CHIMIE ANALYTIQUE

INSTRUMENTALE
Enseignant Intervenant:
Pr: A. DARI

Module:
Chimie Analytique instrumentale
Elément de Module:
Méthodes d’analyse chromatographiques et
spectrales
Chapitre V
Aspects théoriques de la séparation
chromatographique
Semestre: S5
Année Universitaire: 2023-24
Pr: A. DARI 1
www.um6ss.ma
 Chapitre V

Aspects théoriques de la séparation

chromatographique
Valable pour CPG et HPLC

Pr: A. DARI 2
5.1: Chromatogramme

Pr: A. DARI 3
Chromatogramme :
tracé des variations de composition de la phase éluée au cours du
temps

signal

Temps (min)

Pr: A. DARI 4
5.1.1: Le chromatogramme idéal

Aspect théorique
L ~
matie distanbenflexe
S

>

Tr
Caractéristiques de la courbe de Gauss
Pr: A. DARI 5
100 %

2
60,6 %

50 %



13,5 %

95,4 % de la
Surface du pic

m-2 m- m+2

m+
m

Pr: A. DARI 6
B = maximum d’ordonnée = 1 par convention.
¤ E et F = points d’inflexion d’ordonnée 0, 6. Leur distance par rapport à l’axe de
symétrie AD = s (écart-type)
¤ A = sommet du triangle AGI d’ordonnée 1, 2.
Pr: A. DARI 7
¤ GI = 4s
5.1.2: Le chromatogramme réel

Cas idéal Surcharge Composé trop peu retenu

de la phase stationnaire

 Irrégularité de concentration dans la zone de dépôt

 Vitesse de la phase mobile non constante dans la colonne
Pr: A. DARI 8
5-2 Chromatographe Simplifié

Éluant liquide ou
gazeux (M)

régulateur
Sortie de
de pression injecteur colonne (S) détecteur l’éluat
débimètres

Entrée de
l’échantillon Traitement
du signal

signal
temps
temps

Pr: A. DARI 9
 -

Colonne
Injection
Détecteur

Phase mobile

Chromatogramme
Pr: A. DARI 10
5.3 Grandeurs de rétention

5-3-1 : a) Temps de rétention: tR

Temps écoulé entre l’instant de l’injection et celui
qui correspond sur le chromatogramme au
maximum du pic qui lui est lié

Pr: A. DARI 11
 tr :
temps qui passe
une solute dans we

d colome

phase
contenant
stationnaire
ene

de
tm =
to =
temps depassage
Em
la phas milet

travers ane colonne

le
on
temps de
passage
Temps de font soluté non

reterm le
par
phase stationnaire
b) Temps de rétention réduit : tR’
tR’= tR – tM
tM ou t0 : temps mort : temps nécessaire pour qu’un
composé non retenu traverse la colonne
t’R

Pr: A. DARI 12
 -
tri temps de
exacte
sejour longue
s
s

du soluté dans la U
o
=

to
phase stationnaire %
Vitesse
colome

tp-to bnéaire
de la
phase
K' =
facteur de ritention , facteu
mobile

6
de capacité l'affinité 4
=to
:

dimsolute vis-à vis la

phase stationnaire
tr = to (1 + 1)
( + le d'affunte +
solute à
I'est élevée ( Relation
 H
.
6 facteur de sélechuité ( =

>
-

Lit
Calculé entre 2

t
pics
>
adjacents
-

RP
réponse 1 2
detecteu
11
(

tr
 G écart entre sommet

~Gite
-

au
pic
↓ est elevée letaux
-

- + +
A B
de recouvrement est

M
faille
42] Es
2 ne
taux de recouvrement ↑ permet pas
de determiner si

on a me home
3
A B
Séparation
de 2
Rs R résolution Rs =
()) W
= :

=H
&s
tu N :
efficacité d'une colome (Distil atio
=
ntre deplateaux théorique
=

2 r -
=
Nest elevé +efficacité

à
Capacité d'une colome
correctement APTE
=
séparer
2
pics adjacent chauteur equivalente

Si
pics bien séparé 1 5
,
: 1 plateau théorique) volme
cychendere
5.3-2 Volume de rétention VR ou volume d’élution :

Volume de phase mobile nécessaire pour faire

migrer un composé d’un bout à l’autre de la
colonne

V R = tR . D ou VR = tR . F

D « ou F »: débit de la phase mobile (constant)

Pr: A. DARI 13
Pr: A. DARI 14
Pr: A. DARI 15
 Grains de phase
stationnaire :
Volume total occupé : VS

Colonne
chromatographique
Volume interne : VI Volume interstitiel ou
volume Mort occupé par la
phase mobile : VM

Pr: A. DARI 16
Volume mort : Vm
Il correspond au volume occupé par la phase
mobile dans la colonne, c’est à dire au volume
interstitiel de celle-ci.
Si on suppose un débit D constant : VM = tM D
avec tM = temps mort (ou to)

Pr: A. DARI 17
Le temps mort ou le volume mort sont déterminables
sur le chromatogramme a condition que l’un des
composés détectés soit non retenu (ou le moins
possible) par la phase stationnaire « S ».

Porosité de la colonne  :

La porosité d’une colonne correspond au rapport

entre son volume mort VM et son volume interne VI
 = VM / VI

Pr: A. DARI 18
 Volume interne VI :
Les colonnes sont généralement cylindriques leur
volume interne se calcule donc à partir de leurs
caractéristiques géométriques : diamètre interne fint et
longueur L.

VI = ¼  int2 * L

Volume de la phase stationnaire : VS

Ce volume n’est pas accessible sur le chromatogramme
mais on peut le déduire si on connaît le volume interne
VI de la colonne : VS = VI - VM
Pr: A. DARI 19
 Volume de rétention : VR
Le volume de rétention de chaque soluté représente le
volume de phase mobile nécessaire pour le faire migrer
d’une extrémité à l’autre de la colonne.
Remarque : on considère que l’injecteur et le détecteur
qui ont leur propre volume mort sont compris dans la
colonne.
Dans ces conditions, le volume de rétention correspond
au volume de phase mobile écoulé entre le moment de
l’injection et celui de la détection du composé.
A débit constant :
VR = tR * D
Pr: A. DARI 20
 Relation entre u et VM :

D = ( VM / L ) * u
U = D * L / VM

Calcul de VM et tM :

On connaît le débit et les caractéristiques de la colonne.

 = VM / VI
VM =  VI
VI = ¼  int2 * L
VM = ¼  int2 * L
Pr: A. DARI 21
 D = ( VM / L ) * u
u = D * L / VM
tM = L / u = VM / D

tM = VM / D

to=tM = ¼   int2 * L / D

Pr: A. DARI 22
5-3-3: Coefficient de distribution: KA

AFM
rétention
AFS K 
A PS

élution
A
A PM

KA
Rapport entre la concentration du composé dans la
phase stationnaire et la concentration du composé dans
la phase mobile
Traduit l’importance relative des forces
intermoléculaires qui existent entre le composé et les 2
phases

Pr: A. DARI 23
Théorie de la partition :
La distribution d'un soluté A entre deux phases non-miscibles, l'une
stationnaire ( Saq ), l'autre mobile ( Sorg ), relève de l'équilibre :

Pr: A. DARI 24
5-3-4 : Facteur de rétention k’ (ou de capacité) :

t '

k'  R

t M

Rend compte de la faculté plus ou moins grande de la colonne à

retenir un composé

Indépendant du débit de la M et des dimensions de la colonne

k’ est accessible à partir du chromatogramme

Pr: A. DARI 25
Pr: A. DARI 26
Pr: A. DARI 27
Pr: A. DARI 28
tR = tM + tR’
Si composé non retenu par la S :
tR = tM= tM : temps passé dans la M
 tR’= tS: temps passé dans la S
si mT = mM + mS
On a alors

k 
'
t


'
R
m A

PS

APS
.V
K .
V PS PS
A
t M
m A

PM
A 
PM .V V PM
A
PM

k’ est indépendant de mT

Pr: A. DARI 29
 V
β PM

V t V '
K
PS k'   K. R PS

t V M
β PM

En chromatographie capillaire ( GC) :

 β est très élevé  tR réduits
 on peut prévoir le comportement des colonnes grâce à ce
facteur β : pour un composé et une S donnés,
k’ diminue quand β augmente

Pr: A. DARI 30
 entre 0 et 5 y a une grande influence sur la resolution
au dela de 5 l amelioration sera tres faible

on peut jouer sur les valeurs de la phase stationnaire et phase mobile de tel sorte que k= 5
mais si k = 10 k>5 on aura pas plus de resolution donc y a perte de temps (sara :))) )
Facteur de rétention k’ et tR :
tR = tM ( 1 + k’ )
tR = tM( 1 + K / β)

⇒ permet de calculer le coefficient de distribution

En pratique, k’ ne peut pas dépasser 10

k’ < 1: le composé sort trop tôt
k’ ≈ 2-5 : correct

Pr: A. DARI 31
5-3-5 Facteur de séparation ou de sélectivité α

permet de préciser les positions relatives de deux pics

sur un chromatogramme :

KB k' B (t' R )B
α α α
KA k' A (t' R ) A

α est toujours supérieur à 1

α est l’aptitude d’un système chromatographique à
séparer deux composés

Pr: A. DARI 32
Pr: A. DARI 33
Pr: A. DARI 34
5-3-6 Modèle des plateaux: (Craig)

 Déplacement du soluté dans la

colonne en une suite d’étapes
distinctes Instant I-1 Instant I

à chaque étape: AFM AFS

 Colonne de chromatographie =
 Série de compartiments distincts
ou « plateaux théoriques » dans
lesquels s’établit l’équilibre de
répartition du soluté

Pr: A. DARI 35
la ou l epaisseur est de 15 cm et la ou c 1m (les 2 ont la mm largeur) la difference entre les 2 C
EST LE NOMBRE
Pr: A. DARI 36
Pics d’élution gaussien

Un soluté se déplaçant

dans une colonne donne
un signal d’allure
gaussienne au moment de
sa sortie au niveau du
détecteur

 : écart-type
w1/2 ou  = 2.35  : largeur
à mi-hauteur
w ou wb : largeur à la base
=4

Pr: A. DARI 37
hauteur équivalente à un plateau théorique

A apprendre
L longueure de la colonne N : l’efficacité (n’a pas d’unité

plus une colonne est efficace plus N est élevé est plus H est faible

Pr: A. DARI 38
La colonne de longueur L est découpée en N petits
disques fictifs ou « plateaux théoriques » de même
hauteur H : L
N 
H

N = nombre de plateaux théoriques

Si: L en cm
Alors : → H en cm

Pr: A. DARI 39
5-3-7 Efficacité d’une colonne: Définition de H

colonne

départ

Profil de concentration
Plus H est faible, plus la dispersion est faible,
Plus l’étalement de la bande est réduit, plus le pic est étroit « fin ».
l2 = H . l
H : Coefficient de proportionnalité entre la variance de la bande et
la longueur parcourue
2
σ H : HEPT = hauteur équivalente à un plateau théorique
H l
l : longueur parcourue
l
Pr: A. DARI 40
Plus le temps de séjour dans la colonne augmente, plus le pic « s’étale » à
cause du phénomène de diffusion
La dispersion linéaire σ croît avec la longueur parcourue
Et la variance de la bande est proportionnelle à la longueur parcourue
dans la colonne: 2 = H . L

Pr: A. DARI 41
Valeurs usuelles de H:
 0.1 à 1 mm en GC
 ~ 10 μm en HPLC

σ 2 2
H L L L.L L t2
N    R

L H σ 2 σ 2 σ2
L L

Lorsque L est la longueur est la longueur totale de la colonne

On peut évaluer N en mesurant tR et l’écart-type du pic
chromatographique puisque ces 2 paramètres sont dans le même rapport
que L et  L.
Pr: A. DARI 42
 a apprendre

avec (w) omega = 1,7 x delta

largeur du pic à moitié hauteur Pr: A. DARI 43

colonnes capillaire = efficacité augmente

Nombre de
N/par mètre de H (HETP) en
Type de chromatographies plateaux
colonne mm
théoriques N
2000 1000 1
CPG (colonne remplie de 2m )
100000 4000 0,25
CPG (colonne capillaire de 25m)
100 200 5
CPL classique de 50 cm
5000 50000 0,02
HPLC de 10cm

Pr: A. DARI 44
 Conc.dans la colonne
éluant chromatogramme

signal
L
l σl

détecteur tR temps

Pr: A. DARI 45
N = mesure de l’efficacité d’une colonne
si H ↓→ largeur de bande ↓ → séparation ↑
2
t
t2
16 t 2 N  16 R
L w
2
N   R R

H σ 2 Donc
w2
b

t
2

N  5.55
b
R

w 2
1/2

Car: σ=Wb/4

Car W0 = 1,7 W1/2

N est mesurable sur un chromatogramme

 Si N est constant, la largeur d’un pic chromatographique augmente quand le temps de rétention
augmente

Pr: A. DARI 46
Pr: A. DARI 47
Pr: A. DARI 48
Pr: A. DARI 49
relation a apprendre

Pr: A. DARI 50
 alpha, k’ et N sont des facteurs de résolution
en general pour avoir une bonne resolution = bonne séparation, on respecte les 3 conditions

on joue avec le temps de retention soit en changeant la colonne

augmenter k’2 pour augmenter alpha

pour modifier l’affinité on joue sur la polarité et la phase mobile

Pr: A. DARI 51
5-4-Théorie de l’élargissement des bandes

Influence de la vitesse d’écoulement de la phase mobile

la variance du pic (2)

est proportionnelle à H :
quand H diminue, la largeur du
pic diminue
A retenir
Équation de van Deemter :
H min
H = A + B/ u + C. u

u = vitesse linéaire d’écoulement de la phase

mobile U optimal
A, B, C : constantes pour une colonne donnée et
une S donnée pour s’en debarasser du parametre A ,
enenlever la phase stationnaire et on utilise
si la colonne est une colonne capillaire A=0 des colonne capillaire
Pr: A. DARI 52
 Pour
16(t
avoir une meilleus
N=
RI if faut
séparation
avoi bame efficacité
R R = cts
donc it faut avoir w faille
eth minimal et vitesse optimal
facteur influençant la
qualité d'une reparation
colome dome
A
,
B, C :

paramètre fixe pour

d'une colome d'econleut
A :
factor de
remplissage Camisotropie
A = A d!
.

colome colone plane A

cappilari A = 0 ,
:
to
B :
diffusion longitudinal
très
influent en
phase
garzense
Pour réolime le
paramétre
il suffit
daugmenter u

la vitesse .

Q . E:

6 Pour améliorer
qualité reparation
Relevée
Pour améliorer Cet brechire
viscosité (milieu
on
change -

visquena 1 (voice note 2: 0 % /

Pr: A. DARI 53
5.5 Grandeurs physiques : la théorie cinétique

Pr: A. DARI 54
 La théorie cinétique considère le pic chromatographique comme représentatif de la distribution statistique
des temps de rétention des molécules d’une substance donnée sur la colonne.

 La théorie cinétique considère les phénomènes de diffusion et de transfert de masse

Pr: A. DARI 55
Phénomènes de diffusion :

Diffusion moléculaire longitudinale

Diffusion turbulente
Remplissage

Pr: A. DARI 56
Transfert de masse

a b
 t0, les molécules a et b d’une
même substance sont sur la même
ligne

 ti, a va rester dans le pore du grain

de la phase stationnaire et b dans la
phase mobile

 tf, b ira plus vite que la molécule a

Pr: A. DARI 57
2 heures
5.6. Application à la CPG

Equation de Van Deemter

H = A + B/ū + C.ū
ū = vitesse linéaire moyenne d’écoulement de la phase mobile dans la colonne
Pr: A. DARI 58
Pr: A. DARI 59
Pr: A. DARI 60
5.6.-1: Signification physique des termes A, B et C.

A : terme de remplissage
Ce terme est en relation avec le profil d’écoulement de la phase mobile à
travers la phase stationnaire.
La taille des particules, leur répartition et la régularité du remplissage ou
du tassement de la colonne font que la phase mobile circule plus ou moins
facilement.
Si des chemins préférentiels sont crées, la phase mobile circule librement
et rapidement à l’intérieur de la phase stationnaire et les équilibres entre
phase fixe et mobile ne se font plus correctement ce qui diminue l’efficacité
de la colonne.
Ce phénomène est appelé diffusion turbulente d’Eddy.

Pr: A. DARI 61
 A: diffusion turbulente ou
diffusion de Eddy :
terme dû aux multiples
veines d’écoulement :
Anisotropie d’écoulement
A= λ.dp

λ : facteur de remplissage de la
colonne
dp : diamètre des grains ou des
particules

Pr: A. DARI 62
parametre A

Diffusion de Eddy
molécules

Text

3 va sortir en 1er 2 en 2ème et 1 en dernier vu la qualité de remplissage irrégulier et non uniforme

temps

donc pour avoir une bonne separation , on doit avoir un bon remplissage
d’ou A faible remplissage ——> regulier et uniforme
Pr: A. DARI 63
• Remarque : Ce phénomène est parfois négligeable et on
peut écrire une équation sans terme A appelée équation
de Golay. C’est souvent le cas en chromatographie liquide
ou pour les colonnes dites capillaire en C.P.G.
•

Pr: A. DARI 64
Colonne pleine : A ≠ 0
Colonne capillaire(G.C.) : A = 0
→ Equation de Golay pour la GC en colonne capillaire :

Courbe de Golay
H

Pas de dispersion des trajets

B H
H  C.u
u
H
min B
C
Ce terme A est absent par nature dans les u
colonnes capillaires car il n’y a pas de
remplissage de la colonne.
la courbe correspondante montre
l’abaissement de la courbe consécutif à la
suppression du terme A.

Pr: A. DARI 65
 Bon remplissage bien régulier
Pas de chemins préférentiels :
A faible voire négligeable

Mauvais remplissage irrégulier

Création de chemins préférentiels :
A élevé = mauvaise séparation

Pr: A. DARI 66
anisotropie d’écoulment prend un seul sens
droit

critere B: reserver pour les gaz

diminuer B pour augmenter la vitesse de la phase mobile

pour il qu il va droit
Pr: A. DARI 67
 B : terme de diffusion dans la phase mobile
Ce terme est particulièrement important en C.P.G.
Il est un conséquence du second principe de la thermodynamique qui veut que
l’entropie (et donc le désordre) augmente spontanément.
La séparation chromatographique est une “mise en ordre” et est donc opposée a
cette augmentation de l’entropie.
Les molécules ont toujours une tendance naturelle à occuper au maximum
l’espace qui leur est offert et à se remélanger entre elles.
Cela est particulièrement vrai si le débit de la M est très faible, les molécules
se mélangent alors plus vite qu’elles ne se séparent.
C’est ce qui explique la diminution de l’efficacité pour les très faible débits, qui
pourrait paraître à priori paradoxale.

Pr: A. DARI 68
B: diffusion longitudinale :
B 2γD
diffusion du composé de  M

la région concentrée d’une u u

bande vers la région diluée

γ : facteur d’obstruction ou de tortuosité

DM : coefficient de diffusion :
 mesure la mobilité du composé dans la phase
mobile
 plus faible dans les liquides que dans les gaz
 augmente avec la température
 diminue quand la viscosité du milieu augmente

pour augmenter l’efficaciter il faut diminuer B et augmenter le debit (vitesse) de la phase mobile
Pr: A. DARI 69
chromatographie exprime l’ordre au contraire a l’entropie qui exprime le désordre

C diminuer reflète le transfert de masse de soluté entre phase stationnaire et mobile

si on favorise C on défavorise B
ce sont 2 paramètres contradictoires
pour réduire c on augmente sur la viscosité

Pr: A. DARI 70
 C : terme de transfert de masse
Le terme C, est dû à la résistance au transfert de masse du
soluté entre les deux phases,
il devient prépondérant lorsque le passage est trop rapide
pour que les équilibres puisse s’établir correctement.
Les solutés sont entraînés hors équilibre et les séparations
ne se font plus correctement.

Pr: A. DARI 71
 C. : cinétique de transfert de masse
C. u = (CPS + CPM).u

Transfert de masse favorisé par

une faible épaisseur de phase stationnaire

un petit diamètre de colonne
une température plus élevée
un coefficient de diffusion DM peu élevé
(PM peu visqueuse)
un faible débit d’éluant

Pr: A. DARI 72
On observe aussi un élargissement des pics dû aux effets de transfert de masse.
L’équilibre entre M et S s’établit lentement et la qualité de la séparation sera
mauvaise si l’élution est trop rapide et les équilibres, incomplets ce qui se produit
aux grandes valeurs de u
Ce transfert de masse est dès lors favorisé par de faibles épaisseurs de M et de
S, par un petit diamètre de colonne, par des coefficients de diffusion élevés (M
peu visqueuse ), par des débits d’éluant faibles.
On constate donc que la contribution de la vitesse d’élution sur les termes B/u et
C.u est contradictoire.
La courbe expérimentale montre qu’il faut chercher un compromis entre deux
phénomènes : la diffusion et la vitesse d’échange entre les phases.

Pr: A. DARI 73
Voici la courbe de Van Deemter pour l’HPLC/ On n’observe pas de remontée abrupte de la courbe du côté des très
faibles débits car le coefficient Dm est beaucoup plus faible qu’en GC
La contribution du terme C.u sur H dépend de la vitesse de l’éluant de manière plus complexe
car la cinétique de transfert de masse dans la m liquide est très limitée
En HPLC :
H
effet moins prononcé de
B/U à très faible débit
car DM beaucoup plus
faible qu’en GC
u La contribution du terme
C.u sur H dépend de la
vitesse de l’éluant de
manière plus complexe

Pr: A. DARI 74
 sau liquide
&
↑
s
équivalent
à équation
hrechit & de Van Dee inter
vitesse linéaire réduite
pour
gas

echelle logarithmique
pour
valeur faible

Pr: A. DARI 75
 Dimensions
À apprendre saus

Pr: A. DARI 76
 On utilise des valeurs & Optimisation on K'

réduite car c'est des grandes si Let n est

dimension R
sans
meilleur condition
= N

Le
y=
B
Comment
optimiser ane
analyse R =
cst
en chromato sur colonne ? courbe

= ti ärztemit

L'optimisation des 3
paramètreil emi
temps résolution K'
·
Skiş2 :

impossible par consequent faut fixer sensible pour

zene
3
paramètre et
optimiser le des valeurs
faible
Pr: A. DARI 77
Les solutions pour minimiser des phénomènes de diffusion :

 Améliorer l’homogénéité de la phase:

 Absence d’hétérogénéités
 Absence de bulle
 Absence de vide

 Réduire le diamètre des particules dp

 Homogénéiser le débit de la phase mobile

 Diminuer la taille des grains et des pores

Pr: A. DARI 78
En résumé :

 Prendre des particules

 De petites tailles
 De faible porosité

 Réaliser des chromatographies

 Rapides
 Avec des phases stationnaires
miniaturisées

 Travailler

 A faible température
 En réduisant les volumes morts

Pr: A. DARI 79