PROJET DE FIN D’ETUDES

Pour l’obtention de la Licence professionnelle

Option : Biotechnologie végétale

4ème promotion

Effet de biopesticide d'origine végétale et

de biopessticide microbien sur le botrytis
cinerea

Présenté par : Encadré par :

Pr.
LACHGAR Ayyoub

Soutenu le 25 juin 2016 devant la commission du jury :

: Professeur à la faculté poly disciplinaire de Taroudant : Président

: Professeur à la faculté poly disciplinaire de Taroudant : Examinateur

: Professeur à la faculté poly disciplinaire de Taroudant : Encadrant

 DEDICACE

Nous dédions ce modeste travail :

Nos parents,

Aucune dédicace ne saurait exprimer notre immense

amour, notre

Estimes, notre profonde affections et nos reconnaissance

pour tous les

Sacrifices consentis pour notre bonheur et nos réussites.

Merci pour

Votre soutien et votre amour.

Tous ceux qui nous sont chers.

Tous ceux qui,

D’une manière ou d’une autre,

Ont contribué à l’aboutissement de ce travail

2
 REMERCIEMENTS

Cette étude a été réalisée sous la direction de Madame le Professeur Khadija

ELMAHRACH, a qui nous exprime toute nos gratitude pour avoir encadré ce travail.
Nous remercie pour vos conseils, votre patience, votre disponibilité et votre temps
investi pour réussir ce travail.

Nous adresse nos sincères remerciements à Monsieur le Docteur Rachid

BOUHARROUD pour son encadrement, sa patience, sa bienveillance et son
appui pour aboutir à ce travail.

Nos remerciements s’adressent aussi au Monsieur Redouan Quessaoui

pour avoir procuré toutes les facilités nécessaires pour la réalisation de ce travail.

Nous adresse nos sincères remerciements à Monsieur Abderrahim

Amarraque pour avoir fourni gracieusement tout le matériel nécessaires pour
réalise ce travail. Merci pour votre accueil et votre disponibilité.

Nos vifs remerciements s’adressent aussi à l’équipe de l’administration de

l’INRA d’Agadir et aux responsables.

Enfin, nous remercie toute personne qui a contribué de près ou de loin à la

réussite de ce travail.

3
 Résumé
Ce travail s’intéresse à l’étude de l’activité antifongique d’un extrait de plante,et
de quatre isolats de Pseudomonas fluorescents contre Botrytis cinerea. Cela a pour
but de contrôler la maladie de la pourriture grise de la tomates par des biopesticides
microbiens.

L’évaluation in vitro du potentiel antifongique d’extrait de plante a montre une

forte inhibition vis à vis les champignons avec une inhibition qui atteinte 88%. Les
résultats de la germination des spores ont montrée que le biopesticide possède une
inhibition significative des spores, Ce biopesticide végétale peuvent constituer un
moyen de lutte biologique efficace dans les verger et dans les stations de
conditionnement à l’encontre de Botrytis cinerea, pour limiter l’utilisation d’intrants
chimiques.

Les résultats de test in vivo montrent que les isolats de Pseudomonas

fluorescents, ne montrent aucun effet sur le botrytis cinerea.

Mots clés : Botrytis cinerea, Tomate, extrait de plante , Pseudomonas

4
Sommaire

DEDICACES .................................................................. Error! Bookmark not defined.

REMERCIEMENTS ................................................................................................... 3
Résumé.. ........................................................................................................................ 4
Liste des figures ............................................................................................................ 7
Liste des tableaux ......................................................................................................... 7
Liste des photos ............................................................................................................ 7
Introduction .................................................................................................................. 8
Synthèse bibliographique ............................................................................................ 9
Chapitre I : Généralités sur la culture de la tomate .............................................. 10
I. Quelques généralités sur la tomate ............................................................ 10
II. Importance de la culture au niveau mondial ............................................ 10
III. La culture de la tomate au Maroc : ............................................................ 11
IV. Problèmes phytosanitaires de la tomate .................................................... 12
1. Nématodes .................................................................................................. 12
2. Ravageurs ................................................................................................... 12
3. Maladies bactériens .................................................................................. 14
4. Maladies virals ........................................................................................... 15
5. Maladies cryptogamiques ......................................................................... 16
Chapitre II : Généralités sur botrytis cinerea ..................................................... 18
I. Gamme d'hôte .............................................................................................. 18
II. Symptômes de la pourriture grise .............................................................. 19
III. Méthodes de lutte ........................................................................................ 20
1. Méthodes chimique................................................................................... 20
2. Méthodes culturales ................................................................................. 20
3. Méthodes biologiques ................................................................................ 20
Chapitre III : Les biopesticides ............................................................................... 21
1. Définition .................................................................................................... 21
2. Les avantages des biopesticides microbiens ............................................ 21
3. Les avantages des biopesticides d’origines végétales ............................. 22
Matériel et Méthodes ................................................................................................. 23
I. Matériel biologique ...................................................................................... 24
5
 1. L’agent pathogène ..................................................................................... 24
2. Isolats bactériens ....................................................................................... 24
I. Effet de l’extrait des plantes (biopeticides) sur le champignon Botrytis
cinerea. .................................................................................................................... 25
1. Préparation de milieu de culture pour botrytis cinerea ........................ 25
2. Repiquage de champignon ........................................................................ 26
3. Filtration des spores ................................................................................. 27
4. Confrontation d’extrait de plante et de champignon ............................. 29
II. Effet de bactérie pseudomonas sur le champignon Botrytis cinerea. .. 31
1. Préparation de milieu de culture pour la bactérie ................................. 31
2. Repiquage des bactéries ............................................................................ 31
3. Pulvérisations des spores sur les 4 souches de pseudomonas ................ 32
Résultats et Discussion ............................................................................................... 34
I. Effet de l’extrait des plantes (biopesticides) sur le champignon Botrytis
cinerea : ................................................................................................................... 35
II. Effet de bactérie Pseudomonas sur le champignon Botrytis cinerea. ..... 36
Conclusion .................................................................................................................. 36
Références bibliographiques .................................................................................... 37

6
 Liste des figures

Figure 1:Evolution de la superficie et de la production nationales globales de la

culture de tomate. (DDFR/DFV, 2011) .................................................................... 12

Liste des tableaux

Tableau 1:Principaux pays producteurs de la tomate (FAOSTAT, 2011) ........... 10

Tableau 2:Les principaux pays exportateurs de tomates (CNUCED, 2010) ........ 10
Tableau 3:Répartition de la production de tomate par région (DDFR/DFV, 2011)
...................................................................................................................................... 11
Tableau 4:Principaux ennemis de la culture de la tomate ..................................... 12
Tableau 5:Principales maladies bactérienne (Chibane, 1999) ............................... 14
Tableau 6:Principales maladies virales (Veschambre et al., 1995) ....................... 15
Tableau 7: Principales maladies cryptogamiques de la tomate. (Chibane, 1999) 16

Liste des photos

Photo 1:Symptômes causés par l’agent pathogène Botrytis cinerea sur différents
hôtes. ............................................................................................................................ 19
Photo 2:coulage de milieu PDA dans des boites de pétri. ....................................... 25
Photo 3:chambre de culture ...................................................................................... 26
Photo 4:disques de milieu de culture contenant Botrytis cinerea été repiqué dans
des boites de Pétri contenant le milieu de culture PDA. ......................................... 26
Photo 5:raclée le champignon à l'aide d'une l'anse stérile. .................................... 27
Photo 6:filtration des spores ..................................................................................... 28
Photo 7:dénombrement des spores sur cellule de mallassez. ................................. 28
Photo 8:reffroidissement du milieu à 45°c . ............................................................. 29
Photo 9:L'ajoute des spores sur milieu PDA. .......................................................... 29
Photo 11:A :Remplir des puits par le biopesticide ;B :Boite Témoin. .................. 30
Photo 12:L'ensemencement des bactéries. ............................................................... 32
Photo 13:pulvérisation des spores sur la bactérie. .................................................. 33
Photo 14: Inibition de germination du champignon se forme d’un halo. ............. 35
Photo 15:résultats de confrontation du champignon. ............................................. 36

7
 Introduction

La culture de la tomate est considérée comme étant la principale culture

maraîchère au Maroc, elle occupe par conséquent une place motrice dans l’économie
du pays (Mokrini et al., 2010).En raison de leur teneur élevée en eau et de leur
richesse en élément nutritifs, la tomate sont très susceptibles aux attaques des
champignons pathogènes (Eckert and Ogawa, 1985; Tripathi and Dubey, 2004).

La pourriture grise c’est l’une de plus importante maladie qui est due à des
infections initiées soient avant la récolte, ou après la récolte des fruits, et l’agent
responsable c’est Botrytis cinerea. La maitrise de ce parasite n’est accomplie qu’au
prix d’interventions chimiques fréquentes, celles-ci présentent par contre, des effets
néfastes sur l’environnement et favorisent le développement de souches résistantes.
En effet, le Botrytis cinerea a développé une résistance particulièrement aux
benzimidazoles. En outre, l’utilisation intensive de l’imazalil, comme produit de
remplacement, a également réduit la sensibilité de Botrytis cinerea à ce fongicide. La
prise de conscience du coût environnemental de ces pratiques et les craintes des
consommateurs du danger que peuvent provoquer les résidus de pesticides pour la
santé humaine, font naître un intérêt grandissant pour d’autres alternatives de lutte.
Parmi les alternatives envisagées c’est la lutte biologique qui vise à contrôler la
maladie de la pourriture verte par des biopesticides. (El guilli M et al 2009).

Actuellement, les centres et les laboratoires de recherches agricoles ont

commencé à chercher des nouveaux moyens de lutte biologique qui visent à contrôler
les agents pathogènes par des biopesticides.

8
 Synthèse
bibliographique

9
 Chapitre I : Généralités sur la culture de la tomate

I. Quelques généralités sur la tomate

La tomate (lycopersicon esculentum) est d’origine sauvage américaine, en

particulier d’Amérique centrale et Amérique du Sud (Mexique, Pérou, Equateur et
Bolivie) (Kolev, 1976). C’est une plante annuelle de la famille des Solanacées, dont le
fruit est une baie de couleur rouge, parfois jaune ou orangée, de forme ronde ou plus
ou moins allongée, lisse ou creusée de sillons. Les fruits sont toujours charnus et
contiennent, noyées dans la pulpe, une grande quantité de petites graines blanches,
plates, réniformes.

II. Importance de la culture au niveau mondial

La production mondiale de tomate progresse régulièrement passant de 64 millions

de tonnes en 1988 à plus de 112 millions en 2010 (FAOS TAT, 2012), dont 30
millions sont destinés à la transformation.

Tableau 1:Principaux pays producteurs de la tomate (FAOSTAT, 2011)

Tableau 2:Les principaux pays exportateurs de tomates (CNUCED, 2010)

10
III. La culture de la tomate au Maroc :

Grâce à l’extension de la production sous serre, essentiellement dans la région

du Souss Massa, que le Maroc a connu ces dernières années une forte augmentation
de la production de la tomate pour conquérir plusieurs marchés internationaux et
figurer parmi les premiers pays exportateurs de la tomate au monde (Tableau 2). Tout
cela a poussé les producteurs exportateurs à mieux développer cette culture et
s’organiser pour rendre ce secteur plus stratégique dans l’économie nationale.

Tableau 3:Répartition de la production de tomate par région (DDFR/DFV, 2011)

La tomate est l’une des cultures les plus importantes parmi les primeurs. Elle
représente 27% de la superficie et assure 63% de la production globale et 70% des
exportations de primeurs. En effet, avec une superficie de 20 100 ha, le secteur de la
tomate assure une production totale de 1,3 millions de tonnes dont 410 000 tonnes
sont destinées à l’exportation (FAOSTAT, 2012). Par ailleurs, la production en tomate
sous serre contribue avec plus de 60% dans la production globale de tomate.

La figure 1 représente l’évolution de la superficienationale globale de la tomate

cultivée durant la période allant de 2002/2003 à 2009/2010, ainsi que l’évolution de la
production du secteur pour la même période. (DDFP/DFV, 2011).

11
 Figure 1:Evolution de la superficie et de la production nationales globales de la
culture de tomate. (DDFR/DFV, 2011)

IV. Problèmes phytosanitaires de la tomate

1. Nématodes

Généralement, les attaques de nématodes se traduisent par des galles au niveau

des racines de la plantes. Elles sont causées par les nématodes à galles ou les
meloidogynes Tylenchida : Heteroderidae. La tige rabougrit, les feuilles jaunissent et
enfin la plante dépérit. Les méthodes de luttes préconisées contre ces biogresseurs-a
se résument dans l’évitement des sols infestés, le traitement par des nématicides avant
la plantation et enfin l’usage des porte-greffes résistants (Chibane, 1999).

2. Ravageurs

Tableau 4:Principaux ennemis de la culture de la tomate

Ravageurs Dégâts Moyens de lutte

Acariens
-Sur feuilles : Brunissement de la Assurer un bon binage pour
Tetranychus urtica
Koch. 1836 : Acari, face inférieure. éliminer les plantes hôtes, éviter
-Sur fruit : la peau devient l'excès de certains produits
Tetranychidae Aculops
lycopersici Massee. 1937 : suberifiée et présente des chimiques qui peuvent éliminer

12
Acari, Eriophydae.
craquelures.
Noctuelles (Lepidoptera,
Les jeunes chenilles dévorent
Noctuidae)
Helicoverpa armigera le collet et entraînent la mort
Hübner. 1803
de la plante.
Chrysodeixis chalcites
Esper. Sur fruit : les larves creusent
1789
des galeries qui évoluent en
Spodoptera littoralis
Boisduval. 1833 pourriture, puis une chute
Spodoptera exigua
prématurée des fruits attaqués.
Hübner.
1808
Aleurodes (Homoptera:
Les aleurodes absorbent le
Aleyrodidae) Bemicia tabaci
Genn. 1889 Trialeurodes contenu cellulaire entraînant
vaporariorum West. 1856
l’affaiblissement des organes
attaqués Dégâts indirects :
Miellat, fumagine et
transmission par B. tabacidu
TYLCV.
L’attaque se caractérise par
la présence de plages
décolorées nettement
visibles. Les larves dévorent
Tuta absoluta Meyrick. 1917 : seulement le parenchyme en
Lepidoptera, Gelechiidae laissant l’épiderme de la
feuille. Les mines sont de
les auxiliaires naturels et faire
apparaitre des réssistences chez
leravageur et traitement
chimique avec des acaricides.
Traitement insecticide à base de
pyréthrinoïdes
(Deltamethrine, permethrine
etc..) en alternance avec les
autres insecticides
couramment utilisés
Utiliser les pièges jaunes pour
suivre la population de la
mouche blanche qui
transmet le virus TYLC,
raisonner la lutte chimique
en fonction des résultats des
piégeages,utiliser les
produits homologués dés
l’apparition des 1ères larves,
décaler les dates de semis par
rapport à la période
d’activité de l’insecte et à
son alimentation et arracher
les mauvaises herbes qui
peuvent héberger les insectes ou
le virus.
Respectez un délai de vide
Sanitaire d’environ 6 semaines
entre l’arrachage
d’une culture infestée et la
plantation. En début d’attaque,
retirez et détruisez les organes
(feuilles et fruits) infestés par les
13
 formes irrégulières,
blanchâtres et transparentes.
En pénétrant dans le fruit,
elles laissent un orifice
formé par les restes du fruit et
les excréments de la larve
larves.Utilisation des pièges à
phéromones :des pièges à
eau et des pièges de type
Delta Procéder aux lâchers
d’insectes prédateurs dans
les serres dès les premières
captures. Notamment
Nesidiocoris tenuis
Macrolophus caliginosus

3. Maladies bactériens

Tableau 5:Principales maladies bactérienne (Chibane, 1999)

Agents causaux Symptômes et dégâts Méthodes de lutte

Sur feuille : apparition d’un
flétrissement unilatéral, suivi d'un
dessèchement total. Des coupes
longitudinales sur tige et pétioles
Chancre
montrent des stries brunâtres et en
bactérien Eviter les terrains
cas de forte chaleur et humidité
infestés, éviter l'apport
Clavibacter relative élevée, on observe des
excessif d'azote, éviter
chancres ouverts sur tiges et
michiganensis les excès d'eau,
pétioles. Sur fruit : formation des
éliminer les plants
Subsp taches blanchâtres, dont le centre
malades,appliquer des
brunit et s'entoure d'un halo jaune
fongicides à base de
clair, d'où le nom de "oeil d'oiseau"
cuivre qui ont un effet
Sur feuillage : apparition des taches
bactériostatique,
brunâtres relativement régulières
utilisation de semences
entourées d'un halo jaune. De
certifiées, traitement de
nombreuses taches entraînent le
Gale bactérienne semences et utilisation
dessèchement de folioles et la
des variétés résistantes
Xantomonas chute des feuilles. Sur fruit : de
petits chancres pustuleux

14
 vesicatoria Doidge. apparaissent et prennent un aspect
liégeux .

Sur feuillage: apparition des taches

noires de contour irrégulier
Moucheture de la entourées d'un halo jaune. Ces
tomate taches peuvent se joindre et
Pseudomonas syringae forment une plage nécrotique brun-
Van Hall. sombre. Les folioles se dessèchent
et tombent. Si l'attaque est précoce,
on assiste à une coulure importante
des fleurs. Sur fruit : on observe des
taches brunes nécrotiques.

4. Maladies virals

Tableau 6:Principales maladies virales (Veschambre et al., 1995)

Agents causaux Symptômes et dégâts Moyens de luttes

Ralentissement de la
croissance,jaunissement des folioles,
enroulement des feuilles en forme de
cuillère, rabougrissement des plants
TYLCV
infectés et fruits petits et peu
Tomato Yellow
Leaf Curl Virus nombreux.
Vecteur : Bemisia tabaci Genn
Les feuilles présentent une marbrure
ou une mosaïque en plages vertes,
blanches ou jaunes selon la souche et
TMV Tomato on observe également une croissance
Mosaic Virus
chétive et des décolorations au niveau
des fruits. Vecteur : vecteur naturel
n’est pas connu mais les machines ou
Lutte biologique: utilisation des
auxilieres tels que :Eretmocerus
sp contre la mouche blanche
(Hanafi, 2000).Lutte
culturale:éliminer les sources
primaires et secondaires du
virus, utilisation de filets
étanches.
Utiliser des graines libres de
pathogènes et détruire les
plantes contaminées, éviter le
contact avec les plantes
infectées ainsi qu’avec le tabac,
ne pas fumer du tabac à
proximité des plantes, éviter la

15
 la main d’œuvre transmettent le virus présence d’autres Solanacées
physiquement ainsi que les graines. dans les environs du champ et
utiliser des variétés résistantes.
Rabougrissement des pieds de tomate, Cultiver des variétés
les feuilles peuvent montrer de résistantes,éliminer les
légères marbrures vertes et les fruits mauvaises herbes ainsi que les
CMV sont de taille réduite et souvent plantes ornementales qui
Cucumber
difformes. recèlent le viru et arracher les
Mosaic Virus
Vecteur : différentes espèces
pieds contaminés pour limiter la
de pucerons.
propagation du virus.

5. Maladies cryptogamiques

Tableau 7: Principales maladies cryptogamiques de la tomate. (Chibane, 1999)

Agents causaux Symptômes et dégâts Méthodes de lutte

Apparition des taches jaunâtres
Mildiou qui brunissent rapidement. Sur
la face inférieure des feuilles :
Phytophtora
infestans apparition d’un duvet blanc,
grisâtre qui dissémine les spores
et les tiges attaquées
noircissent et la plante meurt
en quelques jours.
Eviter les excès d'azote et
d'eau, élimination des plants
malades, effeuillage régulier,
traitements chimiques
préventifs, alterner les produits
pour éviter l'accoutumance .

Sur feuille et tige: Apparition Réduire les sources

(Pourriture grise) des taches brunâtres
accompagnées d'un duvet
Botrytis cinerea
Pers grisâtre. Ces taches peuvent
évoluer en chancre sur tiges et
pétioles. Sur fruit : on observe
une pourriture molle grise.
Chute des fleurs et des
fruits
d'infection, destruction des
débris végétaux, choix de
variétés résistantes, éviter
l'excès d'eau, éviter l’excès
d'azote, et traitement
chimique, en préventif
(alterner les produits de la
famille benzimidazoles et les

16
 dicarboximides) .

Sur la face supérieure des Eviter les assoiffements des

Oïdium feuilles : Apparition de taches plant, supprimer les feuilles
Leveillula taurica
jaunes. Alors que sur la face basales attaquées par la
Lév.
Et Oïdium inférieure des feuilles on voit un maladie, stimuler la croissance
lycopersicum Cooke &
duvet blanc et après par un apport azoté et
Massee
jaunissement des feuilles, elles traitements chimiques.
se dessèchent et tombent. Une
malnutrition minérale accentue
la maladie qui ne se manifeste
jamais sur le fruit
Sur feuille : Apparition de Utilisation des variétés
taches arrondies noirâtres résistantes, destruction des
montrant des cercles fanes des cultures.
Alternariose
Alternaria solani concentriques. Des taches précédentes, rotation culturale
Sorauer.
chancreuses peuvent se adéquate et traitement
manifester sur tige. chimique .
Sur fruit : la maladie s'attaque
en premier lieu aux sépales
qui se nécrosent, puit passe aux
calices.

17
 Chapitre II : Généralités sur botrytis cinerea

Le champignon phytopathogène ubiquiste Botrytis cinerea, responsable de la

pourriture grise, est un microorganisme polyphage qui cause d'énormes dégâts en
agriculture. La maladie auséec par cet agent pathogène est économiquement
redoutable et importante car ce champignon attaque plus de 230 espèces de plantes.
Sur cultures maraîchères, viticoles et horticoles, en pré- ou en post-récolte, cette
maladie conduit à des pertes importantes de rendement.

Le champignon Botrytis cinerea vit sur les tissus des plantes, qu’ils soient morts
(déchets de culture, vieilles feuilles, fleurs fanées, etc.) ou vivants. Il peut
produire des spores ou du mycélium filamenteux. Très résistant, il passe l’hiver
facilement sous forme de sclérotes. Comme la plupart des champignons, le Botrytis
a besoin d’humidité pour son développement, mais dans son cas particulier, il a
besoin d’un film d’eau sur la plante pour se développer. Cette eau peut provenir des
arrosages (éclaboussures), des gouttes d’eau qui tombent du toit de la serre à cause
des battements du film de plastique par le vent, de la condensation ou autres.

I. Gamme d'hôte

Botrytis cinerea est un champignon polyphage capable d’attaquer plus de 230

espèces de plantes (Jarvis, 1980). Il affecte de nombreuses productions végétales
d'importance économique en culture sous serre ou en plein champ, comme par
exemple: le raisin, la pomme, la poire, la cerise, la fraise et le kiwi en production
fruitière, l’aubergine, la carotte, la laitue, le concombre, le poivron, la tomate, la
courgette en production légumière ou des plantes ornementales comme la rose, le
gerbera ou le cyclamen. Ce champignon est responsable de lourdes pertes
économiques sur de nombreuses cultures (Gullino, 1992). Un exemple de cette large
gamme d’hôtes est présenté dans la figure 1.

18
Photo 1:Symptômes causés par l’agent pathogène Botrytis cinerea sur différents hôtes .

II. Symptômes de la pourriture grise

Le parasite s’attaque à tous les organes des plantes, mais en s’installant d’abord
sur les tissus morts.

Sur Fleurs et fruits : L’attaque des fleurs commence généralement par les pétales
âgés et sénescents. L’inflorescence se trouve alors complètement envahie En cas de
développement du fruit, le champignon passe des pétales qui y adhèrent et provoque
une nécrose apicale du fruit. Celle-ci peut détruire tout une partie du fruit et peut
passer d’un fruit à l’autre lorsque les fruits se trouvent en contact.

Des Taches foliaires : Certaines espèces de Botrytis sont responsables de tâches

foliaires. Les tâches d’abord petites et limitées envahissent par la suite toute la
feuille.

Sur tige : Les infections des tiges sont extrêmement fréquentes, elles provoquent
l’apparition de chancres plus ou moins étendus, entravant la circulation de la sève et
la mort de la partie de la plante se trouvant au dessus des chancres .

19
Parties souterraines : Les fontes de semis à Botrytis sont observées généralement
par temps froid et humide. Elles sont fréquentes lorsque les sclérotes sont mélangées
aux semences et également lorsque le sol est infesté par les sclérotes et le mycélium.
Les infections des parties souterraines (bulbes, tubercules, racines) débutent à
n’importe quel point, mais elles ont lieu généralement à la base de ces organes ou au
niveau du collet. Les tissus infectés pourrissent.

III. Méthodes de lutte

1. Méthodes chimique

Actuellement la lutte contre la pourriture grise est très difficile car il existe dans
de nombreuses cultures des souches de Botrytis résistantes aux principaux fongicides
employés pour la combattre. Donc Un mélange de fongicides (vinchlozoline +
thirame) ou (diéthofencarbe + carbendazime) pourrait apporter une protection
satisfaisante.

2. Méthodes culturales

 Eliminer très rapidement les débris végétaux de la culture en particulier les

plantes et les fruits altérés.
 Eviter d’avoir des plantes très vigoureuses.
 Aérer au maximum les abris afin de diminuer l’hygrométrie de la serre ; éviter au
maximum la présence d’eau libre sur les plantes. Parfois, s’il s’impose,
l’effeuillage des plantes permettra une meilleure aération de celles-ci.
 Tailler précocement les bourgeons axillaires au ras de la tige afin d’obtenir des
plaies de taille les plus petites possibles et donc moins sensibles à la maladie.

3. Méthodes biologiques

Différents prouduits existant qui peuvent contribuer a assécher les plaies ou a

les protéger des contaminants extérieurs comme la pâte d’argile (p.ex.bentonite) et la
pâte de silice (p.ex.scaniavital slica de Biobest).

20
 A l’heure actuelle, de nombreuses options sont disponibles sur le marché.Les
biofongicides à base de bactéres et de champignons,sont efficaces pour lutter contre la
moisissurre grise.

Chapitre III : Les biopesticides

1. Définition

Ces biopesticides ou agents de lutte biologique, peuvent être définis comme des
produits phytosanitaires dont le principe actif est un organisme vivant ou l´un de ses
dérivés. Ils peuvent donc être constitués d´organismes (plantes, insectes, nématodes)
ou de micro-organismes (bactéries, levures, champignons, virus) exerçant une
activité protectrice sur les plantes vis-à-vis d´agents phytopathogènes, mais aussi de
substances d´origine naturelle telles que des extraits végétaux, phéromones,
etc…(Thakore 2006).

2. Les avantages des biopesticides microbiens

Tout comme les autres agents de lutte biologique, les biopesticides microbiens
sont écologiquement beaucoup plus compatibles que les produits chimiques et ont
une spécificité accrue vis-à-vis des pathogènes contre lesquels ils sont dirigés. Ils
sont par conséquence moins dommageables pour les organismes non ciblés de la
microflore endogène qui exerce une action bénéfique sur les plantes. De plus, les
biopesticides sont souvent efficaces en faibles quantités et leurs activités protectrices
peuvent relever de mécanismes multiples et déclenchent donc rarement des
phénomènes de résistance chez le pathogène à cause d´une faible pression de
sélection. En outre, ils peuvent compléter les pesticides conventionnels une fois
utilisés dans les programmes intégrés de la gestion des parasites (IPM) (Fravel 2005;
Thakore 2006). Par exemple, l'intégration du contrôle biologique avec des fongicides,
les pratiques culturales, et d'autres mesures peuvent contribuer au contrôle de la
rouille sur la tomate (Lourenco Junior et al. 2006). Les biopesticides peuvent
donc être complémentaires au traitement chimique, mais peuvent aussi être utilisés
dans des situations pour lesquelles aucune solution de contrôle utilisant des produits
de synthèse n´est actuellement disponible. Des agents microbiens sont utilisés à
21
travers le monde dans les champs et dans les serres (Jiet al. 2006; Leeet al.2006;
Minutoet al. 2006; Saravanakumaret al. 2007), pour combattre un grand nombre de
maladies causées par des pathogènes du sol, foliaires ou de post-récoltes. Ces
produits ont été développés pour contrôler de multiples maladies sur diverses
céréales, légumes, fruits et fleurs (Paulitz et Bélanger 2001; Fravel 2005).

3. Les avantages des biopesticides d’origines végétales

L'emploi des extraits de plantes comporte des avantages certains. Avec

l'augmentation des prix des produits chimiques et la rareté de ces produits sur les
marchés locaux, les produits biodégradables provenant de plantes constituent une
bonne alternative qui permet aux producteurs de pouvoir assurer la protection de leurs
semences à un coût relativement faible (Bouda et al., 2001). La réduction de l'emploi
des pesticides chimiques due à l'utilisation des extraits de plantes contribue
énormément à la réduction de la pollution de l'environnement et cela permet
également d'améliorer la santé publique des populations. L'emploi des extraits des
plantes dans la lutte contre les champignons est prometteur compte tenu de leur
efficacité et de leur innocuité sur l'environnement (Weaver et Subramanyam, 2000).

22
Matériel et
Méthodes

23
 Site d’étude

L’étude a été effectuée dans le Laboratoire de la protection de plantes au sein du

Centre Régional de la Recherche Agronomique-Agadir (CRRA-Agadir) de l’Institut
National de la Recherche Agronomique (INRA). CRRA-Agadir est l’un des 10
centres régionaux de l’INRA. Il est situé à ait Melloul à 14 Km de la ville d’Agadir.
Sa zone d’action qui s’étend sur les provinces de Guelmim, Tiznit et Agadir
Idaoutanane est estimée à une superficie globale d’environ 1.200 000 Ha. Il a été créé
dans le but de chercher les solutions aux différents problèmes posés à l’agriculture et
de contribuer par le biais des recherches et expérimentations à la mise en valeur
agricole de ces zones.

I. Matériel biologique

1. L’agent pathogène

Botrytis cinerea été fourni par le laboratoire national de recherche agronomique

d’Agadir (INRA). En vue de réaliser plusieurs repiquages successifs qui servent à
contrôler la pourriture grise ; des disques de milieu de culture Botrytis cinerea été
repiqué dans des boites de Pétri contenant le milieu de culture Potato-Dextrose-Agar
(PDA). Les boites, ainsi préparées, sont incubées à 25 °C pendant sept jours.

2. Isolats bactériens

Les dix isolats du genre Pseudomonas utilisé sont été isolés par
MrRedouanQUESSAOUI doctorant à l’institut national de recherche agronomique
d’Agadir,à partir du sol rhizosphérique. Les isolats antagonistes ont été repiqués dans
des boites de pétrie contenant milieu GN (Gélose Nutritive),incubés à 25°C pendant
24h.

24
 I. Effet de l’extrait des plantes (biopeticides) sur le champignon
Botrytis cinerea.

1. Préparation de milieu de culture pour botrytis cinerea

L’activité antifongique des extraits a été recherchée in vitro. Le microorganisme

testé est Botrytis cinerea , un pathogènes récoltés dans les plantes de tomate .

Le milieu de culture PDA est favorable pour la croissance des champignons

phyto pathogènes. Il contient de la pomme de terre, du sucre sous forme de dextrose
et de la gélose (Agar). On le préparé selon la procédure suivante:

- Peser 39 gramme de poudre de PDA dans un erlenmeyer de 1,5 litres, Ajouter

1 litre d'eau distillée.
- Mettre au bain-marie pour faciliter la dissolution de la gélose.

- Stériliser à l'autoclave à 121 oC pendant 15mn à une pression de 1,2 bar.

- Laisser refroidi jusqu'à 55 oC pour éviter la condensation de vapeur.

-Distribuer dans des boîtes de pétri stériles, 20 ml par boîte :

Photo 2:coulage de milieu PDA dans des boites de pétri.

-Mettre dans l’etuve pendant 24 heures pour vous assurer qu’il n’y a pas de
contamination

25
 Photo 3:chambre de culture

2. Repiquage de champignon

-Dans des conditions de stérilités très élevées, tous le matériel utilises été rincer
par l’éthanol.

-on prend une culture de champignon récente, On prend nos boites qui sont
prêts pour le repiquage, on les ouvrit à côté de Bec Bunsen.

-on prend un crochet, sterille, attendre qu’il refroidit pour ne pas abîmer les
champignons.

Photo 4:disques de milieu de culture contenant Botrytis cinerea été repiqué dans
des boites de Pétri contenant le milieu de culture PDA.
26
 -découper un petit disque, puis on dans nos boites voir (figure 5)

-a fin de terminer le repiquage, on mit nos boites dans l’etuve à une température
et humidité relatives pour le développement de ce champignon pendant 10 jusqu'à 15
jours.

3. Filtration des spores

A fin que tous nos culture a développé, On passe a la deuxième partie de

l’extraction des spores :

Materiel : boites de petri, erlenmeyer, bicher, entonoir, papier filtre, tubes.

Photo 5:raclée le champignon à l'aide d'une l'anse stérile.

Methode :

 On prend notre boite de pétri qui contient le champignon,

 On ajoute 5ml d’eau distille, et deux goutes de tween 80.
 On embrouiller le milieu pour obtient les spores.
 On verser le liquide sur une papier filtre qu’on est mis dans un
entonoir, qui est brancher avec un tube, pour récupérer le filtrat.

27
 Photo 6:filtration des spores

On faire une denombrement des spores pour obtient une quantité de 106 on
utilisant la cellule de Mallassez.

On prend par une micropepitte 1ml de filtrat, on le mis sur la cellule de

Mallassez, puis mettre sous un microscope.

Photo 7:dénombrement des spores sur cellule de mallassez.

On utilisant la relation suivante pour demontrer le nombre des spores,

Si nombre total = 200 spore.

Alors 200/20(nombre de carraux) = 10 * 105 = 106 spore

28
 4. Confrontation d’extrait de plante et de champignon

 Apres l’obtention des spores, on préparent un milieu PDA, et on lisse refroidir a

45°c sur la plaque chauffant.

Photo 8:refroidissement du milieu à 45°c .

 On prend un erlynmeyer stérile, on ajout 50ml de solution PDA , plus 50µl de

solution qui contient les spores.

Photo 9:L'ajoute des spores sur milieu PDA.

29
 On agité le solution pour homogénéisé les composants.
 On collé le solution (PDA+spores) dans les boites de pétri.
 On met des billes dans le milieu, puis on attend qu’il gélifier.

Photo 10 : obtention des puits

 On prélève les billes pour obtient des trou qui nous permit d’ajouter un
biopesticide(extrait de plantes).

 On prend une boite comme témoin, dans l’autre boite on ajoute 30 µl de

biopesticide dans chaque trou.

Photo 10:A :Remplir des puits par le biopesticide ;B :Boite Témoin.

30
 II. Effet de bactérie pseudomonas sur le champignon Botrytis
cinerea.

1. Préparation de milieu de culture pour la bactérie

-le milieu de culture gélose nutritive est un milieu favorable pour la croissance des
bactéries, il contient de peptone, extrait de bœuf, extrait de levure, chlorure de sodium
puis l’agar.

-on peser la quantité qui nos intéressent de bouillon nutritif, puis on ajout la même
quantité de l’agar pour solidifier le milieu et pour obtient une gélose nutritifs .

-on prend un bécher et on met la quantité de l’eau nécessaire.

-Agiter en chauffant sur une plaque chauffante jusqu'à totale dissolution.

-Laisser refroidi jusqu'à 55 oC pour éviter la condensation de vapeur.

- Distribuer dans des boîtes de pétri stériles, 20 ml par boîte.

-Mettre dans l’étuve pendant 24 heures pour vous assurer qu’il n’y a pas de
contamination.

2. Repiquage des bactéries

- Dans des conditions de stérilités très élevées, tous le matériel utilises été rincer par
l’éthanol et l’eau distillé, la place du travail et les mains aussi rincer par l’éthanol .

-on prend une culture de cactéries récente, On prend nos boites qui sont prêts pour le
repiquage, on les ouvrit à côté de Bec Bunsen.

-on prend un l’anse stérile, attendre qu’il refroidit pour ne pas tué les bactéries.

31
 Photo 11:L'ensemencement des bactéries.

-découper un petit morceau, puis on l’ensemencer dans nos boites .

-a fin de terminer le repiquage, on mit nos boites dans l’étuve à une température et
humidité relatives pour le développement de ce bactérie pendant 24 jusqu’à 72 heures,
la duré maximal pour la croissance de Pseudomonas.

3. Pulvérisations des spores sur les 4 souches de pseudomonas

- on utilise les spores qui sont déjà filtré.

-on utilise la technique de pulvérisation pour pulvérise les spores sur les boites qui
contient les bactéries, qui ont à déjà préparé avant 48 heure, et sur une boite temoin
qui ne contient que le milieu.

32
 Photo 12:pulvérisation des spores sur la bactérie.

-on met les boites dans la chambre de culture dans des conditions relatives.

33
Résultats et
Discussion

34
 I. Effet de l’extrait des plantes (biopesticides) sur le champignon
Botrytis cinerea :

Photo 13: Inhibition de germination du champignon se forme d’un halo.

Les résultats montrent un Effet remarquable de l’extrait des plantes comme des
biopesticides sur la croissance de champignon Botrytis cinerea dans le milieu de
culture PDA. Cet effet a été remarque par un halo clair (zone d’inhibition) autour de
puits contenant l’extrait à tester après 48h d’incubation. L’effet d’extrait est plus
marqué sur la germination des spores. Ces résultats sont similaire a celle trouver au
laboratoire (Protection des plantes) par d’autre extrait de plants ou vis-à-vis d’autres
champignons pathogène. La plupart des extraits ont présenté un pourcentage
d’inhibition importante .Certains ont même inhibé totalement la sporulation, et
d’autres agit sur la germination des spores et sur la langueur de tube germinatif.
L’inhibition des colonies mycéliennes d’isolats en présence de l’extrait de plante
montre qu’il existe un principe actif aux propriétés antifongiques qui inhiberait la
croissance des Botrytis. Ces résultats ont été aussi obtenus par Ngono et al. (2006) sur
plusieurs champignons pluricellulaires dermatophytes en présence d’extrait de feuilles
de C. odorata.

35
II. Effet de bactérie Pseudomonas sur le champignon Botrytis cinerea.

Les résultats de cette partie ne montrent aucun effet significatif des bactéries
du genre Pseudomonas sur le botrytis cinerea. Ce la peut être explique par l’absence
de la matière actives vis-à-vis de botrytis chez les Pseudomonas.

Photo 14:résultats de confrontation du champignon.

Conclusion

L’efficacité des différents extraits de plante sur un pathogène important de la

tomate présente une alternative par rapport aux fongicides synthétiques peu
biodégradables.

36
 Références bibliographiques

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