UNIVERSITE DE LOME

Ecole Supérieure des Techniques Biologiques et Alimentaires

(E.S.T.B.A.)

Domaine : Sciences et techniques

Licence : Biologie et Physiologie Animale et Végétale (BPA, BPV)

Faculté des Sciences (FDS)

UE BCH 230 – BIOLOGIE MOLECULAIRE DU GENE

Crédits : 4
Public cible : Etudiants
Semestre : 6
Pré-requis : Biologie cellulaire, Biochimie

Responsible: Pr. TCHACONDO Tchadjobo, Professeur Titulaire,

Chronophysiologie et Toxicologie moléculaire/environnement
Tel. +228. 92 20 23 92. tchacondotchadjobo@yahoo.fr

Disponibilité : mardi et mercredi, 16h à 18h

Objectif général :
Cette UE vise à offrir aux apprenants des notions essentielles de la biologie et physiologie
moléculaires et sur des techniques et outils biologiques de base nécessaires pour la pratique et
recherche aux laboratoires de biologie moléculaire.
Objectifs spécifiques : Les apprenants seront capables de :
- décrire les différentes structures chimiques des biomolécules.
- reconnaître par leur nature chimique, les différents composants des biomolécules.
- maitriser les mécanismes d’action moléculaire caractérisant les différentes biosynthèse.
- maitriser les différentes techniques et tests de base de la biologie moléculaire.

CONTENU
Cette UE est composée de trois grandes parties et terminée par des exemples de pratiques de
laboratoire. La première partie traite de la structure des acides nucléiques et des mécanismes de
synthèse des protéines. La deuxième partie est une récapitulation des différents enzymes de
restriction utilisés au laboratoire pour cliver et digérer les ADN et ARN. La troisième partie
décrit les différentes techniques de base de la biologie moléculaire. Ainsi, les étudiants se
familiariseront aux notions de base de la biologie moléculaires. Ils compléteront aussi leurs
connaissances acquises en biochimie et en biologie cellulaire sur l’expression des gènes.

PLAN DU COURS

Séance N° Objectifs spécifiques Titres/Sous titres

1 Historique et intérêt Histoire de la naissance de la Biologie moléculaire,
prix Nobel et relation avec d’autres UE
2 Connaitre la structure -structure des acides nucléiques
détaillée des RNA et - les propriétés fondamentales
DNA - Les différents DNA et RNA

3 Maitriser les -Réplication, synthèse du DNA

mécanismes de -Transcription, synthèse du RNA
synthèses, du DNA à -Code génétique et traduction, synthèse protéique
la protéine
4 Comprendre les - Dommage et erreurs apparus au niveau du DNA
systèmes de - Les différents systèmes de réparations pour la
réparations lors des fidélité du DNA
dommages
cellulaires
5 -Connaitre les Sites des enzymes de restriction
enzymes de Origine et différentes classes
restriction Utilisation des enzymes de restriction
-Utiliser ces enzymes
6 -Comprendre les -Substitutions et fidélité du DNA
phénomènes de -Mutation et modification géniques
substituions et -Etude de cas de maladies congénitales
mutation
-Les interpréter
 7 -Connaitre les -Insertion, délétion et maladies génétique
mécanismes - Etude de cas de maladies congénitales
d’insertion et de
délétions
- Les interpréter
8 Savoir extraire, -Extraction et purification du DNA
purifier et quantifier -Electrophorèse du DNA
le DNA
9 -Comprendre -PCR et réplication
l’amplification -Les différents PCR
génique -Les étapes de réalisation
-Savoir utiliser un -Les produits PCR
thermocycleur -Les applications pratiques

10 -Comprendre les -Différentes techniques de séquençage du DNA

principes de -Principe et interprétation
séquençage du DNA
-Savoir l’interpréter
11 -Comprendre les -Différentes étapes de la technique de Southern
techniques de -Les applications de la technique de Southern
Southern et de -Différentes étapes de la technique de Northern
Northern -Les applications de la technique de Northern
-Savoir les appliquer
12 Répondre aux Dépends des questions et inquiétudes des
questions et apprenants
inquiétudes des
apprenants en
révision générale

MODALITE D’EVALUATION
Contrôle continu des connaissances
− Devoir sur table (33.33%)
− Examen finale (66.67%)

Bibliographie
1. Françoise Quentin, Paul-françois Gallet, Michel Guilloton & Bernadette Quintard.
Biochimie en 84 fiches, Dunod, Paris, 2015, 5 rue Laromiguière, 75005 Paris,
www.dunod.com ISBN 978-2-10-073922-6
2. Simon Beaumont. Biochimie-UE1 ,1ère année santé, Dunod, Paris, 2015, 5 rue
Laromiguière, 75005 Paris, www.dunod.com , © Dunod, Paris, 2005, ISBN 978-2-10-
073044-5
3. Weinman S., 2004. Toute la Biochimie. ISBN 2 10 006734 6. Dunod, Paris
4. David L. Nelson & Michael M. Cox, Lehninger, Principles of Biochemistry, Fourth
Edition; 1130p.
5. Jacques Kruh. Biochimie Etudes Médicales et Biologiques. Tome 1, Biologie Cellulaire
Et Moléculaire, Editions Hermann
6. Jacques Kruh. Biochimie Etudes Médicales et Biologiques. Tome 2, Métabolismes,
Edition Hermann 1989.
7. Etienne J. & Clauser E. Biochimie génétique, biologie moléculaire. Masson, 1999.
 8. Stryer L. La biochimie. Flammarion, Médecine – sciences, 1992.
9. Alberts B. & al. Biologie moléculaire de la cellule. Flammarion, Médecine – sciences,
1995.
10. MAMAN I., TCHACONDO T., BANLA-KERE A. Ulcer de Buruli. Edition
Universitaire Européenne, 2019 ; 207p.
11. Biologie moléculaire et médecine. Flammarion, Médecine – sciences, 1993.
12. Boyard E. Cancer et médicaments, Masson, 1993.
 INTRODUCTION A LA BIOLOGIE MOLECULAIRE

1- Définition
La Biologie Moléculaire (BM) est le champ de la biologie qui concerne les
phénomènes biologiques en termes d’interaction moléculaire ou chimique. Elle se
consacre au monde vivant par la connaissance des molécules qui lui sont propres.
Ces molécules sont des constituants élémentaires des organismes vivants (ADN,
ARN).

2- Historique
L’histoire de la Biologie Moléculaire commence en 1953 avec la découverte de
la structure en double hélice de l’ADN par Watson et Crick (Prix Nobel 1962).
Cette découverte très importante ouvre la voie à la compréhension de plusieurs
fonctions cellulaires. On sait dès lors que c’est à partir des gènes portés par l’ADN
que sont synthétisées des molécules qui permettront la vie de la cellule, des tissus
et de l’organisme. Les hormones, les enzymes, les facteurs de croissance et les
fonctions de développement constituent quelques exemples de ces molécules
essentielles de la vie.

3- Biologie Moléculaire : Science particulière

La Biologie Moléculaire diffère de la biochimie par le fait que cette dernière
concerne principalement le comportement chimique des substances biologiques
importantes et de leur analogue. Elle diffère également des autres champs
biologiques par son emphase sur les interactions chimiques particulières entre
autres celles impliquées dans la réplication de l’ADN, sa transcription en ARN et
sa traduction en protéine ; en résumé dans les réactions chimiques reliant le
génotype et le phénotype.

4- Importance de la Biologie Moléculaire

La biologie moléculaire a favorisé l’évolution rapide de diverses techniques
biologiques avec des domaines d’application assez variés.
- En médecine : exemple de la Fabrication de l’insuline, de la lutte contre le
cancer (Cancer génétique).
- En agriculture
- Environnement
- Nutrition
STRUCTURE DES ACIDES NUCLEIQUES

I – Définition
Les acides nucléiques sont des macromolécules comportant des sous – unités
appelées nucléotides.
On distingue deux grands groupes d’acides nucléiques :
- Les acides ribonucléiques (ARN) ;
- Les acides désoxyribonucléiques (ADN). qui sont surtout localisés dans le
noyau.

II – Les Nucléotides

1- Définition
Ce sont des macromolécules formées de 03 composants qui sont les bases (T, A,
G, U, C), les oses (ribose, désoxyribose) et l’aide phosphorique.

a- Les bases

Elles sont classées selon la nature de leur noyau en bases puriques et

pyrimidiques.
- Les principales bases pyrimidiques c’est à dire issues d’un noyau pyrimidine
sont l’Uracile(U), la Cytosine(C) et la Thymine(T).

- Les principales bases puriques c’est à dire dérivées d’un noyau purine sont : la
Guanine(G) et l’Adénine(A).
 b- Les oses
Elles sont de deux sortes : le ribose et le désoxyribose. Ces deux sucres sont des
pentoses dont la structure de base se présente comme suit :

c- L’acide phosphorique
Il est caractérisé par trois fonctions acides. Deux de ces fonctions sont estérifiées
dans les ADN et les ARN. La troisième est libre.

2- Liaisons dans les nucléotides

a- Liaison base – ose
C’est une liaison glucosidique appelée b- osidique. L’association ose – base donne
un nucléoside.

b- Liaison acide phosphorique – ose

Il s’agir d’une liaison ester. Il y a élimination d’une molécule d’eau entre un OH
de l’H3PO4 et un H de la fonction alcool de l’ose.

Fig.
 3- Nomenclature des acides nucléiques
a- Nucléotides à bases pyrimidiques
Le nom des nucléosides se termine par « idine » et celui des nucléotides se termine
par « idylique ».

b- Nucléotides à bases puriques

Le nom des nucléosides se termine par « ine » et celui des nucléotides par
« ylique ».

L’appellation est complétée, si l’ose est un désoxyribose, en faisant précéder

l’abréviation du nucléotide par la lettre « d » dans les deux cas.
Le tableau de la nomenclature des principaux nucléotides est le suivent

Nomenclature des principaux nucléotides

BASE NUCLEOSIDE NUCLEOTIDE ARN ADN

Monophosphate Monophosphate
Adénine Adénosine Acide AMP d- AMP
adenylique
Guanine Guanosine Acide GMP d- GMP
guanylique
Cytosine Cytidine Acide CMP d- CMP
cytidylique
Thymine Thymidine Acide - d- TMP
thymidylique
Uracile Uridine Acide UMP -
uridylique
III- Les acides nucléiques
1- Liaison entre les acides nucléiques
Dans un acide nucléique, les nucléotides sont rassemblés entre eux par des liaisons
esters. Une molécule d’eau est donc éliminée entre OH de l’H 3PO4 et H de la
fonction alcool située en position 3’ de l’ose. Quand l’ H3PO4 présente ses deux
fonctions acides bloquées dans la formation de l’ester, on parle de liaison
phosphodiester. On peut indiquer les lettres a et b pour préciser les liaisons
concernées.
- La liaison phosphodiester « a » correspond à la liaison ester entre l’acide
H3PO4 et le OH en 3’ de l’ose.
- La liaison « b » correspond à la liaison ester entre l’acide H3PO4 et le OH
en 5’ de l’ose.
-
Fig.

2- Sens de lecture d’un acide nucléique

Par convention, l’acide nucléique est lu dans le sens de l’extrémité 5’ extrémité
comportant un groupement phosphate, vers l’extrémité 3’ qui possède un OH
libre.

Exemple : 5’ –AACTTGG-3’

IV- Les Acides Désoxyribonucléiques (ADN ou DNA)

1- Constituants
Ce sont les acides nucléiques faits de 02 chaînes de nucléotides. Les ADN
présentent quelques caractéristiques particulières notamment :
- l’ose : désoxyribose ;
- les bases : sont A, T, G, C soient 2 bases puriques et 2 bases pyrimidiques.

2 - Propriétés caractéristiques de l’ADN

Trois propriétés caractérisent l’ADN :
- la complémentarité
- l’antiparallélisme
 - la forme hélicoïdale

* Antiparallélisme
Les 2 brins de la molécule d’ADN sont disposés dans le sens opposé. L’un est
orienté dans le sens 5’-3’ et l’autre parallèle, s’oriente dans le sens 3’-5.

* Complémentarité
Les 2 brins composant l’ADN sont appariés par des bases. Cet appariement des
bases se fait selon une règle dite de complémentarité : A est appariée à T et C à
G. Cette complémentarité repose sur des raisons structurales et sur la formation
des liaisons hydrogènes. Ces liaisons hydrogènes sont au nombre de 2 entre A et
T, et de 3 entre C et G.

Fig.

* Forme hélicoïdale
Dans l’espace, les 2 chaînes d’une molécule de DNA, présentent une
conformation hélicoïdale. Elles s’enroulent autour d’un axe imaginaire pour
former une double hélice en rotation droite (la forme A et B) ou plus
exceptionnellement à rotation gauche (forme Z).

Fig.
 - Les formes d’ADN
Il existe plusieurs formes d’ADN dont les plus connues sont A, B et Z. La forme
B est la forme biologique la plus importante décrite par WATSON et CRICK. Les
caractéristiques de B sont les suivantes :
• Environ 10 paires de bases par tour de spire
• Le diamètre est de 2,4nm,

3- Priorités physico-chimiques de l’ADN

a- Température de fusion
A une certaine température, les liaisons hydrogènes entre les 2 brins d’un ADN
se rompent et les 2 brins se séparent. On dit que l’ADN est dénaturé. C’est la
fusion de l’ADN caractérisée par une température Tf dite température de fusion.
Cette dénaturation est cependant réversible. Les 2 brins peuvent se réassocier
suivant la règle de complémentarité.

b- Absorption dans l’ultraviolet

Dans l’UV, les bases pyrimidiques permettent de doser l’ADN grâce à leur
pouvoir d’absorption. Généralement l’ADN absorbe à 260 nm. Cette propriété
permet au laboratoire de détecter facilement la présence d’ADN dans un milieu.

c- Hybridation des acides nucléiques et notion de sondes nucléiques

L’hybridation est l’une des propriétés fondamentales des acides nucléiques qui
reposent sur la règle de complémentarité. Il est possible d’apparier les brins
d’ADN avec les oligonucléotides ou les polynucléotides qui reconnaissent
spécifiquement des séquences sur les brins d’ADN de manière antiparallèle et
complémentaire. Ces oligo et polynucléotides sont appelés des sondes et l’ADN
obtenu, est dit hybride.
4 - Chromatine et Nucléosomes
Dans les cellules eucaryotes, la molécule d’ADN est fortement associée à des
protéines pour constituer la chromatine. Les nucléosomes sont constitués
d’environ 200 paires de bases associées à des protéines appelées Histones. Au
niveau des nucléosomes, l’ADN est associé à un octamère d’histones. Le
traitement doux de la chromatine par une endonucléase, libère des particules qui
sont l’ADN, les protéines d’histone et quelques protéines non histones (voir
purification).

II - Les Acides Ribonucléiques : ARN ou RNA

1- Caractéristiques
Les ARN sont des acides nucléiques dont les caractéristiques générales sont les
suivantes :
- Sucre : ribose
- bases : A, U, C, G.
- appariement : les règles d’appariement dans les bases complémentaires
peuvent s’observer aussi au niveau des ARN. En effet dans une même chaîne
d’ARN, des parties peuvent être bicaténaires avec des appariements tels que A=U
et C=G. Ceci donne au niveau de la portion appariée, des sortes de lignes alors
que les régions non appariées présentent des formes en boucle. Ainsi les ARN
peuvent prendre plusieurs formes.

2- Différents types d’ARN

Les cellules contiennent essentiellement 4 types d’ARN :
- les ARNr (ribosomique)
- les ARNt (transfert)
- les ARNm (messager)
- les ARN de petites tailles (sRNA, cytoplasmique).
a- Les ARNr
Ce sont les plus nombreux des ARN. Les ARNr jouent un rôle essentiel dans la
structure et le maintien de l’intégrité des ribosomes en association avec les
protéines ribosomales. Les ribosomes sont des organites situés dans le cytoplasme
et qui constitue l’usine de fabrication des protéines chez les procaryotes et les
eucaryotes. Chaque ribosome comporte 2 sous unités :
- Une grande sous-unité de 50 S (procaryote) ou de 60 S (eucaryote) ;
- Une petite sous-unité de 30 S (procaryote) ou de 40 S (eucaryote).

b- Les ARNt
* Rôle
Leur rôle est essentiel dans la synthèse protéique. Ce sont des vecteurs qui vont
transférer les acides aminés jusqu’à l’usine ribosome où s’effectue la synthèse des
protéines.
* Structure des ARNt
En plus de la structure générale des ARN, les ARNt possèdent des particularités
propres :
- des bases inhabituelles comme l’hypoxanthine dont le nucléotide correspondant
est IMP (Inosine monophosphate), mais aussi la thiamine ou encore des bases
méthylées.
- structure spatiale : chaînes constituées d’une centaine de nucléotides avec des
zones d’appariement et des boucles non appariées. La forme générale est celle
d’une L qui prend la forme de trèfle en structure spatiale.
- des sites importants : on note plusieurs sites dont les plus importants sont :
* l’extrémité 3’-OH portant 3 nucléotides caractéristiques. C-C-A-3’-OH et qui
fixera l’acide aminé qui sera véhiculé par l’ARNt.
* l’anticodon qui correspond à un groupe de 3 nucléotides ou triplet situé sur une
boucle d’ARN. Ce triplet joue un rôle important lors de la synthèse protéique. En
effet, c’est ce triplet qui s’apparie à un autre triplet appelé codon présent sur
l’ARNm. Cet appariement se fait par des liaisons hydrogènes et selon les règles
de complémentarité. Le codon et l’anticodon sont disposés de façon antiparallèle.

Fig.

Il existe naturellement une vingtaine d’acides aminés, mais on dénombre 61

codons différents reconnus et transportés par plusieurs ARNt spécifiques.
- l’extrémité 5’ de l’ARNt comporte un groupement phosphate
e - ARNm
C’est le support essentiel de l’information génétique entre l’ADN et les ribosomes
du cytoplasme où s’effectue la synthèse protéique. Leur durée de vie est très
courte à la différence des ARNt.
Chez la bactérie, la durée de vie d’un ARNm est de quelques minutes.
Les ARNm sont très rapidement synthétisés. Ils sont formés d’une seule chaîne
de nucléotides avec des bases communes aux ARN (A,G,C et U). Cette chaîne
comporte une succession de triplets nucléotidiques et chaque triplet constitue un
codon spécifique d’un acide aminé.

d- Petits ARN nucléaires

Présents dans le noyau, ils sont impliqués dans certaines étapes de la transcription,
c'est-à-dire de la copie de l’ADN en ARNm.
 LA REPLICATION

I – Généralités
Lors de la division cellulaire, quand une cellule mère donne deux cellules filles,
il est essentiel que l’ADN présent dans ces cellules filles soit la copie identique
de l’ADN parental. On parle de réplication de l’ADN.
Ainsi, préalablement à la division cellulaire, la quantité d’ADN est multipliée par
2. Le mécanisme de réplication conditionne donc le déroulement de la division
cellulaire. Ce mécanisme comporte en générale trois étapes : Initiation,
Elongation et Terminaison.

II – Réplication chez les procaryotes

1- Caractéristiques
La réplication est dite semi-conservative c'est-à-dire que sur les deux brins d’ADN
fils on a toujours un qui provient d’un des deux brins de l’ADN parental et un brin
nouvellement synthétisé.

Fig.

A chaque réplication les deux brins d’ADN parental se séparent ; chacun de ces
deux brins sert de matrice pour la synthèse d’un brin qui lui est complémentaire.

2- Eléments nécessaires à la réplication

La réplication d’ADN nécessite :
- Une matrice d’ADN constituée par un brin parental ;
- La présence de nombreuses enzymes : hélicase, ADN polymérases …. ;
- La présence de certains ions comme Mg2+ .
Ces différents éléments interviennent dans le bon déroulement de chacune des
trois étapes de la réplication.

3- Mécanisme d’initiation de la réplication

3-1- Notion de réplicon
L’unité d’ADN où se produit la réplication est appelée réplicon. Ce réplicon a une
origine où est initiée la réplication, et une terminaison où s’arrête la réplication.
A partir d’un point d’initiation, la réplication peut progresser soit d’une manière
unidirectionnelle soit d’une manière bidirectionnelle.
3-2- Initiation de la réplication
Chez E. coli, il existe au niveau de l’ADN, une origine unique de la réplication
appelée Ori C. Ce locus Ori C est constitué d’une séquence de 245 bases. Cette
séquence contient :
- 3 séquences nucléotidiques presque identiques faites de 13 nucléotides
chacune et riches en thymine.
- 4 sites de liaison comportant un motif de 9 paires de bases pour une protéine
appelée dna A qui est une protéine d’initiation de la réplication codée par
le gène du même nom dna A.
Au début de la réplication, des copies de cette protéine s’associent avec l’ADN à
l’origine de la réplication. Ces liaisons nécessitent de l’ATP. C’est une étape
indispensable à la transformation localisée de l’ADN double brin en ADN simple
brin. Ces complexes viennent ensuite fixer l’ADN hélicase ou protéine dna B,
enzyme qui catalyse le déroulement de la double hélice d’ADN en présence
d’ATP. Ce qui définira la future fourche de réplication. Une protéine appelée dna
C est indispensable à cette étape, mais elle sera ensuite relâchée après fixation de
la protéine dna B à la fourche de réplication.
Les brins séparés de l’ADN sont ensuite stabilisés sous forme de simples brins
grâce à la fixation d’autres protéines appelées SSB (Simple Strand Binding).
Il se formera ensuite un complexe appelé Primosome ou protéine dna G entre
l’hélicase et un autre enzyme appelé Primase ; complexe qui synthèse une amorce
d’ARN de 9 bases. Après synthèse de l’amorce, une enzyme dite ADN
polymérase III s’insère au niveau de la fourche de la réplication pour commencer
la synthèse de l’ADN à partir de l’extrémité 3’-OH de l’amorce. Le complexe de
protéine qui se déplacera le long de l’ADN pour catalyser la réplication est appelé
Réplisome.

4- Discontinuité de la réplication et élongation

4-1- Discontinuité
Le déroulement de la réplication n’est pas identique entre les deux brins d’ADN.
En effet sur l’un des deux brins en synthèse, la réplication s’effectue de manière
continue : c’est le brin avancé. Alors que sur l’autre brin, elle est discontinue et
on parle de brin retardé.

4-2- Elongation
Sur le brin avancé, la progression de la réplication se fait dans le sens 5’-3’ en
utilisant comme modèle, le brin d’ADN parental orienté dans le sens 5’-3’.
Sur le brin retardé, de petits fragments d’ADN sont synthétisés : ce sont des
fragments d’Okazaki. Chaque fragment est synthétisé dans le sens 5’-3’. Le brin
modèle correspondant (de l’ADN) est orienté de manière antiparallèle 3’-5’.
*ADNp III et étape d’élongation
L’intervention de l’ADNp III est essentielle dans l’incorporation des nucléotides.
L’ADNp III synthétise un brin complémentaire à partir de l’extrémité 3’-OH de
l’amorce d’ARN, en utilisant les brins d’ADN comme matrice. Cet enzyme
comportant 10 polypeptides, synthétise le brin avancé et les fragments discontinus
sur le brin retardé et toujours dans le même sens 5’-3’.
En résumé, la copie d’un brin parental nécessite donc l’intervention d’une amorce
d’ARN, une synthétase qui synthétise l’amorce d’ARN puis l’ADNp III qui
allonge cette amorce d’ARN pour fabriquer le brin complémentaire d’ADN.

5- Hydrolyse et remplacement des amorces d’ARN

Ce mécanisme est caractérisé par l’intervention d’une ADN polymérase appelée
ADNp I. Les amorces d’ARN sont ensuite détruites et hydrolysées par
l’intervention d’un enzyme appelé RNase H.
Les lacunes engendrées par l’RNase H sont comblées par l’ADNp I. Finalement
les fragments d’ADN deviennent contigus et soudés les uns aux autres grâce à un
enzyme appelé DNA ligase.
Notons que l’ADNp I est aussi capable d’hydrolyser les amorces d’ARN.

6- Remarques générales sur la fonction des ADN polymérases

Les ADNp présentent plusieurs fonctions enzymatiques :
- Fonction polynucléasique permettant de constituer la chaîne
polynucléotidique, l’enzyme ajoute les nucléotides à l’extrémité 3’-OH
d’un acide nucléique.
- Fonction exonucléasique 3’-5’ : elle permet de vérifier les derniers
nucléotides mis en place. En cas d’un défaut d’appariement, elle enlève ce
dernier nucléotide et insère le nucléotide correct ; ce mécanisme capital est
appelé fonction d’édition des ADNp. Il permet la correction d’erreurs au
cours de la réplication.

7- Terminaison de la réplication
Il existe plusieurs sites de terminaison dans le génome bactérien. Une protéine
spécifique appelée Tus, se lie au site de terminaison. Cette liaison arrête la
protéine hélicase en même temps que la réplication.

III – Réplication de l’ADN chez les Eucaryotes

1- Caractéristiques générales
La réplication est en général comparable à celle des ADN procaryotes. Elle est
bidirectionnelle, discontinue, complémentaire, antiparallèle et se fait dans le sens
5’-3’. Elle utilise également les amorces d’ARN.

2- Caractéristiques particulières
• La réplication chez le Eucaryotes se fait en de nombreux points d’initiation.
Elle fait intervenir un nombre d’ADNp plus important et de nombreuses
protéines comme facteurs de réplication.
 • Il existe au moins 05 ADNp chez les Eucaryotes qui sont ADN alpha, β,
gama, Δ, et epsilon.
• L’ADN simple brin au cours de la réplication est stabilisé par des protéines
SSB particulières.
• Les télomères : ce sont des extrémités des chromosomes d’eucaryotes
formées des séquences répétitives.
- A l’extrémité 3’ des chromosomes, on trouve des copies répétées de
séquences de type TTGGGG ou TTAGGG.
- A l’extrémité 5’, on a les séquences complémentaires riches en cytosine.
Ainsi, la réplication de l’ADN à l’extrémité des chromosomes eucaryotes fait
donc intervenir un enzyme spécifique : la Télomérase. Cet enzyme ajoute des
séquences spécifiques en 3’-OH des brins d’ADN. Il assure également la
protection de ces extrémités chromosomiques.

Figure résumé.
 LA TRANSCRIPTION

I – Généralités
La transcription constitue l’ensemble des mécanismes par lesquels l’ARNm est
synthétisé. L’ARNm est une copie d’une portion d’ADN.
Seules certaines parties de l’ADN sont transcrites. Ces séquences d’ADN sont
appelées des gènes.
Seul l’un des deux brins de l’ADN est copié en ARNm.
La transcription constitue l’étape préliminaire essentielle pour la biosynthèse des
protéines.

II – Caractères généraux
1- Règles de base
La synthèse d’un ARNm à partir d’une ADN s’effectue toujours :
- dans le sens 5’-3 de l’ARNm en synthèse
- de manière antiparallèle par rapport à la portion d’ADN copiée.
- de façon complémentaire c'est-à-dire G - C et A - U.

2- Eléments nécessaires
La synthèse d’ARNm nécessite :
- La présence de nucléotides propres aux ARN c'est-à-dire contenant des
bases A, C, G, U ;
- La présence d’un sucre : le ribose ;
- La présence d’ARNp et des sels de Mg2+ ;
- La présence d’une matrice d’ADN servant de modèle : on parle d’ARN
polymérase – ADN dépendant.

III – Différentes étapes de la transcription

La transcription ne concernant qu’une portion de l’ADN, il faut déterminer son
début et sa fin, puis préciser les mécanismes par lesquels l’ARNp reconnaît la
portion d’ADN à transcrire. On parle d’unité transcriptionnelle. La synthèse de
l’ARNm comprend trois phases : l’initiation, l’élongation et la terminaison.

1- Initiation
a- Généralités
Par convention, on donne le chiffre +1 au 1er nucléotide à partir duquel commence
la transcription, puis le chiffre –1, au nucléotide qui le précède. Le signal pour
initier une transcription correcte est appelé Promoteur. Ce promoteur est situé en
avant et au début de la zone où commence la transcription.

b- Promoteur des gènes procaryotes

Ils sont généralement situés en 5’ du site +1 d’initiation. Ces promoteurs ne sont
pas donc transcrits. Dans la plupart des cas, les séquences nucléotidiques des
promoteurs sont courtes et assez similaires. Deux de ces séquences sont
remarquables :
- Une première située entre -30 et -35 paires de bases en avant de l’origine
de la transcription. On l’appelle séquence -35, constituée de six paires de
bases.
- Une deuxième séquence dite séquence -10 située à environ dix nucléotides
par rapport à l’origine de la transcription +1.

Fig.

5’ TTGACA TATAAT II +1 3’
3’ AACTGT ATATTA 5’
- 35 - 10

c- ARNp des procaryotes

L’ensemble des ARN est synthétisé par l’ARNp chez les procaryotes. Cet enzyme
reconnaît les sites promoteurs, puis se positionne sur ces sites. Il recouvre une
région située entre les positions -60 et +20. Dès lors placée sur cette région,
l’ARNp protège l’ADN de l’action d’autres enzymes.
Chez les eucaryotes l’initiation est plus complexe.

2- Elongation
a- Mécanisme
La progression de la transcription se fait par formation de la liaison entre les
nucléotides. Les nucléotides à ajouter sont sous formes de nucléosides
triphosphates riches en énergie. Chaque nucléoside forme une liaison ester par
extrémité 5’ avec l’extrémité 3’ de l’ARN en cours d’élongation. Le 1 er nucléotide
comporte toujours une base purique. Ce 1er nucléotide va conserver son
groupement triphosphate. La progression de la transcription se fait dans le sens
5’-3’ de l’ARN en synthèse.

Fig. rechercher dans la bibliographie.

Au fur et à mesure qu’elle se réalise, les 2 brins d’ADN se séparent et un seul brin
est copié. L’ARN formé, initialement apparié au brin d’ADN, se détache par la
suite. La liaison hydrogène des brins d’ADN se forme après passage de l’ARNp.
Puis les 2 brins de l’ADN matrice reprennent leur forme hélicoïdale.

Fig. rechercher dans la bibliographie.

b- Identification de brins
Considérons la séquence d’ADN suivante comme matrice :
+1
5’ AGCTTAACGCGTA 3’
3’ TCGAATTGCGCAT 5’

Le chiffre +1 ci-dessus sur la base A, désigne le site d’initiation, c’est la 1ère base
transcrite.
Au cours de la transcription et dans le cas d’une ARNp progressant dans le sens
gauche - droit sur la séquence ci-dessus, l’ARNp synthétisera un ARNm dans le
sens 5’-3’ ; ce qui signifie que la séquence d’ARNm commerce par A soit

5’ –AACGCGUA- 3’

Par définition,
- le brin d’ADN qui a le même sens que l’ARN est appelé brin sens.
- Le brin d’ADN opposé est nommé brin non-sens ou brin antisens.
Le brin sens est aussi dit non transcrit c'est-à-dire qu’il ne sert pas de brin matrice
de lecture de l’ARNp. Par contre le brin d’ADN orienté 3’-5’ est appelé brin
transcrit.
Par référence à la synthèse protéique, on parlera de brin non transcrit (sens) ou
brin codant et de brin transcrit ou non codant.

Considérons une autre séquence d’ADN suivante :

5’-GCAATCG-3’
3’-CGTTAGC- 5’

Si l’ARNp progresse dans le sens gauche - droit, le brin sens est constitué par le
brin 5’-3’. Par contre si l’ARNp progresse dans le sens droit - gauche, le brin sens
est 3’- 5’.

3- Terminaison
L’arrêt de la transcription s’effectue par l’intervention des signaux de fin de
transcription.
Les signaux formés par les séquences de polyadénylation de type 5’AATAAAA3’
sur le brin sens annoncent la terminaison de la transcription chez les eucaryotes.
L’ARNp reconnaît ce signal sur l’ADN mais poursuit la transcription. Dans ces
conditions les produits primaires de la transcription. Dans ces conditions les
produits primaires de la transcription sont appelés transcrits primaires
Chez les procaryotes la terminaison est caractérisée par un site dit Terminateur. Il
apparaît à l’extrémité de l’ARNm, des boucles qui déstabilisent la liaison ARNp
et matrice d’ADN.

Fig. rechercher dans la bibliographie.

4- Produits de la transcription
Ces produits peuvent être principalement :
- ARNm qui sera traduit en protéine et peut être polycistronique c'est-à-dire
pour plusieurs chaînes polypeptidiques (Procaryotes) avec un ARNm issu
de plusieurs gènes) ou monocistronique (Eucaryotes).
- ARNt, ARNr, sARN.

IV- Modifications Post-transcriptionnelles chez les procaryotes

Après la synthèse de l’ARN, ARNm sort de l’ADN et du noyau pour le
cytoplasme. Les cassures réalisées au niveau de l’ADN matrice sont comblées et
réparées par les ADNp I ou II et les ligases.

Fig. rechercher dans la bibliographie.

Après la synthèse protéique, les ARNm sont rapidement dégradés. La

dégradation des ARNm bactériens est réalisée par la combinaison des fonctions
d’endo et d’exonucléases. Les clivages par les endonucléases s’effectuent dans le
sens 5’-3’ et en arrière des ribosomes qui assurent la traduction protéique. Les
fragments seront ensuite dégradés par les exonucléases qui travaillent dans le sens
3’-5’.

Fig. rechercher dans la bibliographie.

V- Modifications post-transcriptionnelles chez les eucaryotes

Chez les eucaryotes on a 03 groupes d’ARNp :

- ARNp I : qui transcrit les ARNr
- AAARNp II : qui transcrit les précurseurs des ARNm appelés transcrits
primaires.
- ARNp III : qui transcrit les ARNt
Ces 03 ARNp sont des protéines constituées de sous-unités et ont besoin de
facteurs multiples pour se positionner au point de départ (+1) au niveau des gènes.
1- Structure des gènes eucaryotes
Chez les eucaryotes les gènes possèdent une structure discontinue comportant
des sous-unités appelées Exons et Introns.
* Les exons sont des séquences d’ARN qui seront traduites en protéine.
* Les introns sont des séquences non traduites intercalées par les exons.

2- Unité de transcription et transcrit primaire

a- Définition
On appelle unité de transcription, un ensemble comportant une origine ou point
de départ de la transcription +1 et un point de fin de transcription ou site de
terminaison. Elle va donc de la 1ère base transcrite à la dernière base transcrite.
L’ARNm correspondant s’appelle Prè-ARNm ou transcrit primaire (eucaryote).
Ce pré-ARNm comprend outre les exons et les introns, des régions extrêmes non-
traduites appelées UTR (Untranslated region) : 5 UTR et 3’ UTR.
Le schéma général se présente comme suit :

b- Structure détaillée et sites de Pré-ARNm

Au niveau du transcrit primaire, les séquences de bases d’un intron commencent
par GU et se terminent par les bases AG. L’exon d’amont se termine par CAG
ou AAG et l’exon d’aval par G ou A.
Le transcrit primaire comporte 02 sites appelés site d’épissage : le site 3’-OH et
le site 5’P. Ces sites sont respectivement receveurs et donneurs d’électron lors de
la maturation de l’ARNm.
D’autres sites dits régulateurs assurent la régulation de cette maturation. En amont
du site 3’-OH d’épissage entre 20 et 30 nucléotides, se trouve un autre site appelé
site de branchement A, qui joue un rôle important dans les mécanismes d’excision
– épissage.

Fig. rechercher dans la bibliographie.

3- Les modifications du transcrit primaire

a- Addition de la coiffe
La coiffe est une macromolécule indispensable ajoutée à l’ARNm pour la
protection contre l’attaque des enzymes de dégradation.

b- Addition des poly A à l’extrémité

La présence de poly A à l’extrémité 3’-OH aurait également une fonction
protectrice des ARNm.

c- Excision – épissage
L’excision-épissage est un mécanisme qui permet la maturation du transcrit
primaire en ARNm. Il se déroule dans le noyau des cellules eucaryotes.
* Mécanisme
L’excision-épissage fait intervenir deux réactions de tranestérification.
Considérons le schéma suivant :

5’ 3’ A 5’ 3’
5’ 3’
Exon 1 2’-OH Exon 2
Intron

Deux grandes étapes caractérisent les mécanismes d’excision – épissage.

- Etape 1 : Clivage en 5’ de l’intron et formation d’un boucle appelé Lasso.

E1 E 2A’

- Etape 2 : Clivage en 3’ de l’intron, il y a simultanément soudure des deux

exons avec formation d’une liaison phosphodiester entre 3’- OH de l’exon
1 et 5’ –P de l’exon 2 ; puis libération de Lasso qui sera ensuite dégradé.
L’exclusion des introns détermine la maturation des pré-ARNm en ARNm.

• Intervention des SnARN

Les SnARN s’associent aux facteurs ribonucléoprotéiques (RNP) pour donner le
complexe SnRNP. Ce complexe va se fixer au niveau de l’intron à éliminer. Il se
forme ainsi un autre complexe appelé Splicéosome nécessaire pour un
déroulement correct du mécanisme de l’excision – épissage.

VI – Contrôle de la transcription et régulation post – transcriptionnelle

1- Contrôle de la transcription

La transcription étant un mécanisme assez complexe, des erreurs peuvent

apparaître. Ainsi un système de contrôle est mis en marche depuis l’étape
d’initiation jusqu’à l’étape de la terminaison. Ce système est constitué en général
des protéines appelées Facteurs de Transcription (TF) qui s’associent à chaque
étape, aux différentes structures de transcription. Exemples : TF II –A ; TF II –D.
 2- Régulation post – transcriptionnelle
Elle est assurée par un système de régulateur composé de protéines dites
régulatrices. Ces protéines sont caractérisées par :
- leur situation à proximité du promoteur
- leur interaction avec les protéines fixées sur le promoteur
- leur variation d’un gène à l’autre.
Ces protéines ne peuvent se rencontrer très en amont ou en aval d’un site
d’initiation. On distingue deux grands groupes, le groupe des cis –régulateurs et
le groupe des trans – régulateurs. L’association des deux groupes de facteurs de
régulation joue un rôle quantitatif important dans la synthèse des ARNm.

a- Régulation quantitative
• Epissage alternatif
Une cellule peut épisser le pré – ARNm de diverses façons pour donner plusieurs
protéines différentes à parti d’un seul gène. Ce processus est appelé épissage
alternatif ou différentiel, et l’exon éliminé est dit optionnel.

• Edition
La correction d’un ARN concerne tout traitement par addition, suppression ou
substitution d’un ou plusieurs nucléotides aboutissant à la formation d’un ARNm
dont la séquence diffère de celle du brin d’ADN lu au cours de la transcription.
On distingue :
- Edition par insertion d’une base et décalage du cadre de lecture.
- Edition avec changement d’un codon ou triplet (substitution) .

b- Régulation qualitative
Elle fait intervenir les facteurs régulateurs de :
- la stabilité de l’ARNm : cette stabilité peut être très variable et conditionne
la durée de vie de l’ARNm.
- Stockage de l’ARNm.
 TRADUCTION ET CODE GENETIQUE

I – Le Code Génétique
A – Définition
Le code génétique correspond à l’enchaînement ordonné de trois bases (triplet)
permettant de déterminer le code d’un acide aminé. Ce codage c'est-à-dire
"séquence nucléotidique" correspond à séquence protéique, est assuré par un
système de traduction présent dans le cytoplasme. Il faut noter qu’il existe dans la
nature 20 acides aminés et 04 bases susceptibles de former des codons. La
combinaison des bases donne 43 = 64 triplets. Ainsi un acide aminé peut être
déterminé par plus d’un triplet.

B- Caractéristiques principales
1- Code génétique défini par trois lettres
Sur 64 codons disponibles 03 ne peuvent pas être traduits en acides aminés et sont
appelés codons non – sens ou codons stop. Il s’agit de : UAA, UAG et UGA.

2- Code universel
Le code génétique est le même dans tous les organismes vivants à quelques
exceptions près.

3- Code génétique dégénéré

Un même acide aminé peut être codé par plusieurs codons. Dans beaucoup de cas,
les triplets nucléotidiques codant pour un même acide aminé ne diffèrent que par
la troisième base.
 4- Code génétique non chevauchant
La partie exprimée en protéine d’un ADN est transcrite en ARNm, puis traduite
triplet pat triplet selon un ordre bien précis. Les triplets nucléotidiques sont lus
d’un point de départ jusqu’à un point de terminaison et ceci sans chevauchement.

a- Notion de cadre de lecture (RF)

Considérons l’exemple suivant :

1 2 3 4 5 6 7 8 9
ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG

* Première façon de lecture : ACG ACG ………………. ACG (9)

* Deuxième façon de lecture : CGA CGA ……………… CGA (8)
* Troisième façon de lecture : GAC GAC ……………… GAC (8)
Il y a donc trois cas de lecture possibles pour cet exemple.

b- Cadre ouvert de lecture (ORF)

C’est un cadre de lecture fait exclusivement de triplets représentant les acides
aminés.

c- Séquences traduites en protéines

C’est un cadre portant un codon d’initiation généralement AUG (méthionine) et
un codon de terminaison.

d- Cadre de lecture bloqué

C’est un cadre qui ne peut être lu et traduit en protéine car riche en codons stop.

C- Les adaptateurs de synthèse protéique

Il s’agit des aminoacyl- tRNA qui jouent un rôle important dans la traduction.

1- Synthèse des aminoacyl – ARNt

Cette synthèse se fait en deux étapes en présence de l’ATP et de l’aminoacyl –
synthétase.

activation
E1 : acides aminés + ATP aminoacyl – AMP + 2Pi

Aminoacyl – synthétase
E2 : aminoacyl – AMP + ARNt aminoacyl – ARNt + AMP
 2- Fonction d’édition des aminoacyl – synthétase
Cet enzyme reconnaît d’une part les bons acides aminés et d’autre part les tRNA
correspondant. Il intervient donc dans les deux réactions précédentes et peut jouer
le rôle de correcteur dans le cas de 02 acides aminés à structure proche.

II – Traduction

A- Localisation et éléments nécessaires

La traduction s’effectue dans le cytoplasme au niveau des ribosomes et en
présence d’autres éléments nécessaires pour la synthèse de la chaîne
polypeptidique. Ces éléments sont les acides aminés, l’ARNm, l’ARNt, les
aminoacyl – tRNA – synthétase, les peptidyl – synthétases.

*ARNm : Il est porteur du message de l’ADN et indique par un codage

nucléotidique, l’ordre des acides aminés dans la future chaîne polypeptidique.
* ARNt : ce sont des adaptateurs entre les ARNm et les acides aminés. Ils
transportent les acides aminés par leur extrémité 3’-OH et possèdent l’anticodon
permettant de reconnaître les codons correspondants sur l’ARNm.

B- Différentes étapes de la traduction

Il y a trois étapes : Initiation, Elongation et Terminaison.
Notons que la synthèse protéique se déroule de l’extrémité N- terminale à
l’extrémité C- terminale du polypeptide en synthèse.
Les ribosomes lisent l’ARNm dans le sens 5’-3’. La synthèse se déroule avec des
polysomes. Chaque ribosome réalise sa propre synthèse protéique en décodant
l’ARNm. Chaque ARNm peut être décodé par plusieurs ribosomes à la fois.

1- Initiation
L’ARNm porte le codon initiateur en 5’-P, généralement le codon AUG codant
pour la méthionine. Toutes les chaînes polypeptidiques commencent alors par la
méthionine. Ainsi chez les procaryotes comme chez les eucaryotes, l’initiation
nécessite la reconnaissance du codon AUG et la présence de ribosome.
Au début de l’initiation de la traduction, les deux sous – unités du ribosome se
dissocient, puis la petite sous – unité forme au niveau du codon initiateur, un
complexe avec l’ARNm et l’ARNt portant la formyl –méthionine (procaryote) ou
la méthionine (eucaryote).

Fig. Rechercher dans la bibliographie.

La grande sous – unité viendra par la suite s’ajouter à cet ensemble. Les ribosomes
possèdent deux sites de fixation des ARNt :
- Un site A où se fixe l’ARNt porteur des acides aminés.
- Un site P pour l’ARNt porteur de la chaîne peptidique en cours
d’élongation.

Fig. Rechercher dans la bibliographie.

2- Elongation
Elle comprend trois étapes permettant d’accrocher les acides aminés les uns aux
autres par des liaisons peptidiques grâce aux peptidyl – synthétases.

• Etape1 : Accrochage d’un aminoacyl – tRNA

Un deuxième aminoacyl – tRNA vient se fixer sur le site A, le codon situé après
le codon initiateur détermine l’anticodon qui va se fixer, c'est-à-dire l’aminoacyl
– tRNA.

ARNm 5’ 3’

• Etape 2 : Formation des liaisons peptidiques

Elle commence par la rupture de la liaison entre la méthionine et le premier ARNt.
Ce dernier est éjecté du ribosome, puis il y a formation d’une liaison peptidique
grâce à une peptidyl – transférase, entre le groupement carboxylique de l’acide
aminé N°1 (méthionine) et le groupement amine de l’acide aminé N°2.

ARNm 5’ 3’
A la fin de cette phase, on a la formation d’un dipeptide est logé dans le site A, le
site P est alors libre.

5’ 3’

• Etape3 : Translocation
Le ribosome se déplace d’un cran sur l’ARNm dans le sens 5’-3’ d’une distance
de 03 paires de base. Ceci correspond à un déplacement de trois nucléotides. Un
nouveau codon (codon 3) est placé en face du site A des acides aminés ; et le
mécanisme recommence.
La répétition de ce mécanisme, allonge la chaîne peptidique et conduit à l’étape
de terminaison.

5’ 3’

3- Terminaison
La traduction est terminée quand le ribosome se déplaçant, se trouve en présence
d’un des trois codons stop sur l’ARNm. Ces trois codons ne codant pour aucun
acide aminé, il n’y a donc pas d’ARNt correspondant. Il se produit une rupture
entre le dernier ARNt et le dernier acide aminé de la chaîne polypeptidique. Puis
une molécule d’eau viendra former avec l’extrémité C terminal, le COOH de la
nouvelle protéine.

5’ 3’

C – Intervention des facteurs de régulation

La synthèse peptidique fait intervenir des facteurs protéiques essentiels pour le
déroulement correct des étapes.
Au niveau de l’initiation on a les facteurs d’initiation appelés IF (Initiation
Factors) pour les procaryotes ou eIF pour les eucaryotes.
Au niveau de l’élongation on a les EF (Elongation Factors) pour les procaryotes
et les eEF pour les eucaryotes.
Au niveau de la terminaison on a les RF pour les procaryotes et les eRF pour les
eucaryotes.
Notons l’existence des ARNt dits suppresseurs capables en cas d’erreurs, de
supprimer les effets de certaines mutations. Ces tRNA sont aussi capables de
supprimer des codons stop apparus prématurément et susceptibles d’arrêter la
traduction et permettent ainsi d’éviter la synthèse de protéines raccourcies.
 OUTILS ENZYMATIQUE DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE
LES ENZYMES DE RESTRICTION

1-GENERALITE
La révolution technologique du début des années 70 a été fortement marquée par
la notion et l’utilisation des enzymes de restriction. Cette utilisation a ouvert la
voie à une exploitation technologique du matériel génétique (clonage,
séquençage…). On assiste dès lors à une évolution importante du concept de gène
et de la notion de polymorphisme. C’est en fait le début de l’ère des
biotechnologies avec l’usage sous forme purifiée de courtes séquences
nucléotidiques directement analysables, rendu possible grâce à la caractérisation
d’endonucléases sites-spécifiques nommées enzymes de restriction ou
endonucléases de restrictions ou ciseaux moléculaires.

Ces enzymes de restriction sont en fait, des outils utilisés au laboratoire pour
cliver les ADN. La coupure se fait en un site particulier reconnu spécifiquement
par un enzyme et appelé site de restriction. Très nombreuses, ses enzymes sont
capables de cliver les liaisons phosphodiesters entre deux nucléotides à l’intérieur
d’un acide nucléique.

Examples: Eco RI, Sma I.

.2- Séquences d’ADN Reconnues par les Enzymes de Restriction

Les séquences reconnues par les Enzymes de restriction sont souvent des
séquences dites palindromique. Ce sont des séquences où la succession des
nucléoniques lus dans le sens 5’ – 3’ pour le premier brin est identique à la
séquence lue dans le sens droite-gauche pour le second brin.
Exemple :
5’CCGG3’
3’GGCC5’
.
3- Fréquence théorique des sites de restriction
Les séquences palindromiques son généralement constitué de 4 à 6 paires de bases
et sont rencontrées dans l’ADN avec une fréquence donnée. En général, la
fréquence de coupure d’un ADN par un enzyme de restriction, peut être estimée
statistiquement en considérant le nombre de nucléotide de la séquence spécifique
reconnue par cet enzyme et/ou la fraction GC du DNA.
Ainsi, en ne considérant que le site de restriction :
F = 1/4n ; avec n, le nombre de nucléotide de la séquence spécifique
Exemple : la séquence GATC reconnue par l’enzyme de restriction Mbo I est
présente avec une fréquence statistique de 1/44 soit 1/256.
 En prenant en considération le nombre de nucléotides de la séquence spécifique
reconnue par cet enzyme et la fraction GC du DNA, on estime que la probabilité
P de rencontrer un site est :
P= p² (1-p)²/2n
P: fraction GC
1-p : Fraction AT
n: le nombre de nucléonique de séquence spécifique
L’inverse de cette probabilité représente la distance moyenne entre 2 sites pour
cette enzyme dans cet ADN
Exo : On considère un DNA contenant 40% de GC et 2 ER Sau3AI (GATC) et
BamHI (GGATCC).
1- Calculer la probabilité de rencontre chaque site sur ce DNA
2- Déterminer la distance moyenne entre 2 sites de chacune des ER.

La distance moyenne entre les sites prédit comment est centrée la distribution des
tailles réelles des fragments. En réalité l’analyse est purement probabilistique car
la distribution des bases n’est pas toujours régulière ; de plus pour des raisons de
mutation et réparation, certaines séquences ne sont pas présentes aussi
fréquemment qu’il est prédit par les analyses statistiques.
4.- Origine des Enzymes de Restriction
Les enzymes des restrictions sont extraites de microorganismes en particulier des
bactéries, et le plus souvent des bactéries parasitées par des virus à ADN. Une
souche peut porter jusqu’à une dizaine de ER. Ces enzymes servent à cliver les
ADN étrangers comme ceux des virus en reconnaissant de courtes séquences de
nucléotides qu’elle hydrolyse en présence de Mg2+.

5 – Nomenclature des Enzymes de Restriction

Le nom d’un enzyme de restriction comporte des lettres et est lié à la bactérie
sources.
- La première lettre est écrite en majuscule et correspond au genre de la bactérie
source.
- La seconde et la troisième lettre écrites en minuscules, correspondent à l’espèce
de la bactérie source.
- Une probable quatrième lettre écrite en majuscules, est en rapport avec la souche
bactérienne.
- Un chiffre romain vient indiquer l’ordre de caractérisation de l’enzyme de
restriction.

Exemples : voir tableau

.
6- Types de coupures réalisées par les enzymes de restriction
Les enzymes de restriction coupent l’ADN autant de fois qu’il y a de sites de
restriction leur correspondant. L’ADN est donc découpé en fragments de taille
variable. D’où l’importance de ce type d’outil enzymatique dans les techniques
biologiques.
Les enzymes de restriction peuvent donner deux types de coupure selon la forme
des bouts obtenus :
- Coupure à bout franc : coupure en milieu de la séquence palindromique.
- Coupure à bout collant ou à extrémité adhésive qui se fait de part et d’autre
d’un centre de symétrie imaginaire.

On peut considérer ici les exemples de HaeIII, et de EcroRI

Exemple 1 : Coupure de l'ADN double brin par HaeIII, générant des extrémités
franches.
Hea III est une enzyme de restriction produite par Haemophilus aegypticus. Le
site de liaison à l’ADN est formé de quatre paires de nucléotides 3’CC/GG 5’
 Lorsque l’hydrolyse des liaisons phosphodiesters se fait au centre de symétrie du
palindrome, toutes les paires de nucléotides restent appariées : les fragments qui
en résultent sont dits « à bouts francs.

Exemple 2 : Coupure de l'ADN double brin par EcoRI, générant des extrémités
cohésives.

EcoR I est une enzyme de restriction produite par Escherichia coli, souche R.
Le site de liaison à l’ADN est formé de six paires de nucléotides 5’G/AATTC 3’
Lorsque l’hydrolyse des liaisons phosphodiesters se fait loin du centre de symétrie
du palindrome, certaines paires de nucléotides restent non appariées. Les
fragments qui en résultent sont dits « à bouts collants ou à extrémités cohésives».

7 – Classes des Enzymes de Restriction

Les enzymes de restriction sont groupés en trois classes (I, II, III) selon la position
du site de coupure par rapport au site de reconnaissance.
7.1 – Enzymes de type I
Ils coupent non pas au niveau de la séquence de reconnaissance, mais 1000 à 5000
pb plus loin.
7.2 Enzymes de type II
Ils sont caractérisés par un site de reconnaissance identique ou proche du site de
coupure. Ce groupe est le plus utilisé au laboratoire à cause des propriétés
suivantes :
- L’attaque endonucléolytique a lieu dans la séquence reconnue ou à une distance
proche du site (moins de 25 pb)
- Les fonctions d’endonucléase et de méthylation sont dissociables car portées par
des protéines distinctes ; on peut purifier et utiliser les deux enzymes
indépendamment.
- Les extrémités générées peuvent être cohésives ou franches; la coupure laisse
une extrémité 3’OH et une extrémité 5’P ; extrémités qui sont des substrats de
ligases. Cette dernière propriété est intéressante pour la manipulation des gènes.
Exple : EcoRI, HaeIII,…..
7.3- Enzymes de type III
Leur site de reconnaissance est séparé du site de coupure par une vingtaine de
nucléotides au moins.
.8- Inactivation des Enzymes de restriction et Méthylation
L’ADN bactérien présente des sites de restriction repérables par les enzymes de
restriction que possède la bactérie. Pour éviter une autodestruction, la bactérie fait
intervenir ses enzymes de restriction que possède la bactérie. Pour éviter une
autodestruction, la bactérie fait intervenir ses enzymes de modification de l’ADN
qui sont souvent des méthylases. Ces enzymes reconnaissent le même site que
l’ER et lient de façon covalente un groupement méthyle aux résidus adénine et
guanine de la séquence cible. Cette méthylation peut se réaliser sur une ou
plusieurs bases appartenant à un site de restriction. Ce qui entraine l’inactivation
du site.
La méthylation ne modifie pas les propriétés d’appariement des bases, mais fait
saillit dans l’un des sillons de l’hélice, empêchant ainsi l’ER de s’associer à
l’ADN; le chromosome devient alors résistant. On parle de systèmes de
Restriction/modification(RM).
Exemple de EcoR I

Fig.: Systèmes de restriction et de méthylation.

Considérons par exemple l’enzyme de restriction Hind III reconnaissant la

séquence spécifique palindromique suivante :
5’AAGCTT 3’
3’TTCGAA 5’
La méthylation de l’adénine ou de cytosines aboutit à une absence de
reconnaissance de ce site (A/AGCTT) spécifique par Hind III et donc à une
absence de coupure enzymatique.
L’ADN, d’une bactérie ainsi méthylé, n’est pas hydrolysé alors que l’ADN
parasite qui n’est pas méthylé sera hydrolysé.
Exo : décrire les résultats de l’action de Hind III avant et après la méthylation.

.9 – Utilisations des Enzymes de Restriction

Les utilisations des enzymes de restriction sont très nombreuses en biologie
moléculaire, en génie génétique, en biotechnologie etc. ………. On peut citer
quelques exemples
- Electrophorèse
Les enzymes de restriction permettent la fragmentation de l’ADN pour séparation.

Fig.: Gel d'agarose des produits de digestion d'un fragment de 5kb par deux
enzymes de restriction.
La figure au-dessous montre la digestion d'un fragment d'ADN de 5 kb par deux
enzymes de restriction (BamHI et EcoRI).

- Utilisation des ER de restriction pour établir la mappe de restriction

Fig. 7: Les différentes possibilités de localisation des sites de restriction des deux
enzymes (EcoRI, et BamHI).

-Insertion et transfert de gènes

Préparation des fragments d’ADN d’un gène destiné à être inséré dans vecteur
pour un transfert
-Recherche de mutation dans un génome
-Recherche des méthylations de bases dans l’ADN
Elle concerne des cellules eucaryotes. En effet, ces méthylations provoquent
parfois le verrouillage de l’expression des gènes dans un tissu. Les méthylations
concernent généralement les cytosines impliquées dans les doublets
nucléotidiques CG.
En pratique, la recherche de ces doublets et de la présence ou non d’une
méthylation sur les cytosines est réalisée à l’aide de deux enzymes de restriction,
une insensible et l’autre sensible à cette méthylation. Exemple de Msp I insensible
et de Hpa II sensible.
Des notions sont à retenir pour maitriser l’utilisation des enzymes de restriction
notamment la notion d’enzymes compatibles et la notion d’isoschizomère .

.9.1-Notion d’enzymes compatibles

C’est une notion importante dans l’utilisation des enzymes de restriction. Deux
enzymes sont dites compatibles si elles génèrent, après digestion, des fractions
aux extrémités cohésives complémentaires. Ces fragments peuvent être
facilement ligaturés.
Exemple 1 : BamH I et BgtII (fig)
*Exemple 2 : Bam HI (G/GATCC) et Mbo I (/GATC
Considérons les fragments suivants reconnus et digérés respectivement par Bam
HI et Mbo I.

Action de Bam HI
5’ GGATCC 3’ 5’ G 3’ + 5’ GATC 3’
3’ CCTAGG 3’ 3’ CCTAG 5’ 3’ G 5’
Action de Mbo I
5’ AGATCAGC 3’ 5’ A 3’ + 5’ GATCAGC 3’
3’ TCTAGTCG 5’ 3’ TCTAG 5’ 3’ TCG 5’
Exo : Quels sont les fragments à bouts cohésifs ?

.9.2 – Les Isoschizomères

Ce sont des enzymes de restriction qui reconnaissent la même séquence
nucléotidique, mais les fragments obtenus après leur action, ont des extrémités
différentes.
*Quelques exemples
- les enzymes de restriction Kpn I (GGTAC/C ) et Acc 65 I (G/GTACC) agissent
sur la séquence GGTACC.
Exo : Décrire les résultats obtenus. Conclure.
-Les enzymes Msp I (C/CGG) et Hpa II (CC/GG) reconnaissent et agissent sur la
séquence CCGG.
Exo : Décrire les résultats obtenus. Conclure. -
Notons que Msp I est insensible à la méthylation et permet donc d’étudier les
séquences CG dans un génome ; alors que Hpa II qui est son isoschizomère est
sensible à la méthylation des cytosines.

9.3 – Polymorphisme de restriction

C’est la variation individuelle d’une séquence de DNA par des modifications de
longueur de fragment de restriction. Ainsi, suite à l’électrophorèse, on observe un
polymorphisme de longueur des fragments de restriction connu sous l’abréviation
R F L P (Restriction Fragment Length Polymophism).
Le profil électrophorétique obtenu avec une enzyme de restriction donnée montre
des différences individuelles dans la taille des fragments de restriction.
Exemple chez l’homme : polymorphisme Msp I et gène de l’apoA-II
Il existe un polymorphisme dans le gène de l’apolipoprotéine A-II. Lorsqu’on
digère le DNA (gène apo AII) génomique de plusieurs individus choisis au hasard,
on obtient des fragments de tailles différentes entre chaque point de coupure par
l’enzyme.
La plupart des sujets (81%) qui possèdent trois sites de coupure autour du gène
donnent un fragment de 3000 paires de nucléotides (3,0kb).
D’autres sujets, plus rares (19%) qui ne possèdent pas le site de restriction ont un
fragment plus grand = 3700 paires de nucléotides (3,7kb).
9.4. Cartes de restriction
Une carte de restriction est une représentation situant les positions des ER ou
marqueurs génétiques.
Les ER peuvent caractériser les DNA responsables des maladies héréditaires
grâce aux cartes de restriction. La DNA du malade est digéré par de nombreuses
enzymes de restriction isolément ou associées entre elles. Les fragments de
restriction sont reconnus par une sonde spécifique du gène responsable de la
maladie. Il en résulte un grand nombre de fragments possibles dont les longueurs
(en kilobases) sont mesurées par électrophorèse à côté d’un marquer de masse
moléculaire.
Par exemple, les DNA d’un malade atteint d’une dysliproptoteinémie et celui d’un
témoin sain digérés par BamH I : le sujet sain montre un seul fragment long de
11,65 kb reconnaissable par la sonde du gène de l’apoA-I, alors que le DNA du
malade en montre deux de 7,5 et 10, 25 kb.
LES MODIFICATIONS DE L’ADN : LA MUTATION :
SUBSTITUTIONS, DELETIONS ET INSERTIONS

La transmission du message génétique au cours de l’évolution dans une espèce,

se fait avec des modifications ponctuelles de la structure de DNA, modifications
transmises héréditairement si elles sont compatibles avec la reproduction. Ces
modifications peuvent parfois être sources de mutation.
Trois sortes de modifications sont connues :
- Substitution : remplacement d’un nucléotide par un autre ;
- Délétion : suppression d’un ou de plusieurs nucléotides ;
- Insertion : addition d’un ou de plusieurs nucléotides.

1. Substitution et type de substitutions

C’est le remplacement d’un nucléotide par un autre dans la structure primaire d’un
acide nucléique. Selon la nature des bases touchées, la substitution peut être une
transition ou une transversion.
On parle de « transition » lorsqu’une purine remplace une purine ou une
pyrimidine remplace une pyrimidine ou inversement. Ces substituions sont les
plus fréquentes :
A →G, C→ T, G → A et T → C
Au contraire, on parle de « traversions » quand une purine remplace une
pyrimidine ou inversement.
A → C, A → T, C → G, G →C, G → T, T →A et T→ G
1.1 : Substitution somatique et germinale.
Une substitution peut être source de mutation ponctuelle. L’effet de cette mutation
varie selon qu’elle affecte le DNA d’une cellule somatique ou celui d’une cellule
de la lignée germinale (Fig.1).
Fig. : Cellules et tissus montrant les conséquences de la substitution
Lorsque le DNA d’une cellule somatique est modifié et qu’il en résulte une
mutation, les cellules issues de cette cellule mutée, forment un clone de cellules
mutées qui présente des caractères différents de ceux du tissu d’origine. De tels
clones constituent souvent des tumeurs cancéreuses. Les mutations somatiques ne
sont pas transmises à la descendance.
Lorsque le DNA d’une cellule germinale est modifié et qu’il en résulte une
mutation, celle-ci sera transmise par les gamètes et apparaîtra dans la
descendance : la mutation est alors héréditaire.

1.2 : Substitution et traduction

Une substitution peut aboutir à des résultats très différents (mutation) après la
traduction. Cela dépend de sa position par rapport au cadre de lecteur. En
général, les transversions font plus de mutations que les transitions. Considérons
l’exemple suivant :
 Quand une substitution dans un codon se traduit par un même acide aminé : on dit
qu’elle est synonyme. La protéine traduite est celle attendue.
Une substitution dans un codon peut se traduire par un acide aminé différent : on
dit qu’elle est faux-sens. Elle sera d’autant plus délétère pour les fonctions de la
protéine que le nouvel acide aminé sera différent de celui qui aurait dû être traduit.
Lorsqu’une substitution dans un codon se traduit par un codon de terminaison, on
dit qu’elle est non-sens. La protéine traduit sera tronquée à cet endroit.
.2 Mutation
C’est un changement permanent de la structure du DNA conduisant à une
structure primaire différente et devenue permanente de la protéine exprimée. Il y
a alors mutation.
Les substitutions de base nucléique dans le DNA conduisent :
- Soit à l’incorporation d’un acide aminé différent dans la protéine (substitution
non -synonyme).
- Soit à l’incorporation du même acide aminé dans la protéine (substitution
synonyme)

Ces substitutions synonymes résultent de la dégénérescence du code génétique.

Lorsqu’une substitution non-synonyme se produit dans le DNA d’un sujet
(génotype) et aboutit à l’incorporation d’un acide aminé fonctionnellement
diffèrent, dans la structure primaire d’une protéine, il en résulte l’apparition d’un
caractère différent (mutation) dans le phénotype de l’individu.
Toute autre modification entraînant une protéine traduite plus longue ou plus courte,
ou encore un décalage de la lecture des codons, se traduit par une séquence primaire
différente et donc la plupart du temps, une mutation dans le phénotype de l’individu.
*Exemple de mutation Arg3500 → Gln de l’apoB-100

La mutation 3500 de l’apolipoprotéine B-100 résulte d’une substitution G → A non

synonyme, qui, à la traduction, code pour le 3500eme acide aminé de l’apoB-100,
Glutamine au lieu d’Arginine. Cette mutation n’entraine pas de modification de site
de restriction et on ne peut pas la détecter directement par un polymorphisme de
longueur des fragments de restriction. La présence de cette mutation chez un
individu, est un facteur de risque vis-à-vis de l’athérome et des maladies cardio-
vasculaires, parce qu’elle perturbe la liaison de l’apolipoprotéine B-100 avec le
récepteur cellulaire des lipoprotéines de basse densité (LDL).

.3- Délétions
Elle est caractérisée par la suppression d’un ou de plusieurs nucléotidique dans la
séquence primaire d’un DNA ou d’un RNA.
La délétion est un des phénomènes importants de modifications transmissibles ou
non au cours de l’évolution. Elle est d’importance variable selon sa longueur :
- De 1 ou 2 nucléotides, elles décalent le cadre de lecture (codons)
- De 3 nucléotides, elles aboutissent à la suppression d’un acide aminé dans la
protéine exprimée ;
- De grande longueur, elles peuvent supprimer l’expression d’un ou de plusieurs
exons voire d’un gène entier
-
3.1. Décalage du cadre de lecture
Le cadre de lecture déterminé une fois pour toute, la traduction aboutit à la
synthèse d’une protéine de 77 acides aminés si on prend comme exemple le gène
apoA-II. Mais un décalage arrive suite à une délétion

-
Une délétion*, emportant le premier nucléotide de codon 59 décale d’une lettre,
le cadre de lecture et aboutit à la synthèse de cinq acides aminés faux, suivis d’un
codon Stop. La protéine produite est inexacte et tronquée (63aa).
- De même si on retire les deux premiers nucléotides** du codon 59 on aboutit
encore à une protéine fausse et tronquée (60 aa). Dans les deux cas, on dit qu’il
y a « décalage du cadre de lecture »
- Si on retirait trois nucléotides, le cadre de lecture resterait le même et la
traduction se poursuivrait normalement avec un acide aminé de mois (76 aa)

Une délétion large entraîne souvent l’inactivation du gène. Dans le cas présent, la
délétion s’étend depuis l’intron 8 jusqu’à l’intron 9 (2136pb) du gène de la
lipoprotéine lipase, et par conséquent supprime la totalité de l’exon 9 de ce gène.
 Il est probable que l’excision épissage de l’intron coupé ne peut pas se faire avec
le site receveur de l’intron 9 et donc que la maturation du transcrit n’est pas
possible. On constate chez un sujet porteur de cette délétion sur ses deux
chromosomes β (homozygote), une absence d’expression du gène et par
conséquent, l’absence de la Lipoprotéine lipase en tant que protéine, ainsi que son
activité enzymatique dans le plasma sanguin.
4. Insertions
C’est l’addition d’un ou de plusieurs nucléotidiques dans la séquence primaire d’un
DNA ou d’un RNA. Les insertions sont d’importance variable selon leur longueur :
- De 1 ou 2 nucléotides ; elles décalent le cadre de lecture (codons)
- De 3 nucléotides, elles aboutissent à l’addition d’un acide aminé dans la
protéine exprimée
- De grande longueur, elles peuvent modifier complètement la traduction des
exons

- Dans les introns ou dans les exons non-traduits, on rencontre souvent de

longues insertions de structure variable qui sont sans effet apparent sur
l’expression du gène
 LES TECHNIQUES DE BASE DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE

INTRODUCTION
Le dernier des connaissances en biologie, la biologie moléculaire a favorisé un
progrès rapide de diverses techniques appliquées. Il existe maintenant de
nombreuses techniques propres à la biologie moléculaire. Certaines sont plutôt
pratiquées dans les laboratoires de recherche, d’autres sont non seulement
utilisées au laboratoire, mais aussi dans les centres de contrôle et de bio-
surveillance des aliments et de l’environnent, dans les services sanitaires et même
judiciaire.
Des terminologies appropriées sont apparues avec les techniques biologiques et
doivent être maîtrisées par le bio - ingénieur. En général, l'étude des processus liés
à l’ADN nécessite un grand nombre de techniques expérimentales. Cela consiste à
utiliser des méthodes pour l'extraction, la purification, la séparation, restriction,
l'amplification, le séquençage etc…, des acides nucléiques.

* QUELQUES TERMINOLOGIES

- NOTION D’ADN RECOMBINANT

C’est un ADN hybride obtenu au laboratoire par combinaison de deux ADN
appartenant à deux espèces différentes.

- NOTION D’ADN VECTEUR

C’est l’ADN dans lequel on insère un fragment d’ADN à étudier ou à transférer.
Le fragment inséré est appelé « insert » ou ADN étranger ou ADN exogène. Cette
séquence nucléotidique est capable de s’auto-répliquer.

- NOTION DE CLONE
Un clone correspond à un grand nombre de molécules ou de de cellules identiques
provenant d’un seul ancêtre. L’opération qui consiste à obtenir ce grand nombre
s’appelle « clonage ».

- NOTION DE SONDE NUCLEOTIDIQUE

Une sonde nucléotidique est un segment de nucléotide qui permet de rechercher
de manière spécifique, un autre fragment d’acide nucléique que l’on désire
étudier. La réaction sonde – fragment recherché correspond à une hybridation.

- NOTION D’HYBRIDATION MOLECULAIRE

Après séparation des deux brins d’un ADN par fusion, si la solution d’ADN est
refroidie lentement et dans les conditions et milieux favorables, une réassociation
des brins est progressivement observée : c’est le phénomène d’hybridation
moléculaire. Cette réassociation peut concerner 2 séquences d’ADN d’une même
espèce ou d’espèces différentes ou encore une séquence d’ADN complémentaire.
Elle est donc d’une spécificité très grande.

- NOTION D’ADN COMPLEMENTAIRE (ADNc)

C’est l’ADN fabriqué comme copie d’un ARNm et qui de fait est dépourvu
d’introns.
- NOTION D’ADN GENOMIQUE
C’est l’ADN normal qui constitue le génome d’une cellule ou d’un organisme.
 EXTRACTION – PURIFICATION ET MIGRATION
ELECTROPHORETIQUE

I - EXTRACTION ET PURIFICATION DE l’ADN

1 Extraction et purification du DNA
*Définition et principe
Toute étude de biologie et génétique moléculaire implique la disposition
d'échantillon d'acides nucléiques. Les techniques d'extraction d'acides nucléiques
sont relativement simples. Il convient simplement d'éviter toute destruction
enzymatique ou mécanique. En effet les acides nucléiques qui sont stables dans la
cellule intacte, deviennent très vulnérables à la digestion par les nucléases
endogènes une fois la cellule lysée.

1 - EXTRACTION A PARTIR DU MATERIEL BIOLOGIQUE

Les méthodes d’extraction utilisent parfois les enzymes. Chaque fois que l’on a
été amené à traiter un acide nucléique par un enzyme, il est nécessaire de procéder
à une purification pour éliminer ces enzymes avant de passer à d’autres étapes de
travail. L’ADN doit impérativement être purifié à partir de matériels biologiques
propres et dans des conditions optimales de qualité au laboratoire.
Dans la pratique, les acides nucléiques peuvent être extraits du sang total, des
cheveux, des tissus broyés entre autres. Le procédé classique est l’extraction par
le couple phénol - chloroforme.
Le phénol est un excellant agent dénaturant des protéines. Il permet ainsi de
séparer les protéines et les acides nucléiques. Le phénol est ensuite éliminé par
extraction avec du chloroforme non miscible à l’eau. Il se forme alors deux
phases :
- une phase aqueuse contenant les acides nucléiques et les protéines
résiduelles;
- une phase organique contenant le chloroforme et phénol.
Les deux phases peuvent être séparées par la méthode de centrifugation. La phase
aqueuse contenant les acides nucléiques est recueillie puis traitée si nécessaire par
des protéolyses ou agents clivant les protéines. Ce traitement permet d’éliminer
les traces de protéines restantes. Les acides nucléiques sont finalement récupérés
sous forme solide à la suite de leur précipitation en présence d’alcool éthylique
ou isopropylique.

Actuellement, de nombreuses substances réactives permettant de faciliter les

opérations de purification sont disponibles. Il est ainsi possible d’extraire les
acides nucléiques à partir de plusieurs échantillons biologiques comme les
cultures cellulaires, les tissus animaux ou végétaux etc.…
*Méthode pratique : exemple de sang (Fig).
Fig. 1 : Extraction/Purification de DNA

Aussi les méthodes d’extraction au laboratoire doivent être adaptées au type de

tissus et au matériel disponible. Notons que lorsque les acides nucléiques viennent
des extraits cellulaires, les protéines sont au préalable hydrolysées par les
enzymes protéolytiques comme la protéinase k.

2. - ESTIMATION DE LA QUALITE ET DE LA QUANTITE DE L’ADN

a. - VERIFICATION DE LA PURETE DE L’ADN.

Elle se fait grâce au spectrophotomètre Une lecture de la densité optique (Do) en
U.V permet de vérifier la pureté du DNA obtenu. En général quand la pureté est
nette, un pic à 260 nm doit être observé. Par ailleurs, le rapport

RDO = Do(260nm) / Do(280mn)

doit normalement être égal à 1,8.

- Si RDO > 1,8 -→ contamination par des RNA

- Si RDO < 1,8 -----→ contamination par les protéines ou par du phénol.

b - ESTIMATION DE LA QUANTITE DU DNA

Cette étape est indispensable, après extraction de l’ADN à partir du matériel
biologique. Deux méthodes peuvent être utilisées :
 * La spectrophotométrie
L’estimation quantitative de l’ADN peut se faire par spectrophotométrie dans
l’U.V à 260 mn. C’est la longueur d’onde correspondant à l’absorption maximale
du DNA.
Cette absorption se définit par unité de Do mesurée toujours à 260 mn (UDo)
1UDO correspond à l’absorption d’une solution de DNA double brins à la
concentration de 50 microgr / ml ou à l’absorption d’une solution de DNA simple
brin (RNA) à la concentration de 25 microgr / ml.

* Méthode en minigel.
Elle est utilisée lorsque l’on ne dispose pas de DNA en quantité suffisante pour
mesurer la densité optique en UV.
Le principe consiste à comparer l’intensité de la tâche en UV de l’échantillon
étudié à celle donnée dans les mêmes conditions par un DNA standard déposé en
quantité connue.

II - TECHNIQUE DE SEPARATION ELECTROPHORETIQUE

C'est une technique de bioséparation permettant la séparation des biomolécules
selon leur charge et leur taille (ADN, ARN, protéines).
1 - Principe
L’ADN est soumis à un champ électrique dans une cuve électrophorétique. Cette
technique permet non seulement de séparer les fragments d’ADN mais aussi de
déterminer leurs tailles et leur poids moléculaire (PM).
Après purification, les ADN peuvent être digérés par des enzymes de restriction.
On obtient ainsi des fragments de DNA de tailles et de PM différents qui
permettent d’étudier les caractéristiques de l’ADN (PM, nature des bases…).
Il est fréquent au laboratoire d’avoir à séparer ces fragments de DNA par
électrophorèse. En effet, à pH neutre, le DNA est chargé négativement. Ainsi
encadré par l’anode et la cathode de la cuve électrophorétique, il migre vers
l’anode avec une vitesse de migration des fragments inversement proportionnelle
au logarithme de la taille.

2 - SUPPORTS ELECTROPHORETIQUES

a - Gel de polyacrylamide
Il est utilisé pour séparer des petits fragments de DNA de taille inférieure à 500
paires de bases. On prépare généralement des gels à 15% pour les DNA de 25 à
150 nucléotides, ou des gels à 5% pour les DNA de
80 à 500 nucléotides.
La migration est effectuée souvent en position verticale.
b - Gel d’agarose
Il sert plus spécifiquement à séparer des fragments de tailles comprises entre 0,2
– 80 kilobases. C’est un gel à 1,5% pour les DNA de 0,2 – 5kb ; à 0,9% pour les
DNA de 5-7 kb et inférieur à 0,9% pour les DNA de plus grande taille.
La migration est effectuée en position verticale.

c - Champ pulsé
Pour de très gros fragments de DNA de taille allant jusqu’à 10 4 kb, on utilise
souvent l’électrophorèse en champ pulsé pour la séparation.

3- ESTIMATION
Dans toutes les électrophorèses, des marqueurs de PM de DNA sont déposés et
migrent parallèlement au DNA à étudier. Le DNA est repéré par fluorescence aux
U.V après avoir été mis au contact avec le bromure d’éthidium (BET).
En comparant l’emplacement du DNA échantillon avec celui du DNA marqueur,
le PM et/ou la taille du DNA étudié peut être estimée.

Exemple de figure d’électrophorèse du DNA (gel et filme)

Fig.: Distance de migration en fonction du logarithme de la taille des fragments
d’ADN.

*Cas spécifique du gel d’agarose

Dans ce cas, les fragments vont migrer selon leur taille plus que selon leur charge.
Plus le fragment à une taille élevée, moins la migration électrophorétique, par
rapport au puit d’inclusion, sera importante.
La détermination précise des fragments séparés par électrophorèse est effectuée
en faisant migrer des marqueurs de taille et PM connus, en parallèle avec des
échantillons à analyser. La détection des fragments d’ADN sur ce type de gel est
réalisée par exposition aux rayons UV, après réaction avec un réactif spécifique
comme le BET par exemple. Le BET est un agent qui s’intercale entre les brins
d’ADN.

cDNA, HYBRIDATION ET SONDE

1. Le cDNA
*Définition et principe

Un cDNA est un DNA obtenue à partir d’un ARN.

La manipulation et l’étude des RNA est difficile à cause de leur grande
sensibilité aux ribonucléases qui les détruisent. Il est alors nécessaire de recopier
la séquence en DNA pour qu’elle soit plus stable et qu’on puisse l’amplifier en
fonction des besoins.

*Méthode pratique d’obtention du cDNA

Fig. : Synthèse de cDNA
Le mRNA purifié (chromatographie d’affinité sur une colonne d’oligo-d(T)) est
lié dans un premier temps avec des oligonucléotides poly(T) qui s’attachent à la
queue poly(A).
A partir de l’extrémité 3’ de cette amorce poly(T) la transcriptase réverse, qui
est une DNA polymérase, synthétise un brin de DNA complémentaire du
messager de départ.
Une fois cette synthèse achevée, on dégrade le RNA par une base forte ou par
une ribonucléase spécifique.
Le brin de DNA fabriqué, forme spontanément à son extrémité 3’ une boucle en
épingle à cheveux en s’hybridant sur lui-même.
L’extrémité 3’ de cette boucle va servir de site de démarrage pour la DNA
polymérase qui va synthétiser un brin de DNA complémentaire du premier.
Une nucléase spécifique du DNA simple brin supprimera la boucle de
l’extrémité. Le cDNA double brin est prêt.
On peut ainsi constituer autant de cDNA qu’il existe de messagers dans une
cellule : l’ensemble de ces cDNA forme une « banque de cDNA »

2. Les sondes et l’hybridation

-*Hybridation des acides nucléiques
L'hybridation est une propriété fondamentale des acides nucléiques qui repose
sur les règles de complémentarité. Il est possible d'apparier des brins d'ADN ou
ARN avec des oligonucléotides qui reconnaissent spécifiquement des séquences
sur les brins d'ADN de manière antiparallèle et complémentaire. Ces
oligonucléotides sont appelés sondes nucléiques
(fig. 5). Dans le cas de deux brins complémentaires de la même molécule
d'ADN (brins homologues), on parle de renaturation (hybridation à 100%).

Fig.5: Hybridation des acides nucléiques

*Hybridation et température d’hybridation

Chaque 1% de non homologie diminue la température d'hybridation (Th) de
1°C.
L'hybridation moléculaire est ainsi utilisée surtout dans la détection de
l'homologie entre les molécules d'ADN de sources différentes. La
complémentarité dépendra de la spécificité et de la sensibilité.

-Mécanisme d’hybridation
Un fragment de DNA double brin affecte normalement une structure secondaire
en double hélice.
En élevant la température jusqu’à la Tm, on disjoint 50% environ des liaisons
hydrogène qui unissent les brins de DNA, ce qui dénature partiellement la double
hélice.
Lorsque la température atteint 95°C, toutes les liaisons hydrogène sont rompues
et la dénaturation du DNA est complète. Le DNA simple brin obtenue, est qualifié
de « dénaturé ». Au cours de cette dénaturation, le coefficient d’extinction du
DNA à 260 nm augmente (hyperchromicité)
En refroidissant brutalement (glace) les structures secondaires ne se reforment pas
et le DNA reste dénaturé. Si on refroidit doucement, la double hélice se reforme
progressivement. Un oligonucléotide (soude) ajouté à ce moment peut s’hybrider
avec un fragment complémentaire du DNA, dès que la température descend en-
dessous de la Tm.
L’hybridation d’une sonde marquée (atomes radioactifs, radicaux fluorescents ou
ligands spécifiques) sur un DNA dénaturé permet de marquer spécifiquement tous
les fragments de ce DNA dont la séquence est complètement de la soude.

- Méthode de calcul de la Tm
Il est possible de mesurer directement la température de fusion (Tm) d’un DNA
double brin en mesurant l’augmentation de l’absorbance de la solution à 260 nm
en fonction de la température.
Toutefois, on se contente, la plupart du temps, d’une estimation à partir de la
composition de l’oligonucléotide. Si celui-ci a une longueur égale ou inférieur à
20 nt on compte 2°C par couple A : T et 4°C par couple G :C. A partir de N = 20,
on corrige d’un multiplicateur proportionnel à la longueur au-delà de ce chiffre :
1 + [(N-20)/20]
Lorsqu’il existe des mésappariements, il faut soustraire de la Tm calculée, autant
de degrés C que le pourcentage de séquence non-appariée de l’oligonucléotide.

- Sonde hybridée
Fig.5: Reaction d’hybridation
Pour pouvoir reconnaître spécifiquement une séquence du DNA, on utilise au
laboratoire un petit morceau de DNA synthétisé (sonde) dont la séquence
correspond au moins en partie à celle d’un des brins du DNA.
Parce qu’elle est complémentaire de l’autre brin du DNA, la sonde est capable de
se fixer spécifiquement sur l’autre brin à l’endroit où se lit la séquence
complémentaire,
En marquant cette sonde par un atome radioactif ou par une molécule fluorescente
liés covalentiellement à un des nucléotides de la sonde, on peut détecter la sonde et
le morceau de DNA complémentaire qui lui est hybridé.
TECHNIQUE D’AMPLIFICATION GENIQUE OU TECHNIQUE PCR.

I. DEFINITION ET PRINCIPE

1 - Définition
Cette technique dite « Polymerase Chain Reaction » c’est à dire réaction de
polymérisation en chaîne, décrite en 1985 permet d’augmenter et d’amplifier de
manière considérable, la quantité d’ADN dont on dispose initialement.

2 - Principe
Cette technique impose de connaître la séquence des régions qui délimitent le
segment d’ADN à amplifier. Connaissant chacune des deux séquences sur une
vingtaine ou une trentaine de nucléotides environs, on synthétisera des
oligonucléotides complémentaires. Ces oligonucléotides auront deux fonctions :
- ils permettent de repérer la partie du DNA à amplifier ;
- ils serviront d’amorce ou primer à la DNA polymérase qui sera introduite pour
les réactions de polymérisation.

Fig : Amplification du DNA

II - REALISATION PRATIQUE
A la différence d’un clonage bactérien, le PCR est caractérisé par une
amplification enzymatique in vitro.
1 - Cycles et phase de la PCR
La technique PCR comporte des cycles successifs et chaque cycle comprend une
succession de3 phases :
- une phase de dénaturation par la chaleur à la température comprise entre 92 et
95°C. Elle dure 30 secondes à 1 minute et permet de séparer les deux brins
d’ADN.
- une phase d’hybridation avec deux amorces spécifiques à la température de 55-
60°C. Une amorce va se fixer sur un brin, la seconde amorce sur le brin
complémentaire. Cette phase dure également 30 secondes à 1minute. Notons que
la fixation sur les brins est rendue possible grâce à l’abaissement de la température
de 95 à 55°C.
- une phase d’extension par l’ADN polymérase à partir des amorces à 70 -72°C
pendant 1 à 2 minutes.
A la fin de chaque cycle, le nombre de brin d’ADN est multiplié par deux.
L’amplification est donc exponentielle. En pratique, le rendement n’étant pas
souvent de 100%, 30 à 40 cycles sont nécessaires et permettent d’amplifier l’ADN
d’un facteur de 105 à 106.

2. PCR ET POLYMERASES THERMOSTABLES

-Taq Polymérase.
La technique PCR connaît un grand essor depuis qu’il a été possible en 1988
d’utiliser une DNA polymérase non inactivée par la chaleur. Cette ADN
polymérase, appelée taq polymérase, est extraite d’une bactérie thermophile et
permet une automatisation des cycles. On peut ainsi effectuer un nouveau cycle
sans avoir à ajouter à chaque fois l’enzyme polymérase.
>Les différences entre l’ADN Taq Polymérase et l'ADN polymérase III.

-Pfu polymérase
L’ADN polymérase de l’hyper thermophile Pyrococcus furiosus (croissance
optimale à 100°C, la bactérie d’une source hydrothermale), appelée Pfu
polymérase est actuellement la meilleure polymérase thermostable pour la
correction des erreurs de réplication
(Fidélité élevée) grâce à son activité auto-correctrice. Cette enzyme est très
utilisée lorsqu’une haute précision est requise. De plus elle est plus stable que la
Taq polymérase.

3 - OPTIMISATION DES RESULTATS PCR

Les résultats peuvent être optimisés en fonction d’un certain nombre de
paramètres notamment :
- concentration en Mg2+ ;
- concentration en amorces ;
- spécificité des amorces.
Le choix des amorces est particulièrement crucial pour obtenir des résultats
satisfaisants (paramètres physico – chimiques, taille, spécificités). Cependant
d’autres facteurs peuvent également perturber cette optimisation C’est le cas par
exemple de la contamination ou du pouvoir d’édition.
* Cas des contaminations
Il faut s’assurer de la spécificité des fragments à amplifier car il existe toujours un
risque d’amplifier des DNA non désirés.
Le fait de former le DNA amorce avec des séquences atteignant une vingtaine de
nucléotides devrait rendre négligeable la possibilité de retrouver ailleurs la même
séquence de nucléotides. Mais les conditions opératoires font que parfois, on peut
amplifier d’autres fragments.

* Fonction d’édition de la Taq polymérase

La taq polymérase présente une activité exonucléasique 5’ – 3’, mais elle est
dénuée d’activité exonucléasique 3’ – 5’, c'est-à-dire, de la f onction d’édition.
Elle peut alors insérer des bases qui ne suivent pas la règle d’appariement. On
estime qu’elle réalise une mauvaise incorporation tous les 105 bases environs.

III - PCR CLASSIQUE ET PCR EN TEMPS REEL (recherche personnelle,

différences ?)

IV- UTILISATION DES PRODUITS PCR.

Les utilisations des produits PCR sont très nombreuses actuellement. Ces produits
ont permis de développer plusieurs techniques.

1 - TECHNIQUE DU DOT – BLOT

Elle utilise les produits PCR et permet de mettre en évidence des mutations
ponctuelles au niveau d’un gène donné. Les produits PCR peuvent après
transformation en monobrins, être hybridés avec des sondes oligonucléotidiques
libres ou fixées sur un support solide.
Ces sondes correspondent à des séquences normales ou pathogènes pour un gène
donné.
Les résultats de l’hybridation permettent de confirmer ou d’infirmer la présence
de mutations qui peuvent être pathogène ou non.
Ces techniques peuvent permettre de détecter entre autres certaines anomalies
génétiques chez le fœtus.

1.1- ANALYSE DE RESTRICION ET DREPANOCYTOSE

* Principe
Les enzymes de restriction sont des endonucléases naturelles qui dégradent les
brins d’ADN à partir des sites bien précis dits sites de restriction. Le produit PCR
est soumis à une digestion enzymatique par une enzyme de restriction. Si une
mutation ponctuelle modifie le site de restriction initialement présent, la taille des
fragments d’ADN obtenus après digestion sera modifiée et décelable après
électrophorèse des fragments d’ADN.

* Exemple d’application : Gène responsable de la drépanocytose

La mutation ponctuelle de GAG en GTG qui arrive sur le 6 eme codon du 1er exon
du gène b de la globine humaine, entraîne l’apparition des hémoglobines S (HbS).
Ces HbS sont caractérisées par le remplacement dans la chaîne des acides aminés,
de la Glu par la Val suite à la mutation. Cette mutation est responsable à l’état
homozygote, d’une pathologie grave très répandue dans le monde : la
drépanocytose.
L’anomalie modifie ainsi le site de restriction GAG de l’enzyme Dde I qui est C
/ TGAG.

* Description de la technique
La séquence suivante représente les 9 premiers codons humains du 1er exon du
gène b de la globine humaine.

1 2 3 4 5 6 7 8 9
GTG CAC CTC ACT CCT GAG GAG AAG TCT

Avec l’enzyme de restriction Dde I, on aura après digestion, 2 fragments après

électrophorèse dans les conditions normales.
La mutation HbS conduit à une mutation ponctuelle au niveau du codon numéro
6. Elle entraîne alors la disparition du site de restriction de l’enzyme Dde I en
transformant GAG en GTG. L’action de Dde I devient alors nulle.
L’électrophorèse des produits PCR après digestion par Dde I permet de confirmer
ou d’infirmer la présence de mutation GAG / GTG sur le codon N° 6 par
comparaison des tailles des fragments.
On peut donc confirmer l’état homo ou hétérozygote pour cette mutation
responsable de la drépanocytose.

3 – TECHNIQUE PCR DANS L’ANALYSE DES ALIMENTS ET DE L’EAU

Avec les techniques traditionnelles d’analyse microbiologiques, il faudra
plusieurs jours voire semaines pour confirmer ou infirmer l’origine d’une toxi-
infection. Ainsi, depuis quelques années, la technique PCR dans certains
laboratoires d’analyse de l’eau et surtout des aliments permet d’obtenir des
résultats précis. En quelques heures, il est possible, grâce à la PCR, de déterminer
le type de microorganisme responsable d’une infection ou d’une intoxication par
absorption d’eau ou d’aliment.
4 - TECHNIQUE DGGE ET SSCP
Ce sont des techniques d’analyse électrophorétique des produits PCR qui sont
particulièrement utilisées pour mettre en évidence les mutations ponctuelles au
niveau d’un gène.
Des produits PCR particuliers appelés amplimères sont formés si des mutations
sont présentes sur l’ADN étudié (ou initial). Les produits PCR seront différents
en fonction de la présence d’une séquence normale ou d’une séquence mutée.

a - TECHNIQUE DGGE
La DGGE. « Denaturation Gel Gradien Eletrophoresis » c’est à dire
électrophorèse de gel en présence d’un gradient d’agent dénaturant.
C’est une technique qui permet de mettre en évidence une mutation ponctuelle en
utilisant la température de fusion de l’ADN et un produit PCR. En effet la
température de fusion d’un produit PCR c’est à dire la température moyenne de
séparation des deux brins est fonction de sa séquence. Une mutation ponctuelle
qui change la séquence entraîne une modification de la température de fusion
Autrement dit, le changement de la température de fusion d’un produit PCR
(ADN) suggère une modification de séquence et probablement une mutation.
Cette mutation peut être ensuite directement mise en évidence par électrophorèse
sur gel de polyacrylamide en présence d’un gradient d’agent dénaturant.

b - TECHNIQUE SSCP
La SSCP « Single Strand Chain Polymorphism » c’est à dire polymorphisme en
chaîne d’un simple brin, est une technique basée sur l’analyse électrophorétique
des produits PCR sous forme de fragments simples brin.
Il s’agit d’amplifier par PCR une région d’un gène ou d’un ADN que l’on désire
étudier, puis de comparer la mobilité de l’ADN dénaturée portant une mutation
avec celle d’un fragment de référence comportant une séquence normale.
Une mutation ponctuelle au sein d’une séquence modifie suffisamment la
structure primaire de l’ADN monobrin pour qu’il en résulte des changements de
migration électrophorétique sur gel.
Actuellement, la technique de chromatographie en phase liquide à haute
performance (HLPC) peut concurrencer la DGGE et la SSCP.

V - Exemple d’application des techniques de BM dans la recherche de

l’agent causal de l’ulcère de Buruli dans le district endémique de Tsévié

L’ulcère de Buruli (UB) est une maladie grave de la peau, causée par une infection à
Mycobacterium ulcerans. Elle entraîne la présence de plaies sur la peau qui sont en général des
ulcères.
Trois méthodes de laboratoire étaient utilisées pour la confirmation :
 - L’examen direct des frottis, peu sensible (40-60%)
- La culture in vitro, très difficile à mettre en œuvre car temps long de croissance
- L’examen histopathologique, très difficile d’application.

Ainsi, ces dernières, les techniques de la BM, notamment le PCR et l’hybridation, ciblant la
séquence génomique IS2404 jugée très sensible et spécifique, sont devenues des techniques de
choix.
Chez les patients suspectés d’ulcère de Buruli, l’utilisation de ces techniques permet de
confirmer la maladie par la détection de l’insertion IS2404 sspécifique du gène de M. ulcerans.

Recherche de M. ulcerans par la PCR chez les patients

La PCR réalisée est dite classique ou conventionnelle.
Echantillons biologiques utilisés
On effectue des prélèvements chez le patient par aspiration de liquide sur les lésions pré-
ulcéreuses ou par écouvillonnage à partir des ulcères.
Etapes
Trois étapes essentielles sont nécessaires :
- Extraction d’ADN
- Amplification de la région incluant IS2404
- Révélation par la technique d’électrophorèse sur gel d’agarose.

Extraction d'ADN.
L’ADN de l’échantillon est extrait en utilisant les réactifs suivants :
- La solution de Lyse des cellules (CLS)
- La solution d’hydratation de l’ADN
- La solution de précipitation des protéines
- La Lysozyme (10 mg/ml)
- La Protéinase K (20 mg/ml)
- Le Glycogen (20 mg/ml)
- L’Ethanol 70% (Applichem)
- Le 2-Propanol (Isopropanol)
Cette extraction se fait en 4 étapes.
La lyse cellulaire :
La lyse des cellules est effectuée avec une solution de lyse des cellules et des enzymes en
particulier la protéinase K (incubation à 55°C toute une nuit).
La déprotéinisation : par l’utilisation d’une solution précipitant les protéines suivi d’une
centrifugation. Ces protéines sont ainsi déposées au fond du tube sous forme de débris.
La purification de l’ADN
Il s’agit de précipiter l’ADN avec une solution d’isopropanol dans le surnageant obtenu après
l’élimination des protéines. L’ADN obtenu est ensuite lavé avec de l'éthanol 70%.
Conservation de l’ADN
Le culot d'ADN est séché et réhydraté dans une solution d'hydratation d'ADN. Il est conservé
entre 2 et 8°C ou à -20oC en cas d’une longue durée de conservation avant l’amplification.

Amplification de l’ADN de M. ulcerans - IS2404.

Matériel utilisé

- Thermocycleur
- Bille PCR PuReady-Go-Taq
• dNTPs
• Mgcl2
• Taq polymerase
- Amorces MU5 et MU6
- Eau distillée purifiée (DNAse/RNAse free)
Séquences des amorces : Sens (MU5) : 5'agcgaccccagtggattggt 3'
Anti-sens (MU6) : 5'cggtgatcaagcgttcacga 3'
Préparation du mélange réactionnel ou Master Mix

Réactifs N = 1 (µl) N+2 (µl)

Billes Pure Ready Go-Taq 1 Bille
Eau 20
Amorce MU5 1,25
Amorce MU6 1,25
Total 22,5
ADN 2,5

Le programme d’amplification utilisé dans le thermocycleur est le suivant :

Tableau du programme d’amplification :
Température Temps Cycles
95°C 10 min 1
95°C 10 sec 40
58°C 10 sec
72 °C 30 sec
72°C 10 min 1
15°C --- Prise en main

Électrophorèse des produits PCR (amplicons) sur gel d’agarose

Matériel

- Poudre d’agarose
- Tampon TBE, 10x
- GelRedMD
- Loading dye Blue juice, 10x
- Marqueur de poids d’ADN, 100 bp (Invitrogène)
Principe : Les produits PCR (amplicons) ont été séparés par électrophorèse sur gel d’agarose
selon leurs poids moléculaires.
Préparation du gel : Un gel d'agarose à 1,5% a été préparé en dissolvant 1,5g d'agarose dans
100 ml de tampon TBE 1X. Le résultat est MP 1 11 12
le suivant : 3 13 4 14 5 15 6 16 7 17 8 18 CP CN MP
Légende

MP : Marqueur de poids MP 1 11 2 12 3 13 4 14 5 15 6 16 7 17 8 18 MP

Echantillons positifs : A B C
A (1-11) ; B (2-12) CP
Bandes d’échantillons : 1 ; 2
Bandes de contrôle d’inhibition :
11 ; 12 500 Pb
Echantillons négatifs : CN
C (4-14)
P
Bandes échantillons : 4
Bandes de contrôle inhibition : 14

CP : Contrôle positif

CN : Contrôle négatif
 Figure A : Electrophorèse sur gel d’agarose des
produits d’amplification PCR pour la détection de
l’insertion IS2404

Légende MP 1 11 2 12 3 13 4 14 5 15 6 16 7 17
MP : Marqueur de poids

Echantillons inhibés :
D
D (3-13)

Absence de bande 500 Pb

d’échantillon : 3
Absence de bande de
contrôle d’inhibition : 13
DETERMINATION MOLECULAIRE DE M. ULCERANS DANS ENVIRONNEMENT

Pour établir une relation entre l’environnement et la survenue de l’ulcère de Buruli chez
l’homme, il faut déterminer la niche écologique (réservoir) de l’agent pathogène et déterminer
son profil génétique. Il s’agit spécifiquement de :
- Déterminer la présence du M. ulcerans dans l’environnement.
- Identifier les habitats probables et les sources de contamination.
- Comparer le profil génétique de M. ulcerans trouvés dans les échantillons cliniques et
celui de l’environnement.

Recherche de M. ulcerans dans les échantillons environnementaux

Echantillons biologiques
Le matériel est composé d’échantillons prélevés dans l’environnement de vie des patients
confirmés à l’ulcère de Buruli : Eau, flore végétale, sol et excréments d’animaux.
Extraction d’ADN

Matériel et réactifs

- Homogénéiseur FastPrep-24
- Micro-centrifugeuse (Eppendorf)
- Vortexeur
- Lysing Matrix E tubes
- Tampon Sodium Phosphate
- Tampon de lyse cellulaire MT Buffer
Avant l’extraction, certains échantillons environnementaux ont été broyés à l’aide de l’appareil
FastPrep-24-Homogenizer : Echantillons de sol, de plantes et d’excréments d’animaux

➢ Echantillons d’eau et le biofilm directement centrifugés.

A la fin de la centrifugation, le surnagent est recueilli dans un tube Eppendor pour l’extraction
d’ADN en utilisant le kit FastDNA® Spin Kit for Soil.

Amplification d’ADN par la PCR en temps réel (qPCR)

La technique de PCR utilisée est dite en temps réel utilisant trois couples d’amorces avec des
sondes qui ciblent les séquences des insertions IS2404 et IS2606 et le gène de la toxine, la
mycolactone, kétoréductase-B, KR.
Tableau 3.1 : Liste des séquences des amorces et sondes utilisées pour la PCR en Temps réel

Nom des
Position des Taille des
séquences Séquence (5'-3')
nucléotides amplicons
recherchées
IS2404 TF AAAGCACCACGCAGCATCT 27746-27762
IS2404 TR AGCGACCCCAGTGGATTG 27787-27804 59
IS2404 TP 6 FAM-CGTCCAACGCGATC-MGBNFQ 27768-27781

IS2606 TF CCGTCACAGACCAGGAAGAAG 28912-28932

IS2606 TR TGCTGACGGAGTTGAAAAACC 28947-28969 58
IS2606 TP VIC-TGTCGGCCACGCCG-MGBNFQ 28933-28946

KR TF TCACGGCCTGCGATATCA 3178-3195
KR TR TTGTGTGGGCACTGAATTGAC 3222-3242 65
KR TP 6 FAM-ACCCCGAAGCACTG-MGBNFQ 3199-3212
Matériel

- Thermocycleur
- Plaque optique de PCR 7300

Réactifs
- TaqMan Environmental Master Mix 2.0
- Amorces de M. ulcerans (Sens, anti-sens pour chaque marqueur)
- Sonde de M. ulcerans (pour chaque marqueur)
- Exo IPC mix (contrôle positif interne) (TaqMan, ABI)
- ADN IPC (contrôle positif interne) (TaqMan, ABI)
- Extraits d’ADN d’échantillons
- Eau Nuclease free

Trois séries de PCR successives ont été effectuées pour confirmer la présence de M. ulcerans
dans un échantillon.

- Première série : PCR-IS2404

La PCR-IS2404 était quantitative en utilisant une sonde de la technologie Taqman ciblant
l’insertion IS2404 avec trois contrôles : Un contrôle positif interne (IPC, Applied Biosystems)
pour déterminer le degré d’inhibition, un contrôle négatif pour vérifier l’absence de
contamination des réactifs et un contrôle positif.
Tableaux 3.2 : Préparation de master mix

Réactifs Volume n = 1 (µl) Volume n = n+2 (µl)

Eau (Rnase/Dnase Free) 2,75 2,75 (n+2)
IS2404 TF (20 µmol) 1,25 1,25 (n+2)
IS2404 TR (20 µmol) 1,25 1,25 (n+2)
IS2404 TP (20 µmol) 1,25 1,25 (n+2)
TaqMan EMM 2.0 (2x) 12,5 12,5 (n+2)
Exo IPC mix 2,5 2,5 (n+2)
IPC DNA 0,5 0,5 (n+2)
Total 22 22 (n+2)
ADN échantillon 3
n= nombre d’échantillons

La réaction a été conduite dans le thermocycleur ABI 7300 dans les conditions suivantes :
➢ 50°C pendant 2 minutes
➢ 95°C pour 15 minutes
➢ 40 cycles d’amplification
 • 95°C pendant 15 secondes
• 60°C pendant 60 secondes
L’émission et la collecte de la fluorescence se fait à l’étape d’hybridation des amorces et la
phase d’élongation qui sont combinées (60°C pendant 60 secondes).
Tous les échantillons révélés positifs à la PCR-IS2404 ont été analysés à nouveau pour la
recherche de la séquence de l’insertion IS2606.

- Deuxième série : PCR-IS2606

La PCR-IS2606 était semi-quantitative avec l’utilisation d’une sonde qui détecte la séquence
de l’insertion IS2606. Dans cette réaction, le contrôle IPC n’était plus utilisé et le master mix a
été préparé à partir d’un mélange de 3µl d’ADN extrait d’échantillon et 22µl du mélange
réactionnel ou master mix.
Les conditions d’amplifications étaient identiques à celles de la PCR-IS2404.
Après la seconde série de PCR, tous les échantillons qui étaient positifs à la fois aux séquences
des deux insertions (IS2404/IS2606) ont été analysés pour détecter le gène de la toxine, la
mycolactone, kétoréductase-B, KR.

- Troisième série : PCR-KR

Cette PCR était réalisée pour rechercher le gène de la toxine, KR sur les échantillons révélés
déjà positifs aux insertions IS2404 et IS2606.
La réaction d’amplification a été conduite à partir d’un mélange de 5µl d’ADN extrait
d’échantillon et 20µl du mélange réactionnel ou master mix avec les conditions d’amplification
identiques à celle des PCR-IS2404 et PCR-IS2606.

Interprétation des données

La présence d’une séquence d’une insertion ou du gène de la toxine a été révélée par l’apparition
d’une courbe d’amplification dont le cycle seuil (Ct) est inférieur à 40.
Un échantillon est considéré positif au M. ulcerans si les trois marqueurs sont détectés et que
la différence (ΔCt) entre IS2606 et IS2404 calculée est < 7.
Comparaison du profil génétique du M. ulcerans détecté dans les échantillons
environnementaux et cliniques.

Pour comparer le profil génétique du M. ulcerans détecté dans les échantillons

environnementaux et cliniques provenant de patients confirmés d’UB des mêmes districts, 50
patients ont été testés pour la recherche des insertions IS2404 et IS2606 et le gène KR.

L’amplification par la PCR en temps réel pour détecter les insertions IS2404 et IS2606 et le
gène KR a été effectuée dans les mêmes conditions que celles décrites pour les échantillons
environnementaux.

Figure : Distribution géographique des différents profils de M. ulcerans en fonction des

séquences détectées et des villages de résidence des patients d’ulcère de Buruli.

Conclusion
Ce travail a permis grâce à l’analyse moléculaire de confirmer la présence de M. ulcerans dans
l'environnement des districts de Zio et de Yoto de la région maritime au sud Togo.
 TECHNIQUES DE SEQUENÇAGE DE L’ADN

Le séquençage d’un ADN consiste à identifier les différentes bases qui constituent
les chaînes de cet ADN. Deux techniques sont généralement utilisées :
- technique de SANGER
- technique chimique de MAXAM et GILBERT

I - TECHNIQUE DE SANGER

1 - Principe
Cette technique enzymatique dite encore séquençage au didesoxyribonucléotide
triphosphate (ddNTP) est la plus utilisée actuellement pour effectuer le
séquençage d’un fragment d’ADN.
C’est une technique basée sur la copie d’un fragment d’ADN monocaténaire que
l’on désire séquencer par l’ADN polymérase. On utilise des ddNTP pour assurer
l’incorporation.
En effet le ddNTP est un analogue du dNTP mas ne possède pas de OH en 3, du
désoxyribose. Ainsi, il s’incorpore normalement dans une chaîne nucléotidique
en cours de synthèse. Mais cette incorporation du ddNTP par l’ADN polymérase
bloque l’allongement de la molécule d’ADN en cours de synthèse.
Rappelons que l’allongement d’une chaîne polynucleotidique par un ADN
polymérase nécessité en effet un groupement – OH en 3 du ribose disponible

2- Synthèse des ddNTP

-Les différentes formes des nucléotides.

Exemple de synthèse du Didésoxyadénosine triphosphate ddATP

 3- Réactions de Séquençage
a- Réactions enzymatiques de synthèse du brin complémentaire
Les réactions s’effectuent en traitant de manière parallèle 4 tubes contenant
chacun :

- le brin d’ADN obtenu après fusion ;

- les 4 types de desoxyribonucléotides (dNTP) ;
- l’amorce universelle ; Mg2+
- la DNA polymérase qui est généralement la taq polymérase ou Pfu Polymérase.

Chacun des tubes contient en outre un type de ddNTP en quantité bien définie
proportionnellement aux desoxyribonucléotides associés. Le travail se fait
toujours dans des conditions dénaturantes.

NOTE si on change le sens du fragment, on aura pluto 2 AU LIEU DE 3

* Procédé pratiques
Soit l’ADN bicentenaire suivant dont on désire déterminer la séquence :

5 GGT CAT CCA TGG ATT CGA 3

3 CCA GTA GGT ACC TAA GCT 5
- Séparons préalablement les 2 brins de cet ADN par fusion et considérons le brin
orienté 3 - - - - - - -5

- Réalisons une hybridation avec l’amorce de séquençage suivant :

GGT CAT CC orienté 5 - - - - - - -3

5 GGT CAT CC- 3

3 CCA GTA GGT ACC TAA GCT- 5

- Laissons agir dans les 4 tubes : une réaction de séquençage démarre entre les
dNTP (dATP, ddTTP, dCTP, dGTP ), les ddNTP (ddATP, ddTTP, ddCTP,
ddGTP ) et la Taq polymerase.
Les 4 tubes sont identifies en A, T, G, C comme l’indique le tableau suivant :

TUBE A T C G
Taq poly + + + +
dNTP + + + +
ddNTP ddATP ddTTP ddCTP ddGTP

* Description des réactions

Considérons le cas du tube A.
Quand l’ADN polymérase en action arrive en face d’un T situé sur le brin de
l’ADN matrice qu’elle est entrain de copier, elle doit incorporer A sur le brin
complémentaire en voie de synthèse. Elle a alors le choix entre :
- incorporer le d’AMP et donc la réaction de polymérisation se poursuit ;
- incorporer le ddAMP et la réaction s’arrête.

En effet, si la Taq polymérase incorpore de l’AMP, la réaction de synthèse se

poursuit jusqu’au prochain A approprié et de nouveau, le choix s’offre entre
dAMP et ddAMP.

Ainsi, les molécules obtenues dans chaque tube sont très nombreuses. On a toute
une famille de fragments de DNA synthétisés avec des tailles différentes selon
que dNTP ou ddNTP a été au hasard incorporé. Mais dans tous les cas toutes les
molécules se termineront obligatoirement par un ddNMP.

Dans l’exemple choisi, il y aura dans le tube A, des fragments stoppés en face du
premier « T » situé sur le brin à séquencer et formés donc de 9 nucléotides ;
d’autres stoppés en face du 2nd « T » et ayant donc 13 nucléotides et d’autres
encore devant le 3eme « T » avec 18 nucléotides.
En appliquant le même raisonnement sur chacun des 3 autres tubes, on obtient
finalement pour chacun des 4 tubes, les résultats suivant :

TUBE A
5 – GGT CAT CCA 3’ ( 9 nucléotides)
5 – GGT CAT CCA TGGA 3’ (13 nucléotides)
5 –GGT CAT CCA TGG ATT GGA 3’ (18 nucleotides)

TUBE T
5 – GGT CAT CCAT 3’
5 – GGT CAT CCA TGGAT 3’
5 – GGT CAT CCA TGG ATT 3’

TUBE C
5 – GGT CAT CCA TGG ATTC 3’

TUBE G
5 – GGT CAT CCATG 3’
5 – GGT CAT CCAT TGG 3’
5 – GGT CAT CCATGG ATT CG 3’

2 - Séparation sur gel et autoradiographie

* Marquage
On voit finalement qu’avec cette technique, si l’amorce ajoutée est marquée en
5’P par un P radioactif 32P, dans chaque tube, on aura différents fragments qui
présenteront tous un marquage en 5’ - P.
Dans le tube A on aura un brin 3’ - 5’ et l amorce.

Exo. Représenter par un schéma

Ainsi, on verra les 3 espèces suivantes qui se terminent toutes par ddA en leur
extrémité 3’- OH.

Exo. Représenter par un schéma

Le même raisonnement s’applique aux autres tubes T , C , et G et montre les

différentes espèces ou fragments avec un marquage radioactif en 5’ – P.
* Electrophorèse
Après les réactions de séquençage, on dépose sur 4 pistes électrophorétiques
séparés, les produits contenus dans les tubes A , T , C et G. Les fragments
nucléotidiques sont alors séparés selon leur taille par électrophorèse. Les plus
petits migrent plus loin. La distance de migration par rapport à leur position
initiale varie selon la taille des fragments.

* Autoradiographie et révélation
A la fin de l’électrophorèse, le gel est séché, un film est appliqué sur ce gel ;
et une révélation est effectuée après plusieurs heures de contact.
Chaque petit trait vu sur le film correspond à un fragment nucléotidique radioactif
terminé par un ddNTP.
Si par exemple dans la piste 1 on repère 3 trais successifs en .9, 13 et 18, cela veut
dire qu’il y a un « A » en position 9, 13 et18 dans le brin synthétisé. Le même
raisonnement s‘applique aux 3 autres tubes.

Exo. Représenter par un schéma

La lecture de ce gel se fait de bas en haut c’est à dire des fragments de petite taille
aux fragments de grande taille. Cette lecture nous donne comme résultat de
Séquençage :

5’ - ATGGATTCGA - 3’

Connaissant la séquence du brin complémentaire qui vient d’être synthétisé, il est

maintenant facile d’en déduire la séquence du brin matrice, soit :

3’ –TACCTTGCT – 5’

Soulignons que de nos jours, la radioactivité étant connue pour sa pollution et sa

toxicité, le marquage se fait de plus en plus grâce à la fluorescence.
Considérons un autre fragment de DNA à séquencer. Interpréter le schéma
suivant :
La détermination de l'enchaînement des nucléotides dans un fragment d'ADN
simple brin par la méthode de Sanger comporte deux étapes, lesquels ?

- Séquençage automatique : marquage des produits d'extension

Dans le séquençage automatique, des marqueurs fluorescents sont utilisés, un
marqueur différent pour chaque ddNTP (bleu, rouge, vert, orange...etc.). La
polymérisation se fait dans un seul tube contenant le mélange réactionnel et les
quatre ddNTPs. La séparation est faite selon la figure suivante.
•Pour connaître la séquence des DNA, on fait synthétiser un brin du DNA par
une enzyme spécifique.
• L’enzyme commence son travail à partir de l’extrémité 3’ d’une sonde
hybridée qui sert d’amorce. Elle ajoute des nucléotides complémentaires de ceux
du brin de DNA qu’elle copie.
• On lui donne pour substrats des désoxynucléosides triphosphates normaux
mélangés avec des didésoxynucléotides dont la fonction alcool secondaire en 3’
est réduite ce qui empêche la synthèse de se poursuivre au delà.
• Les didésoxynucléotides incorporés en dernier sont marqués spécifiquement
par des molécules fluorescentes (vert pour didésoxyA, bleu pour didésoxyC,
jaune pour didésoxyG et rouge pour didésoxyT)
• On sépare ensuite les fragments synthétisés dans un champ électrique
(électrophorèse : les DNA sont des anions, ils vont donc vers le pôle +), en
fonction de leur longueur (les plus petits vont plus vite).
• On lit ensuite les taches successives, identifiées par leur couleur, ce qui révèle
la séquence des fragments synthétisés.

II - TECHNIQUE CHIMIQUE DE MAXAM ET GILBERT

Elle est peu utilisée actuellement pour des raisons de pollution. L’ADN à
séquencer est tout d’abord marqué en 5’ avec du 32P puis clivé après A, C, G ou
T par divers réactifs chimiques.

Exemples :
 - Le diméthylsulfate : pour G et A par chauffage ; en jouant sur les conditions
opératoires, on peut favoriser le clivage en A ou en G.
- L’hydrazine clive au niveau de C et T, le clivage s’effectue au niveau des
2 bases ; mais suivant les conditions, l’un des deux clivages est grandement
privilégié.

Après ces clivages, les différents fragments obtenus sont séparés par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
L’examen de l’autoradiographie correspondante permet de connaître les
séquences du brin analysé.
 TECHNIQUE DE SOUTHERN ET TECHNIQUES PARALLELES

I - TECHNIQUES DE SOUTHERN
1 - Définition principe
Cette technique dite encore « Transfert selon southern » consiste à détecter
spécifiquement des fragments d’ADN (gène) sur filtre par leur hybridation à des
séquences complémentaires. C’est une technique initialement décrite en 1976 par
E .M Southern.

2 - Réalisation pratique
En pratique on précède par un certain nombre d’étapes successives qui sont :
- extraction de l’ADN ;
- digestion de l’ADN ;
- séparation des fragments ;
- transfert des fragments ;
- fixation des fragments ;
- lavage et révélation des bondes d’ADN.

a - Extraction de l’ADN génomique

Cette extraction s’effectue à partir des leucocytes circulants obtenus en général à
partir du sang total.

b - Digestion par des enzymes de restriction

L’ADN génomique est digéré par des enzymes de restriction différentes. Ainsi
plusieurs tubes de digestion sont préparés :

tube 1: ER1 + ADN

tube 2 : ER2 + ADN
tube 3 : ER 3 + ADN ....... (ER: enzyme de restriction)

Il est aussi possible de réaliser les digestions par 2 enzymes de restriction dans un
même un tube.
Dans ces conditions, on obtient un grand nombre de fragments, mais seuls
quelques-uns correspondent à une partie ou à la totalité du gène étudié ou
recherché.

c - Séparation des fragments obtenus

Elle se fait par électrophorèse sur un gel d’agarose. Après cette séparation
électrophorétique, des fragments d’ADN bicentenaires obtenus par digestion
enzymatique, on réalise une dénaturation de ces fragments par traitement alcalin
du gel d’électrophorèse. Ce traitement transforme les fragments d’ADN double
brins en fragments simple brins.
d - Transfert des fragments monocaténaires
Les fragments monobrins obtenus précédemment sont par la suite transférés du
gel d’agarose à un support souple comme par exemple une feuille de nylon. Ce
traitement s’effectue par simple capillarité.
e - Fixation des fragments
Les fragments monocaténaires sont fixés sur le support et hybridés dans les
conditions optimales.
En effet, les fragments monocaténaires transférés sur le support solide souple, sont
mis en présence d’une sonde qui va s’hybrider dans des conditions physico –
chimiques bien définies : on parle de condition optimale de stringence. La sonde
s’apparie alors avec le fragment d’ADN monocaténaire selon les règles
habituelles de complémentarité. Cette sonde est manquée avec un radioisotope
soit en son extrémité 5’P, soit à l’intérieur de la chaîne polynucléotidique.
f - Lavage et révélation
Après fixation et hybridation, le support solide subit plusieurs lavage afin
d’éliminer entre autre l’excès de produits radioactifs non fixé. Ce support est
ensuite mis en contact avec un film photographique pendant plusieurs heures ou
plusieurs jours. Le film sera ensuite révélé. Il pourra ainsi être décelé une ou
plusieurs bandes radioactives qui correspondent aux fragments de DNA
monocaténaire reconnus par la sonde. En effet ces bandes d’ADN monocaténaire
hybridées avec la sonde radioactive, sont visibles sous forme de bandes noires sur
un film blanc. La position de ces bandes par rapport à des témoins de poids
moléculaires, permet de déterminer la taille de ces fragments.

- Montage
3 - Les Applications de la Technique de Southern
Les applications sont très nombreuses. On peut citer entre autre :
*Etablissement d’une carte de restriction
Les enzymes de restriction coupent l’ADN aux niveaux des séquences
parfaitement connues. Il est ainsi possible d’établir une véritable carte de sites
de restriction d’un gène donné par la technique de Southern. Cette carte est dite
carte de restriction. Elle favorise la maîtrise et l’utilisation de l’ADN à des fins
médicales, agronomique etc…
*Mise en évidence des délétions
Si l’on dispose des sondes spécifiques de gène à explorer, la technique de
Southern permet de mettre en évidence des délétions dans le gène. L’étendu de
la délétion peut être estimée par la détermination de la taille des fragments
d’ADN.
*Comparaison des ADN de différents individus
Cette comparaison se fait avec la mise en évidence des polymorphismes de
restriction grâce à la technique de Southern.
En présence de mutations ponctuelles au niveau des sites de restriction, des
variations dans la taille de certains fragments seront observées et ceci par
exemple à l’intérieur d’une même population. Cette petite différence entre des
individus de la même population est qualifiée de polymorphisme de taille de
fragment. En anglais on parle de Restriction Fragment Lengh polymorphisme.
D’où le nom de technique RFLP.

4. AUTRES TECHNIQUES PARALLELES

a. TECHNIQUE DE NORTHERN
Southern étant le nom du chercheur ayant mis point la technique de Southern qui
permet de séparer les fragments d’ADN, il a été appelé Northern par analogie, la
technique consistant à séparer les fragments d’ARN.
b. TECHNIQUE RFLP
Cette technique de polymorphisme de longueurs de restriction, est une
technique qui permet de comparer les ADN de différents individus et de
rechercher si des mutations ponctuelles faisant apparaître ou disparaître des sites
de restriction se sont produites ou non.
*Principe
Deux ADN de séquences identiques traités par des enzymes de restriction
similaires donneront des fragments identiques. Les Southern-blots (tâche)
obtenus avec fragments de DNA seront donc identiques. Au contraire, si un site
de restriction a disparu à la suite d’une mutation ponctuelle, les fragments
n’auront plus des tailles identiques. Ce qui sera visible sur les autoradiogammes.
Il en est de même si un nouveau site de restriction est apparu suite à une
mutation. Cette technique est souvent utilisée dans l’étude de la drépanocytose.
c-TECHNIQUE DES DOTS
Cette technique des dots, c’est dires des tâches, est assez simple car pas de
digestion par les enzymes de restriction.
En pratique, un échantillon est déposé sur un filtre en nylon. Puis comme la
technique de Southern, on procède successivement à la dénaturation, à
l’hybridation, au lavage et l’autoradiographie. Ce qui permet d’observer les
tâches représentant les fragments. Cette technique est souvent utilisée dans
l’étude des hépatites.
 APPLICATION DES TECHNIQUES BIOLOGIQUES

Introduction
Les applications des techniques de la biologie moléculaires sont, de nos jours, très
nombreuses. Elles sont utilisées dans plusieurs domaines de la vie modernes. On
peut citer entre autres la police judiciaire et frontalière, les industries
électroniques, les industries pharmaceutiques, la médecine et les laboratoires de
recherches.

I - IDENTIFICATION DES DNA NORMAUX : empreintes génétiques

A- GENERALITES
Les empreintes génétiques ont été décrites par JEFFREYS en Angleterre en 1985
et sont utilisés depuis 1987. Elles permettent d’identifier un individu par son ADN
et ceci dans des cas aussi divers : crimes, violes, recherche de paternité, avec
pratiquement aucun risque d’erreurs.

B - ECHANTILLON UTILISE
Le prélèvement contenant le DNA à identifier est selon les cas, une goutte de sang,
du sperme, les fragments de cheveux etc.… ; en fait, toute cellule nucléé.

C – TECHNIQUES UTILISEES
Deux techniques sont très utilisées : la RFLP et le PCR

1 - Utilisation de la RFLP
a – Polymorphisme de restriction
a1 - Définition et principe
Un locus est l’emplacement occupé par un gène (ou segment de DNA) sur un
chromosome.
Un allèle est une des diverses séquences nucléotidiques polymorphiques qui
peuvent occuper un même locus.
Les séquences codantes de notre DNA sont généralement très semblables d’un
sujet à l’autre. Alors qu’au contraire, les séquences non codantes ont subi d’assez
grandes variations au cours de l’évolution. Dans cette partie non codantes, se
trouvent des séquences appelées minisatellites ou VNTR (Variable Number of
Temdem Repeat). Il s’agit de la répétition d’une même séquence nucléotidique.
Le nombre de répétition de cette séquence est variable d’un individu à un autre et
se transmet héréditairement.

a2 - Données pratiques
Considérons les individus 1 et 2, un locus L et une séquence S.
 • Individu 1 qui a :
- dans un locus L, hérité de son père une séquence S répétée 3 fois.
- dans ce même locus, mais hérité de sa mère, la même séquence S mais répétée
un nombre de fois différent, par exemple 8 fois.

• Individu 2 qui a :
- dans ce même locus L, hérité de son père cette même séquence S mais répétée 7
fois.
- dans ce même locus, mais hérité de sa mère, cette même séquence répétée 5 fois

Dans les 2 cas, il s’agit d’un même locus mais qui prend des formes différentes
selon le nombre de répétitions de séquences. On dit qu’il y a un polymorphisme
de répétition. Il s’agit là d’un type de polymorphisme autre que le polymorphisme
dû à un changement de bases.

a3 - Détermination du nombre de répétition

- Fragmentation de DNA par les enzymes de restriction.
Pour déterminer le nombre de répétition par RFLP, le DNA est tout d’abord extrait
à partir du noyau des cellules présentes dans l’échantillon biologique prélevé.
Quand il s’agit par exemple d’un échantillon de sang, le DNA est extrait des
leucocytes.
Les enzymes de restriction utilisées doivent reconnaître un site de restriction situé
non pas à l’intérieur du groupe des séquences répétées, mais juste à côté. La
longueur des fragments obtenus sera alors fonction du nombre de répétition de la
séquence S dans le locus.

a4 - Transfert des fragments selon SOUTHERN

Après clivage du DNA par les enzymes de restriction, un transfert est effectué.

a5 - Hybridation
Deux types de sondes peuvent être utilisés : uniloculaire et multiloculaire.

a6 - Hybridation avec sonde uniloculaire

Une sonde uniloculaire reconnaît une séquence unique du locus, situé juste à côté
du groupe de séquences répétées. Le résultat est présenté dans le schéma suivant :

Fig. voir bibliographie

 • Les Applications

Cas de viol
Dans un prélèvement obtenu par écouvillon vaginal, deux populations de cellules
coexistent : les spermatozoïdes du violeur et les cellules vaginales de la victime.
Après avoir effectué une lyse cellulaire différentielle, il est possible d’obtenir
l’empreinte génétique de la victime avec le DNA des cellules vaginales et celle
de l’agresseur avec le DNA des spermatozoïdes. On compare avec les empreintes
des suspects.
Exo :Exemple de résultats dans le tableau suivant.

Dans cet exemple, les suspects 1 et 2 peuvent être innocentés. Répresenter.

- Cas de crime

Considérons la figure suivante obtenue après électrophorèse de sang d’une

victime et du sang de 5 suspects.
Exo : Faire une figure représentant les empreintes génétiques RFLP avec une
sonde uniloculaire dans le cas de crime. On observe que le sang recueilli sur le
lieu du crime n’appartient pas à la victime, mais à l’agresseur. Les suspects 1, 2,
3, 5 peuvent être innocentes.
Reprenons l’exemple précédent concernant les 2 individus 1 et 2.
- La RFLP de l’individu 1 relèvera avec une sonde uniloculaire 2 fragments
de taille différente, donc 2 bandes sur l’image radiographique.
- Il existe une certaine probabilité pour que les deux allèles de l’individu 2
soient différents de celle de l’individu 1
- la comparaison des deux empreintes génétique à 2 bandes est donc très
simple.
Mais il arrive que la sonde reconnaisse un locus ayant des zones répétitives de
même taille chez 2 individus. Pour augmenter le pouvoir discriminant, il suffit
d’utiliser plusieurs sondes uniloculaires. Plus on augmente le nombre de sondes
et donc le nombre de locus étudiés, plus on augmente la probabilité de trouver une
différence.
On peut ainsi déshybrider puis réhybrider la membrane plusieurs fois avec
différentes sondes. La nouvelle sonde reconnaîtra chaque fois une séquence
unique de locus différent.
Ainsi avec 4 sondes par exemples, la probabilité de retrouver la même empreinte
génétique dans une population est de 10-6 à 10-15.

NB : cas homozygote.
Dans l’exemple ici choisi (individu 1 et 2), il s’agit de sujet hétérozygotes ayant
hérité de leur père un allèle différent de celui de leur mère. Bien évidemment,
lorsqu’il s’agit d’un sujet ayant hérité du même allèle pour son père et sa mère
(homozygote), on aura une seule bande et non 2 bandes détectées.

 Nomenclature de locus
Un locus est défini par un groupe de lettres et de chiffres.
Exemple D2 S44
Par convention D signifie DNA, le numéro suivant désigne le chromosome, la
lettre suivante est S s’il s’agit d’une séquence unique puis un numéro de catégorie
de sonde termine l’ensemble. La sonde qui explore le locus D2 S44 a pour cible
une séquence unique et pour catégorie 44. c‘est une sonde uniloculaire située sur
le chromosome 2 du DNA.
• Interprétation de profil
Crime : l’identification consiste à comparer les empreintes génétiques de la
victime, celle des suspects et celle obtenue à partir de tache de sang recueilli sur
le lieu du crime.
Viol : un suspect peut être innocenté si l’empreinte génétique obtenue avec son
sang est différente de celle donnée par les spermatozoïdes recueillis chez la
victime.
Les spermatozoïdes donnent deux bandes car bien que le DNA de spermatozoïdes
ne comprenne qu’un chromosome. Il s’agit d’une population mixte constituée de
spermatozoïdes de type X et de spermatozoïdes de type Y.

Recherche de paternité
On est amené à comparer les empreintes de la mère, de l’enfant et du père
présumé. On ne s’intéresse pas à la bande de l’enfant correspondant à l’allèle
hérité de sa mère, mais à la 2eme bande, celle héritée de son père. On cherche à
situer cette 2ème bande chez le ou les pères présumés.
Exo Représenter un exemple de figure dans lequel, on voit nettement que l’allèle
inférieur de l’enfant a été transmis par la mère. Pour l’allèle supérieur, les pères
présumés 2 et 3 peuvent être exclus. Le père présumé 1 pourrait être le père
biologique. Ce travail peut être poursuivit par d’autres sondes pour analyser
l’enfant et le père 1.
Mère enfant pères présumes

1 2 3
Recherche de maternité
Elle peut être effectuée lors d’une substitution d’enfant ou d’un vol d’enfant (voir
recherche de paternité).
Identification d’individus
Cette recherche permet d’identifier un cadavre lors d’une catastrophe de train ou
d’avion…, en comparant les empruntes génétique du mort avec celles d’un
ascendant ou d’un descendant présumé. On peut aussi prendre des échantillons de
cheveux du défunt.

a8- Hybridation avec une sonde multiloculaire

Une séquence répétitive peut être située sur plusieurs locus. Cette séquence
présente quelques variations d’un locus à l’autre. Il s’agit en fait d’une famille de
séquences comportant un motif central commun. Ce qui permet dans les
conditions d’hybridation pas trop stringente, de les révéler avec la même sonde.

Une sonde multiloculaire reconnaît en effet le cœur d’une séquence répétitive,

donnée. Elle reconnaît donc tous les locus où se trouve cette séquence même
lorsque ces locus sont situés sur plusieurs chromosomes. Chez un même individu,
une sonde peut ainsi s’hybrider avec par exemple 4 locus en une seule hybridation.
On obtiendra finalement sur le film autoradiographique, une succession de bandes
dont le nombre et la localisation sont spécifiques d’un individu. Plus on étudie les
bandes, plus on augmente la probabilité de trouver une différence entre 2
individus. Il suffit en général de retenir que 20 à 30 bandes pour cette étude.
Exo : Représenter une figure des empruntes génétiques (EG) avec une sonde
multiloculaire dans le cas d’une identification de 2 individus ; tel que 2 séquences
a et n ont la même taille.
Comme elles sont reconnues par la même sonde, elles forment donc une bande au
même niveau. Quant aux autres bandes, la migration s’effectue en des niveaux
différents. Les individus 1et 2 peuvent être considérés comme différents.

La probabilité P pour que 2 sujets qui ne sont pas de vrais jumeaux ait par hasard
la même empreinte génétique, est infime et diminue avec le nombre de bandes
étudiées. Elle est également P = 1/4n avec n le nombre total de bandes communes
entre 2 profils. Ainsi, les calculs théoriques indiquent qu’il aurait une chance sur
68 milliards de rencontrer 2 individus ayant 18 bandes communes à la même
position. La réalité pratique est cependant différente et la probabilité de trouver 2
individus ayant ces 18 mêmes bandes est en faite plus élevé.

Comme avec les sondes uniloculaires, l’interprétation se fait par comparaison de

2 profils. Mais l’interprétation du film est plus délicate dans le cas des sondes
multiloculaires puisqu’il y’a d’avantage de bandes.

Recherche de paternité
Sur le film autoradiographique, on examine chaque allèle de l’enfant. Selon le
même principe que précédemment, on s’intéresse aux allèles de l’enfant que l’on
ne retrouve pas chez la mère. Si on les retrouve chez le père présumés, celui ci
est bien le père biologique de l’enfant.

Représenter les Empreintes génétiques FRLP avec une sonde multiloculaire dans
le cas de la recherche de paternité.

Mère Enfant père présumé

1 2
Le père présumé 2 peut être exclu. Pour simplifier le travail, seul le schéma d’un
segment du film a été représenté. L’examen de la concordance des bandes permet
de conclure que le père 1 est le père biologique.

2 - La PCR et empreintes génétiques

La PCR appliquée à la détermination des empruntes génétique a été introduite
récemment. Elle est utilisée dans les cas où il y a peu de DNA à identifier ou bien
lorsque le DNA est partiellement dégradé.
La séquence que l’on choisit d’amplifier est sélectionnée en raison de son
polymorphisme qu’il s’agisse d’un polymorphisme de répétition ou de séquence.
Au lieu de couper la région sélectionnée par un enzyme de restriction on l’amplifie
par PCR grâce à des amorces qui encadrent cette région.

Si la technique PCR présente le grand avantage de permettre des déterminations

sur de faibles quantités de DNA, il faut se rappeler que cette technique nécessite
des précautions afin d’éviter l’amplification des DNA contaminant.

a – Polymorphisme de répétition
Les amorces de PCR utilisées sont donc des séquences uniques situées de part et
d’autre du minisatellite.
Après amplification de la région souhaitée, les fragments de DNA obtenus seront
séparés par électrophorèse selon leur taille.
Comme la quantité du DNA à analyser est plus importante, on peut éviter les
techniques recourant à un transfert suivi d’hybridation avec des sondes
radioactives. Les fragments de DNA sont donc directement visualisés grâce au
BET et au rayons U. V.