Validation Analytique de Dosage Du Bromazépam Par La Méthode HPLC - FALOUS Redouane

Université Sidi Mohammed Ben Abdellah
Faculté des Sciences et Techniques

www.fst-usmba.ac.ma
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Année Universitaire : 2015-2016
Master Sciences et Techniques : CMBA

Chimie des Molécules Bio Actives
MEMOIRE DE FIN D’ETUDES

Pour l’Obtention du Diplôme de Master Sciences et Techniques
Validation Analytique de Dosage du

Bromazépam par la Méthode HPLC
Présenté par:
FALOUS REDOUANE
Encadré par:
- Pr. LAMCHARFI EL HADI (FST FES)
- Pr. ACHOUR SANAE (CHU FES)
Soutenu Le 15 Juin 2016 devant le jury composé de:

- Pr. S.ACHOUR (CHU FES)
- Pr. J.HAZM (FST FES)
- Pr. J.ASSOUIK (FST FES)
- Pr. E .LAMCHARFI (FST FES)
- Dr. A.ATTARI (CHU FES)
Stage effectué à : Centre Hospitalier Universitaire Hassan II

Laboratoire de Toxicologie Fés
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Faculté des Sciences et Techniques - Fès
 B.P. 2202 – Route d’Imouzzer – FES
 212 (0) 5 35 60 29 53 Fax : 212 (0) 5 35 60 82 14
Université Sidi Mohammed Ben Abdellah
Faculté des Sciences et Techniques
www.fst-usmba.ac.ma
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Mémoire de fin d’études pour l’obtention du Diplôme de Master Sciences et Techniques
Nom et prénom: FALOUS REDOUANE

Année Universitaire : 2015/2016
Titre: Validation Analytique de Dosage de la Bromazépam par la Méthode
HPLC
Résumé
Une méthode de dosage d’un médicament Bromazépam dans le sang des patients est
soumise à la validation analytique.
On a travaillé sur la validation de méthode de dosage analytique de la Bromazepam par
Chromatographie Liquide à haute Pression sur une colonne C18 à une longueur d’onde de 220
nm. La phase mobile est constitué d’un tampon phosphate (pH=2,6) et l’Acétonitrile.
Dans le but de trouver une méthode de dosage correctement validé offrant des résultats
fiable et interprétables de façon satisfaisante.
D’après les résultats des analyses:
 La validation de la méthode d’analyse est La linéarité est vérifiée le coefficient de
détermination qui est proche de 1.
 La fidélité est vérifiée par le calcul du coefficient de variation de répétabilité
 La justesse est vérifiée par recouvrement supérieure de 80% et Biais < inferieur de 20%.
Suite à ces résultats satisfaisants, on peut confirmer que la méthode d’analyse du bromazépam
par HPLC est apte à être appliquée
Mots clés: Bromazépam , anxiété ,GABA, HPLC, benzodiazépine, toxique
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Faculté des Sciences et Techniques - Fès
 B.P. 2202 – Route d’Imouzzer – FES
 212 (0) 5 35 60 29 53 Fax : 212 (0) 5 35 60 82 14
Dédicace
A mes parents
Qui m’ont donné beaucoup de soutien et d’encouragement,
symbolisant pour moi le sacrifice et la source d’où nait la
lumière qui éclaire ma vie, et pour qui aucune dédicace
n’exprimera la profondeur de mon amour,
A mon frère
Pour son véritable et sincère amour. Je lui souhaite, une vie
pleine de succès avec beaucoup de bonheur,
A mes formateurs
Qui m’ont dirigé vers le chemin du succès par leur
compréhension et leur conseil .Veuillez trouver dans ce
travail, l’expression de mes profondes reconnaissances et ma
grande estime.
A tous mes amis et collègues,
Pour les moments forts et agréables que nous avons passé
ensemble, à tous ce qui m’aiment et me souhaitent le bonheur
et à tous ceux qui ont contribué de près ou de loin à la
réalisation de ce travail et à l’élaboration de ce rapport.
Remerciements
Au terme de ce travail,
J’ai le plaisir d’exprimer mes profonds remerciements
A Madame ACHOUR Sanae, Professeur Toxicologie CHU Hassan
II Fès et Chef d’unité de toxicologie, Laboratoire central d’analyses
médicales, qu’elle trouve ici l’expression de ma profonde
reconnaissance tant pour m’avoir accordé sa confiance que pour
m’avoir guidé dans mon travail tout au long de cette période de stage.
Ses compétences, ses précieux conseils, sa disponibilité et sa
gentillesse à mon égard ont contribué au bon déroulement de ce
travail de recherche dans son laboratoire.
Pr. A.ATTARI chef service du Laboratoire central d'analyses
médicales, CHU Hassan II- Fès.
Mes plus vifs remerciements vont aussi à Monsieur le professeur
LAMCHARFI ELHADI pour sa collaboration, et pour sa
disponibilité. Sa grande expérience, sa gentillesse et ses grandes
qualités scientifiques et humaines qui ont constitué un support
permanent à ma réflexion.
Professeur OUAZZANI CHAHDI Fouad, je tiens à vous remercier
pour m’avoir accueilli dans votre master. Je suis très reconnaissant
pour la confiance que vous m’avez accordée, votre gentillesse, votre
disponibilité, et vos encouragements m’ont été indispensables.
Merci également aux membres de jury Pr J.Hazm et Pr J.ASSOUIK
d’avoir accepter de juger ce travail.
Il est évident que je ne peux oublier de remercier ma famille,
notamment mes parents, mes frères et ma sœur, qui ont toujours
répondu « présents » et ont été d’un grand secours moral en toutes
situations.
Liste des figures
Figure 1 : CHU HASSAN II-FES 5
Figure2 : Laboratoire central d’analyses médicales 5
Figure3 : Organigramme de l’unité de pharmacotoxicologie de CHU- Fès 6
Figure4 : Cassettes d’analyse des drogues 7
Figure 5 : Appareil de Chromatographie en phase Liquide a Haute Performance 8
Figure6 : Coloration des imipramines 9
Figure7: Spectrophotomètre UV (jasco 530) 9
Figure8:Structure générale des benzodiazépines. 12
Figure9: Structure de quelques benzodiazépines 12
Figure 10: Récepteur GABA-A. 15
Figure 11 :Structure du bromazépam 18
Figure 12 :Schéma de principe d’une chaîne d’HPLC 21
Figure 13 : Description de l’HPLC SHIMADZU/DAD au laboratoire des analyses 25
Figure14 : Critères de validation 28
Figure 15: Courbe représentative du manque d’impureté vis-à-vis le pic de la bromazépam 37
Figure 16 : Représentation spectrale de la molécule bromazépam 38
Figure 17 : Chromatogramme de blanc (sans bromazépam) 39
Figure 18 : Chromatogramme de bromazépam dans la phase mobile (tampon phosphate/

acétonitrile) 39
Figure 18 :La représentation des trois gammes d’étalonnage exprimant de l’aire de pic en
fonction de la concentration 42
Figure19 : Courbe de bromazépam dans le sérum 46

Liste des tableaux
Tableau1 :Benzodiazépines commercialisées et présentations 13
Tableau 2:Préparation de la gamme d’étalonnage et la gamme de validation 41
Tableau 3 : Conditions chromatographique 36
Tableau4: Plan d’étalonnage 41
Tableaux5 : Résultats de la Répétabilité 45
.
Liste des abréviations
AU:Automate
BZD : Benzodiazépine
CCM : Chromatographie sur Couche Mince
CV :coefficient de variation.
CHU : Centre Hospitalier Universitaire
ED : Eau Distillée
Forrest : Réactif (dichromate de potassium, acide sulfurique, acide perchlorique)
FPN : Réactif (chlorure Ferrique, acide Perchlorique acide Nitrique)
HPLC : Chromatographie en phase Liquide a Haute Performance
HEPT :La hauteur équivalente à un plateau théorique
LG : Liquide Gastrique
L :est la longueur de la colonne
Nef f :nombre de plateaux effectifs
Nth le nombre de plateaux théoriques
PTZ : Phénothiazine
TR : Temps de Rétention
tr :temps de rétention e
t’r : temps de rétention réduit
U : Urine
UV : Ultraviolet
Vo : moyenne des valeurs observées
Vs : valeur suggérée.
la largeur du pic à mi-hauteur
W: largeur du pic
Sommaire
Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des abréviations
Introduction 2
Chapitre I 3
I-Présentation générale 4
1-Présentation du Centre Hospitalier Universitaire Hassan II 4
2-Présentation du laboratoire 5
II-Les différentes méthodes d’analyses médicamenteuses du laboratoire CHU Fès : 7
1- Méthodes Immuno-chromatographiques 7
2-Méthodes chromatographiques 7
a-CCM : Chromatographie sur couche mince 7
b- HPLC : Chromatographie en phase liquide à haute performance 8
3- Méthodes colorimétriques 9
4-Méthode spectrophotométrie 9
Chapitre II 10
I- Généralité sur Benzodiazépines 11
1- Définition 11
2- Rôle 11
3-Structure générale 11
4-Doses toxiques 13
5-Propriété physico-chimiques 13
6-Classification des BZD en fonction des indications 14
7- Métabolisme 14
8- Les récepteurs GABA A sont localisés dans : 14
a- Mécanisme d’action et propriétés pharmacologiques 14
b- Le GABA possède un rôle dans 15
c- Effets de l’ouverture du canal chlore : 15
9- Symptomatologie 15
10-Pharmacodynamique 16
II-Bromazépam 17
1- Introduction 17
2- Définition 17
3- Structure générale 18
4-Caractéristiques 19
5-Doses toxiques 19
6-Les effets indésirables 19
7-Indications thérapeutiques 20
8-Contre-indications. 20
III-La méthode de dosage par HPLC (High Performance Liquid Chromatography) 20
1-Principe de fonctionnement 20
2-Les composants d’une chaîne HPLC 21
a-Réservoir 21
b-Pompes 22
c-Injecteurs 22
d-Colonne 22
e- Solvants 22
f-Phase stationnaire 23
g-Détecteur 24
3- Qualité de la séparation 25
a-La sélectivité (α) 25
b-La résolution (R) 25
IV-Généralités sur la validation analytique 27
1-Principe 27
2- Définitions : 27
a_ La méthode d’analyse 27
b- Validation 27
c- La Validation d’une méthode 27
d-Types de validation 27
3-Les critères de la validation : 28
a- La linéarité 29
b- La spécifité 29
c- La sélectivité 29
d- Limite de détection, Limite de quantification : 29
e- La fidélité : 30
f- La justesse 30
chapitre III 32
I-Matériel et Réactif 33
1-Produits 33
2- Verrerie 33
3- Appareillage 33
4- Mode opératoire 34
5-Conditions chromatographiques 36
II-Résultats et Discussion : 36
1-Validation de la méthode analytique : 37
2- Sélectivité : 39
3-la spécificité 40
4-Linéarité : 40
5-La fidélité :répétabilité 43
6-La justesse 46
7-Limite de Détection / Limite de Quantification : 47
Conclusion 48
References
Projet de fin d’étude
Laboratoire de Toxicologie- CHU Fès FST
Introduction générale
La validation analytique est fondée sur une analyse statistique basée sur un certain
nombre de critères aboutissant à des méthodes analytiques permettant de donner des résultats
fiables. La validation des méthodes est demandée lorsque les laboratoires utilisent des
méthodes non normalisées ou hors du domaine d’application de la norme (ISO). Les
laboratoires d’analyses ont une longue expérience de validation de leurs méthodes d’analyse,
mais éprouvant parfois des difficultés pour évaluer l’incertitude de leurs résultats.
Les performances d’une méthode peuvent s’exprimer à l’aide de caractéristiques dont

les plus souvent cités sont :
 La spécificité
 La sélectivité
 La linéarité
 La fidélité
 La justesse
 La limite de détection
 La limite de quantification
Ces caractéristiques s’évaluent soit en interne, soit de manière collective en impliquant

plusieurs laboratoires. La connaissance des caractéristiques des méthodes est une information
tout à fait pertinente pour l’évaluation de l’incertitude des résultats d’analyse.
L’objectif de mon travail est de développer et valider une méthode de dosage du

bromazépam par HPLC.
Redouane Falous MST : CMBA Page 2

Chapitre I :
Présentation générale

I. Présentation générale
1. Présentation du Centre Hospitalier Universitaire Hassan II
Le secteur de la santé connaît une nouvelle dynamique avec l’ouverture récente du CHU
Hassan II à Fès. En effet, cet établissement public couvre les besoins d’une population
estimée à plus de 3 millions d’habitants issus des régions de Fès-Meknès Ce centre est l’une
des plus grandes infrastructures médicales réalisées au Maroc depuis l’indépendance.
 Date de création : 30 Août 2001

 Date de départ au travail : 01Septembre 2008
Il est construit sur deux tranches :

- 1ère Tranche :
 Hôpital des spécialités (A, B, C, D, E, F)
 Hôpital mère et enfant (G)
 Consultations externes (I)
 Laboratoire central d’analyse médicale (J)
 Hôpital d'oncologie et de médecine nucléaire
 Hôpital IBN AL HASSAN.
 Hôpital OMAR DRISSI,
- 2ème Tranche :
 Centre d’Oncologie
 Centre de la médecine nucléaire
Figure 1 :CHU HASSAN II-FES

2. Présentation du laboratoire :
Le Laboratoire Central d’Analyses Médicales est situé au bâtiment J du Centre
Hospitalier Universitaire Hassan II de Fès, conçu comme un pôle d’activité hospitalière
comportant plusieurs spécialités d’analyses médicales :
 Anatomie pathologique;
 Bactériologie-Immun analyses
 Parasitologie;
 Biochimie et pharmaco-toxicologie ;
 Hématologie;
 Génétique médicale et biologie moléculaire.
Figure2 : laboratoire central d’analyses médicales
La création d'un laboratoire central d'analyses médicales au sein du CHU est une première
nationale. Cette conception adoptée récemment dans les laboratoires hospitaliers
internationaux permet de
 Optimiser les moyens techniques et le budget de fonctionnement du laboratoire;

 Offrir des plateaux techniques spécialisés de grande qualité ouverts à toutes les
disciplines biologiques;

 Assurer une formation complète et de haut niveau aux résidants de biologie, de

génétique et d'anatomie pathologique.
 Avec son plateau technique performant, son équipe multidisciplinaire et motivée et sa
situation privilégiée au sein d'un CHU qui est dotée d'une offre de soins de grande
qualité et fortement diversifiée, le laboratoire peut jouer un rôle majeur au niveau de la
région et même au niveau national.
CHU-HASSAN II Fès
Laboratoire central d’analyse médicale
Anatomie Bactériologie Biochimie Pharmacotoxicologie Hématologie Sérologie

Pathologie
Pharmacovigilance Analyses Toxicologiques

Toxico-vigilance
Suivi Thérapeutique
Figure3 : organigramme de l’unité de pharmacotoxicologie de CHU- Fès
II. Les différentes méthodes d’analyses médicamenteuses du

laboratoire CHU Fès :
1. Méthodes Immuno-chromatographiques :
Elles sont basées sur le principe de l’immuno-chromatographie sur membrane avec des
nanoparticules naturellement colorées en rose.
Ces méthodes permettent l’identification des drogues, chaque cassette est spécifique pour
une drogue (benzodiazépines, cannabis, morphine, cocaïne……..)

La phase mobile (urines), migrant le long de la bandelette, est constituée de particules

préalablement conjuguées à un anticorps monoclonal spécifique de l’antigène cible.
L’anticorps de capture, fixé en un trait fin sur la membrane centrale de nitrocellulose, sert
à retenir et concentrer les particules complexées à l’antigène cible éventuellement contenu
dans l’échantillon à tester.
Après 2 à 5 minutes, un résultat positif se traduit par l’apparition d’un seul trait rose,
tandis qu’un résultat négatif apparaît en deux traits roses.
Figure4 : Cassettes d’analyse des drogues

2. Méthodes chromatographiques
a) CCM : Chromatographie sur couche mince

Cette méthode est utilisée pour l'identification des organophosphorés et carbamates sur
couche mince en comparant les spots obtenus par rapport à un témoin.
Les molécules à séparer sont entrainées par un fluide qui en montant dans la phase
stationnaire, va entraîner le composé que l’on avait déposé.
Il y a donc distribution ou partition des composants entre ces deux phases.
Cette méthode passe par différentes étapes :
 Extraction et récupération de la phase éthérée,

 Evaporation de la phase éthérée au bain-marie à une température de 45°C,
 Migration sur une plaque de silice dans une cuve de migration CCM.
 Révélation et exposition de la plaque CCM à la lumière U.V 254 (mise en évidence
des spots fluorescents).
b) HPLC : Chromatographie en phase liquide à haute performance
La chromatographie en phase liquide à haute performance est une méthode d'analyse

physico-chimique, qui sépare les constituants d'un mélange par entraînement au moyen d'une
phase mobile le long d'une phase stationnaire.
Chaque soluté est donc soumis à une force de rétention exercée par la phase stationnaire et
une force de mobilité due à la phase mobile
Cette méthode permet la séparation puis la quantification des composés chimiques.
Figure 5 : Appareil de Chromatographie en phase Liquide a Haute Performance

3. Méthodes colorimétriques :
Ces méthodes permettent l’identification des différents médicaments (salicylés,
imipramines et phénothiazines…). Elles se basent sur une recherche colorimétrique des
médicaments dans les urines et/ou dans le liquide de lavage gastrique.
 Dans un tube à essai on met 1ml d’Urine ou de Liquide Gastrique et 1ml du réactif.
 Une réaction colorée en moins de 10 sec signe la présence de médicament a identifié.
 Les Phénothiazines sont identifiées par le réactif FPN, leurs présences se traduisent
par l'apparition de diverses colorations (Rose, violette….) [1].
 Les imipramines sont identifiées par le réactif de Forrest, une réaction positive se
traduit par l'apparition d'une coloration bleue [1].
 Identification des salicylés se fait par le réactif de Trinder, leurs présence se traduit par
une coloration violette [2].

Figure6 : coloration des imipramines

4. Méthode spectrophotométrie
La spectrophotométrie est une méthode analytique quantitative qui consiste à mesurer
l'absorbance ou la densité optique d'une substance chimique donnée, généralement
en solution. Plus l'échantillon est concentré, plus il absorbe la lumière dans les limites de
proportionnalité énoncées par la loi de Beer-Lambert. La densité optique des échantillons est
déterminée par un spectrophotomètre préalablement étalonné sur la longueur
d’onde d'absorption de la substance à étudier. [3]
Figure7: spectrophotomètre UV (jasco 530)

Chapitre II:
Etudes
Bibliographiques

I. Généralité sur Benzodiazépines :

1. Définition
Les benzodiazépines (BZD) sont une classe de composés chimiques formés d’un cycle
appelé diazépine attaché à un cycle de benzène. Elles forment ensemble une classe de
médicaments psychotropes utilisés dans le traitement de l’anxiété, de l’insomnie, de
l’agitation psychomotrice, des convulsions, ou dans le contexte d’un syndrome de sevrage
alcoolique. Cependant, elles peuvent entraîner d’une part une accoutumance et une
dépendance et d’autre part un syndrome associant, à des degrés divers, une altération de l'état
de conscience à des troubles du comportement et de la mémoire.
2. Rôle
Le rôle des benzodiazépines dans la genèse de la maladie d'Alzheimer est discuté : il
existe une corrélation entre leur emploi et la survenue de la maladie et cette corrélation est
d'autant plus forte que la prise de benzodiazépines a été prolongée
3. Structure générale
Toutes les benzodiazépines ont une Structure chimique identique, ils comportent trois
parties importantes :

 Un cycle benzène (benzo): cycle A.

 Deux atomes d’azote (diaza) : cycle B.
 Un cycle azoté à 7 atomes (azépine) : cycle C.
Figure8:Structure générale des benzodiazépines.
Figure9: Structure de quelques benzodiazépines.

4. Doses toxiques
Les doses toxiques théoriques sont différentes d’une molécule à l’autre, et peuvent varier
pour une molécule en fonction de l’âge, des antécédents et de la tolérance du sujet : on peut
citer par exemple chez l’adulte :
Tableau1 :Benzodiazépines commercialisées et présentations

Benzodiazépine Dose(mg)
Triazolam (halcion®) 5
Diazepam (valium®) 500
Loprazépam
(havlane®) 10
Bromazépam
(lexomil®) 180
Nitrazépam
(mogadon®) 100
Flunitrazépam
(rohpnol®) 10
Clonazépam (rivotril®) 10
Oxazépam (seresta®) 500
Lorazépam (temesta®) 100
Clorazépate (tranxéne) 500
5. Propriétés physico-chimiques
 Les benzodiazépines se présentent sous la forme de poudres cristallines blanches ou
légèrement jaunâtres, inodores et de saveur amère
 Les benzodiazépines sont des bases faibles (non dissociées au Ph physiologique).
 elles se dissolvent mal dans l’eau, soluble dans l'éthanol, chloroforme, et dans l'éther.
 Le Chlordiazépoxide et le Midazolam sont des bases un peu plus fortes et forment des
sels hydrosolubles (à des pH d’environ 4).
 Le coefficient de partition Octanol / Eau (à un pH physiologique) varie énormément

6. Classification des BZD en fonction des indications

BZD anxiolytiques
o Diazépam, Oxazépam, Bromazépam, Clobazam, Alprazolam, Chlorazépate,Lorazepam..
BZD hypnotiques
o Nitrazépam, Flunitrazépam, Témazepam, Loprazolam, Triazolam… et aussi Zopiclone et

Zolpidem
BZD antiépileptiques
o Clonazépam
BZD anesthésiques
o Midazolam
7. Métabolisme
La plupart des BDZ sont transformés avant leur élimination en métabolite le plus souvent
actifs eux, aussi ce qui peut prolonger leur demie vie de façon très importante.
8. Mécanisme d’action et propriétés pharmacologiques

Les benzodiazépines se fixent spécifiquement sur le récepteur GABA A (récepteur canal
Chlore). Le site de fixation des BZD sur ce récepteur est appelé sous unité α.
a) Les récepteurs GABA A sont localisés dans :

40% des neurones comportent des récepteurs GABA A , le récepteur GABA-A, comporte,
en plus des sites de fixation au GABA : des sous-unités correspondant aux sites de fixation
des :
 Benzodiazépines
 Barbituriques
 Certains stéroïdes notamment les métabolites de la progestérone
L'ouverture de ce récepteur-canal perméable aux ions Cl- est commandée directement par le
GABA.

La fixation de deux molécules de GABA entraîne son ouverture, la pénétration des

ions Cl- et une hyperpolarisation cellulaire. Cependant, un excès de GABA désensibilise le
récepteur.
Une particularité du récepteur GABA-A est d'être modulée allostériquement par d'autres
récepteurs.
Ces récepteurs favorisent l’effet du GABA.
b) Le GABA possède un rôle dans :

la motricité extra pyramidale les sensations le comportement (prise alimentaire,
sommeil, stress) les fonctions cognitives
Figure 10: Récepteur GABA-A.
c) Effets de l’ouverture du canal chlore :

Les benzodiazépines sont des agonistes qui favorisent l'ouverture du canal Cl par le
GABA et ont donc un effet inhibiteur. [5]
9. Symptomatologie
 Troubles neurologiques : vont de la simple somnolence, à la torpeur au coma. La

rapidité d’installation du coma et sa profondeur dépendent de l’âge, de la quantité

ingérée, des antécédents du patient (insuffisance respiratoire, myasthénie), et de

l’éventualité d’une prise associée (alcool, médicament…).
 Dépression respiratoire : la dépression respiratoire est très rare, et souvent très
modérée.
 Troubles de la mémoire : ils sont prolongés pour les benzodiazépines à demie vie
longue, à type d’amnésie de fixation, parfois d’amnésie antérograde.
10.Pharmacodynamique
 Effets sur le système nerveux central : Ils sont proportionnels au degré
d'occupation des récepteurs, l'anxiolyse précédant la sédation, elle-même suivie de
l'hypnose
Les différentes propriétés peuvent être présentes à des degrés divers selon les
molécules.
 Anxiolyse :Les benzodiazépines sont anxiolytiques.
Cette propriété majeure explique leur intérêt non seulement dans le traitement au long cours
des états anxieux, mais aussi pour la prémédication anesthésique et la sédation en
réanimation.
 Hypnose :A forte dose, les benzodiazépines induisent un effet narco hypnotique,

ce qui a permis de les proposer comme agents de l'anesthésie générale ou comme
inducteurs du sommeil.
 Amnésie : Les benzodiazépines sont amnésiantes.
L'amnésie induite porte surtout sur l'acquisition des faits récents.
Elle persiste après que l'hypnose et la sédation aient disparu. L'impression de récupération
totale est donc trompeuse.
 Effets respiratoires : Les effets respiratoires des benzodiazépines sont moins

marqués que ceux d'autres agents anesthésiques ou des analgésiques centraux.

Ils ne sont néanmoins pas négligeables : apnées centrales et obstructives lors de

l'administration en injection intraveineuse rapide, dépression de la réponse ventilatoire au
CO2 et à l’hypoxie.
 Effets neuromusculaires :Les benzodiazépines ont un effet myorelaxant certain, mis
à profit depuis longtemps par exemple dans le traitement du tétanos, et qui peut
contribuer à faciliter l'adaptation des patients de réanimation au respirateur, mais aussi
à potentialiser l'action des curares en anesthésie.
II. Bromazépam
1. Introduction
Le bromazepam est le principe actif du LEXOMIL, médicament anxiolytique
commercialisé en France par les laboratoires ROCHE, sous la forme de comprimés-baguettes
quadrisécables dosés à 6 mg. Le LEXOMIL est indiqué dans le traitement de l’anxiété, ainsi
que dans la prévention et le traitement du delirium tremens. Un traitement par ce médicament
est toujours initié à la dose minimale efficace, et ne devrait pas « logiquement » excéder
douze semaines. En général, la posologie quotidienne moyenne est de 6 mg par jour, répartis
en trois prises : un quart de comprimé-baguette le matin, un autre quart le midi, et un demi le
soir. En psychiatrie, la posologie peut aller de 6 à 18 mg par jour pour les patients
ambulatoires, et de 24 voire 36 mg par jour pour les patients hospitalisés, lorsque la sévérité
du syndrome anxieux l’exige. [6].
2. Définition
Le Bromazépam est le médicament générique qui correspond au Lexomil. C'est
un anxiolytique (diminue l'anxiété), qui appartient à la classe des Benzodiazépines. Il est
principalement utilisé dans les cas d'anxiété, d'angoisse et également dans le cadre
du sevrage alcoolique. Ce traitement peut cependant engendrer une dépendance et ne doit en
aucun cas être stoppé brutalement. L'arrêt s'effectue par diminution progressive des dosages,
sur plusieurs semaines ou plusieurs jours, afin d'éviter l'apparition d'un syndrome de sevrage.
3. Structure générale
Le bromazépam est la seule benzodiazépine à avoir une pyridine comme substituant en
position 5. Toutes les autres ont un cycle phényle. La toxicité du bromazépam en cas de

surdosage ainsi que les comas mortels qui sont comme l'hépatotoxicité (toxicité pour le foie)
des effets propre au bromazépam sont plus explicables. Le bromazépam est également une
des très rares benzodiazépines bromées.
Figure 11 :Structure du bromazépam
Identification
7-bromo-2,3-dihydro-5-(2-pyridinyl)-
Nom UICPA
1H-1,4-benzodiazépine-2-one
Propriétés chimiques
Formule brute C14H10BrN3O
316,153 ± 0,014 g/mol

Masse molaire1
C 53,19 %, H 3,19 %, Br 25,27 %, N 13,29 %, O 5,06 %,
4. Caractéristiques :
 poudres cristallines blanches ou légèrement jaunâtres, inodores.

 Pratiquement insoluble dans l’eau, peu soluble ou assez soluble dans l’éthanol à 96%
et dans le chlorure de méthylène.
5. Doses toxiques
À haute dose
 Risque de coma potentiellement mortel (spécifique au bromazépam)

 Risque de dépendance et dépendance psychique
 Risque de phénomène de sevrage
 Risque de phénomène de rebond
 Troubles de la mémoire et risque d'amnésie qui est majoré par la prise d'alcool
 Risque de troubles de la personnalité
 Syndrome prolongé de sevrage lors de son arrêt
6. Les effets indésirables

Ils sont proportionnels à la dose prise et spécifiques à la benzodiazépine :
 Tolérance : l'effet diminue lors d'une utilisation prolongée.

 Désinhibition de type alcoolique confuse.
 Amnésie antérograde. Par exemple, une personne ne prenant jamais de
benzodiazépines a de fortes chances, après un léger surdosage (environ 3 comprimés
ou +), de ne plus avoir aucun souvenir de ce qu'il s'est passé dans les dernières 24
heures. Pourtant il aura continué à mener sa vie sociale. Le lorazépam est la
benzodiazépine reine dans ce domaine.
 Somnolence plus ou moins forte selon les individus;
 Euphorie de courte durée (15 minutes maximum après les premiers effets ressentis,
suivi d'une période de dysphorie (inverse de l'euphorie) durant quant à elle beaucoup
plus longtemps;
 Chutes multiples dues à l'effet myorelaxant.
 Risque d'accumulation si prise quotidienne, que ce soit des petites doses (1/4 de
comprimé) ou de grandes doses (+ de deux comprimés)

7. Indications thérapeutiques
Traitement de courte durée de forte anxiété ou des attaques de panique : sous toutes ses
formes, en particulier réactionnelle et manifestations somatiques associées à l'anxiété en cas
de nécessité de traitement par benzodiazépine.
Prémédication pour diminuer l'anxiété avant une chirurgie.
Sevrage alcoolique : prévention et traitement du delirium tremens. À éviter cependant

en cas de cirrhose avec insuffisance hépato-cellulaire .
Comme de nombreuses autres benzodiazépines, le bromazépam est un traitement

symptomatique des crises d'angoisse. Pour traiter une dépression, le bromazépam comme
Des thérapies psycho-comportementales sont souvent indiqués pour traiter le fond du

problème et que sa guérison soit réelle et non pas caché par les médicaments.
8. Contre-indications.
 Hypersensibilité au bromazépam
 Insuffisance respiratoire
 Apnée du sommeil
 Insuffisance hépatique aiguë
 Personnes atteintes de la maladie d'Alzheimer et leurs descendants.
III. La méthode de dosage par HPLC Chromatographie en

phase Liquide a Haute Performance
1. Principe de fonctionnement
Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est
introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles
interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé colonne
chromatographique.
La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système
chromatographique.

Le mélange à analyser est injecté puis transporté à travers le système chromatographique.

Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et la
phase stationnaire.
En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont caractérisés
par un pic. L’ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme.
Il est souvent difficile de trouver rapidement les conditions opératoires qui mèneront à une
bonne séparation en raison des interactions du soluté avec la phase stationnaire et la phase
mobile.
Il est par ailleurs préférable, avant d’entreprendre une analyse par la technique HPLC,
d’avoir une idée a priori des éléments ou constituants que va révéler l’analyse pour pouvoir se
focaliser sur une gamme de longueurs d’onde de largeur restreinte.
Figure 12 :Schéma de principe d’une chaîne d’HPLC
2. Les composants d’une chaîne HPLC
a) Réservoir
Le plus souvent, un Erlenmeyer tient lieu de réservoir pour l’éluant. On recommande
cependant l’emploi d’un vase clos pour éviter l’évaporation, surtout si l’un des solvants est
très volatil et lorsqu’il est nécessaire d’être en présence d’un gaz inerte.

b) Pompes
Les pompes ont constitué, au moment de la mise au point de la technique, la principale
cause de difficulté des utilisateurs. Le débit de liquide qu’elles refoulaient étant fréquemment
irrégulier, il en résultait sur l’enregistrement, une ligne de base instable.
Les problèmes semblent être résolus, car certaines pompes fournissent désormais un débit
constant jusqu’à des pressions de 240 bars; elles demeurent tout de même la partie la plus
délicate de l’appareillage.
c) Injecteurs
Le type d’injecteur le plus courant consiste en une vanne à boucle d’échantillonnage,
on introduit d’abord l’échantillon dans une boucle de volume connu; après rotation de la
vanne, la phase mobile entraîne l’échantillon en tête de colonne.
d) Colonne
Les colonnes devant recevoir la phase stationnaire sont généralement en acier
inoxydable, celles d’usage général, servant à l’analyse qualitative, ont un diamètre intérieur de
4 mm et une longueur de 3 à 15 cm , les tubes capillaires employés pour relier la colonne au
détecteur, doivent être le plus court possible afin de limiter les volumes morts et par
conséquent ne pas altérer la qualité de la séparation , un fabricant a mis au point un dispositif
permettant de réduire encore ce volume mort en employant une colonne de matière plastique
soumise à une pression radiale.
e) Solvants
Il est recommandé de toujours employer des solvants traités spécifiquement pour la
HPLC; Ils doivent être dégazés et filtrés avant usage. Le dégazage est effectué au moment de
la filtration sous vide, il assure une bonne reproductibilité et évite l’apparition d’une
oscillation sur la ligne de base, malgré la haute qualité des solvants.
La filtration sur filtre spécial (0,4 μm) est recommandée pour empêcher l’obstruction
éventuelle des orifices par les particules.
On ne doit pas utiliser des solvants « stabilisés » car les substances Stabilisatrices
donneront un signal indésirable dans le détecteur.

Le choix du solvant constitue habituellement la partie la plus difficile de type de

chromatographie.
Il est toujours préférable de faire quelques essais sur couches minces avant de se lancer
Dans le développement d’une méthode de séparation en HPLC. Il faut utiliser en priorité les
Mélanges suivants:
 Méthanol-eau
 Acétonitrile-eau
 Tétrahydrofurane-eau
On fait d’abord les essais avec une forte proportion d’eau, puis on augmente
progressivement La proportion en solvant organique jusqu’à obtention d’une bonne
séparation.
Avec un mélange de solvants de composition constant, il n’est pas toujours possible

d’obtenir Une bonne résolution et une durée d’analyse raisonnable.
Pour concilier les deux, on peut opérer par élution graduée, c’est à dire par augmentation
graduelle du pourcentage de solvant ayant la force d’élution la plus élevée.
f) Phase stationnaire
Les phases stationnaires en HPLC sont très variées: On peut travailler par échange
d’ions ou par perméation sur gel d’où les nombreuses possibilités d’application de la
méthode.
La silice est l’absorbant choisi lorsqu’on désire effectuer une chromatographie solide
liquide, elle s’applique bien aux composés organiques de masse inférieure à 2000 et à la
séparation de composants renfermant des groupements fonctionnels différents, Par contre la
séparation est difficile si les composés à dissocier sont peu polaires et elle requiert une grande
quantité de solvant organique.
La chromatographie de partage est beaucoup plus usuelle, d'autant que le
développement de phases stationnaires greffées peu polaires autorise l'emploi de phases
mobiles aqueuses dans lesquelles le solvant organique est en faible proportion. Ces phases

sont formées par salinisation des groupements hydroxyle de la silice, Dans ce cas la
chromatographie est dite à polarité de phase inversée car plus le solvant est moins
polaire (proportion élevée en eau), moins il entraîne les substances organiques peu polaires :
Ces dernières sont d’avantage retenues par la phase stationnaire faiblement polaire.
 Si la phase stationnaire est polaire, les composés polaires seront plus retenus que
les composés non polaires.
 Si la phase stationnaire est apolaire, les composés apolaires seront plus retenus que
les composés polaires.
g) Détecteur :
Le détecteur suit en continu l'apparition des solutés. Pour détecter, on utilise différents
phénomènes physico-chimiques. Le signal obtenu est enregistré en fonction du temps.
Généralement, on compare le signal obtenu pour la phase mobile et le soluté à celui de la
phase mobile seule. Le détecteur le plus utilisé en CLHP est un spectrophotomètre
d'absorption UV-visible (190-600 nm) relié à la sortie de colonne. [8,9,10]
Il existe d'autres détecteurs :
• réfractomètre différentiel
• UV à barrette de diodes
• électrochimique
• fluoré-métrique.

B G
H C F
D E
Figure 13 : description de l’HPLC SHIMADZU/DAD au laboratoire des analyses
- A : Solvants de la phase Mobile - B : Dégazeur

- C : Pompe Quaternaire 1 - D : Injecteur automatique
- E : Colonne - F : Pompe Quaternaire 2
- G : Détecteur : UV (D2) / Visible (W) - H : Ordinateur qui contient le
logiciel enregistreur
3. Qualité de la séparation
La séparation entre les pics chromatographiques se base sur plusieurs critères:
a) La sélectivité (α)
Elle est définit comme le rapport des temps de rétention réduits.
α avec t’r : temps de rétention réduit
α est toujours > 1 car on choisit
b) La résolution (R)
R= avec tr :temps de rétention
W: largeur du pic

Elle quantifie la qualité de la séparation en caractérisant le fait qu'il y ait ou non

chevauchement de 2 pics contigus.
 R < 1 : mauvaise résolution

 1 < R < 1,4 : résolution acceptable
 1,4 < R < 1,6 : résolution optimale
 R > 1,6 : résolution trop bonne mais le temps d'analyse est rallongé
Remarque :
Il est parfois utile d’exprimer cette résolution en fonction de la sélectivité et de l’efficacité
entre les deux derniers pics étudiés
R × ×√
La largeur d’un pic est caractérisée par l’efficacité de la séparation : plus le pic est fin
plus la chromatographie est efficace.
L’efficacité est mesurée par le nombre de plateaux théoriques Nth qui est définit comme suit:
)2
Où tr est temps de rétention et la largeur du pic à mi-hauteur.
NB: Nth est très utilisé en HPLC. Pourtant il serait plus judicieux d’utiliser Neff (nombre de
plateaux effectifs) puisqu’il dépend vraiment du temps passé dans la phase stationnaire.
5,54 )2
Expérimentalement est difficile à déterminer, donc on préfère toujours utiliser le Nth.
La hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT)
Elle est définit comme suit:
HEPT=L /Nth

Avec L est la longueur de la colonne [10]
IV. Généralités sur la validation analytique:

1. Principe :
Opération permettant d’assurer qu’un résultat a été obtenu dans des conditions techniques
satisfaisantes et que celui-ci est compatible avec le dossier biologique du patient. Cette
validation est à la fois analytique et biologique.
La validation analytique comporte la vérification de la conformité des conditions

d’exécution aux procédures et tient compte notamment des résultats obtenus avec les
échantillons de contrôle.
Elle a pour principal objectif : s'assurer qu'une méthode analytique donnée donnera des
résultats suffisamment fiables et reproductibles, comptes tenus du but de l'analyse.
2. Définitions :
a) La méthode d’analyse :
Permet de réaliser une analyse, par description détaillée des différentes opérations
nécessaires pour effectuer l'analyse de la substance à examiner.
b) Validation :
C’est l’application déterminée avec un objectif clairement déterminé. Selon la norme ISO
17025 ; la validation c’est la confirmation par examen et fourniture des preuves réelles que les
exigences particulières d’un usage projeté donné sont remplies.
c) La Validation d’une méthode :

C’est la procédure par laquelle on démontre, preuves expérimentales à l’appui, que les
performances de la méthode permettent de répondre aux exigences de l’usage auquel elle est
destinée.
d) Types de validation :
Il existe plusieurs degrés de validation suivant la nature de la méthode, ce à quoi elle est
destinée et le domaine concerné:

 Méthode de contrôle en routine, utilisée sur plusieurs sites, contexte réglementaire

fort égal validation approfondie.
 Méthode utilisée ponctuellement dans un seul laboratoire, contexte réglementaire
faible égal validation rapide.
3. Les critères de la validation :
Les critères de validation sont ceux couramment utilisés dans les procédures
analytiques de séparation Il s’agit représenté dans le schéma suivant : [10].
Spécificité/
Sélectivité
Linéarité Robustesse
Critères de
validation
Limite de
sensibilité détection et
Quantification
Fidélité Justesse
Figure14 : critères de validation

a) La linéarité :
La linéarité d’une méthode de mesure ou d’une procédure d’analyse est, sa capacité, à
l’intérieur d’un certain intervalle, d’obtenir des résultats de mesure directement proportionnels
à la concentration (quantité) en substance de l’échantillon analysé.
y=ax+b
b) La spécificité
C’est la capacité à identifier puis à quantifier un analyte sans équivoque en présence de
composé endogène de la matrice. On pratique On fait une identification spectrale et un temps
de rétention des analytes (cela veut dire, on compare les spectres UV des molécules à une
bibliothèque spectrale).
c) La sélectivité
Ce critère est fondé sur une démonstration, dans un blanc matrice (plasma, urine), de
l’absence de réponse au temps de rétention de l’analyte par comparaison avec une solution
pure de l’analyte.
d) Limite de détection, Limite de quantification :

La limite de détection (LD) :
C’est la plus faible concentration de l’analyte détectée, mais pas nécessairement à

doser, à l’aide d’une méthode spécifique dans des conditions expérimentales imposées.
La limite de quantification (LQ):
C’est la concentration minimale qui peut être quantifiée à l’aide d’une méthode
d’analyse avec une fiabilité définie.

e) La fidélité :
La fidélité selon l’ISO 3534-1, l’étroitesse de l’accord entre les résultats d’essai obtenus
en appliquant le procédé expérimental à plusieurs reprises dans des conditions déterminées.
Selon les conditions d’exécution de l’essai, cette caractéristique s’exprime sous forme de
répétabilité ou de reproductibilité pour une méthode.
La répétabilité :
L'essai de répétabilité consiste à effectuer l'analyse d'un même échantillon pour le même
analyte dans des conditions identiques : même opérateur, même lots de réactifs, même
appareil, même calibreur. En pratique, cet essai sera réalisé au cours d'une même série.
L'exploitation des résultats consiste à calculer la moyenne (X), l’écart-type (s) et le coefficient
de variation(CV) des valeurs expérimentales. Le CV représentera la répétabilité de la méthode
en %.
 La fidélité intermédiaire :
Concerne les mesures effectuées à l’intérieur d’un même laboratoire, quand un ou plusieurs
facteurs sont changés (jour, opérateur, équipement…) pendant un intervalle de temps donné.
On la pratique pendant trois différents jours dont le premier jour correspond à la
détermination de la répétabilité.
 Reproductibilité
A un niveau donné c’est l’étroitesse de l’accord entre les résultats individuels obtenus sur
le même échantillon soumis a l’essai dans le même laboratoire et dont au moins l’un de
éléments suivants est différent : l’analyste l’appareil le jour.
f) La justesse
La justesse d’une méthode est déduite après avoir établi, la linéarité, la fidélité et la spécificité
de la méthode, elle est déterminée par le calcul du biais% et du justesse%.
Justesse = 100 -│ Biais (%) │

Biais =
La valeur moyenne de Biais % (inférieur à 20%) et de justesse % (supérieur à 80%) ont

montré que la méthode est bien juste.

Chapitre III :
Matériels et méthodes

I. Matériel et Réactif
1. Produits
Dans notre expérience on a utilisé en plus du réactif principal qui est le bromazepam
d’autres réactifs secondaires pour valider les critères de ce médicament.
 Etalon interne (méthylclonazépam) de concentration 10mg/l
 Tampon bicarbonate
 Diéthyl éther
 Serum humain
 Acétonitrile
 Tampon phosphate
 Eau HPLC
2. Verrerie
 Tubes en verre borosilicaté de 15 ml à fond rond
 Tubes en verre borosilicaté de 15 ml à fond conique
 Flacons pour injecteur automatique
 Béchers en verre
3. Appareillage
L’appareillage est référencé dans le système informatique de gestion des équipements
QUALIMS_EQM.
 HPLC-Shimadzu
 Thermostat à sec à bloc métallique avec rampe d’évaporation (TOULEMONDE et cie)
 Agitateur oscillant Agitelec
 Agitateur vibrant type VORTEX
 Centrifugeuse JOUAN (Réf. : G 412)
 pH-mètre de paillasse (précision ±0,01)
 Agitateur à retournement
 Micropipettes à volume réglable et volume fixe.
 Vortex
 Balance de précision de classe

 2 pompes SHIMADZU LC 10 A
 Auto-injecteur SHIMADZU SIL-10 ADVP
4. Mode opératoire
En général, le dosage est effectué dans le sang total, le sérum, les urines ou le liquide
gastrique. Il est toute fois possible de rechercher et de doser les benzodiazépines dans d’autres
matrices telles que les poudres, les liquides inconnus... L’analyse nécessite un volume
minimal de 2 ml pour chaque milieu.
Préparation de la solution mère :

On pèse 1 g de médicament du bromazépam et on ajoute 1 l de méthanol, puis, on
l’agite quelque seconde. La concentration finale de la solution mère est égale à 1g/l.
Préparation des solutions filles :

 100mg/l (50µl de solution mère+ 450µl eau distillé)
 10mg/l (10µl de solution filles100mg/l + 90 µl eau distillé)
 1mg/l (1µl de solution fille 10mg/l +9µl eau distillé)

Dans des tubes de 15 ml, introduit successivement :
Tableau 2:Préparation de la gamme d’étalonnage et la gamme de validation

Gamme d’étalonnage
Concentration µg/l 0 50 100 500 1000 2000
Milieu biologique
2000 µl 1900 µl 1800 µl 1900 µl 1800 µl 1600 µl
sans BZD
solution fille de
bromazépam à 10 - - - 100 µl 200 µl 400 µl
mg/l
solution fille de
- 100 µl 200 µl - - -
bromazépam à 1 mg/l
Etalon interne à 50
500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl
mg/l
Tampon carbonate
1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
pH 9,5
Diéthyl éther 8ml 8ml 8ml 8ml 8ml 8ml
 Agiter par retournement pendant 10 min

 Centrifuger pendant 5 min à 3000 tr/min environ
 Transférer la phase éthérée dans un tube à fond conique de 10 ml
 Evaporer à sec sous faible courant d’azote, à 40 °C environ
 Reprendre le résidu sec par 100 µl de phase de reprise
 Agiter au vortex
 Centrifuger pendant 5 min à 3000 tr/min environ
 Injecter 40 µl du surnageant dans le système HPLC

5. Conditions chromatographiques
Phase mobile : tampon phosphate/acétonitrile selon le gradient d’élution suivant :
Temps (min) Tompan phosphate Acétonitrile

0 85 15
2 85 15
42 25 75
45 10 90
48 10 90
50 85 15
Tableau 3 : conditions chromatographique
Préparation des phases mobile
 Tampon phosphate de migration 0,025M ajusté à pH 2,6 avec H3PO4.
On dissout 3,4 g de K2H2PO4 dans un volume de 1L d’eau distillée, après filtration, le pH

est ajusté à 2,6 avec H3PO4.
 Eau HPLC / acétonitrile (10/90)

 Le chromatogramme est suivi par spectrophotomètre UV avec un balayage de 200nm
à 400 nm pour analyse nous avons fixé la longueur d’onde à 220 nm pendant 50min
une bande passante de 1 nm.
 Température optimale : 25°C
 Phase stationnaire : le gel de silice, pré colonne C18, colonne C18 (250*4.6)
 Débit : 1,3 ml/min
II. Résultats et Discussion :

Comme résultats d’analyse, on obtient des chromatogrammes à analyser on les
comparants avec ceux dans la bibliothèque.

1. Validation de la méthode analytique :
Figure 15: courbe représentative du manque d’impureté vis-à-vis le pic du bromazépam

--- pic de la Bromazépam
--- courbe de pureté

--- ligne de zéro
On a eu de bons résultats, sans aucune impureté, ni aucune interférence et une meilleur

séparation et identification des pics dans la zone de détection du bromazépam
Alors il n y a pas d’impuretés détecté et l’index de la pureté du pic a une valeur qui
tend vers « 1 » (Index= 0.999999)
Alors on trouve que le BROMAZEPAM est détectée sans aucune impureté.

Figure 16 : Représentation spectrale de la molécule bromazépam
D’après la figure 16 on note bien qu’il s’agit de la molécule de bromazépam, en effet

la courbe obtenue est en très bon accord avec celle de la librairie avec une absorbance sur la
même longueur d’onde 220 nm ce qui prouve que la substance analysée au sein de la matrice
est bien l’analyte recherché
Le Bromazépam apparait aux longueurs d’ondes suivantes : 220nm ; 234 nm mais

pour la longueur d’ondes : 234nm il y a un risque d’interférence avec des molécules non-
spécifiques dans le sérum et on a trouvé que le Bromazépam peut être détectée à 220nm sans
aucune interférence.

2. Sélectivité :
Figure 17 : Chromatogramme de blanc (sans bromazépam)
Figure 18 :chromatogramme de bromazépam dans la phase mobile (tampon phosphate/

acétonitrile)

L'examen de la sélectivité s'effectue sur l'analyse du blanc matrice démontre bien

l'absence de réponse au temps de rétention de la bromazepam que le temps de rétention de
bromazépam est : 16.2 min et dans la bibliographie spectrale sorte avec un temps de rétention
égale a 15.55min
La différence entre les pic du Blanc et d’un échantillon du Bromazépam tellement
important et les temps de rétention ne cause pas un problème d’interprété les résultats
Donc la sélectivité est bien validée.
3. la spécificité
D’après la comparaison entre les résultats obtenus et la bibliographie (cela veut dire,
on compare les spectres UV et le temps de rétention des molécules à une bibliographie

spectrale). on observe que les résultats compatible cela veut dire que le critère de spécificité
est bien validé
4. Linéarité :
On a utilisé cinq niveaux de concentration, répétée trois fois, à partir d’une même
solution mère et analysée le même jour pour déterminer l’exactitude des valeurs obtenues
dans les chromatogrammes, on tracé les trois courbes d’étalonnages (les aires des pics en
fonction des concentration) pour détérminer La pente, l’ordonné à l’origine et le coefficient
de détermination

Tableau4: plan d’étalonnage
Niveau Ci (Ug/ml) jour 1 jour 2 jour 3
aires aires aires

50 33928 55011 28395
50 44635 55378 31942
1 50 30990 51112 26571
100 108911 112749 51872
100 104880 103209 55378
2
100 112353 193942 66876
500 518258 638777 326207
500 604085 602221 999619
3
500 545121 597789 228333
1000 1442566 844963 1031655
1000 1222215 1178202 1214493
4
1000 1185695 1011866 1214493
2000 2718535 2485275 2079288
2000 3335602 2251785 2469801
5
2000 2877772 2002117 2608770

1 er gamme d'etalonnage
4000000
3000000 y = 1503,7x - 105316
R² = 0,994
2000000
aire
Série1
1000000
Linéaire (Série1)
0
0 500 1000 1500 2000 2500
-1000000
concentration
2eme gamme d'etalonnage

2500000
2000000 y = 1101,8x + 7997,3
R² = 0,9955
1500000
aire
1000000 Série1
500000 Linéaire (Série1)
0
0 500 1000 1500 2000 2500
concentration
3eme gamme d'etalonnage

3000000
2500000 y = 1218,7x - 60743
2000000 R² = 0,9995
aire
1500000
Série1
1000000
500000 Linéaire (Série1)
0
0 500 1000 1500 2000 2500
concentration
Figure 18 :La représentation des trois gammes d’étalonnage exprimant de l’aire de pic
en fonction de la concentration

Représentation graphique d’aires en fonction de la concentrations mesurées lors des

essais d’étalonnage.Les résultats obtenus démontrent une bonne linéarité : Y= aX + b avec un
coefficient de détermination (R2) qui se rapproche le plus possible de 1
Air : moyennes des d’aires
Concentration : moyennes des concentrations
5. La fidélité :répétabilité
L’analyse est faite sur une gamme d’étalonnage de cinq concentrations différentes et
répétée six fois. la moyenne (m) et l’écart type (σ) afin de calculer le coefficient de variation
(C.V) sont calculé selon la formule suivante :
C.V m100
Référence certifiée : C.V ne dépasse pas 20%
Les procédés de fidélité sont déterminés à partir des valeurs intra-jour pour la
Bromazépam . Les résultats obtenus sont presentés dans les tableaux suivants :
Tableaux5 : Résultats de la Répétabilité
Concentration aire Concentration biais Justesse

(µl/mg) observé(µl/mg)
50 23458 62,18117 0,243623
50 25678 63,95291 0,279058
50 25637 63,92019 0,278404
50 25600 63,89066 0,277813
50 20456 59,78532 0,195706
50 21023 60,23783 0,204757
moyenne 23642 62,83655 0,24656

Ecart type 2408,431 99,75344
Coefficient de 10 ,18709
variation


(µl/mg) observé
100 60166 91,47725 -
0,08523
100 64573 94,99441
-
100 62067 92,99441 0,05006
100 48520 82,18276 -
0,07006
100 45600 79,85235
-
100 56662 88,68077
0,17817
- 100,1164
0,20148
-
0,11319
moyenne 56264,67 90,06592 -0 ,11636

Ecart type 7639,224
Coefficient de 13,5773
variation

(µl/mg) observé
500 523012 460,8675 -0,07826
500 512382 452,3839 -0,09523
500 650163 562,3448 0,12469
500 621174 539,2091 0,078418
500 501233 443,486 -0,11303
500 627361 544,1468 0,088294
moyenne 572554,2 511 ,7904 0,000813

Ecart type 67160 ,45 99,99919
Coefficient de 11,72997
variation


(µl/mg) observé
1000 1219476 1016,705 0,016705
1000 1217072 1014,786 0,014786
1000 1175684 981,755 -0,01825
1000 1218074 1015,586 0,015586
1000 1324741 1100,715 0,100715
1000 1127750 943,4996 -0,0565
moyenne 1213800 994,4662 0 ,012174

Ecart type 65156,01
Coefficient de 5,36938 99,987883
variation

(µl/mg) observé
2000 2507334 2044,524 0,022262
2000 2323873 1898,107 -0,05095
2000 2250514 1839,56 -0,08022
2000 2653793 2161,411 0,080706
2000 2363924 1930,071 -0,03496
2000 2583529 2105,334 0,052667
moyenne 2447161 2009,787 -0 ,00175

Ecart type 158563,7 100,0017
Coefficient de 6 ,479494
variation

3000000
2500000 y = 1251,9x - 51195

R² = 0,9998
2000000
air
1500000
Série1
1000000
Linéaire (Série1)
500000
0
0 500 1000 1500 2000 2500
concentration
Figure19 : courbe de bromazépam dans le sérum

D’après ces résultats on constate que le C.V appartient au domaine de Référence
Certifiée (CV ne dépasse pas 20%) donc la répetabilité est bien validée.
La répétabilité est évaluée par le calcul du coefficient de variation. Ce dernier est

inférieur à 20% confirmant que la méthode est répétable et bien précise.
6. La justesse :
La justesse d’une méthode est déduite après avoir établi, la linéarité, la fidélité et la
spécificité de la méthode, elle est déterminée par le calcul du biais% et du justesse%.
Justesse = 100 -│ Biais (%) │
Biais =

D’après les résultats obtenus du tableau 5, on remarque bien que la méthode est bien
juste.
En effet la valeur moyenne de la justesse est supérieure à 80% et la valeur moyenne du

biais est inferieure à 20%.

7. Limite de Détection / Limite de Quantification :

21525,75 écart type est calculé a l’aide de logiciel Excel
a= 1253 la pente de la courbe (figure 19)
b= -54455 ordonnée àl’origine de la courbe (figure 19)

Donc :
LD = = 8,07812µg/L
La Limite de détection est égal 8,0712μg/L c’est la plus faible concentration possible
qui peut être détectée, mais insuffisante pour doser le bromazépam à l’aide de cette méthode
(HPLC)
LQ = = 128.334μg/L
La limite de quantification est égal LQ est égal 128,334μg/L. Elle correspond la

concentration minimale de bromazépam qui peut être quantifiée à l’aide d’une méthode
d’analyse avec une fiabilité définie.

Conclusion
Avec la mise en place des systèmes d’assurance qualité dans les laboratoires, la validation
des méthodes d’analyse est aujourd’hui un objectif important.
Après réalisation des expériences sur trois gammes d’étalonnage et une gamme de
validation (chaque gamme contient cinq niveaux de concentration répéter 6 fois ), nous avons
calculé les différents critères statistiques à savoir la sélectivité, la spécificité, la linéarité, la
répétabilité, la limite de détection et de quantification, confirme que la méthode d’analyse est
normale, fidèle et juste.
 La linéarité est vérifiée par le coefficient de détermination qui est proche de 1.

 La fidélité est vérifiée par le calcul du coefficient de variation de répétabilité
 La justesse est vérifiée par recouvrement supérieur ou égal 80% et Biais inférieur ou
égal 20%.
Suite à ces résultats satisfaisants, on peut confirmer que la méthode d’analyse du bromazépam
par HPLC est apte à être appliquée.
En guise de conclusion, la technique d’analyse par chromatographie liquide à haute
performance présentée dans ce modeste mémoire est convenable pour le dosage du
médicament de la Bromazépam dans le futur

References:
[1] Forrest IS, Forrest FM. Urine color test for the detection of phenothiazine compouds. Clin
Chem 1960 ; 6 : 11-3.
[2] Trinder J. Rapid determination of salicylate in biological fluids. Biochem J 1954 ; 57 :

301-3.
[3] Chimie Analytique Instrumentale, Notions De Spectrophotométrie UV-Visible. Laboratoire

Chimie Provence, UMR 6264. Universités d’Aix-Marseille I, II et III – CNRS.
[4] https://fr.wikipedia.org/wiki/Benzodiazépine#Histoire
[5] http://www.blog.nutrition-outlet.org/2013/10/Tout-savoir-sur-le-GABA.html
[6] Dictionnaire Vidal, 2011.
[7]K. Anton & C. Berger, Supercritical Fluid Chromatography with Packed Columns,
Chromatographic Science Series, vol. 75, Marcel Dekker, New York, 1998
[8]L. S. Ettre, « The Centenary of the Invention of Chromatography », in Journal of

Chromatographic Science, pp. 225-226, vol. 41, 2003
[9]K. M. Gooding & F. E. Regnier, HPLC of Biological Macromolecules, Chromatographic

Science Series, vol. 51, Marcel Dekker, New York, 1990
[10] les procédures analytiques de séparation et repris dans le document Q2A de la

Conférence Internationale sur l’Harmonisation .

Lexique
Diazépine : est un composé insaturé hétérocyclique à sept atomes dont deux d'azote
psychotrope est une substance qui agit principalement sur l'état du système nerveux
central en y modifiant certains processus biochimiques et physiologiques cérébraux, sans
préjuger de sa capacité à induire des phénomènes de dépendance, ni de son éventuelle toxicité
anxiété : est un état psychologique et physiologique caractérisé par des composants

somatiques émotionnels et comportementaux En l’absence ou en présence de stresse
psychologique, l’anxiété peut créer des sentiments de peur, d’inquiétude et de crainte
l’agitation psychomotrice : est l'expression dans le comportement de l’excitation psychique.

Il s’agit d’une activité motrice augmentée et inadaptée. Cette activité peut être contrôlable ou
non par le sujet. Les manifestations cliniques de l’agitation sont motrices (mouvements
brutaux et incoordonnés, manifestations d’agressivité) et verbales (voix forte et parole
précipitée, cris…)
Le sevrage : peut se référer à toute sorte de séparation, mais est plus communément utilisé
pour décrire le groupe de symptômes qui surviennent lors d'un arrêt progressif ou brutal
de dosages durant des prises de médicaments, drogues / substances associées et alcool; ou
entre deux prises, cela
concerne alors surtout les molécules à demi-vie courte. Il se produit alors une période de
manque et un début de sevrage.
L'accoutumance : est un processus d'adaptation de l'organisme à un stimulus extérieur, un

environnement nouveau ou même un produit toxique
Un sédatif : est une substance qui a une action dépressive sur le système nerveux central et
qui entraîne un apaisement, une relaxation, une réduction de l'anxiété, une somnolence, un
ralentissement de la respiration et une diminution des réflexes
anticonvulsivant : sert à désigner l'ensemble des substances médicamenteuses prescrites pour

enrayer des crises de convulsions dans le cadre, notamment, de l'épilepsie
L'amnésie : est une perte partielle ou totale de la mémoire.

fente Synaptique : désigne une zone de contact fonctionnelle qui s'établit entre
deux neurones, ou entre un neurone et une autre cellule (cellules musculaires, récepteurs
sensoriels…). Elle assure la conversion d'un potentiel d'action déclenché dans le neurone
présynaptique en un signal dans la cellule postsynaptique.
Progestérone : est une hormone stéroïdienne principalement sécrétée par les cellules
du corps jaune des ovaires et impliquée dans la grossesse.
Agoniste : est une molécule interagissant avec un récepteur membranaire et activant celui-ci.
Hypnotique : sont une classe de médicaments ayant la propriété d'induire le sommeil chez
des patients qui souffrent de difficultés d'endormissement ou de réveils précoce
La somnolence : est un symptôme qui se traduit par une forte envie de dormir
Torpeur : état de quelqu’un chez qui l’activité psychique et physique, la sensibilité sont
réduites.

Validation Analytique de Dosage Du Bromazépam Par La Méthode HPLC - FALOUS Redouane

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Université Sidi Mohammed Ben Abdellah

Faculté des Sciences et Techniques

Année Universitaire : 2015-2016

Master Sciences et Techniques : CMBA

MEMOIRE DE FIN D’ETUDES

Validation Analytique de Dosage du

- Pr. LAMCHARFI EL HADI (FST FES)

- Pr. ACHOUR SANAE (CHU FES)

Soutenu Le 15 Juin 2016 devant le jury composé de:

Stage effectué à : Centre Hospitalier Universitaire Hassan II

Mémoire de fin d’études pour l’obtention du Diplôme de Master Sciences et Techniques

Nom et prénom: FALOUS REDOUANE

Mots clés: Bromazépam , anxiété ,GABA, HPLC, benzodiazépine, toxique

Figure 1 : CHU HASSAN II-FES 5

Figure2 : Laboratoire central d’analyses médicales 5

Figure3 : Organigramme de l’unité de pharmacotoxicologie de CHU- Fès 6

Figure4 : Cassettes d’analyse des drogues 7

Figure 5 : Appareil de Chromatographie en phase Liquide a Haute Performance 8

Figure6 : Coloration des imipramines 9

Figure7: Spectrophotomètre UV (jasco 530) 9

Figure8:Structure générale des benzodiazépines. 12

Figure9: Structure de quelques benzodiazépines 12

Figure 10: Récepteur GABA-A. 15

Figure 11 :Structure du bromazépam 18

Figure 12 :Schéma de principe d’une chaîne d’HPLC 21

Figure 13 : Description de l’HPLC SHIMADZU/DAD au laboratoire des analyses 25

Figure14 : Critères de validation 28

Figure 15: Courbe représentative du manque d’impureté vis-à-vis le pic de la bromazépam 37

Figure 16 : Représentation spectrale de la molécule bromazépam 38

Figure 17 : Chromatogramme de blanc (sans bromazépam) 39

Figure 18 : Chromatogramme de bromazépam dans la phase mobile (tampon phosphate/

Figure19 : Courbe de bromazépam dans le sérum 46

Tableau1 :Benzodiazépines commercialisées et présentations 13

Tableau 2:Préparation de la gamme d’étalonnage et la gamme de validation 41

Tableau 3 : Conditions chromatographique 36

Tableau4: Plan d’étalonnage 41

Tableaux5 : Résultats de la Répétabilité 45

CCM : Chromatographie sur Couche Mince

CHU : Centre Hospitalier Universitaire

Forrest : Réactif (dichromate de potassium, acide sulfurique, acide perchlorique)

FPN : Réactif (chlorure Ferrique, acide Perchlorique acide Nitrique)

HPLC : Chromatographie en phase Liquide a Haute Performance

HEPT :La hauteur équivalente à un plateau théorique

L :est la longueur de la colonne

Nef f :nombre de plateaux effectifs

Nth le nombre de plateaux théoriques

t’r : temps de rétention réduit

Vo : moyenne des valeurs observées

la largeur du pic à mi-hauteur

Liste des tableaux

Liste des abréviations

1-Présentation du Centre Hospitalier Universitaire Hassan II 4

II-Les différentes méthodes d’analyses médicamenteuses du laboratoire CHU Fès : 7

a-CCM : Chromatographie sur couche mince 7

b- HPLC : Chromatographie en phase liquide à haute performance 8

I- Généralité sur Benzodiazépines 11

6-Classification des BZD en fonction des indications 14

8- Les récepteurs GABA A sont localisés dans : 14

a- Mécanisme d’action et propriétés pharmacologiques 14

b- Le GABA possède un rôle dans 15

c- Effets de l’ouverture du canal chlore : 15

6-Les effets indésirables 19

III-La méthode de dosage par HPLC (High Performance Liquid Chromatography) 20

2-Les composants d’une chaîne HPLC 21