Chapitre III: La chromatographie, définition et notions de bases Mr.

ZAHI

III.1 Le chromatogramme
C’est une représentation à deux dimensions, elle montre un paramètre dépendant de la
concentration instantanée du soluté en sortie de la colonne. Dans le chromatogramme, le
temps est porté en axe des « X » et l’intensité du signale en axe des « Y ». Le
chromatogramme peut être utilisé dans l’analyse qualitative (identification des composés
analysés) et quantitative (détermination de la concentration et/ou la masse des composés
analysés).

Figure III.1: L’allure d’un chromatogramme

III.2 Les grandeurs de rétention

III.2.1 Temps mort (t0 ou tM)
C’est le temps nécessaire de la phase mobile pour traverser la colonne.
III.2.2 Temps de rétention (tR)
C’est le temps écoulé entre l’instant de l’injection et celui du maximum du pic éluer.
III.2.3 Temps de rétention réduit ( )
C’est le temps écoulé entre la sortie du produit et le temps mort :

(III.1)

Figure III.2: Chromatogramme avec les temps de retentions

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III.2.4 Volume mort (VM)

C’est le volume de la phase mobile qui passe de l’extrémité à l’autre extrémité de la colonne.
Il peut être calculé à partir du chromatogramme, à condition d’introduire un soluté non retenu
par la phase stationnaire. Il est calculé par la relation suivante :

VM = tM . D (III.3)
D: est le débit de la phase mobile.
III.2.5 Volume de rétention (VR)
Il représente le volume nécessaire de la phase mobile pour éluer le produit de l’extrémité à
l’autre extrémité de la colonne. Il est calculé par la relation suivante :

VR = tR . D (III.4)
III.2.6 Volume de rétention réduit ( )
C’est le volume qui doit passer dans la colonne afin d’éluer le produit. Il est calculé par la
relation suivante :

= VR-VM (III.5)

III.6.7 Facteur de rétention k (ou capacité )

C’est le rapport entre la masse du composé dans la phase stationnaire et celui de la phase
mobile. C’est est le paramètre le plus important en chromatographie, car il reflète le
comportement des colonnes et leur capacité à retenir chaque composé. Il est indépendant de
la longueur de la colonne ou du débit. Il est noté :

(III.6)

Le facteur de rétention peut aussi être calculé à partir du chromatogramme par la relation
suivante :

(III.7)

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La relation (II.7) est souvent rencontrée sous la forme de :

(III.8)

D’après les relations (II.3), (II.4) et (II.8) le volume de rétention peut s’exprimer comme suit :

VR = VM . (III.9)

III.7 Facteur de séparation (ou sélectivité) entre deux composés

C’est un facteur qui permet de déterminer avec précision, les positions relatives de deux pics
adjacents (voisin), sur un chromatogramme. Il est exprimé par les deux relations suivantes :

(III.10)

(III.11)

Remarque : Par définition, le facteur de séparation ne peut être inférieur à 1. Et si α = 1 cela

indique que la structure des deux composés est trop proche, pour permettre la séparation dans
les conditions opératoires utilisées.

III.8 Facteur de résolution entre deux pics

C’est un paramètre qui est utilisé pour traduire numériquement la meilleure ou la mauvaise
séparation entre deux composés, il est noté comme:

(III.12)

Plus la résolution entre deux pics est grande, plus la séparation est bonne.
 Pour une valeur de , la séparation est mauvaise.
 Pour une valeur de , la séparation est optimale.
La résolution, peut être exprimée, en fonction de relations dérivées des relations précédentes et par le
remplacement des paramètres par d’autres paramètres. Ces relations sont exprimées ainsi :

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(III.13)

Maintenant si on suppose que les deux composés ont la même largeur a la base du pic
, on obtient la relation de Purnell suivante :

√ (III.14)

III.9 Efficacité théorique d’une colonne (nombre de plateaux

théoriques)
Au cours du passage du composé dans la colonne, il occupe une zone qui s’élargit (dispersion
linéaire σ2). Cette dernière, peut être repérée par la variance σ qui croit avec la distance
parcourue par le composé.
Lorsque cette distance vaut L (la longueur de la colonne) la variance peut être écrite comme :

(III.15)
H : étant la hauteur équivalente à un plateau théorique.
Pour tout chromatogramme, à partir d’un pic d’élution dont σ2 est bien connu, l’efficacité
théorique de la colonne N peut être déterminée par :

= (III.16)

D’après les équations (II.15) et (II.16), H peut être calculé comme par la relation:

= (III.17)
Il est bien connu que les pics chromatographique ont une allure Gaussienne. Du coup, l’aire
du pic est calculé par l’assimilation du pic à un triangle.

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Figure III.3: Pic chromatographique avec les trois paramètres classiques.

Ou :
: représente la largeur du pic à 13,5% de sa hauteur, elle est égale a σ.
: représente la largeur du pic à 50 % de sa hauteur, elle est égale a σ.
σ: représente la demi-largeur du pic à 60,6% de sa hauteur, elle est connu comme l’écart type.
Le nombre de plateau théoriques peut être alors calculé par la relation suivante :

= = (III.18)

III.10 Influence de la vitesse de la phase mobile sur la séparation

III.10.1 Equation de Van Deemter
L’influence de la vitesse de la phase mobile sur la qualité d’analyse (efficacité de séparation)
a été établie en 1956 par Van Deemter. Ce dernier, a posé la première équation cinétique dans
le cas des colonnes remplies en chromatographie en phase gazeuse (CPG). Cette équation,
relie la HEPT à la vitesse moyenne d’écoulement ( ) de la phase mobile dans la colonne.

= +C . (III.19)
A, B, et C : des constantes pour une colonne et phase stationnaire données.
Cette équation donne une interprétation mathématique de la courbe, d’où H est égale à la
somme des trois termes , C, , ou chaque terme a une signification physique précise.

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Van Deemter a pu aussi démontrer qu’il existe un débit optimale pour chaque colonne, et que
vers des débits élevés H augmentait linéairement. Et vers les faibles débits l’augmentation et
asymptotique.

Figure III.4: La courbe de Van Deemter

III.10.1.1 Interprétation du terme A dans l’équation de Van Deemter
C’est le facteur de diffusion turbulente ou diffusion d’Eddy. Il est en relation avec
d’écoulement de la phase mobile via la phase stationnaire.

=2λ. (III.20)

λ: est le facteur de remplissage de la colonne

dp : taille des particules (ou diamètre des graines)

Remarque : Dans le cas des colonnes capillaires, le terme A n’existe pas car il n’y a pas de
remplissage.

III.10.1.2 Interprétation du terme ( ) dans l’équation de Van Deemter

Ce terme est connus comme la diffusion moléculaire longitudinale, il vari inversement avec la
vitesse d’écoulement de la phase mobile.

= (III.21)
: Facteur d’obstruction ou de tortuosité (lié à l’espace entre les particules de remplissage).
Il est égal à 0,6 et 1 pour les colonnes capillaires et remplies, respectivement.
: Le coefficient de diffusion du soluté dans la phase mobile.

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Remarque : Il faut noter que la diffusion longitudinale dans la colonne est rapide, et par
conséquent, si le débit est trop faible, les solutés en cours de séparation se mélangeant à
nouveau plus vite qu’ils migrent. De ce fait, on ne doit jamais interrompre provisoirement une
analyse chromatographique en marche.
III.10.1.3 Interprétation du terme C dans l’équation de Van Deemter
C’est le terme de transfère de masse, il est dû à la résistance au transfert de masse du soluté
entre les deux phases.
= (III.22)

: Terme de transfère de masse dans la phase stationnaire.

: Terme de transfère de masse dans la phase mobile.
III.10.2 Equation de Golay
Cette équation a été proposée par Golay en 1958, elle est applicable en CPG pour les colonnes
capillaires ou le terme de remplissage A n’existe pas.

= +C. (III.23)

III.10.3 Equation de Knox

C’est une équation plus récente par rapport aux équations précédentes, elle a été donnée par
Knox en 1977. Elle est applicable à tout type de chromatographie liquide.

= +C. (III.24)

III.11 Analyse quantitative par chromatographie

III.11.1 Etalonnage externe
Cette méthode permet le calcul des concentrations des composés qui existent dans
l’échantillon. Dans cette méthode, on injecte la solution référence (Créf) et on détermine son
air du pic (Aréf).

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Figure III.5: La méthode d’étalonnage externe

Sous les mêmes conditions, on injecte le même volume de la solution échantillon qui
contient le composé à doser (Céch) et on détermine son air du pic correspondant (Aéch), on aura
alors :

Et
=

D’où : (III.25)

K : le coefficient de réponse relatif.

III.11.2 Etalonnage interne
Comme pour l’étalonnage externe, cette méthode fait aussi appel à deux chromatogrammes.
Le premier pour le calcul des coefficients de réponse relatifs, et le second pour l’analyse de
l’échantillon. En pratique, un volume connu de l’étalon interne (E), est ajouté à la solution de
l’échantillon. L’étalon (E) ne doit pas être présent au préalable dans la solution précédente, et
qui doit être élué en dehors de tous les pics du mélange.

Figure III.6 : La méthode d’étalonnage interne

Soit deux composés 1 et 2 qu’on veut doser dans un échantillon, et (E) l’étalon interne.

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- Dans une première étape, on doit préparer une solution d’étalonnage de concentration C 1,
C2 et CE pour les composés 1, 2 et E respectivement. On injecte cette solution, et on détermine
leurs aires des pics d’élutions A1, A2 et AE. Appelons aussi m1, m2 et mE les masses précises
de 1, 2 et E. On aura alors :

Les rapports de masses par rapport à l’étalon peuvent être écrits:

et

Les coefficients de réponses relatifs seront :

Et

- Dans une deuxième étape, on ajoute à la solution étalon un volume connu en E et on

injecte le mélange. Par la suite on obtient, A1 , A2 et AE relatives aux masses m1 , m2 et mE .
D’où :

et

Etant donné que : et

et

La relation générale de calcule des concentrations des composants de l’échantillon peut

s’écrire ainsi :

(III.26)

III.11.3 Normalisation interne

Si on désire faire une identification de tous les constituants d’un échantillon, et de même le
pourcentage de concentration massique de chaque produit, on fait appel à la méthode de la
normalisation interne. Son principe est un peu similaire à celui de l’étalonnage interne.
Supposons qu’on désire identifier trois composés qu’on note 1, 2 et 3 présents dans
l’échantillon à analyser. Là-aussi on doit passer par deux étapes.

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Figure III.7: La méthode de normalisation interne

- L’étape 1, repose sur la préparation de la solution d’étalonnage contenant les trois composés
avec leurs concentrations respectives C1, C2 et C3. Le chromatogramme obtenu comporte trois
pics des trois composés avec des aires des pics A1, A2 et A3. Pour la détermination des
coefficients de réponses relatifs, on fixe un des composés comme un point de normalisation
interne. Pour mieux comprendre, on fixe le composé 3 par exemple.
D’où :

Et

En remplaçant, les masses par la relation m i = Ci . V on obtient :

Et

- L’étape 2, consiste à injecter notre solution d’échantillon qui contient bien sûr les
composés 1, 2 et 3. On détermine juste après les aires des pics sur le chromatogramme qu’on
note A1 , A2 et A3 . On pourra, dans ce cas, avoir facilement la composition massique des
trois produits on appliquant la formule suivante :

(III.27)

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X1 + X2 + X3 = 100.
Avec i= 1, 2, 3.

Exercice III.1
1. Dans la théorie de van Deemter, comment appelle-t'on le paramètre H? Pour avoir une
bonne séparation chromatographique, vaut-il mieux avoir un H petit ou grand? Justifier?
Exercice III.2
L’allure d’un pic chromatographique suit une courbe de Gauss. Ce pic est souvent caractérisé
par les 4 paramètres (tR, σ, δ et ω).
1. Donner la signification de chacun de ces paramètres.
2. Placer chaque paramètre sur le chromatogramme ci-dessous en justifiant brièvement.

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