défit métabolique qui lui impose de devoir adapter son
métabolisme pour subsister. Chez les eucaryotes, la plus grande partie de la formation d’ATP
aérobie se déroule dans la mitochondrie, véritable usine énergétique. Pour beaucoup d’organismes,
l’accepteur ultime d’électrons est l’oxygène. La forme réduite de cet accepteur est l’eau qui est donc
le produit final de ce métabolisme. Ce processus qui consomme de l’oxygène dans ses étapes finales
est appelé respiration aérobie. Au contraire, les métabolismes qui mettent en jeu des accepteurs
d’électrons qui ne nécessitent pas d’oxygène correspondent à la respiration anaérobie. Ainsi,
l’oxygène est l’élément central du métabolisme cellulaire car il permet la synthèse d’ATP en étant
le dernier accepteur d’électrons au sein de la phosphorylation oxydative.

Lors d’une hypoxie, la cellule risque de ne plus disposer de suffisamment d’oxygène pour
assurer la synthèse d’ATP qui était la sienne et maintenir son métabolisme énergétique. Une
diminution critique de la synthèse d’ATP peut induire alors une dépolarisation de la membrane
plasmatique, une ouverture des canaux voltage-dépendants du sarcolemme et une chute du potentiel
de membrane mitochondrial (Piper, 1988). Il en résulte une accumulation de Ca++ dans la cellule et
dans la mitochondrie qui provoque des lésions cellulaires irréversibles (ouverture du pore de
transition mitochondrial) (Snyder and Chandel, 2009).

Cependant, la cellule est susceptible de maintenir un taux d’ATP suffisant pour sa survie
grâce à la possibilité de moduler son métabolisme et de produire de l’ATP par voie anaérobique.
Plusieurs mécanismes d’adaptation à l’hypoxie permettent aux cellules de compenser les variations
aiguës et chroniques en oxygène. Par exemple, les chémorécepteurs artériels sont sensibles aux
variations de pression artérielle en oxygène (PaO2) et stimulent immédiatement les systèmes

47
cardiovasculaires et respiratoires en cas de diminution de la PaO 2. De même, les cellules rénales sont
capables d’ajuster leur sécrétion d’érythropoïétine (EPO) en cas d’oxygénation rénale inadéquate.
Ainsi, toutes les cellules ont la capacité de détecter des variations de PaO 2 et d’initier l’expression de
gènes par l’activation de facteurs induits par hypoxie (Semenza, 1994). De plus en plus d’arguments
dans la littérature suggèrent que la mitochondrie pourrait jouer un rôle central dans l’adaptation
cellulaire à l’hypoxie en détectant les variations de PaO 2 et en initiant la génération des facteurs
induits par hypoxie (Brunelle et al., 2005) ; (Bell et al., 2005) ; (Chandel et al., 1998) ; (Bell et al.,
2007); (Harrois et al., 2009).

I. 2 Adaptation du métabolisme mitochondrial à l’hypoxie.

I.2.1. Détection des variations mitochondriales de la pression intracellulaire en Oxygène (PaPO2)

Au cours de ces dernières années, plusieurs théories ont été avancées pour expliquer
comment une cellule pouvait percevoir la pression partielle intracellulaire en oxygène (oxygen
sensing). Malgré une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu, le sujet reste
actuellement extrêmement discuté. La mitochondrie est depuis longtemps suggérée comme pouvant
être un détecteur de la quantité d’oxygène au sein de la cellule. En effet, c’est elle qui consomme
l’oxygène et elle représente donc le site intracellulaire où la pression partielle en oxygène est la plus
basse. Dans cette hypothèse, les espèces radicalaires de l’oxygène (ERO) pourraient jouer un rôle de
médiateurs intracellulaires entre la mitochondrie et les mécanismes d’adaptations cellulaires à
l’hypoxie. Lors du fonctionnement normal de la chaîne respiratoire, les électrons provenant du
cytochrome c sont transférés vers l’oxygène provenant d’une simple diffusion à partir des
capillaires. 0,4 à 4% de l’oxygène consommé s’échappe sous forme d’anion superoxyde (O 2-) libéré
au niveau des complexes I et III mitochondriaux. Cet anion est rapidement transformé par l’enzyme
superoxyde dismutase (SOD) en une ERO plus stable mais hautement diffusible, le peroxyde
d’hydrogène (H2O2). Lors d’une hypoxie, la diminution d’oxygène au niveau du dernier complexe
mitochondrial (complexe IV – cytochrome oxydase) impliquerait une diminution de l’activité de ce
complexe et une production accrue d’ERO au niveau du complexe III mitochondrial avec une

48
élévation brutale de la quantité d’anion superoxyde qui s’échappe de la mitochondrie (Chandel et al.,
1998) et (Duranteau et al., 1998). Cette élévation d’O2− serait le signal initiateur de plusieurs
mécanismes d’adaptation cellulaire à l’hypoxie comme la régulation de hypoxia inducible factor
(HIF), la synthèse d’EPO, de facteurs de croissance vasculaire ou de transporteur du glucose
(GLUT-1). Cette diminution de l’activité de l’enzyme cytochrome oxydase s’accompagne d’une
diminution du métabolisme cellulaire (Duranteau et al., 1998) et (Budinger et al., 1998). Ce
phénomène appelé « hypoxic conformance of metabolism » entraîne une diminution d’utilisation de
l’ATP cellulaire et donc une préservation des capacités énergétiques cellulaires.

I.2.2. Régulation du facteur HIF-1

Les facteurs induits par l’hypoxie sont à l’origine de l’augmentation de l’expression de plus
de 200 gènes impliqués dans la réponse cellulaire à l’hypoxie et/ou l’ischémie (Schumacker, 2005)
et (Safran and Kaelin, 2003).

Parmi ces facteurs de transcription activés par une faible concentration d’oxygène, se
trouvent la protéine liant l’élément de réponse à l’AMP cyclique (CREB) (Beitner-Johnson and
Millhorn, 1998), l'Activator Protein-1 (AP-1) (Finkenzeller et al., 1995); (Bandyopadhyay et al.,
1995), le facteur-KB nucléaire (Nfkb) (Koong et al., 1994a); (Koong et al., 1994b) et la protéine
Early Growth Response-1 (Egr-1) (Yan et al., 1999); (Yan et al., 1998); (Lo et al., 2001); (Nishi et
al., 2002). Cependant, le facteur de transcription inductible par l’hypoxie ou « Hypoxia Inducible
Factor 1 » (HIF-1) est le régulateur le plus important dans le contrôle de l'homéostasie de l'oxygène.
HIF-1, en induisant une batterie de gènes cibles, permet la réponse et l'adaptation des cellules dans
un micro-environnement pauvre en oxygène. Ce facteur de transcription a été identifié pour la
première fois en 1992 par Gregg Semenza comme régulateur crucial de l’expression du gène de
l’érythropoïétine (EPO) en réponse à une faible concentration en oxygène (Semenza and Wang,
1992); (Wang and Semenza, 1993). A l’heure actuelle, plus d’une centaine de gènes ont été
identifiés comme cible de HIF-1. Ces gènes, permettant la réponse et l’adaptation des cellules à
l’hypoxie, sont impliqués dans les phénomènes d’angiogénèse, de glycolyse, de prolifération et
survie, de régulation du pH, d’invasion et de migration (Semenza, 2003); (Ke and Costa, 2006).

49
 HIF-1, est une protéine qui est un hétérodimère composé de deux sous-unités, HIF-1α et
HIF-1β. Chacune de ces sous-unités a une structure de base du type hélice, boucle, hélice ainsi que
deux domaines, chacun appartenant à la famille des facteurs de transcription du type PER-ARNT-
SIM (PAS-A et PAS-B). HIF-1β est exprimé de manière constante et indépendante du taux
d’oxygène. Au contraire, HIF-1α est régulé par l’oxygène et est rapidement dégradée en normoxie
par des prolylhydroxylases (PHD).

Figure I.12: Représentation schématique des domaines fonctionnels de la protéine HIF-1

La protéine HIF-1α est constituée par plusieurs domaines ou régions. La région basique
(bHLH) est impliquée dans la dimérisation et dans la liaison directe avec l’ADN. Le domaine Per-
ARNT-Sim (PAS) contient des régions hydrophobes nommées PAS A et PAS B. Ce domaine forme
une seconde zone de dimérisation entre les sous-unités α et β (Jiang et al., 1996). Le domaine PAS
est également connu pour lier la protéine chaperone HSP90 qui joue un rôle dans la stabilisation et
l'accumulation de la sous-unité HIF-1α. En plus de la région basique N-terminale (bHLH) et des
domaines PAS, la protéine HIF-1α possède dans sa moitié C-terminale, deux domaines de
transactivation (TADs) impliqués dans la régulation et la stimulation de la transcription : le domaine
de transactivation N-teminal (N-TAD) et le domaine de transactivation C-terminal (C-TAD) (Pugh
et al., 1997). Le domaine C-TAD a été montré comme agissant dans l’activation de la transcription
via l’interaction avec des co-activateurs comme p300/CBP (Lando et al., 2002); (Hewitson et al.,
2002). En amont du domaine N-TAD, se trouve un domaine de dégradation dépendant de l'oxygène
(ODD), qui confère une certaine instabilité à la sous-unité HIF-1α en présence d’oxygène ((Jiang et
al., 1997); (Huang et al., 1998)). Ce domaine comporte des résidus reconnus et hydroxylés par des
prolyl-hydroxylases (PHD). Ce domaine, situé dans sa partie centrale, s’étend sur environ 200 acides
aminés (401-603). Il contient deux prolines 402 et 564. HIF va s’associer par l’intermédiaire d’une

50
des prolines hydroxylées au complexe E3 ubiquitine ligase appelé ECV (Elongin/Cullin2/VHL)
(Figure I.13).

Figure I.13 : Le complexe E3 ubiquitine ligase (ECV) constitué de l'élongineB, l'élongineC, de

Rbx1 (également connu sous le nom de ROC1/Hrt1) et de la Culline2 (Cul2) et de la protéine
VHL (Semenza, 2008)).

Régulation sous normoxie.

En normoxie, le temps de demi-vie de HIF-1α se situe aux alentours de 5 minutes

(Maxwell et al., 2001); (Maxwell et al., 1999). HIF-1α est hydrolysé au niveau de deux prolines, les
Prolines 402 et 564, situées dans le domaine ODD (l’oxygen-dependent degradation domain). Les
prolines hydroxylées sont reconnues par le facteur de suppression tumorale von Hippel-Lindau
(pVHL) et vont pouvoir se lier à lui par l’intermédiaire de son domaine β. La protéine HIF-1α liée
au complexe E3 ubiquitine ligase celui-ci va, dans un premier temps, assurer sa polyubiqutinylation
pour, dans un second temps, la diriger vers le protéasome 26S afin qu’elle soit dégradée. (Jaakkola
et al., 2001).

51
Figure I.14 : en situation de normoxie la sous-unité Hypoxia inductible factors (HIF-1α) est
hydroxylée sur ses acides aminés par des prolylhydroxylases (pHD). Cette hydroxylation permet
à HIF-1α d’être reconnu par le facteur de suppression tumorale Von Hippel-Lindeau et d’être
degradé.

Régulation sous hypoxie.

Lorsque l’apport en O2 devient insuffisant, l’activité des PHD est inhibée et HIF-1α
s’accumule, migre vers le noyau cellulaire et s’associe à HIF-β pour initier la transcription des gènes
impliqués dans la réponse à l’hypoxie (figure I.15, Dupic L et al, 2010). Les mécanismes prévenant
l’hydroxylation de HIF-1α restent débattus, mais là encore, il apparaît que cette hydroxylation
pourrait être prévenue par la génération d’ERO mitochondriaux (Bell et al., 2007) ; (Schumacker,
2005) ; (Loor and Schumacker, 2008) ; (Chandel et al., 2000). Cette hypothèse s’appuie sur le fait
que les cellules dépourvues d’ADN mitochondrial (cellules ρ°) semblent incapables d’assurer la
stabilisation d’HIF-1α au cours de l’hypoxie (Chandel et al., 2000). De même, l’administration
d’inhibiteurs de la chaîne respiratoire mitochondriale inhibe la stabilisation hypoxique de HIF-1α
(Chandel et al., 2000) et HiF-1, via l’hypoxie, engendre un changement dans l’expression d’un
intermédiaire de la chaîne de transport d’électrons (« cytochrome c oxidase complex IV »),
augmentant ainsi l’efficacité de la respiration sous des conditions pauvres en oxygène (Fuduka et al,

52
2007). Gerald et ses collaborateurs, en utilisant un modèle cellulaire ayant perdu ses capacités
antioxydantes, ont montré qu’il existait un lien entre stress oxydatif et inhibition de HIF. Ces
différentes approches suggèrent que la voie de signalisation de HIF en situation d’hypoxie est
dépendante d’une altération de la fonction mitochondriale par l’intermédiaire de la production
d’ERO. L’accumulation d’ERO serait due à une inactivation de Jun D (une des protéines de la
famille multigénique Jun, facteur de transcription AP-1 du VGEF) et favoriserait l’accumulation
des ROS parmi lesquels le peroxyde d’hydrogène (H 2O2). Conformément à la réaction de Fenton, le
H2O2 réagit avec l’ion ferreux (Fe2+) pour produire l’ion ferrique (Fe3+). La diminution d’ion ferreux
(Fe2+) et l’accumulation de l’ion ferrique (Fe 3+) produit par réaction inhiberait l’activité enzymatique
des PHD (figure 3) (Gerald et al., 2004)

Figure I.15 : Dans des conditions d’hypoxie, les espèces radicalaires en oxygène (ERO) produites
en quelques secondes inhibent l’activité des PHD ce qui empêche la dégradation de Hypoxia
inducible factors (HIF-1α) qui va alors se lier à HIF-1 . La partie N-terminale de HIF-1
contient les domaines Basis helix Loop helix (bHLH) et PAS qui permettent la dimérisation de
HIF-1 et leur fixation sur le promoteur de nombreux genes impliqués dans la glycolyse
l’angiogénèse et la survie cellulaire.

Une autre hypothèse est actuellement débattue sur la participation de la mitochondrie

dans l’inhibition de la voie de HIF en situation d’hypoxie. Cette hypothèse est basée sur le fait que
la constante de dissociation (Km) de la cytochrome oxydase est faible (< 1 μM) et impose une large

53
utilisation de l’oxygène disponible dans la cellule. Les PHD qui interviennent dans l’hydroxylation
de HIF-1α ont un Km plus élevée. Ainsi en situation d’hypoxie les cytochromes utiliseraient tout
l’oxygène, ce qui empêcherait les PHD de fonctionner et permettrait l’activation de HIF-1 (Hagen
et al., 2003) ; (Taylor, 2008).

Ainsi, l’activation de HIF pourrait générer l’expression de gènes impliqués dans la glycolyse
et renforcer la protection cellulaire à l’hypoxie en augmentant la capacité cellulaire à générer de
l’ATP par la glycolyse anaérobie. HIF stimule également la synthèse de l’EPO qui permet la
stimulation de l’érythroblastose médullaire (Semenza, 1994) ; (Semenza, 1998) ;(Semenza, 2000) ;
(Semenza et al., 2006). HIF -1 joue également un rôle important dans la détermination de la capacité
antioxydante d’une cellule. Par exemple, des souris délètées de HIF-2α développent des
dysfonctions d’organes associées à des diminutions d’expression des antioxydants enzymatiques et
au développement de lésions de stress oxydant (Scortegagna et al., 2003). L’activation de HIF
conduit également à l’expression de l’hème oxygénase-1 (HO-1), susceptible de réguler la survie
cellulaire lors des phénomènes d’ischémie ou de reperfusion et de stress oxydant, de la NO synthase
inductible, ou du vascular endothelial growth factor (VEGF) impliqué dans l’adaptation locale
microvasculaire. Ainsi, l’activation de HIF apparaît améliorer la survie cellulaire lors de l’hypoxie
par le biais de multiples mécanismes dont l’augmentation des capacités antioxydantes, la stimulation
de l’angiogénèse, des effets anti-apoptotiques et reprogramme le métabolisme énergétique cellulaire
ainsi que le métabolisme glucidique (Semenza, 2008) (Figure I.16).

54
Figure I.16 : Représentation schématique de la régulation de HIF (Carroll and Ashcroft, 2005)

Il a été montré que lors de la mobilisation des CSM induite par hypoxie ces cellules
exprimaient le facteur HIF ((Eder et al., 2004)). D’autres auteurs ont démontré que la sous-unité
sensible à l’oxygène de la protéine HIF-1α avait la capacité de réguler le recrutement de cellules
souches progénitrices dérivant de la moelle osseuse au site de lésion du tissu afin d’amorcer sa
régénération (Ceradini and Gurtner, 2005).

Hypothèse 2 : les cellules souches mésenchymateuses soumises à l’hypoxie chronique gardent

des modifications transcriptionnelles ou posttranscriptionnelle de HIF-1α.

55
II.Hypoxie et migration des cellules souches mésenchymateuses.

Au sein de la moelle osseuse, les cellules souches adultes sont physiologiquement exposées à
une faible teneur en oxygène, évaluée à 7% à l'état stable (Ishikawa and Ito, 1988).

I.1 Les études de la migration des CSM sous hypoxie.

Des modèles mathématiques ont ainsi indiqué l'existence d'un gradient de concentration en
oxygène au sein de la moelle osseuse allant de la zone plutôt bien oxygénée (sinus vasculaires) à
une zone relativement hypoxique (près de l'endostéum) (Chow et al., 2001). La moelle osseuse est le
lieu de résidence des Cellules Souches Mésenchymateuses (CSM) et la teneur en oxygène a été
démontrée comme modulant certaines de leurs caractéristiques. En particulier, la culture de CSM
sous une tension réduite en oxygène (5-8%) augmenterait in vitro leur potentiel de différenciation
osseuse (Lennon et al., 2001), adipocytaire (Fink et al., 2004); (Honczarenko et al., 2006) et
chondrocytaire (Moussavi-Harami et al., 2004); (Robins et al., 2005).

Une étude a montré sur des CSM humaines qu'une courte exposition à l'hypoxie (24
heures) stimulait leur prolifération et leur entrée dans le cycle cellulaire ((Martin-Rendon et al.,
2007)) avec une expression différentielle de nombreux gènes, tandis que le potentiel de
différenciation était maintenu pour les voies ostéocytaire et adipocytaire et augmenté pour la voie de
différenciation chondrocytaire.

Les CSM peuvent être isolées à partir de la plupart des organes et tissus fœtaux et adultes
(da Silva Meirelles et al., 2006). Cependant elles sont habituellement isolées à partir de la moelle
osseuse. La présence constitutive des CSM dans le sang périphérique chez l'adulte a longtemps été
débattue et controversée chez l'homme, que cela soit en situation physiologique ou après
stimulation. Ainsi, la circulation des CSM semble un événement rare chez l'homme. La présence
d'un contexte physiopathologique particulier, tels que l'infarctus du myocarde ou l'encéphalopathie

56
((Zyuz'kov et al., 2005)) ont été rapportées comme permettant la mobilisation des CSM dans la
circulation périphérique dans le cadre d'une adaptation à l'hypoxie induite (Kuznetsov et al., 2001).
Des cellules souches provenant de la moelle osseuse ont été rapportées comme pouvant contribuer
au remodelage vasculaire induit par l'hypoxie chronique (Hayashida et al., 2005). Toutefois, une
étude précédente de notre équipe a montré qu'une exposition de rats à l'hypoxie chronique (3
semaines) entraînait une mobilisation spécifique des CSM de ces rats dans la circulation
périphérique (Rochefort et al., 2006). La poursuite de l'étude a démontré la viabilité à long terme des
CSM après injection intraveineuse in vivo ainsi qu'une absence de domiciliation spécifique des CSM
dans la paroi artérielle pulmonaire au cours du développement de l'hypertension pulmonaire induite
par l'hypoxie chronique (Rochefort et al 2005). En effet, après une injection de CSM radiomarquées
à l'indium-111 en intraveineuse chez des animaux hypoxiques et normoxiques, la radioactivité s'était
accumulée dans un premier temps dans la zone pulmonaire. Puis graduellement et séquentiellement,
la radioactivité a été observée dans le foie, la rate, les reins et le tissu osseux. On a pu observer une
répartition stable et homogène au bout de 24 heures dans les deux groupes. Enfin, on a retrouvé une
domiciliation médullaire de ces CSM marquées après injection intraveineuse significativement
augmentée chez les animaux exposés à l'hypoxie chronique par rapport aux animaux normoxiques.

L'absence de domiciliation spécifique des CSM dans la paroi artérielle pulmonaire au cours
du développement de l'hypertension pulmonaire induite par l'hypoxie chronique sans discontinuité
de l'endothélium intimal, mais avec une localisation au sein du parenchyme pulmonaire autorise une
action paracrine de ces cellules, comme cela avait été évoqué par l'équipe de Baber (Baber et al.,
2007).

Les résultats ont permis d'établir que le mécanisme de mobilisation serait différent de celui
responsable de la mobilisation des progéniteurs hématopoïétiques. Pour expliquer ce phénomène de
mobilisation, des hypothèses ont été proposées, parmi lesquelles les auteurs ont évoqué: (1) une
action locale de la perméabilité vasculaire; (2) l'apparition d'un gradient chimiotactique entre la
moelle osseuse et le sang périphérique; (3) la sécrétion de molécules inflammatoires et/ou
chimiotactiques d'origine pulmonaire lors de la mise en place des remodelages vasculaires
pulmonaires conduisant au développement de l'hypertension pulmonaire induite par l'hypoxie
chronique. La stimulation hypoxique des CSM induit l'expression de nombreux facteurs de
croissance intervenant dans la prolifération et la survie cellulaire tels que le VEGF-D (Vascular

57
endothelial growth factor-D), le PGF (placenta growth factor), le HB-EGF (heparin-binding
epidermal growth factor), certaines métalloprotéases (Ohnishi et al., 2007) ou encore l’Interleukine-
6 (Rattigan et al.) qui augmente parallèlement leur capacité migratoire. Rosova et al ont aussi
montré une activation de la voie Akt intervenant dans la survie cellulaire avec une augmentation de
l’expression du récepteur c-Met pour HGF (hepatocyte growth factor) et une augmentation du
potentiel de migration chez des CSM précultivées sous hypoxie (Rosova et al., 2008). Ainsi, ces
données suggèrent l'existence d'un senseur à l'hypoxie et de mécanismes de régulation associés.

Hypothèse 3 : l’augmentation du potentiel migratoire des CSM liée à l’hypoxie chronique

pourrait être liée à une augmentation de facteurs chimiotactiques mais aussi à une augmentation
de leur propriété intrinsèque de migration.

II.2. Hypoxie et activation de la NADPH oxydase.

II.2.1. La NADPHoxydase membranaire

La NADPH oxydase est un complexe enzymatique dissocié dans la cellule au repos. Les
différents constituants qui la composent s’assemblent pour former un complexe multiprotéique actif
sous l’effet d’une stimulation extracellulaire. L’activation de la NADPH oxydase a été décrite
initialement au niveau de la NADPH oxydase phagocytaire. Le facteur p47-phox cytosolique de
l’oxydase lorsqu’il est phosphorylé migre à la membrane plasmique.

58
Figure I.17 : Modèle d’activation de la NADPH oxydase phagocytaire.

La consommation d’oxygène par les neutrophiles durant la phagocytose avait été observée
par Baldrige et Gerard (1933), et différenciée de la respiration mitochondriale par Sbarra et
Karnovsky (1959). Ce sont Babior et coll. (1973) qui identifient l’anion superoxyde comme le
produit de la NADPH oxydase, avec le NADPH comme donneur spécifique d’électron (Rossi and
Zatti, 1964) selon la réaction (Wientjes and Segal, 1995):

NADPH + 2 O2 ® NADP+ + H+ + 2 O2-

L’électron est transféré du NADPH au FAD qui est réduit, puis au cytochrome b 558 dont le
fer ferrique (Fe3+) du premier hème passe à l’état de fer ferreux (Fe 2+). De la même façon, le fer du
second hème est réduit, puis l’accepteur final d’électron, l’oxygène moléculaire est réduit en anion
superoxyde O2-. Les ions superoxyde produits sont instables et vont dismuter en peroxyde
d’hydrogène spontanément ou sous l’action de la superoxyde dismutase :

2 O2- + 2H+ ® O2 + H2O2

Différentes NADPHoxydases.

59
 Les NADPHoxydases ont la capacité de transporter des électrons à travers la membrane
plasmique afin de produire des anions superoxydes, précurseurs de différentes formes réactives de
l’oxygène. Récemment, six homologues de la sous-unité catalytique Nox2 ont été identifiés
(Guichard et al., 2006); (Bedard and Krause, 2007) : Nox1 – Nox2 – Nox3 – Nox4 – Nox5 et les
Duox 1 et 2 (FigureI.18). Les Ros provenant des Nox sont impliqués dans la réorganisation du
cytosquelette, l’expression des gènes, la prolifération, la différenciation, la migration et la mort
cellulaire (Brown and Griendling, 2009). Ces enzymes sont souvent exprimées dans les mêmes
cellules et les mêmes tissus mais elles régulent fonctions différentes dans chacun de ces types
cellulaires.

Structurellement, tous les membres des Nox possèdent au moins six domaines
transmembranaires (obtenus selon le profil d’hydrophobicité de la séquence protéique) contenant
deux hèmes, un site de fixation au NADPH et un site de liaison au FAD cytosoliques. En plus, la
protéine Nox5 présente en partie N-terminale, quatre domaines EF-hand nécessaires lors de
l’activation de la protéine par le calcium (Banfi et al., 2001); (Banfi et al., 2004). Les Duox
possèdent les mêmes domaines que Nox 5 mais disposent, en plus, d’un domaine extra-cellulaire
Peroxydase-like et un domaine d’homologie gp91phox (Nox2) (Brown and Griendling, 2009).

L’activation de l’oxydase a lieu quand la NADPH se lie à la protéine Nox sur le côté
cytosolique de la membrane où les électrons sont transférés au FAD, puis à travers la chaîne
respiratoire jusqu’à l’oxygène au niveau de la face externe de la membrane, aboutissant à la
formation d’anion superoxide (O2-). Dans les Nox 1-4, la sous-unité transmembranaire p22phox
s’associe avec la protéine Nox à l’état actif et inactif. Il semblerait que les enzymes Nox
interagissent principalement avec les sous-unités du cytosol NoxO 1, NoxA1 et Rac-GTP. Cependant,
p47phox, p67phox peuvent remplacer respectivement NoxO1 et NoxA1. L’activation de la protéine
Nox2 implique son association avec Rac-GTP, p47phox, p67phox et p40phox. L’activation de
Nox3 est moins bien définie, mais on pense que Rac-GTP p47phox et NoxA 1 sont impliqués. Nox4
est activée de manière constitutive quand elle est associée avec la sous-unité p22phox. L’activation
des protéines Nox5 et Duox1/2 implique la présence de Calcium (Ca 2+) lié au domaine «EF-Hand
» dans le cytosol. (Geiszt and Leto, 2004).

Les sous-unités catalytiques Nox1 – Nox2 – Nox3 – Nox4 – Nox5 sont présentes dans de
nombreux tissus dans lesquelles elles exercent différentes fonctions (Figure I.19).

60
Figure I.18 : Les membres de la famille NOx et leurs sous-unités régulatrices (d’après (Brown
and Griendling, 2009)).

61
Figure I.19 : Distribution tissulaire et fonctions des Nox/Duox ((Guichard et al., 2006)).

Nous ne nous détaillerons que Nox1, Nox2 et No4x qui ont été décrites comme intervenant
dans la migration.

Nox1 Cette protéine a été clonée à partir d’une banque d’ADNc issue de cellules épithéliales du
colon (Suh et al, 1999). Elle est très exprimée dans les cellules épithéliales du colon (Rokutan et al.,
2008) et à un moindre degré dans les cellules musculaires lisses, endothéliales, dans les tissus utérin
et prostatique (Bedard and Krause, 2007). Elle présente 56 % d’homologie avec Nox2 sur ses 564
acides aminés (Banfi et al., 2000). Sa présence est associée notamment à une régulation de la
pression sanguine via l’angiotensine II mais l’hypothèse d’un rôle dans la défense immunitaire n’est
pas exclue depuis que des ROS ont été détectés au niveau du colon (Lambeth, 2002). De plus, un
homologue de p47phox, NoxO1 a été découvert dans l’épithélium colique et serait colocalisé avec
Nox1 (Banfi et al., 2003). L’induction des ARNm de Nox1 par l’IFN-g dans des cellules
épithéliales de l’intestin conforte cette hypothèse (Kuwano et al., 2006). D’autres recherches ont
montré son rôle dans la régulation de la croissance et la migration des cellules musculaires lisses
(Brewer et al., 2006); (Garrido and Griendling, 2009). Enfin, une étude récente suggère que

62
l’augmentation de l’activité de Nox 1 promeut la migration de l’adénocarcinome du colon ((Sadok
et al., 2008)) (Figure I.20).

Figure I.20 : Voies de signalisation résultant du recrutement de TRADD, RPI, Rac

et Nox1 au récepteur (Brown and Griendling, 2009).

Nox2 : C’est la protéine qui a été la plus étudiée et toutes autres les Nox sont décrites en référence à
cette protéine. Elle est synthétisée dans le réticulum endoplasmique sous sa forme précurseur
gp65phox partiellement glycosylée (Porter et al., 1994). Si la glycosylation de la protéine Nox2 n’est
pas essentielle à son activité catalytique, elle augmenterait la résistance contre la digestion par les
protéases cellulaires et permettrait un bon adressage de la protéine à la membrane (Paclet et al.,
2001) ; (Murillo and Henderson, 2005). Nox2 possède un poids moléculaire théorique de 65,339 Da
pour 570 acides aminés.

Elle est essentiellement connue pour son rôle dans la défense innée de l’hôte par production
de ROS et initialisation d’un certain nombre de réponse inflammatoire et immunoprotectrices. Dans
les cellules vasculaires Nox2 est activée par VGEF, l’Angiotensine-II, la thrombine, le VGEF, le
TNF  et les forces mécaniques (Dworakowski et al., 2008). Les anions superoxides produits par
Nox2 peuvent réagir avec No (élément protecteur majeur des fonctions vasculaires) dans la cellule

63
pour en réguler sa biodisponibilité avec pour conséquence la création de NO 3- impliqué dans le
stress oxydatif (Oakley et al., 2009). Des études ont aussi montré leur implication dans l’apoptose
(Li et al., 2009); (Shen et al., 2004), la prolifération, la migration des cellules endothéliales ((Ushio-
Fukai, 2007)) et sur la réorganisation du cytosquelette (Yan et al., 1995) et sur les voies de
signalisation (Chen et al., 2009).

Figure I.21 : Fonctions de Nox2

Nox4 La protéine Nox4 a été initialement identifiée comme la NADPH oxydase rénale. Sa structure
composée de 578 acides aminés présente une homologie de 39 % avec Nox2. Comme pour Nox1 et
Nox2, la présence de la protéine p22phox est absolument nécessaire pour l’activité oxydase.
Néanmoins, son activation semble être indépendante des facteurs cytosoliques (Martyn et al., 2006);
(Serrander et al., 2007) permettant une production constitutive d’anions superoxydes. La
modulation de l’activité de Nox4 se ferait par la régulation de son niveau d’expression (Touyz et al.,
2002).

Les ROS dérivés de Nox4 sont impliqués dans de très nombreux processus physiologiques
(Guichard, 2006) tels le vieillissement cellulaire (Schilder et al., 2009), l’apoptose, la survie , la

64
signalisation de l’insuline (Mahadev et al., 2004) et la migration (Meng et al., 2008); (Pendyala et
al., 2009). Cependant, en ce qui concerne la migration, les études sont sujet à controverse. Certaines
études ont montré son rôle activateur (Mahadev et al., 2004) alors que d’autres l’ont décrite
comme inhibitrice ((Lyle et al., 2009); (Haurani et al., 2008)) (Figure I.22).

Figure I.22: Fonctions de Nox4

II.2.2 Rôle de Rac dans l’activation de la NADPH oxydase.

Le processus de translocation et d’assemblage des facteurs cytosoliques nécessite l’activation

de Rac et des phosphorylations réversibles d’acides aminés sérine et thréonine des facteurs
cytosoliques p47phox, p67phox et p40phox, ainsi que de p22phox et gp91phox (Nox2), (Groemping
and Rittinger, 2005); (Czesnikiewicz-Guzik et al., 2008) et (Raad et al., 2009). Ces événements sont
induits par divers stimuli via différentes voies de signalisation qui peuvent se recouper ou agir en

65
synergie. L’intensité et la durée de l’activité NADPH oxydase dépendent des stimuli présents et de
leur quantité.

Selon Bokoch et Zhao, la petite protéine G monomérique Rac représente un élément

essentiel à l’activité oxydase lorsqu’elle est sous sa forme liée au GTP (Bokoch and Zhao, 2006).
Cette protéine est présente sous trois isoformes Rac1 (Abo 1991), Rac2 (Knaus et al., 1991) et Rac3
(Haataja et al., 1997). Si l’expression de Rac1 est ubiquitaire, l’expression de Rac2 est restreinte aux
cellules hématopoïétiques. Il a été trouvé, chez un patient, une mutation inhibitrice (dominant
négatif) à l’origine d’une immunodéficience sévère caractérisée par une diminution de l’activité
oxydase mais également d’autres fonctions du neutrophile (Ambruso et al., 2000); (Williams et al.,
2000). En effet, les neutrophiles de ce patient présentaient un défaut de chimiotactisme et de
polarisation limitant leur mobilisation vers les sites infectieux, ainsi qu’un défaut de dégranulation
du contenu des azurophiles.

Le recrutement de Rac requiert une geranylgeranylation dans une région polybasique en

C-terminal et se réalise indépendamment de celui de p47phox et de p67phox. En outre, La
translocation de Rac dans des neutrophiles déficients en Nox2 est moins importante, ce qui laisse
supposer une association directe entre Rac et le cytochrome b 558 (Heyworth et al., 1994). Au repos,
Rac est présente dans le cytoplasme et associée à une protéine RhoGDI qui la maintient sous forme
inactive (Kwong et al., 1993). L’activation du neutrophile induit la dissociation de RhoGDI et la
translocation de Rac à la membrane (Quinn et al., 1993); (Abo et al., 1994) Rac est alors convertie
sous sa forme active, c’est-à-dire liée à une molécule GTP, sous l’action d’une protéine GEF
(GDP/GTP eschange factor). Rac va alors s’associer à p67phox et au cytochrome b 558 et permettre
l’activation de la NADPHoxydase. D’ailleurs, Dang et ses collaborateurs ont suggéré que la protéine
Rac1 augmentait l’affinité directement de la protéine p67Phox pour le cytochrome b558 (Dang et al.,
2001). Le domaine d’activation joue un rôle critique dans la régulation du flux d’électrons et plus
probablement dans le transfert d’électrons du NADPH au FAD (Cross and Curnutte, 1995) ; (Dang
et al., 1999).

La région N_terminale de Rac est le site de fixation du GDP et du GTP. Comme nous
l’avons décrit précédemment, elle contient deux régions « Switch » (Switch I et II), c’est-à-dire
deux régions adoptant une conformation différente selon la nature du nucléotide lié à Rac. Les

66
régions Rac impliquées dans l’activation de l’oxydase sont la région Switch I (résidus 25-45), les
résidus 145-175 pour la liaison p67phox et sa région « insert » (résidus 124-135) probablement via
son interaction via le cytochrome b558 (Freeman et al., 1996); (Nisimoto et al., 1997).

En liant p67Phox, RacGTP entrainerait un changement de conformation orientant

favorablement le domaine d’activation de p67phox par rapport au cytochrome b 558 (Mizrahi et al.,
2006). Selon Bokoch et Diebold puis Kao, la protéine RacGTP agirait dans un premier temps par
elle-même sur le transfert d’éléctrons du NADPH au FAD en interagissant avec le cytochrome b 558 ,
et , dans un deuxième temps son association à p67Phox permettrait la poursuite du transfert des
électrons via les hèmes (Bokoch and Diebold, 2002); (Kao et al., 2008).

Figure I.23 : Régulation de l’activité du cytochrome b558 en deux étapes d’après (Bokoch and
Diebold, 2002).

D’autres auteurs ont aussi montré que Rac 1/2 lié au GTP lié à p67-phox, entraînant le
changement dans sa conformation au niveau de la partie C-terminale, conduisait à la dissociation
du complexe p67-phox/p40-phox, pour permettre à p67-phox libre d’agir avec le cytochrome b 558
(Rinckel et al., 1999), (Heyworth et al., 1994). Une des conséquences de la stimulation de Rac est
l’activation de la NADPHoxydase via un démasquage de la sous-unité p47phox qui permet la
translocation de cette sous-unité vers la membrane et l’accrochage au cytochrome b 558 formant la
NADPHoxydase active. La participation de Rac2 à l’activation de la NADPHoxydase est
directement impliquée dans la physiopathologie du syndrôme de Wiskott-Aldrich.

67
 Par ailleurs, il semblerait que Rac contrôle le chimiotactisme des neutrophiles et le
processus d’exocytose des granules primaires au cours de la dégranulation (Sun et al., 2004); (Koh
et al., 2005); (Mitchell et al., 2008). Enfin, Rac1 et les ROS intracellulaires moduleraient le potentiel
migratoire des cellules par l’intermédiaire d’un mécanisme dépendant de NFB et de la NADPH
oxydase (Tobar et al., 2008).

II.2.3. NADPHoxydase et migration cellulaire

L’activation de la NADPH oxydase est reliée à la migration induite par l’hypoxie des
cellules endothéliales et la migration des cellules phagocytaires (neutrophiles). Le rôle de la
NADPH oxydase dans la migration des cellules mésenchymateuses n’a pas été étudié. Le
mécanisme exact reliant l’activation de la NADPHoxydase et la migration n’est pas parfaitement
connu.

La NADPHoxydase est électrogénique (Henderson et al., 1987) et la pompe à protons

permet une compensation de charges (Henderson et al., 1988); (Murphy and DeCoursey, 2006) qui
prévient un excès de dépolarisation qui stopperait l’activité enzymatique. (DeCoursey et al., 2003).
Il y eu beaucoup de controverses pour savoir si la sous unité gp91 correspondait directement à la
pompe à protons (Henderson et al., 1995); (Henderson and Meech, 1999); (Touret and Grinstein,
2002); (DeCoursey et al., 2002); (Henderson and Meech, 2002); (Maturana et al., 2002);
(Decoursey, 2003) ; (DeCoursey, 2008); (Musset et al., 2009). Il a été montré dans un premier temps
que le cytochrome b558 et particulièrement la sous-unité gp91-phox pouvaient servir de canal à
protons (H+) quand la NADPHoxydase est activée (Henderson et al., 1995). La partie N-terminale
(de 1 à 230) de gp91-phox serait impliquée et le flux de protons se ferait en parallèle et dans le
même sens que le transfert d’électrons. De plus, il a été montré que les flux calciques sont
particulièrement importants dans la régulation de la fonction oxydase dans les neutrophiles
(Foyouzi-Youssefi et al., 1997); (Hii and Ferrante, 2007); (Brechard and Tschirhart, 2008);
(Shmelzer et al., 2003) et (Shmelzer et al., 2008).

68
 Récemment, cette hypothèse a été modifiée par la mise en évidence du rôle de la pompe à
protons voltage dépendante VSOP couplée à l’activation de la NADPHoxydase. Cette pompe
permet, par l’évacuation de protons, de contrebalancer l’acidification induite par l’activité de
l’oxydase. Cette pompe est couplée à une ATPase membranaire (DeCoursey, 2008). Le gène humain
HV1 du canal proton a été caractérisé (Ramsey et al., 2006). D’autres canaux protons ont été
identifiés dans des espèces animales, le CiVSOP chez le requin (Sasaki et al., 2006), le mVSOP
chez la souris. Un gène codant pour une phosphatase sensible au voltage avait été précédemment
identifié (Murata et al., 2005). Ce canal est particulier par le fait qu’il comporte 4 domaines
transmembranaires mais ne possèderait pas les domaines S5-S6 correspondant au pore
conventionnel. Il s’agirait donc plus d’une protéine sensible au voltage que d’un véritable canal
ionique (Sasaki et al., 2006); (Ramsey et al., 2006) ; (Murata et al., 2005). Cette phosphatase
pourrait jouer un rôle dans la transformation d’un signal électrique en un signal chimique (Murata
and Okamura, 2007) (Figure I.24). Elle connecterait son domaine VSD à son domaine lipidique PD
induisant ainsi un changement de conformation allostérique à l’origine de son activation. Elle
s’autorégule par l’intermédiaire de son substrat PI(4,5)P2. En effet, un faible niveau de PI(4,5)P2
provoque le découplage de VSD de l’enzyme (Kohout et al., 2010).

Figure I.24 : Phosphatase, protéine sensible au voltage (Murata and Okamura, 2007)

L’activation de la NADPH oxydase modifie localement le pH (acidose), ce qui est compensé par la
pompe à protons et ce qui induit secondairement un flux calcique entrant. La pompe à protons est
couplée à l’ATPase membranaire.

69
Figure I.25 : Pompe à protons.

Hypothèse 4 : Calcium et ATP libérés au niveau du site d’activation de la NADPH oxydase

pourraient contribuer directement aux modifications de phosphorylation de la cofiline et au
comportement migratoire des cellules.

Ainsi l’hypothèse de ce travail était que la NADPH oxydase qui n’est décrite dans la littérature
que comme un système production de ROS pourrait avoir un rôle physiologique dans l’apport
d’ATP et de calcium de façon polarisée dans la cellule soumis à l’hypoxie chronique initiant les
changements de conformations du cytosquelette à proximité du front de migration.

70
 Chapitre II :

Résultats personnels

71
A. Matériel et méthodes

I.Modèle d'hypoxie chronique chez le rat.

Des rats Wistar adultes mâles (7semaines, 220 g; Harlan, Gannat, france
http://www.harlan.com) ont été hébergés pendant trois semaines dans une chambre hypobarique (50
kPa), induisant une baisse de 50% de la pression artérielle en oxygène. Cette exposition qui est un
équivalent d’une exposition à une Fi02 de 10% et induit un remodelage de l’artère pulmonaire
générant une hypertension artérielle pulmonaire en trois semaines validé par des études antérieures.
Les rats soumis à l’hypoxie chronique ont été comparés à des rats de contrôle appariés en âge
hébergés dans des conditions normoxiques (101 kPa). Le sang périphérique et la moelle osseuse ont
été collectées après sacrifice des animaux dans l’heure suivant leur sortie du caisson.

72
II.Préparation des cellules

II.1.Isolement des cellules mésenchymateuses.

Les techniques d'isolement et de cultures des CSM ont été réalisées selon le protocole
de la Société Française de Greffe de Moelle Osseuse et de Thérapie Cellulaire (SFGM-TC). Nous
avons prélevé en condition d'asepsie les fémurs. La surface de l'os a été débarrassée de tout tissu
adhérent. La moelle osseuse a été récupérée après irrigation de la cavité médullaire à l'aide d'une
aiguille 20 Gauge par du milieu murin composé de milieu de croissance Modified Eagle Medium
Alpha (α-MEM; Introven Corporation, Carlsbad, Californie), de 10% de serum de veau fœtal (Fetal
Calf Serum FCS; Hyclone, Logan, Utah), de solution antbiotique (1% penicilline/streptomycine;
Introgen), d'une solution antifongique (0,01% fungizone; Bristol Myers, New York) et d'un acide
aminé (1% L-glutamine, Introvigen). Les cellules ont été dispersées en passant le mélange dans une
aiguille de 20 Gauge de manière à obtenir une couche monocellulaire. Les cellules ont été
centrifugées 8 minutes à 1200 tours/mn à 20°C puis remises en suspension dans du milieu de
4
culture. Elles ont été comptées sur cellule Fastride puis étalées sur une flasque à une densité de 10
cellules/cm2, avant d'être incubées à 37°C dans une étuve à atmosphère contrôlée (air 95%, CO 2
5%). Le milieu de culture a été renouvelé à J4 puis deux fois par semaine. Les CSM ont été purifiées
selon leurs propriétés d'adhérence au plastique. Lorsque les CSM ont atteint 90% de confluence,
elles ont été mises en présence de trypsine (trypsin-EDTA, Introvigen) puis comptées sur cellule
Fastride et étalées à une densité de 1500 cellules/cm2.

CSM utilisées après P2 :

73
 Pour un lot de cellules issues des mêmes rats, marqueurs à la surface des cellules
positifs pour CD90 (78%) et CD73 (80%) et négatifs pour CD31 et CD45 (détermination par
cytométrie cytométrie en flux)

II.2.Conservation des cellules

Congélation

Nous avons effectué deux types de congélation:

-La congélation rapide en milieu humide : elle a été effectuée à l'aide du DMSO à 10% à partir d'une
suspension de cellules RPMI (v/v).

-La congélation rapide sur culot sec : elle est utilisée pour les expériences de biologie moléculaire.
Les cellules subissent 2 lavages au PBS suivis d’une centrifugation (10 minutes à 4° / 1500 tours
minutes) dans des eppendorfs de 500 μl. Après la dernière centrifugation, on retire totalement le
PBS et on place très rapidement les tubes à -80°C directement (Protocole Evry-Genopole).

Décongélation

Nous avons utilisé une méthode de décongélation rapide. Le tube congelé stocké à -80°C est
immergé dans un bain-marie à 37°C. Le petit tube est tenu jusqu'à l'obtention d'un petit glaçon. On
transvase alors très rapidement le contenu dans un falcon stérile préalablement rempli avec du
milieu de culture (milieu murin) afin de neutraliser la toxicité du dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma
Aldrich). Après centrifugation à 1200 tours/mn pendant 6 mn, on reprend le culot dans du milieu
murin et les cellules sont mises en culture après comptage sur cellule Fastride.

74
III.Techniques utilisées

III.1.Expériences de migration de CSM.

®
Les tests de migration ont été réalisés dans des Transwells (pores de 8 μm de
diamètre) (Corning, Costar, Cambridge) en milieu de migration (RPMI avec 0,025 de sérum
albumine bovine, Fisher). La face supérieure des filtres a été recouverte avec 0,1% de gélatine puis
®
les Transwells ont été incubés pendant une heure à 37°C dans une étuve. 300 μl de CSM
médullaires issues de rats normoxiques et hypoxiques en suspension (2,5x10 5 cellules) ont été
déposées dans la chambre supérieure et 400 μl de sérum de rats normoxique dilué au demi, de
solution de SVF à des concentrations différentes (10% ET 20%) ou de milieu de migration seul ont
été déposés dans les puits. La migration observée avec le milieu de migration seul (RPMI/BSA
0,25%) a été considéré comme contrôle négatif. Le lendemain, après 18 heures de migration, nous
avons lavé la face supérieure des inserts avec du PBS froid et les cellules qui n'ont pas migré (donc
restée à la face supérieure du filtre) ont été enlevées avec un coton-tige. Ensuite, nous avons
récupéré dans des tubes eppendorf les CSM qui avaient migré dans les puits. Afin de ne perdre
aucune cellule ayant migré, nous avons trypsiné le fond de chaque insert avec 300 µl de
trypsine/EDTA 0,5% et reposé les inserts sur les puits. Après 10 mn à l'étuve à 37°C, nous avons
récupéré la trypsine de chaque puit que nous avons ajouté à la suspension de CSM puis lavé chaque
puit avec du RPMI/SVF 10%. Après centrifugation à 3000 tours/mn pendant 10 mn à 4°C, le
surnageant a été éliminé et chaque culot a été repris avec du RPMI et compté sur cellule Fastride.
Chaque expérience a été réalisée en duplicata et reproduite plusieurs fois. Les résultats ont été
exprimés en nombre de cellules ayant migré dans chaque puit puis comparés à ceux obtenus pour la
migration des CSM normoxiques et hypoxiques du contrôle (milieu de migration sans SVF).

Dans les expériences de migration concernant l’effet de l'apocynine (acéto-vanillone,

inhibiteur de la NADPHoxydase Sigma Aldrich) il a été rajouté 34 μl d' apocynine (10μmol/L) dans
chaque insert. Le Transwell a été placé à l'étuve pendant 18 heures. Les cellules récupérées de la
même manière que précédemment ont été ensuite comptées sur cellules Fastride.

75
III.2.Immunofluorescence.

Les cellules, CSM normoxiques et CSM hypoxiques, préalablement cultivées en Flasque,

ont été mises en culture dans de petites boîtes de Pétri d'un diamètre de 10 cm 2, contenant 1ml de
milieu de migration. Après deux jours de culture, à 80% de confluence, les cellules ont été fixées à
l'aide de Paraformaldhyde (PAF) à 3,65 % pendant 10 minutes. Elles ont été ensuite perméabilisées à
l'aide d'une solution de Triton à 0,1% pendant deux minutes puis saturées avec une solution de
BSA/PBS 1% pendant 20 minutes.

Les cellules ont été ensuite lavées avec du PBS 1% à température ambiante avec deux lavages
courts suivis d'un lavage long. Les boîtes ont été alors préparées pour le marquage de l'actine par
300 μl d'une solution de Phalloïdine (25 μl/ ml)/PBS pendant 30 minutes suivi d’un lavage au PBS
1% (2 rinçages courts et un rinçage long).

76
 Les bords de chaque boîte ont été découpés à l'aide d'une pince puis les lames obtenues
ont été rincées au PBS et séchées sur un papier absorbant. 300 μl d'une solution d’Anticorps primaires
a été déposés sur un papier parafilm recouvert par le fond des boites (annexe-tableau1). Au bout de
deux heures, les lames ont été rincées avec une solution de PBS 1% à température ambiante (2
rinçages courts et un rinçage long) et séchées sur un papier absorbant. 300 μl d'une solution
d’Anticorps secondaires ont été appliqués de la même façon avec un temps d’incubation de 1H00. Les
lames ont été conservées à 4°C avant d'être lues au microscope confocal.

L’étude en immunofluorescence a été réalisée par microscope confocale Fluoview 500,

(OLYMPUS, France). L’acquisition des (e) données a été faite par le logiciel fluoview. La
microscopie confocale élimine les informations situées en dehors du point de focalisation et améliore
considérablement la résolution de l’image acquise. Cette amélioration résulte :

-d’un balayage de l’échantillon point par point à l’aide d’un ou plusieurs faisceaux lasers.

-d’une limitation des signaux collectés en retour à l’aide de diaphragme ou pinhole placés en avant
des photomultiplicateurs.

III.3.RT-PCR (Reverse Transcription-PolyméraseChain Reaction)

Elle a été réalisée à partir de deux populations de cellules (CSM hypoxiques et CSM
normoxiques) pour comparer l'expression de gènes codant pour l'expression de HIF-1α
comparativement au 18S.

Extraction d’ARN

Aux culots secs contenant les cellules CSM normoxiques et les CSM hypoxiques conservés
au congélateur à -80 ° C a été ajouté 500 μl de Trizol et les tubes ont été de nouveau placés 30
minutes au congélateur à -80 ° C. Après ajout de 300 μl de chloroforme pendant 6 minutes les tubes
ont été centrifugés à 10 000 rpm pendant 15 minutes à 4°C. Le surnageant des échantillons
contenant l’ARN ont été prélevé puis 500 μl d’isopropanol a été ajouté suivi 5 minutes après d’une
nouvelle centrifugation. Le surnageant a été totalement enlevé puis de l’éthanol à 70% a été

77
rajouté suivi d’une nouvelle centrifugation. Après élimination totale du surnageant, de l’eau milliQ
RNAse free a permis de récupérer l’éluât contenant les ARN dosé et stocké à -80°C. La
concentration en ARN des différents échantillons a mesurée par spectrophotométrie (Nanodrop) à
une absorbance de 260nm. L’absorbance à 280nm permettait de vérifier l’absence de contamination
par l’ADN et l’absorbance 230 l’absence de contamination par l’éthanol. Le ratio Absorbance à
260nm sur absorbance à 280nm était toujours compris entre 1.8 et 2.1.

PCR quantitative

TM
La PCR quantitative a été réalisée à l'aide du kit SuperScript One-step RT-PCR avec du
®
Platinium Taq (Invitrogen). Les constituants tant pour la synthèse de l'ADNc et la PCR sont
combinés ensemble dans un même tube, utilisant des amorces spécifiques de gènes et en ciblant
l'ARNs de l'ARNtotal ou l'ARNm. La RT suit automatiquement le cycle PCR sans étapes
additionnelles.

Ce système est composé de deux constituants majeurs:

®
-le mélange RT/Platinium Taq qui contient un mélange d'ADN polymérase pour une synthèse
d'ADNc et l'amplification de la PCR complexée à un anticorps qui inhibe l'activité de la polymérase
à température ambiante.cet anticorps est dénaturé et l'activité de la polymérase est restaurée durant
l'étape du cycle PCR à 94°C.

-le mélange de réaction 2X un tampon de réaction propre à la RT et à l'amplification de la PCR

contenant 0.4mM de chaque désoxyribonucléotide triphosphate (dNTP), 2.4 mM de MgSO4 et des
stabilisateurs. Les échantillons d’ARN sont ajoutés pour une concentration finale de 20ng/mL. La
synthèse d'ADNc est achevée après une incubation de deux heures 50°C. La réaction d'amplification
de la PCR comprend 3 étapes se répétant sur 38 cycles consécutifs

-dénaturation pendant 15s à 94°C.

-hybridation pendant 30s à 55°C

-élongation pendant 1min à 60°C

78
 La PCR quantitative a été réalisée dans un appareil iCycler (BIO-RAD). La technique de
RT-PCR semi quantitative permet d’évaluer l’augmentation relative de l’expression de gènes. La
détection des amplicons est effectuée en temps réel grâce à un procédé de mesure de la fluorescence
tout au long de l’amplification sur ABIPRISM 7700 (Applied Biosystems). La chimie Taqman est
utilisée. La sonde Taqman est un nucléotide de 20 pairs de bases comportant en son extrémité 5’ un
fluochrome dit « reporter » et à son extrémité 3’ un fluochrome dit « quencher », inhibiteur de
fluorescence (TAMRA). Au cours de la PCR, la sonde s’hybride spécifiquement entre les amorces
sens et anti-sens. Pendant l’élongation, la sonde est clivée par l’activité exonucléasique 5’-3’de la
Taq polymérase. Le fluorochrome est libéré et peut ainsi fluorescer. Au cours de la phase
exponentielle, la quantité de brins néo-synthétisés est proportionnelle à la quantité de matrice
initiale. A fluorescence constante, le nombre de cycle est donc proportionnel à la quantité de matrice
initiale. Les différents contrôles sont : un contrôle de l’absence de contamination de la PCR où
l’ADNc est remplacé par de l’eau, un contrôle de l’absence d’ADN génomique résiduel où l’ADNc
est remplacé par une quantité similaire d’ARN (non rétro transcrit), le dernier contrôle est constitué
d’une gamme d’ADNc (courbe de calibration) qui permet de contrôler que l’efficacité de la PCR est
proche de 100%. La lecture de fluorescence a été faite en fin d'élongation après synthèse de tous les
ADN alors organisés en double brin.

Le niveau d'expression de l'ARNm de HIF-1α et du gène de ménage 18S a été

déterminé en utilisant les amorces spécifiques: TaqMan ® Gène Expression Assay HIF-1α
(Hs00383438-m1), 18S (Hs03928990-g1).

III.4.Western-Blott

Dosage des protéines

Nous avons utilisé la méthode de Bradford pour déterminer des quantités de protéines de
l'ordre du microgramme. A l’échantillon contenant les protéines dans un volume de 20 μl on ajoutait
1 ml du réactif de Bradford. Après agitation et incubation pendant 5 minutes, l'absorbance était

79
mesurée à 595 nm. Une gamme protéique de sérum albumine bovine (BSA) était mesurée en
parallèle et en duplicate pour établir une courbe d’étalonnage permettant de calcul la concentration
de l’échantillon.

Séparation des protéines sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE).

Cette technique permet la séparation de protéines en fonction de leur masse relative (Mr).
Les gels de résolution et de focalisation sont coulés successivement entre deux plaques de verre (une
fine et une épaisse).

a.Dénaturation des protéines

Le dosage des protéines a permis d'évaluer la concentration en protéines de l'échantillon.

Après un pipetage de 20 μg de protéine et l'ajout de solution tampon de Laemli 2X ((v/v) 62.5 mM
Tris pH=6.8, 15% glycérol (v/v), 2.3% SDS (p/v), 0/001% bleu de bromophénol (p/v) et 5% α-
monothioglycérol (v/v)), on dépose 20 μl de solution dans chaque alicot. Les protéines sont alors
dénaturées par chauffage pendant 4 minutes à 95°C.

b.Electrophorèse

On charge au niveau des gels 20 μL de chaque aliquot ainsi que 5μL de marqueurs
colorés de poids moléculaires connus (de 14 à 220 kD) (RainbowTM protein molecular weight
marker, Amersham) dans les puits du gel de concentration de SDS-polyacrylamide de focalisation de
7% à 12% en fonction du PM de la protéine recherchée (0.5M TRIS/HCL pH 6.8, glycine(v/v),
10% SDS (p/v)). La migration s'effectue à 50mA.

80
Electrotransfert sur membrane de nitrocellulose.

Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose 0,45 μm
(Protan BA85, GE Healthcare). Dans la cuve à électrotransfert, le sandwich est placé de telle sorte
que le gel est du côté de la borne négative et la membrane de nitrocellulose du côté de la borne
positive de la cuve. Le transfert est effectué à 4°C 20V constant, sous agitation, pendant 45 minutes
à une heure, suivant la taille des protéines à transférer, dans un tampon de transfert Tris-Glycérine
(25 mM Tris pH 8.3, 192 mM glycine). Après transfert, la membrane est lavée trois fois 5 minutes
dans du TBS-Tween.

Détection immunologique des protéines.

Toutes les manipulations sont réalisées sous agitation.

a. Blocage de la membrane.

La membrane est d'abord saturée dans une solution de TBS-Tween 0,1% (20 mM Tris pH
7.6, 150 mM NaCl et 0.2% Tween 20 contenant 5% de lait écrémé en poudre (sauf pour la recherche
des protéines phosphorylées) pendant une heure. Elle est ensuite rincée 3 fois 10 à 15 minutes sous
agitation dans une solution de TBS-Tween.

b. Incubation des anticorps.

La membrane est déposée dans une solution de tampon bloquant TBS-Tween-lait, de façon
à la recouvrir, en présence d'un anticorps primaire dirigé contre la proteine d'intérêt et placée 12H à
4°C (annexe-tableau 2). Elle est ensuite lavée trois fois dans du TBS-Tween 0,2% puis mise en
présence de l'anticorps secondaire couplé à la peroxydase et dirigé contre l'espèce qui a servi à
fabriquer l'immunoglobuline de l'anticorps primaire. On laisse l'anticorps agir pendant une heure
puis la membrane est de nouveau lavée trois fois pendant 10 minutes avec du TBS-Tween 0,2%.

81
Révélation.

La révélation enzymatique par chémiluminescence, effectuée à l'aide du Kit ECL (Amersham,

Biosciences) permet de détecter les protéines d'intérêt de manière très sensible. La membrane est
placée dans une pochette à l'abri de la lumière dans laquelle on verse une solution de révélation. Au
bout de 5 minutes, elle est séchée et déposée dans une boîte noire.

La membrane est ensuite impressionnée sur un film photo placé au contact de la membrane pendant
un temps approprié. Dès l'apparition de bandes le film est sorti, plongé dans une solution de fixation,
puis séché.

Les résultats de Western-Blot sont ensuite quantifiés par les mesures de densitométrie avec le
logiciel Image J. Les résultats sont exprimés par rapport à l’expression de l’actine ou de la tubuline.

III .5.Mesure de l’activité enzymatique de la NADPH

La mesure de l’activité enzymatique de la NADPH a été réalisée par un kit de

chemoluminescence commercial basé sur la détection du luminol. Les cellules ont été lavées avec du
PBS. Après centrifugation à 2000 rpm pendant 5 minutes, le culot de cellules est repris avec 200 μl
de NADP/NADPH Extraction Buffer et laissé dans la glace pendant 20 minutes puis pendant 10
minutes à température ambiante. Après un vortex de 10 secondes, chaque échantillon est centrifugé
à 14000 rpm pendant 5 min. La NADP/NADPH extraite est alors transférée dans un nouveau tube.

Dans un premier temps, on procède à l'élaboration d'une courbe étalon préparée à partir
du NADPH standard : 10 μl de NADPH standard (1 nmol/μl) et 990 μl de NADP/NADPH
Extraction Buffer (10 pmol/μl).

82
 Ensuite, le NADPH standard est déposé dans chaque puit à des concentrations différentes
(0, 20, 40, 60, 80 et 100 pmol de NADP/puit). Chaque puit est alors complété à 50 μl de
NADP/NADPH Extraction Buffer. Chaque échantillon est réalisé en duplicata.

La courbe étalon étant établie, les échantillons sont alors dosés. 50 μl d'échantillons sont
déposés par puit en duplicata. On ajoute alors 100 μl de mix dans chaque puit (NaDP Cycling
Buffer Mix: 98 μl + NaDP Cycling Enzyme Mix 2 μl). Après incubation pendant 5 minutes à
température ambiante pour convertir le NADP en NADPH. Le NADPH est ainsi développé dans
chaque puit. Après un temps de réaction variable de 4 heures, la DO est lue à 450 nm. Une nouvelle
lecture est réalisée à 24H00 après addition d’une solution stoppant la réaction.

Les valeurs de DO obtenues permettent de calculer le ratio NADP/NADPH de l'échantillon

(NADPt-NADPH/NADPH) est alors calculé à partir des valeurs de NADPH standard de la courbe
d'étalonnage.

III.6. Analyse statistique

Les résultats ont étaient exprimés comme la moyenne±SEM. Un test de normalité à précédé la
réalisation de test d’Anova pour séries indépendantes suivi par un test de Mann Whitney pour
comparer chaque groupe deux à deux. Le seuil P<0,05 a été considéré comme significatif. Les
analyses ont été effectuées par le logiciel STAEL (Ad Science, France).

83
B. Résultats

I. Expression de HIF-1alpha au niveau des cellules hypoxiques

Les CSM soumises à l’hypoxie chronique et cultivées en normoxie pour la réalisation des
expériences exprimaient encore la protéine HIF 1 alpha comme montré en immunofluorescence
(Figure II.1A), et en Western Blotting (Figure II.1B). La RT-PCR confirmait l’augmentation des
transcrits (Figure 1C).

Figure II.1 : Expression de HIF-1α au niveau des CSM normoxiques et hypoxiques évaluée en
immunofluorescence (1A), Western Blotting (1B, n=8pour chaque groupe) et RT-PCR (1C, n=6
pour chaque groupe). Comparaison groupe hypoxique versus normoxique n=8; Δ : seuil de
significativité; P>0,05.

II. Migration des CSM hypoxiques

La figure II.2A présente les résultats obtenus pour les CSM hypoxiques en présence d’un
gradient de SVF à 10% et 20% comparativement à CSM normal utilisé comme contrôle. On
observait une très faible migration spontanée des cellules en absence de SVF. Toutefois il existait un
passage non nul des CSM hypoxiques comparativement aux CSM normoxiques. On observait une
augmentation de la migration des CSM hypoxiques comparativement aux normoxiques. Ce
différentiel de migration était significatif avec la concentration la plus forte de SVF (20%)
(respectivement nombre de cellules ayant migré : en présence de SVF 10% ; CSMH =2392±387 vs.
CSMN =1360±268 ; pNS ; en présence de SVF 20% CSMH =6506±336 vs. CSMN =3014±245 ;
p<0,001). Le serum de rat normoxique augmentait de façon importante la migration des CSM
hypoxiques par rapport au SVF 20% (rapport nombre cellules ayant migré sérum
hypoxique/SVF20% = 6,02). Inversement le serum de rat hypoxique avait un effet sur la migration
des CSM normales peu augmenté par rapport au SVF 20% (rapport nombre cellules ayant migrés
sérum hypoxique/SVF20% = 1,32) (Figure II.2B). On observait par ailleurs en immunofluorescence

84
(Figure II.2C) une augmentation de l’expression de l’inhibiteur de l’activateur du plasminogène 1
(PAI-1) au niveau du cytosol des CSM hypoxiques.

Les Tests de migration en présence d’apocynine, inhibiteur de la PI3K, montrent à t=18h des effets
paradoxaux avec une inhibition très importante des CSM hypoxiques et des CSM normoxiques
mais à un moindre degré pour les CSM normoxiques.

85
Figure II.2 : 2A : migration différentielle des CSM hypoxiques (H) en comparaison avec les
CSM normoxiques (N) en présence de SVF10% et SVF20% comparativement au milieu
RPMIseul (blanc). * : comparaison avec blanc. Δ : comparaison CSM H versus CSMN. Seuil de
significativité : P<0,05. 2B : migration différentielle des CSM hypoxiques (H) en présence de
sérum issus de rats normoxiques (serum N) et normales (N) en présence de sérum issus de rats)
hypoxiques (sérum H). 2C : expression de PAI-1 en immunofluorescence.

86
III. Activation de la NADPHoxydase et rôle dans la migration

L’inhibition de la NADPHoydase par utilisation d’apocynine (graphique de migration), retrouvait

une inhibition de la migration des CSM hypoxiques en présence de SVF (Figure II.3A). De façon
paradoxale nous avons observé une augmentation de la migration chez les CSM normoxiques. Ce
type de réponse paradoxale a déjà été décrit dans la littérature et elle est souvent reliée à un effet
indirect de l’action de l’apocynine sur la NADPHoxydase puisqu’il s’agit d’un inhibiteur de la
PI3kinase. Nous allons compléter les expériences par utilisation d’un inhibiteur de la gp91 qui en
empêchant la formation du complexe enzymatique permet d’obtenir une inhibition directe de son
activité. Le dosage enzymatique de la NADPHoxydase a retrouvé une augmentation de l’activation
basale de la NADPHoxydase au niveau des cellules hypoxiques comparativement aux cellules
normoxiques (n=3). La stimulation par le SVF 20% augmentait l’activité enzymatique dès la 5 ème
minute. L’adjonction d’apocynine diminuait l’activité de la NADPHoxydase à 30min. Par contre on
observait paradoxalement une augmentation de cette activité au niveau des cellules normoxiques en
accord avec les expériences de migration. Nous avons évalué l’expression de la PI3kinase que nous
avons retrouvé augmentée chez les CSM hypoxiques contrairement au CSM normoxique (Figure
II.3B). La stimulation par du SVF20% semblait augmenter son expression dans le groupe hypoxique
(x 1,6 au maximum; n=3) et cette augmentation était moindre dans le groupe normoxique (x1,3 au
maximum ; n=3). Ceci était en accord avec la cinétique d’activité de la NADPHoxydase après
stimulation avec le SVF20%.

87
Figure II.3 : 3A : dosage de l’activité enzymatique de la NADPHoxydase après stimulation avec
du SVF20%. L’effet de l’apocynine est évalué à 30min. L’apocynine a été ajoutée au temps t=0.
n=. 3B : expression de la PI3kinase après stimulation du SVF20%. n=3.

88
IV. Activation de PI3kinase, RAC1 et activation de la NADPHoxydase.

L’activité de Rac1 total n’était pas différents au niveau des CSM hypoxiques
comparativement au normoxiques. Par contre l’activité Rac-GTP correspondant à la forme active
était augmentée au niveau des cellules hypoxiques (Figure II.4A). L’activation de Rac1 a été reliée à
l’activation de la PI3kinase. De façon parallèle, on retrouvait une activation de Rock-1 au niveau des
CSM hypoxiques en Western Blot (Figure II.4B) confirmé par immunofluorescence (Figure II.4C).

Figure II.4 : 4A : expression de la forme active de Rac-1 (Rac1-GTP) en Western Blotting

comparativement à la forme inactive. 4B : étude de l’expression de la protéine ROCK-1 en
Western Blot. 4C : étude de l’expression de la protéine ROCK-1 en Immunofluorescence.
Comparaison groupe hypoxique versus normoxique, n=8 ; Δ : seuil de significativité P<0,05.

89
V. Activation de p47 et modifications de phosphorylation de la Cofiline

En parallèle on observait une augmentation de l’expression de la sous unité p47 de la

NADPHoxydase au niveau des cellules hypoxiques retrouvée en Immunofluorescence (Figure
II.5A). La forme phosphorylée n’a pas pu être évaluée en Western Blotting. Nous n’avons pas eu
assez de matériel cellulaire pour réaliser un fractionnement membranaire, qui aurait permis
d’évaluer la fraction p47 transloquée au niveau de la membrane et qui correspond à la forme activée
rejoignant le cytochrome b558 pour former le complexe NADPHoxydase actif. Toutefois, les
images de microscopie confocale montré une localisation de l’expression de p47 au niveau de la
membrane. Par ailleurs nous avons retrouvé une augmentation de la forme phosphorylée de la
cofiline au niveau des CSM hypoxiques (Figure II.5B). Cette forme phosphorylée correspond à la
forme inactive de la cofiline. Nous n’avons pas réussi à démontrer la co-expression de la sous unité
p47 phosphorylée avec la cofiline.

Figure II.5 : 5A : expression de la forme active phosphorylée de p47 en immunofluorescence.

5B : expression de la forme phosphorylé de la cofiline en Western Blotting. Comparaison groupe
hypoxique versus groupe normoxique ; n=8 ; seuil de significativité Δ : P<0,05. Flèches
blanches : localisation membranaire de l’expression de phospho-p47.

90
VI. Modification de l’expression des LIM kinases

Nous avons montré en immunofluorescence une augmentation de l’expression de LIM

kinase 1 en lien avec l’augmentation de ROCK1 et de LIM kinase2 en lien avec l’augmentation de
Rac-GTP. La détectabilité des LIM kinases en Western Blot était limitée, probablement en raison
d’une insuffisance d’affinité de l’anticorps utilisé. En immunofluorescence il semblait que les LIM
kinases étaient exprimées au niveau membranaire et au niveau des câbles de stress.

Figure II.6 : 6A : expression de LIM kinase-1 en immunofluorescence. 6B expression de LIM

kinase-2 en immunofluorescence. flèches blanches : expression membranaire.

6A CSM N CSM H

LIMK1 LIMK1 + Phalloïdine LIMK1 LIMK1 + Phalloïdine

6B CSM N CSM H

LIMK2 LIMK2 + Phalloïdine LIMK2 LIMK2 + Phalloïdine

91
C. Discussion
Nos résultats ont montré que les CSM issues de rats hypoxiques gardaient une augmentation
de l’expression de HIF1 α même après expansion en culture en milieu normoxique. Cette expression
de HIF1 α s’accompagnait d’une augmentation de l’expression de PI3kinase et d’une augmentation
de l’activation de l’activité et de la réactivité de la NADPHoxydase membranaire. Ceci avait un
impact sur la migration des CSM hypoxiques en lien probablement avec un switch vers la voie
Rock/LIMkinase-1 lorsqu’elles étaient stimulées avec du SVF20%.

Le modèle utilisé était un modèle d’hypoxie de réoxygénation dans la mesure où les caissons
d’hypobarie étaient ouverts deux fois par semaine pour assurer la maintenance des animaux. Ceci a
pu avoir une influence importante sur les résultats.

La première constatation est le maintien d’une expression augmentée de HIF-1α avec,

comme montré en immunofluorescence, une translocation nucléaire de HIF-1α. Cette translocation
retrouvée habituellement en condition hypoxique est responsable de la régulation par HIF-1α de
gènes intervenant dans l’adaptation à l’hypoxie. Ce maintien de HIF-1α en conditions normoxiques
a été montré essentiellement en réponse à une stimulation par les cytokines tel que le TGFß. Dans ce
cas la dégradation par ubiquitination de HIF-1α est inhibée par une action des cytokines sur la
prolyl-2-hydroxylase et il n’a pas été documenté dans ce cas si HIF-1α avait une translocation
nucléaire. Récemment, Patten et ses collaborateurs (Patten et al.) ont montré que seuls les ROS
produits par la mitochondrie étaient responsable d’un maintient de HIF-1α en conditions
normoxiques. Nous n’avons pas, dans notre expérience, documenté la production de ROS et leur
origine, mitochondriale ou liée à l’activation de la NADPHoxydase membranaire.

Nous avons relié l’activation de Rac1 à l’hypoxie chronique. En effet Xue Y (Xue et al.,
2006) a montré que l’augmentation de l’expression génique et de l’activation de Rac1 et de Cdc42
était reliée à la teneur en oxygène d’une manière dépendante du temps d’exposition à l’hypoxie.
Turcott (Turcotte et al., 2003; Turcotte et al., 2004) avait décrit également une augmentation de
l’expression de Rac1, Cdc42 et RhoA au niveau de cellules cancéreuses de rein soumises à
l’hypoxie. L’activation de Rac1 avec augmentation des transcrits a été aussi retrouvée au niveau de
lignées de cellules cancéreuses gastriques soumises à l’hypoxie (Xue et al., 2006). Cependant, des
résultats contradictoires ont été apportés sur des cellules musculaires lisses de porc nouveau né
soumises à des conditions d’hypoxie chronique ou aigüe, où Rac1 n’était pas activé (Bailly et al.,
2004). Inversement, les petites protéines Rho peuvent jouer un rôle sur la modulation de

92
l’expression de HIF-1α avec un impact sur la sécrétion de VEGF et l’angiogénèse. Hue et al (Xue et
al., 2006) ont montré, en effet, que l’utilisation d’un dominant négatif de Rac1 ou de Cdc42
augmentait l’expression de la protéine de Von Hippel Lindau (VHL) et diminuait la stabilité de HIF-
1α et par conséquent l’expression de VEGF.

Semenza et al ont montré que l’activation de Rac1 et de Cdc42 en conditions hypoxiques

était réversible par les inhibiteurs de la PI3kinase (LY294002), les inhibiteurs de PTK (genisteine)
ainsi que par le DPI (diphénylène iodonium) antagoniste du complexe I mitochondrial (Hirota and
Semenza, 2001). Dans notre étude nous n’avons pas encore vérifié que l’inhibition de l’activité de la
PI3kinase inhibait le différentiel de pouvoir de migration des CSM hypoxiques. L’augmentation de
la phosphorylation de la PI3kinase en condition hypoxique a été initialement décrite en condition
d’hypoxie aigüe (1%) sur des lignées de cellules fibroblastiques embryonnaires (Mazure et al.,
1997) et confirmée par Chen EY sur des lignées de fibrosarcome (Chen et al., 2001). Cette
activation avait un impact sur la phosphorylation d’AKT et l’inhibait l’expression de GS3K. Elle
pourrait augmenter la sécrétion de VEGF en hypoxie induisant des effets pro-angiogéniques
(Mazure et al., 1997). La mécanistique n’est pas connue, mais ces auteurs ont émis l’hypothèse
d’une modulation des facteurs des voies de signalisation associées aux facteurs de croissance dont
l’expression était augmentée par HIF-1α. Mazure a montré d’ailleurs que la stimulation de PI3kinase
par l’hypoxie aigüe était indépendante d’une liaison aux récepteurs puisqu’elle n’était pas modifiée
par l’inhibition du récepteur du PDGFβ. L’activation par la PI3kinase de la NADPHoxydase n’est
pas parfaitement élucidée. Il régulerait l’échange de guanine au niveau de Rac1 et pourrait
également par la sécrétion de ionositol bi et triphosphate (PtdIns (3,4)P2 et PtdIns P3) se lier
directement au domaine phox des sous-unités p47 et p40.

Le rôle de l’activation de Rac1 dans l’activation de la NADPHoxydase a été parfaitement

documenté, mais pas pour les cellules souches mésenchymateuses. Dans ces études, l’activation de
Rac1 a été directement relié à une augmentation de stress oxydant impliquant des lésions
dégénératives de différents tissus vasculaires (Rey et al., 2001), cardiaques, neuronaux (Raz et al.),
hépatiques. Le stress initial était soit lié à un stress ischémique (Raz et al,), soit lié à des
rayonnements (Haruta et al., 2009), ou encore à un stress mécanique. Au niveau des cellules
phagocytaires il a été montré que Rac1-GTP se liait directement à la sous unité p67 contribuant à sa
translocation membranaire. Ceci a été confirmé pour les isoformes NOX1, 2 ou 3 mais pas pour les
autres isoformes de la NADPHoxydase (Koga et al., 1999); (Miyano and Sumimoto, 2007). Par
ailleurs la phosphorylation de la sous-unité p47phox permet à cette sous-unité de se transloquer à la

93
membrane et contribue à augmenter l’affinité de p67phox pour le cytochrome p558 (Paclet et al.,
2001).

Le rôle de l’hypoxie dans l’activation de la NADPHoxydase a fait l’objet de nombreuses

publications antérieures notamment au niveau des cellules vasculaires musculaires lisses ou
endothéliales (He et al.) ; (Schroder et al., 2009); (Cutz et al., 2009); (Hool et al., 2005). Nos
résultats ont retrouvé une augmentation non seulement de l’expression de Rac1 mais aussi de la
protéine p47 au niveau des CSM hypoxiques avec des images en immuofluorescence pouvant
évoquer une translocation membranaire. HIF-1α avait été précédemment impliqué dans le contrôle
de l’expression génique de NOX4 et il a été montré par des techniques de « chips » que NOX4
comportait un site de liaison pour HIF-1α (Diebold et al.). De façon originale, nous avons retrouvé
une augmentation de la réactivité de l’activation de NADPHoxydase lorsque les CSM hypoxiques
sont stimulées par du SVF 20%.

Nous avons montré que la migration des CSM hypoxiques était inhibée par l’utilisation
d’inhibiteurs de la NADPHoxydase. L’implication de l’activation de la NADPHoxydase dans la
migration cellulaire a également fait l’objet de travaux antérieurs. Les effets « paradoxaux » de
l’apocynine ont déjà été rapportés avec l’hypothèse d’une première phase d’augmentation de
l’activité enzymatique précédent son inhibition ce qui pourrait expliquer l’augmentation de
migration des CSM normale sous l’action de l’apocynine non retrouvé par utilisation de l’inhibiteur
de gp91. Dans des lignées de cellules leucémiques myéloïde ou lymphoïde, la migration cellulaire
est abolie par l’inhibition de l’expression de NOX2 ou 4 (Reddy et al.). Dans un modèle de co-
culture de cellules stromales avec des lignées épithéliales de cancer du sein, Tobar N (Tobar et al.) a
montré que l’augmentation de l’activation de NOX4 par du TGFβ augmentait le potentiel de
migration en lien avec la libération accrue de radicaux libres alors que la « down-régulation » de
l’expression de NOX4 inhibait au contraire la migration. L’activation de la NADPHoxydase a été
également impliquée dans la migration de cellules non tumorales telles que les cellules musculaires
lisses mises en causes dans les remodelages vasculaires pathologiques (Sundaresan et al., 1995) .
De façon parallèle, Marcelo G. Binker a montré une augmentation de l’invasivité de cellules
cancéreuses de pancréas par stimulation de la voie Rac1 (Binker et al., 2009). Nous montrons aussi
que les CSM hypoxiques expriment le facteur PAI-1 (inhibiteur de l’activateur du plasminogène)
qui a été impliqué dans l’invasivité de nombreux cancers en lien avec la migration ameboïde (Malo
et al., 2006).

94
La mécanistique reliant l’activation de la NADPHoxydase et l’augmentation de la migration
mésenchymateuse n’est pas parfaitement comprise. Nous avons montré au niveau des CSM
hypoxiques que la cofiline était phosphorylée. Les modifications de l’état de phosphorylation de la
cofiline sur une sérine3 sont nécessaires pour le réarrangement du cytosquelette (Ridley et al.,
2003). La phosphorylation inhibe l’activité de la cofiline permettant la polymérisation de la F-
actine, qui est le premier événement initiateur de la migration cellulaire. Le rôle de la
phosphorylation de p47 dans la phosphorylation de la cofiline a déjà été évoqué (Nagaishi et al.,
1999). La production de H2O2 modifie la phosphorylation de la cofiline par une action sur le
régulateur Slingshot-1L (SSH-1L) (Kim et al., 2009).

Dans notre expérimentation nous avons retrouvé une augmentation de l’expression des
LIMkinase 1 et 2 qui modifient également l’état de phosphorylation de la cofiline. LIMKinase 1
serait responsable des modifications de phosphorylation de la cofiline liée à l’activation de Rac-1
(Yang et al., 1998). De façon intéressante, une expérimentation a montré que des clones de cellules
dominant négatif pour la prolyl-2-hydroxylase avaient une absence de phosphorylation de la
cofiline diminuant la migration cellulaire sur un test de blessure (Vogel et al.). La régulation
différentielle des voie Rac1/LIMkinase2 et Rock1/LIMkinase1 due à l’hypoxie chronique et/ou à la
stimulation par le SVF pourrait rendre compte de l’état différentiel de migration entre les cellules
hypoxiques stimulées ou non et les cellules normoxiques. En effet, il existe potentiellement des
relations entre la voie Rac1/LIMK2 et Rock1/LIMK1 qui ont été précédemment évoquées pour
expliquer les transitions de migration mésenchymo-ameboïde au niveau des cellules cancéreuses
(Mishima et al.); (Pankova et al.). L’activation initiale de Rac1 en condition hypoxiques pourrait
favoriser le switch vers Rock1/LIMK1 lors de la stimulation par le SVF. Nos résultats montrent en
effet une augmentation de l’expression de Rock1/LIMK1 au niveau des CSM stimulées par le SVF
20%. L’utilisation dans la suite de nos expérimentations de dominant négatif pour LIMK1 pourrait
confirmer cette hypothèse.

95
Conclusion
Cette expérimentation confirme les résultats de la littérature concernant le rôle de l’activation de la
PI3kinase de Rac1 et de la NADPHoxydase dans la migration cellulaire. Il n’y avait jusqu’à présent
pas de données concernant les cellules souches mésenchymateuses. Il conviendra d’étudier
également la libération des radicaux libres oxygénés en lien avec cette activation de la
NADPHoxydase au niveau des cellules hypoxiques. La rémanence des ces activations au niveau des
cellules hypoxiques revenues dans un environnement normoxique reste à comprendre. La nature
exacte de la migration des CSM hypoxiques n’a pas pu être définie. Des images de migration en
chambre de migration 3D, en présence de PAI-1 matriciel, en microscopie confocale temps réel
(lames avec chambre de migration Ibidi, Biovalley, France) pourraient permettre de visualiser la
morphologie de ces cellules en cours de migration. La régulation différentielle des voies
Rac1/Rock1, LIMK2/LIMK1 reste à étudier. Nous sommes confrontés à la difficulté de trouver à la
fois des anticorps et des oligonucléotides spécifiques au rat permettant de réaliser les analyses en
Western Blotting et RT-PCR. Enfin, le lien mécanistique exact existant entre l’activation de la
PI3kinase et de la NADPHoxydase dans ce contexte d’hypoxie chronique reste à trouver. Au final
nous proposons le schéma mécanistique suivant qu’il conviendra de confirmer en poursuivant cette
expérimentation.

96
III.Bibliographie

Abedin M, Tintut Y and Demer LL (2004) Mesenchymal stem cells and the artery wall. Circ Res
95:671-676.
Abo A, Webb MR, Grogan A and Segal AW (1994) Activation of NADPH oxidase involves the
dissociation of p21rac from its inhibitory GDP/GTP exchange protein (rhoGDI) followed by
its translocation to the plasma membrane. Biochem J 298 Pt 3:585-591.
Airey JA, Almeida-Porada G, Colletti EJ, Porada CD, Chamberlain J, Movsesian M, Sutko JL and
Zanjani ED (2004) Human mesenchymal stem cells form Purkinje fibers in fetal sheep heart.
Circulation 109:1401-1407.
Allal C, Pradines A, Hamilton AD, Sebti SM and Favre G (2002) Farnesylated RhoB prevents cell
cycle arrest and actin cytoskeleton disruption caused by the geranylgeranyltransferase I
inhibitor GGTI-298. Cell Cycle 1:430-437.
Alsalameh S, Amin R, Gemba T and Lotz M (2004) Identification of mesenchymal progenitor cells
in normal and osteoarthritic human articular cartilage. Arthritis Rheum 50:1522-1532.
Ambruso DR, Knall C, Abell AN, Panepinto J, Kurkchubasche A, Thurman G, Gonzalez-Aller C,
Hiester A, deBoer M, Harbeck RJ, Oyer R, Johnson GL and Roos D (2000) Human
neutrophil immunodeficiency syndrome is associated with an inhibitory Rac2 mutation.
Proc Natl Acad Sci U S A 97:4654-4659.
Anjos-Afonso F, Siapati EK and Bonnet D (2004) In vivo contribution of murine mesenchymal
stem cells into multiple cell-types under minimal damage conditions. J Cell Sci 117:5655-
5664.
Arber S, Barbayannis FA, Hanser H, Schneider C, Stanyon CA, Bernard O and Caroni P (1998)
Regulation of actin dynamics through phosphorylation of cofilin by LIM-kinase. Nature
393:805-809.
Aspenstrom P, Fransson A and Saras J (2004) Rho GTPases have diverse effects on the
organization of the actin filament system. Biochem J 377:327-337.
Baber SR, Deng W, Master RG, Bunnell BA, Taylor BK, Murthy SN, Hyman AL and Kadowitz PJ
(2007) Intratracheal mesenchymal stem cell administration attenuates monocrotaline-
induced pulmonary hypertension and endothelial dysfunction. Am J Physiol Heart Circ
Physiol 292:H1120-1128.
Baddoo M, Hill K, Wilkinson R, Gaupp D, Hughes C, Kopen GC and Phinney DG (2003)
Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative
selection. J Cell Biochem 89:1235-1249.
Bailly K, Ridley AJ, Hall SM and Haworth SG (2004) RhoA activation by hypoxia in pulmonary
arterial smooth muscle cells is age and site specific. Circ Res 94:1383-1391.
Bamburg JR and Bernstein BW (2008) ADF/cofilin. Curr Biol 18:R273-275.
Bandyopadhyay RS, Phelan M and Faller DV (1995) Hypoxia induces AP-1-regulated genes and
AP-1 transcription factor binding in human endothelial and other cell types. Biochim
Biophys Acta 1264:72-78.
Banfi A, Bianchi G, Notaro R, Luzzatto L, Cancedda R and Quarto R (2002) Replicative aging and
gene expression in long-term cultures of human bone marrow stromal cells. Tissue Eng
8:901-910.
Banfi B, Clark RA, Steger K and Krause KH (2003) Two novel proteins activate superoxide
generation by the NADPH oxidase NOX1. J Biol Chem 278:3510-3513.

97
Banfi B, Maturana A, Jaconi S, Arnaudeau S, Laforge T, Sinha B, Ligeti E, Demaurex N and
Krause KH (2000) A mammalian H+ channel generated through alternative splicing of the
NADPH oxidase homolog NOH-1. Science 287:138-142.
Banfi B, Molnar G, Maturana A, Steger K, Hegedus B, Demaurex N and Krause KH (2001) A
Ca(2+)-activated NADPH oxidase in testis, spleen, and lymph nodes. J Biol Chem
276:37594-37601.
Banfi B, Tirone F, Durussel I, Knisz J, Moskwa P, Molnar GZ, Krause KH and Cox JA (2004)
Mechanism of Ca2+ activation of the NADPH oxidase 5 (NOX5). J Biol Chem 279:18583-
18591.
Barry F, Boynton R, Murphy M, Haynesworth S and Zaia J (2001) The SH-3 and SH-4 antibodies
recognize distinct epitopes on CD73 from human mesenchymal stem cells. Biochem Biophys
Res Commun 289:519-524.
Bartholomew A, Sturgeon C, Siatskas M, Ferrer K, McIntosh K, Patil S, Hardy W, Devine S, Ucker
D, Deans R, Moseley A and Hoffman R (2002) Mesenchymal stem cells suppress
lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol
30:42-48.
Bedard K and Krause KH (2007) The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases:
physiology and pathophysiology. Physiol Rev 87:245-313.
Beitner-Johnson D and Millhorn DE (1998) Hypoxia induces phosphorylation of the cyclic AMP
response element-binding protein by a novel signaling mechanism. J Biol Chem 273:19834-
19839.
Bell EL, Emerling BM and Chandel NS (2005) Mitochondrial regulation of oxygen sensing.
Mitochondrion 5:322-332.
Bell EL, Klimova TA, Eisenbart J, Schumacker PT and Chandel NS (2007) Mitochondrial reactive
oxygen species trigger hypoxia-inducible factor-dependent extension of the replicative life
span during hypoxia. Mol Cell Biol 27:5737-5745.
Bennett JH, Joyner CJ, Triffitt JT and Owen ME (1991) Adipocytic cells cultured from marrow
have osteogenic potential. J Cell Sci 99 ( Pt 1):131-139.
Bensidhoum M, Chapel A, Francois S, Demarquay C, Mazurier C, Fouillard L, Bouchet S, Bertho
JM, Gourmelon P, Aigueperse J, Charbord P, Gorin NC, Thierry D and Lopez M (2004)
Homing of in vitro expanded Stro-1- or Stro-1+ human mesenchymal stem cells into the
NOD/SCID mouse and their role in supporting human CD34 cell engraftment. Blood
103:3313-3319.
Bernards A (2003) GAPs galore! A survey of putative Ras superfamily GTPase activating proteins
in man and Drosophila. Biochim Biophys Acta 1603:47-82.
Beyer RE (1990) The participation of coenzyme Q in free radical production and antioxidation.
Free Radic Biol Med 8:545-565.
Bhagavati S and Xu W (2004) Isolation and enrichment of skeletal muscle progenitor cells from
mouse bone marrow. Biochem Biophys Res Commun 318:119-124.
Bianchi G, Banfi A, Mastrogiacomo M, Notaro R, Luzzatto L, Cancedda R and Quarto R (2003) Ex
vivo enrichment of mesenchymal cell progenitors by fibroblast growth factor 2. Exp Cell
Res 287:98-105.
Bianco P and Gehron Robey P (2000) Marrow stromal stem cells. J Clin Invest 105:1663-1668.
Bianco P, Riminucci M, Gronthos S and Robey PG (2001) Bone marrow stromal stem cells: nature,
biology, and potential applications. Stem Cells 19:180-192.
Bianco P, Riminucci M, Kuznetsov S and Robey PG (1999) Multipotential cells in the bone marrow
stroma: regulation in the context of organ physiology. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 9:159-
173.

98
Binker MG, Binker-Cosen AA, Richards D, Oliver B and Cosen-Binker LI (2009) EGF promotes
invasion by PANC-1 cells through Rac1/ROS-dependent secretion and activation of MMP-
2. Biochem Biophys Res Commun 379:445-450.
Block J, Stradal TE, Hanisch J, Geffers R, Kostler SA, Urban E, Small JV, Rottner K and Faix J
(2008) Filopodia formation induced by active mDia2/Drf3. J Microsc 231:506-517.
Bokoch GM and Diebold BA (2002) Current molecular models for NADPH oxidase regulation by
Rac GTPase. Blood 100:2692-2696.
Bokoch GM and Zhao T (2006) Regulation of the phagocyte NADPH oxidase by Rac GTPase.
Antioxid Redox Signal 8:1533-1548.
Bonnet P, Awede B, Rochefort GY, Mirza A, Lermusiaux P, Domenech J and Eder V (2008)
Electrophysiological maturation of rat mesenchymal stem cells after induction of vascular
smooth muscle cell differentiation in vitro. Stem Cells Dev 17:1131-1140.
Bonyadi M, Waldman SD, Liu D, Aubin JE, Grynpas MD and Stanford WL (2003) Mesenchymal
progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null
mice. Proc Natl Acad Sci U S A 100:5840-5845.
Bosch P, Pratt SL and Stice SL (2006) Isolation, characterization, gene modification, and nuclear
reprogramming of porcine mesenchymal stem cells. Biol Reprod 74:46-57.
Bosnakovski D, Mizuno M, Kim G, Takagi S, Okumura M and Fujinaga T (2005) Isolation and
multilineage differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells. Cell Tissue
Res 319:243-253.
Boureux A, Vignal E, Faure S and Fort P (2007) Evolution of the Rho family of ras-like GTPases in
eukaryotes. Mol Biol Evol 24:203-216.
Bourne HR, Sanders DA and McCormick F (1991) The GTPase superfamily: conserved structure
and molecular mechanism. Nature 349:117-127.
Brechard S and Tschirhart EJ (2008) Regulation of superoxide production in neutrophils: role of
calcium influx. J Leukoc Biol 84:1223-1237.
Brewer AC, Sparks EC and Shah AM (2006) Transcriptional regulation of the NADPH oxidase
isoform, Nox1, in colon epithelial cells: role of GATA-binding factor(s). Free Radic Biol
Med 40:260-274.
Brooke G, Tong H, Levesque JP and Atkinson K (2008) Molecular trafficking mechanisms of
multipotent mesenchymal stem cells derived from human bone marrow and placenta. Stem
Cells Dev 17:929-940.
Brown DI and Griendling KK (2009) Nox proteins in signal transduction. Free Radic Biol Med
47:1239-1253.
Bruder SP, Jaiswal N and Haynesworth SE (1997) Growth kinetics, self-renewal, and the
osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive
subcultivation and following cryopreservation. J Cell Biochem 64:278-294.
Brunelle JK, Bell EL, Quesada NM, Vercauteren K, Tiranti V, Zeviani M, Scarpulla RC and
Chandel NS (2005) Oxygen sensing requires mitochondrial ROS but not oxidative
phosphorylation. Cell Metab 1:409-414.
Budinger GR, Duranteau J, Chandel NS and Schumacker PT (1998) Hibernation during hypoxia in
cardiomyocytes. Role of mitochondria as the O2 sensor. J Biol Chem 273:3320-3326.
Burbelo PD, Drechsel D and Hall A (1995) A conserved binding motif defines numerous candidate
target proteins for both Cdc42 and Rac GTPases. J Biol Chem 270:29071-29074.
Caceres M, Tobar N, Guerrero J, Smith PC and Martinez J (2008) c-jun-NH2JNK mediates
invasive potential and EGFR activation by regulating the expression of HB-EGF in a
urokinase-stimulated pathway. J Cell Biochem 103:986-993.
Caplan AI (1991) Mesenchymal stem cells. J Orthop Res 9:641-650.
Carroll VA and Ashcroft M (2005) Targeting the molecular basis for tumour hypoxia. Expert Rev
Mol Med 7:1-16.

99
Castro-Malaspina H, Gay RE, Resnick G, Kapoor N, Meyers P, Chiarieri D, McKenzie S,
Broxmeyer HE and Moore MA (1980) Characterization of human bone marrow fibroblast
colony-forming cells (CFU-F) and their progeny. Blood 56:289-301.
Ceradini DJ and Gurtner GC (2005) Homing to hypoxia: HIF-1 as a mediator of progenitor cell
recruitment to injured tissue. Trends Cardiovasc Med 15:57-63.
Chance B, Sies H and Boveris A (1979) Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. Physiol
Rev 59:527-605.
Chandel NS, Maltepe E, Goldwasser E, Mathieu CE, Simon MC and Schumacker PT (1998)
Mitochondrial reactive oxygen species trigger hypoxia-induced transcription. Proc Natl
Acad Sci U S A 95:11715-11720.
Chandel NS, McClintock DS, Feliciano CE, Wood TM, Melendez JA, Rodriguez AM and
Schumacker PT (2000) Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III
stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: a mechanism of O2 sensing. J
Biol Chem 275:25130-25138.
Chapel A, Bertho JM, Bensidhoum M, Fouillard L, Young RG, Frick J, Demarquay C, Cuvelier F,
Mathieu E, Trompier F, Dudoignon N, Germain C, Mazurier C, Aigueperse J, Borneman J,
Gorin NC, Gourmelon P and Thierry D (2003) Mesenchymal stem cells home to injured
tissues when co-infused with hematopoietic cells to treat a radiation-induced multi-organ
failure syndrome. J Gene Med 5:1028-1038.
Charbord P, Tavian M, Humeau L and Peault B (1996) Early ontogeny of the human marrow from
long bones: an immunohistochemical study of hematopoiesis and its microenvironment.
Blood 87:4109-4119.
Chen EY, Mazure NM, Cooper JA and Giaccia AJ (2001) Hypoxia activates a platelet-derived
growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway that results in glycogen
synthase kinase-3 inactivation. Cancer Res 61:2429-2433.
Chen K, Craige SE and Keaney JF, Jr. (2009) Downstream targets and intracellular
compartmentalization in Nox signaling. Antioxid Redox Signal 11:2467-2480.
Chow DC, Wenning LA, Miller WM and Papoutsakis ET (2001) Modeling pO(2) distributions in
the bone marrow hematopoietic compartment. I. Krogh's model. Biophys J 81:675-684.
Coleman CN (1988) Hypoxia in tumors: a paradigm for the approach to biochemical and
physiologic heterogeneity. J Natl Cancer Inst 80:310-317.
Colter DC, Class R, DiGirolamo CM and Prockop DJ (2000) Rapid expansion of recycling stem
cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. Proc Natl Acad Sci U S
A 97:3213-3218.
Covas DT, Siufi JL, Silva AR and Orellana MD (2003) Isolation and culture of umbilical vein
mesenchymal stem cells. Braz J Med Biol Res 36:1179-1183.
Cross AR and Curnutte JT (1995) The cytosolic activating factors p47phox and p67phox have
distinct roles in the regulation of electron flow in NADPH oxidase. J Biol Chem 270:6543-
6548.
Cuevas P, Carceller F, Garcia-Gomez I, Yan M and Dujovny M (2004) Bone marrow stromal cell
implantation for peripheral nerve repair. Neurol Res 26:230-232.
Cutz E, Pan J and Yeger H (2009) The role of NOX2 and "novel oxidases" in airway chemoreceptor
O(2) sensing. Adv Exp Med Biol 648:427-438.
Czesnikiewicz-Guzik M, Lorkowska B, Zapala J, Czajka M, Szuta M, Loster B, Guzik TJ and
Korbut R (2008) NADPH oxidase and uncoupled nitric oxide synthase are major sources of
reactive oxygen species in oral squamous cell carcinoma. Potential implications for immune
regulation in high oxidative stress conditions. J Physiol Pharmacol 59:139-152.
da Silva Meirelles L, Chagastelles PC and Nardi NB (2006) Mesenchymal stem cells reside in
virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci 119:2204-2213.

100
Dang PM, Babior BM and Smith RM (1999) NADPH dehydrogenase activity of p67PHOX, a
cytosolic subunit of the leukocyte NADPH oxidase. Biochemistry 38:5746-5753.
Dang PM, Cross AR and Babior BM (2001) Assembly of the neutrophil respiratory burst oxidase: a
direct interaction between p67PHOX and cytochrome b558. Proc Natl Acad Sci U S A
98:3001-3005.
Dazzi F, Ramasamy R, Glennie S, Jones SP and Roberts I (2006) The role of mesenchymal stem
cells in haemopoiesis. Blood Rev 20:161-171.
De Bari C, Dell'Accio F, Tylzanowski P and Luyten FP (2001) Multipotent mesenchymal stem cells
from adult human synovial membrane. Arthritis Rheum 44:1928-1942.
De Ugarte DA, Alfonso Z, Zuk PA, Elbarbary A, Zhu M, Ashjian P, Benhaim P, Hedrick MH and
Fraser JK (2003) Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on
multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunol Lett 89:267-270.
Decoursey TE (2003) Voltage-gated proton channels and other proton transfer pathways. Physiol
Rev 83:475-579.
DeCoursey TE (2008) Voltage-gated proton channels. Cell Mol Life Sci 65:2554-2573.
DeCoursey TE, Morgan D and Cherny VV (2002) The gp91phox component of NADPH oxidase is
not a voltage-gated proton channel. J Gen Physiol 120:773-779.
DeCoursey TE, Morgan D and Cherny VV (2003) The voltage dependence of NADPH oxidase
reveals why phagocytes need proton channels. Nature 422:531-534.
Demple B (1999) Radical ideas: genetic responses to oxidative stress. Clin Exp Pharmacol Physiol
26:64-68.
Dennis JE and Charbord P (2002) Origin and differentiation of human and murine stroma. Stem
Cells 20:205-214.
Dennis JE, Merriam A, Awadallah A, Yoo JU, Johnstone B and Caplan AI (1999) A quadripotential
mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of an adult mouse. J Bone Miner Res
14:700-709.
DerMardirossian C, Schnelzer A and Bokoch GM (2004) Phosphorylation of RhoGDI by Pak1
mediates dissociation of Rac GTPase. Mol Cell 15:117-127.
Devine SM, Bartholomew AM, Mahmud N, Nelson M, Patil S, Hardy W, Sturgeon C, Hewett T,
Chung T, Stock W, Sher D, Weissman S, Ferrer K, Mosca J, Deans R, Moseley A and
Hoffman R (2001) Mesenchymal stem cells are capable of homing to the bone marrow of
non-human primates following systemic infusion. Exp Hematol 29:244-255.
Devine SM, Cobbs C, Jennings M, Bartholomew A and Hoffman R (2003) Mesenchymal stem cells
distribute to a wide range of tissues following systemic infusion into nonhuman primates.
Blood 101:2999-3001.
Dicker A, Le Blanc K, Astrom G, van Harmelen V, Gotherstrom C, Blomqvist L, Arner P and
Ryden M (2005) Functional studies of mesenchymal stem cells derived from adult human
adipose tissue. Exp Cell Res 308:283-290.
Diebold I, Petry A, Hess J and Gorlach A The NADPH oxidase subunit NOX4 is a new target gene
of the hypoxia-inducible factor-1. Mol Biol Cell 21:2087-2096.
Disanza A, Steffen A, Hertzog M, Frittoli E, Rottner K and Scita G (2005) Actin polymerization
machinery: the finish line of signaling networks, the starting point of cellular movement.
Cell Mol Life Sci 62:955-970.
Donaldson JG and Honda A (2005) Localization and function of Arf family GTPases. Biochem Soc
Trans 33:639-642.
Duan HF, Wu CT, Wu DL, Lu Y, Liu HJ, Ha XQ, Zhang QW, Wang H, Jia XX and Wang LS
(2003) Treatment of myocardial ischemia with bone marrow-derived mesenchymal stem
cells overexpressing hepatocyte growth factor. Mol Ther 8:467-474.
Duranteau J, Chandel NS, Kulisz A, Shao Z and Schumacker PT (1998) Intracellular signaling by
reactive oxygen species during hypoxia in cardiomyocytes. J Biol Chem 273:11619-11624.

101
Dworakowski R, Alom-Ruiz SP and Shah AM (2008) NADPH oxidase-derived reactive oxygen
species in the regulation of endothelial phenotype. Pharmacol Rep 60:21-28.
Eder V, Gautier M, Boissiere J, Girardin C, Rebocho M and Bonnet P (2004) Gamma irradiation
induces acetylcholine-evoked, endothelium-independent relaxation and activates K-channels
of isolated pulmonary artery of rats. Int J Radiat Oncol Biol Phys 60:1530-1537.
Fackler OT and Grosse R (2008) Cell motility through plasma membrane blebbing. J Cell Biol
181:879-884.
Fernandez M, Simon V, Herrera G, Cao C, Del Favero H and Minguell JJ (1997) Detection of
stromal cells in peripheral blood progenitor cell collections from breast cancer patients.
Bone Marrow Transplant 20:265-271.
Fiedler J, Brill C, Blum WF and Brenner RE (2006) IGF-I and IGF-II stimulate directed cell
migration of bone-marrow-derived human mesenchymal progenitor cells. Biochem Biophys
Res Commun 345:1177-1183.
Fiedler J, Etzel N and Brenner RE (2004) To go or not to go: Migration of human mesenchymal
progenitor cells stimulated by isoforms of PDGF. J Cell Biochem 93:990-998.
Fiedler J, Leucht F, Waltenberger J, Dehio C and Brenner RE (2005) VEGF-A and PlGF-1
stimulate chemotactic migration of human mesenchymal progenitor cells. Biochem Biophys
Res Commun 334:561-568.
Fiedler J, Roderer G, Gunther KP and Brenner RE (2002) BMP-2, BMP-4, and PDGF-bb stimulate
chemotactic migration of primary human mesenchymal progenitor cells. J Cell Biochem
87:305-312.
Fillingame RH (1999) Molecular rotary motors. Science 286:1687-1688.
Fink T, Abildtrup L, Fogd K, Abdallah BM, Kassem M, Ebbesen P and Zachar V (2004) Induction
of adipocyte-like phenotype in human mesenchymal stem cells by hypoxia. Stem Cells
22:1346-1355.
Finkenzeller G, Technau A and Marme D (1995) Hypoxia-induced transcription of the vascular
endothelial growth factor gene is independent of functional AP-1 transcription factor.
Biochem Biophys Res Commun 208:432-439.
Forte G, Minieri M, Cossa P, Antenucci D, Sala M, Gnocchi V, Fiaccavento R, Carotenuto F, De
Vito P, Baldini PM, Prat M and Di Nardo P (2006) Hepatocyte growth factor effects on
mesenchymal stem cells: proliferation, migration, and differentiation. Stem Cells 24:23-33.
Foyouzi-Youssefi R, Petersson F, Lew DP, Krause KH and Nusse O (1997) Chemoattractant-
induced respiratory burst: increases in cytosolic Ca2+ concentrations are essential and
synergize with a kinetically distinct second signal. Biochem J 322 ( Pt 3):709-718.
Francois S, Bensidhoum M, Mouiseddine M, Mazurier C, Allenet B, Semont A, Frick J, Sache A,
Bouchet S, Thierry D, Gourmelon P, Gorin NC and Chapel A (2006) Local irradiation not
only induces homing of human mesenchymal stem cells at exposed sites but promotes their
widespread engraftment to multiple organs: a study of their quantitative distribution after
irradiation damage. Stem Cells 24:1020-1029.
Freeman JL, Abo A and Lambeth JD (1996) Rac "insert region" is a novel effector region that is
implicated in the activation of NADPH oxidase, but not PAK65. J Biol Chem 271:19794-
19801.
Friedenstein AJ, Chailakhjan RK and Lalykina KS (1970) The development of fibroblast colonies
in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet 3:393-
403.
Friedenstein AJ, Deriglasova UF, Kulagina NN, Panasuk AF, Rudakowa SF, Luria EA and
Ruadkow IA (1974) Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells
as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol 2:83-92.
Friedenstein AJ, Gorskaja JF and Kulagina NN (1976) Fibroblast precursors in normal and
irradiated mouse hematopoietic organs. Exp Hematol 4:267-274.

102
Friedenstein AJ, Ivanov-Smolenski AA, Chajlakjan RK, Gorskaya UF, Kuralesova AI, Latzinik
NW and Gerasimow UW (1978) Origin of bone marrow stromal mechanocytes in
radiochimeras and heterotopic transplants. Exp Hematol 6:440-444.
Friedl P (2004) Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin
Cell Biol 16:14-23.
Friedl P, Entschladen F, Conrad C, Niggemann B and Zanker KS (1998) CD4+ T lymphocytes
migrating in three-dimensional collagen lattices lack focal adhesions and utilize beta1
integrin-independent strategies for polarization, interaction with collagen fibers and
locomotion. Eur J Immunol 28:2331-2343.
Friedl P and Wolf K (2003) Proteolytic and non-proteolytic migration of tumour cells and
leucocytes. Biochem Soc Symp:277-285.
Garrido AM and Griendling KK (2009) NADPH oxidases and angiotensin II receptor signaling.
Mol Cell Endocrinol 302:148-158.
Geiszt M and Leto TL (2004) The Nox family of NAD(P)H oxidases: host defense and beyond. J
Biol Chem 279:51715-51718.
Gerald D, Berra E, Frapart YM, Chan DA, Giaccia AJ, Mansuy D, Pouyssegur J, Yaniv M and
Mechta-Grigoriou F (2004) JunD reduces tumor angiogenesis by protecting cells from
oxidative stress. Cell 118:781-794.
Gordon-Weeks PR (2004) Microtubules and growth cone function. J Neurobiol 58:70-83.
Groemping Y and Rittinger K (2005) Activation and assembly of the NADPH oxidase: a structural
perspective. Biochem J 386:401-416.
Gronthos S and Simmons PJ (1995) The growth factor requirements of STRO-1-positive human
bone marrow stromal precursors under serum-deprived conditions in vitro. Blood 85:929-
940.
Gronthos S, Zannettino AC, Graves SE, Ohta S, Hay SJ and Simmons PJ (1999) Differential cell
surface expression of the STRO-1 and alkaline phosphatase antigens on discrete
developmental stages in primary cultures of human bone cells. J Bone Miner Res 14:47-56.
Guichard C, Pedruzzi E, Fay M, Ben Mkaddem S, Coant N, Daniel F and Ogier-Denis E (2006)
[The Nox/Duox family of ROS-generating NADPH oxidases]. Med Sci (Paris) 22:953-959.
Haataja L, Groffen J and Heisterkamp N (1997) Characterization of RAC3, a novel member of the
Rho family. J Biol Chem 272:20384-20388.
Hagen T, Taylor CT, Lam F and Moncada S (2003) Redistribution of intracellular oxygen in
hypoxia by nitric oxide: effect on HIF1alpha. Science 302:1975-1978.
Hancock JF, Cadwallader K, Paterson H and Marshall CJ (1991) A CAAX or a CAAL motif and a
second signal are sufficient for plasma membrane targeting of ras proteins. Embo J 10:4033-
4039.
Harris DA and Das AM (1991) Control of mitochondrial ATP synthesis in the heart. Biochem J 280
( Pt 3):561-573.
Harrois A, Huet O and Duranteau J (2009) Alterations of mitochondrial function in sepsis and
critical illness. Curr Opin Anaesthesiol 22:143-149.
Haruta M, Bush RA, Kjellstrom S, Vijayasarathy C, Zeng Y, Le YZ and Sieving PA (2009)
Depleting Rac1 in mouse rod photoreceptors protects them from photo-oxidative stress
without affecting their structure or function. Proc Natl Acad Sci U S A 106:9397-9402.
Haurani MJ, Cifuentes ME, Shepard AD and Pagano PJ (2008) Nox4 oxidase overexpression
specifically decreases endogenous Nox4 mRNA and inhibits angiotensin II-induced
adventitial myofibroblast migration. Hypertension 52:143-149.
Hayashida K, Fujita J, Miyake Y, Kawada H, Ando K, Ogawa S and Fukuda K (2005) Bone
marrow-derived cells contribute to pulmonary vascular remodeling in hypoxia-induced
pulmonary hypertension. Chest 127:1793-1798.

103
Haynesworth SE, Baber MA and Caplan AI (1992) Cell surface antigens on human marrow-derived
mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies. Bone 13:69-80.
He L, Liu X, Chen J, Dinger B, Stensaas L and Fidone S Modulation of chronic hypoxia-induced
chemoreceptor hypersensitivity by NADPH oxidase subunits in rat carotid body. J Appl
Physiol 108:1304-1310.
Henderson LM, Banting G and Chappell JB (1995) The arachidonate-activable, NADPH oxidase-
associated H+ channel. Evidence that gp91-phox functions as an essential part of the
channel. J Biol Chem 270:5909-5916.
Henderson LM, Chappell JB and Jones OT (1987) The superoxide-generating NADPH oxidase of
human neutrophils is electrogenic and associated with an H+ channel. Biochem J 246:325-
329.
Henderson LM, Chappell JB and Jones OT (1988) Internal pH changes associated with the activity
of NADPH oxidase of human neutrophils. Further evidence for the presence of an H+
conducting channel. Biochem J 251:563-567.
Henderson LM and Meech RW (1999) Evidence that the product of the human X-linked CGD gene,
gp91-phox, is a voltage-gated H(+) pathway. J Gen Physiol 114:771-786.
Henderson LM and Meech RW (2002) Proton conduction through gp91phox. J Gen Physiol
120:759-765.
Hermes-Lima M and Zenteno-Savin T (2002) Animal response to drastic changes in oxygen
availability and physiological oxidative stress. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol
133:537-556.
Hewitson KS, McNeill LA, Riordan MV, Tian YM, Bullock AN, Welford RW, Elkins JM, Oldham
NJ, Bhattacharya S, Gleadle JM, Ratcliffe PJ, Pugh CW and Schofield CJ (2002) Hypoxia-
inducible factor (HIF) asparagine hydroxylase is identical to factor inhibiting HIF (FIH) and
is related to the cupin structural family. J Biol Chem 277:26351-26355.
Heyworth PG, Bohl BP, Bokoch GM and Curnutte JT (1994) Rac translocates independently of the
neutrophil NADPH oxidase components p47phox and p67phox. Evidence for its interaction
with flavocytochrome b558. J Biol Chem 269:30749-30752.
Hii CS and Ferrante A (2007) Regulation of the NADPH oxidase activity and anti-microbial
function of neutrophils by arachidonic acid. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 55:99-110.
Hirota K and Semenza GL (2001) Rac1 activity is required for the activation of hypoxia-inducible
factor 1. J Biol Chem 276:21166-21172.
Ho IA, Chan KY, Ng WH, Guo CM, Hui KM, Cheang P and Lam PY (2009) Matrix
metalloproteinase 1 is necessary for the migration of human bone marrow-derived
mesenchymal stem cells toward human glioma. Stem Cells 27:1366-1375.
Honczarenko M, Le Y, Swierkowski M, Ghiran I, Glodek AM and Silberstein LE (2006) Human
bone marrow stromal cells express a distinct set of biologically functional chemokine
receptors. Stem Cells 24:1030-1041.
Hool LC, Di Maria CA, Viola HM and Arthur PG (2005) Role of NAD(P)H oxidase in the
regulation of cardiac L-type Ca2+ channel function during acute hypoxia. Cardiovasc Res
67:624-635.
Horwitz EM, Gordon PL, Koo WK, Marx JC, Neel MD, McNall RY, Muul L and Hofmann T
(2002) Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cells engraft and stimulate
growth in children with osteogenesis imperfecta: Implications for cell therapy of bone. Proc
Natl Acad Sci U S A 99:8932-8937.
Howell JC, Lee WH, Morrison P, Zhong J, Yoder MC and Srour EF (2003) Pluripotent stem cells
identified in multiple murine tissues. Ann N Y Acad Sci 996:158-173.
Hu Y, Liao L, Wang Q, Ma L, Ma G, Jiang X and Zhao RC (2003) Isolation and identification of
mesenchymal stem cells from human fetal pancreas. J Lab Clin Med 141:342-349.

104
Huang LE, Gu J, Schau M and Bunn HF (1998) Regulation of hypoxia-inducible factor 1alpha is
mediated by an O2-dependent degradation domain via the ubiquitin-proteasome pathway.
Proc Natl Acad Sci U S A 95:7987-7992.
Ishikawa Y and Ito T (1988) Kinetics of hemopoietic stem cells in a hypoxic culture. Eur J
Haematol 40:126-129.
Jaakkola P, Mole DR, Tian YM, Wilson MI, Gielbert J, Gaskell SJ, Kriegsheim A, Hebestreit HF,
Mukherji M, Schofield CJ, Maxwell PH, Pugh CW and Ratcliffe PJ (2001) Targeting of
HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl
hydroxylation. Science 292:468-472.
Jaffe AB and Hall A (2005) Rho GTPases: biochemistry and biology. Annu Rev Cell Dev Biol
21:247-269.
Jiang BH, Rue E, Wang GL, Roe R and Semenza GL (1996) Dimerization, DNA binding, and
transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem 271:17771-17778.
Jiang BH, Zheng JZ, Leung SW, Roe R and Semenza GL (1997) Transactivation and inhibitory
domains of hypoxia-inducible factor 1alpha. Modulation of transcriptional activity by
oxygen tension. J Biol Chem 272:19253-19260.
Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, Schwartz RE, Keene CD, Ortiz-Gonzalez XR, Reyes M,
Lenvik T, Lund T, Blackstad M, Du J, Aldrich S, Lisberg A, Low WC, Largaespada DA and
Verfaillie CM (2002) Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.
Nature 418:41-49.
Jones EA, English A, Henshaw K, Kinsey SE, Markham AF, Emery P and McGonagle D (2004)
Enumeration and phenotypic characterization of synovial fluid multipotential mesenchymal
progenitor cells in inflammatory and degenerative arthritis. Arthritis Rheum 50:817-827.
Kaneko K, Satoh K, Masamune A, Satoh A and Shimosegawa T (2002) Myosin light chain kinase
inhibitors can block invasion and adhesion of human pancreatic cancer cell lines. Pancreas
24:34-41.
Kao YY, Gianni D, Bohl B, Taylor RM and Bokoch GM (2008) Identification of a conserved Rac-
binding site on NADPH oxidases supports a direct GTPase regulatory mechanism. J Biol
Chem 283:12736-12746.
Kawada H, Fujita J, Kinjo K, Matsuzaki Y, Tsuma M, Miyatake H, Muguruma Y, Tsuboi K,
Itabashi Y, Ikeda Y, Ogawa S, Okano H, Hotta T, Ando K and Fukuda K (2004)
Nonhematopoietic mesenchymal stem cells can be mobilized and differentiate into
cardiomyocytes after myocardial infarction. Blood 104:3581-3587.
Ke Q and Costa M (2006) Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol 70:1469-1480.
Kim JS, Huang TY and Bokoch GM (2009) Reactive oxygen species regulate a slingshot-cofilin
activation pathway. Mol Biol Cell 20:2650-2660.
Klein AK, Dyck JA, Stitzel KA, Shimizu J, Fox LA and Taylor N (1983) Characterization of canine
fetal lymphohematopoiesis: studies of CFUGM, CFUL, and CFUF. Exp Hematol 11:263-
274.
Knaus UG, Heyworth PG, Evans T, Curnutte JT and Bokoch GM (1991) Regulation of phagocyte
oxygen radical production by the GTP-binding protein Rac 2. Science 254:1512-1515.
Koc ON, Day J, Nieder M, Gerson SL, Lazarus HM and Krivit W (2002) Allogeneic mesenchymal
stem cell infusion for treatment of metachromatic leukodystrophy (MLD) and Hurler
syndrome (MPS-IH). Bone Marrow Transplant 30:215-222.
Koc ON, Gerson SL, Cooper BW, Dyhouse SM, Haynesworth SE, Caplan AI and Lazarus HM
(2000) Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of autologous-blood stem cells and
culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients
receiving high-dose chemotherapy. J Clin Oncol 18:307-316.
Kodama A, Lechler T and Fuchs E (2004) Coordinating cytoskeletal tracks to polarize cellular
movements. J Cell Biol 167:203-207.

105
Koga H, Terasawa H, Nunoi H, Takeshige K, Inagaki F and Sumimoto H (1999) Tetratricopeptide
repeat (TPR) motifs of p67(phox) participate in interaction with the small GTPase Rac and
activation of the phagocyte NADPH oxidase. J Biol Chem 274:25051-25060.
Koh AL, Sun CX, Zhu F and Glogauer M (2005) The role of Rac1 and Rac2 in bacterial killing.
Cell Immunol 235:92-97.
Kohout SC, Bell SC, Liu L, Xu Q, Minor DL, Jr. and Isacoff EY Electrochemical coupling in the
voltage-dependent phosphatase Ci-VSP. Nat Chem Biol 6:369-375.
Konstantinopoulos PA, Karamouzis MV and Papavassiliou AG (2007) Post-translational
modifications and regulation of the RAS superfamily of GTPases as anticancer targets. Nat
Rev Drug Discov 6:541-555.
Koong AC, Chen EY and Giaccia AJ (1994a) Hypoxia causes the activation of nuclear factor kappa
B through the phosphorylation of I kappa B alpha on tyrosine residues. Cancer Res 54:1425-
1430.
Koong AC, Chen EY, Mivechi NF, Denko NC, Stambrook P and Giaccia AJ (1994b) Hypoxic
activation of nuclear factor-kappa B is mediated by a Ras and Raf signaling pathway and
does not involve MAP kinase (ERK1 or ERK2). Cancer Res 54:5273-5279.
Kopp HG, Avecilla ST, Hooper AT and Rafii S (2005) The bone marrow vascular niche: home of
HSC differentiation and mobilization. Physiology (Bethesda) 20:349-356.
Kozma R, Ahmed S, Best A and Lim L (1995) The Ras-related protein Cdc42Hs and bradykinin
promote formation of peripheral actin microspikes and filopodia in Swiss 3T3 fibroblasts.
Mol Cell Biol 15:1942-1952.
Ksenzenko M, Vygodina TV, Berka V, Ruuge EK and Konstantinov AA (1992) Cytochrome
oxidase-catalyzed superoxide generation from hydrogen peroxide. FEBS Lett 297:63-66.
Kucia M, Ratajczak J, Reca R, Janowska-Wieczorek A and Ratajczak MZ (2004) Tissue-specific
muscle, neural and liver stem/progenitor cells reside in the bone marrow, respond to an
SDF-1 gradient and are mobilized into peripheral blood during stress and tissue injury.
Blood Cells Mol Dis 32:52-57.
Kuwano Y, Kawahara T, Yamamoto H, Teshima-Kondo S, Tominaga K, Masuda K, Kishi K,
Morita K and Rokutan K (2006) Interferon-gamma activates transcription of NADPH
oxidase 1 gene and upregulates production of superoxide anion by human large intestinal
epithelial cells. Am J Physiol Cell Physiol 290:C433-443.
Kuznetsov SA, Friedenstein AJ and Robey PG (1997) Factors required for bone marrow stromal
fibroblast colony formation in vitro. Br J Haematol 97:561-570.
Kuznetsov SA, Mankani MH, Gronthos S, Satomura K, Bianco P and Robey PG (2001) Circulating
skeletal stem cells. J Cell Biol 153:1133-1140.
Kwong CH, Malech HL, Rotrosen D and Leto TL (1993) Regulation of the human neutrophil
NADPH oxidase by rho-related G-proteins. Biochemistry 32:5711-5717.
Lambeth JD (2002) Nox/Duox family of nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate) oxidases.
Curr Opin Hematol 9:11-17.
Lando D, Peet DJ, Whelan DA, Gorman JJ and Whitelaw ML (2002) Asparagine hydroxylation of
the HIF transactivation domain a hypoxic switch. Science 295:858-861.
Latsinik NV, Gorskaia Iu F, Grosheva AG, Domogatskii SP and Kuznetsov SA (1986) [The stromal
colony-forming cell (CFUf) count in the bone marrow of mice and the clonal nature of the
fibroblast colonies they form]. Ontogenez 17:27-36.
Lauffenburger DA and Horwitz AF (1996) Cell migration: a physically integrated molecular
process. Cell 84:359-369.
Lemonnier M, Landraud L and Lemichez E (2007) Rho GTPase-activating bacterial toxins: from
bacterial virulence regulation to eukaryotic cell biology. FEMS Microbiol Rev 31:515-534.

106
Lennon DP, Edmison JM and Caplan AI (2001) Cultivation of rat marrow-derived mesenchymal
stem cells in reduced oxygen tension: effects on in vitro and in vivo osteochondrogenesis. J
Cell Physiol 187:345-355.
Li Q, Spencer NY, Oakley FD, Buettner GR and Engelhardt JF (2009) Endosomal Nox2 facilitates
redox-dependent induction of NF-kappaB by TNF-alpha. Antioxid Redox Signal 11:1249-
1263.
Liechty KW, MacKenzie TC, Shaaban AF, Radu A, Moseley AM, Deans R, Marshak DR and Flake
AW (2000) Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific
differentiation after in utero transplantation in sheep. Nat Med 6:1282-1286.
Lo LW, Cheng JJ, Chiu JJ, Wung BS, Liu YC and Wang DL (2001) Endothelial exposure to
hypoxia induces Egr-1 expression involving PKCalpha-mediated Ras/Raf-1/ERK1/2
pathway. J Cell Physiol 188:304-312.
Loor G and Schumacker PT (2008) Role of hypoxia-inducible factor in cell survival during
myocardial ischemia-reperfusion. Cell Death Differ 15:686-690.
Lyle AN, Deshpande NN, Taniyama Y, Seidel-Rogol B, Pounkova L, Du P, Papaharalambus C,
Lassegue B and Griendling KK (2009) Poldip2, a novel regulator of Nox4 and cytoskeletal
integrity in vascular smooth muscle cells. Circ Res 105:249-259.
Mackay DJ and Hall A (1998) Rho GTPases. J Biol Chem 273:20685-20688.
Mahadev K, Motoshima H, Wu X, Ruddy JM, Arnold RS, Cheng G, Lambeth JD and Goldstein BJ
(2004) The NAD(P)H oxidase homolog Nox4 modulates insulin-stimulated generation of
H2O2 and plays an integral role in insulin signal transduction. Mol Cell Biol 24:1844-1854.
Makino A, Shin HY, Komai Y, Fukuda S, Coughlin M, Sugihara-Seki M and Schmid-Schonbein
GW (2007) Mechanotransduction in leukocyte activation: a review. Biorheology 44:221-
249.
Malliri A and Collard JG (2003) Role of Rho-family proteins in cell adhesion and cancer. Curr
Opin Cell Biol 15:583-589.
Malo M, Charriere-Bertrand C, Chettaoui C, Fabre-Guillevin E, Maquerlot F, Lackmy A, Vallee B,
Delaplace F and Barlovatz-Meimon G (2006) [The PAI-1 swing: microenvironment and
cancer cell migration]. C R Biol 329:919-927.
Manser E, Chong C, Zhao ZS, Leung T, Michael G, Hall C and Lim L (1995) Molecular cloning of
a new member of the p21-Cdc42/Rac-activated kinase (PAK) family. J Biol Chem
270:25070-25078.
Martin-Rendon E, Hale SJ, Ryan D, Baban D, Forde SP, Roubelakis M, Sweeney D, Moukayed M,
Harris AL, Davies K and Watt SM (2007) Transcriptional profiling of human cord blood
CD133+ and cultured bone marrow mesenchymal stem cells in response to hypoxia. Stem
Cells 25:1003-1012.
Martin DR, Cox NR, Hathcock TL, Niemeyer GP and Baker HJ (2002) Isolation and
characterization of multipotential mesenchymal stem cells from feline bone marrow. Exp
Hematol 30:879-886.
Martyn KD, Frederick LM, von Loehneysen K, Dinauer MC and Knaus UG (2006) Functional
analysis of Nox4 reveals unique characteristics compared to other NADPH oxidases. Cell
Signal 18:69-82.
Maturana A, Krause KH and Demaurex N (2002) NOX family NADPH oxidases: do they have
built-in proton channels? J Gen Physiol 120:781-786.
Maxwell PH, Pugh CW and Ratcliffe PJ (2001) The pVHL-hIF-1 system. A key mediator of
oxygen homeostasis. Adv Exp Med Biol 502:365-376.
Maxwell PH, Wiesener MS, Chang GW, Clifford SC, Vaux EC, Cockman ME, Wykoff CC, Pugh
CW, Maher ER and Ratcliffe PJ (1999) The tumour suppressor protein VHL targets
hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature 399:271-275.

107
Mazure NM, Chen EY, Laderoute KR and Giaccia AJ (1997) Induction of vascular endothelial
growth factor by hypoxia is modulated by a phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling
pathway in Ha-ras-transformed cells through a hypoxia inducible factor-1 transcriptional
element. Blood 90:3322-3331.
Mendes SC, Robin C and Dzierzak E (2005) Mesenchymal progenitor cells localize within
hematopoietic sites throughout ontogeny. Development 132:1127-1136.
Meng D, Lv DD and Fang J (2008) Insulin-like growth factor-I induces reactive oxygen species
production and cell migration through Nox4 and Rac1 in vascular smooth muscle cells.
Cardiovasc Res 80:299-308.
Miao Z, Jin J, Chen L, Zhu J, Huang W, Zhao J, Qian H and Zhang X (2006) Isolation of
mesenchymal stem cells from human placenta: comparison with human bone marrow
mesenchymal stem cells. Cell Biol Int 30:681-687.
Miki H, Suetsugu S and Takenawa T (1998) WAVE, a novel WASP-family protein involved in
actin reorganization induced by Rac. Embo J 17:6932-6941.
Mirza A, Hyvelin JM, Rochefort GY, Lermusiaux P, Antier D, Awede B, Bonnet P, Domenech J
and Eder V (2008) Undifferentiated mesenchymal stem cells seeded on a vascular prosthesis
contribute to the restoration of a physiologic vascular wall. J Vasc Surg 47:1313-1321.
Mishima T, Naotsuka M, Horita Y, Sato M, Ohashi K and Mizuno K LIM-kinase is critical for the
mesenchymal-to-amoeboid cell morphological transition in 3D matrices. Biochem Biophys
Res Commun 392:577-581.
Mitchell P (1961) Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-
osmotic type of mechanism. Nature 191:144-148.
Mitchell T, Lo A, Logan MR, Lacy P and Eitzen G (2008) Primary granule exocytosis in human
neutrophils is regulated by Rac-dependent actin remodeling. Am J Physiol Cell Physiol
295:C1354-1365.
Mitin N, Rossman KL and Der CJ (2005) Signaling interplay in Ras superfamily function. Curr
Biol 15:R563-574.
Miyano K and Sumimoto H (2007) Role of the small GTPase Rac in p22phox-dependent NADPH
oxidases. Biochimie 89:1133-1144.
Mizrahi A, Berdichevsky Y, Ugolev Y, Molshanski-Mor S, Nakash Y, Dahan I, Alloul N,
Gorzalczany Y, Sarfstein R, Hirshberg M and Pick E (2006) Assembly of the phagocyte
NADPH oxidase complex: chimeric constructs derived from the cytosolic components as
tools for exploring structure-function relationships. J Leukoc Biol 79:881-895.
Moscoso I, Centeno A, Lopez E, Rodriguez-Barbosa JI, Santamarina I, Filgueira P, Sanchez MJ,
Dominguez-Perles R, Penuelas-Rivas G and Domenech N (2005) Differentiation "in vitro"
of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell
transplantation. Transplant Proc 37:481-482.
Moussavi-Harami F, Duwayri Y, Martin JA, Moussavi-Harami F and Buckwalter JA (2004)
Oxygen effects on senescence in chondrocytes and mesenchymal stem cells: consequences
for tissue engineering. Iowa Orthop J 24:15-20.
Muraglia A, Cancedda R and Quarto R (2000) Clonal mesenchymal progenitors from human bone
marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci 113 ( Pt 7):1161-
1166.
Murata Y, Iwasaki H, Sasaki M, Inaba K and Okamura Y (2005) Phosphoinositide phosphatase
activity coupled to an intrinsic voltage sensor. Nature 435:1239-1243.
Murata Y and Okamura Y (2007) Depolarization activates the phosphoinositide phosphatase Ci-
VSP, as detected in Xenopus oocytes coexpressing sensors of PIP2. J Physiol 583:875-889.
Murillo I and Henderson LM (2005) Expression of gp91phox/Nox2 in COS-7 cells: cellular
localization of the protein and the detection of outward proton currents. Biochem J 385:649-
657.

108
Murphy R and DeCoursey TE (2006) Charge compensation during the phagocyte respiratory burst.
Biochim Biophys Acta 1757:996-1011.
Musset B, Cherny VV, Morgan D and DeCoursey TE (2009) The intimate and mysterious
relationship between proton channels and NADPH oxidase. FEBS Lett 583:7-12.
Nagaishi K, Adachi R, Kawanishi T, Yamaguchi T, Kasahara T, Hayakawa T and Suzuki K (1999)
Participation of cofilin in opsonized zymosan-triggered activation of neutrophil-like HL-60
cells through rapid dephosphorylation and translocation to plasma membranes. J Biochem
125:891-898.
Nagy S, Ricca BL, Norstrom MF, Courson DS, Brawley CM, Smithback PA and Rock RS (2008) A
myosin motor that selects bundled actin for motility. Proc Natl Acad Sci U S A 105:9616-
9620.
Neuss S, Becher E, Woltje M, Tietze L and Jahnen-Dechent W (2004) Functional expression of
HGF and HGF receptor/c-met in adult human mesenchymal stem cells suggests a role in cell
mobilization, tissue repair, and wound healing. Stem Cells 22:405-414.
Nishi H, Nishi KH and Johnson AC (2002) Early Growth Response-1 gene mediates up-regulation
of epidermal growth factor receptor expression during hypoxia. Cancer Res 62:827-834.
Nisimoto Y, Freeman JL, Motalebi SA, Hirshberg M and Lambeth JD (1997) Rac binding to
p67(phox). Structural basis for interactions of the Rac1 effector region and insert region
with components of the respiratory burst oxidase. J Biol Chem 272:18834-18841.
Nobes CD and Hall A (1999) Rho GTPases control polarity, protrusion, and adhesion during cell
movement. J Cell Biol 144:1235-1244.
Oakley FD, Abbott D, Li Q and Engelhardt JF (2009) Signaling components of redox active
endosomes: the redoxosomes. Antioxid Redox Signal 11:1313-1333.
Ohnishi S, Yasuda T, Kitamura S and Nagaya N (2007) Effect of hypoxia on gene expression of
bone marrow-derived mesenchymal stem cells and mononuclear cells. Stem Cells 25:1166-
1177.
Okamoto T, Aoyama T, Nakayama T, Nakamata T, Hosaka T, Nishijo K, Nakamura T, Kiyono T
and Toguchida J (2002) Clonal heterogeneity in differentiation potential of immortalized
human mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun 295:354-361.
Owen M (1988) Marrow stromal stem cells. J Cell Sci Suppl 10:63-76.
Owen M and Friedenstein AJ (1988) Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors.
Ciba Found Symp 136:42-60.
Paclet MH, Coleman AW, Burritt J and Morel F (2001) NADPH oxidase of Epstein-Barr-virus
immortalized B lymphocytes. Effect of cytochrome b(558) glycosylation. Eur J Biochem
268:5197-5208.
Paduch M, Jelen F and Otlewski J (2001) Structure of small G proteins and their regulators. Acta
Biochim Pol 48:829-850.
Pankova K, Rosel D, Novotny M and Brabek J The molecular mechanisms of transition between
mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cell Mol Life Sci 67:63-71.
Papandreou I, Powell A, Lim AL and Denko N (2005) Cellular reaction to hypoxia: sensing and
responding to an adverse environment. Mutat Res 569:87-100.
Paterson HF, Self AJ, Garrett MD, Just I, Aktories K and Hall A (1990) Microinjection of
recombinant p21rho induces rapid changes in cell morphology. J Cell Biol 111:1001-1007.
Patten DA, Lafleur VN, Robitaille GA, Chan DA, Giaccia AJ and Richard DE Hypoxia-inducible
factor-1 activation in nonhypoxic conditions: the essential role of mitochondrial-derived
reactive oxygen species. Mol Biol Cell 21:3247-3257.
Pendyala S, Gorshkova IA, Usatyuk PV, He D, Pennathur A, Lambeth JD, Thannickal VJ and
Natarajan V (2009) Role of Nox4 and Nox2 in hyperoxia-induced reactive oxygen species
generation and migration of human lung endothelial cells. Antioxid Redox Signal 11:747-
764.

109
Pereira RF, Halford KW, O'Hara MD, Leeper DB, Sokolov BP, Pollard MD, Bagasra O and
Prockop DJ (1995) Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor
cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice. Proc Natl Acad Sci U S A 92:4857-
4861.
Pereira RF, O'Hara MD, Laptev AV, Halford KW, Pollard MD, Class R, Simon D, Livezey K and
Prockop DJ (1998) Marrow stromal cells as a source of progenitor cells for
nonhematopoietic tissues in transgenic mice with a phenotype of osteogenesis imperfecta.
Proc Natl Acad Sci U S A 95:1142-1147.
Phinney DG, Kopen G, Isaacson RL and Prockop DJ (1999) Plastic adherent stromal cells from the
bone marrow of commonly used strains of inbred mice: variations in yield, growth, and
differentiation. J Cell Biochem 72:570-585.
Pinner S and Sahai E (2008) PDK1 regulates cancer cell motility by antagonising inhibition of
ROCK1 by RhoE. Nat Cell Biol 10:127-137.
Piper HM (1988) Metabolic processes leading to myocardial cell death. Methods Achiev Exp Pathol
13:144-180.
Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti
DW, Craig S and Marshak DR (1999) Multilineage potential of adult human mesenchymal
stem cells. Science 284:143-147.
Ponte AL, Marais E, Gallay N, Langonne A, Delorme B, Herault O, Charbord P and Domenech J
(2007) The in vitro migration capacity of human bone marrow mesenchymal stem cells:
comparison of chemokine and growth factor chemotactic activities. Stem Cells 25:1737-
1745.
Porter CD, Parkar MH, Verhoeven AJ, Levinsky RJ, Collins MK and Kinnon C (1994) p22-phox-
deficient chronic granulomatous disease: reconstitution by retrovirus-mediated expression
and identification of a biosynthetic intermediate of gp91-phox. Blood 84:2767-2775.
Pountos I and Giannoudis PV (2005) Biology of mesenchymal stem cells. Injury 36 Suppl 3:S8-
S12.
Preston SL, Alison MR, Forbes SJ, Direkze NC, Poulsom R and Wright NA (2003) The new stem
cell biology: something for everyone. Mol Pathol 56:86-96.
Prockop DJ (1997) Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science
276:71-74.
Pugh CW, O'Rourke JF, Nagao M, Gleadle JM and Ratcliffe PJ (1997) Activation of hypoxia-
inducible factor-1; definition of regulatory domains within the alpha subunit. J Biol Chem
272:11205-11214.
Quarto R, Mastrogiacomo M, Cancedda R, Kutepov SM, Mukhachev V, Lavroukov A, Kon E and
Marcacci M (2001) Repair of large bone defects with the use of autologous bone marrow
stromal cells. N Engl J Med 344:385-386.
Quinn MT, Evans T, Loetterle LR, Jesaitis AJ and Bokoch GM (1993) Translocation of Rac
correlates with NADPH oxidase activation. Evidence for equimolar translocation of oxidase
components. J Biol Chem 268:20983-20987.
Raad H, Paclet MH, Boussetta T, Kroviarski Y, Morel F, Quinn MT, Gougerot-Pocidalo MA, Dang
PM and El-Benna J (2009) Regulation of the phagocyte NADPH oxidase activity:
phosphorylation of gp91phox/NOX2 by protein kinase C enhances its diaphorase activity
and binding to Rac2, p67phox, and p47phox. Faseb J 23:1011-1022.
Raftopoulou M and Hall A (2004) Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol 265:23-32.
Ramsey IS, Moran MM, Chong JA and Clapham DE (2006) A voltage-gated proton-selective
channel lacking the pore domain. Nature 440:1213-1216.
Rattigan Y, Hsu JM, Mishra PJ, Glod J and Banerjee D Interleukin 6 mediated recruitment of
mesenchymal stem cells to the hypoxic tumor milieu. Exp Cell Res 316:3417-3424.

110
Raz L, Zhang QG, Zhou CF, Han D, Gulati P, Yang LC, Yang F, Wang RM and Brann DW Role of
Rac1 GTPase in NADPH oxidase activation and cognitive impairment following cerebral
ischemia in the rat. PLoS One 5:e12606.
Reddy MM, Fernandes MS, Salgia R, Levine RL, Griffin JD and Sattler M NADPH oxidases
regulate cell growth and migration in myeloid cells transformed by oncogenic tyrosine
kinases. Leukemia.
Rey FE, Cifuentes ME, Kiarash A, Quinn MT and Pagano PJ (2001) Novel competitive inhibitor of
NAD(P)H oxidase assembly attenuates vascular O(2)(-) and systolic blood pressure in mice.
Circ Res 89:408-414.
Reyes M, Lund T, Lenvik T, Aguiar D, Koodie L and Verfaillie CM (2001) Purification and ex
vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. Blood 98:2615-
2625.
Ridley AJ (2006) Rho GTPases and actin dynamics in membrane protrusions and vesicle
trafficking. Trends Cell Biol 16:522-529.
Ridley AJ and Hall A (1992) Distinct patterns of actin organization regulated by the small GTP-
binding proteins Rac and Rho. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 57:661-671.
Ridley AJ, Paterson HF, Johnston CL, Diekmann D and Hall A (1992) The small GTP-binding
protein rac regulates growth factor-induced membrane ruffling. Cell 70:401-410.
Ridley AJ, Schwartz MA, Burridge K, Firtel RA, Ginsberg MH, Borisy G, Parsons JT and Horwitz
AR (2003) Cell migration: integrating signals from front to back. Science 302:1704-1709.
Rinckel LA, Faris SL, Hitt ND and Kleinberg ME (1999) Rac1 disrupts p67phox/p40phox binding:
a novel role for Rac in NADPH oxidase activation. Biochem Biophys Res Commun 263:118-
122.
Ringe J, Haupl T and Sittinger M (2003) [Mesenchymal stem cells for tissue engineering of bone
and cartilage]. Med Klin (Munich) 98 Suppl 2:35-40.
Rioux-Bilan A, Daubon T, Morel F, Kitzis A and Bourmeyster N (2008) Inhibition of PI3K
synergistically enhances the apoptotic effect of STI-571 on p210(bcr-abl)-transformed cells
in a Rac1-dependent manner. Leuk Res 32:517-519.
Robins JC, Akeno N, Mukherjee A, Dalal RR, Aronow BJ, Koopman P and Clemens TL (2005)
Hypoxia induces chondrocyte-specific gene expression in mesenchymal cells in association
with transcriptional activation of Sox9. Bone 37:313-322.
Rochefort GY, Delorme B, Lopez A, Herault O, Bonnet P, Charbord P, Eder V and Domenech J
(2006) Multipotential mesenchymal stem cells are mobilized into peripheral blood by
hypoxia. Stem Cells 24:2202-2208.
Rokutan K, Kawahara T, Kuwano Y, Tominaga K, Nishida K and Teshima-Kondo S (2008) Nox
enzymes and oxidative stress in the immunopathology of the gastrointestinal tract. Semin
Immunopathol 30:315-327.
Romanov YA, Svintsitskaya VA and Smirnov VN (2003) Searching for alternative sources of
postnatal human mesenchymal stem cells: candidate MSC-like cells from umbilical cord.
Stem Cells 21:105-110.
Rosova I, Dao M, Capoccia B, Link D and Nolta JA (2008) Hypoxic preconditioning results in
increased motility and improved therapeutic potential of human mesenchymal stem cells.
Stem Cells 26:2173-2182.
Rossi F and Zatti M (1964) Biochemical aspects of phagocytosis in polymorphonuclear leucocytes.
NADH and NADPH oxidation by the granules of resting and phagocytizing cells.
Experientia 20:21-23.
Rossman KL, Der CJ and Sondek J (2005) GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine
nucleotide-exchange factors. Nat Rev Mol Cell Biol 6:167-180.

111
Sadok A, Bourgarel-Rey V, Gattacceca F, Penel C, Lehmann M and Kovacic H (2008) Nox1-
dependent superoxide production controls colon adenocarcinoma cell migration. Biochim
Biophys Acta 1783:23-33.
Safran M and Kaelin WG, Jr. (2003) HIF hydroxylation and the mammalian oxygen-sensing
pathway. J Clin Invest 111:779-783.
Sahai E, Garcia-Medina R, Pouyssegur J and Vial E (2007) Smurf1 regulates tumor cell plasticity
and motility through degradation of RhoA leading to localized inhibition of contractility. J
Cell Biol 176:35-42.
Salingcarnboriboon R, Yoshitake H, Tsuji K, Obinata M, Amagasa T, Nifuji A and Noda M (2003)
Establishment of tendon-derived cell lines exhibiting pluripotent mesenchymal stem cell-
like property. Exp Cell Res 287:289-300.
Santa Maria L, Rojas CV and Minguell JJ (2004) Signals from damaged but not undamaged skeletal
muscle induce myogenic differentiation of rat bone-marrow-derived mesenchymal stem
cells. Exp Cell Res 300:418-426.
Sasaki M, Takagi M and Okamura Y (2006) A voltage sensor-domain protein is a voltage-gated
proton channel. Science 312:589-592.
Satomura K, Krebsbach P, Bianco P and Gehron Robey P (2000) Osteogenic imprinting upstream
of marrow stromal cell differentiation. J Cell Biochem 78:391-403.
Schilder YD, Heiss EH, Schachner D, Ziegler J, Reznicek G, Sorescu D and Dirsch VM (2009)
NADPH oxidases 1 and 4 mediate cellular senescence induced by resveratrol in human
endothelial cells. Free Radic Biol Med 46:1598-1606.
Schraufstatter IU, DiScipio RG and Khaldoyanidi SK (2009) Alpha 7 subunit of nAChR regulates
migration of human mesenchymal stem cells. J Stem Cells 4:203-215.
Schroder K, Kohnen A, Aicher A, Liehn EA, Buchse T, Stein S, Weber C, Dimmeler S and Brandes
RP (2009) NADPH oxidase Nox2 is required for hypoxia-induced mobilization of
endothelial progenitor cells. Circ Res 105:537-544.
Schumacker PT (2005) Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Crit Care Med 33:S423-425.
Scortegagna M, Ding K, Oktay Y, Gaur A, Thurmond F, Yan LJ, Marck BT, Matsumoto AM,
Shelton JM, Richardson JA, Bennett MJ and Garcia JA (2003) Multiple organ pathology,
metabolic abnormalities and impaired homeostasis of reactive oxygen species in Epas1-/-
mice. Nat Genet 35:331-340.
Scott RW and Olson MF (2007) LIM kinases: function, regulation and association with human
disease. J Mol Med 85:555-568.
Semenza GL (1994) Regulation of erythropoietin production. New insights into molecular
mechanisms of oxygen homeostasis. Hematol Oncol Clin North Am 8:863-884.
Semenza GL (1998) Hypoxia-inducible factor 1 and the molecular physiology of oxygen
homeostasis. J Lab Clin Med 131:207-214.
Semenza GL (2000) Surviving ischemia: adaptive responses mediated by hypoxia-inducible factor
1. J Clin Invest 106:809-812.
Semenza GL (2003) Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer 3:721-732.
Semenza GL (2008) Hypoxia-inducible factor 1 and cancer pathogenesis. IUBMB Life 60:591-597.
Semenza GL, Shimoda LA and Prabhakar NR (2006) Regulation of gene expression by HIF-1.
Novartis Found Symp 272:2-8; discussion 8-14, 33-16.
Semenza GL and Wang GL (1992) A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein
synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for
transcriptional activation. Mol Cell Biol 12:5447-5454.
Serrander L, Cartier L, Bedard K, Banfi B, Lardy B, Plastre O, Sienkiewicz A, Forro L, Schlegel W
and Krause KH (2007) NOX4 activity is determined by mRNA levels and reveals a unique
pattern of ROS generation. Biochem J 406:105-114.

112
Shen HM, Lin Y, Choksi S, Tran J, Jin T, Chang L, Karin M, Zhang J and Liu ZG (2004) Essential
roles of receptor-interacting protein and TRAF2 in oxidative stress-induced cell death. Mol
Cell Biol 24:5914-5922.
Shih YL and Rothfield L (2006) The bacterial cytoskeleton. Microbiol Mol Biol Rev 70:729-754.
Shin SH, Song HY, Kim MY, Do EK, Kim KH and Kim JH Platelet-activating factor receptor
mediates oxidized low density lipoprotein-induced migration of bone marrow-derived
mesenchymal stem cells. Cell Physiol Biochem 26:689-698.
Shmelzer Z, Haddad N, Admon E, Pessach I, Leto TL, Eitan-Hazan Z, Hershfinkel M and Levy R
(2003) Unique targeting of cytosolic phospholipase A2 to plasma membranes mediated by
the NADPH oxidase in phagocytes. J Cell Biol 162:683-692.
Shmelzer Z, Karter M, Eisenstein M, Leto TL, Hadad N, Ben-Menahem D, Gitler D, Banani S,
Wolach B, Rotem M and Levy R (2008) Cytosolic phospholipase A2alpha is targeted to the
p47phox-PX domain of the assembled NADPH oxidase via a novel binding site in its C2
domain. J Biol Chem 283:31898-31908.
Sidani M, Wessels D, Mouneimne G, Ghosh M, Goswami S, Sarmiento C, Wang W, Kuhl S, El-
Sibai M, Backer JM, Eddy R, Soll D and Condeelis J (2007) Cofilin determines the
migration behavior and turning frequency of metastatic cancer cells. J Cell Biol 179:777-
791.
Silva GV, Litovsky S, Assad JA, Sousa AL, Martin BJ, Vela D, Coulter SC, Lin J, Ober J, Vaughn
WK, Branco RV, Oliveira EM, He R, Geng YJ, Willerson JT and Perin EC (2005)
Mesenchymal stem cells differentiate into an endothelial phenotype, enhance vascular
density, and improve heart function in a canine chronic ischemia model. Circulation
111:150-156.
Simmons PJ, Masinovsky B, Longenecker BM, Berenson R, Torok-Storb B and Gallatin WM
(1992) Vascular cell adhesion molecule-1 expressed by bone marrow stromal cells mediates
the binding of hematopoietic progenitor cells. Blood 80:388-395.
Simmons PJ and Torok-Storb B (1991) Identification of stromal cell precursors in human bone
marrow by a novel monoclonal antibody, STRO-1. Blood 78:55-62.
Snyder CM and Chandel NS (2009) Mitochondrial regulation of cell survival and death during low-
oxygen conditions. Antioxid Redox Signal 11:2673-2683.
Son BR, Marquez-Curtis LA, Kucia M, Wysoczynski M, Turner AR, Ratajczak J, Ratajczak MZ
and Janowska-Wieczorek A (2006) Migration of bone marrow and cord blood mesenchymal
stem cells in vitro is regulated by stromal-derived factor-1-CXCR4 and hepatocyte growth
factor-c-met axes and involves matrix metalloproteinases. Stem Cells 24:1254-1264.
Sordella R, Jiang W, Chen GC, Curto M and Settleman J (2003) Modulation of Rho GTPase
signaling regulates a switch between adipogenesis and myogenesis. Cell 113:147-158.
Sordi V, Malosio ML, Marchesi F, Mercalli A, Melzi R, Giordano T, Belmonte N, Ferrari G, Leone
BE, Bertuzzi F, Zerbini G, Allavena P, Bonifacio E and Piemonti L (2005) Bone marrow
mesenchymal stem cells express a restricted set of functionally active chemokine receptors
capable of promoting migration to pancreatic islets. Blood 106:419-427.
Stephens L, Milne L and Hawkins P (2008) Moving towards a better understanding of chemotaxis.
Curr Biol 18:R485-494.
Sun CX, Downey GP, Zhu F, Koh AL, Thang H and Glogauer M (2004) Rac1 is the small GTPase
responsible for regulating the neutrophil chemotaxis compass. Blood 104:3758-3765.
Sundaresan M, Yu ZX, Ferrans VJ, Irani K and Finkel T (1995) Requirement for generation of
H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science 270:296-299.
Symons M, Derry JM, Karlak B, Jiang S, Lemahieu V, McCormick F, Francke U and Abo A (1996)
Wiskott-Aldrich syndrome protein, a novel effector for the GTPase CDC42Hs, is implicated
in actin polymerization. Cell 84:723-734.

113
Takai K, Hara J, Matsumoto K, Hosoi G, Osugi Y, Tawa A, Okada S and Nakamura T (1997)
Hepatocyte growth factor is constitutively produced by human bone marrow stromal cells
and indirectly promotes hematopoiesis. Blood 89:1560-1565.
Taylor CT (2008) Mitochondria, oxygen sensing, and the regulation of HIF-2alpha. Focus on
"Induction of HIF-2alpha is dependent on mitochondrial O2 consumption in an O2-sensitive
adrenomedullary chromaffin cell line". Am J Physiol Cell Physiol 294:C1300-1302.
Tobar N, Caceres M, Santibanez JF, Smith PC and Martinez J (2008) RAC1 activity and
intracellular ROS modulate the migratory potential of MCF-7 cells through a NADPH
oxidase and NFkappaB-dependent mechanism. Cancer Lett 267:125-132.
Tobar N, Guerrero J, Smith PC and Martinez J NOX4-dependent ROS production by stromal
mammary cells modulates epithelial MCF-7 cell migration. Br J Cancer 103:1040-1047.
Toma C, Pittenger MF, Cahill KS, Byrne BJ and Kessler PD (2002) Human mesenchymal stem
cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation
105:93-98.
Touret N and Grinstein S (2002) Voltage-gated proton "channels": a spectator's viewpoint. J Gen
Physiol 120:767-771.
Touyz RM, Chen X, Tabet F, Yao G, He G, Quinn MT, Pagano PJ and Schiffrin EL (2002)
Expression of a functionally active gp91phox-containing neutrophil-type NAD(P)H oxidase
in smooth muscle cells from human resistance arteries: regulation by angiotensin II. Circ
Res 90:1205-1213.
Tropel P, Noel D, Platet N, Legrand P, Benabid AL and Berger F (2004) Isolation and
characterisation of mesenchymal stem cells from adult mouse bone marrow. Exp Cell Res
295:395-406.
Tuli R, Tuli S, Nandi S, Wang ML, Alexander PG, Haleem-Smith H, Hozack WJ, Manner PA,
Danielson KG and Tuan RS (2003) Characterization of multipotential mesenchymal
progenitor cells derived from human trabecular bone. Stem Cells 21:681-693.
Turcotte S, Desrosiers RR and Beliveau R (2003) HIF-1alpha mRNA and protein upregulation
involves Rho GTPase expression during hypoxia in renal cell carcinoma. J Cell Sci
116:2247-2260.
Turcotte S, Desrosiers RR and Beliveau R (2004) Hypoxia upregulates von Hippel-Lindau tumor-
suppressor protein through RhoA-dependent activity in renal cell carcinoma. Am J Physiol
Renal Physiol 286:F338-348.
Ushio-Fukai M (2007) VEGF signaling through NADPH oxidase-derived ROS. Antioxid Redox
Signal 9:731-739.
Vallabhaneni KC, Tkachuk S, Kiyan Y, Shushakova N, Haller H, Dumler I and Eden G Urokinase
receptor mediates mobilization, migration and differentiation of mesenchymal stem cells.
Cardiovasc Res.
Van den Heuvel RL, Versele SR, Schoeters GE and Vanderborght OL (1987) Stromal stem cells
(CFU-f) in yolk sac, liver, spleen and bone marrow of pre- and postnatal mice. Br J
Haematol 66:15-20.
Van Troys M, Huyck L, Leyman S, Dhaese S, Vandekerkhove J and Ampe C (2008) Ins and outs of
ADF/cofilin activity and regulation. Eur J Cell Biol 87:649-667.
Vogel S, Wottawa M, Farhat K, Zieseniss A, Schnelle M, Le-Huu S, von Ahlen M, Malz C,
Camenisch G and Katschinski DM Prolyl hydroxylase domain (PHD) 2 affects cell
migration and F-actin formation via RhoA/rho-associated kinase-dependent cofilin
phosphorylation. J Biol Chem 285:33756-33763.
Vogel W, Grunebach F, Messam CA, Kanz L, Brugger W and Buhring HJ (2003) Heterogeneity
among human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and neural progenitor cells.
Haematologica 88:126-133.

114
Wang GL and Semenza GL (1993) Characterization of hypoxia-inducible factor 1 and regulation of
DNA binding activity by hypoxia. J Biol Chem 268:21513-21518.
Wennerberg K and Der CJ (2004) Rho-family GTPases: it's not only Rac and Rho (and I like it). J
Cell Sci 117:1301-1312.
Wientjes FB and Segal AW (1995) NADPH oxidase and the respiratory burst. Semin Cell Biol
6:357-365.
Williams DA, Tao W, Yang F, Kim C, Gu Y, Mansfield P, Levine JE, Petryniak B, Derrow CW,
Harris C, Jia B, Zheng Y, Ambruso DR, Lowe JB, Atkinson SJ, Dinauer MC and Boxer L
(2000) Dominant negative mutation of the hematopoietic-specific Rho GTPase, Rac2, is
associated with a human phagocyte immunodeficiency. Blood 96:1646-1654.
Winter-Vann AM, Kamen BA, Bergo MO, Young SG, Melnyk S, James SJ and Casey PJ (2003)
Targeting Ras signaling through inhibition of carboxyl methylation: an unexpected property
of methotrexate. Proc Natl Acad Sci U S A 100:6529-6534.
Wolf K, Mazo I, Leung H, Engelke K, von Andrian UH, Deryugina EI, Strongin AY, Brocker EB
and Friedl P (2003a) Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-
amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol 160:267-277.
Wolf K, Muller R, Borgmann S, Brocker EB and Friedl P (2003b) Amoeboid shape change and
contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix
remodeling by MMPs and other proteases. Blood 102:3262-3269.
Worster AA, Nixon AJ, Brower-Toland BD and Williams J (2000) Effect of transforming growth
factor beta1 on chondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cells. Am
J Vet Res 61:1003-1010.
Wu S, Suzuki Y, Ejiri Y, Noda T, Bai H, Kitada M, Kataoka K, Ohta M, Chou H and Ide C (2003)
Bone marrow stromal cells enhance differentiation of cocultured neurosphere cells and
promote regeneration of injured spinal cord. J Neurosci Res 72:343-351.
Xue Y, Bi F, Zhang X, Zhang S, Pan Y, Liu N, Shi Y, Yao X, Zheng Y and Fan D (2006) Role of
Rac1 and Cdc42 in hypoxia induced p53 and von Hippel-Lindau suppression and HIF1alpha
activation. Int J Cancer 118:2965-2972.
Yan SF, Lu J, Zou YS, Soh-Won J, Cohen DM, Buttrick PM, Cooper DR, Steinberg SF, Mackman
N, Pinsky DJ and Stern DM (1999) Hypoxia-associated induction of early growth response-
1 gene expression. J Biol Chem 274:15030-15040.
Yan SF, Zou YS, Gao Y, Zhai C, Mackman N, Lee SL, Milbrandt J, Pinsky D, Kisiel W and Stern
D (1998) Tissue factor transcription driven by Egr-1 is a critical mechanism of murine
pulmonary fibrin deposition in hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A 95:8298-8303.
Yan SR, Fumagalli L, Dusi S and Berton G (1995) Tumor necrosis factor triggers redistribution to a
Triton X-100-insoluble, cytoskeletal fraction of beta 2 integrins, NADPH oxidase
components, tyrosine phosphorylated proteins, and the protein tyrosine kinase p58fgr in
human neutrophils adherent to fibrinogen. J Leukoc Biol 58:595-606.
Yang N, Higuchi O, Ohashi K, Nagata K, Wada A, Kangawa K, Nishida E and Mizuno K (1998)
Cofilin phosphorylation by LIM-kinase 1 and its role in Rac-mediated actin reorganization.
Nature 393:809-812.
Yin T and Green KJ (2004) Regulation of desmosome assembly and adhesion. Semin Cell Dev Biol
15:665-677.
Yoshida K and Soldati T (2006) Dissection of amoeboid movement into two mechanically distinct
modes. J Cell Sci 119:3833-3844.
Young HE, Steele TA, Bray RA, Hudson J, Floyd JA, Hawkins K, Thomas K, Austin T, Edwards
C, Cuzzourt J, Duenzl M, Lucas PA and Black AC, Jr. (2001) Human reserve pluripotent
mesenchymal stem cells are present in the connective tissues of skeletal muscle and dermis
derived from fetal, adult, and geriatric donors. Anat Rec 264:51-62.

115
Yumura S, Mori H and Fukui Y (1984) Localization of actin and myosin for the study of ameboid
movement in Dictyostelium using improved immunofluorescence. J Cell Biol 99:894-899.
Zhang Y, Li CD, Jiang XX, Li HL, Tang PH and Mao N (2004) Comparison of mesenchymal stem
cells from human placenta and bone marrow. Chin Med J (Engl) 117:882-887.
Zhang Y, Liang JL, Wang S, Wang H, Zheng XZ, Yang Z and Zhang B (2007) [Autologous bone
marrow stromal cell transplantation with application of granulocyte colony-stimulating
factor improves rabbit cardiac performance after acute myocardial infarction]. Nan Fang Yi
Ke Da Xue Xue Bao 27:43-45, 48.
Zhao ZS and Manser E (2005) PAK and other Rho-associated kinases--effectors with surprisingly
diverse mechanisms of regulation. Biochem J 386:201-214.
Zvaifler NJ, Marinova-Mutafchieva L, Adams G, Edwards CJ, Moss J, Burger JA and Maini RN
(2000) Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals. Arthritis Res 2:477-
488.
Zyuz'kov GN, Suslov NI, Dygai AM, Zhdanov VV and Gol'dberg ED (2005) Role of stem cells in
adaptation to hypoxia and mechanisms of neuroprotective effect of granulocytic colony-
stimulating factor. Bull Exp Biol Med 140:606-611.

116
IV Annexes

Annexe 1 : Protocoles
I.Migration sur Transwells

Migration in vitro des CSM-Second protocole

Jour-1 :
1. Quand les cellules sont à 80% de confluence, laver les flasques 2 fois avec du PBS 1X
Stérile.
2. Ajouter 21 ml pour les F150,
10,5 ml pour les F75 de milieu de migration : RPMI/BSA 0,25%.
ou 3,5 ml pour les F25 et incuber 24h à 37°C.
Jour-2 :
Préparation de la gélatine et coating :

3. Coating de chaque insert avec de la gélatine 0,1% : 150 l/insert.

Incuber 1h à 37°C.
Préparation de la migration cellulaire :
4. Au bout de 24h, éliminer le milieu de migration.

5. Faire un lavage avec du PBS 1X.

6. Trypsiner les cellules avec 6 ml pour les F150,

3 ml pour les F75,
1 ml pour les F25 de trypsine 0,025%/EDTA 0,01% et
Vérifier le décollement au microscope.
7. Bloquer l’action de la trypsine avec le même volume d’anti-trypsine.

8. Faire 2 lavages des cellules avec le milieu de migration (milieu sans sérum).

9. Reprendre le culot cellulaire dans du RPMI/BSA 0,25%.

10. Compter le nombre des cellules sur cellule de Malassez ou de Fastride :

Faire un dilution au ½ dans du bleu de Trypan : Trypan 15l / Cellules 15l.

117
 11. Complétez le culot cellulaire pour obtenir une concentration cellulaire de
2x105 cellules /300 l de milieu de RPMI /BSA 0,25%.

12. Reprendre les inserts et éliminer l’excès de gélatine.

13. Déposer dans chaque puits 400 l de sérum +/- chimiokines ou cytokines à tester.

14. Déposer 300 l de suspension cellulaire (2x105 cellules) dans chaque insert et poser l’insert
sur les puits. Vérifier l’absence de bulles d’air sous la membrane de chaque insert.

15. Mettre la plaque de 24 puits 18h à 37° pour permettre la migration cellulaire.

Jour-3 :
Récupération et comptage des cellules :
16. Eliminer à la pipette le contenu de chaque insert.

17. Récupérer le contenu de chaque puits dans un tube eppendorf 1,5 ml.

18. Nettoyer chaque insert à l’aide d’un coton tige imbibé de RPMI pour éliminer les cellules
n’ayant pas migré.

19. Trypsiner le fond de chaque insert : pour cela ajouter 500 l de trypsine/EDTA0,5% dans
chaque puits et poser l’insert sur le puits.

20. Mettre 10 min à 37°C.

21. Récupérer la trypsine et laver chaque puits avec 500 l de RPMI/SVF10%.

21. Centrifuger les tubes 10 min à 3000 tr/min.

22. Eliminer le surnageant et reprendre chaque culot cellulaire avec entre 50 et 100 l de RPMI
dans un eppendorf de 500 l.

23. Compter le nombre de cellules sur cellule de Malassez ou Fastride :

Faire un dilution au ½ dans du bleu de Trypan : Trypan 15l / Cellules 15lMilieu de

118
migration: Références :
Pour 150 ml Nom Fournisseur Référence

1,5 ml L-Glutamine Glutamine Fisher (Introven) 25030024

1,5 ml Penicilline/Streptomycine P/S Fisher (Introven) 15140122

15 l Fungizone Fungizone Bristol-Myers-Squibb

1,9 ml BSA BSA pharmacie
145 ml RPMI sans L-Glutamine RPMI Fisher 31870074

Filtrer sur 0,22 m

119
II.Western-Blott

1- préparation : Tampon Lysis Buffer

2- Mixage des broyats cellulaires
3- Dosage des protéines
4- Préparation du matériel et des solutions western blot
5- Préparation des gels
6- Préparation finale de l’échantillon
7- Incubation dans les anticorps
8- Révélation
Rho A et RhoA activée

1 –Préparation Lysis Buffer

Mettre des gants

Toute la préparation se fait sur glace pilée et la conservation à 4°
Solution : Lysis Buffer de 100ml de Jean Marc à gauche (ne marche pas pour les
vaisseaux), de Bonaventure à droite ( marche pour les vaisseaux)

TRIS 605.1 mg TRIS 10 mM 121

mg

NaCl 2.92g Sucrose 300 mM 10.27g

SDS (poudre) 1g EDTA 100mM 292

mg

TRITONx100 1ml (à la seringue)

Ac. Desoxycholique1% 1g

H2O distillée 90 ml H2O 100ml

Ajuster au pH 7.2 Ajuster à Ajuster le pH à 7.4

100 ml

Ajouter 2 tablettes de cocktail Ajouter 2 tablettes de

inhibiteur de protéases (dans le cocktail inhibiteur (dans le
réfrigérateur) réfrigérateur

Mélanger. Conserver à 4°

120
2-Broyats tissulaires
Mettre des gants
Préparer de la glace pilée
Prendre un échantillon de tissu, le placer dans un aliquot
Immerger l’aliquot dans la glace
Ajouter 400µl de tampon Lysis Buffer (100µl pour tissus moins riches en protéines)
Laisser dans la glace 15min.
Homogénéiser avec broyeur 30 à 45 secondes dans la glace.
Si l’homogénéisation ne semble pas correcte laisser dans la glace 5Min. supplémentaires,
broyer à nouveau tous les échantillons quelques secondes.
Les broyats homogénéisés sont conservés à -20°C
Nettoyer le broyeur entre chaque broyat de chaque aliquot avec eau
A la fin des broyages nettoyer le broyeur sous l’eau. Le démonter, le brosser (brosse à dent)
passer sous l’eau distillée. Tremper dans éthanol 70%. Sécher et ranger ou tremper dans
Falcon rempli d’éthanol 95%, scotcher le tube avec parafilm.
Le jour de la manipulation. Mettre des gants, rincer le broyeur abondamment à l’eau distillée
pour enlever l’éthanol. (S’il était sec, le laver à l’eau, puis à l’éthanol puis le rincer à l’eau).
Le remonter, le placer dans Falcon rempli de Lysis Buffer et l’immerger dans la glace pilée.
Centrifuger 5 minutes à 10000tours. Pipeter le surnageant, c’est lui qui contient les
protéines.

3- Dosage des protéines

Sortir le BRADFORD du réfrigérateur (4°) le laisser à température ambiante
Préparer une courbe étalon de BSA (bovine sérum albumine)
Prendre un aliquot BSA (20%) au congélateur
Eau bi-distillée

Préparer une courbe étalon comme suit après avoir dilué un peu de LB au 1/10

121
 A 2mg/ml 10 µl BSA 0.99 ml LB
1/10

B 1.5mg/ml 7.5µl BSA 0.925 LB

1/10

C 1mg/ml 0.5 ml A 0.5 ml LB

1/10

D 0.75 mg/ml 0.5ml B 0.5 ml LB

1/10

E 0.5 mg/ml 0.5ml C 0.5 ml LB

1/10

F 0.25 mg/ml 0.5ml E 0.5 ml LB

1/10

G 0.125mg/m 0.5 ml F 0.5 ml LB

l 1/10

H blanc 0 1ml LB 1/10

Remplissage des cuves du spectrophotomètre

Dans chaque cuve pipeter 20 µl (40, 60 ou 80µl) de chaque tube étalon et 1 ml (2, 3 ou
4ml) de BRADFORD.
Laisser reposer 5 min à température ambiante
Lire l’absorption à 595 nM.
Dosage des protéines des échantillons.
Diluer chaque échantillon au /10. Dans un épendorf pipeter 10 µl de l’échantillon pour 90
µl d’eau.
Préparer deux dosages par échantillon.
Dans une cuve spectro pipeter 20 µl de chacun des épendorfs et 1ml de BRADFORD
Préparer un échantillon du Lysis Buffer dilué au 1/10 ème (100 µl/900 µl H2O) si la gamme
étalon a été préparée dans de l’eau.
Dans une cuve (référence LB) pipeter 20 µl et 1ml de BRADFORD
Laisser reposer 5 minutes
Lire l’absorption à 595 nM.
Utilisation du spectrophotomètre :
Allumer l’appareil (derrière)
Attendre. Si message d’erreur autre que « Light Pass » éteindre et recommencer

122
 Quit
« Fixed wavelenght » cliquer sur 500 et remplacer par 595
Cliquer sur « Read mod » (Abs)
Cliquer sur « Vis on » (en bas) , allume la lampe
Cliquer sur « Blank » après avoir mis la cuve de référence contenant de l’eau, met à zéro.
Cliquer sur « Read samples ». Mettre un tube sous le faisceau , cliquer sur « read samples »,
affiche l’absorption de la cuve. Changer de cuve. Enfin de manipulation Cliquer sur Quit
Modification OK
Eteindre la lampe « Vis of »
Eteindre l’appareil brutalement derrière.

4- Préparation solutions et matériel de western

Préparer la veille et conserver au réfrigérateur :
Solution Tampon de migration
Préparer 500 ml/cuve.10xBUFFER (TRIS/HCL/(glycine/SDS) diluer au 1/10 dans de l’H2O
distillée

10XBUFFER 50ml 450 ml

d’H2O

Solution Tampon de transfert pH 8.3

pour 1 litre quantité concentration

TRIS 3.03g 25 mM

GLYCINE 14.4g 192mM

METHANOL 20% 200ml

Ajuster le pH à
8.3

H2O QSP
1000ml

Solution TBS pH 7.6

123
 Préparer 1 quantité concentratio
litre n

TRIS 2.42 g 20mM

NaCl 8g

ajuster le ph
7.6 HCl 1M

H2O QSP
1000ml

Solution TBS-TWEEN 20
Ajouter 1ml de TWEEN 20 ( détergent) à la solution de TBS
Solution TBS-TWEEN20-Lait
Ajouter du lait à 5% (5g/100ml) à la solution TBS-TWEEN20

5-Préparation des gels : mettre des gants

Dans cuve remplie d’H2O, tremper et presser les deux bandes de caoutchouc,
évacuer les bulles, les laisser tremper.
Laver 4 plaques de verre (deux fines et deux épaisses) à l’eau du robinet, puis à
l’éthanol 96%, puis à l’eau distillée, essuyer avec du papier.
Glisser deux plaques de verre, la fine à l’avant, la plus épaisse à l’arrière dans les
portoirs verts. Bloquer.
Remettre les deux bandes de caoutchouc dans le bas du support des portoirs verts.
Poser le portoir vert sur la bande et fixer avec la pince supérieure.

Gel de résolution

Becher, Tris/HCl pH 8.8, Acrylamide (réfrigérateur) Temed (placard), SDS 10%

(placard) aliquot d’ammonium persulfate (congélateur tiroir 1 ou 2).
Choisir la concentration du gel de résolution selon la taille de la protéine recherchée.
La concentration du gel définira la taille du maillage du gel.
ex : pour actine gel à 12 ou 10%, pour une protéine de 20 KDa gel de 12 à 15%, une
protéine de 80KDa gel à 10%, supérieure à 80KDa gel de 7.5 à 10%....

124
 Gel de résolution :

7.5% 10% 12% 15%

40% acrylamide (4°C) 1.9ml 2.5 3 3.8

TRIS/HCl pH8.8 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml

SDS 10% 100µl 100µl 100µl 100µl

H2O 5.4 ml 4.8ml 4.3ml 3.5ml

Persulfate d’ammonium 50µl

10% 50µl 50µl 50µl

TEMED 10µl 10µl 10µl 10µl

Persulfate d’ammonium (aliquot au congélateur). Pipeter 50µl et conserver à l’abri

de la lumière, dans le tiroir.
Préparer une pipette de 1000, sortir l’isopropanol (dans portoir).
Prévoir une seringue de 10 ml et un filtre.
Mettre le TEMED en dernier toujours. Agiter à la main. Remplir la seringue et
couler le gel à travers le filtre en s’appuyant sur la lame de verre du fond.
Ajouter 1 ml d’isopropanol sur la plaque (permet de chasser les bulles et
d’horizontaliser le gel) (500 µl pour les 2 gels).
Attendre la polymérisation du gel (vérifier sur le gel restant dans Falcon).
En attendant préparer le gel de focalisation
Gel de focalisation 4% :

4%

40% Acrylamide/bis 500µl

0.5M TRIS/Hcl 1.3ml

pH6.8

10% SDS 50µl

H2O 3.1ml

10% persulfate 25µl

d’ammonium

TEMED 5µl

125
 Attendre la polymérisation du premier gel avant d’introduire le persulfate
d’ammonium et le TEMED. Quand le gel est pris, retirer l’isopropanol en renversant le
portoir sur le côté. Pipeter le reste aux extrémités.
Ajouter 1ml de tampon TRIS HCl pH 6.8, rincer le gel, agiter doucement retourner et
éliminer le tampon, pipeter le reste.
Remplir la cuve à raz bord avec le deuxième gel à travers un filtre.
Insérer les peignes latéralement pour éviter les bulles. Allumer le Thermoblock 95°C ;
Attendre la polymérisation du deuxième gel 20 à 30 min.
Préparer 500ml de tampon de migration.
Retirer les gels des portoirs, les monter dans la cuve d’électrophorèse. Les puits
doivent être dirigés vers l’intérieur.
Verser le tampon de migration entre les deux gels, le tampon déborde de part et
d’autre. Retirer les peignes. Placer le guide ad hoc pour les puits.
Recouvrir.

6-Préparation finale de l’échantillon :

Dénaturation des protéines

Le dosage des protéines permet d’évaluer la concentration en protéines de
l’échantillon. Calculer le volume à pipeter pour que l’échantillon contienne 10 à 50 µg
suivant la rareté de la protéine. Ajouter 2 ou 3 volumes de Laemli pour un volume de
protéines, volume total inférieur à 15 ou 20 µl. Placer dans des aliquots.
Percer les aliquots (pour éviter les projections à 95°C). Chauffer à 90-95°C 4 à 5
minutes dans le Thermoblock pour dénaturer les protéines.
Le volume du puits est de 20 µl pour peigne 10, et de 15 µl pour peigne 14. Charger
les puits avec les échantillons et un ou deux puits aux extrémités avec un échantillon
de 10 µl de marqueur de poids moléculaire (congélateur -20°) incubé 1 min à 40° et un
puits avec un contrôle positif. Charger doucement et éviter les bulles.

Electrophorèse
Migration à courant constant U=RI, I= 25 à 30 mA/gel.
Régler I et fixer I =50 ou 60 mA
S’assurer que le volume du tampon de migration entre les deux gels soit supérieur à la
ligne supérieure des puits, pour assurer la circulation du courant.
Mettre le couvercle. Allumer le générateur. S’assurer de la progression du front de
migration (ligne bleue) 30 min plus tard.

126
 Attendre que le front de migration atteigne la limite inférieure du gel (sans jamais la
dépasser). Arrêter le générateur. Enlever le chapeau.

Transfert des protéines sur une membrane

Méthode Jean-Marc, pour un gel. Préparer 2 tampons : anode et cathode. Remplir
trois récipients. Le troisième avec de l’eau.
(Les deux solutions anode et cathode peuvent être remplacées par une seule le
Towin).

Anode 1 pour 500 ml Cathode pour 500 ml

10x TRIS/CAPS Buffer 50ml 10x TRIS /CAPS Buffer 50ml

H2O 375 ml H2O 445ml

Méthanol 10% 75 ml SDS % 5ml

Placer 2 papiers buvards (dans tiroir sous paillasse) dans le tampon anode 1, 2 dans
cathode. Découper une membrane de nitrocellulose de la taille du papier buvard.(si
membrane PVDF, la tremper 15 secondes dans du méthanol, puis la rincer et la
tremper dans le tampon précédent).
Rincer la membrane 10 secondes dans H2O. La placer 15 minutes dans le tampon
anode.
Démouler le gel avec le pied de biche (vert). Retirer avec le grattoir le gel de
focalisation (gel où sont les puits). Décoller le gel avec pied de biche, l’attraper avec
les doigts et le transporter dans le bac cathode et l’y laisser 15 minutes.

Transfert des protéines du gel sur la membrane

Nettoyer à l’eau la plaque de l’appareil Semidry

Réaliser un sandwich en superposant un carton du tampon anode 1, la membrane (la
placer avec deux pinces) puis le gel (au doigt). Lisser délicatement pour supprimer les
bulles. Ajouter le carton cathode, après l’avoir découpé à la taille du gel !!!
Sécher autour du sandwich. Recouvrir. Bloquer le chapeau. Rebrancher sur Biorad
20V constant
Mettre en marche. Laisser 45 minutes à 1 heure.
Arrêter.

127
 Blocage de la membrane

Enlever les cartons

Récupérer le gel dans un tampon comasie (laisser la journée).
Récupérer la membrane dans un flacon 15 ml. Incuber dans TBS-Tween-lait 1h à
température ambiante en agitant ou jusqu’à 24h au réfrigérateur à 4°C, mais dans un
bac.
Jeter le TBS-Tween-Lait du tube contenant la membrane et rincer 3 fois la membrane
10 à 15 minutes en l’agitant dans du TBS-TWEEN.

7-Incubation dans les Ac

Incubation dans Ac1

Prendre un flacon 50ml, prendre l’Ac1 (exemple AcAnti-actine (congélateur tiroir 4),
utiliser une dilution prévue par le fournisseur, le diluer dans TBS-Teen-Lait et y
ajouter la membrane transportée à la pince.
Agitation sur plaque 1 heure ou 24h à 4° selon l’Ac.
Rinçage
Retirer TBS-Tween-LaitA1. Trois Rinçages de 10 minutes dans TBS-Tween.

Incubation dans Ac2

Rechercher un Ac2 dirigé contre l’espèce qui a servi pour fabriquer l’Ac1. Ici Goat
anti-souris.
Le premier Ac est fabriqué par une espèce animale, souris, chèvre, lapin….Le
deuxième Ac est dirigé contre cette espèce animale, goat anti souris, chèvre, lapin…
Diluer au 1/6000. (12 ml TBS-Tween-Lait 2 µl d’Ac goat-souris)
Laisser incuber une heure en agitant.
Rincer trois fois 10 minutes dans TBS-Tween. Arrêt.

8-Révélation

128
 Saisir la membrane et la faire sécher sur un grand buvard.
Préparer le Kit ECL de révélation (réfrigérateur). Dans un Falcon de 15 ml mélanger 3
ml du gros flacon et 75 µl du petit. Conserver à l’abri de la lumière. Placer la
membrane sèche dans une pochette plastique. Verser la solution de révélation dans la
pochette sur la membrane. Eviter les bulles d’air. Attendre 5 minutes.
Enlever la membrane, la faire sécher sur le buvard. La placer dans une boîte noire dans
une pochette.
Installer dans la pièce photo les trois bacs. Les remplir de la solution de révélation,
d’eau, et de fixation.
Dans le noir découper un morceau de film photo (1/2film) de la taille de la membrane.
Placer le film 5 à 15 secondes au contact de la membrane. Puis tremper le film dans le
bac de révélation. Arrêter dès que quelque chose apparaît. Rincer, puis plonger
quelques minutes dans le bac de fixation. Sortir du bac Laver et faire sécher le film
toute la nuit en le suspendant. Si trop d’exposition, retailler un autre film et
recommencer le contact membrane film pendant moins longtemps. Reprendre comme
précédemment.

Puis colorer au rouge de Ponceau la membrane. Agiter 2 minutes. Rincer à la pissette

d’eau distillée jusqu’à obtention de bandes de protéines.

III. RT-PCR

PROTOCOLE RT

Random primer (hexamère) 0,5 µl X n puits à remplir

dNTP (10mM) 0,5 µl X n puits à remplir

Tampon 5 µl X n puits à remplir

129
DTT 2,5 µl X n puits à remplir

Eau milliQ (qsp21,7) 12,7 µl X n puits à remplir

Superscript II 0,5 µl X n puits à remplir

Total du MIX 21,7 µl X n puits à remplir

+ ARN 3,3

Total 25 µl

NB : Préparer le mix total en fonction du nombre total de puits à remplir (vortexer le mix 10
secondes).
Faire les échantillons en double

RT : 42° pdt 45 min/ 92° pdt 5 min/ 4°

ARN 0,25 ds 25 µL
bNA 250 ny ds 25 µL

IV. Immunofluorescence Indirecte (protocole d’Evry).

1-Fixation des cellules

 Ajouter 0,5mL de Formaldéhyde à 3,65% CHAUD

 Incuber à température ambiante pendant 10min COUVERT
 Rincer 3 fois avec 0,5mL de PBS2-

2-Marquages supplémentaires

 PERMEABILISATION : 300µL Triton x100 0,1%, 2min COUVERT

 Rincer avec 500µL de PBS2- : 2 rinçages courts + 1 rinçage long
 SATURATION : 300µL de PBS2- 1% BSA, 20min COUVERT
 Éliminer le PBS2- 1% BSA
 MARQUAGE F-(que pour les marquages 4, 5, 6) : 250µL solution Phalloïdine TRITC, 30min
COUVERT

130
  Rincer avec 500µL de PBS2- : 2 rinçages courts + 1 rinçage long
 MARQUAGE ADN (que pour les marquages 4, 5, 6) : 500µL solution DAPI, 4min COUVERT
 Rincer avec 500µL de PBS2- : 2 rinçages courts + 1 rinçage long
 ANTICORPS 1aire : 200µL solution d’anticorps 1aire, 2H en chambre humide COUVERT
 Rincer avec 500µL de PBS2- : 2 rinçages courts + 1 rinçage long
 ANTICORPS 2aire : 300µL solution d’anticorps 2aire, 1H en chambre humide COUVERT
 Rincer avec 500µL de PBS2- : 2 rinçages courts + 1 rinçage long

3-Préparation de la solution de Phalloïdine TRITC

18 puits, 250µL/puits : 4 500µL sont nécessaires, on prépare une solution de 5 000µL

1 aliquot (10µL) pour 5mL
 10µL (1 aliquot) dans 4 990µL de PBS2- 1% BSA

4-Préparation de la solution de DAPI

 1µL dans 50mL de PBS2- ou une goutte de DAPI sur la lamelle.



5-Préparation de la solution d’anticorps primaire

Préparation de la solution d’anticorps primaire anti-PAI-1 (produit chez le lapin)

6 puits, 200µL/puits, dilution 1/200 : 1 200µL sont nécessaire, on prépare une solution de 1
400µL.
 7µL de solution mère anti-PAI-1 + 1 393µL de PBS2- 1% BSA

Préparation de la solution d’anticorps primaires anti-uPA (produit chez le lapin)

6 puits, 200µL/puits, dilution 1/200 : 1 200µL sont nécessaire, on prépare une solution de 1
400µL.
 7µL de solution mère anti-uPA + 1 393µL de PBS2- 1% BSA

Préparation de la solution d’anticorps primaires anti-uPAR (produit chez la souris)

6 puits, 200µL/puits, dilution 1/200 : 1 200µL sont nécessaire, on prépare une solution de 1
400µL.
 7µL de solution mère anti-uPAR + 1 393µL de PBS2- 1% BSA

6-Préparation de la solution d’anticorps secondaires.

Préparation de la solution d’anticorps secondaires vert (Alexa Fluor 488, chèvre) anti-
souris (pour uPAR et Intégrine β1) et rouge (TRITC, chèvre) anti-lapin (pour PAI-1, uPA
et MT1-MMP)
18 puits, 300µL/puits, dilution 1/100 : 5 400µL sont nécessaire, on prépare une solution de
5 700µL.
 57µL de solution mère anti-souris + 57µL de solution mère anti-lapin
+ 5 586µL de PBS2- 1% BSA

Préparation de la solution d’anticorps secondaire vert (Alexa Fluor 488, chèvre) anti-
lapin (pour PAI-1 et uPA)
12 puits, 300µL/puits, dilution 1/100 : 3 600µL sont nécessaire, on prépare une solution de

131
3 900µL.
 39µL de solution mère anti-lapin + 3 861µL de PBS2- 1% BSA

Préparation de la solution d’anticorps secondaire vert (Alexa Fluor 488, chèvre) anti-
souris (pour uPAR)
6 puits, 300µL/puits, dilution 1/100 : 1 800µL sont nécessaire, on prépare une solution de
2 100µL.
 21µL de solution mère anti-lapin + 2 079µL de PBS2- 1% BSA

7-Montage des lames

 Sécher la lamelle par la tranche sur du papier absorbant

 Déposer une goutte de moviol de 12µL sur la lame avec du DAPI
 Déposer la lamelle sur la goutte (cellules côté lame)
 Une fois sec, faire des points de vernis pour fixer la lamelle
 Conserver à 4°C dans du papier aluminium

132
 Annexe 2 : Tableaux

Tableau 1 des anticorps utilisés en

immunofluorescence
Anticorps Origine-Type Référence/Lot dilution
SC-10790-Santa
Hif-1 Rabbit polyclonal cruz 1/50
Mouse
PAI-1 monoclonal SC-5297-Santa cruz 1/50
ROCK1 Goat polyclonal SC-6055-Santa cruz 1/50
LIMK1 Rabbit polyclonal ab-38505-abcam 1/100
LIMK2 Rabbit polyclonal ab-38499-abcam 1/100
SC-65343-Santa
p47 Rabbit polyclonal cruz 1/50

Tableau 2 des anticorps utilisés en

Western-Blott
Anticorps Origine-Type Référence/Lot dilution
SC-10790-Santa
Hif-1 Rabbit polyclonal cruz 1/1000
cofiline Rabbit polyclonal ab12866-abcam 1/1000
p47 Rabbit polyclonal SC-65343-abcam 1/1000
SC-71177-Santa
PI3K Rabbit polyclonal cruz 1/500
Mouse A2547-Sgma-
actine monoclonal Aldrich 1/400
Mouse
Tubuline monoclonal T4026-Sigma 1/800
Rac1-GTP KIT 17294_Millipore 1/800
ROCK1 Goat polyclonal SC-6055-Santa cruz 1/1000

133
Le Directeur de Thèse :

Tours, le

Vu et Transmis :

Le Doyen

134
135