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Agents pathognes

Outil PCR et surveillance de la rsistances des pathognes responsables de maladies infectieuses (SIMR) ( )
Pr Dosso
H elminthes Protozoaires Ascaris lumbricoides Plasmodium falciparum AD N + ARN AD N + ARN AD N + ARN AD N + ARN AD N + ARN AD N

Champignons A Ch i Aspergillus f ill fumigatus i t Bactries E scherichia coli Chlamydia pneumoniae H erps simplex

Virus

H aemophilus influenzae ARN

Introduction
Dtection et/ ou Quantification acides nucliques joue un rle majeur dans de nombreux domaines de la biologie

Techniques molculaires et biologie


Diagnostic des maladies Infectieuses , Cancers, Gntique Facteurs de virulence: Toxine, Enzymes, Capsule Rsistances : q Antibiotiques Antiviraux Antiparasitaire Diversit gntique Tracabilit des pidmies Rinfection Coinfection Rechute

Intrt de la biologie molculaire en infectiologie


Dtection dagent pathogne Typage dagent pathogne T d t th Evaluation de la charge virale Epidmiologie

Techniques molculaires et biologie (2)


Dtermination de la charge virale: Suivi des thrapeutiques et apprciation de la gravit VIH (efficacit du traitement) VHC (pronostic de rponse au traitement) Virus herptiques (dtection de ractivation) Diagnostic antnataux : Biologie prdictive

Liste rvise des maladies prioritaires, des affections et des vnements


Maladies potentiel pidmique, affections et vnements recommands par le RSI
1.Cholra 2.Dysenterie 3.Rougeole 4.Mningite 5.Peste 6.Fivres hmorragiques virales (Ebola, Marburg, fivre de la valle du Rift) 7.Grippe humaine due un nouveau sous type 1.Fivre jaune 2.SRAS 3.Variole 4.Dengue 5.Trachome 6.Chikungunya 7.Anthrax 8.Fivre Typhode 9.Hpatite-B

Marqueurs molculaires = gne, groupe de gnes ou squences spcifiques Dtection et caractrisation dorganisme (empreinte gntique) Prdiction dactivit chez lhte (pathognse, virulence) Nature marqueurs molculaires = facteurs de virulence, gnes de rgulation, squences dinsertion, squences rptes d insertion, LES FACTEURS DE VIRULENCE
Elments microbien qui participent leur capacit infecter et provoquer une maladie chez une espce donne. Exemple:facteur K des E.coli sur les pili

Maladies Eradiquer et Eliminer 1.Poliomylite 1 P li lit 2.Dracunculose 3.Lpre 1.Ttanos nonatal 2.Noma Autres Maladies dImportance en Sant Publique 1.Tuberculose 2.Filarioses 3.Ulcre de Buruli 4.Asthme 5.Diabte sucr 6.Epilepsie 7.Hypertension artrielle 8.Drpanocytose 9.Malnutrition 10.Cancers 11.Rage 12.Schistosomiase

1.Diarrhe chez les enfants de moins de 5 ans 2.Pneumonie chez les enfants de moins de 5 ans 3.VIH/SIDA 4.Paludisme 5.Onchocercose 6.Infections sexuellement transmissible (IST) 7.Trypanosomiase

Objectif
INTERET DE LUTILISATION DE LA PCR MULTIPLEX DANS LE DIAGNOSTIC DE LA VIRULENCE DES ENTEROBACTERIES PRODUCTRICES DE BETALACTAMASES A SPECTRE ETENDU (B.L.S.E).
COULIBALY N.ab, EKAZAa, W. LOUBIENGAb, GUESSENNDb, DOSSO.ab

Caractriser chez des souches productrice de bta-lactamases spectre tendu (BLSE), des facteurs de virulence (facteurs favorisant la rsistance)

INTRODUCTION
Bactries rsistantes et virulentes = Problme de sant publique

Mthodologie: Echantillons: 28 Souches E. coli BLSE 23 Souches K. pneumoniae BLSE Extraction dADN plasmidique Utilisation de la technique damplification in-vitro: PCR multiplex (+s cibles): Extraction dADN par Choc Thermique Utilisation damorces spcifiques des facteurs de virulence cibles Amplification spcifique in-vitro et rvlation sur gel dagarose. Gnes cibles = facteurs de virulence sta (Heat-stable toxine) = souches entrotoxinognes LT (Heat-labile toxine) = souches entrotoxinognes ipaH = souches entroinvasives

Variabilit profil biochimique

Problmes identification classique

Utilisation autres mthodes de caractrisation des micro-organismes : les l marqueurs molculaires l l i Gnome = succession de gnes ncessaires pour multiplication et adaptation

Gnes spcifiques

Utilisation comme empreintes gntiques Identification, caractrisation des micro-organismes

Rsultats (1)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15 16 17

ipaH

424 pb

18

19

20 21 22

23 24

25 M

26

27

28

( ) () (+) (-)

INTERET DE LA PCR COMME OUTIL DE DETECTION DES ENTEROCOQUES RESISTANTS A LA VANCOMYCINE (VRE)
EN SITUATION DE COLONISATION DANS LES SERVICES DE REANIMATION DES CHU DABIDJAN

424 pb 218 pb

Rsultats (2)
Prsence de plasmide : 10 souches K. pneumoniae (origine rsistance?) 00 souches E. coli Facteurs de virulence Souches entrotoxinognes 15 % (sta) (sta) 00 (LT) (LT) Souches entroinvasives 51 % (ipaH, E. coli+++) (ipaH, coli+++)

Introduction
ENTEROCOQUES = Bactries ubiquistes (intestin/homme, animaux, environnement) BACTERIES PATHOGENES OPPORTUNISTES Infection graves / septicmie, endocardite, mningite nonatal Surinfection plaies chirurgicales Infections nosocomiales +++ ( resp 10% Inf. urinaires nosocomiales) ENTEROCOCCUS FAECALIS+++ (85-90%) (85AUTRES: AUTRES: E.faecium, avium, durans

Tuberculose : Mthodes de diagnostic


Mthodes phnotypiques
Microscopie: examen de base Culture et identification despce Mycobiogramme

Introduction (2)
VRE = Entrocoques portant des gnes de rsistance la vancomycine (van) 6 Types Acquis: Van A, B, D, E, G Intrinsques: Van C (E. gallinarum,
casseliflavus, flavescens) flavescens)

Mthodes gnotypiques
Gnotypage des souches : gne rpoB, cat G

Mthodes gntiques : tudes des gnes

Gnes mobiles ports par des plasmides ou des transposons transfert de la rsistance dautres espces (S. aureus) (S. aureus)

OBJECTIFS
Dterminer le gnotype des souches de colonisation digestive de VRE isoles chez d patients hospitaliss d h des ti t h it li dans l les services de ranimation des 3 CHU dAbidjan
GENES Van A = 0/11 Van B = 0/11 Van C = 0/11 Van D = 0/11

RESULTATS
11 souches dclares VRE lantibiogramme

ESPECES E. faecalis = 10/11, E. faecium = 0/11

MATERIEL
TYPE DETUDE Etude exprimentale: Septembre 2004 ECHANTILLONS 11 Souches dEnterococcus faecalis VRE isoles en 2002 dEnterococcus

DISCUSSION
Lanalyse des produits damplification na d n permis de dtecter aucun des gnes d g recherch recherchs mais 10 souches de E. faecalis ont t confirmes. confirmes. Les gnes Van G et E nont pas t recherchs

Ecouvillonnage rectal de patients hospitaliss dans les services de ranimation des CHU de Cocody, Yopougon et Treichville Mthodes bactriologiques conventionnelles

Rsistantes la vancomycine lATB CMI > 256 g/ml par la mthode des E test

METHODES
PCR MULTIPLEX Extraction dADN Typage / Identification

Mthode physique: Choc thermique

Amplification gnique: Type PCR multiplex Amorces spcifiques / Squences


E. faecalis
5-ATC AAG TAC AGT TAG TCT-3 TCT5-ACG ATT CAA AGC TAA CTG-3 CTG-

Cas des techniques PCR en temps rel Maladies virales

E. faecium
55-TCG AAT GTG CTA CAA TC-3 TC55-TAG AGA CAT TGA ATA TGC C-3 C-

Conclusions
Lutilisation en routine des marqueurs molculaires est dun grand intrt en rgion tropicale o svissent de nombreuses maladies infectieuses causes par les micro-organismes : Diagnostic de virulence (PCR multiplex) Recherche de rservoir environnemental Acquisition de nouvelles proprits Contribution la traabilit microbiologique dans les cosystmes Comprhension de la virulence bactrienne dans les cosystmes